CN109337900A - 一种高效经济的土壤微生物dna提取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明为一种高效经济的土壤微生物DNA提取方法。该方法包括如下步骤:步骤一:获取微生物悬液;称取1克土壤,加入2 ml悬浮缓冲液Buffer C1,并加入1克粒径0.09‑0.12 mm的玻璃珠,加入500μL的腐殖酸吸附剂Buffer C2,加入10μL蛋白酶K(10 mg/mL),混合后震荡;步骤二:获取微生物DNA;步骤三:获取粗制DNA;将上步得到的物质搅拌下置于60℃下水浴,然后4℃条件下高速离心,收集第一上清液;步骤四:获取精制DNA。本发明立足于土壤污染微生物检测的需要,能从土壤、粪便等复杂环境样品中提取不含抑制因子的DNA,提取速度快、分析结果准确。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域,具体涉及一种快速提取土壤微生物DNA的提取方法。
背景技术
由于污水灌溉、粪便施肥以及医院废水排放等工农业生产,使得土壤中微生物污染形势日益严峻。因此对土壤污染微生物的检测工作显得尤为重要。基于PCR技术的土壤微生物多样性分析可以鉴定土壤中微生物的种类和含量。但由于农田土壤使用各种肥料以及秸秆还田,土壤有机质含量较高,腐植酸也较多,因此从土壤中提取的微生物总DNA中常有一定的腐植酸污染。腐植酸对PCR扩增有较大影响,少量的腐植酸会抑制DNA聚合酶的活性,使得PCR扩增无法进行。因此,提取土壤总DNA在避免蛋白质、RNA污染的同时,如何尽可能地降低腐植酸的污染,从而获得高质量的土壤微生物DNA是进行土壤微生物污染鉴定的核心和基础。
目前常用的土壤DNA提取方法如采用化学方法裂解细胞,辅之以酶处理等方法:具体步骤为采用DNA提取液(Tris-HCI,EDTA,磷酸钠,NaCl,CTAB)混合,再加入蛋白酶K及SDS,225r/min摇床上37℃摇动30min,接着加入65℃水浴2h,收集上清,转移到50mL离心管中。重复上述操作,收集三次上清液合并。上清液与等体积的氯仿、异戊醇混合液(v(氯仿)∶v(异戊醇)=24∶1)混合,离心,以0.6倍体积的异丙醇室温沉淀1h,室温12000r/min离心20min,收集核酸沉淀,用70%乙醇洗涤沉淀,溶解DNA。该方法的缺点在于实验耗时长,实验步骤繁琐,而且在处理土壤中大量存在的腐殖酸方面效果不佳。而在去除腐殖酸方面,也有Mobio公司开发的DNA提取试剂盒:具体方法见实施例1。该方法实验步骤繁琐,DNA在提取过程中损失量较大。有文献报道采用该方法的DNA提取量为10.5μg/g(干土),DNA提取浓度比采用化学裂解法的23.5μg/g(干土)较低,而且试剂盒的价格比较昂贵(1600元/50次),不适合较大规模的土壤样品检测。
发明内容
本发明的目的为解决现有土壤微生物DNA提取过程中面临的国外试剂盒价格昂贵,国内方法效果不佳的问题,提供了一种高效、经济的土壤微生物DNA提取方法。该方法通过在腐殖酸吸附剂的成分中加入纳米TiO2和活性炭和玻璃珠,在增强细胞破碎效果的同时利用其对腐殖酸有良好的吸附效果,可以避免过柱洗脱过程。本发明有效降低了成本,省时省力。
本发明由如下技术方案实现的:
一种高效经济的土壤微生物DNA提取方法,包括如下步骤:
步骤一:获取微生物悬液;称取1克土壤,加入2ml悬浮缓冲液Buffer C1,并加入1克粒径0.09-0.12mm的玻璃珠,加入500μL的腐殖酸吸附剂Buffer C2,加入10μL蛋白酶K(10mg/mL),混合后震荡10min;
步骤二:获取微生物DNA;将步骤一所得溶液再加入裂解液2ml的Buffer C3并涡旋振荡20~30S;
步骤三:获取粗制DNA;将上步得到的物质搅拌下置于60℃下水浴20~30min,然后4℃条件下高速离心,收集第一上清液;
步骤四:获取精制DNA;将步骤三所得第一上清液与等体积的buffer C4混合,高速离心15-20min,然后吸取水相转移至离心管中,加入与吸取的水相等体积的buffer C5,高速离心10-15min,得到第二上清液;以0.6倍第二上清液体积的buffer C6,在-20℃条件下沉淀30-45min,4℃高速离心20-30min,收集核酸沉淀,分别用在-20℃预冷的WB1和WB2依次洗涤沉淀,最后用TE溶液溶解沉淀,得到含有土壤微生物DNA的溶液。
所述的BufferC1试剂为:浓度为0.10~0.30mol/L磷酸钠溶液。
所述的BufferC2试剂的制备方法,包括以下步骤:称取3.2000g光谱纯二氧化钛于容器中,加入12.8g硫酸铵,32mL硫酸,并称取0.2g活性炭,加热至溶解,冷却至室温,加水稀释至200mL,摇匀,备用。
所述的BufferC3试剂为含有2%CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)、1.4M NaCl、0.02MEDTA(乙二胺四乙酸)、0.1M Tris-Cl(三羟甲基氨基甲烷的氯化氢缓冲溶液)、0.2%巯基乙醇和20%SDS的水溶液。
所述的Buffer C4试剂的组成为酚、氯仿和异戊醇,体积比为酚:氯仿:异戊醇=25:24:1。
所述的buffer C5试剂的组成为氯仿和异戊醇,其中体积比氯仿:异戊醇=24:1。
所述的buffer C6试剂为异丙醇。
WB1试剂为纯度95%的乙醇;所述的WB2试剂为纯度75%乙醇。
所述的步骤三和步骤四中的高速离心为10000-12000r/min。
所述的Buffer C4试剂中的酚具体为苯酚。
所述的TE缓冲液为公知物质,为Tris和EDTA的混和液。
本发明涉及物料的量,均可以整体放大或缩小,都属于本发明的保护范围。
本发明的有益效果为:
采用本发明所述提取方法进行土壤微生物DNA提取,利用专门研制的含有纳米TiO2:0.2M;活性炭:0.1%的腐殖酸吸附剂能有效的吸附和去除土壤中的腐殖酸,大大提高DNA的提取质量,另外加入玻璃珠可以增强细胞破碎效果,所提取的DNA浓度得到了很大的提高,比采用原试剂盒的提取方法所提取的DNA浓度提高了38.2%,且并不需要通过柱子吸附和洗脱,减少了试剂的使用量,且简化DNA收集过程,缩短了实验时间,节省了试剂用量,因此本发明所述提取方法对DNA的提取效率更高,更省时省力,也更经济合算。
本发明不仅操作简单,节省实验时间,提取的DNA在浓度上了也有较大提高,比采用原试剂盒方法提取的DNA浓度最高分别提高了30.9%、48.1%,DNA纯度无明显变化。
因此,本发明为一种立足于土壤污染微生物检测的需要,能从土壤、粪便等复杂环境样品中提取不含抑制因子的、提取速度快、分析结果准确、具有市场可开发前景的土壤污染微生物DNA的试剂盒。
具体实施方式
土样取自于天津市静海县普通小麦田,这些土壤长期种植小麦,施化肥和农家肥,秸秆全部还田,实行小麦、玉米轮作制度。农田土壤类型均为褐土,采样深度为表层土下10~20cm,按5点取样法,混匀放入无菌容器中,-20℃保存。采用三种方法同时进行DNA提取实验,具体提取方法为:
实施例1(三次重复)
采用mobio公司的土壤提取试剂盒Soil DNA Isolation Kit进行提取,方法如下:
加2g土壤到15mL Bead Tube中,加入0.25mLSR1和0.8mLSR2,加入2.5mL BeadSolutior到Bead Tube,再加入3.5mL酚:氯仿:异戊醇=25:24:1到试管中,加盖后涡旋混合直到分层消失。最大转速涡旋震荡15min,室温,2500g离心10min。取出后,小心地转移上层水相到干净的15mL收集管中,弃掉下层酚。加1.5mL SR3到水相中,然后祸旋混匀,4℃孵育10min,室温,2500g离心10min。转移上清到一个新的15mL收集管中,加入5mL SR4溶液到装有上清的收集管中,混匀室温孵育30min。室温,2500g离心30min。倒掉上清,将收集管倒置在纸上5min。震荡SR5混合。加1mL SR5到15mL收集管中,并反复吹打使完全重悬。为每一个RNA样品推备一个RNA Capture Column拿去15mL收集管的盖子,将RNA Capture Column放入15mL收集管中。加2mL SR5到RNA Capture Column中,让其完全流尽。从之前步骤加入RNA样品至RNA Capture Columr中,然后让其在重力作用下流尽。收集液体。用1mLSR5清洗柱子。重力流尽,收集洗脱液。转移柱子到新的收集管,加入SR6震荡混合,然后加入1mL SR6到RNA Capture Column。洗脱RNA到15mL收集管中,重力流尽。转移洗脱的RNA到2.2mL收集管中,并且加入1mL SR4.颠倒至少一次混合,然后-20℃孵育最少10min。室温,13000g离心15min浓缩RNA。倒掉上清并倒转收集管在纸上10min晾干。用100μL SR7溶液重悬RNA沉淀,去除其中的基因组。(更具体步骤详见其使用说明)
实施例2(当前使用的冷融法)
取1g经研磨的土壤粉末,置10mL离心管中,加2mL磷酸钠缓冲液(0.12mol/L,pH8.0),混合,放30℃摇床上,150r/min,摇动15min。8000r/min,离心10min。取沉淀,重复上述操作。取沉淀,加裂解液Ⅰ(0.15mol/LNaCl,0.1mol/LEDTA,pH8.0)1.5mL和50mg/L的溶菌酶0.5mL,混匀,37℃水浴2h,每20~30min摇一下。加裂解液Ⅱ(0.1mol/LNaCl,0.5mol/LTris-HCl,pH8.0,10%SDS)2mL,反复冻融3次,8000r/min,离心15min。取上清液与等体积酚试剂(v(苯酚)∶v(氯仿)∶v(异戊醇)=25∶24∶1)混合,8000r/min,离心10min。重复上一步操作。取水相与等体积氯仿、异戊醇混合液(v(氯仿∶v(异戊醇)=24∶1)混合,8000r/min,离心10min。取水相,加0.6倍体积的异丙醇,-20℃冰箱过夜,10000r/min,离心20min,弃上清液。用70%乙醇洗沉淀,收集沉淀溶解于pH8.0的TE缓冲液,终体积100μL。
实施例3
称取1克土壤,加入2ml悬浮缓冲液(磷酸钠水溶液,0.15mol/L,pH8.0),1克粒径0.1mm玻璃珠放入提取管中,在玻璃珠的摩擦作用下,裂解土壤中的所有生物包括G+细菌、酵母菌、真菌、藻类、线虫甚至真细菌的孢子、芽孢、动植物遗体等的游离DNA;加入腐殖酸吸附剂500μl:其组成为含有纳米TiO2:0.2M;活性炭:0.1%(质量百分比)。具体配置过程为:称取3.2000g光谱纯二氧化钛于容器中,加入12.8g硫酸铵,32mL 98%硫酸并称取0.2g活性炭,加热至溶解,冷却至室温,加水稀释至200mL,摇匀,备用。)混合充分震荡1min;加入10μL蛋白酶K(10mg/mL)溶液,混合后震荡10min,再加入高效的裂解液2ml(2%CTAB(质量百分比),1.4M NaCl,0.02M EDTA,0.1M Tris-cl,0.2%(体积百分比)巯基乙醇,20%SDS(质量百分比))并涡旋震荡30s(旋涡震荡器转速为1000rpm),在玻璃珠的摩擦作用下,裂解土壤中所有生物的DNA。充分混匀后置于60℃水浴30min,期间不时摇匀。4℃,12000r/min离心10min,收集上清液,与等体积的buffer C4混合(苯酚:氯仿:异戊醇(体积比25:24:1)),12000r/min离心15min,吸取水相800μl转移至5mL离心管中,加入800μl的buffer C5(即氯仿:异戊醇(体积比24:1))12000r/min离心15min,收集上清液600μl,以其0.6倍体积的异丙醇室温沉淀30min,4℃12000r/min离心20min,收集核酸沉淀,用-20℃预冷的95%(体积比)乙醇洗涤沉淀1次,再同温度的75%(体积比)的乙醇再洗涤沉淀一次。用TE缓冲液(Tris和EDTA的混和液)溶解沉淀,最终得到体积为50μL的含有土壤微生物DNA的溶液。
表1.提取土壤DNA的方法比较
采用上述实施例1、实施例2和实施例3所述方法提取DNA,经核酸蛋白测定仪(Eppendorf Bio Photometer D30)检测,其DNA浓度最高分别为13.8μg/mL、20.7μg/mL、30.8μg/mL,A260/A280比值分别为1.73、1.59、1.814。由实验结果可知,本发明采用的实施例3所述方(备注):方法1-3各重复三次,每次数据基本稳定,以证明实验没有误差。
法提取的DNA在浓度上了有较大提高,比采用试剂盒方法和冻融法提取的DNA浓度分别提高了1.23倍和48.8%,DNA纯度无明显变化。考虑到在试剂使用量上的变化,优选实施例3所述方法,其DNA提取效率更高,更省时省力、更经济合算。
由实验结果可知,采用本发明实施例3所述方法进行实验操作,不仅操作简单,节省实验时间,提取的DNA在浓度上了也有较大提高,比采用原试剂盒方法提取的DNA浓度最高分别提高了30.9%、48.1%,DNA纯度无明显变化。其DNA提取效率更高,更省时省力、也更经济合算。
实施例4,
其他步骤同实施例3,不同之处为土壤样本为工厂污水排污口附件的土壤,并且玻璃珠的直径为0.12mm。得到的土壤微生物DNA含量经过与实施例3相同的测试,效果接近。
实施例5
其他步骤同实施例3,不同之处为土壤样本为医院废弃物堆放附近的土壤。得到的土壤微生物DNA含量经过与实施例3相同的测试,效果接近。
本发明未尽事宜为公知技术。
Claims (3)
1.一种高效经济的土壤微生物DNA提取方法,其特征为该方法包括如下步骤:
步骤一: 获取微生物悬液;称取1克土壤 ,加入2 ml悬浮缓冲液Buffer C1,并加入1克粒径0.09-0.12 mm的玻璃珠,加入500μL的腐殖酸吸附剂Buffer C2,加入 10 μL蛋白酶 K(10 mg/mL),混合后震荡10 min;
步骤二:获取微生物DNA;将步骤一所得溶液再加入裂解液2 ml的Buffer C3并涡旋振荡20~30 S;
步骤三:获取粗制DNA;将上步得到的物质搅拌下置于 60℃下水浴 20~30 min, 然后4℃条件下高速离心, 收集第一上清液;
步骤四:获取精制DNA;将步骤三所得第一上清液与等体积的buffer C4混合,高速离心15-20 min, 然后吸取水相转移至离心管中,加入与吸取的水相等体积的 buffer C5,高速离心10-15 min,得到第二上清液;以 0.6倍第二上清液体积的buffer C6,在-20℃条件下沉淀 30-45 min,4℃高速离心20-30 min,收集核酸沉淀, 分别用在-20℃预冷的 WB1和WB2依次洗涤沉淀,最后用TE溶液溶解沉淀;
所述的BufferC1试剂为:浓度为0.10~0.30 mol/L磷酸钠溶液;
所述的BufferC2试剂的制备方法,包括以下步骤:称取3.2000 g光谱纯二氧化钛于容器中,加入12.8 g硫酸铵,32 mL硫酸,并称取0.2 g活性炭,加热至溶解,冷却至室温,加水稀释至200 mL,摇匀,备用;
所述的BufferC3试剂为含有2% CTAB、1.4 M NaCl、0.02 M EDTA、0.1 M Tris-Cl、0.2%巯基乙醇和20% SDS的水溶液;
所述的Buffer C4试剂的组成为酚、氯仿和异戊醇,体积比为酚:氯仿:异戊醇=25:24:1;
所述的buffer C5试剂的组成为氯仿和异戊醇,其中体积比氯仿:异戊醇=24:1;
所述的buffer C6试剂为异丙醇;
WB1试剂为纯度95%的乙醇;WB2试剂为纯度75%乙醇。
2.如权利要求1所述的高效经济的土壤微生物DNA提取方法,其特征为所述的步骤三和步骤四中的高速离心为10000~12000r/min。
3.如权利要求1所述的高效经济的土壤微生物DNA提取方法,其特征为所述的BufferC4试剂中的酚具体为苯酚。
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