CN107690481B - 利用阴离子交换粒子分离细胞外核酸的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及利用阴离子交换粒子从生物样品分离细胞外核酸的方法和试剂盒。据发现，在结合混合物中纳入聚氧化烯脂肪醇醚补偿了可归因于阴离子交换表面的差异的性能变化，所述差异可以在例如不同批次/批的所述阴离子交换粒子之间和/或在所述粒子储存期间出现。此外，在所述结合混合物中包含聚氧化烯脂肪醇醚导致所得到的洗脱物纯度较高，揭示了下游反应例如PCR反应中显著减少的抑制。

Description

利用阴离子交换粒子分离细胞外核酸的方法
本发明涉及利用阴离子交换粒子从生物样品分离细胞外核酸的方法和试剂盒。
背景技术
细胞外核酸已在许多生物类型样品例如血液、血浆、血清和其他体液中被鉴定到并引起了极大兴趣。在许多医疗状况、恶性肿瘤和感染性过程中，尤其是对于筛查、诊断、预后、监督疾病进展、鉴定潜在治疗靶标、和监测治疗响应来说，分析细胞外核酸是令人感兴趣的。另外，对母体血液中存在的胎儿细胞外核酸进行分析以用于诊断或医疗目的，例如用于测定或分析性别认同、遗传病例如染色体异常和/或用于监测妊娠相关的并发症。因此，细胞外核酸在无创诊断和预后中特别有用并且它们可在许多应用领域例如无创产前遗传检测、肿瘤学、移植医学或许多其他疾病中使用，例如作为诊断或预后标志物。然而，细胞外核酸也存在于健康的人类中。细胞外核酸的常见应用和分析方法例如被描述在以下文献中：WO97/035589，WO97/34015，Swarup等，FEBS Letters 581(2007)795-799，Fleischhacker Ann.N.Y.Acad.Sci.1075：40-49(2006)，Fleischhacker和Schmidt，Biochmica et Biophysica Acta 1775(2007)191-232，Hromadnikova等(2006)DNA andCell biology，第25卷，第11期，第635-640页；Fan等(2010)Clinical Chemistry 56：8。除了源自于例如肿瘤细胞或胎儿的哺乳动物细胞外核酸以外，含细胞的样品也可以包含不包含在细胞中的其他感兴趣的核酸。重要的非限制性实例是病原体核酸例如病毒核酸。
样品通常只含有低浓度的细胞外核酸。例如，在血浆中，游离的循环核酸经常以仅1-100ng/ml的浓度存在，尽管在疾病状况例如癌症中可发现较高的水平。此外，细胞外核酸经常作为尺寸在100至500nt、特别是120至250nt范围内的片段循环(当指示分子的尺寸并由此指示链长时，术语“nt”在DNA的情况下也包括“bp”)。对于血浆中的ccfDNA来说，平均长度经常只有大约140-180bp。另外，本应为了诊断或医疗目的而鉴定的实际靶细胞外核酸通常也只代表总细胞外核酸内的一小部分。关于ccfDNA，取决于情况例如妊娠状态或肿瘤分级，每毫升血液通常只存在数千个可扩增的拷贝。具体来说，肿瘤特异性DNA片段非常罕见，并且经常所包含的浓度比“正常”细胞外核酸背景低1000倍。低浓度对于所述细胞外核酸的分离造成了挑战，所述细胞外核酸的分离必须是非常高效而稳固的。
从生物样品例如特别是血浆样品分离细胞外核酸的方法在现有技术中是已知的。对此，也有几种试剂盒是可商购的。例如，QIAamp循环核酸试剂盒(QIAGEN)提供了允许处理高达5ml的样品大小来分离细胞外核酸的高效方案。因为处理体积大(高达25ml)，它必然需要手动核酸提取。
然而，希望提供适合自动化的方法。例如，一旦已经建立了用于例行测试的诊断靶标，则消费者需要自动化来管理例如实验室中的较高通量。大容量实验室可以例如每天处理250至2500个样本，对于尽可能避免手动步骤和使样品制备自动化具有高要求。自动化分离方案有显著的优点，因为它降低了由于在手动核酸分离期间出现的误差所致的错误结果的风险。
WO 2013/045432中描述了适合于自动化的细胞外核酸分离方法。利用适当的pH条件将细胞外核酸结合到包含阴离子交换基团的固相上。所述固相可由磁性粒子提供。所描述的方法是高效并可快速执行的。
在核酸分离领域中，希望以试剂盒形式提供用于所述分离方法的材料。这要求当用于核酸分离时，试剂盒材料也提供储存后一致的结果。另外，应该避免批之间的变化，以便确保达到可靠的、一致的分离结果，特别是在分离的核酸的收率和纯度方面。所述分离应该优选是定量的。
据发现，用阴离子交换粒子分离细胞外核酸而有一致的结果是特别富有挑战性的。尽管所述阴离子交换珠粒的核酸结合表面与样品中少量的细胞外核酸相比是大幅过量的，但据发现，分离结果是变化的，即使在相同的方案中使用相同类型的试剂和阴离子交换珠粒。尽管可用的阴离子交换表面过量，但据发现，定量分离结果可能强烈地取决于合成的珠粒的批次(也称为批)。即使阴离子交换表面中的小变化都导致关于细胞外核酸回收效率的强烈的性能变化。阴离子交换表面中的这种小变化对细胞外核酸收率具有显著的影响可能可归因于样品中只含有少量细胞外核酸这一事实。阴离子交换表面中的这种变化可出现在阴离子交换粒子的标准生产过程期间或可出现在储存(也称为老化)期间。这是不利的，因为排除阴离子交换表面中的这种小变化，将需要甚至更加严格控制阴离子交换粒子的生产过程，导致更多的损耗，增加了成本。此外，这种性能风险不利地减少了试剂盒的可接受的存储时间。
本发明的目的是提供一种从含有细胞外核酸的样品分离细胞外核酸的方法，其避免了至少一个以上论述的现有技术缺点。特别地，本发明的目的是提供一种不太易受性能变化影响的细胞外核酸分离方法。
发明内容
本发明涉及一种技术，其中提供阴离子交换表面的粒子用于分离细胞外核酸。本发明尤其是基于以下令人惊讶的发现：在结合混合物中纳入特定的非离子型去污剂，即聚氧化烯脂肪醇醚，补偿了可归因于所述阴离子交换表面的差异的性能变化，所述差异可以在例如不同批次/批的阴离子交换粒子之间和/或在所述粒子储存期间出现。该效应未见于其他非离子型去污剂例如Triton X-100或其他类别的去污剂例如阳离子去污剂。此外，在结合混合物中包括聚氧化烯脂肪醇醚导致所得到的洗脱物纯度较高，揭示了与使用其他非离子型去污剂例如Triton X-100时相比，下游反应例如扩增反应如PCR反应中的抑制显著减少。由此，本发明提供了一种利用阴离子交换粒子从生物样品分离细胞外核酸的改进的方法。
根据第一个方面，本发明提供了一种从生物样品分离细胞外核酸的方法，其包含
(a)从所述样品制备结合混合物，所述结合混合物包含
i)细胞外核酸；
ii)提供阴离子交换表面的粒子；
iii)至少一种是聚氧化烯脂肪醇醚的非离子型去污剂；
iv)任选的至少一种盐，
其中所述结合混合物具有使细胞外核酸与所述粒子结合的pH，
(b)将带有结合的细胞外核酸的粒子与剩余的结合混合物分离；
(c)任选洗涤所述结合的细胞外核酸；和
(d)任选洗脱结合的细胞外核酸。
根据第二个方面，提供了一种用于执行根据第一个方面所述的方法的试剂盒，其包含
(a)裂解和/或结合组合物，其包含
i)至少一种是聚氧化烯脂肪醇醚的非离子型去污剂；
ii)任选的至少一种盐；
iii)至少一种缓冲剂；
其中所述组合物具有酸性pH；
(b)提供阴离子交换表面的粒子；
(c)任选的蛋白水解酶；
(d)任选的一种或多种洗涤溶液；和
(e)任选的一种或多种洗脱溶液。
根据以下描述和权利要求书，本申请的其他目的、特征、优点和方面对本领域技术人员将变得显而易见。然而，应该理解，给出以下描述、权利要求书和具体的实施例，在指示本申请的优选实施方式的同时，只是用于说明。
附图说明
图1：利用(I)使用磁性阴离子交换粒子分离循环DNA的自动化提取方案(比较在结合缓冲剂中与Triton X-100和Brij58一起的不同“差效果”珠粒批次)和作为参考方法(II)QIAamp循环NA试剂盒，从2ml血浆提取ccfDNA。从利用产品无细胞DNA BCT(Streck Inc，目录号：218962)稳定化的血液样品获得所述血浆样品。对每种条件测试四个重复样(n＝4)。对洗脱物进行实时PCR(18S编码序列；双链体PCR：显示了66bp扩增子)并按每毫升血浆的拷贝数计算ccfDNA回收率并与手动比较并按每毫升血浆的拷贝数计算ccfDNA回收率并与手动QIAamp循环NA试剂盒(回收率设定为100％)比较。在所述结合缓冲剂中包括聚氧乙烯脂肪醇醚作为非离子型去污剂，在此是Brij58，补偿了显示出ccfDNA亲和性降低的珠粒批次。当使用非离子型去污剂Triton X-100时，未见到这种效应。
图2：利用(I)使用磁性阴离子交换粒子分离循环DNA的自动化提取方案(比较在结合缓冲剂中与Triton X-100和Brij58一起的不同珠粒批次)和作为参考方法(II)QIAamp循环NA试剂盒，从2ml血浆提取ccfDNA。从利用EDTA稳定化的血液样品获得所述血浆样品。对洗脱物进行实时PCR(18S编码序列；双链体PCR：显示了66bp扩增子)并按每毫升血浆的拷贝数计算ccfDNA回收率并与手动QIAamp循环NA试剂盒(回收率设定为100％)比较。与TritonX-100相比，在所述结合缓冲剂中并因此在结合混合物中包括聚氧乙烯脂肪醇醚，在此是Brij58，导致了使用敏感的珠粒批次获得更稳固的ccfDNA回收率。
图3至5：利用(I)使用磁性阴离子交换粒子分离循环DNA的自动化提取方案(比较在结合缓冲剂中Triton X-100和Brij58的不同去污剂浓度)和作为参考方法(II)QIAamp循环NA试剂盒，从2ml血浆提取ccfDNA。对洗脱物进行实时PCR(18S编码序列；双链体PCR：显示了66bp或500bp扩增子)并按每毫升血浆的拷贝数计算ccfDNA回收率并与手动QIAamp循环NA试剂盒(回收率设定为100％)比较。结果显示，在结合缓冲剂中并因此在结合混合物中的聚氧乙烯脂肪醇醚，在此是Brij58，产生与Triton X-100可比或更高的ccfDNA收率并能以各种浓度用于所述结合混合物中。
图6和7：利用使用磁性阴离子交换粒子分离循环DNA的自动化提取方案，在结合混合物中使用Triton X-100(图6)或Brij58(图7)，从用无细胞DNA BCT(Streck Inc，目录号：218962)稳定化的血液获得的2、4和6ml血浆提取ccfDNA。利用不同的洗脱物输入体积(2-8μl；∑20μl)，对洗脱物进行实时PCR(18S编码序列；双链体PCR：显示了500bp扩增子)。按每毫升血浆的拷贝数计算ccfDNA回收率。与Triton X-100相比，在结合混合物中包括聚氧乙烯脂肪醇醚，在此是Brij58，导致杂质的更高效去除。
图8：在包含蛋白酶K的裂解期间升高的温度导致ccfDNA收率降低。利用(I)使用磁性阴离子交换粒子分离循环DNA的自动化提取方案，从2ml血浆提取ccfDNA。在结合混合物中使用30μl或60μl ProtK并在室温或65℃下温育10min，进行消化。作为参考方法，使用(II)QIAamp循环NA试剂盒。对洗脱物进行实时PCR(18S编码序列；双链体PCR：显示了66bp扩增子)并按每毫升血浆的拷贝数计算ccfDNA回收率并与手动QIAamp循环NA试剂盒(回收率设定为100％)比较。
图9：利用使用磁性阴离子交换粒子分离循环DNA的自动化提取方案，从2ml血浆提取ccfDNA。在结合混合物中使用不同浓度(2.0％、0.5％和0.1％)的不同聚氧乙烯脂肪醇醚非离子型去污剂。对洗脱物进行实时PCR(18S编码序列；双链体PCR：显示了66bp扩增子)。结果显示，不同的聚氧乙烯脂肪醇醚达到与Brij58相似的有利结果。
图10：在结合混合物中使用磁性阴离子交换粒子和不同的非离子型去污剂，利用分离循环DNA的自动化提取方案从2ml和4ml血浆提取ccfDNA。对洗脱物进行实时PCR(18S编码序列；双链体PCR：显示了66bp扩增子(图10A)或500bp扩增子(图10B))。结果显示，与其他非离子型去污剂相比，在结合混合物中使用聚氧乙烯脂肪醇醚提供了收率和纯度方面的优异结果。
图11：在结合混合物中使用老化的磁性阴离子交换粒子和不同的非离子型去污剂，利用分离循环DNA的自动化提取方案从4ml血浆提取ccfDNA。对洗脱物进行实时PCR(18S编码序列；双链体PCR：显示了66bp扩增子)。结果显示，与其他非离子型去污剂相比，在结合混合物中使用聚氧乙烯脂肪醇醚提供了优异的、更稳固的结果。
具体实施方式
本发明提供了一种利用提供阴离子交换表面的粒子从生物样品分离细胞外核酸的改进的技术。
方法
根据第一个方面，本发明提供了一种从生物样品分离细胞外核酸的方法，其包含
(a)从所述样品制备结合混合物，所述结合混合物包含
i)细胞外核酸；
ii)提供阴离子交换表面的粒子；
iii)至少一种是聚氧化烯脂肪醇醚的非离子型去污剂；
iv)任选的至少一种盐，
其中所述结合混合物具有使细胞外核酸与所述粒子结合的pH，
(b)将带有结合的细胞外核酸的粒子与剩余的结合混合物分离；
(c)任选洗涤所述结合的细胞外核酸；和
(d)任选洗脱结合的细胞外核酸。
本方法允许以良好的、均一的收率分离细胞外核酸，即使在所述粒子的阴离子交换表面发生变化的情况下。这样的变化可发生在生产过程期间和/或在所述粒子储存期间。本方法适合自动化并且所使用的材料能够以也适合长期储存的试剂盒形式提供。因此，所述方法具有重大的优点。下面解释各个步骤和优选实施方式。
步骤(a)–制备结合混合物
在本方法的步骤a)中，从含有细胞外核酸的生物样品制备结合混合物。所述结合混合物包含用于结合所述细胞外核酸的阴离子交换粒子并且还包含至少一种是聚氧化烯脂肪醇醚的非离子型去污剂。
本文中所用的术语“结合混合物”是指为所述核酸结合步骤而制备并允许样品中包含的细胞外核酸与所述粒子的阴离子交换表面结合的组合物。通过制备所述结合混合物，建立条件，以使所述结合混合物中包含的细胞外核酸与所述粒子的阴离子交换表面结合。所述结合混合物特别包含生物样品、阴离子交换粒子和为了制备用于所述结合步骤的样品而添加的试剂和/或化合物。
本发明的重要特征是在所述结合混合物中纳入至少一种聚氧化烯脂肪醇醚作为非离子型去污剂。聚氧化烯脂肪醇醚通过脂肪醇的烷氧基化、优选乙氧基化来制备。所述聚氧化烯脂肪醇醚可以选自聚氧乙烯脂肪醇醚和聚氧丙烯脂肪醇醚，优选使用聚氧乙烯脂肪醇醚。随后，本发明的实施方式特别参考其中使用聚氧乙烯脂肪醇醚的优选实施方式来描述。本公开一般而言适用于使用聚氧化烯脂肪醇醚。另外，本文中一般通过参考聚氧化烯脂肪醇醚而描述的实施方式具体来说涉及聚氧乙二醇脂肪醇醚的使用并因此是指聚氧乙二醇脂肪醇醚的使用。
术语“脂肪醇”对本发明的目的而言特别是指链长为6至22个碳原子的醇。所述链长可以选自8至20个碳原子、10至19个碳原子和12至18个碳原子。特别优选的是链长为14至20个碳原子、更优选15至19个碳原子或16至18个碳原子的脂肪醇。虽然所述脂肪醇可以是单或多不饱和的，但优选是饱和脂肪醇。
术语“聚氧乙烯”对本发明的目的而言特别是指-(CH2CH2O)n单元，特别是HO-(CH2CH2O)n单元，其中n优选是2至150的整数，例如选自以下的整数：2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35，36，37，38，39，40，41，42，43，44，45，46，47，48，49，50，51，52，53，54，55，56，57，58，59，60，61，62，63，64，65，66，67，68，69，70，71，72，73，74，75，76，77，78，79，80，81，82，83，84，85，86，87，88，89，90，91，92，93，94，95，96，97，98，99，100，101，102，103，104，105，106，107，108，109，110，111，112，113，114，115，116，117，118，119，120，121，122，123，124，125，126，127，128，129，130，131，132，133，134，135，136，137，138，139，140，141，142，143，144，145，146，147，148，149和150。优选地，n在选自4至120、8至80、10至60和12至50的范围内。
合适的聚氧乙烯脂肪醇醚的优选实例是聚乙氧基化的月桂醇、鲸蜡醇、油醇或硬脂醇，其可以单独或组合使用。根据一种实施方式，所述至少一种聚氧乙烯脂肪醇醚包含具有6至22个碳原子的脂肪醇组分和具有2至150个(CH2CH2O)单元的聚氧乙烯组分。根据一种实施方式，所述聚氧乙烯脂肪醇醚选自聚氧乙烯(2)鲸蜡基醚、聚氧乙烯(10)鲸蜡基醚、聚氧乙烯(20)鲸蜡基醚、聚氧乙烯(2)硬脂基醚、聚氧乙烯(10)硬脂基醚、聚氧乙烯(20)硬脂基醚、聚氧乙烯(2)油基醚、聚氧乙烯(10)油基醚、聚氧乙烯(20)油基醚和聚氧乙烯(100)硬脂基醚。所述数字指示氧化乙烯单元的平均数。特别合适的是由例如ICI Surfactants以商品名
Figure BDA0001498191290000095
销售的聚氧乙烯脂肪醇醚。
聚氧乙烯鲸蜡基、聚氧乙烯油基或聚氧乙烯硬脂基醇醚可选自聚氧乙烯(2)鲸蜡基醚(
Figure BDA0001498191290000091
52)、聚氧乙烯(10)鲸蜡基醚(
Figure BDA0001498191290000092
56)、聚氧乙烯(20)鲸蜡基醚(
Figure BDA0001498191290000093
58)、聚氧乙烯(2)硬脂基醚(
Figure BDA0001498191290000094
72)、聚氧乙烯(10)硬脂基醚(
Figure BDA0001498191290000101
76)、聚氧乙烯(20)硬脂基醚(
Figure BDA0001498191290000102
78)、聚氧乙烯(2)油基醚(
Figure BDA0001498191290000103
92)、聚氧乙烯(10)油基醚(
Figure BDA0001498191290000104
97)、聚氧乙烯(20)油基醚(
Figure BDA0001498191290000105
98)和聚氧乙烯(100)硬脂基醚(
Figure BDA0001498191290000106
700)。聚氧乙烯鲸蜡基、聚氧乙烯油基或聚氧乙烯硬脂基醇醚也可以作为粉末使用，例如聚氧乙烯(21)硬脂基醚粉末(
Figure BDA0001498191290000107
721P)。
根据一种实施方式，所述聚氧化烯脂肪醇醚选自聚氧乙烯鲸蜡基、聚氧乙烯油基和聚氧乙烯硬脂基醇醚，并优选选自聚氧乙烯(10)鲸蜡基醚
Figure BDA0001498191290000108
56)、聚氧乙烯(20)鲸蜡基醚(
Figure BDA0001498191290000109
58)、聚氧乙烯(20)硬脂基醚(
Figure BDA00014981912900001010
78)和聚氧乙烯(20)油基醚(
Figure BDA00014981912900001011
98)。特别优选使用聚氧乙烯(20)鲸蜡基醚。
去污剂本质上是两亲性的，并含有在一端的极性基团和在另一端的疏水碳链。当表面活性化合物在溶液中形成非共价簇时，发生胶束化，这种过程由疏水作用驱动。当考虑去污剂应用时，胶束化是一种关键的现象。每种去污剂都可以通过它的临界胶束浓度(CMC)来表征；临界胶束浓度是指下述的去污剂浓度：超过该浓度时，单体自我装配成被称作胶束的非共价集合体(参见Rosen，《表面活性剂和界面现象》(Surfactants and interfacialphenomena)，第三版，2004；Helenius等，去污剂的性质(Properties of detergents).Methods Enzymol，1979，56：第734-49页，和Mukerjee等，水性表面活性剂体系的临界胶束浓度(Critcal micelle concentrations of aqueous surfactants systems)，NSRDS-NBS36卷.1970)。CMC实际上不是在单个浓度下发生的，而是在一个窄的浓度范围内发生的。当总去污剂浓度低于CMC时，在本体溶液中没有去污剂单体。然而，当添加更多去污剂超过CMC时，附加的去污剂单体将进入胶束。去污剂胶束是动态结构；所述胶束内的去污剂单体与溶液中的前去污剂单体不断地快速交换。CMC可通过各种方法来测定，所述方法包括表面张力测量(参见Mittal，通过表面张力法测定水溶液中聚山梨醇酯20的CMC(Determination ofCMC of polysorbate 20in aqueous solution by surface tension method).J PharmSci，1972.61(8)：1334-5页)和染料(例如苯胺基-1-萘磺酸[ANS]结合实验(参见DeVendittis等，估算表面活性剂的临界胶束浓度的荧光测定法(A fluorometric methodfor the estimation of the critical micelle concentration of surfactants)，AnalBiochem，1981，115：第278-286页)。去污剂的疏水基团产生CMC。对直链烷基而言，CMC通常随着烷基链中碳原子的数量增加而降低，直到大约16至18个碳。
据发现，使用具有低CMC的聚氧化烯脂肪醇醚是有益的。根据一种实施方式，所述聚氧化烯脂肪醇醚具有0.15mM或更低的CMC。根据一种实施方式，它具有0.125mM或更低、0.12mM或更低、0.115mM或更低、0.1mM或更低、0.095mM或更低、0.90mM或更低、或者0.085mM或更低的CMC。0.1mM或更低的CMC是优选的。CMC范围包括但不限于0.005至0.15mM、0.01至0.125mM、0.015mM至0.12mM、0.02mM至0.115mM、0.025mM至0.1mM、0.03mM至0.095mM和0.035mM至0.09mM。例如，所述优选实施方式聚氧乙烯(20)鲸蜡基醚具有大约0.08mM的CMC。根据一种实施方式，CMC位于0.05mM至0.09mM范围内。
根据一种实施方式，所述结合混合物包含浓度选自0.05％至15％、0.75％至12％、0.1％至10％、0.125％至8％、0.15％至7.5％、0.175％至6.5％和0.2％至6％的所述至少一种聚氧化烯脂肪醇醚。如通过实施例所证实的，特别合适的是在0.1％至5％和0.1％至2％范围内的浓度。在所述结合混合物中包含多于一种聚氧化烯脂肪醇醚的情况下，所指示的浓度范围根据一种实施方式是指所包含的聚氧化烯脂肪醇醚的总浓度。
所述粒子提供阴离子交换表面。因此，它们在其表面包含阴离子交换基团。所述阴离子交换基团可以是相同类型的，然而，也可以使用不同类型的阴离子交换基团。这样的阴离子交换基团的实例是单胺、二胺、多胺、和含氮芳族或脂族杂环基团。优选地，所述阴离子交换基团包含至少一个氨基基团，例如伯、仲、叔或季氨基基团。在优选实施方式中，所述阴离子交换基团包含选自伯、仲和叔胺的基团，更优选式R3N、R2NH、RNH2和/或X-(CH2)n-Y的基团，
其中
X是R2N、RNH或NH2，
Y是R2N、RNH或NH2，
R彼此独立地是直链、支链或环状的烷基、烯基、炔基或芳基取代基，其可以包含一个或多个杂原子，所述杂原子优选选自O、N、S和P，并且
N是在0至20、优选0至18范围内的整数。
因此，所述阴离子交换基团可以具有可质子化基团并任选可以具有多于一个可质子化基团，所述可质子化基团可以相同或不同。可质子化基团优选是在高pH值下中性或不带电荷而在低pH值下被质子化从而具有正电荷的化学基团。特别是，所述可质子化基团在发生细胞外核酸与所述粒子结合的结合pH下是带正电荷的。优选地，(质子化的)可质子化基团的pKa值在约8至约13、更优选约8.5至约12或约9至约11.5的范围内。
合适的阴离子交换基团的实例特别是氨基基团例如伯、仲和叔氨基基团以及环胺、芳族胺和杂环胺，优选叔氨基基团。所述氨基基团优选带有烷基、烯基、炔基和/或芳族取代基，包括环状取代基以及与所述氮原子一起形成杂环或杂芳族环的取代基。所述取代基优选包含1至20个碳原子，更优选1至12、1至8、1至6、1至5、1至4、1至3或者1或2个碳原子。它们可以是直链或支链的，并可包含杂原子例如氧、氮、硫、硅和卤素(例如氟、氯、溴)原子。优选地，所述取代基包含不超过4、更优选不超过3、不超过2或不超过1个杂原子。
在一种实施方式中，所述阴离子交换基团优选带有1至10个氨基基团。更优选地，所述阴离子交换基团带有2至8个氨基基团，并且具体地，所述阴离子交换基团带有2至6个氨基基团。
胺官能团的实例是伯胺例如氨基甲基(AM)、氨基乙基(AE)、氨基烷基、烷基氨基烷基、二烷基氨基烷基例如二乙基氨基乙基(DEAE)、乙二胺、二乙烯三胺、三乙烯四胺、四乙烯五胺、五乙烯六胺、三甲基氨基(TMA)、三乙基氨基乙基(TEAE)、直链或支链聚乙烯亚胺(PEI)、羧化或羟基烷基化聚乙烯亚胺、聚醚胺、精胺、亚精胺、3-(丙基氨基)丙胺、聚酰胺胺(PAMAM)树枝状聚合物、聚烯丙胺、聚乙烯胺、N-吗啉乙基、聚赖氨酸和四氮杂环烷烃。
优选地，所使用的粒子包含二烷基氨基基团，尤其二乙基氨基基团，其中所述粒子也可以包含多于一种类型的二烷基氨基基团。
在本发明的情形中可以使用的阴离子交换粒子包括但不限于，用阴离子交换基团官能化的粒状材料。作为所述粒子的基本材料，可以使用适合于阴离子交换色谱术的任何材料，包括但不限于：含硅材料例如二氧化硅和聚硅酸材料、硼硅酸盐、硅酸盐、非有机玻璃，有机聚合物例如聚(甲基)丙烯酸酯、聚氨酯、聚苯乙烯、琼脂糖、多糖例如纤维素，金属氧化物例如氧化铝、氧化镁、氧化钛和氧化锆，金属例如金或铂，交联葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺、二乙烯基苯聚合物、苯乙烯二乙烯基苯聚合物、右旋糖苷、及其衍生物；玻璃或二氧化硅。在实施方式中，所述粒子由矿物质或聚合材料例如二氧化硅、玻璃、石英、聚乙烯、聚丙烯、聚偏二氟乙烯、聚丙烯腈、聚氯乙烯、聚丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯或甲基丙烯酸甲酯制成，或含有所述矿物质或聚合材料。重要的是，所述粒子在它们的表面包含阴离子交换基团，并因此提供与所述细胞外核酸相互作用的阴离子交换表面。这样的表面可以通过用合适的阴离子交换基团将所述粒子的基本材料官能化来提供。对于用阴离子交换基团将粒子官能化以便提供阴离子交换表面，几种方法是可行的并且是技术人员已知的。所述阴离子交换基团可以共价或非共价、静电地直接结合于所述粒子的表面，和/或可以形成聚合物或其他组合物的一部分，所述聚合物或其他组合物形成所述粒子的表面涂层或被提供在所述粒子的表面处。所述阴离子交换基团也可以沉淀在所述粒子上。根据一种实施方式，所述阴离子交换基团以涂层的形式施加在所述粒子上。优选共价连接所述阴离子交换基团。所述粒子可以在它们的表面包含用于连接所述阴离子交换基团的官能团，例如诸如Si-O-Si、Si-OH、醇、二醇或多元醇、羧酸酯、胺、磷酸酯或膦酸酯的官能团。可以例如通过使用环氧化物、(活化的)羧酸、硅烷、酸酐、酰基氯、甲酰基基团、三氟乙磺酰基基团或五氟苯基基团，将所述阴离子交换基团连接于固相。所述官能团可以直接连接于固相或经由(直链或支链)间隔基团例如烃如-(CH2)n-基团、碳水化合物、聚乙二醇和聚丙二醇而连接于固相。或者，也可以使用由包含所述阴离子交换基团如氨基官能团的单体构成的聚合物作为阴离子交换材料。在某些实施方式中，所述粒子具有含硅表面例如聚硅酸表面并且所述阴离子交换基团通过利用合适的有机硅烷例如氨基硅烷而偶联于所述表面。
所述阴离子交换基团可以包含与接头结构相连的可质子化基团。所述接头优选是直链、支链或环状的亚烷基、亚烯基或亚炔基基团，其优选包含1至20个碳原子，更优选1至12、1至8、1至6、1至5、1至4、1至3或者1或2个碳原子。它可以进一步包含杂原子例如氧、氮、硫、硅和卤素(例如氟、氯、溴)原子，优选不超过4、更优选不超过3、不超过2或不超过1个杂原子。在优选实施方式中，所述接头基团是亚烷基基团，特别是亚丙基基团。
根据一种实施方式，所述粒子包含含硅表面，优选为用包含至少一个阴离子交换基团的硅烷化合物衍生化的聚硅酸表面。涉及使用有机硅烷例如氨基硅烷的合适的方法是公知的。
所述粒子优选是球形的。所述粒子可具有选自以下范围的平均直径：100nm至35μm、150nm至30μm、200nm至25μm、250nm至20μm、300nm至15μm、350nm至10μm、400nm至7.5μm、450nm至5μm、500nm至3μm、550nm至2.5μm、600nm至2μm和650nm至1.75μm。特别优选的范围包括但不限于100nm至10μm、150nm至7.5μm、200nm至5μm、300nm至4μm、500nm至3.5μm、550nm至2μm和600nm至1.5μm。所述各个尺寸并特别是较小尺寸例如10μm或更小、7.5μm或更小、优选5μm或更小、2.5μm或更小或者1.5μm或更小的粒子容易处理并可很好地重悬浮在所述结合混合物中。此外，相应的小粒子提供大的表面积，所述表面积可结合细胞外核酸并因此可从所述结合混合物高效收集细胞外核酸。
当执行所述结合步骤时，所述阴离子交换粒子不包含在柱或会防止所述粒子在所述结合混合物中移动的其他装置中，但例如当搅拌所述结合混合物时，所述粒子可以在所述结合混合物中移动。因此，必须从所述结合混合物收集所述粒子以回收结合的细胞外核酸。根据一种实施方式，所述粒子是磁性的。这简化了所述粒子的处理，因为它们可以借助于磁体进行处理，这对于自动化是有利的。所述粒子可具有亚铁磁、铁磁、顺磁、或超顺磁的性质并优选是超顺磁的。这样的性质可通过在所述粒子中纳入合适的磁性材料来实现。合适的方法是技术人员已知的。优选地，所述磁性材料被例如用作所述粒子的基本材料的二氧化硅、聚硅酸、玻璃或聚合材料完全囊封。在某些优选实施方式中，所述核酸结合基质是含硅粒子，优选聚硅酸粒子，优选带有阴离子交换基团的磁性聚硅酸粒子。
合适的粒子和阴离子交换基团的实例被描述在WO 2010/072834A1、DE10 2008063 001A1、WO2010072821A1、DE 10 2008 063 003和WO 99/29703中，对它们进行参考。
所述阴离子交换粒子的添加量要使得所述阴离子交换表面的结合容量超过样品中所含的核酸。这支持细胞外核酸的定量分离。每毫升样品的合适的粒子量(以mg计)的非限制性实例包括0.15mg至10mg、0.25mg至5mg、0.5mg至3.5mg、0.75mg至3mg、1mg至2.5mg和1.25mg至2mg。所述合适的量尤其取决于待处理的样品体积和所使用的阴离子交换粒子并可由技术人员确定。
所述结合混合物具有允许所述细胞外核酸与所述粒子的阴离子交换表面结合的pH。所述结合混合物的pH在本文中也称为“结合pH”。在所述结合pH下，所述阴离子交换基团是带电荷的，以致它们可与所述核酸相互作用并由此结合所述核酸。适合于结合的pH特别取决于所述阴离子交换基团的性质。所述结合pH的合适的pH值可由技术人员确定。根据一种实施方式，所述结合pH低于所述阴离子交换基团的可质子化基团的pKa值。如果所述阴离子交换基团包含多于一种类型的可质子化基团，则所述结合pH低于至少一种可质子化基团、优选所有可质子化基团的pKa。优选地，所述结合pH比所述pKa值低至少0.5个单位，更优选至少1个单位、至少1.5个单位、至少2个单位、至少2.5个单位、并最优选比所述pKa值低至少3个单位。
所述结合混合物可具有选自≤7、≤6.5、≤6.25和≤6的pH。根据一种实施方式，所述结合pH在3至7的范围内，更优选在选自3.5至6.5、4至6.25、4.25至6和4.5至5.75的范围内。酸性pH值是有利的，因为它增强结合并此外可以支持可能被捕获在例如组蛋白复合物中的细胞外核酸例如DNA的释放。
根据一种实施方式，所述结合混合物的制备包含调整样品的pH到所述结合pH。这可通过添加酸化化合物和/或试剂来实现。酸化试剂的合适实例包括但不限于酸，酸性缓冲剂例如羧酸例如乙酸、乙酸钠/乙酸缓冲剂、柠檬酸/柠檬酸盐缓冲剂、马来酸、丙二酸、酒石酸、HCl、HClO4、HClO3、甲酸、硼酸、H2SO4、H2SO3、酸性磷酸/磷酸盐缓冲体系、MES或其他水溶性无机或有机酸。所述酸化化合物可被包括在与样品接触的裂解和/或结合组合物中，以便建立所述结合混合物中的结合条件。
为了维持所述结合pH，优选所述结合混合物包含缓冲剂。取决于所使用的缓冲剂，所述缓冲剂可以同时充当酸化化合物，以便建立所述结合混合物中的酸性条件。合适的缓冲剂包括但不限于基于羧酸的缓冲剂、基于磷酸的缓冲剂、磷酸盐缓冲剂和基于氨基酸的缓冲剂例如甘氨酸、谷氨酸/谷氨酰胺、天冬氨酸/天冬酰胺。据发现，这些类型的缓冲剂在本发明的方法中效果很好，其他缓冲体系也可以由技术人员确定。优选使用羧酸例如乙酸、乙酸钠/乙酸缓冲剂、柠檬酸/柠檬酸盐缓冲剂、马来酸、丙二酸和酒石酸，并特别是柠檬酸。所述缓冲剂可被包括在裂解和/或结合组合物中并因此被包括在与样品接触的试剂中，以便建立所述结合混合物中的结合条件。
所述结合混合物可以包含盐。在所述结合混合物中纳入盐改善了分离结果。根据一种实施方式，所述盐是碱金属盐或铵盐。所述碱金属盐根据一种实施方式是碱金属卤化物。合适的实例包括氯化钠、氯化钾和氯化锂，其中氯化钠和氯化钾是优选的。根据一种实施方式，使用氯化钠。所述盐可以以选自50mM至1.5M、75mM至1M、100mM至750mM、125mM至500mM和150mM至350mM的浓度包含在所述结合混合物中。当使用例如750mM和更高的盐浓度时，使用5或更低、优选4.5或更低的pH可能是有利的。特别优选的是在50mM至750mM或75mM至500mM范围内的盐浓度。所述盐可被包括在与样品接触的裂解和/或结合组合物中，以便建立所述结合混合物中的结合条件。
根据一种实施方式，所述结合混合物不包含500mM或更高、200mM或更高或100mM或更高浓度的离液盐例如胍盐、碘化物、硫氰酸盐、高氯酸盐或其他具有相等或更强的离液性质的离液盐。优选地，所述结合混合物缺乏这样的离液盐。这支持了防止不想要的蛋白沉淀，所述蛋白可以例如非特异性地与所述粒子结合或使循环DNA共沉淀，这对收率来说是不利的。当面对富含蛋白质的样品例如血浆时，缺乏如上所述的离液盐尤其是个优点。
根据优选实施方式，所述结合混合物还包含蛋白水解酶。蛋白水解酶是催化例如蛋白质、多肽、寡肽和肽中的肽键切割的酶。示例性的蛋白水解酶包括但不限于蛋白內肽酶(proteinase)和蛋白外肽酶(protease)，特别是枯草杆菌蛋白酶、枯草杆菌酶、碱性丝氨酸蛋白酶等。示例性的枯草杆菌蛋白酶包括但不限于蛋白酶K、蛋白酶R、蛋白酶T、枯草杆菌蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶A、QIAGEN蛋白酶等。枯草杆菌酶、枯草杆菌蛋白酶、蛋白酶K和其他蛋白酶的讨论可以见于Genov等，Int.J.Peptide Protein Res.45：391-400，1995等。优选地，所述蛋白水解酶是蛋白酶K。据发现，纳入蛋白水解酶改善了所得到的洗脱物的纯度。特别是，显著降低了蛋白质污染物的量。另外，据发现，使用蛋白水解酶增加了细胞外核酸收率。这特别是在处理稳定化的样品例如涉及使用甲醛释放剂来稳定化的样品的情况下可看到。如实施例所证明的，当从用无细胞DNA BCT(Streck)稳定化的样品分离例如无细胞DNA时，所述方法是高效的。所述酶优选不被包括在所述裂解和/或结合组合物中，而是单独添加。
根据一种实施方式，通过将所述样品与组合物接触并由此与包含所述至少聚氧化烯脂肪醇醚的试剂接触来制备所述结合混合物。所述组合物可以任选包含盐和/或缓冲剂。关于所述盐和所述缓冲剂的细节如上所述。所述裂解/结合组合物的组分被纳入并由此存在于所述结合混合物中。所述组合物因而协助准备所述结合条件并另外可支持所述样品的消化以使所述细胞外核酸对于结合来说是可接近的。因此，所述组合物可充当裂解和/或结合组合物(在本文中也简称为裂解/结合组合物或裂解/结合试剂)。术语“消化”和“裂解”在本文中可互换使用并且是指含细胞样品的消化以及贫细胞(cell-depleted)或无细胞样品的消化。所述消化或裂解例如通过将细胞外核酸从相关的蛋白质或其他组分释放，支持了致使所述细胞外核酸对于结合来说是可接近的。优选地，所述组合物是水溶液并具有酸性pH值。这种实施方式是有利的，因为它允许简单地通过向样品添加所述组合物，在所述结合混合物中建立结合条件，包括所述结合pH。所述组合物的pH可在选自3至6.5、3.5至6和4至5.5的范围内。所述组合物的pH优选使得当所述组合物被纳入所述结合混合物中时，建立如本文中所述的结合pH。优选所述组合物包含缓冲剂以维持所述pH。所述裂解和/或结合组合物的细节也结合根据第二个方面所述的试剂盒来描述，并且它涉及的相应公开内容在此也适用。
根据一种实施方式，所述裂解和/或结合组合物以适合于建立所述结合条件的量添加到样品中。为了保持处理体积小并在所述结合混合物中包含高样品量，优选所述样品占所述结合混合物的至少50％、至少60％、优选至少70％、更优选至少75％或至少80％。取决于其组成，所述裂解和/或结合组合物可以以例如选自1:25至1:2、1:20至1:3、1:15至1:6和1:10至1:4的比率添加。
所述样品、所述阴离子交换粒子和所述裂解和/或结合组合物可以按任何顺序接触或添加以制备所述结合混合物。如本文中所讨论的，所述样品可以在所述裂解/结合组合物中降解，然后添加所述阴离子交换粒子，和/或它可以在所述结合混合物中并因此在所述阴离子交换粒子存在下降解。另外，可以例如向所述样品添加蛋白水解酶。所述蛋白水解酶可以在例如所述裂解/结合组合物之前、之后或同时与所述样品接触，和/或可以在所述阴离子交换粒子之前、之后或同时添加。
根据一种实施方式，将所述样品与所述裂解/结合组合物和任选，但优选地，蛋白水解酶接触，以便消化所述样品。为了消化所述样品，可以温育由此产生的组合物。这样的消化步骤支持细胞外核酸从例如蛋白质或与所述细胞外核酸相关的其他组分释放。由此，可以使所述细胞外核酸对于核酸结合来说是可接近的。在所述消化步骤之后，可以添加所述阴离子交换粒子以便制备所述结合混合物。
在一种可选实施方式中，通过以下步骤来制备所述结合混合物
-通过将所述阴离子交换粒子与包含所述至少一种聚氧化烯脂肪醇醚并任选包含盐和/或缓冲剂的组合物接触来形成悬液；
-将所述悬液与包含细胞外核酸的生物样品接触；
-任选地，在将所述样品与所述悬液接触之前、同时或之后添加蛋白水解酶。
这种实施方式具有显著的优点。在提供包含所述裂解/结合组合物和所述阴离子交换粒子的悬液之后添加包含所述细胞外核酸的生物样品。这减少了与所述样品接触的操作步骤并从而降低了污染风险。根据优选实施方式，所述蛋白水解酶在将所述悬液与所述样品接触之前纳入所述悬液中。为了制备所述悬液，所述蛋白水解酶、所述组合物、和所述阴离子交换粒子可按任何顺序添加，所述组合物优选是如上所述的裂解和/或结合组合物。如通过实施例所证明的，所述样品的消化可在所述结合混合物内发生。
发生结合的时间足以让所述细胞外核酸与所述阴离子交换粒子基本结合。为了使所述细胞外核酸与所述阴离子交换粒子结合，可以温育所述结合混合物。合适的、相应必要的温育时间取决于所使用的粒子和阴离子交换基团的类型和量、样品体积、和样品中细胞外核酸的浓度。例如，如果使用具有高密度阴离子交换基团并因此能够快速而紧密地结合所述细胞外核酸的粒子的话，较短的温育时间可能就足够了。较长的温育时间确保了所述核酸与所述阴离子交换粒子高效结合，从而允许使所述样品的细胞外核酸回收率最大化。所述结合混合物可以温育例如两分钟至一小时，优选5分钟至45分钟，更优选10分钟至35分钟，更优选15至30分钟。所述结合混合物在温育期间可以搅拌。在所述样品与所述阴离子交换粒子接触之前未被裂解的情况下，延长的温育步骤是特别有利的。在这种实施方式中，所述样品的消化和所释放的细胞外核酸的结合实质上在同一处理步骤中发生。在使用蛋白水解酶的情况下，至少10或至少15min的温育时间是有利的，因为这促进所述样品中所含的蛋白质的彻底消化。所述结合混合物在所述温育步骤期间可以搅拌。
当使用蛋白水解酶来支持所述样品的消化时，本领域中常见的是通过在例如35℃至65℃、例如40℃至55℃范围内的温度下加热来支持所述蛋白水解酶(例如蛋白酶K)的活性。虽然在本发明的方法中可进行这样的加热步骤，但令人惊讶地发现并且在实施例中显示，如果在消化期间不进行加热步骤，而是其中在室温下发生消化的话，分离结果被显著改善。因此，如果在室温下进行所述消化并优选还有所述结合步骤的话，得到改善的结果。更优选地，所述方法的所有步骤(a)至(d)都在不加热并因此在室温下发生。
所述样品是包含细胞外核酸的生物样品。生物样品是从生物来源获得的。所述样品不是带有合成生产的核酸的人造样品，而是从生物来源获得的。生物样品通常具有复杂的组成并包含许多不同的组分，这使得具有足够纯度的核酸分离富有挑战性。所述生物样品可以例如选自体液、全血、血浆、血清、痰液、泪液、淋巴液、滑液、胸膜积液、尿液、汗液、汁液(liquor)、脑脊液、腹水、乳汁、粪便、支气管灌洗液、唾液、羊水、鼻分泌物、阴道分泌物、表面活检、精子、精液、伤口分泌物和排泄物、以及细胞培养物上清液和从其他拭子样品获得的上清液。根据一种实施方式，所述样品是体液、身体分泌物或身体排泄物，优选体液或源自于体液的包含细胞外核酸的样品。最优选地，所述样品是全血、血浆或血清。可用本发明的方法处理的其他样品实例包括但不限于生物样品细胞悬液、细胞培养物、细胞培养物的上清液等，其包含细胞外核酸。生物样品特别是天然样品，例如从人类或动物获得或源自于细胞培养物。所述生物样品可被稳定化。稳定化的样品也被术语生物样品并也被术语天然样品包括在内。此外，细胞可以已经从原始样品去除。相应的贫细胞或无细胞样品也被术语生物样品并也被术语天然样品包括在内。相应的天然样品的典型实例是体液例如血液和源自于体液的样品，特别是通过从体液去除细胞而源自于体液的样品。
根据一种实施方式，所述包含细胞外核酸的生物样品是无细胞或贫细胞样品。相应的无细胞或贫细胞生物样品可通过利用适当的细胞去除技术从例如含细胞样品获得。典型的实例是可从全血获得的血浆或血清。如果所述样品包含大量细胞，如同例如全血的情况那样，则将细胞与剩余样品分离，以便获得包含所述细胞外核酸的无细胞、相应细胞减少的样品级分。因此，根据一种实施方式，从所述含细胞样品去除细胞以提供无细胞或贫细胞样品，所述无细胞或贫细胞样品包含细胞外核酸并利用本发明的方法从中分离所述细胞外核酸。这种细胞去除步骤只是任选的，并且例如如果样品经过处理(相应地获得以供处理)并仅仅包含少量残余细胞，例如血浆或血清，则可以省去这种细胞去除步骤。然而，为了改善结果，优选也去除相应的剩余细胞(或潜在剩余细胞)，因为它们在分离期间可能污染所述细胞外核酸群体。取决于样品类型，可例如通过离心、优选高速离心，或者如果要避免离心步骤的话，通过利用离心以外的手段，例如过滤、沉降或结合于(任选磁性的)粒子上的表面，来分离和去除细胞，包括残留细胞。相应的细胞去除步骤也可以被容易地包括在自动化样品制备方案中。相应去除的细胞也可以被进一步处理，例如以便分析细胞内核酸。可以例如储存所述细胞和/或可以从去除的细胞分离生物分子例如核酸或蛋白质。
本方法特别适合于处理包含少量细胞外核酸的生物样品。即使样品中的核酸浓度很低，也能达到良好的核酸收率。如前言中所讨论的，细胞外核酸取决于样品，经常以1至100纳克/毫升样品的相当低的量包含在所述样品(例如血浆或血清样品)中，虽然例如癌症患者的血浆可包含较高的量。根据一种实施方式，所述含有核酸的样品包含浓度选自2.5微克/毫升样品或更低、2微克/毫升样品或更低、1.5微克/毫升样品或更低、1微克/毫升样品或更低、750纳克/毫升样品或更低、500纳克/毫升样品或更低、300纳克/毫升样品或更低、200纳克/毫升样品或更低、150纳克/毫升样品或更低和100纳克/毫升样品或更低的核酸。
所述样品可以构成稳定化的样品并因此构成已经通过适当的试剂稳定化的样品。本文中描述了实例。
本文中所用的术语“细胞外核酸”特别是指不包含在细胞内的核酸。相应的细胞外核酸也经常被称为无细胞核酸。这些术语在本文中作为同义词使用。因此，细胞外核酸通常存在于样品内细胞的外部或许多细胞的外部。术语“细胞外核酸”是指例如细胞外RNA以及细胞外DNA及其混合物。在生物样品例如体液或源自于体液的样品例如血浆的无细胞级分(相应部分)中发现的典型的细胞外核酸的实例包括但不限于哺乳动物细胞外核酸例如细胞外肿瘤相关或肿瘤来源的DNA和/或RNA、其他细胞外疾病相关DNA和/或RNA、表观遗传修饰的DNA、胎儿DNA和/或RNA、小干扰RNA例如miRNA和siRNA、和非哺乳动物细胞外核酸例如来自例如原核生物(例如细菌)、病毒或真菌的被释放到所述细胞外核酸群体中的病毒核酸、病原体核酸。根据一种实施方式，从体液或源自于体液的样品作为生物样品获得所述细胞外核酸，所述生物样品例如血液、血浆、血清、唾液、尿液、汁液、脑脊液、痰液、泪液、汗液、羊水或淋巴液；优选所述细胞外核酸从前述样品的无细胞或贫细胞部分获得。根据一种实施方式，术语细胞外核酸特别是指哺乳动物细胞外核酸，优选疾病相关或疾病来源的细胞外核酸例如肿瘤相关或肿瘤来源的细胞外核酸、由于炎症或受伤特别是创伤释放的细胞外核酸、与其他疾病相关和/或由于其他疾病释放的细胞外核酸、或源自于胎儿的细胞外核酸。本文中所述的术语“细胞外核酸”也指从其他样品、特别是除体液以外的其他生物样品获得的细胞外核酸。在本文中，我们指的是从循环体液或源自于循环体液的样品、特别是从循环体液的无细胞或贫细胞部分获得的细胞外核酸作为循环细胞外核酸或循环无细胞(ccf)核酸。根据一种实施方式，分离细胞外DNA，特别是循环无细胞DNA。
在步骤a)结束时，所述结合混合物中所含的细胞外核酸与所述阴离子交换粒子结合。
步骤(b)-分离
在步骤(b)中，将带有结合的细胞外核酸的粒子与剩余的结合混合物分离。从而收集所述带有结合的细胞外核酸的粒子。为此，可使用本领域已知的任何手段。合适的手段包括但不限于，如果使用磁性粒子时的磁性分离、例如如果使用非磁性粒子时的离心、沉降、施加真空、过滤等。
步骤(c)-洗涤
在步骤(b)之后，在步骤(c)中可以任选进行一个或多个洗涤步骤。根据一种实施方式，将至少一种洗涤溶液、优选洗涤缓冲剂与结合了所述细胞外核酸的粒子接触。为了确保所述结合的细胞外核酸的最大回收率，应该选择洗涤条件，以使在洗涤期间不会从中去除显著量的与所述核酸结合基质相结合的细胞外核酸。
所述洗涤溶液可以含有表面活性剂。合适的表面活性剂包括但不限于非离子型表面活性剂，例如基于聚氧乙烯的非离子型表面活性剂，优选选自聚氧乙烯脂肪醇醚、聚氧乙烯烷基苯基醚、和聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物。优选的实例是Triton X-100或Brij58，浓度例如为约0.01％-1％。
如果所分离的细胞外核酸例如应该在例如诊断性测定法中被直接分析和/或检测而无需进一步纯化的话，洗涤是特别推荐的。如果所分离的细胞外核酸应该利用例如对潜在杂质敏感的方法(例如PCR法)直接分析的话，推荐进行至少两个洗涤步骤。根据一种实施方式，优选使用两个不同体积的洗涤溶液。在此，第一洗涤溶液的体积优选大于第二洗涤溶液的体积。然而，如果随后使用的检测和/或分析方法对杂质相当不敏感的话，洗涤不是必需的。
合适的洗涤溶液也是现有技术中已知的(参见例如WO2013/045432)，因此，在此不需要任何进一步的描述。
步骤(d)-洗脱
根据一种实施方式，所述方法进一步包含步骤(d)：从所述阴离子交换粒子洗脱细胞外核酸。这个步骤是任选的但优选的。
可以使用任何合适的洗脱方法，并且合适的实施方式是技术人员已知的。优选地，洗脱涉及改变pH值。因此，根据一种实施方式，洗脱在高于所述结合pH的洗脱pH下发生。所述洗脱pH的选择尤其取决于所述粒子上存在的所述阴离子交换基团的性质、所述阴离子交换基团的密度和所述洗脱溶液的离子强度。所述洗脱pH优选比所述结合pH高至少0.5个单位、比所述结合pH高至少1个单位，更优选比所述结合pH高至少1.5个单位或至少2个单位。所述洗脱pH可以低于、等于或超过所述阴离子交换基团的可质子化基团的pKa。
优选地，向结合了所述细胞外核酸的粒子添加洗脱溶液。所述洗脱溶液可以含有缓冲剂，但这不是强制性的。使用两种或更多种洗脱溶液来产生洗脱条件也在本发明的范围内。例如，可以将所述两种或更多种洗脱溶液混合以形成与所述粒子接触的单一洗脱溶液，或者可以将带有结合的核酸的粒子与两种或更多种分开的洗脱溶液接触，所述两种或更多种分开的洗脱溶液当与所述粒子接触时一起产生所述洗脱条件并由此产生所述“洗脱溶液”。所述洗脱优选在选自pH≥8且≤14；pH≥8且≤13.5；pH≥8且≤13；≥8且≤12.75的范围内的pH下发生。因此，可以使用pH在这些范围内的洗脱溶液。所述pH值也可以取决于洗脱物的预期的进一步应用。如果在较高的pH值(例如10或更高)下发生洗脱的话，则可以对包含核酸的洗脱物进行中和，例如如果相应的中性pH值对预期的下游应用有益的话。
也可以通过加热和/或振荡来协助洗脱。合适的洗脱程序也被描述在WO 2013/045432中，对其进行参考。
步骤(e)–分析所述分离的细胞外核酸
所述分离的细胞外核酸可利用合适的测定法和/或分析方法来分析和/或进一步处理。由此，根据一种实施方式，在步骤(e)中对所述分离的细胞外核酸进行分析。可进行所述分析以便鉴定、检测、筛查、监测或排除疾病、感染和/或至少一种胎儿特征。
所述分离的细胞外核酸和/或被包含或怀疑包含在所述分离的细胞外核酸中的特定靶细胞外核酸可以被鉴定、定量、修饰、与至少一种酶相接触、扩增、逆转录、克隆、测序、与探针相接触、和/或检测。相应的方法是现有技术中公知的并普遍应用于医疗、诊断和/或预后领域，以便分析细胞外核酸(也参见本发明的背景中的详细描述)。因此，在任选作为总核酸、总RNA和/或总DNA的一部分，分离细胞外核酸之后，可以对它们进行分析以鉴定疾病状态的存在、不存在或严重度，所述疾病状态包括但不限于众多肿瘤疾病，特别是恶变前肿瘤和恶性肿瘤例如不同形式的癌。例如，在许多应用领域，包括但不限于无创产前遗传检测即筛查、疾病筛查、肿瘤学、癌症筛查、早期癌症筛查、癌症治疗监测、遗传检测(基因分型)、感染性疾病检测、病原体检测、损伤诊断、创伤诊断、移植医学或许多其他疾病中，可以分析所述分离的细胞外核酸以便检测诊断性和/或预后性标志物(例如，胎儿或肿瘤来源的细胞外核酸)，并因此具有诊断和/或预后相关性。根据一种实施方式，分析所述分离的细胞外核酸以鉴定和/或表征疾病感染或胎儿特征。可以利用任何核酸分析/处理方法来进行所述核酸的分析/进一步处理，所述方法包括但不限于扩增技术、聚合酶链反应(PCR)、等温扩增、逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)、定量实时聚合酶链反应(Q-PCR)、数字PCR、凝胶电泳、毛细管电泳、质谱测定法、荧光检测、紫外光谱测定法、杂交测定法、DNA或RNA测序、限制酶切分析、逆转录、NASBA、等位基因特异性聚合酶链反应、聚合酶循环组装(PCA)、不对称聚合酶链反应、线性指数聚合酶链反应(linear after the exponential polymerase chainreaction)(LATE-PCR)、解螺旋酶依赖性扩增(HDA)、热启动聚合酶链反应、序列间特异性聚合酶链反应(ISSR)、反向聚合酶链反应、连接介导的聚合酶链反应、甲基化特异性聚合酶链反应(MSP)、多重聚合酶链反应、巢式聚合酶链反应、固相聚合酶链反应、或其任何组合。相应的技术是技术人员公知的，因此不需要在此进一步描述。
实施方式
本发明的方法可以手动、或利用自动化系统进行。手动方法经常可以处理较大的样品体积。自动化系统由于它们的设计，对于它们可以处理的体积通常具有某个限度。自动化系统特别具有可以同时处理许多样品的优点，并且因为避免了操作误差，自动化系统不太易于出错。在要处理大量的样品的场合，正如许多实验室中为医疗和/或诊断目的分析样品的情况，这是特别的优点，本方法特别适合于自动化。因此，根据一种实施方式，所述方法利用自动化系统来进行。在这种实施方式中，优选使用磁性粒子，因为这简化了所述粒子的处理。借助于磁场，例如通过利用永久磁铁，可以容易地处理包括结合的细胞外核酸的磁性粒子。这种实施方式例如可与能够处理磁性粒子的已建立的机器人系统相容。在此，本领域中使用能与本方法相结合使用的不同机器人系统。根据一种实施方式，将磁性粒子收集在反应容器的底部或侧面，并将剩余的液体样品从所述反应容器去除，留下所收集的结合了所述细胞外核酸的磁性粒子。所述剩余样品的去除可通过倾析或吸出而发生。这样的系统在现有技术中是公知的，因此不需要在此详细描述。在一种可选的已知用于处理磁性粒子的系统中，将通常被罩子或封套覆盖的磁体投入所述反应容器中来收集所述磁性粒子。然后将所收集的粒子转移到新的反应容器，例如以便进行洗涤或洗脱步骤。因为相应的系统是现有技术中公知的并且也是可商购的(例如
Figure BDA0001498191290000271
QIAGEN)，它们在此不需要任何详细描述。在实施例中也使用自动化系统QIAsymphony，这是一种可商购的能够全自动执行核酸富集和纯化方案的核酸提取机器人。在另一种可选的用于处理磁性粒子的系统中，将包含磁性二氧化硅粒子的样品吸入移液管尖端，并通过例如向所述移液管尖端的侧面施加磁体，将所述磁性粒子收集在所述移液管尖端中。然后可以将剩余的样品从所述移液管尖端放出，而所收集的带有结合的靶DNA分子的磁性二氧化硅粒子由于所述磁体而留在移液管尖端中。然后可以进一步处理所收集的磁性粒子。这样的系统也是现有技术中公知的并且也是可商购的(例如BioRobot EZ1；QIAGEN)，因此，在此不需要任何详细描述。
根据一种实施方式，用本方法处理的样品体积选自0.1ml至20ml、0.5ml至15ml、0.75ml至10ml、1.0ml至8ml、1.5ml至6ml和1.75ml至5ml。
通过拆分原始样品、平行处理样品部分和在洗脱之前再联合例如所述洗脱物或所述阴离子交换材料，可以克服对于能一次性处理的样品体积的限制(这是例如许多自动化系统的情况)。这种样品拆分以及洗脱物和/或固相的再联合允许利用只能处理有限样品体积的自动化系统来容易地处理较大的样品体积。在另一种高度有利的实施方式中，将应该分离细胞外核酸的样品也拆分成两个或更多个部分。对于也称为样品部分1的第一部分，如本文中所述进行步骤(a)和(b)。从样品部分1获得的带有结合的细胞外核酸的粒子然后用作第二样品部分(也称为样品部分2)的粒子，所述第二样品部分在其它方面按照如本文中所述的步骤(a)进行处理。因此，样品部分2中所含的细胞外核酸在步骤(a)中与已经结合了来自样品部分1的细胞外核酸的相同粒子结合。在样品部分2的结合步骤之后，提供了结合有来自所述第一和第二样品部分的细胞外核酸的粒子。然后将带有来自样品部分1和样品部分2的结合的细胞外核酸的粒子与样品部分2的剩余结合混合物分离。然后可以任选地如步骤(c)和(d)中所定义的对来自样品部分1和2的结合的细胞外核酸进行洗涤和洗脱，或者如果存在样品部分3的话，带有来自样品部分1和2的结合的细胞外核酸的粒子可用作样品部分3的结合混合物中的粒子。对所存在的样品部分数量均可执行这种原则。然后可以任选地对来自样品部分1、样品部分2和任选的其他样品部分的所述结合的细胞外核酸进行洗涤和洗脱。从而可获得包含来自原始样品的细胞外核酸的洗脱物。只需要一个洗脱步骤。据发现，当利用自动化系统执行所述方法时，这种原则特别有利。在此，在处理和例如温育样品部分1以使样品部分1的细胞外核酸与所述粒子结合的时间期间，可制备除所述粒子之外的样品部分2的结合混合物。此外，与样品输入体积无关，可使用相同的粒子量，这有利于核酸的恒定/稳固洗脱。
根据一种实施方式，所述方法包含
(a)从所述生物样品制备结合混合物，所述结合混合物包含
i)细胞外核酸；
ii)提供阴离子交换表面的磁性粒子；
iii)浓度为0.1％至10％、优选0.15％至7.5％、更优选0.2％至6％的至少一种聚氧乙烯脂肪醇醚；
iv)至少一种碱金属盐；
(v)任选的至少一种蛋白水解酶；
其中所述结合混合物的pH≤6.5，以使细胞外核酸与所述粒子结合，
(b)以磁力将带有结合的细胞外核酸的磁性粒子与剩余的结合混合物分离；
(c)洗涤所述结合的细胞外核酸；
(d)洗脱结合的细胞外核酸。
以上描述了合适的和优选的聚氧乙烯脂肪醇醚和阴离子交换粒子并参考相应的公开内容。所述生物样品根据一种实施方式是体液或源自于体液的样品例如血浆或血清。缓冲剂可用于维持所述结合混合物的pH。
根据一种实施方式，所述方法包含
(a)从所述生物样品制备结合混合物，所述结合混合物包含
i)细胞外核酸；
ii)提供包含胺基团的阴离子交换表面的磁性粒子；
iii)浓度选自0.1％至6％、0.2％至5％、0.25％至4％、和0.3％至3％的至少一种聚氧乙烯脂肪醇醚，其中所述聚氧乙烯脂肪醇醚选自聚氧乙烯鲸蜡基醚、聚氧乙烯硬脂基醚和聚氧乙烯油基醚，并优选是聚氧乙烯鲸蜡基醚；
iv)浓度选自100mM至1M、125mM至750mM和125mM至500mM的至少一种碱金属卤化物，优选选自氯化钠、氯化钾和氯化锂，更优选氯化钠；
(v)任选的至少一种蛋白水解酶；
其中所述结合混合物的pH≤6.5，以使细胞外核酸与所述粒子结合，
(b)以磁力将带有结合的细胞外核酸的磁性粒子与剩余的结合混合物分离；
(c)洗涤所述结合的细胞外核酸；
(d)洗脱结合的细胞外核酸。
所述生物样品根据一种实施方式是体液或源自于体液的样品例如血浆或血清。缓冲剂可用于维持所述结合混合物的pH。
根据一种实施方式，从中分离所述细胞外核酸的样品是稳定化的样品。许多样品例如血液样品或源自于血液的样品例如血浆或血清在收集时利用适当的稳定剂稳定化。例如，血液或源自于血液的样品例如血浆或血清通常至少通过添加抗凝剂、优选螯合剂例如EDTA或柠檬酸钠来稳定化。可以加入所采用的稳定化来保存样品中的细胞外核酸群体。现有技术中已知有几种方法能实现样品的稳定化，包括所述样品中包含的细胞外核酸群体的稳定化。所述稳定化防止所述细胞外核酸降解和/或防止所述细胞外核酸被细胞内核酸、特别是由样品中所含的细胞释放的基因组DNA污染。
用于使细胞外核酸稳定化的高效稳定化技术被描述在WO 2013/045457、WO 2013/045458、WO 2014/146781、WO 2014/049022和PCT/EP2015/055699中，所述文献在本文中通过引用并入。这些方法具有它们不依赖于使用甲醛释放剂的优点。实验中已经显示，本发明的方法在从样品例如根据这些技术稳定化的血浆样品分离细胞外核酸中也是高效的。
另一种已知的原则采用使用甲醛释放剂(参见例如US 7,332,277和US 7,442,506)。基于甲醛释放剂的稳定剂可从Streck Inc.以无细胞RNABCT(采血管)的名称商购，它们被描述为由专利US 8,304,187和US 8,586,306覆盖。在此，稳定化尤其涉及使用重氮烷基脲。然而，使用甲醛或甲醛释放物质具有缺点，因为可通过诱导核酸分子之间或蛋白质与核酸之间的交联而阻碍细胞外核酸的分离。因此，许多常规核酸分离方法不容许从甲醛释放剂稳定化的样品定量分离细胞外核酸，而导致收率降低。本发明的方法可用于从甲醛释放剂稳定化的样品例如从利用甲醛释放剂例如重氮烷基脲稳定化的血液获得的血浆样品有效分离细胞外核酸。可达到的细胞外核酸收率高。如果所述结合混合物中包括蛋白水解酶的话，情况尤为如此。
因此，根据一种实施方式，使用本发明的方法以便从甲醛释放剂稳定化的样品分离细胞外核酸。基于使用甲醛释放剂的相应稳定化方法是现有技术中已知的并且例如被公开在US 2011/0111410中，所述文献在本文中通过引用并入。通过将样品例如血液与至少一种甲醛释放剂接触来获得稳定化的样品。如本文中所述，细胞优选被去除，并从所述稳定化的样品的无细胞级分，例如在血液情况下的血浆或血清，分离所述细胞外核酸。甲醛释放剂通常被描述为随时间释放甲醛和/或多聚甲醛的化合物。可结合本方法使用的合适的“甲醛释放剂”包括但不限于，重氮烷基脲、咪唑烷基脲、二羟甲基-5,5-二甲基乙内酰脲、二羟甲基脲、2-溴-2-硝基丙烷-1,3-二醇、
Figure BDA0001498191290000311
唑烷、羟甲基甘氨酸钠、5-羟基甲氧基甲基-1-1氮杂-3,7-二氧杂双环[3.3.0]辛烷、5-羟甲基-1-1氮杂-3,7-二氧杂双环[3.3.0]辛烷、5-羟基聚[亚甲基氧基]甲基-1-1氮杂-3,7-二氧杂双环[3.3.0]辛烷、季金刚烷、或前述各项的任何组合。所述甲醛释放剂优选是杂环脲并可以选自重氮烷基脲(DU)、咪唑烷基脲(IDU)、及其任何组合。在有利的实施方式中，所述稳定化涉及使用重氮烷基脲(DU)和/或咪唑烷基脲，优选重氮烷基脲。所述样品可以已经与其他添加剂接触以改善所述稳定化效应。例如，当使血液或源自于血液的样品稳定化时，所述稳定化将涉及添加抗凝剂。可包含在稳定化组合物中或可单独添加到所述样品中的抗凝剂的实例包括但不限于肝素、金属离子螯合剂、特别是柠檬酸盐、草酸盐、EDTA、及其组合。
根据一种实施方式，从样品分离总核酸，并且所述细胞外核酸被包含在其中作为一部分。如果所述样品是无细胞或贫细胞样品，则从中分离的总核酸将主要包含细胞外核酸或甚至由细胞外核酸组成。至少主要分离特定的靶核酸也在本发明的范围内。靶核酸可以是例如某种类型的核酸，例如RNA或DNA，包括mRNA、microRNA、其他非编码核酸、表观遗传修饰的核酸、和在所述细胞外核酸群体中所含的其他核酸。在分离之后例如使用核酸酶消化非靶核酸也在本发明的范围内。术语靶核酸也可以是指特定种类的核酸，例如已知是某种疾病标志物或病毒核酸的细胞外核酸。如上所讨论的，所述细胞外核酸的分离也可以包含通过例如使用适当的捕获探针来特异性分离相应的靶核酸。术语“靶核酸”也是指具有一定长度的核酸，例如长度为2000nt或更短、1000nt或更短或者500nt或更短的核酸(如上所讨论的，由“nt”指示的链长在双链DNA的情况下是指bp)。分离相应较小的靶核酸可能是有利的，因为已知细胞外核酸通常具有小于2000nt、通常小于1000nt并经常甚至小于500nt的较小尺寸。将所述分离，相应的纯化，集中在相应的小核酸上可以增加在分离的核酸中获得的细胞外核酸的份额。
优选地，使用根据第二个方面所述的试剂盒，以便执行根据第一个方面所述的方法。关于所述试剂盒的特征，参考随后的公开内容。
试剂盒
根据第二个方面，提供了用于执行根据第一个方面所述的方法的试剂盒。所述试剂盒包含
(a)裂解和/或结合组合物，其包含
i)至少一种聚氧化烯脂肪醇醚；
ii)任选的至少一种盐；
iii)至少一种缓冲剂；
其中所述组合物具有酸性pH；
(b)提供阴离子交换表面的粒子；和
(c)任选的蛋白水解酶；
(d)任选的一种或多种洗涤溶液；和
(e)任选的一种或多种洗脱溶液。
可以使用所述试剂盒以便执行根据第一个方面所述的方法。优点如上所述。在添加到样品中的所述裂解和/或结合组合物中包括聚氧化烯脂肪醇醚来制备所述结合混合物是有利的。补偿了在所述粒子储存期间可能发生的所述阴离子交换表面的变化，从而改善分离结果。所分离的核酸具有高质量和纯度。所述方法从而变得更可靠，这特别是在分离细胞外核酸用于医疗和/或诊断领域时是重要的优点。
所述裂解和/或结合组合物包含至少一种聚氧化烯脂肪醇醚。细节如上文所述并且它涉及的上述公开内容在此也适用。如上所讨论的，所述聚氧化烯脂肪醇醚可以选自聚氧乙烯鲸蜡基、聚氧乙烯油基和聚氧乙烯硬脂基醇醚并优选选自聚氧乙烯(10)鲸蜡基醚(
Figure BDA0001498191290000333
56)、聚氧乙烯(20)鲸蜡基醚(
Figure BDA0001498191290000331
58)、聚氧乙烯(20)硬脂基醚(
Figure BDA0001498191290000334
78)和聚氧乙烯(20)油基醚(
Figure BDA0001498191290000332
98)。特别优选使用聚氧乙烯(20)鲸蜡基醚。
所述至少一种聚氧化烯脂肪醇醚可以以0.2％直至饱和限的浓度包含在所述裂解和/或结合组合物中，所述聚氧化烯脂肪醇醚优选是聚氧乙烯脂肪醇醚。合适的浓度包括但不限于0.5％至15％、0.75％至12.5％、1％至10％、1.5％至7.5％和2％至6％。在所述裂解和/或结合组合物中包含多于一种聚氧化烯脂肪醇醚的情况下，所指示的浓度范围根据一种实施方式是指所包含的聚氧化烯脂肪醇醚的总浓度。
所述裂解和/或结合组合物包含盐。所述盐根据一种实施方式是碱金属盐或铵盐。所述碱金属盐优选是碱金属卤化物。合适的实例包括氯化钠、氯化钾和氯化锂，其中氯化钠和氯化钾是优选的。根据一种实施方式，使用氯化钠。所述盐可以以选自100mM至4M、200mM至3.5M、300mM至3M、500mM至2.5M、750mM至2.25M和1M至2M的浓度包含在所述裂解和/或结合组合物中。
所述裂解和/或结合组合物包含缓冲剂。所述缓冲剂优选是酸性的。在上文中结合所述方法描述了合适的缓冲剂。它们包括但不限于酸性缓冲剂例如羧酸例如乙酸、乙酸钠/乙酸缓冲剂、柠檬酸/柠檬酸盐缓冲剂、马来酸、丙二酸和酒石酸，基于磷酸的缓冲剂，磷酸盐缓冲剂，和基于氨基酸的缓冲剂例如甘氨酸、谷氨酸/谷氨酰胺、天冬氨酸/天冬酰胺。使用羧酸例如柠檬酸是优选的。
所述裂解和/或结合组合物具有酸性pH。所述组合物的pH可以在选自3至6.5、3.5至6和4至5.5的范围内。当将样品与所述裂解和/或结合组合物接触时，所述样品的pH降低并建立所述结合pH。
所述试剂盒还包含提供阴离子交换表面的粒子。关于所述粒子和所述阴离子交换基团的细节如上文详细描述的并且它涉及的上述公开内容在此也适用。优选地，所述粒子包含氨基基团，例如伯、仲或叔氨基基团。如上所讨论的，所述粒子优选是磁性的。
所述试剂盒还可以包含蛋白水解酶。细节如上文所描述的并且它涉及的上述公开内容在此也适用。优选地，所述蛋白水解酶是蛋白酶K。所述酶优选不被包括在所述裂解和/或结合组合物中。
所述试剂盒还可以包含一或多种洗涤溶液。细节如上文所描述的并且它涉及的上述公开内容在此也适用。
所述试剂盒也可以包含一种或多种洗脱溶液。细节如上文所描述的并且它涉及的上述公开内容在此也适用。
本发明不受本文中公开的示例性方法和材料限制，并且与本文中所述的方法和材料相似或等效的任何方法和材料均可用于实践或测试本发明的实施方式。数值范围包括限定所述范围的数值。本文中提供的标题不限制本发明的各种方面或实施方式，所述方面或实施方式可以将说明书作为一个整体进行参考来理解。
用于本说明书中时，不带数量指示的指称物包括复数方面，除非上下文明确地另有规定。因此，例如，对“聚氧化烯脂肪醇醚”的指称包括单一类型的聚氧化烯脂肪醇醚、以及两种或更多种聚氧化烯脂肪醇醚。同样地，对“盐”、“添加剂”、“缓冲剂”等的指称包括单一实体和两种或更多种这样的实体的组合。对“本公开”和“本发明”等的指称包括本文中教导的单个或多个方面；等等。本文中教导的方面被术语“发明”包括在内。
如本文中所用的术语“溶液”特别是指液体组合物，优选水性组合物。它可以是只有一个相的均匀混合物，但溶液包含固体添加物例如沉淀物，特别是含有化学品例如稳定剂，也在本发明的范围内。
本文中参考核苷酸(nt)指示的尺寸，相应的尺寸范围，是指链长，因而用于描述单链以及双链分子的长度。在双链分子中，所述核苷酸是配对的。
根据一种实施方式，本文中在方法的情况下被描述为包含某些步骤或在组合物、溶液和/或缓冲剂的情况下被描述为包含某些成分的主题是指由相应的步骤或成分组成的主题。优选选择和组合本文中描述的优选实施方式，并且由优选实施方式的相应组合产生的特定主题也属于本公开。
本申请要求EP 15171466(2015年6月10日提交)的优先权，其公开内容在此通过引用并入。
实施例
材料和方法
通过进行两个离心步骤(1.900xg下15min，16.000xg下10min(4℃))以去除细胞，从全血样品获得血浆样品。利用自动化系统(QIAsymphony)从血浆样品(如果没有另外指示的话就是2ml)分离细胞外DNA(ccfDNA)。将所述血浆与下列试剂接触以制备所述结合混合物(pH大约5)：
-包含碱金属盐(1.5至2M)、羧酸和非离子型去污剂的裂解/结合缓冲剂(pH 4-5)。在所进行的实验中，使用不同的非离子型去污剂并在不同的浓度下比较(参见下文)。所述裂解/结合缓冲剂支持所述样品的消化和所述细胞外核酸的释放。它建立了所述结合条件。
-用于消化所述样品中含有的蛋白质的蛋白酶K。
-包含叔胺基团作为阴离子交换基团的磁性二氧化硅粒子(对于2ml血浆来说大约3mg)。
将所述结合混合物温育20min以允许ccfDNA与所述阴离子交换粒子结合。将结合的ccfDNA洗涤三次并利用75μl的碱性洗脱溶液(pH大约12)洗脱。
为了比较，用QIAamp循环核酸试剂盒(QIAGEN GmbH)，利用“从1ml、2ml或3ml血清或血浆纯化循环核酸”的方案，从血浆分离ccfDNA。如果没有另外说明，则根据制造商的推荐，将2ml血浆与蛋白酶K和裂解缓冲剂ACL混合，在60℃温育30min，与缓冲剂ACB混合，在使用QIAvac 24Plus真空歧管的QIAamp微型柱(其包含用于结合所述核酸的二氧化硅固相)上结合，洗涤并分别用60μl和75μl洗脱缓冲剂AVE洗脱。
通过PCR分析获得的核酸收率(18s rDNA(66bp)和18s rDNA(500bp)并与基因组DNA稀释系列比较以确定拷贝数。如果没有另外说明的话，利用8μl洗脱物在Abi PrismHT7900(Life technologies)上以实时PCR测定法对分离的ccfDNA进行分析。在20μl测定体积中，利用QuantiTect多重PCR试剂盒试剂(QIAGEN GmbH)，在多重PCR中扩增人类18S rDNA基因的两个片段，66bp和500bp。将各个样品的循环阈值(Ct值)根据gDNA标准曲线转换为所述洗脱物中gDNA的量：总定量通过与用从10.000稀释到10个基因组等效物(1个基因组等效物等于约3.6pg的人类基因组单倍体DNA)的人类基因组DNA产生的标准曲线进行比较来完成。由此可以确定所述洗脱物中的拷贝数。然后将该拷贝数除以所使用的洗脱物的量(例如在使用8μl洗脱物的情况下是8)，以便消除所使用的洗脱物量的差异。由此确定每微升洗脱物的拷贝数。然后将该值乘以总洗脱物的量，例如在洗脱物体积是75μl的情况下是75。由此确定洗脱物中的拷贝数并可以在不同的实验之间比较。另外，然后将该计算得到的总拷贝数除以所使用的血浆体积的量(例如在使用2ml血浆的情况下是2)，以便消除所使用的血浆体积的量的差异。由此确定每毫升血浆的拷贝数并可以在不同的实验之间比较。
表1：总结通过定量实时PCR检测的所使用的DNA靶序列的信息
Figure BDA0001498191290000381
实施例1
据发现，虽然由于血浆中ccfDNA的浓度很低，珠粒的ccfDNA饱和度不是限制性的，但所述粒子的阴离子交换表面(最可能可用的带正电荷的基团)的小差异导致对ccfDNA回收率的大影响。一种解释是(血浆中可用的极度过量的)杂质同ccfDNA竞争与所述阴离子交换粒子结合。另外，ccfDNA的亲和性强烈取决于可利用的带负电荷的骨架，后者又取决于它从相互作用蛋白质的释放。因此，阴离子交换表面的小变化可以强烈影响杂质和ccfDNA的竞争亲和性，导致ccfDNA回收率显著降低。所述阴离子交换表面的这种变化可以在所述阴离子交换粒子的制造过程期间或在所述粒子的长时间储存期间，例如当作为试剂盒提供时发生。当在所述结合混合物中不使用去污剂时看到这种效应，并且当在所述结合混合物中使用非离子型去污剂Triton X-100时也看到这种效应。
实施例1证明，在结合缓冲剂中包括聚氧化烯脂肪醇醚例如Brij58，补偿了阴离子交换粒子性能的差异。所述结果表明，所述聚氧乙烯脂肪醇醚增加了ccfDNA对所述阴离子交换粒子的亲和性，因此实现了ccfDNA一贯地以高收率分离，即使当面对所述阴离子交换表面的变化时。当使用Triton X-100作为非离子型去污剂时，看不到这种有利效应。
在实施例1中，使用相同类型的阴离子交换粒子的四个不同珠粒批次。从以前的实验知道，当在结合混合物中使用Triton X-100作为非离子型去污剂时，这些珠粒批次显示出ccfDNA回收率降低。相反，当在所述结合混合物中使用聚氧乙烯脂肪醇醚Brij58时，看到在ccfDNA回收率方面的明显更稳固的性能(参见图1)。从中已去除带有结合的ccfDNA的粒子的所述结合混合物剩余物(上清液)的分析证实，使用Triton X-100时ccfDNA收率降低是基于在所述上清液中发现的高分率的ccfDNA并且所述ccfDNA因此在结合步骤期间不与阴离子交换粒子结合，尽管阴离子交换表面对于样品中存在的ccfDNA而言大为过量。
实施例2
在从EDTA稳定化的血浆分离细胞外核酸的第二种实验设置中，证实了使用更敏感的珠粒(“老化过程”)与在所述结合混合物中纳入Brij58的结合条件的组合时ccfDNA回收率的稳固性增加。对于在储存两个月内显示出性能降低的阴离子交换粒子(R1.1.1和R1.2.1)或在储存7个月之后显示出性能降低的参考珠粒(P7.1.1)，如果在所述结合混合物中使用Brij58作为非离子型去污剂，ccfDNA收率可以恢复到初始收率(参见图2)。使用Triton X-100时在ccfDNA回收率方面显示出良好性能的阴离子交换粒子如果使用Brij58的话，性能不能进一步增加。
实施例3
测试不同的其他去污剂以评价它们对ccfDNA回收率的影响。与Triton X-100相比，去污剂例如CTAB、DTAB、CHAPS显示出差性能(数据未显示)。
实施例4
进行实验来比较所述结合混合物中不同浓度的非离子型去污剂Triton X-100和Brij58(聚氧乙烯脂肪醇醚)。目的在于评价所述非离子型去污剂对ccfDNA提取效率的影响。图3说明了对于在实时PCR(18S编码序列)中小扩增子(66bp)的扩增而言，Brij58与Triton X-100相比显示出可比的ccfDNA回收率。所述500bp扩增子的扩增揭示了，在所述结合混合物中使用0.5％Brij58与0.2％Triton X-100相比，改善了大DNA片段的提取效率/纯度(参见图4)。
比较结合缓冲剂中不同浓度的Brij58的其他实验显示，在结合混合物中0.1-2.0％Brij58范围内，ccfDNA提取性能没有显著差异。如图5中显示，也可以使用所述结合混合物中高达5％Brij58的更高浓度，同时达到与参考(QIAamp循环核酸试剂盒)相当的性能。因此，所述聚氧化烯脂肪醇醚Brij58在所述结合混合物中的各种浓度都是有效的。此外，与Triton X-100相比，所述聚氧化烯脂肪醇醚在所述裂解和/或结合组合物中显示出更高的溶解度。因此，Brij58也能以更高的浓度用于所述裂解和/或结合组合物中以及所述结合混合物中。增加的Triton X-100浓度以及含有Triton X-100的裂解和/或结合组合物在45℃下的储存(模拟长期储存)超过了Triton X-100的溶解限。对于Brij58，在实验中未见到这种效应。
实施例5
分析了使用利用其中在结合混合物中包括Brij58的方案获得的洗脱物时见到的改善是否可归因于ccfDNA收率增加和/或可归因于所述洗脱物的纯度较高。更纯的洗脱物对所述PCR反应显示出较少的抑制效应，因为所述洗脱物包含较少的或甚至不含PCR抑制剂。这又提高了ccfDNA的检测并因而改善了结果。
图6和7显示了所述结合混合物中的Brij58与Triton X-100相比，对洗脱物纯度和随后的PCR效率/PCR抑制的影响。当在结合混合物中使用Triton X-100时(参见图6)，如果血浆输入体积从2增加到6ml(洗脱物中杂质浓度增加)并且在PCR中使用从2至8μl的增加的输入体积的话，可见到某种程度的PCR抑制，并且对于大的500bp扩增子来说示出了降低的ccfDNA收率。
相反，当在所述结合混合物中使用Brij58时，没有看到PCR抑制(参见图7)。发现在2至6ml血浆输入体积下对于大的500bp扩增子而言ccfDNA收率是相当的，并且如果在PCR中使用从2至8μl的增加的输入体积的话，ccfDNA回收率稍有增加。
对洗脱物纯度明确增加以及伴随的与下游应用的相容性增加的一种解释是临界胶束浓度(CMC)。Triton X-100以1.6mM的终浓度使用(CMC：0.2-0.9mM)并且Brij58以4.5mM的终浓度使用(CMC：0.08mM)。Brij58最有可能在所述处理溶液内形成胶束，其可能包含来自血浆的杂质，从而防止杂质与珠粒结合。
去除杂质可能不仅影响洗脱物的纯度，而且也可能影响ccfDNA与AnEx珠粒的亲和性，这是由于(I)竞争剂杂质的可利用性降低(包埋在胶束中)和(II)更“裸露的”ccfDNA(从DNA-蛋白复合物去除杂质(＝蛋白质))，其与包封在蛋白复合物中的DNA相比显示出与AnEx珠粒的更高亲和性。
实施例6
令人惊讶地发现，消化期间的温度影响所述ccfDNA收率。在实施例6中，从2ml血浆样品提取ccfDNA。通过使用所述结合混合物中30μl或60μl ProtK与在室温下或在65℃下温育10min的组合，修改消化条件。将所述样品在所述结合缓冲剂中存在ProtK的条件下消化之后，添加磁性阴离子交换粒子以结合所述ccfDNA。对每种条件测试6个重复样。
令人惊讶地发现，在裂解期间升高的温度降低了ccfDNA收率。所述6个重复样中的2个显示出当在65℃下使用30μl或60μl ProtK时，ccfDNA收率大幅降低。相反，在室温下处理的样品一直提供良好的收率并且没有遇到下降。图8以箱形图的形式总结了结果。能够看出，在升高的温度下，获得了宽的箱(25-75％回收率)。因此，在室温下进行消化对于提高提取结果的一致性和可靠性并由此确保一贯的高ccfDNA收率是有利的。
实施例7
进行其他实验来比较用其他聚氧化烯脂肪醇醚非离子型去污剂达到的结果与用聚氧化烯脂肪醇醚Brij58达到的结果。采用上文所述的使用磁性阴离子交换粒子从血浆样品分离循环DNA的自动化提取方案，测试下列非离子型去污剂：
-Brij 58(聚氧乙烯鲸蜡基醚)；
-Brij 35(聚氧乙烯月桂基醚)；
-Brij 78(聚氧乙烯硬脂基醚)；和
-Brij 98(聚氧乙烯油基醚)。
从利用产品无细胞DNA BCT(Streck Inc，目录号：218962)稳定化的血液样品获得所述血浆样品。将2ml血浆与300μl结合缓冲剂、不同的去污剂、蛋白酶K和带有叔胺基团作为阴离子交换基团的磁性阴离子交换粒子接触。每种非离子型去污剂在所述结合混合物中以2％、0.5％和0.1％的终浓度进行测试。对每种条件测试2个重复样(n＝2)。将所述结合混合物温育大约20min以允许ccfDNA与所述阴离子交换粒子结合。将带有结合的ccfDNA的磁性粒子与剩余的样品分离，洗涤三次并利用75μl的碱性洗脱溶液(pH大约12.0)洗脱(也参见上文，材料和方法)。
对洗脱物进行实时PCR(18S编码序列；双链体PCR)并按每毫升血浆的拷贝数计算ccfDNA回收率。将使用所述结合混合物中不同的非离子型聚氧乙烯脂肪醇醚去污剂获得的结果与使用等浓度的Brij58获得的结果进行比较(在2％时的Brij58ccfDNA回收率设为100％)。
结果在图9中显示(显示了66bp扩增子)。能够看出，其他测试的聚氧化烯脂肪醇醚非离子型去污剂也显示出与Brij58相似的良好结果。这证明了在前面的实施例中显示的有利效果不限于Brij58，而是也能用其他聚氧化烯脂肪醇醚实现。
实施例8
在结合混合物中使用2ml或4ml血浆体积和不同的非离子型去污剂，分析了血浆体积增加(PCR抑制风险增加)对结果的影响。测试下列非离子型去污剂(所测试的每种非离子型去污剂在所述结合混合物中的终浓度为0.5％)：
1.聚氧化烯脂肪醇醚
-Brij 58(设为100％ccfDNA回收率的参考)；
-Brij 35；
-Brij 78；
-Brij 98。
2.其他非离子型去污剂
-Triton X-100；
-Igepal CA630；
-Igepal CO630。
在一种设置中，所述结合混合物中不包括去污剂。对每种条件测试2个重复样(n＝2)。
利用实施例7中描述的方案，从2ml血浆(Streck)提取ccfDNA。对于从4ml血浆提取ccfDNA，使用以下方案：从每个血浆样品获得两个2ml血浆等份。如实施例7中所述从第一个2ml血浆等份制备第一结合混合物并使ccfDNA与所述磁性阴离子交换粒子结合。然后将带有结合的ccfDNA的所述磁性粒子作为阴离子交换粒子转移到从第二个2ml血浆等份制备的第二结合混合物(尚末含有阴离子交换粒子)中。再次温育所述结合混合物以使来自所述第二结合混合物的ccfDNA与已经结合了来自第一结合混合物的ccfDNA的所述阴离子交换粒子结合。在这个第二结合步骤之后，来自总共4ml血浆的ccfDNA与所述阴离子交换粒子结合。然后如实施例7所述进行洗涤和洗脱。
对洗脱物进行实时PCR(18S编码序列；双链体PCR)并按每毫升血浆的拷贝数计算ccfDNA回收率，使得2ml血浆样品的结果与4ml血浆样品的结果相比。
结果在图10A(66bp扩增子)和图10B(500bp扩增子)中显示。能够看出，根据本发明使用的非离子型去污剂(聚氧化烯脂肪醇醚)以高收率回收ccfDNA，并且不管处理2ml还是4ml血浆，都显示出稳定的性能。未见到PCR抑制的增加。对于在比较中测试的其他非离子型去污剂，与使用所述聚氧化烯脂肪醇醚获得的结果相比，总ccfDNA收率降低。此外，当处理4ml血浆时，所计算的每毫升ccfDNA回收率减少。这指示，PCR抑制剂在纯化期间延续，从而致使洗脱物纯度降低。这样的抑制效应在500bp扩增子中更明显，因为较长的片段更易受PCR抑制的影响。当看500bp片段时，所测试的聚氧乙烯脂肪醇醚与其他测试的非离子型去污剂相比较之间的差异甚至更加明显，因此表明PCR抑制。当使用聚氧乙烯脂肪醇醚作为非离子型去污剂时，这可以避免。
实施例9
在另一种实验设置中，其中利用实施例8中描述的自动化方案(QIAsymphony)并使用老化的磁性阴离子交换珠粒从4ml Streck稳定化的血浆分离ccfDNA，证实了当在结合混合物中使用不同的聚氧化烯脂肪醇醚时，ccfDNA回收率的稳固性增加。如本文中所讨论的，老化的阴离子交换粒子在储存之后可能显示出性能降低，这造成了挑战性的问题。测试了下列非离子型去污剂补偿在用老化的磁性阴离子交换珠粒时观察到的性能变化的能力：
1.聚氧化烯脂肪醇醚
-Brij 58(2％设为100％ccfDNA回收率的参考)；
-Brij 35；
-Brij 78；
-Brij 98。
2.其他非离子型去污剂
-Triton X-100；
-Igepal CO630；
-Igepal CA720；
-Igepal CO720。
每种去污剂在所述结合混合物中以2％或0.5％的终浓度进行测试。由于溶解限，只测试了终浓度为0.5％的Igepal CO630。在一种设置中，所述结合混合物中不包括去污剂。对每种条件测试2个重复样(n＝2)。
结果在图11中显示。能够看出，测试的所有聚氧乙烯脂肪醇醚都表现出良好的ccfDNA收率，即使使用老化的珠粒批次作为阴离子交换磁性粒子。相反，所有其他测试的非离子型去污剂都显示出ccfDNA回收率降低，特别是当使用0.5％浓度的所述去污剂时。在这种环境下，ccfDNA回收率下降到低于30％。
因此，实施例9也证明了当在所述结合混合物中使用聚氧乙烯脂肪醇醚作为非离子型去污剂时达到的有利效果。总之，聚氧乙烯脂肪醇醚显著改善了ccfDNA分离的可靠性，因为即使在所述阴离子交换表面发生变化的情况下，ccfDNA也能够一直以高收率回收。正如所讨论的，这样的变化可以在制造期间和/或所述固相储存期间发生(当以试剂盒形式提供分离方法中使用的材料时，这是常见的)。本发明避免了这些问题。也鉴于在典型的样品例如血浆样品中ccfDNA浓度通常低，所以改善的可靠性和改善的ccfDNA回收率代表了重要的优点。可靠且高效的ccfDNA分离方法是所有医疗和/或诊断应用特别需要的，因此本发明作出了重要的贡献。此外，聚氧乙烯脂肪醇醚作为非离子型去污剂与其他重要的优点有关，例如改善的储存稳定性和在水性裂解和/或结合组合物中的高溶解度，即使所述组合物包含较高浓度的盐。本方法中使用的试剂/材料因此可以有利地以试剂盒形式提供。这样的试剂盒有利地是储存稳定的并因此具有长储存期。这些优点是重要的并且不能用其他非离子型去污剂实现。
实施例10
可以连续地在多个实验中证实当在结合混合物中纳入聚氧乙烯脂肪醇醚非离子型去污剂例如Brij58时达到的在改善的可靠性和改善的细胞外核酸收率方面的有利性能特征。正在进行的性能试验使用不同批次的磁性阴离子交换粒子。对每个珠粒批次测试了在结合混合物中使用Brij58达到的结果并与当在所述结合混合物中使用Triton X-100时达到的结果相比较。
表2显示了结果。数值指示与QIAamp循环NA试剂盒(参考–设为100％)相比的％回收率。在生产所述阴离子交换粒子批次后大约1个月内，在三个连续的时间点(TTP1，TPP2，TPP3)测试每个珠粒批次。所测试的聚氧乙烯脂肪醇醚与Triton X-100相比，一直达到改善的收率。此外，与Triton X-100相反，当在结合混合物中使用所述聚氧乙烯脂肪醇醚作为非离子型去污剂时，在不同珠粒批次之间没有观察到显著的性能变化。所述聚氧乙烯脂肪醇醚有效补偿了所述不同珠粒批次中的性能变化。当在结合混合物中使用Triton X-100作为非离子型去污剂时，这是达不到的。与Brij58相比，使用Triton X-100时的总ccfDNA收率通常较低。此外，使用Triton X-100时，对许多珠粒批次在储存1个月内已经看到显著的性能变化，导致回收率低于80％(参见珠粒批次4、7、8、10、11、12、15、16和17和21–低于80％回收率的结果被突出显示)。因此，实施例10也明确证明了当在结合混合物中使用聚氧乙烯脂肪醇醚作为非离子型去污剂时达到的有利效果。
表2
Figure BDA0001498191290000471
序列表
<110> 凯杰有限公司
<120> 利用阴离子交换粒子分离细胞外核酸的方法
<130> 57 093 K
<150> EP 15 171 466.4
<151> 2015-06-10
<160> 6
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward primer - h18S rDNA 66 bp amplicon
<400> 1
gccgctagag gtgaaattct tg 22
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse primer - h18S rDNA 66bp amplicon
<400> 2
cattcttggc aaatgctttc g 21
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe - h18S rDNA 66bp amplicon
<400> 3
accggcgcaa gacggaccag a 21
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward primer - h18S rDNA 500 bp amplicaon
<400> 4
gtcgctcgct cctctcctac tt 22
<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse primer - h18S rDNA 500bp amplicon
<400> 5
ggctgctggc accagactt 19
<210> 6
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe - h18S rDNA 500bp amplicon
<400> 6
ctaatacatg ccgacgggcg ctgac 25

Claims (31)

1.一种从生物样品分离细胞外核酸的方法，其包括
(a)从所述生物样品制备结合混合物，所述结合混合物包含
i)细胞外核酸；
ii)提供阴离子交换表面的粒子；
iii)至少一种是聚氧化烯脂肪醇醚的非离子型去污剂；
iv)任选的至少一种盐，
其中所述结合混合物具有使细胞外核酸与所述粒子结合的pH，
(b)将带有结合的细胞外核酸的粒子与剩余的结合混合物分离；
(c)任选洗涤所述结合的细胞外核酸；
(d)任选洗脱结合的细胞外核酸。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述结合混合物通过将所述样品与包含所述至少一种聚氧化烯脂肪醇醚并任选包含盐和/或缓冲剂的组合物接触来制备。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中制备所述结合混合物包括将所述样品与蛋白水解酶接触。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其中通过以下步骤来制备所述结合混合物
-通过将所述粒子与包含所述至少一种聚氧化烯脂肪醇醚并任选包含盐和/或缓冲剂的裂解和/或结合组合物接触来形成悬液；
-将所述悬液与包含细胞外核酸的样品接触；
-任选地，在将所述样品与所述悬液接触之前、同时或之后添加蛋白水解酶。
5.根据权利要求1或2所述的方法，其中温育所述结合混合物并在所述结合混合物中裂解所述样品。
6.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述结合混合物具有选自≤7、≤6.5、≤6.25和≤6的pH。
7.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述结合混合物包含盐。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述盐具有一个或多个以下特征：
a.所述盐是碱金属盐或铵盐；
b.所述盐是碱金属卤化物；和/或
c.所述盐以选自50mM至1.5M、75mM至1M、100mM至750mM、125mM至500mM和150mM至350mM的浓度包含在所述结合混合物中。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述盐选自氯化钠、氯化钾和氯化锂。
10.根据权利要求8所述的方法，其中所述盐是氯化钠。
11.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述聚氧化烯脂肪醇醚具有一个或多个以下特征：
a.它是聚氧乙烯脂肪醇醚；
b.脂肪醇组分的链长选自8至22个碳原子、10至20个碳原子、12至19个碳原子、14至18个碳原子、和16至18个碳原子；
c.它包含具有14至22个碳原子的脂肪醇组分和具有2至150个(CH2CH2O)单元的聚氧乙烯组分；
d.它选自聚氧乙烯鲸蜡基醚、聚氧乙烯硬脂基醚和聚氧乙烯油基醚；
e.它具有0.15mM或更低、0.125mM或更低、0.12mM或更低、0.115mM或更低的临界胶束浓度(CMC)；和/或
f.所述结合混合物包含浓度选自0.05％至15％、0.75％至12％、0.1％至10％、0.125至8％、0.15％至7.5％、0.175％至6.5％和0.2％至6％的所述聚氧化烯脂肪醇醚。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述脂肪醇组分是饱和的。
13.根据权利要求11所述的方法，其中所述聚氧化烯脂肪醇醚包含具有16至20个碳原子的脂肪醇组分。
14.根据权利要求11所述的方法，其中所述聚氧化烯脂肪醇醚是聚氧乙烯鲸蜡基醚。
15.根据权利要求11所述的方法，其中所述聚氧化烯脂肪醇醚具有0.1mM或更低、0.095mM或更低、0.90mM或更低、或者0.085mM或更低的临界胶束浓度(CMC)。
16.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述阴离子交换粒子不包含在柱中或会防止所述粒子在所述结合混合物中移动的其他装置中，并且其中从所述结合混合物收集所述粒子以回收所述结合的细胞外核酸。
17.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述粒子具有一个或多个以下特征：
a.所述粒子是磁性的；
b.所述粒子具有在选自100nm至10μm、150nm至7.5μm、200nm至5μm、300nm至4μm、500nm至3.5μm、550nm至2μm和600nm至1.5μm的范围内的平均直径；和/或
c.所述阴离子交换表面包含提供阴离子交换基团的阴离子交换部分，其中所述阴离子交换部分选自单胺、二胺、多胺、含氮芳族或脂族杂环基团、环胺、芳族胺和杂环胺。
18.根据权利要求17的方法，其中所述阴离子交换部分包含至少一个伯、仲和/或叔氨基基团。
19.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述生物样品具有一个或多个以下特征：
a.它是无细胞、贫细胞或含细胞的样品；
b.它选自全血、血浆、血清、滑液、胸膜积液、淋巴液、尿液、汁液、脑脊液、腹水、乳汁、支气管灌洗液、唾液、羊水、精液、体液、身体分泌物、鼻分泌物、阴道分泌物、伤口分泌物和排泄物以及源自于前述各项的样品；
c.它选自全血、血浆和/或血清；
d.它是血浆样品；
e.它是稳定化的样品；
f.所述样品被甲醛释放剂稳定化；和/或
g.它是稳定化的血浆样品。
20.根据权利要求19的方法，其中所述生物样品是通过去除细胞而源自于所述各项的样品的无细胞或贫细胞样品。
21.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述方法包括
(a)从所述生物样品制备结合混合物，所述结合混合物包含
i)细胞外核酸；
ii)提供阴离子交换表面的磁性粒子；
iii)浓度为0.1％至10％的至少一种聚氧乙烯脂肪醇醚；
iv)至少一种碱金属盐；
(v)任选的至少一种蛋白水解酶；
其中所述结合混合物的pH≤6.5，以使细胞外核酸与所述粒子结合，
(b)以磁力将带有结合的细胞外核酸的磁性粒子与剩余的结合混合物分离；
(c)洗涤所述结合的细胞外核酸；
(d)洗脱结合的细胞外核酸。
22.根据权利要求21的方法，其中所述结合混合物包含0.15％至7.5％的至少一种聚氧乙烯脂肪醇醚。
23.根据权利要求21的方法，其中所述结合混合物包含0.2％至6％的至少一种聚氧乙烯脂肪醇醚。
24.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述方法包括
(a)从所述生物样品制备结合混合物，所述结合混合物包含
i)细胞外核酸；
ii)提供包含胺基团的阴离子交换表面的磁性粒子；
iii)浓度选自0.1％至6％、0.2％至5％、0.25％至
4％、和0.3％至3％的至少一种聚氧乙烯脂肪醇醚，其中
所述聚氧乙烯脂肪醇醚选自聚氧乙烯鲸蜡基醚、聚氧乙烯硬脂基醚和聚氧乙烯油基醚；
iv)浓度选自100mM至1M、125mM至750mM和125mM至500mM的至少一种碱金属卤化物；
(v)任选的至少一种蛋白水解酶；
其中所述结合混合物的pH≤6.5，以使细胞外核酸与所述粒子结合，
(b)以磁力将带有结合的细胞外核酸的磁性粒子与剩余的结合混合物分离；
(c)洗涤所述结合的细胞外核酸；
(d)洗脱结合的细胞外核酸。
25.根据权利要求24的方法，其中所述聚氧乙烯脂肪醇醚是聚氧乙烯鲸蜡基醚。
26.根据权利要求24的方法，其中所述碱金属卤化物选自氯化钠、氯化钾和氯化锂。
27.根据权利要求24的方法，其中所述碱金属卤化物是氯化钠。
28.根据权利要求1或2所述的方法，其具有一个或多个以下特征：
a.所述样品的消化在室温下发生；
b.步骤(a)和(b)以及任选的(c)和(d)在室温下进行；和/或
c.使用一种试剂盒来执行所述方法，所述试剂盒包含：
(a)裂解和/或结合组合物，其包含
i)至少一种聚氧化烯脂肪醇醚；
ii)至少一种盐；
iii)至少一种缓冲剂；
其中所述组合物具有酸性pH；
(b)提供阴离子交换表面的粒子；和
(c)任选的蛋白水解酶；
(d)任选的一种或多种洗涤溶液；和
(e)任选的一种或多种洗脱溶液。
29.根据权利要求28中的方法，其中所述的试剂盒具有一个或多个以下特征：
a.所述聚氧化烯脂肪醇醚具有一个或多个如权利要求11的a.至e.中限定的特征；
b.所述裂解和/或结合组合物包含浓度选自0.5％至15％、0.75％至12.5％、1％至10％、1.5％至7.5％和2％至6％的所述聚氧化烯脂肪醇醚；
c.所述盐具有一个或多个如权利要求8的a.和b.中限定的特征；
d.所述裂解和/或结合组合物包含浓度选自100mM至4M、200mM至3.5M、300mM至3mM、500mM至2.5mM、750mM至2.25M和1M至2M的所述盐；
e.所述粒子具有一个或多个如权利要求17中限定的特征；
f.所述裂解和/或结合组合物具有在选自3至6.5、3.5至6和4至5.5的范围内的pH；和/或
g.所述试剂盒包含蛋白水解酶，所述蛋白水解酶是蛋白酶K。
30.一种用于执行根据权利要求1至29任一项所述的方法的试剂盒，其包含：
(a)裂解和/或结合组合物，其包含
i)至少一种聚氧化烯脂肪醇醚；
ii)至少一种盐；
iii)至少一种缓冲剂；
其中所述组合物具有酸性pH；
(b)提供阴离子交换表面的粒子；和
(c)任选的蛋白水解酶；
(d)任选的一种或多种洗涤溶液；和
(e)任选的一种或多种洗脱溶液。
31.根据权利要求30所述的试剂盒，其具有一个或多个以下特征：
a.所述聚氧化烯脂肪醇醚具有一个或多个如权利要求11的a.至e.中限定的特征；
b.所述裂解和/或结合组合物包含浓度选自0.5％至15％、0.75％至12.5％、1％至10％、1.5％至7.5％和2％至6％的所述聚氧化烯脂肪醇醚；
c.所述盐具有一个或多个如权利要求8的a.和b.中限定的特征；
d.所述裂解和/或结合组合物包含浓度选自100mM至4M、200mM至3.5M、300mM至3mM、500mM至2.5mM、750mM至2.25M和1M至2M的所述盐；
e.所述粒子具有一个或多个如权利要求17中限定的特征；
f.所述裂解和/或结合组合物具有在选自3至6.5、3.5至6和4至5.5的范围内的pH；和/或
g.所述试剂盒包含蛋白水解酶，所述蛋白水解酶是蛋白酶K。
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