CN107513572A - 一种鉴别窖泥窖龄的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种鉴别窖泥窖龄的方法，基于窖泥主导微生物群落的代谢指纹图谱聚类分析，通过窖泥窖龄自动化鉴别系统实现自动化鉴别，操作简便，准确性高，能科学地鉴别窖泥质量及成熟度，为促进新窖老熟及老窖的维护保养等提供了科学依据。

Description

一种鉴别窖泥窖龄的方法
技术领域
本发明属于酿酒技术领域，具体涉及一种鉴别窖泥窖龄的方法。
背景技术
白酒是五千年中华文明留下来的宝贵遗产，是中华传统文化的重要组成。在浓香型白酒固态发酵酿酒工艺中，窖池是关键设备。“千年老窖万年糟，酒好全凭窖池老”表明：只有窖龄较长的窖池才能酿出好酒。但对于窖池窖龄的鉴定仍然停留在以感官鉴定为主，同时检测相应理化指标。该方法存在主观性高、检测过程复杂、准确性低的缺陷，而理化指标值大小可以通过工艺简单调整就可达到，而且不同生产白酒企业人工窖泥培养方式及配方不尽相同，仅通过理化指标检测和感官进行鉴定是不客观的。
在白酒酿造过程中，参与酿酒发酵的主要是丰富复杂的窖泥微生物，我们应该从不同窖龄窖泥微生物群落结构和主导微生物群系及代谢特征入手，建立窖泥窖龄鉴别的方法，以科学的评估窖泥质量及窖龄鉴定，有效指导窖泥保养技术，提高白酒优质品率。
发明内容
为了解决上述问题，本发明基于窖泥功能基因微生物优势菌群，提供了一种鉴别窖泥窖龄的方法，其特征在于该方法包括如下步骤：
1）窖泥功能基因微生物优势菌群的确立，在确立过程中，首先进行窖泥样品总RNA提取，随后进行基因组数据处理；
2）窖泥主导微生物群系代谢指纹数据的收集，不同窖龄窖泥主导微生物代谢指纹数据通过预处理、培养和聚类进行采集；
3）通过大量的基础试验数据，建立窖泥窖龄聚类标准图谱；
4）通过采集不同车间的窖泥样品，将车间样品的聚类分析结果与各车间样品的实际窖龄进行比对，实现窖泥窖龄聚类标准图谱的验证。
进一步地，所述步骤1）中所述基因组数据处理包括DNA片段统计和拼接、生物信息解释、基因表达分析。
进一步地，通过宏基因组测序，比对不同窖龄窖泥间的微生物相对丰度及多样性指数,得出窖泥的主导微生物群落。
进一步地，所述基因组数据处理中同时利用Newbler软件和SOAPdenovo软件进行基因组的组装，使得拼接操作覆盖尽可能宽的丰度范围。
进一步地，所述基因组数据处理中结合MG-RAST软件或Kraken软件进行生物信息学数据分析。
进一步地，所述步骤2）中所述培养是将样品接种到Biolog ECO MicroPlate生态板，经过培养后放入Biolog微生物鉴定仪读取特征代谢指纹图谱信息。
进一步地，所述步骤2）中所述聚类通过SPSS统计分析软件处理特征代谢指纹图谱信息，得出待检窖泥样代谢指纹聚类分析图谱。
进一步地，所述方法还包括步骤5）基于Java构建窖泥窖龄自动化鉴别系统，通过SPSS软件和Biolog微生物鉴定仪提供的Java接口实现SPSS软件、Biolog微生物鉴定仪与系统核心控制模块之间的数据/控制命令交互，实现系统核心控制模块与ERP企业管理系统的数据连接。
进一步地，所述窖泥窖龄自动化鉴别系统的运行过程为：
（1）实验人员利用Biolog ECO MicroPlate生态板采集待检测窖泥的微生物样本，然后放入Biolog微生物鉴定仪读取特征代谢指纹图谱信息；
（2）系统通过Java接口自动获取检测信息，将信息通过Java接口传输给SPSS软件，同时传输对应的统计分析命令给SPSS软件；
（3）SPSS软件完成聚类分析后，将结果通过Java接口传输给系统核心控制模块，模块根据设定的窖泥窖龄鉴别规则判断当前样本的窖龄；
（4）依据鉴别结果产生鉴定报告，并将鉴定报告传输到ERP企业管理系统，方便查看管理。
进一步地，所述窖泥窖龄自动化鉴别系统会将运行过程中产生的每个中间结果存储在本地数据库。
附图说明
图1是窖泥样品微生物组成（属水平）；
图2是不同窖龄窖泥代谢指纹聚类分析图谱；
图3是窖泥窖龄鉴定聚类标准图谱；
图4是不同车间窖泥代谢指纹聚类分析。
具体实施方式
为了对本发明的技术特征、目的和效果有更加清楚的理解，现对照附图说明本发明的具体实施方式。
一种鉴别窖泥窖龄的方法，包括以下步骤：
1）窖泥功能基因微生物优势菌群的确立
（1）窖泥样品总RNA提取。窖泥样品按10cm2/ml加Trizol后，室温放置5min，使其充分裂解。12000rpm 离心5min，弃沉淀。按200ul氯仿/ml Trizol加入氯仿，振荡混匀15分钟，室温放置15min。4℃/12000g离心15min。吸取上层水相，至另一离心管中，按0.5ml异丙醇/mlTrizol 加入异丙醇混匀，室温放置5-10min，4℃/12000g离心10min，弃上清，RNA沉于管底。按1ml 75%乙醇/ml Trizol加入75%乙醇，温和振荡离心管，悬浮沉淀。4℃ 8000g离心5min，尽量弃上清，室温晾干或真空干燥5-10min，最后用50ul 无菌水溶解RNA样品。RNA经提取后，经富集mRNA、去除rRNA及反转录生成cDNA等过程，获取供高通量测序用的实验样品，利用Illumina的HiSeq2000测序仪进行测序；
（2）基因组数据处理。处理过程包括DNA片段统计和拼接、生物信息解释、基因表达分析(RNA-Seq)等。宏基因组与转录组数据放在一起进行拼接，以获得尽可能长的DNA重叠组。具体分析过程如下：
①overlap–layout–consensus (OLC)拼接算法属于直觉组装算法，于1980年提出，主要用于长的低丰度序列的拼接，其具体组装过程为：首先进行Overlop操作，对所有reads进行两两对比，找到片段间的重叠信息，接下来进行Layout操作，根据得到的重叠信息将存在的重叠片段建立一种组合关系，形成一种重叠群，即Contig，最后进行Consensus操作，根据构成Contig的片段的原始质量信息，在重叠群中寻找一条质量最重的序列路径，并获得与路径对应的序列，相比而言，de-bruijn-graph (DBG)拼接算法属于反直觉算法，它是首先将reads分割为更短的k-mers，再利用k-mers间的overlap关系得到基因组序列，适合高丰度的短序列的拼接。为了使得拼接操作覆盖尽可能宽的丰度范围，保证分析的全面准确性，同时采用基于OLC拼接算法的Newbler软件（454Life Science）和基于DBG拼接算法的SOAPdenovo软件进行基因组的组装；
②NCBI（美国国立生物技术信息中心）接收世界各地生物学实验室提交的基因序列，具有生物基因研究领域非常权威的数据库。通过与NCBI 的nr/nt 库进行序列比对，根据已知序列定位Contigs之间的连接顺序，获得更加精确的基因研究数据，确保研究的完整准确；
③宏基因组包含不同的基因组混合物，并不是单纯的同质微生物菌群，相比于一般的基因组分析，数据量更大，本方法采用MG-RAST、Kraken等软件进行生物信息学数据分析。
通过宏基因组测序，将不同窖龄窖泥间的微生物相对丰度及多样性指数进行对比（图1所示），分析发现，相对丰度靠前的微生物为：梭菌属（Clostridium）、甲烷囊菌属（Methanoculleus）、拟杆菌属（Bacteroides）、乳酸杆菌属（Lactobacillus）、甲烷八叠球菌属（Methanosarcina）、紫单胞菌属（Parabacteroides）、互营单胞菌属（Syntrophomonas）、芽孢杆菌属（Bacillus）、真杆菌属（Eubacterium）和一种产氢细菌（Ethanoligenens），它们是窖泥的主导微生物群落。
研究同时发现，在所研究的窖泥样品中，甲烷囊菌属、互营单胞菌属在新窖池窖泥中明显高于老窖池窖泥，而梭菌属、甲烷八叠球菌属在老窖池窖泥中含量远远高于新窖池窖泥。梭菌属在10~50年窖泥中含量为2年的2.31倍，为5年的1.46倍；甲烷八叠球菌属含量在5~10年期间显著增加，到10年时其含量是2年窖龄窖泥的18.75倍，是5年窖龄窖泥的11.14倍，其后趋于稳定。该研究结果表明梭菌属和甲烷八叠球菌属这两种微生物是窖泥老熟度的标志性微生物。
2）窖泥主导微生物群系代谢指纹数据的收集
美国BIOLOG公司于1989年开发出biolog技术，可以进行95种唯一碳源的生化反应测试，非常适用于微生物鉴定领域。biolog技术的原理是在Biolog ECO MicroPlate生态板上设置多个孔，微孔内含有一种不同的有机碳源和相同含量的四唑紫燃料，将微孔内的有机碳源作为接种后的微生物的唯一能量来源，微生物在生物氧化的过程中产生电子转移，四唑紫燃料就能俘获电子而变成紫色，颜色的深浅反映了微生物对相对碳源的利用能力，即微生物的代谢能力。
基于窖泥老熟标志性微生物及主导微生物群落，不同窖龄窖泥主导微生物代谢指纹数据通过以下流程进行采集：
（1）代谢指纹数据样品预处理：称取10g窖泥样品，加入蒸馏水50ml，漩涡震荡5分钟，800rmp/min离心，取上层菌悬液备用。
（2）培养：将预处理的样品，接种到Biolog ECO MicroPlate生态板，30℃培养5天，然后放入Biolog微生物鉴定仪读取特征代谢指纹图谱信息；
（3）聚类：对读取的特征代谢指纹图谱信息采用SPSS统计分析软件进行聚类分析，得出待检窖泥样代谢指纹聚类分析图谱。
采用上述操作步骤，选用Biolog ECO MicroPlate生态板对不同窖龄的窖泥主导微生物群落进行分析。将不同窖龄样品的窖泥微生物混合菌液接种到Biolog ECOMicroPlate培养5天呈现出一种叫做代谢指纹的特性反应图谱。
代谢指纹灵敏度高，分辨力强，能够分辩微生物群落的微小变化，并且采用该方法无需分离培养纯种微生物，能够尽可能地保留微生物群落原有的代谢特征，在一块微平板上一次完成对不同碳源代谢能力的测定，简单迅速地为我们提供大量数据信息。通过不同窖龄的窖泥微生物代谢指纹特征数据的收集，采用SPSS统计分析软件进行系统聚类分析，得到不同窖龄窖泥代谢指纹聚类分析图谱。通过图2可以看出，不同窖龄的窖泥样品单独聚为一类，2年窖龄样品聚为一类，轴距1.55；5年窖龄样品聚为一类，轴距1.55；10年窖龄样品聚为一类，轴距2.85；20年窖龄样品聚为一类，轴距4.15；30年窖龄样品聚为一类，轴距2.85；40年窖龄样品聚为一类，轴距4.15；50年窖龄样品聚为一类，轴距9.12；多次试验显示该方法具有较好的重现性。从图中大致可以看出20年窖龄样品与30年窖龄样品聚为一类，在与10年窖龄样品聚在一起，与 40年窖龄与50年窖龄样品交集，最后与2年窖龄样品、5年窖龄样品聚合。
3）窖泥窖龄聚类标准图谱的建立
通过大量的基础试验数据，本方法建立了窖泥窖龄聚类标准图谱（图3所示），2年窖龄样品与5年窖龄样品相似性最好，轴距为1.15，但它们与其它年份窖龄相似性最弱，轴距24.99；20年窖龄样品和30年窖龄样品相似性次之，轴距为2.05，接着10年窖龄样品与它们的轴距为6.03。40年窖龄样品与50年窖龄样品轴距4.98，与10年、20年、30年样品轴距13.15。
4）窖泥窖龄聚类标准图谱的验证
为了进一步验证本方法的准确性，我们采集了不同车间的窖泥样品，二车间窖泥样品窖龄44年，六车间窖泥样品窖龄12年，七车间窖泥样品窖龄6年进行了聚类验证。聚类结果如图3，由图可知二车间样品聚类数据处于40年窖龄数据与50年窖龄数据之间，轴距1.05；六车间样品聚类数据与10年窖龄数据聚类，轴距分别为1.05；七车间样品聚类数据与5年窖龄数据聚类，轴距2.11。车间样品的聚类分析结果与各车间样品的实际窖龄一致，这充分说明该方法是准确、可靠的。
5）构建窖泥窖龄自动化鉴别系统
Java语言可以一次编译，到处运行，具有平台无关性，并且提供了许多内置的类库，通过这些类库，简化了开发人员的设计工作，同时缩短了项目开发时间。考虑到Java语言的诸多优点，选择Java语言实现整个自动化鉴别系统。首先，将经过验证的窖泥窖龄聚类标准图谱包含的相关信息保存在本地Mysql数据库中，采用Java语言将窖泥窖龄鉴别规则表达出来，随后通过SPSS软件和Biolog微生物鉴定仪提供的Java接口实现SPSS软件、Biolog微生物鉴定仪与系统核心控制模块之间的数据/控制命令交互，最后，实现系统核心控制模块与ERP企业管理系统的数据连接。
IBM从SPSS21之后，给出了Java调用SPSS的接口，其实质是在SPSS21及之后的安装目录下加入一个名称为spssjavaplugin.jar的jar包，在java中主要就是通过这个jar包中的一些接口来调用SPSS的功能，通过该接口可以实现统计命令的执行、变量的添加、分析结果的获取、改变输出数据格式等功能。
窖泥窖龄自动化鉴别系统的具体运行过程如下：
（1）实验人员利用Biolog ECO MicroPlate生态板采集待检测窖泥的微生物样本，然后放入Biolog微生物鉴定仪读取特征代谢指纹图谱信息；
（2）系统通过Java接口自动获取检测信息，将信息通过Java接口传输给SPSS软件，同时传输对应的统计分析命令给SPSS软件；
（3）SPSS软件完成聚类分析后，将结果通过Java接口传输给系统核心控制模块，模块根据设定的窖泥窖龄鉴别规则判断当前样本的窖龄。
（4）依据鉴别结果产生鉴定报告，并将鉴定报告传输到ERP企业管理系统，方便企业相关人员进行查看管理。
考虑到断电、运行故障等意外情况会导致系统非正常中断，窖泥窖龄自动化鉴别系统会将运行过程中产生的每个中间结果存储在本地Mysql数据库，以备系统非正常中断后进行恢复操作时可以从故障点继续操作，不必重复之前已经完成的操作，减少操作时间。
该方法基于窖泥主导微生物群落的代谢指纹图谱聚类分析，通过窖泥窖龄自动化鉴别系统实现自动化鉴别，操作简便，准确性高，能科学地鉴别窖泥质量及成熟度，为促进新窖老熟及老窖的维护保养等提供了科学依据。该技术进一步丰富了企业核心技术内涵及自主创新能力。
以上所揭露的仅为本发明较佳实施例而已，不能以此来限定本发明之权利范围，依本发明权利要求所作的等同变化，仍属本发明所涵盖的范围。

Claims (10)

1.一种鉴别窖泥窖龄的方法，其特征在于该方法包括如下步骤：
1）窖泥功能基因微生物优势菌群的确立，在确立过程中，首先进行窖泥样品总RNA提取，随后进行基因组数据处理；
2）窖泥主导微生物群系代谢指纹数据的收集，不同窖龄窖泥主导微生物代谢指纹数据通过预处理、培养和聚类进行采集；
3）通过大量的基础试验数据，建立窖泥窖龄聚类标准图谱；
4）通过采集不同车间的窖泥样品，将车间样品的聚类分析结果与各车间样品的实际窖龄进行比对，实现窖泥窖龄聚类标准图谱的验证。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤1）中所述基因组数据处理包括DNA片段统计和拼接、生物信息解释、基因表达分析。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于通过宏基因组测序，比对不同窖龄窖泥间的微生物相对丰度及多样性指数,得出窖泥的主导微生物群落。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述基因组数据处理中同时利用Newbler软件和SOAPdenovo软件进行基因组的组装，使得拼接操作覆盖尽可能宽的丰度范围。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述基因组数据处理中结合MG-RAST软件或Kraken软件进行生物信息学数据分析。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤2）中所述培养是将样品接种到Biolog ECO MicroPlate生态板，经过培养后放入Biolog微生物鉴定仪读取特征代谢指纹图谱信息。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤2）中所述聚类通过SPSS统计分析软件处理特征代谢指纹图谱信息，得出待检窖泥样代谢指纹聚类分析图谱。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述方法还包括步骤5）基于Java构建窖泥窖龄自动化鉴别系统，通过SPSS软件和Biolog微生物鉴定仪提供的Java接口实现SPSS软件、Biolog微生物鉴定仪与系统核心控制模块之间的数据/控制命令交互，实现系统核心控制模块与ERP企业管理系统的数据连接。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于所述窖泥窖龄自动化鉴别系统的运行过程为：
（1）实验人员利用Biolog ECO MicroPlate生态板采集待检测窖泥的微生物样本，然后放入Biolog微生物鉴定仪读取特征代谢指纹图谱信息；
（2）系统通过Java接口自动获取检测信息，将信息通过Java接口传输给SPSS软件，同时传输对应的统计分析命令给SPSS软件；
（3）SPSS软件完成聚类分析后，将结果通过Java接口传输给系统核心控制模块，模块根据设定的窖泥窖龄鉴别规则判断当前样本的窖龄；
（4）依据鉴别结果产生鉴定报告，并将鉴定报告传输到ERP企业管理系统，方便查看管理。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于所述窖泥窖龄自动化鉴别系统会将运行过程中产生的每个中间结果存储在本地数据库。
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