CN103993007A

CN103993007A - 一种从土壤样品中高效提取dna的简易方法

Info

Publication number: CN103993007A
Application number: CN201410249559.8A
Authority: CN
Inventors: 王记鲁; 毛大庆; 罗义
Original assignee: Nankai University
Current assignee: Nankai University
Priority date: 2014-06-09
Filing date: 2014-06-09
Publication date: 2014-08-20
Anticipated expiration: 2034-06-09
Also published as: CN103993007B

Abstract

一种从土壤样品中高效提取DNA的简易方法，本发明方法针对不同的土壤样品利用玻璃珠研磨、液氮反复冻融、SDS和溶菌酶、蛋白酶K法等方法组合，使环境样品中的DNA充分释放暴露，通过多次酚仿抽提过程进行DNA的纯化，并且通过加入内标菌株Xcc8004的方式进行DNA提取效率的测定。本发明所述方法对于样品的预处理要求简单、所需的环境样品量较少，得到的DNA浓度和纯度较高，而且提取效率较高，能够满足复杂环境样本中抗生素抗性基因污染的分析检测，方法简单可靠，具有实际应用价值。

Description

一种从土壤样品中高效提取DNA的简易方法

技术领域

本发明涉及一种环境样品特别是土壤样品中微生物DNA的简易提取方法，该方法借助生物技术手段，对环境土壤样品进行处理，属于环境科学与生物工程技术领域。

背景技术

抗生素抗性基因在自然环境中广泛的存在和传播扩散引起了巨大的环境和健康风险，有必要对自然环境中抗性基因的数量进行准确地检测。土壤介质是自然界微生物栖居较多的场所，目前已经在DNA分子水平上对土壤微生物的多样性和抗性基因的数量检测等方面进行了较多研究。土壤样品DNA提取过程主要包括细胞壁裂解、蛋白质和多糖去除以及DNA沉淀回收等环节。但是由于土壤基质复杂、干扰严重，如腐殖酸通过非特异性吸附降解核酸或抑制酶活性、干扰微生物细胞裂解，许多方法提取出来的DNA由于浓度和纯度不高而难以直接应用于后续分子生物学技术操作，如核酸内切酶酶切消化、PCR-DGGE、核酸分子杂交等。此外，在DNA的抽提过程中常常会残留蛋白质、腐殖酸等杂质，影响后续PCR定性和定量的检测分析，通常在用苯酚/氯仿/异戊醇抽提或过柱法去除杂质的过程中也会对核酸成分造成一定量的损失，因此DNA的提取效率也是准确地反映土壤中抗性基因数量的关键。

目前一些商业化的土壤DNA提取试剂盒对于不同类型的样品，其DNA的提取效率、浓度和纯度也往往有较大的差异，有些甚至无法满足后续各种分子生物学操作的要求。因此建立一种高效的土壤样品DNA提取方法至关重要。

本发明成果受国家环保公益专项基金（201309031）、国家自然科学基金（31270542）资助支持。

发明内容

本发明的目的是解决现有微生物DNA提取方法存在提取DNA量少、纯度不高、提取效率低，所用试剂价格昂贵等问题，而提出的一种高效提取DNA的简易方法。依据本发明方法可以计算DNA的提取效率，并且能得到可直接用于后续分子生物学操作的高纯度DNA。本发明关于提取效率的创新之处在于向未经灭菌的土壤样品中直接加入内标菌。

本发明提供的从土壤样品中高效提取DNA的简易方法，对于不同的土壤、粪便和水体沉积物样品均具有较好的DNA提取效果，并且该方法引入了DNA提取效率的指标，该指标是指通过在待提取的土壤样品中加入已知数量的内标细菌Xcc8004（Xanthomonas campestris pv. Campestris, Xcc8004，十字花科黑腐病菌，是一类γ-变形菌纲的革兰氏阴性细菌），利用该菌基因组上的Xc2068基因的单拷贝的特点，提取DNA之后对该基因进行实时荧光定量PCR确定其拷贝数量，以此计算出DNA的提取效率。加入内标菌之前的土壤样品DNA经过PCR反应检测不到目的基因Xc2068的存在。

本发明方法的具体步骤为：

第1：内标菌Xcc8004的培养；

第1.1：内标菌Xcc8004培养基的配制；

内标菌Xcc8004是一种革兰氏阴性菌，具有利福平抗性。该菌使用的培养基为NYG（Nutrient Yeast Glycerol）培养基。培养基的配方为：质量分数为0.5%的蛋白胨，质量分数为0.3%的酵母提取物，质量分数为2%的甘油，以及琼脂粉质量分数为1%的固体培养基，调节培养基的pH为7.0。利福平抗生素母液的配制浓度为10mg/ml，溶剂为甲醇，其作用浓度为50μg/ml。

第1.2：培养；

将Xcc8004菌接入到NYG液体培养基，置于28℃恒温振荡培养箱中振荡培养20h；

第1.3、Xcc8004菌液浓度的确定；

对第1.2步培养的Xcc8004菌采用涂布平板法或流式细胞仪法进行计数，确定菌液浓度；

第1.3.1：涂布平板法计数

将培养20h的菌液进行10倍梯度稀释，稀释9个梯度。每个梯度浓度下的菌液取100μL涂利福平抗性的NYG固体培养基平板，每个浓度设置3个平行。

第1.3.2：流式细胞仪法计数

将培养20h的菌液用SYBR Green染料染色15分钟，稀释20000倍，取1mL样品进样，调节进样流速，读取细菌数量。

第2：土壤样品DNA提取；

第2.1：土壤样品微生物细胞裂解；

称取0.5g环境样品于10mL无菌离心管中，取200μL第1.3步培养的内标菌液加入到样品中，其浓度为10⁸-10⁹CFU/g土壤。加入0.2g玻璃珠和1.5mL DNA提取液进行提取（每克土壤样品可加入3mL DNA提取液），涡旋震荡至混匀，然后加入20μL 100mg/ml的溶菌酶，37℃水浴30分钟，中间轻晃离心管2次；其中，DNA 提取液包括100mM Tris-HCl、100mM Na₂EDTA、1.5M NaCl、1% β-巯基乙醇、1×PBS Buffer、质量浓度为1%的PVP40000 (Polyvinyl pyrrolidone)和质量浓度为2%的CTAB (Hexadecyl trimethyl ammonium Bromide)；

将土壤样品进行冻融操作，离心管置于液氮中2分钟，再置于65℃水浴中10分钟，重复此操作一次；再向离心管中加入0.5mL质量浓度为20%的SDS溶液和10μL 20mg/mL的蛋白酶K，58℃水浴1h，中间轻晃离心管2-3次；取出样品，6000×g离心10分钟，取上清液置于2mL的无菌离心管中；

第2.2：DNA溶液的获得；

向第2.1步中得到的上清液中，加入15μL 20mg/ml的RNA酶，37℃水浴40分钟去除RNA，加入等体积的体积比为苯酚：氯仿：异戊醇=25:24:1的混合液，上下颠倒混匀进行抽提，在4℃下13000×g离心10分钟，取上层液体置于新的2mL无菌离心管中，重复此操作一次；用体积比为氯仿：异戊醇=24:1的混合液再抽提新获得的上层液体一次，4℃下13000×g离心10分钟，取出上层液体，置于1.5mL的无菌离心管中；

第2.3：粗DNA的纯化溶解；

向第2.2步中得到的液体中加入0.1倍体积的3M NaAc溶液，混匀后再加入0.6倍体积的异丙醇，-20℃时静置60分钟，13000×g离心10分钟，弃去上清液，用0.5mL体积比为70%的冷乙醇洗涤沉淀，吹打使DNA浮起，10000×g离心2分钟，重复洗涤一次，弃去乙醇后风干沉淀30分钟，用30μL的65℃预热的TE缓冲液溶解DNA，TE缓冲液为pH=8.0的10mM Tris-HCl和1mM EDTA混合溶液。

第3：内标基因的定量；

利用实时荧光定量PCR检测提取的DNA中所含内标菌Xcc8004中的目的基因的拷贝数量。实时荧光定量PCR的引物序列及退火温度见实施例2。

用于计算DNA提取效率的内标菌Xcc8004（Xanthomonas campestris pv. campestris 8004），是野油菜黄单胞菌野油菜致病菌种，属于γ-变形菌纲的革兰氏阴性细菌；该菌的全基因组测序已经完成，目的基因Xc2068在该菌的基因组上具有单拷贝的特点，而且在所要提取DNA的环境样品中检测不到。

本发明的优点和积极效果：

本发明所述的方法可以使用较少的样品，利用玻璃珠研磨、液氮反复冻融、SDS法和溶菌酶、蛋白酶K法等物理、化学及生物方法组合，使不同的环境样品中微生物细胞破裂并使DNA充分释放暴露出来。通过紫外分光光度计检测，提取出的DNA的OD260/OD280可以达到1.38，OD260/OD230可以达到1.82，可以进行后续的分子操作，实用性较强。通过DNA的提取效率分析，该方法的DNA提取率可以达到67%，表明该方法可靠性程度较高。

附图说明

图1是内标菌Xcc8004显微镜形态观察；

图2是提取土壤样品中DNA的电泳图谱；

第1泳道：野外土壤样品中微生物DNA，

第2泳道：公园土壤样品中微生物DNA，

第3泳道：温室土壤样品中微生物DNA；

图3是提取土壤样品中DNA扩增Xc2068电泳图谱；

第1泳道：野外土壤样品中Xc2068，

第2泳道：公园土壤样品中Xc2068，

第3泳道：温室土壤样品中Xc2068，

第4泳道：阴性对照；

图4是提取土壤样品中DNA扩增16S rDNA电泳图谱；

第1泳道：野外土壤样品中16S rDNA，

第2泳道：公园土壤样品中16S rDNA，

第3泳道：温室土壤样品中16S rDNA，

第4泳道：阴性对照；

图5是Xc2068基因定量标准曲线。

具体实施方式

下面按照具体实施案例对本发明进行进一步的描述。

实施例1：土壤样品中DNA的提取；

（1）内标菌Xcc8004的培养；

将Xcc8004菌接种到NYG液体培养基，置于28℃恒温振荡培养箱中振荡培养20h；采用涂布平板法或流式细胞仪法确定菌液浓度；

其中，NYG液体培养基的配方为：质量分数为0.5%的蛋白胨，质量分数为0.3%的酵母提取物，质量分数为2%的甘油，以及琼脂粉质量分数为1%的固体培养基，调节培养基的pH为7.0；利福平抗生素母液的配制浓度为10mg/ml，溶剂为甲醇，作用浓度为50μg/ml；

内标菌Xcc8004的显微镜形态观察如附图1所示；

（2）土壤样品中微生物细胞裂解；

称取0.5g土壤样品于10mL无菌离心管中，将200μL第（1）步培养的内标菌液加入到样品中混匀（约10⁸-10⁹CFU/g土壤）。加入0.2g玻璃珠和1.5mL DNA提取液，涡旋震荡至混匀，然后加入20μL 100mg/ml的溶菌酶，37℃水浴30分钟，中间轻晃离心管2次；其中，DNA提取液包括100mM Tris-HCl、100mM Na₂EDTA、1.5M NaCl、1% β-巯基乙醇、1×PBS Buffer、质量浓度为1%的PVP40000和质量浓度为2%的CTAB；

将离心管置于液氮中2分钟，再置于65℃水浴中10分钟，重复此操作一次；再向离心管中加入0.5mL质量浓度为20%的SDS溶液和10μL 20mg/mL的蛋白酶K，58℃水浴1h，中间轻晃离心管2-3次；取出样品，6000×g离心10分钟，取上清液置于2mL的无菌离心管中；

（3）DNA溶液的获得；

向第（2）步中分离得到的上清液中，加入15μL 20mg/ml的RNA酶，37℃水浴40分钟去除RNA，加入等体积的体积比为苯酚：氯仿：异戊醇=25:24:1的混合液，上下颠倒混匀进行抽提，4℃、13000×g离心10分钟，取上层液体置于新的2mL无菌离心管中，重复此操作一次；用体积比为氯仿：异戊醇=24:1的混合液再抽提新获得的上层液体一次，4℃、13000×g离心10分钟，取上层液体，置于1.5mL的无菌离心管中；

（4）微生物DNA的纯化溶解；

向第（3）步中得到的液体中加入0.1倍体积的3M NaAc溶液，混匀后再加入0.6倍体积的异丙醇，-20℃时静置60分钟，13000×g离心10分钟，弃去上清液，用0.5mL体积比为70%的冷乙醇洗涤沉淀，吹打使DNA浮起，10000×g离心2分钟，重复洗涤一次，弃去乙醇后风干沉淀30分钟，用30μL的65℃预热的TE缓冲液溶解DNA。TE缓冲液为pH=8.0的10mM Tris-HCl和1mM EDTA混合溶液。

（5）内标基因的定量；

利用实时荧光定量PCR检测提取的DNA中所含内标菌Xcc8004中的目的基因Xc2068的拷贝数量。实时荧光定量PCR的引物序列及退火温度见实施例2

利用实施例1所述方法提取来自三种土壤样品中的微生物DNA。利用核酸蛋白检测仪对所提取的DNA进行OD260/OD280、OD260/OD230的测定，使用实时荧光定量PCR进行提取效率的测定，结果见表1。结果显示用本发明中的方法提取来自土壤中的DNA其OD260/OD280值接近1.30，说明提取样品中蛋白质残留较少；其OD260/OD230值不低于1.60，说明腐殖酸类等的其它杂质少；而且DNA的提取效率均高于44%。因此，本发明适合提取土壤样品中微生物DNA。此外本发明的应用范围不仅包括土壤，对于粪便和水体底泥等介质，提取的DNA质量和提取效率也较高。

三种土壤样品DNA提取琼脂糖凝胶电泳图如附图2所示；

表1：提取三种土壤样品中微生物DNA纯度及提取效率检测

实施例2：PCR检验；

（1）目的基因引物序列

（2）定性PCR反应程序

（3）实时荧光定量PCR反应程序

（4）定性PCR反应体系

目的基因Xc2068和16S rDNA经PCR扩增之后琼脂糖凝胶电泳图如附图3和附图4所示；

（5）定量PCR反应体系

目的基因Xc2068实时荧光定量PCR标准曲线如附图5所示。

<110> 南开大学

<120> 一种从土壤样品中高效提取DNA的简易方法

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

agagtttgat cctggctcag 20

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

ggttaccttg ttacgactt 19

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 3

tcctcggcaa cctctatgtg 20

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 4

acagcagcgg gtcttcctc 19

Claims

1.一种从土壤样品中高效提取DNA的简易方法，其特征在于步骤如下：

第1、内标菌Xcc8004的培养；

第1.1、内标菌Xcc8004培养基的配制；

Xcc8004菌是一种革兰氏阴性菌，具有利福平抗性，该菌使用的培养基为NYG (Nutrient Yeast Glycerol）培养基；培养基的配方为：质量分数为0.5%的蛋白胨，质量分数为0.3%的酵母提取物，质量分数为2%的甘油，以及琼脂粉质量分数为1%的固体培养基，调节培养基的pH为7.0；利福平抗生素母液的配制浓度为10mg/ml，溶剂为甲醇，作用浓度为50μg/ml；

第1.2、培养；

第1.3、Xcc8004菌液浓度的确定；

第2、土壤样品DNA提取；

第2.1、微生物细胞裂解；

将第1步培养的内标菌Xcc8004加入到0.5g土壤样品中混匀，其浓度为10⁸-10⁹CFU/g土壤，加入0.2g玻璃珠和1.5mL DNA提取液进行涡旋震荡至混匀，然后加入20μL 100mg/ml的溶菌酶，37℃水浴30分钟，中间轻晃离心管2次；其中，DNA提取液包括100mM Tris-HCl、100mM Na₂EDTA、1.5M NaCl、1% β-巯基乙醇、1×PBS Buffer、质量浓度为1%的PVP40000 (Polyvinyl pyrrolidone)和质量浓度为2%的CTAB (Hexadecyl trimethyl ammonium Bromide)；

将土壤样品进行冻融操作两次，具体为液氮中放置2分钟然后65℃水浴10分钟；再加入0.5mL质量浓度为20%的SDS溶液和10μL 20mg/mL的蛋白酶K，58℃水浴1h；取出离心管，6000×g离心10分钟，将上清液置于2mL无菌离心管中备用；

第2.2、DNA溶液的获得；

向第2.1步中分离得到的上清液中，加入15μL 20mg/ml的RNA酶，37℃水浴40分钟去除RNA，加入等体积的体积比为苯酚：氯仿：异戊醇=25:24:1的混合液，上下颠倒混匀进行抽提，4℃、13000×g离心10分钟，取上层液体置于新的无菌离心管中，重复此操作一次；

再用体积比为氯仿：异戊醇=24:1的混合液抽提新获得的上层液体一次，4℃、13000×g离心10分钟，将上清液置于无菌离心管中；

第2.3、粗DNA的纯化溶解；

向第2.2步中得到的液体中加入0.1倍体积的3M NaAc溶液，混匀后再加入0.6倍体积的异丙醇，-20℃时静置60分钟，13000×g离心10分钟，弃去上清液，用0.5mL 体积比为70%的冷乙醇洗涤沉淀，吹打使DNA浮起，10000×g离心2分钟，重复洗涤一次，弃去乙醇后风干沉淀30分钟，用30μL的65℃预热的TE缓冲液溶解DNA，TE缓冲液为pH=8.0的10mM Tris-HCl和1mM EDTA的混合溶液；

第3、内标基因的定量；

利用实时荧光定量PCR检测提取的DNA中所含内标菌Xcc8004中的目的基因的拷贝数量。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于用于计算DNA提取效率的内标菌Xcc8004（Xanthomonas campestris pv. campestris 8004），是野油菜黄单胞菌野油菜致病菌种，属于γ-变形菌纲的革兰氏阴性细菌；该菌的全基因组测序已经完成，目的基因Xc2068在该菌的基因组上具有单拷贝的特点，而且在所要提取DNA的样品中检测不到。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于第1.3步中Xcc8004菌数量的具体确定步骤如下：

涂布平板法：将培养20h的菌液进行10倍梯度稀释，稀释9个梯度，每个梯度浓度下的菌液取100μL涂利福平抗性的NYG固体培养基平板，每个浓度设置3个平行；

流式细胞仪法：将培养20h的菌液用SYBR Green染料染色15分钟，稀释20000倍，取1mL样品进样，调节进样流速，读取细菌数量。