CN113930526B - 用于鉴别甲基苯丙胺涉毒人群的方法、组合物及其应用 - Google Patents

用于鉴别甲基苯丙胺涉毒人群的方法、组合物及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种用于鉴别甲基苯丙胺涉毒人群的方法、组合物及其应用，其中该方法包括以下步骤：获取受试者的待测样本中的肠道菌群的信息；基于肠道菌群的异常判断受试者是否涉及吸食甲基苯丙胺。本发明针对甲基苯丙胺涉毒嫌疑人员，开发了一种采样时间窗口期长、稳定灵敏的法庭辅助甄别技术方案，通过研究服用甲基苯丙胺对涉毒者肠道菌群的影响，实现了基于肠道菌群检材的精确检测。此外，本发明的方法预测准确率显著提高，在特异性为100％时，敏感性超过90％，因此在甄别甲基苯丙胺涉毒人员的法庭辅助技术具有潜在的应用价值。

Description

用于鉴别甲基苯丙胺涉毒人群的方法、组合物及其应用
技术领域
本发明涉及生物医学技术领域和法庭科学领域，具体地涉及使用肠道微生物信息对甲基苯丙胺涉毒人员进行甄别的检测方法，尤其涉及用于鉴别甲基苯丙胺涉毒人群的方法、组合物及其应用。
背景技术
甲基苯丙胺，也称为甲基安非他命(methamphetamine,N-methylamphetamine)，化学式：C6H5CH2CH(CH3)NHCH3(N-甲基-1-苯基丙-2-胺、N-甲基-α-甲基苯乙胺)，是一种强效中枢神经系统兴奋剂。主要用于毒品，较少用于治疗注意力缺陷多动障碍和肥胖症。其结晶形态俗称冰毒，同时也是“摇头丸”的主要成分之一。
甲基苯丙胺有神经毒性，已被证实能够损伤人类中枢神经系统中的多巴胺能神经元和5-羟色胺能神经元，并引起神经元代谢功能异常。服用高剂量甲基苯丙胺可引起兴奋剂型精神病(Stimulant psychosis，如：偏执、幻觉、谵妄和妄想等)、心律失常、横纹肌溶解症、癫痫和颅内出血等，长期使用会导致严重的药物成瘾及侵略性行为。甲基苯丙胺的戒断症状强烈，主要表现为高度疲劳、精神抑郁、饥饿感，有5-15％的涉毒人群无法摆脱药物依赖。甲基苯丙胺成瘾人群会出现脑结构性改变，如海马区明显收缩，扣带皮层、边缘皮层和旁边缘皮层的灰质减少、白质肥大等。
甲基苯丙胺属于安非他命类毒品(ATS)，其2019年缴获总量位列大麻类毒品、新型精神活性物质(new psychoactive substances，NPS)、可卡因类毒品和阿片类毒品之后，位列第五。由于可以通过化学合成，安非他命类毒品的缴获量在过去二十年间增长了20倍，近年来的相关缉获案件数量更是仅次于大麻类毒品，是对人类精神健康安全威胁增长最快的毒品类型。
在安非他命类毒品中，甲基苯丙胺是普及率最高、社会危害最大的毒品类型。其2019年世界范围内的缴获总量为325吨，占所有安非他命类毒品缴获量的71.3％，相较于2009年缴获总量上涨了10倍。东亚/东南亚和北美是甲基苯丙胺滥用的重灾区，其甲基苯丙胺缴获量分别占比43％和49％。据评估，2019年东亚与东南亚约有一千万人吸食冰毒。尽管受到严格控制，中国2019年依然有超过一百万人服用过甲基苯丙胺，在我国涉毒人群中占比超过50％；而我国2019年的冰毒缴获量，仅位居美国、泰国、墨西哥之后，排名第四。作为对我国社会危害极大的毒品类型，在公检法系统的日常工作中需要对甲基苯丙胺涉毒人群进行准确判别。
甲基苯丙胺的生物检材分析是法庭科学研究的热点。目前常规生物检材包括涉毒嫌疑人的体液(尿液、血液等)和毛发，其中尿液因其毒品含量高、易采集、检测速度快等优势，最大限度提高了办案效率，从而广泛用于一线公检法人员的现场检测与跟踪随访。
针对甲基苯丙胺涉毒嫌疑人员的常规甄别技术方案如下：
(1)金标法：目前对甲基苯丙胺涉毒嫌疑人进行司法甄别的主要方法，检测样本为体液。包含冰毒尿检板、甲基苯丙胺检测试纸、电子微芯片竞争免疫法等以免疫胶体金技术为基础的衍生技术方案。其基本原理是利用涉毒人群体液样本中遗存的甲基苯丙胺，对胶体金标记甲基苯丙胺单克隆抗体与检测标准品之间的免疫反应，进行竞争性抑制；继而通过化学显色、电信号检测等方法，对生物检材中的甲基苯丙胺进行定性和/或定量检测。
(2)基于颜色反应和化学荧光的检测：检测样本为体液。由于胺结构的存在，甲基苯丙胺能与特定的化学试剂发生化学反应而产生特定的颜色或者荧光，可作为识别甲基苯丙胺的定性分析方法。如甲基苯丙胺与马改氏试剂反应可生成橘黄色产物；与西门试剂(10％乙醛和1％亚硝酰铁氰化钠水溶液等比例混合溶液)反应可产生蓝色；与没食子酸则产生亮绿色；与具有固态荧光的芳甲基醇反应产生淡紫色荧光等。
(3)高效液相色谱法(HPLC)：检测样本为体液。是一种利用高压输液系统作用动力系统的液相色谱方法，其特点为高压输送、色谱柱采用高效固定相等；检测之前需用β-葡糖苷酸酶和硫酸酯酶在37℃条件下水解24h，固相萃取后可用紫外检测器在215nm下测定。
(4)气相色谱-质谱联用法(CG-MS)：检测样本多为毛发。检测时，需首先将样本中的甲基苯丙胺进行衍生化，形成乙酰基、异硫氰酸盐或氘化的苯丙胺衍生物；依据色谱保留时间、气态红外特征吸收峰，以及质谱仪中得到的特征碎片的荷质比，共同判定生物检材中是否含有甲基苯丙胺残留。
除此之外，针对甲基苯丙胺检测还发展了其它多种技术方案，如红外光谱法、毛细管电泳法、薄层色谱法、拉曼光谱法、局域表面等离子共振法、酶联免疫分析法等。这些检测方法无一例外是以体液、毛发等常规生物检材作为检测对象的。但此类生物检材均存在不足。由于人体代谢和排泄的缘故，甲基苯丙胺在尿液、血液等体液样本中仅能残留1-3天。因此以体液样本作为检测对象的技术方案，只能反映收集样品前短时间内的毒品服用情况。毛发样本虽然具有稳定、易保存等优点，但是其中毒品及其代谢物的含量一般很低，而生物杂质含量很高，从而限制了样本检测的灵敏度。
背景技术中的信息仅仅在于说明本发明的总体背景，不应视为承认或以任何形式暗示这些信息构成本领域一般技术人员所公知的现有技术。
发明内容
为解决现有技术中的技术问题，本发明针对甲基苯丙胺涉毒嫌疑人员，开发了一种采样时间窗口期长、稳定灵敏的法庭辅助甄别技术方案，本发明人通过研究服用甲基苯丙胺对涉毒者肠道菌群的影响，提出了一种用于鉴别甲基苯丙胺涉毒人群的方法、组合物及其应用，从而实现涉毒人群的精确检测。具体地，本发明包括以下内容。
本发明的第一方面，提供一种用于鉴别甲基苯丙胺涉毒人群的方法，其至少包括以下步骤：
a.获取受试者的待测样本中的肠道菌群的信息，其中所述肠道菌群选自表3所示肠道菌中的至少一种或其组合；和
b.基于所述肠道菌群的数据，分析所述肠道菌群是否异常，进而判断所述受试者是否涉及吸食甲基苯丙胺。
根据本发明所述的用于鉴别甲基苯丙胺涉毒人群的方法，优选地，依据受试者肠道菌群数据与选自表3中至少五项指标的变化趋势一致性，判定受试者是否属于涉毒人群。优选地，所述肠道菌群来自于粪便。
本发明的第二方面，提供一种菌群标志物在鉴别甲基苯丙胺涉毒人群中的用途，所述菌群标志物选自表3所示肠道菌中的至少一种或其组合。优选选自表3所示肠道菌中的至少5种肠道菌，进一步优选选自表3所示肠道菌中的至少10种肠道菌，例如11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22或23种肠道菌。
本发明的第三方面，提供一种用于鉴别甲基苯丙胺涉毒人群的组合物，其包括能够检测表3所示至少一种的肠道菌群异常的试剂。优选地，所述试剂包括特异性引物或探针。还优选地，所述引物或探针为用于检测选自表3所示肠道菌的至少一种的16S rDNA或其部分序列的引物或探针。
根据本发明所述的用于鉴别甲基苯丙胺涉毒人群的组合物，优选地，所述组合物包括扩增子测序用试剂。
本发明的第四方面，提供一种用于鉴别甲基苯丙胺涉毒人群的系统，其包括：
数据采集单元，其用于获取来自受试者的表3中至少一种所示肠道菌群的数据，所述数据包括所述菌群种类及相对丰度；
数据处理单元，其用于对所述数据采集单元中获取的数据进行处理，包括将所述数据输入预测模型，根据预设阈值，判断所述受试者是否为涉毒人群。
根据本发明所述的用于鉴别甲基苯丙胺涉毒人群的系统，优选地，所述预测模型通过以下步骤得到：
a.构建基于涉毒人群和对照人群等比例分布的训练集和验证集；
b.获取受试者肠道菌群的种类及相对丰度数据；
c.通过比较涉毒人群和对照组人群菌群种类及相对丰度，获得具有组间差异的代表菌属及其丰度；
d.结合涉毒人群涉毒行为年份，进一步筛选代表菌属中与涉毒行为存在量效关系的菌属；
e.通过机器学习方法进行模型构建，以菌群的种类和丰度作为输入变量，通过涉毒样本和对照样本菌属丰度训练模型并得到输出变量，所述输出变量包括涉毒人群和健康人群的分类概率，通过验证集进行模型的验证；
优选地，所述机器学习包括决策树、支持向量机、随机森林或其组合；
优选地，进一步通过递归特征消除方法删除掉不具有显著区别的菌群种类；
优选地，设置所述预测模型的判定阈值为>0.5。
本发明的第五方面，提供一种用于甲基苯丙胺涉毒人群鉴别的电子设备，包括存储器、处理器及存储在存储器上并可在处理器上运行的计算机程序，所述处理器执行所述计算机程序时实现利用预测模型得到甲基苯丙胺涉毒人员分类概率的步骤，包括：获取患者的特征数据，输入所述预测模型，得到甲基苯丙胺涉毒人员分类概率值，所述特征数据包括选自表3中至少一种所示肠道菌群的种类及相对丰度。
本发明的第六方面，提供一种非暂态计算机可读存储介质，其上存储有计算机程序，该计算机程序被处理器执行时实现利用预测模型得到甲基苯丙胺涉毒人员分类概率的步骤，包括：获取患者的特征数据，输入所述预测模型，得到甲基苯丙胺涉毒人员分类概率值，所述特征数据包括选自表3中至少一种所示肠道菌群的种类及相对丰度。
虽然近年来的研究发现，服用包括甲基苯丙胺在内的各类毒品会对肠道菌群产生变化各异的显著影响，但这些研究主要基于小鼠/大鼠等动物模型。仅有一个肠道微生物组研究队列与甲基苯丙胺涉毒人群相关，且队列构成复杂，多数参与者同时服用两种或两种以上的毒品，并且有相当比例的参与者为艾滋病患者。由于人与啮齿类动物的肠道菌群构成存在显著差异，因此通过动物模型很难获得能够有效甄别涉毒人群的生物标志物；而基于复杂队列的研究，也很难对其中单一因素导致的肠道微生物改变进行有效甄别。
本发明以涉毒嫌疑人员的粪便样本作为检测对象，检材量大、易获取，检测灵敏度高、窗口期长，能够反映收集样品前至少三个月内的毒品服用情况。而且相较于目前公开的、基于复杂人群或动物模型得到的肠道菌群标志物，本发明的方法预测准确率显著提高，在特异性为100％时，敏感性超过90％，有潜力成为甄别甲基苯丙胺涉毒人员的法庭辅助技术。
附图说明
图1示出了本发明鉴别甲基苯丙胺涉毒人群的分析流程图。
图2为本发明的PCR引物设计方案。
图3为甲基苯丙胺涉毒人群和对照人群肠道菌群的α多样性结果。纵坐标表示各样本估算的α多样性指数值。图中位于右侧的箱图为涉毒人群的结果；位于左侧的箱图为健康人群的结果。
图4为甲基苯丙胺涉毒人群和对照人群肠道菌群的β多样性结果。横坐标和纵坐标表示PCoA降维时两个主要成分的维度变量。位于右上一侧的圆点为健康人群样本；位于左下一侧的圆点为涉毒人群样本。
图5为不同菌门在甲基苯丙胺涉毒人群和对照人群的肠道微生物组中的相对丰度结果，其中hgHC代表的箱图为健康人群样本，hgMA代表的箱图为涉毒人群样本。
图6为甲基苯丙胺涉毒人群和对照人群之间有明显差异的代表菌群标志物，其中黑色图例代表涉毒人群，灰色代表健人群。
图7示出了在不同毒龄的甲基苯丙胺涉毒人员中，23个肠道菌属标志物的丰度分布结果，纵坐标表示该菌属在肠道微生物组中的相对丰度。
图8为涉毒人员甄别模型预测验证集中样本类型的受试者工作特征曲线(以下简称为ROC曲线)，横纵坐标分别代表模型预测的特异性和敏感性，曲线下面积AUC为0.993。
图9示出了根据小鼠模型数据所构建的甄别模型，预测验证集中样本类型的ROC曲线，横纵坐标分别代表模型预测的特异性和敏感性，曲线下面积AUC为0.903。
图10示出了根据复杂人群数据所构建的甄别模型，预测验证集中样本类型的ROC曲线，横纵坐标分别代表模型预测的特异性和敏感性，曲线下面积AUC为0.913。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为具体公开了该范围的上限和下限以及它们之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
本发明的用于鉴别甲基苯丙胺涉毒人群的方法、系统、标志物以及检测所述标志物的试剂均用于非疾病诊断和非治疗目的。
用于鉴别甲基苯丙胺涉毒人群的方法
本发明的检测方法中，受试者包括健康人群，优选健康中国人群，还优选涉嫌吸食甲基苯丙胺中国人群。在步骤a中，获取受试者的待测样本中的肠道菌群的信息，其中所述肠道菌群选自表3所示肠道菌的至少一种，或其组合，优选表3所示肠道菌的至少5种，还优选至少7种，进一步优选至少10种肠道菌，例如11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22或23种肠道菌。菌群的信息包括肠道菌群的种类及相对丰度。吸食甲基苯丙胺中国人群包括正在吸食甲基苯丙胺持续一定时间，如1个月以上、2个月以上、6个月或以上、1年以上、2年以上、3年以上或更长时间，或者已脱离毒品超过1周以上、2周以上、3周以上、1个月以上或3个月以上的人群。
在步骤b中，依据受试者肠道菌群数据与选自表3中至少5项指标的变化趋势一致性，判定受试者是否属于涉毒人群。优选地，依据选自表3中的至少10项指标与表3所示的变化趋势一致性，判定受试者是否属于为涉毒人群。例如，依据选自表3中11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22或23项指标与表3所示的变化趋势一致性，判定所述受试者是否属于涉毒人群。所述变化趋势一致性是指菌群丰度上升、下降趋势的一致性。这里的上升或下降趋势是指相对于对应的对照人群或健康人群或未吸食甲基苯丙胺之前的对应个体而言。
菌群标志物
本发明提供菌群标志物在鉴别甲基苯丙胺涉毒人群中的用途，发明人研究发现，特定的微生物或其组合作为标志物能够有效检测甲基苯丙胺涉毒人群，具有显著的特异性和敏感性。优选地，标志物包括表3所示的肠道菌的至少1种，优选表3所示肠道菌的至少5种，还优选至少7种，进一步优选至少10种。例如11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22或23种肠道菌。更优选地，本发明的菌群标志物由表3所示的23个代表菌属组成。表3中的菌株均进行了分类学上的确认，其中在涉毒人群中涉及表3中前10项所示肠道菌的丰度显著上升，表3中后13项所示肠道菌的丰度下降。
用于鉴别甲基苯丙胺涉毒人群的组合物
通过获取来自受试者待测样本的微生物标志物信息，能够实现甲基苯丙胺涉毒人群的精准检测。获取上述肠道菌群的信息可以通过设计特异性的引物或探针(例如荧光定量PCR等)，或基于测序方法(边合成边测序技术、单分子测序技术或纳米孔测序技术)获得相关的标志物序列信息。当采用上述技术方案时，优选地，所述组合物包括检测选自表3所示肠道菌的至少一种的16S rDNA或其部分序列的引物或探针，进一步优选地，所述组合物包括针对表3中的菌群中每个肠道菌的高变区设计特异性引物和/或探针，还优选针对所述菌群的V1-V9高变区的至少一个高变区设计特异性引物和/或探针。虽然本文没有示出所有明确的探针和引物序列，但本领域技术人员在已知本发明的上述标志物信息时，能够设计相应的探针和引物，并实现本发明的目的。
本发明中，所述组合物可选地包括扩增子测序用试剂，例如16S rDNA测序用试剂。可以理解，这里的试剂，包括用于提取上述肠道菌群的基因组的提取试剂、纯化试剂、缓冲试剂、测序引物、接头、定量试剂以及上机试剂等，并且上述试剂均可以通过市售试剂盒获得。
用于鉴别甲基苯丙胺涉毒人群的系统
本发明的系统包括数据采集单元，其用于获取来自受试者的表3中至少一种所示肠道菌群的数据或信息，所述数据或信息包括所述菌群种类和/或相对丰度。本发明的相对丰度可通过已知方法测量或确认。例如通过来自16S rDNA测序数据来测量或确认得到菌群的相对丰度。该测序数据优选经过预处理得到，预处理步骤包括使用QIIME 2(Quantitative Insights Into Microbial Ecology)进行样本拆分和数据处理；使用DADA2软件对数据降噪、去重复、去嵌合体等，从而获得干净的短序列读段进行reads拼接，生成feature表；使用GreenGene数据库注释OTU并进行微生物物种分类和注释。
本发明的数据处理单元包括存储的预测模型。其中，预测模型通过从肠道菌群中筛选作为标志的特异性菌群而获得。
在示例性实施方案中，本发明的筛选采用线性判别分析LEfSe(lineardiscriminant analysis effect size)算法，对训练集所有样本的肠道菌群构成及丰度进行深度分析。该算法使用Kruskal-Wallis rank sum test，计算样本组间差别的显著性；并进一步使用线性判别法，估计每个菌属的效应量，用以区分组间差异性。通过设定筛选参数阈值(显著性≤0.05，差异性≥2)，得到本发明的标志物，需要说明的是，本发明的标志物进一步与涉毒年限关联，从而进一步提高预测准确性。
本发明的示例性实施方案中，基于菌属标志物的种类和丰度的随机森林模型，使用randomForest软件包和caret软件包，在R语言平台上进行所述模型的构建。同时使用贪婪法构建不同参数组合的判别随机森林模型，再依据运算结果进行参数调整，判别森林模型的ROC曲线，将曲线下面积AUC值作为优选指标，重复至少50次进行交叉验证，将AUC面积最大的模型作为最终训练模型。
本领域的技术人员可以理解的是，本发明所述的各种示例性实施方案可以通过软件实现，也可以通过软件结合必要的硬件的方式来实现。因此，根据本发明的具体实施方案可以以软件产品的形式体现出来，该软件产品可以存储在一个非易失性存储介质或非暂态计算机可读存储介质(可以是CD-ROM，U盘，移动硬盘等)中或网络上，包括若干指令以使得计算设备(可以是个人计算机、服务器、移动终端、或者网络设备等)执行根据本发明的方法。
在示例性实施方案中，本发明的程序产品可以采用一个或多个可读介质的任意组合。可读介质可以是可读信号介质或者可读存储介质。可读存储介质例如可以为但不限于电、磁、光、电磁、红外线或半导体的系统、装置或器件，或者任意以上的组合。可读存储介质的更具体的实例包括但不限于：具有一个或多个导线的电连接、便携式盘、硬盘、随机存取存储器(RAM)、只读存储器(ROM)、可擦式可编程只读存储器(EPROM或闪存)、光纤、便携式紧凑盘只读存储器(CD-ROM)、光存储器件、磁存储器件、或者上述的任意合适的组合。
相应地，基于同一发明构思，本发明还提供一种电子设备。
在示例性实施方案中，电子设备以通用计算设备的形式表现。电子设备的组件可以包括但不限于：至少一个处理器、至少一个存储器、连接不同系统组件(包括存储器和处理器)的总线。
其中，所述存储器存储有程序代码，所述程序代码可以被所述处理单元执行，使得所述处理单元执行本发明所述的方法，其中处理器至少包括本发明所述的数据处理模块。存储器可以包括易失性存储单元形式的可读介质，例如随机存取存储单元(RAM)和/或高速缓存存储单元，还可以进一步包括只读存储单元(ROM)。
本发明的存储器还可以包括具有一组(至少一个)程序模块的程序/实用工具，这样的程序模块包括但不限于：操作系统、一个或者多个应用程序、其它程序模块以及程序数据，这些示例中的每一个或某种组合中可能包括网络环境的实现。
总线可以为表示几类总线结构中的一种或多种，包括存储器总线或者存储器控制器、外围总线、图形加速端口、处理单元或者使用多种总线结构中的任意总线结构的局域总线。
电子设备也可以与一个或多个外部设备(例如键盘、指向设备、蓝牙设备等)通信，还可与一个或者多个使得用户能与该电子设备交互的设备通信，和/或与使得该电子设备能与一个或多个其它计算设备进行通信的任何设备(例如路由器、调制解调器等等)通信。
这种通信可以通过输入/输出(I/O)接口进行。并且，电子设备还可以通过网络适配器与一个或者多个网络(例如局域网(LAN)，广域网(WAN)和/或公共网络，例如因特网)通信。网络适配器通过总线与电子设备的其它模块通信。应当明白，尽管本文未示出，可以结合电子设备使用其它硬件和/或软件模块，包括但不限于：微代码、设备驱动器、冗余处理单元、外部磁盘驱动阵列、RAID系统、磁带驱动器以及数据备份存储系统等。
本发明的系统或方法的检测/鉴别价值可通过例如计算AUC、灵敏度、特异度等评价指标来判断其效能。其中AUC被定义为ROC曲线下与坐标轴围成的面积，所述面积的数值范围在0.5和1之间。AUC越接近1.0，检测方法真实性越高。其中AUC在0.5-0.7时准确性较低，AUC在0.7-0.9时有一定准确性，AUC在0.9以上时有较高准确性。等于0.5时，则真实性最低，无应用价值。在具体实施方案中，本发明的系统具有不低于0.7的受试者工作特征曲线下面积，优选不低于0.8，还优选不低于0.90，甚至不低于0.95，不低于0.990，例如0.991、0.992、0.993、0.994、0.995、0.996、0.997、0.998、甚至不低于0.999。
此外，本发明的预测准确率不低于0.6，优选不低于0.7，还优选不低于0.9，例如0.910、0.920、0.930、0.940、0.950、0.960、0.970、0.980，甚至不低于0.990。在具体实施方案中，验证集涉毒人员的预测准确率达到94.12％，健康人员预测准确率达到100％。在保证无健康人员错误判定的同时，显著提高涉毒人员预测的准确率。
本领域技术人员应理解，只要能够实现本发明的目的，在上述步骤a、b前后，或步骤之间还可包含其他步骤或操作，例如进一步优化和/或改善本发明所述的方法。
实施例1
本发明用于鉴别甲基苯丙胺涉毒人群的分析流程如图1所示，共招募已脱离毒品超过3个月的甲基苯丙胺涉毒人员47名，以及健康志愿者(于当地社会招募，年龄性别构成与涉毒人群无显著差异，经过尿液检测和问卷收集)39名入组；通过采集粪便样本进行16SrDNA测序，获得其肠道微生物菌群结构信息。依据入组人员基本数据的分层信息，将他们分为训练集和验证集。其中，训练集包括30名涉毒人员和30名健康志愿者，验证集则包括17名涉毒人员和9名健康志愿者。通过菌群特征分析，获得训练集涉毒人员和健康对照之间具有显著差异的菌属；结合涉毒人员接触毒品的时间信息，筛选出与涉毒时间具有关联性的特征菌属，构成用于甄别涉毒人员的标志物的集合。使用随机森林模型对筛选出的标志物的集合进行数学建模，获得预测准确度较高，敏感性和特异性较强的预测模型。然后，对源自验证集人群的肠道微生物16S rDNA测序数据进行预测分类，从而验证该甄别模型的准确性。
1.人群队列招募
自当地戒毒所共招募甲基苯丙胺涉毒人员47名，涉毒时间最短小于1年、最长16年。入组标准为：1)男性，20-50岁；2)涉毒类型单一，脱离毒品时间超过3个月；3)身体健康，无艾滋病及其它感染性疾病、慢性疾病；
4)过去3个月内未使用过抗生素、益生菌、益生元、合生元等可能影响肠道菌群的药物。
作为对照，自当地招募健康志愿者39名，要求从未接触过甲基苯丙胺或任何其它毒品，其余入组标准与涉毒人群相同。对照人群与涉毒人群饮食结构相似，且卡方检验表明其人员基本数据方面无统计学差异。
在保证基本数据无显著偏倚的前提下，将入组人员随机分为两个样本集合：1)为构建随机森林模型的训练集，共60人(涉毒30人，对照30人)；2)为检验模型对涉毒人员甄别效果的验证集，共26人(涉毒17人，对照9人)。相关队列信息详见表1和表2。
表1训练集人群基本信息
表2验证集人群基本信息
2.样本采集
选取装有样本保存液的无菌样本采集管，利用其中的采集器采集入组人员的新鲜粪便样本，并立即将样本完全浸入样本保存液中。样本在保存液中可常温保存7天，在运送至实验室后，-80℃冰箱冻存。
3.微生物组DNA提取
采用 DNA Isolation kit(MO BIO Laboratories Inc.，美国)，提取粪便样本DNA。具体操作方法按照试剂盒使用说明实施，简述如下：
(1)将适量样本分别转移至装有缓冲液和不规则研磨珠的PowerBead Tubes中，然后加入含有SDS等去垢剂的细胞裂解液，充分混匀后3200rpm漩涡震荡10min；从而协助粪便样本充分均质化、初步溶解腐植酸，并且在化学裂解和机械研磨的共同作用下，充分释放细胞内容物。
(2)将离心(10000g，30s)后上清液转移至新收集管中，加入含有PCR抑制因子去除试剂的缓冲液，涡旋混匀后4℃孵育5min；从而沉淀会影响DNA纯度和下游实验的非DNA的有机、无机物质，如腐植酸、细胞碎片、蛋白质等。
(3)将离心(10000g，1min)后上清液转移至新收集管中，加入1.6倍体积的高浓度盐溶液；充分混匀后，转移至具有硅胶滤膜的离心柱Spin Filter上，从而使DNA在高盐环境下高效吸附在滤膜上。
(4)室温离心(10000g，1min)弃去滤液，加入含有酒精的冲洗缓冲液，通过离心进一步去除滤膜上的盐份、腐植酸等非DNA杂质。
(5)将Spin filter转移到新的收集管中，加入去除DNA的无菌水，离心(10000g，30s)洗脱吸附在硅胶滤膜上的DNA；样本利用Qubit 4荧光光度计(ThermoFisherScientific，美国)以及1％琼脂糖凝胶电泳进行定量、质检后，冷冻保存于-20℃～-80℃，或直接应用于16S rDNA建库。
4.肠道微生物组16S rDNA建库与测序
针对16S rDNA基因的V4可变区(nt 515-860)，通过两步PCR(PCR 1和PCR 2)完成16S rDNA扩增子文库的构建。每个文库中容纳10份样本。PCR引物设计方案如图2，PCR 1为每个文库中的独立样本添加具有特征序列的Barcode(12nt)，PCR 2则为同一文库中的所有样本添加统一的Illumina index(6nt)，后者可以对不同文库样本进行拆分。PCR 1引物识别的16S rDNA基因序列为F：(+)5'-GTGYCAGCMGCCGCGGTAA-3'，R：(+)5'-ATTAGAWACCCBNGTAGTCC-3'；为了可以对样本进行精确拆分，本发明还在Barcode与16S rDNA基因识别序列间加入Spacer(0-4nt)。
(1)经Qubit定量，每个样本取40ng微生物组DNA模板在50μL反应体系中进行PCR 1扩增，退火温度为60℃，共25个循环。使用胶回收试剂盒Zymoclean Gel DNARecovery Kit(ZYMO RESEARCH，美国)，对PCR 1扩增产物胶回收，20μL无菌水洗脱。利用Qubit 4荧光光度计进行DNA定量。
(2)按10份样品/文库、等量(20ng/样品)混合，并依次为模板在100μL反应体系中进行PCR 2扩增，退火温度为60℃，共10个循环。使用胶回收试剂盒Zymoclean GelDNARecovery Kit，对PCR 2扩增产物胶回收，20μL无菌水洗脱。利用Qubit 4荧光光度计进行DNA定量，库检要求扩增产物浓度≥3ng/μL。
文库经库检合格后上机测试，利用Illumina NGS测序平台进行Paired-end测序，测序读长250bp。每文库测序量为1G raw data(2M raw reads)。
5.甲基苯丙胺涉毒人群与对照人群间肠道菌群的差异展示
针对高质量16S rDNA测序数据，使用QIIME 2分析平台进行样本拆分和数据预处理；使用DADA2(Divisive Amplicon Denoising Algorithm)软件对数据降噪、去重复、去嵌合体等，从而获得干净的短序列读段进行reads拼接，生成feature表；使用GreenGene数据库注释OTU并进行微生物物种分类和注释。
α多样性评估显示，虽然在甲基苯丙胺涉毒人群与对照人群中观察到的肠道菌群OTU数量没有显著差异(p>0.05，图3中A所示)，但是涉毒人群的faith_pd指数明显升高(p<0.05，图3中B所示)。这说明尽管物种绝对数量相近，但是甲基苯丙胺涉毒人群的肠道菌群物种间进化距离更远，因此其肠道微生物构成的丰富度也更高。相对应的，用于衡量微生物相对丰度均一性(即均一度)的两个指标，Shannon指数和Simpson指数，在两个人群中均无显著差异(图3中C和D)。
通过主坐标分析，分析甲基苯丙胺涉毒人群与对照人群的肠道微生物的β多样性。结果显示，两组样本之间菌群构成的jaccard距离，明显超过其组内各样本间的jaccard距离，即通过肠道微生物组数据能够很好地区分两个人群，具有统计学差异(p<0.001)(图4)。
具体到两个人群肠道微生物组在菌门水平的差异(图5)，可见4个菌门在甲基苯丙胺涉毒人群样本中的丰度显著升高(p<0.05)，包括古生菌菌门(Euryarchaeota)、黏胶球形菌门(Lentisphaerae)、互养菌门(Synergistetes)和疣微菌门(Verrucomicrobia)；2个菌门在涉毒人群样本中的丰富显著降低(p<0.05)，包括放线菌门(Actinobacteria)和蓝细菌菌门(Cyanobacteria)。
6.涉毒人员甄别标志物筛选
采用线性判别分析LEfSe算法，对训练集所有样本的肠道菌群构成及丰度进行深度分析(图6)。该算法使用Kruskal-Wallis rank sum test，计算样本组间差别的显著性；并进一步使用线性判别法，估计每个菌属的效应量，用以区分组间差异性。通过设定筛选参数阈值(显著性≤0.05，差异性≥2)，一共获得55个代表菌属，其中包含甲基苯丙胺涉毒人群的代表菌属27个、健康对照人群的代表菌属28个。
通过分析55个代表菌属丰度与涉毒年限的相关性，发现甲基苯丙胺涉毒人群的肠道微生物组中，10个上调菌属和13个下调菌属与涉毒行为存在量效关系(图7)。因此，选择这23个代表菌属，作为甄别涉毒人员的标志物，进行后续数学模型建立与评估(表3)。
表3.甄别甲基苯丙胺涉毒人员的标志物
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7.涉毒人员甄别模型构建
为了将筛选到的菌属标志物应用到刑侦实践活动，采用了机器学习的方法和本例中肠道微生物组训练数据集，构建基于菌属标志物种类和丰度的随机森林模型。使用randomForest软件包和caret软件包，在R语言平台上进行模型构建。选择上述包含23个代表菌属的标志物(表3)，提取了它们在训练集所有60个肠道微生物组样本中的相对丰度数据，作为训练模型的特征变量，既模型的输入变量。模型的输出变量是对甲基苯丙胺涉毒人员的分类概率(Predicted MA value)和健康人群的分类概率(Predicted HC value)，Predicted HC value＝1-Predicted MA value，设置涉毒人员的判定阈值为Predicted MAvalue>0.5。
构建随机森林模型需评估决策树数量和用于二叉树分支决策的变量个数。在采用默认参数设置的基础上，使用贪婪法构建不同参数组合的判别随机森林模型，再依据运算结果进行参数调整，判别森林模型的ROC曲线，将曲线下面积AUC值作为优选指标，重复50次进行交叉验证，将AUC面积最大的模型作为最终训练模型。构建的最优随机森林分类器模型决策树数量为210，用于二叉树分支决策的变量数为1，AUC值最高为0.998。
8.涉毒人员甄别模型效果评估
为了评估依据60例训练集样本建立的甲基苯丙胺涉毒人员甄别模型的判定效果，采集、分析了另外17名涉毒人员和9名健康志愿者的肠道微生物组数据作为验证集。通过将测试集数据输入涉毒人员甄别模型中，获得每例样本的甲基苯丙胺涉毒人员分类概率，可知该模型准确度为96.15％，置信区间为0.8036到0.999，结果详见表4。ROC曲线显示，验证集涉毒人员的预测准确率达到94.12％，健康人员预测准确率达到100％(图8)。
表4.涉毒人员甄别模型对验证集数据的预测结果
采用递归特征消除筛选法检测是否存在菌属最优组合。同样使用上述所用方法构建随机森林，重复50次交叉验证，通过对输入变量涉毒人群和健康人群分组概率统计，选择最优的菌属组合。由表5可知，23个差异显著的肠道特征菌属组合时预测精确度最高，ROC曲线下面积最大。
表5.菌属递归消除筛选最佳菌属组合
效果例1
本效果例为实施例1的方案与基于小鼠模型得到的菌群标志物的甄别效果比较。
小鼠与大鼠是药物成瘾研究中的常用模式动物。但是在肠道菌群研究中，由于存在明显的物种特异性，所以难于将从小鼠/大鼠中得到的相关成果直接应用于涉毒人群。为了说明本发明的独特性，本发明从甲基苯丙胺成瘾小鼠模型中筛选得到一组甄别标志物，并与本发明中获得的标志物组合的甄别效果进行了比较。
30只C57小鼠被随机分为两组，既甲基苯丙胺涉毒组和对照组。涉毒组小鼠连续7天腹腔注射甲基苯丙胺，而对照组小鼠连续7天注射生理盐水；其后连续戒断14天，并在模型建立的第7、14、28天进行肠道微生物组检测。行为学监测数据表明，甲基苯丙胺涉毒组小鼠已发生明显的药物成瘾。
所得测序数据分析流程和方法同本发明实施例1。采用LEfSe算法，在三个时间点一共获得35个成瘾相关代表菌属。其中，10个菌属为小鼠特有的肠道微生物；另外25个菌属在本发明人群的肠道微生物组样本中也被鉴定到，但仅有8个菌属在甲基苯丙胺涉毒人群中存在显著差异。利用小鼠模型筛选得到的标志物组合，基于本比较例所用涉毒人群构建随机森林模型(图9)，模型准确度仅为75.6％，特异性达到100％时，灵敏性仅为40％，无法达到法庭辅助技术要求，说明通过动物模型很难获得能够有效甄别涉毒人群的生物标志物。
效果例2
本效果例为实施例1的方案与基于复杂人群得到的菌群标志物的甄别效果比较。
目前已公开的甲基苯丙胺涉毒人群肠道微生物组研究，主要是由美国洛杉矶加州大学研究团队开展的，文章和数据发表于The Journal of Infectious Diseases(2018)和Scientific Reports(2019)。该队列构成复杂，同性恋、HIV感染者和同时服用多种毒品者占比很高。相关研究仅得到了10个甲基苯丙胺涉毒相关的代表菌属，包括在涉毒人群中丰度上升的梭杆菌属(Fusobacterium)、颗粒链菌属(Granulicatella)、和厌氧球菌属(Anaerococcus)，以及丰度下降的副拟杆菌(Parabacteroides)、柯林斯菌属(Collinsella)、副普雷沃氏菌(Paraprevotella)、Fusicatenibacter、布劳特氏菌属(Blautia)、瘤胃菌属(Ruminococcus)和厌氧棍状菌属(Anaerotruncus)。这些结果与同团队得到的男同性恋肛交行为或HIV感染相关的代表菌属较为类似，而与本发明差别较大。例如，副拟杆菌(Parabacteroides)、副普雷沃氏菌(Paraprevotella)和瘤胃菌属(Ruminococcus)在本发明的甲基苯丙胺涉毒人群中丰度明显上升。
为了比较复杂人群中得到的菌群标志物的甄别效果，本比较例使用其文章中报道的10个甲基苯丙胺涉毒相关的代表菌属作为标志物组合，构建随机森林模型(方法同实施例1)(图10)。结果显示模型准确度为81.7％，特异性达到100％时，敏感性为0，无法达到法庭辅助技术要求。需要指出的是，该模型的构建同样使用了实施例1的60例训练集样本(包括30名甲基苯丙胺涉毒人员和30名健康志愿者)。这不但忽视了不同人群得到的同一代表性菌属的丰度变化趋势差异，也规避了复杂人群作为模型构建训练集导致的模型预测准确度下降，从而大大提高了复杂人群中得到的菌群标志物的甄别效果。因此，基于复杂队列的研究也很难对其中单一因素导致的肠道微生物改变进行有效甄别。
综上，从甲基苯丙胺成瘾小鼠模型以及美国涉毒复杂人群中，可以分别筛选得到35个和10个甲基苯丙胺相关代表菌属；它们与实施例1所采用的23个肠道微生物标志物相比，分别有8个和4个相同的代表菌属。将实施例1中的标志物组合替换为其它两个组合，其模型准确度为分别降至75.6％和81.7％，显著低于实施例1的结果。
尽管本发明已经参考示例性实施方案进行了描述，但应理解本发明不限于公开的示例性实施方案。在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的示例性实施方案做多种调整或变化。权利要求的范围应基于最宽的解释以涵盖所有修改和等同结构与功能。

Claims (10)

1.试剂在制备用于鉴别甲基苯丙胺涉毒人群的组合物中的用途，其特征在于，所述试剂包括能够检测以下所示肠道菌群的组合的异常的试剂：
。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述试剂包括扩增子测序用试剂，或特异性引物或探针。
3. 根据权利要求2所述的用途，其特征在于，所述引物或探针为用于检测权利要求1中所示肠道菌的16S rDNA或其部分序列的引物或探针。
4.一种用于鉴别甲基苯丙胺涉毒人群的系统，其特征在于，包括：
数据采集单元，其用于获取来自受试者的以下所示肠道菌群的组合的数据，所述数据包括所述肠道菌群的种类及相对丰度：
；
数据处理单元，其用于对所述数据采集单元中获取的数据进行处理，包括将所述数据输入预测模型，根据预设阈值，判断所述受试者是否为涉毒人群。
5.根据权利要求4所述的用于鉴别甲基苯丙胺涉毒人群的系统，其特征在于，所述预测模型通过以下步骤得到：
a. 构建基于涉毒人群和对照人群等比例分布的训练集和验证集；
b. 获取受试者肠道菌群的种类及相对丰度数据；
c. 通过比较涉毒人群和对照组人群菌群种类及相对丰度，获得具有组间差异的代表菌属及其丰度；
d. 结合涉毒人群涉毒行为年份，进一步筛选代表菌属中与涉毒行为存在量效关系的菌属；
e. 通过机器学习方法进行模型构建，以菌群的种类和丰度作为输入变量，通过涉毒样本和对照样本菌属丰度训练模型并得到输出变量，所述输出变量包括涉毒人群和健康人群的分类概率，通过验证集进行模型的验证。
6.根据权利要求5所述的用于鉴别甲基苯丙胺涉毒人群的系统，其特征在于，进一步通过递归特征消除方法删除掉不具有显著区别的菌群种类。
7.根据权利要求6所述的用于鉴别甲基苯丙胺涉毒人群的系统，其特征在于，所述机器学习包括决策树、支持向量机、随机森林或其组合。
8.根据权利要求6所述的用于鉴别甲基苯丙胺涉毒人群的系统，其特征在于，设置所述预测模型的判定阈值为>0.5。
9.一种用于甲基苯丙胺涉毒人群鉴别的电子设备，包括存储器、处理器及存储在存储器上并可在处理器上运行的计算机程序，其特征在于，所述处理器执行所述计算机程序时实现利用预测模型得到甲基苯丙胺涉毒人员分类概率的步骤，包括：获取患者的特征数据，输入权利要求4-8中任一项所述系统中的预测模型，得到甲基苯丙胺涉毒人员分类概率值，所述特征数据包括以下所示肠道菌群的组合的种类及相对丰度：
。
10.一种非暂态计算机可读存储介质，其上存储有计算机程序，其特征在于，该计算机程序被处理器执行时实现利用预测模型得到甲基苯丙胺涉毒人员分类概率的步骤，包括：获取患者的特征数据，输入权利要求4-8中任一项所述系统中的预测模型，得到甲基苯丙胺涉毒人员分类概率值，所述特征数据包括以下所示肠道菌群的组合的种类及相对丰度：
。
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