JP2016010416A - 核酸精製方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】本発明は、少なくとも以下のステップを含む、核酸を含む試料から規定量の核酸を精製する方法に関する:a.核酸を含む試料を以下の特徴を有する規定量の核酸結合相と接触させるステップであって、(i)核酸結合相は、少なくとも1個のプロトン化可能基を有する複数のリガンド結合核酸を有する、(ii)核酸結合リガンドは担体に結合して存在する、(iii)核酸結合相は低電荷密度の表面を有する、ここで試料中の核酸量は、使用される量の核酸結合相の結合能を超える、ステップ、b.プロトン化可能基のうちの少なくとも1個のpK値よりも低いpH値(結合pH値)において核酸を核酸結合相と結合させるステップ、c.規定量の複数の核酸が得られる、結合pH値よりも高いpH値において核酸を溶出させるステップ。本発明は、さらに核酸の精製に使用することができる対応するキット及び核酸結合相に関する。
【選択図】なし
Description
a.核酸含有試料を、以下の特徴を有する規定量の核酸結合相と接触させるステップであって:
(i)核酸結合相は、少なくとも1個のプロトン化可能基(protonierbare Gruppe)を有する、複数の核酸結合リガンドを有する、
(ii)核酸結合リガンドは担体に結合している、
(iii)核酸結合相は低電荷密度の表面を有する、
ここで、試料中の核酸量は、使用される核酸結合相の結合能を超える、ステップ
b.プロトン化可能基のうちの少なくとも1個のpKs値よりも低いpH(結合pH)において核酸と核酸結合相とを結合させるステップ、
c.規定量の複数の核酸が得られる、結合pHよりも高いpHにおいて核酸を溶出させるステップ
を含む、規定量の核酸を核酸含有試料から単離及び/又は精製するための方法によって、この問題を解決する。
本発明の好ましい実施形態では、例えば以下が提供される:
(項目1)
規定量の複数の核酸を核酸含有試料から単離及び/又は精製するための方法であって、前記方法は、少なくとも以下のステップ:
a.前記核酸含有試料を、以下の特徴を有する規定量の核酸結合相と接触させるステップであって:
(i)前記核酸結合相は、少なくとも1個のプロトン化可能基を有する、複数の核酸結合リガンドを有する、
(ii)前記核酸結合リガンドは担体に結合している、
(iii)前記核酸結合相は低電荷密度の表面を有する、
ここで、前記試料中の核酸量は、使用される量の核酸結合相の結合能を超える、ステップ;
b.前記プロトン化可能基のうちの少なくとも1個のpKs値よりも低いpH(結合pH)において前記核酸と前記核酸結合相とを結合させるステップ;
c.前記結合pHよりも高いpHにおいて前記核酸を溶出させるステップであって、ここで、規定量の複数の核酸が得られる、ステップ;
を含む、方法。
(項目2)
前記低電荷密度が以下の特徴:
a.前記担体に結合した前記核酸結合リガンドは、各場合において前記核酸の結合のための1個以下又は2個のプロトン化可能基を有する、及び/又は
b.前記核酸結合リガンドは、モノアミン及びジアミンの群から選択される
の1つ以上によって達成されることを特徴とする、項目1に記載の方法。
(項目3)
前記プロトン化可能基(単数又は複数)が以下の特徴:
a.9から12のpKs値、
b.10から12のpKs値、
c.前記プロトン化可能基は、アミノ基であり、電子密度低減基と共役しない
の1つ以上を有することを特徴とする、項目1又は2に記載の方法。
(項目4)
前記核酸結合相が、以下の特徴:
a.前記担体及び/又は前記核酸結合リガンドは、前記溶出pHにおいて前記核酸の放出を促進する官能基、すなわち官能基としての複数の陽イオン交換体、特に、好ましくはカルボキシル基などの、酸性基を有する;
b.前記核酸結合リガンドは、次式:
R3N、R2NH、RNH2及び/又はX−(CH2)n−Y
の第一級、第二級及び第三級アミンからなる群より選択され、ただし、
X=R2N、RNH又はNH2
Y=R2N又はRNH又はNH2
R=互いに無関係に、線状、分枝又は環式のアルキル、アルケニル、アルキニル又は芳香族置換基であって、最後のものは1個以上のヘテロ原子を含むこともでき、
n=0から20、好ましくは0から18;
c.前記担体は、前記核酸結合リガンドは別として、それ自体の核酸結合特性を持たない、
d.前記担体は、ポリスチレン及びその誘導体、ポリアクリラート及びポリメタクリラート及びその誘導体、ポリウレタン、ナイロン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリブチレン及びこれらの材料のコポリマーなどの有機ポリマー、アガロース、セルロース、デキストラン、Sephadex、Sephacryl、キトサンなどの多糖及びヒドロゲル、無機担体、ガラス、金属酸化物及びメタロイド酸化物、特にAl2O3、TiO2、シリカ、酸化ホウ素、金属表面を有する担体、例えば、金及び磁性粒子及びその混合物、チューブ、膜、フリース、紙、反応器、マルチプレート、チップ、並びにマイクロアレイからなる群より選択される;及び/又は
e.前記結合能は0.1から500μg核酸/mg核酸結合相、好ましくは0.1から10μg核酸/mg核酸結合相の範囲である
の少なくとも1つ以上を有することを特徴とする、項目1から3の一項以上に記載の方法。
(項目5)
前記担体が複数の核酸結合リガンドと複数の希釈リガンドとの混合物で被覆され、及び/又は前記核酸結合リガンドが、前記担体に不足状態で結合することを特徴とする、項目1から4の一項以上に記載の方法。
(項目6)
結合が以下の特徴:
a.結合がpH3から8で起こる、及び/又は
b.結合がpH4から7.5で起こる、及び/又は
c.結合がpH4.5から7で起こる、及び/又は
d.結合がpH5.5から7で起こる、及び/又は
e.結合がpH6.5から7で起こる、及び/又は
f.結合が塩濃度1M以下、0.5M以下、0.25M以下若しくは0.1M以下で起こる
の少なくとも1つを含む条件下で起こることを特徴とする、項目1から5の一項以上に記載の方法。
(項目7)
溶出が以下の特徴:
a.溶出が、前記結合pHよりも高いが、前記プロトン化可能基のうちの少なくとも1個のpKs値よりも少なくとも1pH単位低い、pHで起こる、及び/又は
b.溶出がpH7.5から10で起こる、及び/又は
c.溶出がpH8から9で起こる、及び/又は
d.溶出がpH8.2から8.8で起こる、及び/又は
e.溶出が塩濃度1M以下、0.5M以下、0.25M以下、0.1M以下、25mM以下、15mM以下若しくは10mM以下で起こる、及び/又は
f.溶出のために、水、生物学的緩衝液及び有機緩衝液の群から選択される溶液が使用される
の少なくとも1つを含む条件下で起こることを特徴とする、項目1から6の一項以上に記載の方法。
(項目8)
洗浄ステップが結合後かつ溶出前に実施されることを特徴とする、項目1から7の一項以上に記載の方法。
(項目9)
以下の特徴:
a.水又は低塩濃度の水溶液が前記洗浄ステップに使用される、及び/又は
b.低塩濃度の水溶液が使用され、前記塩濃度が400mM以下、200mM以下、100mM以下、50mM以下及び/又は25mM以下である
の1つ以上を有する洗浄溶液が使用されることを特徴とする、項目8に記載の方法。
(項目10)
規定量の核酸を核酸含有試料から単離及び/又は精製するための核酸結合相の使用であって、前記核酸結合相が、少なくとも1個のプロトン化可能基を有する複数の核酸結合リガンドを有し、前記核酸結合リガンドが担体に結合しており、前記核酸結合相が低電荷密度の表面を有し、前記低電荷密度が、以下の特徴:
a.前記担体に結合した前記核酸結合リガンドは、各場合において前記核酸の結合のための1個以下又は2個のプロトン化可能基を有する、及び/又は
b.前記核酸結合リガンドは、モノアミン及びジアミンの群から選択される、及び/又は
c.前記担体は、複数の核酸結合リガンドと複数の希釈基との混合物で被覆される、及び/又は
d.前記担体に結合した前記核酸結合リガンドは不足状態にある
の1つ以上によって達成されることを特徴とし、
前記結合pHよりも高い溶出pHが確立され、核酸結合相の量が、前記試料中の前記核酸が、使用される前記核酸結合相の結合能よりも過剰であるように選択される、
核酸結合相の使用。
(項目11)
前記核酸結合相が以下の特徴:
a.前記プロトン化可能基(単数又は複数)のpKs値は9から12、好ましくは10から12である、及び/又は
b.前記プロトン化可能基は、アミノ基であり、前記電子密度低減基と共役しない、及び/又は
c.前記核酸結合相は、前記溶出pHにおいて前記核酸の放出/溶出を促進する複数の官能基を有し、前記官能基は好ましくは陽イオン交換体、特にカルボキシル基である、及び/又は
d.前記核酸結合相の前記結合能は、0.1から500μg核酸/mg核酸結合相、好ましくは0.1から200μg、特に好ましくは0.1から10μg核酸/mg核酸結合相の範囲である、
e.前記担体は、前記核酸結合リガンドは別として、それ自体の核酸結合特性を持たない、及び/又は
f.前記担体は、ポリスチレン及びその誘導体、ポリアクリラート及びポリメタクリラート及びその誘導体、ポリウレタン、ナイロン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリブチレン及びこれらの材料のコポリマーなどの有機ポリマー、アガロース、セルロース、デキストラン、Sephadex、Sephacryl、キトサンなどの多糖及びヒドロゲル、無機担体、ガラス、又は更なる金属酸化物及びメタロイド酸化物、特にAl2O3、TiO2、シリカ、酸化ホウ素、金属表面を有する担体、例えば、金、磁性粒子又はその混合物、チューブ、膜、フリース、紙、反応器、マルチプレート、チップ、並びにマイクロアレイからなる群より選択される、及び/又は
g.前記核酸結合リガンドは、次式:
R3N、R2NH、RNH2及び/又はX−(CH2)n−Y
の第一級、第二級及び第三級アミンからなる群より選択され、ただし、
X=R2N、RNH又はNH2
Y=R2N又はRNH又はNH2
R=互いに無関係に、線状、分枝又は環式のアルキル、アルケニル、アルキニル又は芳香族置換基であって、最後のものは1個以上のヘテロ原子を含むこともでき、
n=0から20、好ましくは0から18
の少なくとも1つを有することを特徴とする、項目10に記載の使用。
(項目12)
規定量の複数の核酸を核酸含有試料から単離及び/又は精製するためのキットであって、項目10又は11で定義された核酸結合相を含むことを特徴とする、キット。
(項目13)
以下の特徴:
a.前記核酸結合相の前記プロトン化可能基のうちの少なくとも1個のpKs値よりも少なくとも1pH単位低いpHを有する結合緩衝液若しくは結合溶液、及び/又は前記試料中で前記pHの調節を可能にする結合緩衝液若しくは結合溶液、及び/又は
b.前記核酸結合相の前記プロトン化可能基のうちの少なくとも1個のpKs値よりも1pH単位低いpHを有する溶出緩衝液若しくは溶出溶液、及び/又は前記試料中で前記pHの調節を可能にする溶出緩衝液若しくは溶出溶液
の少なくとも1つを有することを特徴とする、項目12に記載のキット。
(項目14)
a.前記結合緩衝液又は前記結合溶液が以下の特徴:
i.pH3から8、及び/又は
ii.pH4から7.5、及び/又は
iii.pH4.5から7、及び/又は
iv.pH5.5から7、及び/又は
v.pH6.5から7、及び/又は
vi.塩濃度1M以下、0.5M以下、0.25M以下若しくは0.1M以下、
の少なくとも1つを有し、及び/又は
b.前記溶出緩衝液又は前記溶出溶液が以下の特徴:
i.pH7.5から10、及び/又は
ii.pH8から9、及び/又は
iii.pH8.2から8.8、及び/又は
iv.塩濃度1M以下、0.5M以下、0.25M以下、0.1M以下、25mM以下、15mM以下若しくは10mM以下、及び/又は
v.前記溶出緩衝液又は前記溶出溶液が、水、生物学的緩衝液及び有機緩衝液からなる群より選択される
の少なくとも1つを有する
ことを特徴とする、項目12又は13に記載のキット。
b.核酸結合リガンドは、モノアミン及びジアミンの群から選択される、及び/又は
c.担体は、複数の核酸結合リガンドと複数の希釈基との混合物で被覆される、及び/又は
d.担体に結合した核酸結合リガンドは不足状態にある。
j)炭化水素は、好ましくは鉱油である。
(a)R3N
(b)R2NH
(c)RNH2及び/又は
(d)X−(CH2)n−Y ただし、X=R2N、RNH又はNH2、及びY=R2N又はRNH又はNH2
の第一級、第二級及び第三級アミンであり、式中、
R=互いに無関係に、線状、分枝又は環式のアルキル、アルケニル、アルキニル又は芳香族置換基であって、最後のものは1個以上のヘテロ原子を含むこともできる。
N−プロピル−1,3−プロパンジアミンは、核酸結合リガンドとして好ましく使用される。
b)核酸結合基は、モノアミン及びジアミンの群から選択される、及び/又は
c)担体は、核酸結合基と希釈基との混合物で被覆される、及び/又は
d)担体に結合した核酸結合リガンドは不足状態にある。
b.プロトン化可能基は、アミノ基であり、電子密度低減基と共役しない、及び/又は
c.核酸結合相は、溶出pHにおいて核酸の放出/溶出を促進する複数の官能基、好ましくは陽イオン交換体、特にカルボキシル基を有する、及び/又は
d.担体は、核酸結合リガンドは別として、それ自体の核酸結合特性を持たない、
e.担体は、ポリスチレン及びその誘導体、ポリアクリラート及びポリメタクリラート及びその誘導体、ポリウレタン、ナイロン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリブチレン及びこれらの材料のコポリマーなどの有機ポリマー、アガロース、セルロース、デキストラン、Sephadex、Sephacryl、キトサンなどの多糖及びヒドロゲル、無機担体、ガラス又は更なる金属酸化物及びメタロイド酸化物(特に、式MeOの酸化物(式中、Meは、好ましくは、Al、Ti、Zr、Siを含む群から選択される)、特にAl2O3、TiO2、シリカ)、金属表面を有する担体、例えば、金、磁性粒子又はその混合物からなる群より選択される、及び/又は
f.核酸結合リガンドは、次式:
(a)R3N
(b)R2NH
(c)RNH2及び/又は
(d)X−(CH2)n−Y、ただしX=R2N、RNH又はNH2、及びY=R2N又はRNH又はNH2
の第一級、第二級及び第三級アミンからなる群より選択され、式中、
R=互いに無関係に、線状、分枝又は環式のアルキル、アルケニル、アルキニル又は芳香族置換基であって、最後のものは1個以上のヘテロ原子を含むこともできる。
好ましくはモノアミン及びジアミンである。これらは、置換されていても、いなくてもよい。
b.核酸結合相のプロトン化可能基のうちの少なくとも1個のpKs値よりも1pH単位低いpHを有する溶出緩衝液若しくは溶出溶液、及び/又は試料中で前記pHを確立することができる溶出緩衝液。
ii.pH4から7.5、及び/又は
iii.pH4.5から7、及び/又は
iv.pH5.5から7、及び/又は
v.pH6.5から7、及び/又は
vi.塩濃度1M以下、0.5M以下、0.25M以下又は0.1M以下。
ii.pH8から9、及び/又は
iii.pH8.2から8.8、及び/又は
iv.塩濃度1M以下、0.5M以下、0.25M以下、0.1M以下、25mM以下、15mM以下若しくは10mM以下、及び/又は
v.それが、水、生物学的緩衝液及び有機緩衝液からなる群より選択される。
材料
Estapor、Dynal、Seradyn又はAdemtech粒子を含めて、種々の材料を磁性ポリマーとして使用することができる
アミン:N−プロピル−1,3−プロパンジアミン(Aldrich、カタログNo.308153) 。
カルボキシル化磁性粒子500mgをMES緩衝液10mlに再懸濁させ、次いで50mg/ml N−ヒドロキシスクシンイミド溶液10mlを添加する。Minishakerを使用して混合し、次いで50μmol/l 1−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド溶液10mlを添加し、再度ボルテックス撹拌する。次いで、オーバーヘッド振とう機上で30分間反応させ、次いで上清を除去する。MES緩衝液50ml中に再懸濁させる。懸濁液を磁気的に分離させ、上清を廃棄する。次いで、MES緩衝液5ml中に取り、1,4−ジアミノブタン水溶液10ml(MES中100mg/ml、pH8.5)を添加し、徹底的にボルテックス撹拌し、オーバーヘッド振とう機上で1時間反応させる。次に、MES緩衝液各50mlで2回洗浄し、上清を磁気的に分離させ、廃棄する。次いで、粒子をMES緩衝液10mlに再懸濁させる。
1)同一試料の異なる量の出発DNAの正規化 。
4バッチ:各場合において、ビーズ2μlを50mM TrisHCl pH6.5 2×100μlで洗浄する
ビーズを各場合において少なくとも30秒間磁石で濃縮した後、上清を除去する。
ビーズを洗浄緩衝液(上記参照)100μl+3M NaAc2μl pH5.3に懸濁させる
1 +4μl DNA LR−PCR06(8kb断片)
2 +3μl DNA LR−PCR06 +1μl LR−PCR緩衝液1×
3 +2μl DNA LR−PCR06 +2μl LR−PCR緩衝液1×
4 +1μl DNA LR−PCR06 +3μl LR−PCR緩衝液1×
RTで10分間振とうする 。
水100μlで2×洗浄 。
+20μl 50mM Tris−HCl pH8.5、50mM NaCl
5分間RT
上清を新しい容器に移す
正規化の結果を図2及び3に示す。
12個の異なるlong range PCR試料を1)のプロトコールに従って精製し、正規化した。図4は、Pico−Green測定後の溶出液中のDNA量を示す。
1)8名の異なるドナーの血液からのgDNAの単離
材料
試料:EDTAで安定化された、8名の異なるドナーの新しい全血
ビーズ:N−プロピル−1,3−プロパンジアミンで被覆された磁気ビーズ1mg(上記参照)
溶解緩衝液:10mM Tris、Triton X−100、pH9.0
結合緩衝液:1.5M酢酸カリウムpH4.0
洗浄緩衝液=水
溶出緩衝液:10mM Tris*HCl pH8.5 。
精製を以下の試験指示に従って実施した:
溶解緩衝液1mlとプロテイナーゼK10μlを混合する。ビーズ1mg及び水3.4μlを結合緩衝液200μl中に懸濁させる。Eppendorf容器中で、溶解緩衝液/プロテイナーゼ混合物を血液100μlに添加し、よく混合する。室温で10分間インキュベートする。ビーズを結合緩衝液中に慎重に再懸濁させる。その240μlを溶解血液に添加する。ピペット操作を繰り返して徹底的に混合する。室温で1分間インキュベートする。ビーズを磁気的に分離させる。上清を慎重に除去する。洗浄のために、洗浄緩衝液1mlを添加する。ピペット操作を繰り返して徹底的に混合する。再度磁気的に分離させ、上清を廃棄する。溶解緩衝液1ml及び結合緩衝液50μlを添加し、徹底的に混合し、RTで1分間インキュベートする。磁気的に分離させる。次いで、洗浄緩衝液1mlでもう一回洗浄し、磁気的に分離させる。
結果を図6に示す。データによれば、使用した出発材料は、極めて複雑であり、異なる量の核酸を含み得るが、正規化された量のDNAは、本発明による方法によって精製することができ、ほんのわずかな変動しか受けなかった。
本発明による方法が、極めて異なる量のDNAを含む複雑な試料でもDNA正規化を達成できるかどうか試験するために、以下の試験を実施した。
試料:EDTAで安定化された新しい全血。
溶解緩衝液:10mM TRIS、Triton X−100、pH9.0
結合緩衝液:1.5M酢酸カリウムpH4.0
洗浄緩衝液=水
溶出緩衝液:10mM TRIS*HCl pH8.5
gDNAの理論出発量を白血球を数えて(WBC数=白血球数)決定した。DNA6.6pgを細胞1個当たりに使用した。
精製を以下の試験指示に従って実施した:
各場合において、上記量の溶解緩衝液とプロテイナーゼKを混合する。各場合において、ビーズ600μg(=16.9μl)及び水23.1μlを結合緩衝液200μl中に懸濁させる。各場合において、溶解緩衝液/プロテイナーゼ混合物をEppendorf容器中の上記量の血液に添加し、よく混合する。RTで10分間インキュベートする。ビーズを結合緩衝液中に慎重に再懸濁させる。その240μlを溶解血液に添加する。ピペット操作を繰り返して徹底的に混合する。室温で1分間インキュベートする。ビーズを磁気的に分離させる。上清を慎重に除去する。洗浄のために、洗浄緩衝液1mlを添加する。ピペット操作を繰り返して徹底的に混合する。再度磁気的に分離させ、上清を廃棄する。溶解緩衝液1ml及び結合緩衝液50μlを添加し、徹底的に混合し、RTで1分間インキュベートする。磁気的に分離させる。次いで、洗浄緩衝液1mlでもう一回洗浄し、磁気的に分離させる。
結果を図7及び以下の表に示す。データによれば、使用した出発材料は極めて異なる量の核酸を含んだが、正規化された量のDNAは、本発明による方法によって精製することができ、出発材料よりもはるかに小さい変動を受けた。
材料:
試料:RNA Boehringer Mannheim 16s−及び23s−リボソームβ=4μgRNA/μl
ビーズ:N−プロピル−1,3−プロパンジアミンで被覆された磁気ビーズ38μg
ビーズ洗浄緩衝液:50mM TRIS*HCl pH6.5(RNaseを含まない)
結合緩衝液:3M酢酸ナトリウムpH5.3(RNaseを含まない)
洗浄緩衝液=水(RNaseを含まない)
溶出緩衝液:50mM TRIS*HCl/50mM NaCl pH8.5(RNaseを含まない)
添加RNA量:1〜8μg(0.5μgステップ)
添加RNA体積:4μl(体積差は、RNaseを含まない水で補われた) 。
精製を以下の試験指示に従って実施した:
ビーズを慎重に再懸濁させ、38μgをマイクロタイタープレートに入れる。磁化し、緩衝液を除去し、ビーズ洗浄緩衝液100μlにビーズを取る。このステップをもう一回繰り返す。次いで、結合緩衝液2μl及び種々のRNA溶液4μlを添加する。ピペット操作を繰り返して徹底的に混合する。プレートを1000rpm及び室温(RT)で10分間振とうする。ビーズを磁気的に分離させる。上清を慎重に除去する。
結果を図8及び以下の表に示す。データによれば、使用した出発材料は極めて異なる量の核酸を含んだが、正規化された量のRNAは、本発明による方法によって精製することができ、出発材料よりもはるかに小さい変動を受けた。
Claims (1)
- 明細書に記載された発明。
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EP09007338.8 | 2009-06-03 | ||
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