CN102421898B - 核酸纯化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种从包含核酸的样本中纯化定量的核酸的方法,该方法具有至少以下步骤:a.将包含核酸的样本与定量的核酸结合相接触,该核酸结合相具有以下特征:(i)核酸结合相具有核酸结合配体,该配体具有至少一个可质子化的基团;(ii)核酸结合配体结合于到载体;(iii)核酸结合相具有低电荷密度的表面,其中,样本中核酸的量超过所使用数量的核酸结合相的结合能力;b.在低于至少一个可质子化的基团的pKs值的pH(结合pH)条件下,核酸结合于核酸结合相;c.在高于结合pH的pH条件下,洗脱核酸,从而得到定量的核酸。本发明还涉及可以用于核酸的纯化的相应的试剂盒和核酸结合相。
Description
本发明涉及从包含核酸的样本中纯化定量的核酸的方法。此外,提供相配的试剂盒及核酸结合相,试剂盒及核酸结合相使得定量的核酸从样本中分离,所以适合使洗脱液中的核酸浓度标准化。
现有技术已知各种不同的用于纯化和分离核酸的方法。这些方法包括使用苯酚-氯仿,盐析技术,使用离子交换剂和氧化硅颗粒。一种已知的核酸纯化方法是所谓的“电荷-转换(charge-switch)方法”。依照该方法,在第一pH值下引入核酸结合相,与包含核酸的样本接触,其中核酸结合相具有正电荷。这促进带有负电荷的核酸与相结合。为了核酸的释放/洗脱,根据电荷-转换(charge-switch)原理,为了转换(也就是中和)正电荷,建立高于核酸结合相的pKs值的第二pH。这促进了结合的核酸从核酸结合相分离。
对于许多分析技术和生物学方法来说,需要使用一定的,也就是说定量的核酸。从不同的原材料(样本)中分离或扩增的核酸的量取决于一些难以控制的因素,以致产量可以根据方法和材料大大地改变。为了随后的使用分离的核酸的实验在可比较的条件下实施,作为一个原则,需要对获得的核酸定量,然后调整核酸的浓度或核酸的量至指定值,从而标准化。对于许多标准化的工艺,特别是自动化工艺,为获得可重现的结果,如此标准化常常是必要的。
因为该原因,有大量的方法用于定量纯化样本中的核酸。一个常见的定量方法的例子是分光光度法测定样本中DNA的量。随后测定样本中核酸的浓度,然后浓度可以被统一调整。另一已知的定量核酸的方法是基于添加染料,如溴化乙锭,SYBR Green或Picogreen。通过将测量值与标准曲线进行比较可以测定浓度。
除描述的光谱测定或基于荧光的定量技术外,各种不同的纯化技术在现有技术中也是已知的,据说允许从不同的原材料中制备的核酸的浓度相同。Promega的MagneSil试剂盒或Invitrogen的SequalPrep试剂盒就是例子。
例如,Promega的MagneSil试剂盒被用于从全血中分离基因组DNA。该试剂盒是基于在离液序列高的盐的条件下,DNA结合到外覆氧化硅的顺磁性的颗粒。结果,在用低盐缓冲液或水洗脱后,通常得到1μg(±50%)纯化的基因组DNA。由于多达50%相对大的波动,该方法需要改进。
Invitrogen的SequalPrep试剂盒是基于DNA结合到覆盖有离子交换剂的表面。DNA在酸性pH条件下结合,且采用强碱性的缓冲液进行洗脱,该缓冲液的pH高于离子交换剂的pKs值。该试剂盒是基于所谓的电荷-转换技术(见上)。该试剂盒发现在长片段PCRs(LRPCRs)的纯化和标准化中的应用,它也适用于用于测序的样本制备。厂商阐明当使用至少250ng源DNA时,产量约25ng,具有2-3倍的波动。这意味着这里的波动也是相对大的,以致需要再一次优化。
因此事实上已知的纯化技术在产量方面仍具有宽的变动。难题产生了,特别是当使用不同量的原材料或不同的原材料时。
因此对于样本材料,期望在分离过程中,除了获得纯化的核酸,还纯化定量的核酸,从而已经获得洗脱液,该洗脱液在不同的样本之间具有几乎相同浓度的核酸,在浓度上具有最小可能的波动。
此外,对于纯化的核酸,期望能够立即准备好,在进一步应用中使用,即,如,不需要进一步再用缓冲液处理或类似步骤。基于现有技术已知的纯化技术,这不总是可能的,因为这些常常需要高pH值和/或高盐浓度用于纯化核酸的洗脱。因此,经常需要预先使纯化的核酸沉淀或其他,如为随后的应用(下游应用)调节pH,但是其结果是,洗脱液中的浓度可能再次改变。
尽管已知的技术适用于核酸的纯化,对于定量的核酸的纯化有所保留,目前的方法需要改进,特别是允许源自不同的样本的定量的核酸的纯化,在纯化核酸的浓度上仅具有小的波动。
因此,本发明待解决的问题是对现有的各种纯化核酸的方法进行改进。
本发明采用用于从包含核酸的样本分离和/或纯化定量的核酸的方法来解决该问题,该方法至少具有以下步骤:
a.将包含核酸的样本与定量的核酸结合相接触,该核酸结合相具有以下特征:
(i)核酸结合相具有核酸结合配体,该配体具有至少一个可质子化的基团;
(ii)核酸结合配体结合于载体,
(iii)核酸结合相具有低电荷密度的表面,
其中,样本中核酸的量超过使用的核酸结合相的结合能力;
b.在低于至少一个可质子化的基团的pKs值的pH(结合pH)条件下,核酸结合到核酸结合相;
c.在高于结合pH的pH条件下,洗脱核酸,从而得到定量的核酸。
本发明涉及核酸的分离和/或纯化,借助于特别的核酸结合相,允许从样本中纯化/分离定量的核酸,具有小的浓度波动。对于此,核酸结合相的设计是关键性的。为从样本中结合核酸,后者具有核酸结合配体,配体具有至少一个可质子化的基团。合适的可质子化的基团,特别是氨基,在下文详细描述。核酸的结合在低于至少一个这些可质子化的基团的pKs值的pH条件下发生。可质子化的基团获得一个或多个质子,从而带有正电,这意味着核酸结合相能够与带有负电荷的核酸结合。洗脱发生在较高的pH条件下,以致可质子化的基团的正电荷变得更少,且结合到核酸结合相上的核酸被释放。根据一些实施方式,可质子化的基团在洗脱过程中甚至可以是中性的,或选择性地也能是带负电的。该方法能被用于从生物学样本中分离和/或纯化核酸。此外,例如,为了使已经纯化的核酸标准化,从而得到定量的核酸,该方法可以在经典的核酸纯化技术后实施。
本发明必要的特征在于核酸结合相的表面。根据本发明,该表面具有低电荷密度。该特殊的表面,与以下特征组合,所述特征是指样本中核酸的量超过使用数量的核酸结合相的结合能力,出人意料地具有以下效果:定量的核酸可以从样本中分离,其中,与现有技术相比,产生非常小的核酸浓度波动。
与现有技术相反,根据本发明,没有试图获得允许特别大量核酸结合的表面。相反,表面上的电荷密度以及因此的核酸结合相的核酸结合能力被有意地降低。因此,仅有有限量的核酸,但总是相同的,即为特别的样本限定的,能够被结合,且相应地被洗脱。因此,对于特殊的生物学样本材料来说,有利地,核酸结合相的结合能力必须仅一次测定。进一步的纯化步骤可以被省略,因为特定量的核酸结合相仅可以结合定量的、且因此总是相同量的核酸。结果,有利地,处理步骤如纯化样本的浓缩或稀释可以被省略,这在其他方面、为将所有样本调节到纯化核酸的浓度相同,是必需的。
术语“定量”特别是指在限定的,即窄的变化范围内核酸的浓度。当后者对于特殊的样本或样本材料来说是未知的,变化的范围可以被测定(实验式地)。优选地,根据本发明的方法获得的核酸的量或浓度是在窄的范围内,以致于,取决于样本材料,变化小于±30%,优选小于±20%,特别是在±15%的范围内,且特别优选±10%。
与样本中核酸的量/浓度相关的核酸结合相的量应该更好地被选择,以致它总处于稳定区域,且因此处于核酸结合相的核酸结合能力的饱和区域。因此,选择核酸结合相的量(例如颗粒的量或表面包覆核酸结合配体的载体的大小),从而使样本中的核酸是超过使用的核酸结合相的量的核酸结合能力。由于本发明的核酸结合相的弱的核酸结合能力,本发明的方法与使用具有强的核酸结合能力的核酸结合相/颗粒(例如氧化硅颗粒或传统聚胺包覆的颗粒)相比具有明显的优势。在现有技术中,或者必须接受核酸产量上高的波动,或者必须使用如此小量的核酸结合相/颗粒,以致于处理变得困难,特别是在自动处理过程中。例如,当使用现有技术已知的颗粒,使用的量必须被稀释到一定程度,以致于它们在自动处理过程中难以处理。这具有错误源,因为具有高核酸结合能力的一些颗粒的损失将导致核酸产量的显著波动。因此,同样地根据这些方面,本发明的方法优于现有技术。
为定量的核酸的纯化及因此的核酸浓度的标准化,根据本发明核酸结合相被给予如此多的核酸,以致使用的核酸结合相的核酸结合能力是耗尽的。剩余的,没有结合的部分核酸在纯化过程中被丢弃。可选择地,具有结合核酸的核酸结合相可以在洗脱前被洗涤。在洗脱步骤,核酸从核酸结合相的表面转移到洗脱溶液中。结果,对于给定的样本材料,在纯化过程中,获得的核酸总是相同的,即获得定量的核酸。
优选地,通过一个或多个以下特征,获得具有低电荷密度的表面:
a.结合于载体的核酸结合配体,在各实例中都具有不多于一个或两个用于结合核酸的可质子化的基团;和/或
b.核酸结合配体选自一元-和二元胺构成的组;和/或
c.载体包覆着核酸结合配体和稀释配体的混合物;和/或
d.结合于载体的核酸结合配体是不足量的。
根据本发明,如所描述的,使用表面具有低电荷密度的核酸结合相。为此,在各实例中核酸结合配体优选具有不多于一个或两个可质子化的基团,例如,氨基,用于结合核酸。相应地,核酸结合配体优选自一元胺和二元胺构成的组。已发现与传统的用聚胺(诸如精胺和亚精胺)包覆相比,单元胺和/或二元胺非常适用于使核酸浓度标准化。显然,传统包覆有聚胺的载体在表面上具有的电荷密度太高,不适用于标准化。因此,它们结合较大量的核酸。如果这样的表面被引入与包含核酸的样本接触,会发现结合能力强烈地依赖于核酸浓度。典型地,在研究范围内,在DNA的供给量和洗脱量之间具有比例关系。图1显示包覆有聚胺精胺的聚合物颗粒的例子的这种行为,导致在纯化核酸的量上的所描述的变化,以致在纯化过程中标准化是不可能的。优选使用的单元胺和/或二元胺可以单独被应用或者以混合物被应用。
相反,通过优选使用单-和/或二元胺包覆载体,有限的、但定量的电荷载体,及因此的核酸结合基团在表面上产生。从而产生的用于结合核酸的电荷载体密度,与相应的包覆聚胺,如精胺或甚至是聚乙烯亚胺相比,是相当低的。特别是,用N-丙基-1,3-丙二胺修饰的聚合物颗粒已经在纯化过程中非常适用于使核酸浓度标准化,从而用于从样本中分离定量的核酸。包覆单元胺或二元胺、用于制备核酸结合相的载体的优势特别在于仅有限量的核酸被结合,但在小变动范围内,对于特定的样本来说,所述量是相同的。通过载体材料制备和载体表面的胺功能化的高重现性,获得电荷载体密度的窄的变动和由此的核酸结合能力的窄的变动。因此,在纯化过程中避免了核酸浓度的不良波动。所描述的优势可以被证明不仅与聚胺有关,而且还特别发现与通常使用的氧化硅颗粒有关,对于该颗粒,由于表面的强核酸结合能力,在从相同的样本材料中分离核酸过程中产生多达50%的波动。
令人惊讶地,还发现,如果如聚胺被用作核酸结合配体,载体仅被少量聚胺包覆,来获得核酸结合材料的表面上的期望的低电荷密度,载体的表面上较低的电荷密度也可以获得。根据一个实施例,核酸结合配体因此在载体材料上彼此间隔一定距离排列,或被稀释。为获得核酸结合配体的如此排列,根据一个实施例,载体可以仅被少量核酸结合配体包覆,例如聚胺或优选地,单-和/或二元胺。优选地,核酸结合配体功能化因此而生成不足,尤其与载体材料表面的结合能力相比较。作为结果,载体上的核酸结合配体的稀释被获得,以致较少可质子化的基团是可用的。例如,仅≤50%,≤25%,≤15%,≤10%,或仅≤5%的官能团,或与载体材料上的核酸结合配体官能化的基团,与核酸结合配体官能化。再次,在表面上获得具有低密度电荷的核酸结合相。
此外,载体可以被核酸结合配体和所谓的稀释配体的混合物包覆。术语“稀释配体”被用于此,表示与核酸结合配体相关的功能。它们的功能是允许载体上核酸结合配体的量被改变,从而被调整以致较低电荷密度可以建立在核酸结合相的表面上。与核酸结合配体相比,稀释配体的比例越高,越少核酸结合配体被用在载体上,且核酸结合能力越低。稀释配体可以带正电、负电或不带电荷,或可以具有可电离的基团。根据一个实施例,稀释配体不能结合任何核酸,或它们结合与核酸结合配体相比具有较低的亲合力的核酸。如果稀释配体结合核酸,根据一个实施例,它们结合核酸具有的亲合力低于核酸结合配体的亲合力的至少20%,至少50%或至少75%。相对稀释基团,核酸结合配体的比例可以为,如≤50%,≤25%,≤15%,≤10%,或仅≤5%。合适的稀释配体为,例如,二甲胺,二乙胺,和氨或具有式R,-OH或-OR基团的稀释配体,其中,R为直链或支链烷基残基。另一个合适的稀释配体的例子是乙醇胺。根据本发明的一个优选例,核酸结合配体和稀释配体的混合物被用于包覆载体。
根据一个实施例,核酸结合相的结合能力,在每mg核酸结合相1至500μg核酸的范围内,其中,较小的结合能力,如每mg核酸结合相1至100μg,1至200μg,10至100μg核酸,特别是DNA,也是可能的。根据一个优选例,核酸结合相的结合能力为每mg核酸结合相0.01至100μg,0.025至100μg,0.05至100μg或0.1至100μg核酸,优选地,每mg核酸结合相0.01至50μg,0.025至50μg,0.05至50μg或0.1至50μg核酸,特别优选地,每mg核酸结合相0.01至10μg,0.025至10μg,0.05至10μg或0.1至10μg核酸。这些核酸结合相特别适用于使较小量的核酸标准化,特别是当处理小体积时。
为实现核酸的温和洗脱,优选在高于结合pH的pH条件下实施洗脱,但是比至少一个可质子化的基团,优选所有的可质子化的基团的pKs值低至少一个pH单位,优选低至少两个pH单位。这具有显著优势,洗脱也可以在温和的条件下进行。因此本发明允许在低于可质子化的基团的pKs值的pH下洗脱。
根据本发明的一个实施例,在pH3~8进行核酸的结合。该说法是指结合期间和样本中的pH值。本发明的方法,取决于固相的形式,也可以在非常温和的条件下实施,因此核酸的结合也可以在pH 4~7.5,优选在pH 5~7.5,特别优选在pH 5~7且更特别优选在pH6.5~7,且从而在几乎所有中性范围内进行。因为可质子化的基团优选的pKs值为9~12,更优选10~12,甚至相对中性的pH,这些是充分地正电荷以允许核酸的有效结合。因此结合可以在非常温和的条件下进行,这避免破坏核酸。
而且,已证实对在低盐浓度下实施结合是有利的。根据一个优选例,在核酸结合到核酸结合相期间盐浓度因此为≤1M。盐浓度优选为≤0.5M,≤0.25M或甚至≤0.1M。低盐浓度对核酸结合到固相上的优化是优选的。过高的离子浓度能不利影响核酸和核酸结合相的离子相互作用。已发现结合缓冲液也可以包含某些一定量的有机物质,如糖类,醇类(如甲醇,乙醇),丙酮,乙腈或它们的混合物。这些不会对结合具有不利的影响。
本发明方法的另一重要的步骤是核酸的洗脱。如已经提及的,在高于结合pH的pH条件下发生核酸释放。因此,在洗脱期间,可质子化的基团较少是正电的,这对核酸的释放是有利的。此外,洗脱期间的pH优选为比核酸结合相的至少一个可质子化的基团的pKs值低至少一个pH单位。如以上所解释,这具有洗脱可以在特别温和的条件下进行的结果。
洗脱优选分别在pH7.5~11,pH7.5~10,优选在pH8~9,在pH8.2~8.8条件下进行,取决于使用的核酸结合配体或核酸结合相。因为核酸的释放是特别温和的,在这些pH值条件下获得特别有利的结果。
为允许在洗脱溶液中,优选在洗脱缓冲液中,分离的核酸直接进一步处理,洗脱溶液或洗脱缓冲液优选具有低盐浓度。因此,根据一个实施例,盐浓度为≤1M,优选≤0.5M,≤0.25M,≤0.1M,特别优选≤50mM,≤25mM或甚至≤10mM。合适的盐是碱金属和碱土金属或胺的卤化物,特别是氯化物,其他的无机酸盐,乙酸盐,硼酸盐和混合物如Tris,Bis-Tris及基于无机缓冲液的混合物,如MES,CHAPS,HEPES等。此外,用于洗脱的合适的物质是现有技术已知的。
特别是在核酸的真空或离心洗脱中,如当使用核酸结合膜或当与膜结合使用核酸结合颗粒时,该膜作为颗粒的屏障,可能是有利地,特别是小的洗脱体积,如果额外的测定被采用以确保在每个实例中在小的波动内,获得相同的洗脱体积,特别当多个批次(如在48孔或96孔板中)一起工作时。因此,它已经提供优势加入至少一个碳氢化合物到洗脱溶液中。这样,有利地,获得更一致的洗脱液体积。这大概是因为碳氢化合物的堆积层促进洗脱溶液通过膜完全渗透,以致获得更一致的洗脱液体积。碳氢化合物和/或碳氢化合物的混合物可以具有一个或多个以下特征:
a)碳氢化合物是未取代的或取代的烷烃;
b)碳氢化合物是不溶于水的烷烃;
c)碳氢化合物是无环烷烃;
d)碳氢化合物是无支链的无环烷烃;
e)碳氢化合物是有支链的无环烷烃;
f)碳氢化合物是环烷烃;
g)碳氢化合物是具有6~16个碳原子的烷烃;
h)碳氢化合物是具有8~12个碳原子的烷烃;
i)碳氢化合物是选自下组的烷烃:n-辛烷,n-壬烷,n-癸烷和n-十二烷;和/或
j)碳氢化合物优选为矿物油。
为促进纯化,优选在核酸结合后且在洗脱前进行至少一个洗涤步骤。具有低盐浓度的水性溶液,但也可以是水,优选用于洗涤。如果盐被包含在洗涤缓冲液或洗涤溶液中,它们优选浓度≤400mM,特别优选≤200mM,≤100mM,≤50mM和/或甚至≤25mM。有机成分可以存在于洗涤缓冲液中,如单醇类,多元醇,聚乙烯醇,丙酮,乙腈,糖类或其混合物。无论如何,洗涤缓冲液或洗涤溶液可以没有干扰量的相应有机成分,以致随后的应用,如酶处理,扩增反应等(下游应用)不被限制。
核酸结合配体通过静电的、极性的或疏水的相互作用共价或非共价连接于载体。优选发生在包覆操作步骤内。如果载体材料不具有任何合适的用于结合核酸结合配体的官能团,可以先进行载体材料的官能化,为其提供合适的官能团,特别是羧基。通过相应提供给载体材料用于结合核酸结合配体的较少官能团,也可以获得具有不足的核酸结合配体的载体材料的包覆层的相应性能。合适的包覆技术是现有技术已知的,且因此不需要更详细的描述。核酸结合配体结合于载体,且尤其结合于载体的官能团,可以以各种方式进行。核酸结合配体可以,例如,在二-或聚胺存在的情况下,通过氨基被结合。不管怎样,核酸结合配体也可以具有官能团,被用于结合于载体。合适的官能团是现有技术中已知的。此外,也有可能,核酸结合配体直接连接于载体的表面,优选到聚合物载体的表面。例如,这能通过碳主链直接发生。
优选的可质子化的基团,该基团已被证实适用于结合核酸,是氨基,伯、仲和叔氨基是优选的。可质子化的基团,如特别是氨基,优选具有pKs值至少为8。pKs值优选为9到12,更优选10到12。核酸结合配体优选具有1到2个氨基。优选的核酸结合配体是,例如,伯、仲和叔单-和二元胺。这些可以是取代的或未取代的。
优选的核酸结合配体的例子特别是下式的伯、仲和叔胺:
(a)R3N
(b)R2NH
(c)RNH2和/或
(d)X-(CH2)n-Y,其中X为R2N,RNH或NH2,和Y为R2N或RNH或NH2
其中,
R彼此独立,为直链、支链或环状的烷基、烯基、炔基或芳香取代基,其中,后者(芳香取代基)也可以包含一个或多个杂原子;
n为0到20。
N-丙基-1,3-丙二胺(N-Propyl-1,3-propanediamine)被优选用作核酸结合配体。
此外,环胺,芳香胺或胺官能化杂环也可以被使用。胺可以携带取代基,如烷基、烯基、炔基或芳香取代基,此外碳氢化合物链也可以被选择,形成环。碳氢化合物链也可以具有杂原子,如氧、氮、硫或硅,或是支链的。胺的氨基优选具有pKs值为9到12,特别优选10到12。
另外的合适的核酸结合配体是聚乙二醇胺,具有一个、两个或三个氨基。例如,这些是可获得的名为“Jeffamines”的聚乙二醇胺。Jeffamines含有结合于聚醚主链的末端的伯氨基。聚醚主链可以是基于氧化丙烯,氧化乙烯或其混合物,其他的主链部分的使用也是可能的。
根据本发明,相应的核酸结合配体的混合物也可以被使用或可以被用在载体上。
优选地,核酸结合配体的氨基不与降低电子密度的基团结合,例如羧基,羰基,具有C-C双键或β-羟乙基的基团,以致它们的pKs值优选为9到12。当氨基官能团和相应的降低电子密度的基团通过仅三、两个或更少的碳原子相连时,与降低电子密度的基团结合被认为是存在的。
用于核酸结合配体的可能的载体为,例如,有机聚合物,如聚苯乙烯和其衍生物,聚丙烯酸酯,和聚甲基丙烯酸酯,和其衍生物,或聚氨酯,尼龙,聚乙烯,聚丙烯,聚丁烯和这些材料的共聚物。此外,这些核酸结合配体也可以偶联到多糖,特别是水凝胶如琼脂糖,纤维素,葡聚糖,交联葡聚糖(Sephadex),聚丙烯酰胺葡聚糖(Sephacryl),壳聚糖。此外,核酸结合配体也可以结合于无机载体,如玻璃或另外的金属氧化物和非金属氧化物(特别是MeO所示氧化物,其中Me优选自由Al,Ti,Zr,Si,B构成的组,特别为Al2O3,TiO2,氧化硅,和氧化硼)或金属表面,如金。优选地,载体材料不具有任何它自己的核酸结合能力。
磁性颗粒对操作是特别有利的。因此核酸结合相优选为有磁性的,且可以是顺磁的,亚铁磁的,铁磁的或超顺磁的。超顺磁或顺磁的颗粒是优选的。根据本发明当优选使用磁性颗粒时,为磁性颗粒处理的单独的步骤和实施方式是现有技术中已知的,且因此不需要详细的描述。
核酸结合配体可以直接或通过间隔臂(spacers)结合于这些载体。它们也可以是较大分子的一部分。间隔臂的例子是烃链,聚乙二醇或聚丙烯醇,和官能化硅烷。这些间隔臂可以是线性的或分支的。
采用碳化二亚胺化学过程活化的酰胺或酸酐,环氧化合物,甲苯磺酰基,甲酰基,磺酰氯,马来酰亚胺或羧酸酯基可以作为化学官能团用于核酸结合配体的结合。本发明上下文中,核酸结合配体(例如胺)的非共价结合也是可能的,例如通过离子的相互作用或通过吸附过程。核酸结合配体也可以通过硫醇结合于,如金表面。核酸结合配体结合于羧化的表面是优选的。
用于结合核酸结合配体的合适的载体材料的另外的实施例包括非磁性和磁性颗粒、柱材料、膜和表面涂层。我们可以进一步提到载体,如管、膜、羊毛织物(fleece)、纸、反应容器如PCR管、Eppendorf管、多孔板(多重板,multiplates)、芯片和微阵列。根据本发明,这些载体可以如上所述用核酸结合配体包覆,以获得核酸结合相。依据包覆有核酸结合配体的所述载体材料的密度和面积的大小,使得定量的核酸结合相再次用于纯化。例如,为了获得核酸结合相,用于处理样本的微量滴定板(microtiter plate)或多孔板或相应的设备的单个的或所有的反应区域(孔)可以被核酸结合配体完全或部分包覆。
对核酸纯化效率来说,有效的洗脱及因此的结合核酸从核酸结合相上分离是特别有决定性的。据发现,令人惊讶的是,不仅是核酸结合配体的可质子化的基团的pKs值是决定性的。核酸结合相的结构和其它官能团的存在,在中性或弱碱性pH范围内,也有助于促进和提高洗脱。
根据一个实施例,核酸结合相另外载有官能团,该官能团在洗脱pH条件下促进核酸的洗脱,例如,在洗脱pH通过施加排斥作用。因此,优选地,这些官能团在洗脱阶段是带负电的。例如,这些基团的pKs值在0至7的范围内,优选1至5。例如离子交换剂,特别是阳离子交换剂,优选酸基,如羧基,是合适的。其他合适的基团是甜菜碱,磺酸盐,膦酸盐和磷酸盐。例如,固体载体可以用羧基功能化,以允许核酸结合配体的结合。在核酸结合配体的结合期间,其浓度可以被选择以致一些羧基是自由的,且因此是不能被核酸结合配体功能化的。在低pH值,这些基团不阻碍核酸的结合。然而,在较高的pH,这些基团优选带负电,且从而促进核酸从核酸结合配体上分离。相互作用可以被进一步促进,通过核酸结合配体的可质子化的基团和负离子化基团(例如,羧基)之间的距离的长度的选择。有利地,这在低pH条件下促进洗脱,从而提高产量。官能团(在洗脱pH该官能团对核酸产生排斥影响)的选择、强度和长度因选择的核酸结合基团,且特别每核酸结合基团可质子化的基团的数量和它们与促进洗脱的官能团之间的距离而变化。根据一个是实施例,促进洗脱的官能团作为稀释配体。
通过描述的参数的选择/组合,特别是促进洗脱的官能团,稀释配体,和用核酸结合配体稀释或混合,核酸结合相的pH值可以为洗脱条件而优化。核酸结合相的洗脱特性,特别是洗脱pH,可以被控制或相应调整。
能用本发明的方法纯化的核酸可以存在于体液诸如血液、尿液、粪便、唾液、痰液或其他体液,存在于生物来源(如组织、细胞,特别是动物细胞、人体细胞、植物细胞、细菌细胞等等,器官如肝脏、肾脏或肺等。为此,核酸可以从载体材料获得,载体材料如棉签,半流质涂片标本(PapSmears),和稳定的介质如PreServCyt或抹片(Surepath),或者通常也从其他液体中获得,例如果汁,水性样本或食品。此外,核酸也可以获自植物材料,细菌裂解物,包埋于石蜡中的组织,水性溶液或凝胶。
如果核酸存在于细胞材料中,为释放核酸,如现有技术已知,细胞材料可以被破坏,尤其可以被裂解。相应的细胞破坏技术或裂解技术是现有技术已知的,且因此不需要进一步描述。
由于此方面,在本发明的方法中,基于水的缓冲液能够被使用,且危险的化学品是废弃的,获得非常洁净的洗脱液,优选不含任何对下游应用形成不利的物质,所述下游应用如PCR,限制消化,转染或测序反应。此外,采用本发明的方法,在非常温和的条件(如pH6.5-7)下结合核酸和在仅弱碱pH(如8.5)和很低盐浓度(如25mmol Tris)的条件下实施洗脱是可能的,从而为进一步研究和使用(下游应用)不需要稀释或中和。
本发明标准化或规格化的核酸可以优选用于酶反应,如,举例核酸扩增,修饰反应或测序反应。本发明纯化的及因此被标准化的核酸也适用于,例如,短串联重复序列(STR),分析和转染,它们也使用定量的核酸。
此外,本发明涉及核酸结合相的应用,如以上所描述的,用于从样本中纯化定量核酸,且从而用于核酸浓度的标准化。核酸结合相具有核酸结合配体,该核酸结合配体具有至少一个可质子化的基团,其中,本发明的核酸结合配体结合于载体,且核酸结合相具有低电荷密度的表面,其中,洗脱pH确定为高于结合pH,且其中,样本中存在的核酸,超过所使用数量的核酸结合相的结合能力。
优选地,通过一个或多个以下特征获得低电荷密度:
a.结合于载体的核酸结合配体,在各实例中都具有不多于一个或两个用于结合核酸的可质子化的基团;和/或
b.核酸结合基团选自一元胺和二元胺构成的组;和/或
c.载体包覆着核酸结合基团和稀释基团的混合物;和/或
d.结合于载体的核酸结合配体是不足量的。
本发明使用的核酸结合相,特别具有核酸结合配体,该核酸结合配体具有至少一个可质子化的基团,其pKs值至少为8,优选9到12。以上详细描述优选的实施方式(参见以上内容),特别具有一个或多个以下特征:
a.可质子化的基团的pKs值为9到12,优选pKs值为10到12;和/或
b.可质子化的基团是氨基,且不与降低电子密度的基团结合;和/或
c.核酸结合相具有促进核酸在洗脱pH释放/洗脱的官能团,优选阳离子交换剂,特别是羧基;和/或
d.载体除了核酸结合配体以外,本身没有核酸结合特性;和/或
e.载体选自下组:有机聚合物如聚苯乙烯及其衍生物、聚丙烯酸酯和聚甲基丙烯酸酯及其衍生物、聚氨酯、尼龙、聚乙烯、聚丙烯、聚丁烯和这些材料的共聚物;多糖和凝胶如琼脂糖、纤维素、葡聚糖、交联葡聚糖(Sephadex),聚丙烯酰胺葡聚糖(Sephacryl),壳聚糖;无机载体,玻璃或另外的金属氧化物和非金属氧化物(特别是MeO所示氧化物,其中Me优选自由Al,Ti,Zr,Si,B构成的组,特别为Al2O3,TiO2,氧化硅),具有金属表面(如金)的载体,磁性颗粒或其混合物;和/或
f.核酸结合配体选自包含下式的伯、仲和叔胺的组:
(a)R3N
(b)R2NH
(c)RNH2和/或
(d)X-(CH2)n-Y,其中X为R2N,RNH或NH2,和Y为R2N或RNH或NH2
其中,
R彼此独立,为直链、支链或环状的烷基、烯基、炔基或芳香取代基,其中,后者(芳香取代基)也可以包含一个或多个杂原子;
n为0到20,
且优选表示为单元-和二元胺。这些可以是取代的或未取代的。
此外,本发明提供一种用于纯化定量的核酸的试剂盒,其使用本发明的核酸结合相。核酸结合相的详细说明和与标准化相关的优势在上文被详细描述,且也用于本发明的试剂盒。参考以上公开内容。
优选地,本发明的试剂盒具有至少以下一个特征:
a.结合缓冲液或结合溶液,其pH值比核酸结合相的至少一个可质子化的基团的pKs值低至少一个pH值单位,和/或能在样本中确立所述pH的结合缓冲液;和/或
b.洗脱缓冲液或洗脱溶液,其pH值比核酸结合相的至少一个可质子化的基团的pKs值低一个pH值单位,和/或能在样本中确立所述pH的洗脱缓冲液。
根据一个实施例,试剂盒具有结合缓冲液或结合溶液,所述结合缓冲液或结合溶液具有至少以下一个特征:
i.pH 3~8;和/或
ii.pH 4~7.5;和/或
iii.pH 4.5~7;和/或
iv.pH 5.5~7;和/或
v.pH 6.5~7;和/或
vi.盐浓度≤1M,≤0.5M,≤0.25M或w≤0.1M。
此外,试剂盒具有洗脱缓冲液或洗脱溶液,所述洗脱缓冲液或洗脱溶液具有至少以下一个特征:
i.pH 7.5~10;和/或
ii.pH 8~9;和/或
iii.pH 8.2~8.8;和/或
iv.盐浓度≤1M,≤0.5M,≤0.25M,≤0.1M,≤25mM,≤15mM或≤10mM;和/或
v.选自下组:水、生物的缓冲液和有机的缓冲液的组。
在上文中详细描述核酸结合相以及结合和洗脱条件的详情,且也用在本发明的试剂盒,具有其中使用的组分/缓冲液的特征。参考以上公开的内容。此外,试剂盒可以包含另外的通用组分,如裂解、洗涤和/或中和试剂或缓冲液。
相应的试剂盒可以在本发明方法的范围内使用,特别适用于标准化。因此本发明的试剂盒特别可以用在自动体系中。
本发明的方法,试剂盒和核酸结合固体相尤其可以用于分子生物学、分子诊断学领域,用于法医学,用于食品分析和用于应用测试。它们尤其适用于自动使用。
洗脱的核酸优选可以直接进行进一步处理,同样被用于如分子生物学应用的范畴,如用于酶反应,如PCR,RT-PCR,限制性消化,测序或转染。假如洗脱缓冲液如以上描述被设计,且优选具有低盐浓度,不需要进一步纯化。
用于纯化的可能的核酸包括DNA和RNA,尤其是基因组DNA,质粒DNA,和PCR片段,cDNA,miRNA,siRNA,和寡核苷酸和修饰的核酸,如PMA或LMA。病毒或者细菌RNA和DNA或源于人类、动物或植物的核酸也可以被纯化。此外,根据本发明,DNA/RNA混合物也可以被认为适于纯化,给出几个例子。
将在下文采用一些例子解释本发明。这些都不是限制,而是代表本发明的优选的实施方式。此外,本文陈述的所有的参考文献构成本发明的一部分。
实施例
在实施例中,长片段(LR)PCR片段(8-11kb)被用作模式体系。实验在以下说明书内容的基础上进行。
图1显示了洗脱的DNA(LR PCR片段)的量取决于原始DNA的量,使用精胺包覆的聚合物珠子。被提供到包覆有聚胺的颗粒的DNA越多,越多DNA能够被结合,然后再次被洗脱。但是,即使样本中具有大量的核酸,没有达到核酸结合能力的稳定水平,甚至当使用各种不同量的原始DNA时,标准化没有发生。
A)磁性聚合物与胺的反应
材料
各种不同的材料可以用作磁性聚合物,包括Estapor、Dynal、Seradyn或Ademtech颗粒。
胺:N-丙基-1,3-丙二胺(Aldrich,编号.308153)
制备说明
500毫克的羧化磁性颗粒在10毫升MES缓冲液中重悬,然后加入10毫升的50毫克/毫升N-羟基琥珀酰亚胺溶液。使用迷你振荡器(Minishaker)混合,然后加入10毫升的50微摩/升的1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳化二亚胺,再次涡旋。然后在振荡器上反应30分钟,接着移弃上清。在50毫升的MES缓冲液中重悬。磁性分离悬浮液,弃上清。然后取出5毫升MES缓冲液,加入10毫升水性1,4-二氨基丁烷溶液(100毫克/毫升,在MES中,pH值8.5),彻底涡旋,在振荡器上反应一小时。接着,每次采用50毫升MES缓冲液洗涤两次,磁性分离上清且弃去。然后在10毫升MES缓冲液中重悬颗粒。
B)LR-PCR片段的标准化
1)相同样本的不同量的原始DNA的标准化
珠子的洗涤
4批次:在每个实例中采用2x100μl的50mM TrisHCl(pH6.5)洗涤2μl珠子。在上清且移走前,每个实例的珠子聚集在磁体上至少30s。
DNA的结合
将珠子悬浮在100μl洗涤缓冲剂(参见上文)和2μl 3M NaAc(pH5.3)
1+4μl DNA LR-PCR06(8kb片段)
2+3μl DNA LR-PCR06+1μl LR-PCR缓冲液1x
3+2μl DNA LR-PCR06+2μl LR-PCR缓冲液1x
4+1μl DNA LR-PCR06+3μl LR-PCR缓冲液1x
在室温震荡10min。
洗涤:
用100μl水洗涤两次。
洗脱:
加入20μl 50mM Tris-HCl(pH 8.5),50mM NaCl
5min室温
将上清转移至干净的容器。
标准化的结果如图2和3所示。
2)各种不同的DNA片段(8-11kb)的标准化
根据1)中的方案,12个不同的长片段PCR样本被纯化和标准化。图4为Pico-Green测量后洗脱液中DNA的量。
然后合并12个样本,于OD260nm测定平均浓度。给出的平均值为580ng/PCR片段,与Picogreen测量得到的平均值533ng相当。结果示于图5。泳道12和13较弱的带可以用非特异性扩增导致DNA背景增强来解释。
在各种不同的测试中显示相似大小(8-11kb)和不同大小(如1kb,5kb,10kb;结果未示)的片段可以标准化,具有小于10%的小波动。因此,本方法在现有已知的标准化的方法(产量上的波动明显较大,分别为50%或2-3倍)基础上,具有明确的改进。
当使用本发明的方法用于PCR片段的标准化,从片段长度的知识,除了DNA质量的标准化外,片段的量(摩尔浓度)的标准化也是可能的,使用公式
体积[μl]=分子量[μg/μmol]/浓度[μg/μl]
因此本发明的方法优于现有技术,具有显著的优势。从而获得20μl洗脱液中500ng/2μl珠子的良好产量,只有±10%的波动。本发明的方法可以自动化且可以与磁力分离器,吸移管和振荡器一起使用。此外,它特别具有时效性,因为在一个自动化处理中,20分钟内可以纯化96个样本。这相对于现有技术(同样的样本量的纯化有时需60分钟或更多)是显著的优势。
C)源于血液gDNA的标准化
1)源自8个不同供体的血液gDNA的分离
材料
样本:来自8个不同供体的新鲜全血,EDTA固定。
珠子:1mg N-丙基-1,3-丙二胺包覆的磁珠(参见上文)
裂解缓冲液:10mM Tris,Triton X-100,pH 9.0
结合缓冲液:1.5M乙酸钾pH 4.0
洗涤缓冲液:水
洗脱缓冲液:10mM Tris*HCl pH 8.5
步骤:
根据以下实验说明实施纯化:
将1ml裂解缓冲液和10μl蛋白酶K混合在一起。将1mg珠子和3.4μl水悬浮在200μl结合缓冲液中。在一个Eppendorf管中,将裂解缓冲液/蛋白酶混合物加入到100μl血中且充分混合。在室温下孵育10分钟。在结合缓冲液中,小心将珠子重悬。将其中的240μl加入到裂解的血中。通过反复的吸取充分混合。在室温下孵育1分钟。磁性分离珠子。小心移走上清。为了洗涤,加入1ml洗涤缓冲液。通过反复的吸取充分混合。再次磁性分离,移弃上清。加1ml裂解缓冲液和50μl结合缓冲液,充分混合,室温孵育一分钟。磁性分离。然后再一次用1ml洗涤缓冲液洗涤和磁性分离。
为洗脱纯化的DNA,将150μl洗脱缓冲液加入到珠子。通过反复的吸取重悬珠子。磁性分离珠子,移去上清,光度测量量化DNA。
结果:
结果显示于图6。数据显示,虽然使用的原材料很复杂,且可以包含不同量的核酸,但依照本发明的方法,标准量的DNA可以被纯化,仅有轻微的波动。
2)分离,采用初始量有意变化的DNA
为了测试即使用非常复杂的样本(其中包含非常不同量的DNA),本发明方法是否实现DNA标准化,实施以下测试。
材料
样本:新鲜全血,EDTA固定。
珠子:600μg N-丙基-1,3-丙二胺包覆的磁珠
裂解缓冲液:10mM Tris,Triton X-100,pH 9.0
结合缓冲液:1.5M乙酸钾pH 4.0
洗涤缓冲液:水
洗脱缓冲液:10mM Tris*HCl pH 8.5
通过白血球细胞计数(WBC计数为白血球细胞计数)测得gDNA理论初始量。每个细胞使用6.6pg DNA。
血体积 | WBC | DNA的量 |
x103/μl | μg DNA | |
50μl | 4.7 | 1.55 |
100μl | 4.7 | 3.10 |
150μl | 4.7 | 4.65 |
200μl | 4.7 | 6.20 |
250μl | 4.7 | 7.76 |
300μl | 4.7 | 9.31 |
裂解混合物的组分:
血体积 | 蛋白酶K[μl] | 裂解缓冲液[ml] |
50μl | 10 | 1 |
100μl | 10 | 1 |
150μl | 15 | 1 |
200μl | 20 | 1 |
250μl | 25 | 1 |
300μl | 30 | 1 |
步骤:
根据以下实验说明进行纯化。
在每个实例中,将如上文所述的大量裂解缓冲液和蛋白酶K混合在一起。在每个实例中,将600μg珠子(=16.9μl)和23.1μl水悬浮在200μl结合缓冲液中。在每个实例中,在一个Eppendorf管内,将裂解缓冲液/蛋白酶混合物加入到上述量的血中,混合均匀。室温孵育10分钟。小心将珠子重悬在结合缓冲液中。将其中的240μl加入到裂解的血中。通过反复的吸取完全混合。在室温下孵育1分钟。磁性分离珠子。小心移走上清。为了洗涤,加入1毫升的洗涤缓冲液。通过反复的吸取完全混合。再次磁性分离,且移弃上清。加1ml裂解缓冲液和50μl结合缓冲液,完全混合,在室温孵育一分钟。磁性分离。然后再一次用1ml洗涤缓冲液洗涤和磁性分离。
为洗脱纯化的DNA,将150μl洗脱缓冲液加入到珠子。通过反复的吸取重悬珠子。磁性分离珠子,移去上清,光度测量量化DNA。
结果:
结果显示于图7和下表内。数据显示,虽然使用的原材料包含非常不同量的核酸,但依照本发明的方法,标准量的DNA可以被纯化,与原料相比,有相当小的波动。
D.)RNA的标准化
材料:
样本:RNA Boehringer Mannheim 16s-和23s-核糖体β为4μg RNA/μl
珠子:38μg N-丙基-1,3-丙二胺包覆的磁珠
珠子洗涤缓冲液:50mM Tris*HCl pH 6.5(无RNA酶)
结合缓冲液:3M乙酸钾pH 5.3(无RNA酶)
洗涤缓冲液:水(无RNA酶)
洗脱缓冲液:50mM TRIS*HCl/50mM NaCl pH8.5(无RNA酶)
加入的RNA的量:1-8μg(0.5μg梯度(steps))
加入的RNA的体积:4μl(体积差别用无RNA酶的水补齐)
步骤:
根据以下实验说明实施纯化。
小心重悬珠子,在微量滴定板内放入38μg。在100μl珠子洗涤缓冲液中磁化,移去缓冲液,取出珠子。再次重复该步骤。接着加入2μl结合缓冲液和4μl各种不同的RNA溶液。通过反复的吸取完全混合。在1000rpm、室温将板震荡10min。磁性分离珠子。小心移去上清。
为了洗涤,加入100μl洗涤缓冲液。通过反复的吸取彻底混合。再次磁性分离,且移弃上清。重复洗涤步骤一次。
为RNA的洗脱,将20μl洗脱缓冲液加到珠子。通过反复的吸取重悬珠子,在1000rpm、室温震荡5min。磁性分离,移去上清,且光度测量量化RNA。
结果:
结果显示于图8和下表内。数据显示,虽然使用的原材料包含完全不同量的核酸,但依照本发明的方法,标准量的RNA可以被纯化,与原材料相比,有相当小的波动。
Claims (21)
1.一种从包含核酸的样本分离和/或纯化定量的核酸的方法,该方法具有至少以下步骤:
a.将所述包含核酸的样本与定量的核酸结合相接触,该核酸结合相具有以下特征:
(i)所述核酸结合相具有核酸结合配体,该配体具有至少一个可质子化的基团;
(ii)所述核酸结合配体结合于载体;
(iii)所述核酸结合相具有低电荷密度的表面,
其中,通过以下特征获得低电荷密度:结合于载体的所述核酸结合配体,都具有不多于一个或两个用于结合核酸的可质子化的基团,且所述样本中核酸的量超过所使用数量的所述核酸结合相的结合能力;
b.在低于至少一个可质子化的基团的pKs值的pH条件下,使所述核酸结合于所述核酸结合相;
c.在高于结合pH的pH条件下,洗脱核酸,从而得到定量的核酸。
2.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述核酸结合配体选自一元胺和二元胺构成的组。
3.如权利要求1或2所述的方法,其特征在于,可质子化的基团具有一个或多个以下特征:
a.pKs值为9到12;
b.pKs值为10到12;
c.所述可质子化的基团是氨基,且不与降低电子密度的基团结合。
4.如权利要求1或2所述的方法,其特征在于,所述核酸结合相具有至少一个或多个以下特征:
a.所述载体和/或核酸结合配体具有在洗脱pH值条件下促进核酸释放的官能团,即阳离子交换剂作为官能团;
b.所述核酸结合配体选自包含下式的伯、仲和叔胺的组:
R3N,R2NH,RNH2和/或X-(CH2)n-Y
其中X为R2N,RNH或NH2,
Y为R2N或RNH或NH2,
R是彼此独立的,为直链、支链或环状的烷基、烯基、炔基或芳香取代基,其中,所述取代基也可以包含一个或多个杂原子;
n为0到20;
c.所述载体除了所述核酸结合配体之外,本身不具有核酸结合特性;
d.所述载体选自下组:有机聚合物;多糖和水凝胶;无机载体,金属氧化物和非金属氧化物,具有金属表面的载体和磁性颗粒及其混合物,管、膜、羊毛织物、纸、多孔板、芯片和微阵列;和/或
e.结合能力在每mg核酸结合相0.1至500μg核酸的范围内。
5.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述载体包覆着核酸结合配体和稀释配体的混合物,和/或所述结合到载体的核酸结合配体是不足量的。
6.如权利要求1所述的方法,其特征在于,在具有至少一个以下特征的条件下进行结合:
a.在pH3~8进行结合;和/或
b.在pH4~7.5进行结合;和/或
c.在pH4.5~7进行结合;和/或
d.在pH5.5~7进行结合;和/或
e.在pH6.5~7进行结合;和/或
f.在盐浓度≤1M,≤0.5M,≤0.25M或≤0.1M条件下进行结合。
7.如权利要求1所述的方法,其特征在于,在具有至少一个以下特征的条件下进行洗脱:
a.洗脱在以下pH条件下进行,该pH高于所述结合pH,但比至少一个可质子化的基团的pKs值低至少一个pH单位;和/或
b.在pH7.5~10进行洗脱;和/或
c.在pH8~9进行洗脱;和/或
d.在pH8.2~8.8进行洗脱;和/或
e.在盐浓度≤1M,≤0.5M,≤0.25M,≤0.1M,≤25mM,≤15mM,或≤10mM的条件下进行洗脱;和/或
f.为了洗脱,使用的溶液选自下组:水、有机的缓冲液。
8.如权利要求1所述的方法,其特征在于,洗涤步骤在结合后且在洗脱前实施。
9.如权利要求8所述的方法,其特征在于,使用具有一个或多个以下特征的洗涤溶液:
a.使用水或具有低盐浓度的水性溶液用于所述洗涤步骤;和/或
b.使用具有低盐浓度的水性溶液,其中盐浓度≤400mM,≤200mM,≤100mM,≤50mM和/或≤25mM。
10.如权利要求4所述的方法,其特征在于,所述有机聚合物选自下组:聚苯乙烯及其衍生物、聚丙烯酸酯和聚甲基丙烯酸酯及其衍生物、聚氨酯、尼龙、聚乙烯、聚丙烯、聚丁烯和这些材料的共聚物;
所述多糖选自下组:琼脂糖、纤维素、葡聚糖、交联葡聚糖,聚丙烯酰胺葡聚糖,壳聚糖;
所述无机载体为玻璃;和
所述金属氧化物和非金属氧化物选自下组:Al2O3、TiO2、氧化硅、氧化硼。
11.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述载体为反应容器。
12.核酸结合相在从包含核酸的样本分离和/或纯化定量的核酸中的应用,其特征在于,所述核酸结合相具有核酸结合配体,该核酸结合配体具有至少一个可质子化的基团,其中所述核酸结合配体结合于载体,且所述核酸结合相具有低电荷密度的表面,其中通过一个或多个以下特征,获得低电荷密度:
a.结合于载体的所述核酸结合配体,都具有不多于一个或两个用于结合核酸的可质子化的基团;和/或
b.所述核酸结合配体选自一元-和二元胺构成的组;
其中,高于所述结合pH的洗脱pH被确定,且其中选择核酸结合相的量,从而使样本中所述核酸超过使用的所述核酸结合相的结合能力。
13.如权利要求12所述的应用,其特征在于,所述核酸结合相具有以下至少一个特征:
a.可质子化的基团的pKs值为9到12;和/或
b.可质子化的基团是氨基且不与降低电子密度的基团结合;和/或
c.所述核酸结合相具有在洗脱pH促进核酸释放/洗脱的官能团,所述官能团为阳离子交换剂;和/或
d.所述核酸结合相的结合能力在每mg核酸结合相0.1至500μg核酸的范围内;
e.所述载体除了所述核酸结合配体,本身没有核酸结合特性;和/或
f.所述载体选自下组:有机聚合物;多糖和凝胶;无机载体,或另外的金属氧化物和非金属氧化物,具有金属表面的载体,磁性颗粒或其混合物,管、膜、羊毛织物、纸、多孔板、芯片和微阵列;和/或
g.所述核酸结合配体选自包含下式的伯、仲和叔胺的组:
R3N,R2NH,RNH2和/或X-(CH2)n-Y
其中X为R2N,RNH或NH2,
Y为R2N或RNH或NH2,
R彼此独立,为直链、支链或环状的烷基、烯基、炔基或芳香取代基,其中,所述取代基也可以包含一个或多个杂原子;
n为0到20。
14.如权利要求13所述的应用,其特征在于,所述有机聚合物选自下组:聚苯乙烯和其衍生物、聚丙烯酸酯和聚甲基丙烯酸酯及其衍生物、聚氨酯、尼龙、聚乙烯、聚丙烯、聚丁烯和这些材料的共聚物;
所述多糖选自下组:琼脂糖、纤维素、葡聚糖、交联葡聚糖,聚丙烯酰胺葡聚糖,壳聚糖;
所述无机载体为玻璃;和
所述金属氧化物和非金属氧化物选自下组:Al2O3、TiO2、氧化硅、氧化硼。
15.如权利要求12所述的应用,其特征在于,所述载体为反应容器。
16.一种用于从包含核酸的样本分离和/或纯化定量的核酸的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒包含如核酸结合相,所述核酸结合相具有核酸结合配体,该核酸结合配体具有至少一个可质子化的基团,其中所述核酸结合配体结合于载体,且所述核酸结合相具有低电荷密度的表面,其中通过一个或多个以下特征,获得低电荷密度:
a.结合于载体的所述核酸结合配体,都具有不多于一个或两个用于结合核酸的可质子化的基团;和/或
b.所述核酸结合配体选自一元-和二元胺构成的组;
其中,高于所述结合pH的洗脱pH被确定,且其中选择核酸结合相的量,从而使样本中所述核酸超过使用的所述核酸结合相的结合能力,
其中所述核酸结合配体为N-丙基-1,3-丙二胺。
17.如权利要求16所述的试剂盒,其特征在于,所述核酸结合相具有以下至少一个特征:
a.可质子化的基团的pKs值为9到12;和/或
b.可质子化的基团是氨基且不与降低电子密度的基团结合;和/或
c.所述核酸结合相具有在洗脱pH促进核酸释放/洗脱的官能团,所述官能团为阳离子交换剂;和/或
d.所述核酸结合相的结合能力在每mg核酸结合相0.1至500μg核酸的范围内;
e.所述载体除了所述核酸结合配体,本身没有核酸结合特性;和/或
f.所述载体选自下组:有机聚合物;多糖和凝胶;无机载体,或另外的金属氧化物和非金属氧化物,具有金属表面的载体,磁性颗粒或其混合物,管、膜、羊毛织物、纸、多孔板、芯片和微阵列;和/或
g.所述核酸结合配体选自包含下式的伯、仲和叔胺的组:
R3N,R2NH,RNH2和/或X-(CH2)n-Y
其中X为R2N,RNH或NH2,
Y为R2N或RNH或NH2,
R彼此独立,为直链、支链或环状的烷基、烯基、炔基或芳香取代基,其中,所述取代基也可以包含一个或多个杂原子;
n为0到20。
18.如权利要求17所述的试剂盒,其特征在于,所述有机聚合物选自下组:聚苯乙烯和其衍生物、聚丙烯酸酯和聚甲基丙烯酸酯及其衍生物、聚氨酯、尼龙、聚乙烯、聚丙烯、聚丁烯和这些材料的共聚物;
所述多糖选自下组:琼脂糖、纤维素、葡聚糖、交联葡聚糖,聚丙烯酰胺葡聚糖,壳聚糖;
所述无机载体为玻璃;和
所述金属氧化物和非金属氧化物选自下组:Al2O3、TiO2、氧化硅、氧化硼。
19.如权利要求16所述的试剂盒,其特征在于,所述载体为反应容器。
20.如权利要求16所述的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒具有至少一个以下特征:
a.结合缓冲液或结合溶液,其具有的pH值比所述核酸结合相的至少一个可质子化的基团的pKs值低至少一个pH单位,和/或能调整样本中所述pH的结合缓冲液或结合溶液;和/或
b.洗脱缓冲液或洗脱溶液,其具有的pH值比所述核酸结合相的至少一个可质子化的基团的pKs值低一个pH单位,和/或能调整样本中所述pH的洗脱缓冲液或洗脱溶液。
21.如权利要求16-20任一项所述的试剂盒,其特征在于,
a.所述结合缓冲液或所述结合溶液,具有至少一个以下特征:
i.pH3~8;和/或
ii.pH4~7.5;和/或
iii.pH4.5~7;和/或
iv.pH5.5~7;和/或
v.pH6.5~7;和/或
vi.盐浓度≤1M,≤0.5M,≤0.25M或≤0.1M;
和/或
b.所述洗脱缓冲液或所述洗脱溶液,具有至少一个以下特征:
i.pH7.5~10;和/或
ii.pH8~9;和/或
iii.pH8.2~8.8;和/或
iv.盐浓度≤1M,≤0.5M,≤0.25M,≤0.1M,≤25mM,≤15mM,或≤10mM;和/或
v.选自下组:水、有机的缓冲液。
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