KR101053023B1 - 구형 실리카 자성입자 및 이의 제조방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 구형 실리카 자성입자 및 이의 제조방법에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 비극성용매에 계면활성제, 가용성규산염 수용액, 및 자성입자를 첨가한 후, 초음파로 분산하여 에멀젼을 제조하는 단계, 상기 에멀젼에 지방산(Fatty Acid)을 첨가하여 실리카 자성입자를 제조하는 단계를 포함하며, 부가적으로 상기 실리카 자성입자 표면에 기능기를 도입하는 단계를 더 포함하는 구형 실리카 자성입자의 제조방법 및 이와 같이 제조된 구형 실리카 자성입자에 관한 것이다.
본 발명에 의해 제조된 구형 실리카 자성입자는 자성입자를 함유하고 부가적으로 표면에 기능기를 갖는 실리카 입자로서 입자의 크기 분포가 균일한 장점이 있으며, 바이오 물질 분리용 시약 및 바이오 물질 검출 시약으로 사용될 수 있다.
자성입자, 실리카, 에멀젼, 기능기, 분리

Description

구형 실리카 자성입자 및 이의 제조방법{Magnetic silica coated particles having a spherical form and a process for preparing the same}
본 발명은 자성을 갖는 실리카 입자, 이의 제조방법, 및 상기 자성을 갖는 실리카 입자를 이용한 바이오물질의 분리방법에 관한 것이다.
자성체를 이용하여 바이오 관련 연구용 소재 및 바이오 의료에 응용하는 연구가 최근에 많이 시도되고 있다. 특히 바이오 물질 분리용 소재 및 의료 소재로의 이용 연구가 많이 되고 있는데, DNA 및 RNA의 분리정제, 단백질 및 아미노산의 분리정제, 바이오 센서, 약물전달시스템(Drug Delivery System), 자기공명영상(MRI) 조영제 및 국소온열치료 등에 사용이 가능하도록 자성입자에 유기기능성 화합물로 코팅하는 기능성 실란 코팅 자성입자들이 연구되고 있다.
자성입자는 생명공학 연구에서 사용되는 기본 소재 물질로 많이 응용되기 시작하고 있으며, 자성입자를 이용하여 바이오 물질을 빠르고 간단하게 분리하는데 사용되고 있다. 종래의 바이오 물질, 특히 핵산(Nucleic acid) 또는 단백질의 분리 방법은 많은 시간과 노동력이 필요한 공정으로 몇 단계의 추출과 원심분리 단계를 거치지만 분리되는 바이오 물질의 수율 및 순도가 낮았으며, 자동화 또는 대량 분리 방법으로 사용하기에 적절하지 못하였다. 그러나 최근의 연구에서 특별한 자성입자들이 제조되었고, 적절한 버퍼 조건에서 자성입자를 사용하여 아주 빠르고 효율적인 바이오 물질 분리 방법이 개발되었다(미국특허 제5,523,231호, 미국특허 제5,665,554호). 또한 상기 바이오 물질 분리 방법을 사용하면, 수 많은 시료를 동시에 처리하여 바이오 물질을 분리할 수 있는 자동화 방법을 제공할 수 있다. 예를 들어 로봇 자동 장치를 사용하면 수백 또는 수천의 시료를 자동으로 처리하여 시료에서 원하는 바이오 물질을 대량으로 분리 할 수 있다.
여러 세포 혼합물에서 핵산이나 단백질을 구별하기 위해서는 효과적이고 재현성 있는 분리 방법이 필요하고 여기에 최근 자성 입자를 이용한 분리방법이 개발되고 있다. 생물학적 시료에서 핵산(DNA와 RNA)의 분리는 생화학 연구 및 진단 프로세스에서 가장 중요한 단계이다. 시료에서 유전자 물질(핵산)을 분리하지 않으면 다음 단계인 유전자 검출, 유전자 클로닝, 유전자 시퀀싱, 유전자 증폭, cDNA 합성 등이 수행될 수 없다. 여러 세포 혼합물에서 DNA 또는 RNA를 구별하기 위해서는 효과적이고 재현성 있는 분리 방법이 필요하고 여기에 최근 자성 입자를 이용한 분리방법이 개발되고 있다. 자성 입자를 이용한 핵산의 분리방법은 자성 입자를 이용하여 바이오 물질과 결합을 유도한 후, 시편에 외부 자기장을 이용하여 분리하는 방법으로서 일반적으로 DNA, RNA, 단백질 등을 분리 정제하는데 사용되는 자성입자는 입자크기가 500 - 2000 nm 정도가 적당하다고 알려져 있다.
이와 같이 자성입자가 유전자(핵산)나 단백질 분리정제에 사용되기 위해서는 단순히 자성 특성만을 갖는 것 이외에, 입자표면에 유전자나 특정단백질과 결합이 가능한 기능기를 접합시키는 것이 바람직하다. 이를 위해서는 유기물 기능기 또는 실리카를 이용하여 자성입자를 코팅하는 것이 필요하다.
상술한 바이오 물질의 분리에 사용되는 자성 입자 재료 중에서 대표적인 것이 산화철 자성 입자이다. 산화철 자성입자는 일반적으로 마그네타이트(Magnetite; Fe3O4), 마그헤마이트(Maghemite; Fe2O3) 또는 헤마타이트(Hematite; Fe2O3)로 존재하며, 산화철 자성 입자는 바이오물질, 예를 들어 핵산(DNA와 RNA) 분리 정제, 단백질 분리 정제, 펩타이드 및 폴리 펩타이드 정제, 지질(Lipids) 정제 등에 사용이 가능하다.
기존의 바이오 물질 분리용 자성입자 제조방법들은 철염 화합물을 액상환원법으로 철 또는 철산화물 자성입자를 제조하고 여기에 실리카, 고분자 또는 비자성 물질인 금 또는 은으로 코팅해야만 자성 입자간의 응집과 상호작용이 없는 자성 입자의 제조가 가능하였다. 최근 들어 이러한 자성입자 중 실리카 코팅 자성입자가 많이 개발되고 있다(미국특허 제6,027,945호, 미국특허 제6,673,631호, 미국특허 제7,183,002호, 일본특허 제3253638호). 그러나 이러한 실리카 코팅 자성입자는 제조 과정이 복잡하고, 입자형태가 불규칙하며, 핵산 등 바이오 물질의 분리 정제에서 분리 수율이 떨어지는 단점이 있다.
한편, 일본공개특허 제2001-136970호 및 제1994-047273호에서는 규산나트륨용액과 유화제를 이용하여 W/O형 에멀젼을 형성한 후 황산 암모늄 수용액을 첨가하 여 충분히 교반하는 방법으로부터 구형의 자성 실리카 입자를 제조하는 방법이 공지되어 있다. 그러나 상기 방법에서는 황산 암모늄 수용액을 W/O형 에멀젼에 분산시키는 과정이 필요하며 또한 분산된 황산 암모늄 수용액 마이셀(micelle)이 규산나트륨 수용액 마이셀(micelle)과 반응이 이루어지기 위해서는 초음파 등을 사용하여 충분한 교반이 이루어지도록 해야 하므로 제조과정이 복잡할 뿐만 아니라, 상기 황산 암모늄 수용액과의 교반과정에서 규산나트륨 수용액 마이셀(michelle)의 크기가 변화하기 때문에 형성되는 실리카 입자의 크기 분포를 균일하게 제어하기 어려운 문제점이 있다.
기능성 실리카 자성입자에 대한 한국공개특허 제2006-0061494호에서는 핵산, DNA, RNA 분리정제용 기능성 실리카 자성나노입자의 제조방법으로 표면에 아민기 또는 클로로기를 도입하여 제조하는 방법이 공지되어 있다. 그러나 상기 특허의 제조 방법은 고가의 TEOS(Tetra ethyl ortho silicate)을 사용하고 제조 과정이 복잡하며 입자가 균일하지 않은 문제점이 있다. 또한, 한국등록특허 제0541282호에는 자성나노입자를 실란 물질로 개질하여 사용하는 방법이 공지되어 있으나 사용하는 자성 나노입자가 자성체 자체이기 때문에 생체 독성 등의 문제점을 가지고 있다.
본 발명은 종래 기술의 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로서 종래 실리카 자성입자의 제조방법에 비해 제조과정이 간단할 뿐만 아니라 실리카 자성 입자의 크기를 균일하게 제어할 수 있는 새로운 제조방법을 제공하는데 목적이 있다.
보다 구체적으로 본 발명의 목적은 바이오 물질 분리 용도로 사용되는 실리카 자성입자를 화학적으로 제조하는 제조방법에 있어서, 에멀젼 방법을 사용하고 비극성용매에 용해가 가능한 지방산(Fatty Acid)을 첨가하여 솔-겔 반응을 유도함으로써 제조 공정이 간단할 뿐만 아니라, 다양한 기능기를 유도하기 쉽고, 제조된 실리카 자성입자의 형태가 구형이며 입자의 크기를 균일하게 제어할 수 있는 제조방법을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명은 상기 제조방법으로부터 제조된 구형 실리카 자성입자 표면에 다양한 기능기를 도입함으로써 바이오 물질을 분리 또는 정제하거나 바이오 물질 검출용 시약에 효과적으로 사용될 수 있는 기능성 실리카 자성나노입자 제조 방법을 제공하는 데 또 다른 목적이 있다.
본 발명은 에멀젼 방법을 사용하고 비극성용매에 용해가 가능한 지방산(Fatty Acid)을 첨가하여 솔-겔 반응을 유도하는 것을 특징으로 하는 구형 실리카 자성입자의 제조방법, 이로부터 제조된 균일한 입도분포를 갖는 구형 실리카 자 성입자, 및 상기 구형 실리카 자성입자를 이용한 바이오 물질의 분리 정제 방법에 관한 것이다.
본 발명은 하기의 단계를 포함하는 구형 실리카 자성입자의 제조방법을 제공한다.
1) 비극성용매에 계면활성제, 가용성규산염 수용액, 자성입자를 첨가한 후, 초음파로 분산하여 에멀젼(Emulsion)을 제조하는 단계; 및
2) 상기 에멀젼에 지방산(Fatty Acid)을 첨가하여 실리카 자성입자를 제조하는 단계.
또한 본 발명은 상기의 제조방법을 통하여 제조된 자성입자를 내부에 포함하는 구형의 실리카 자성입자를 제공한다. 본 발명의 제조방법을 통해 제조되는 구형 실리카 자성입자는 도 1, 도 4 내지 도 6에 도시된 바와 같으며, 제조된 구형 실리카 자성입자는 입자크기가 1 내지 20 ㎛인 것을 확인할 수 있으며 도 2의 입도 분석 결과를 참고하면 입자 크기 분포가 균일한 것을 알 수 있다.
본 발명에 따른 구형 실리카 자성입자의 제조방법은 상기 2) 단계 후에 부가적으로 상기 2) 단계에서 제조된 실리카 자성입자 표면에 기능기를 도입하는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 기능기 도입은 2)단계에서 제조된 구형의 실리카 자성입자를 용매에 분산시킨 후 기능기 도입용 화합물과 접촉시킴으로써 실리카 자성입자 표면에 기능기 도입용 화합물이 결합되는 반응을 통하여 이루어질 수 있다.
상기 기능기는 아민기, 카복실산기(-COOH), 에폭시기, (C1~C30)알킬기, 스트렙타비딘(Streptavidin)기, 바이오틴(Biotin)기 및 이미노디아세트 산(Iminodiacetic acid)기로부터 선택되는 1종 이상인 것이 바람직하다.
상기 2)단계에서 제조된 구형 실리카 자성입자는 표면에 히드록시기(-OH)기를 가지고 있어 바이오 물질, 구체적으로는 핵산의 분리에 사용될 수 있다. 구체적인 실시예에 따르면, 상기 2)단계에서 제조된 구형 실리카 자성입자를 핵산 결합성 담체로 사용하고 구형 실리카 자성입자를 핵산과 결합하기 위한 시약, 예를 들면 카오트로픽(Chaotropic)시약 등을 사용하여 핵산을 분리하는 방법을 제공할 수 있다.
상기 기능기를 도입하는 단계를 거쳐 제조된 구형의 기능성 실리카 자성입자는 다양한 기능기를 통하여 보다 폭넓게 바이오 물질을 분리 또는 정제하거나 바이오 물질 검출용 시약에 이용할 수 있다.
이하 본 발명의 내용을 보다 상세히 설명한다.
본 발명에서 바이오 물질 분리용 구형 기능성 실리카 자성입자의 제조방법은 비극성용매에 계면활성제, 가용성규산염 수용액, 및 자성입자를 첨가한 후, 초음파로 분산하여 에멀젼을 제조하는 첫 번째 단계, 및 상기 에멀젼에 지방산(Fatty Acid)을 첨가하여 솔-겔 반응에 의해 실리카를 형성시킴으로써 실리카 자성입자를 제조하는 두 번째 단계, 및 상기 실리카 자성입자에 기능성화합물을 첨가하여 기능성 실리카 자성입자를 제조하는 세 번째 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에서 구형 기능성 실리카 자성입자를 제조하기 위한 첫 단계에서는 비극성 용매에 계면활성제, 가용성규산염 수용액, 및 자성입자를 첨가한 후, 초음 파로 분산하여 에멀젼을 제조한다. 비극성 용매에 가용성규산염 수용액과 계면활성제를 적절한 양으로 첨가하고 초음파를 처리하면 계면활성제에 의하여 마이셀(micelle)이 형성된다. 여기서 형성된 마이셀은 역에멀젼(inverse emulsion) 용액으로 비극성 용매인 오일 상에 수용액 마이셀이 형성된 형태, 즉 W/O형 에멀젼이다. 또한 첨가한 자성입자도 초음파에 의하여 마이셀 내에 존재하게 된다. 가용성 규산염 수용액이 포함된 구형의 마이셀은 후에 첨가되는 지방산과 반응하여 그대로 구형의 실리카가 만들어진다. 본 발명에 따른 제조방법의 첫 번째 단계는 균일한 크기의 가용성규산염 수용액 마이셀을 형성하고 상기 마이셀 내에 자성입자가 존재하도록 분산시키는 단계이다.
본 발명에 따른 제조방법에서 비극성 용매는 물에 대한 용해도가 낮은 용매로서 W/O형 에멀젼을 형성할 수 있는 용매이며, 구체적으로는 물에 대한 용해도가 8% 이하인 용매를 사용할 수 있다. 상기 비극성 용매로는 시클로헥산(Cyclohexane), 헥산(Hexane), 헵탄(Heptane), 옥탄(Octane) 또는 이의 혼합물을 사용하는 것이 바람직하나, 반드시 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 제조방법에서 계면활성제로 사용될 수 있는 물질은 비이온성 계면활성제, 양이온성 계면활성제과 음이온성 계면활성제이나 비이온성 계면활성제를 사용하는 것이 보다 바람직하다. 상기 계면활성제는 비극성용매 100 중량부에 대하여 5 내지 30 중량부의 함량으로 사용될 수 있으며, 10 내지 25 중량부의 함량으로 사용되는 것이 바람직하다. 만일 30 중량비를 초과하게 되면 에멀션 형성에 영향을 주어 구형의 실리카를 만들지 못하는 문제점이 있고, 5 중량부 미만이면 계 면활성제가 에멀션에서 마이셀을 수가 너무 적어 구형의 실리카 자성입자 수율이 너무 낮아 생산성에 문제가 있다.
비이온성 계면활성제는 구체적으로 폴리옥시에틸렌 데실 에테르(Polyoxyethylene Decyl Ether), 폴리옥시에틸렌 라우릴 에테르(Polyoxyethylene Lauryl Ether), 폴리옥시에틸렌 세틸 에테르(Polyoxyethylene Cetyl Ether), 폴리옥시에틸렌 올레일 에테르(Polyoxyethylene Oleyl Ether), 폴리옥시에틸렌 스테아릴 에테르(Polyoxyethylene Stearyl Ether), 폴리옥시에틸렌 옥틸 데실 에테르(Polyoxyethylene Octyl Decyl Ether), 폴리옥시에틸렌 트리데실 에테르(Polyoxyethylene Tridecyl Ether), 폴리옥시에틸렌 노닐페놀 에테르(Polyoxyethylene Nonylphenol Ether), 폴리옥시에틸렌 옥틸페놀 에테르(Polyoxyethylene Octylphenol Ether), 폴리옥시에틸렌 페닐 에테르(Polyoxyethylene Phenyl Ether), 폴리옥시에틸렌 소비탄 에스테르(Polyoxyethylene Sorbitan Ester), 소비탄 모노라우레이트(Sorbitan Monolaurate), 소비탄 모노팔미테이트(Sorbitan Monopalmitate), 소비탄 모노스테레이트(Sorbitan Monosterate), 소비탄 트리올레이트(Sorbitan Trioleate), 폴리옥시에틸렌 글리콜(Polyoxyethylene Glycol), 폴리옥시에틸렌 올레일 에스테르(Polyoxyethylene Oleyl Ester) 또는 이의 혼합물인 것이 바람직하지만, 반드시 이에 한정하는 것은 아니다. 양이온성 계면활성제는 도데실 암모니움 클로라이드(Dodecyl ammonium Chloride), 세틸트리메틸암모니움 브로마이드(Cetyltrimethylammonium bromide), 알킬암모니움 메소설페이트(Alkylammonium Methosulfate), 알킬디메틸 암모니움 클로라이트(Alkyl Dimethyl Ammonium Chloride), 또는 이의 혼합물인 것이 바람직하지만, 반드시 이에 한정하는 것은 아니다. 음이온성 계면활성제는 소디움 스테아레이트(Sodium stearate), 소디움 라우레이트(Sodium Laurate), 소디움 팔미테이트(Sodium Palmitate), 포타슘 스테아레이트(Potassium Stearate), 포타슘 라우레이트(Potassium Laurate), 포타슘 팔미테이트(Potassium Palmitate), 소디움 라우릴 설페이트(Sodium Lauryl sulfate), 소디움 도데실 벤젠 설포네이트(Sodium dodecylbenzene sulfonate) 또는 이의 혼합물인 것이 바람직하지만, 반드시 이에 한정하는 것은 아니다.
본 발명에 따른 제조방법에서 가용성규산염 수용액으로는 규산나트륨(Sodium Silicates) 수용액, 규산칼륨(Potassium Silicates) 수용액 또는 규산리튬(Lithium Silicates) 수용액인 것이 바람직하고 규산나트륨 수용액을 사용하는 것이 보다 바람직하지만, 반드시 이에 한정하는 것은 아니다. 상기 가용성규산염 수용액의 몰농도(morality, M)는 0.1mol/L 내지 5mol/L가 바람직하다. 이는 상기 농도가 0.1mol/L 미만인 경우에는 반응속도가 너무 늦어 공정상에 문제점이 있고, 상기 농도가 5mol/L을 초과하여 너무 높은 경우에는 반응속도가 너무 빨라 균일한 구형의 실리카가 형성되지 않는 문제점이 발생할 수 있기 때문이다. 상기 가용성 규산염 수용액은 비극성용매 100 중량부에 대하여 1 내지 20 중량부의 함량으로 사용되는 것이 바람직하며, 1 내지 10 중량부의 함량으로 사용되는 것이 보다 바람직하다. 만일 20 중량부를 초과하게 되면 에멀션에서 마이셀이 너무 커서 실리카 자성입자가 너무 크게 만들어지는 문제점이 있고, 1 중량부 미만이면 계면활성제가 에멀션 에서 마이셀 형성이 안 되어 구형의 실리카 자성입자가 만들어지지 않는 문제점이 있다.
본 발명에 따른 제조방법에서 자성입자로 사용될 수 있는 물질은 산화철 (Hematite, Maghemite; Fe2O3, Magnetite; Fe3O4), 페라이트(Ferrite), 철, 코발트, 망간, 크롬, 니켈, 아연 또는 이들의 혼합물로 이루어진 1종 이상의 입자인 것이 바람직하지만, 반드시 이에 한정하는 것은 아니다. 가장 바람직한 것은 100 내지 300nm 크기의 산화철(Magnetite)이다. 산화철 자성입자는 직접 제조하거나 시판되는 것을 구매하여 사용할 수 있다. 산화철 자성입자의 제조방법은 예를 들면, 카보닐 철을 고온의 용매에 순간적으로 주입하면 열분해에 의하여 일산화탄소가 발생되면서 철 자성입자를 제조한 후, 제조된 철 자성입자를 산화시켜 산화철을 제조할 수 있다. 또 다른 제조방법으로 FeCl2와 FeCl3 혼합액에 암모니아수(NH4OH)를 첨가하여 산화철을 제조하는 방법도 널리 알려져 있다. 상기 자성입자는 비극성용매 100 중량부에 대하여 0.01 내지 1.0 중량부의 함량으로 사용될 수 있으며, 0.01 내지 0.5 중량부의 함량으로 사용되는 것이 바람직하다. 만일 1.0 중량부를 초과하게 되면 에멀션 용액의 마이셀 밖에도 존재하여 구형의 실리카를 만들지 못하는 문제점이 있고, 0.01 중량부 미만이면 실리카 입자 내에 포함하는 자성체 수가 너무 적어 자력에 대한 자성이 낮은 문제점이 있다.
본 발명에 따른 제조방법에서, 두 번째 단계는 상기 첫 번째 단계에서 제조한 에멀젼 용액을 교반하면서 비극성 용매에 용해가 가능한 지방산(Fatty Acid)을 첨가하여 마이셀의 실리카 형성 반응을 진행하여 구형인 실리카 자성입자를 제조한다. 상기 지방산은 직접 에멀젼에 첨가하거나 비극성 용매에 용해한 지방산 용액을 첨가할 수 있으며, 지방산 또는 지방산 용액을 첨가하는 시간은 10분에서 30분이 바람직하고, 교반속도는 가능한 빠르게 하는 것이 실리카 형성 반응 속도를 향상시킬 수 있어서 유리하지만, 교반속도가 지나치게 빠른 경우 생성되는 실리카 자성 입자 크기의 균일도가 저하될 수 있으므로 50 내지 2000 rpm 정도의 범위에서 교반하는 것이 바람직하다.
상기 지방산은 비극성 용매에 용해 가능하고 산성을 가지는 것이라면 어떠한 것도 사용할 수 있으며 천연 지방산이거나 합성된 지방산을 모두 사용할 수 있다. 상기 지방산은 구체적으로 하기 화학식 1의 화합물 또는 이들의 혼합물을 예로 들 수 있다.
[화학식 1]
R-COOH
(상기 화학식 1에서 R은 C8~C20의 직쇄 또는 분지쇄의 알킬기로부터 선택되고, 상기 알킬기는 탄소 사슬 내에 1 이상의 이중결합 또는 1이상의 삼중결합을 포함할 수 있으며 히드록시기로 더 치환될 수 있다.)
본 발명에 따른 제조방법에서 사용가능한 지방산(Fatty Acid)으로는 미리스트산(Myristic Acid), 팔미트산(Palmitic Acid), 라우르산(Lauric Acid), 스테아르산(Stearic Acid), 리놀레산(Linoleic Acid), 리놀렌산(Linolenic Acid), 리시놀레산(Ricinoleic Acid), 올레산(Oleic Acid) 또는 이들의 혼합물을 예로 들 수 있다. 상기 지방산(Fatty Acid)은 비극성용매 100 중량부에 대하여 0.1 내지 10 중량부의 함량으로 사용될 수 있으며, 1 내지 5 중량부의 함량으로 포함되는 것이 바람직하다. 만일 10 중량부를 초과하게 되면 에멀션 마이셀 형성에 영향을 주어 구형의 실리카를 만들지 못하는 문제점이 있고, 0.1 중량부 미만이면 에멀젼 용액에서 실리카 입자 합성 반응이 완전히 진행되지 않는 문제점이 있다.
또한, 본 발명에 따른 제조방법은 상기 두 번째 단계 이후에 통상적인 여과, 세척, 건조의 단계를 더 포함할 수 있다. 여과는 마이크로 필터 여과지를 사용하며, 세척은 에탄올 및 초순수를 사용하여 수회 반복하여 세척한다. 상기 건조는 통풍이 되는 건조 장치에 제조한 구형 실리카 자성입자를 100 내지 300℃, 바람직하게는 120℃ 내지 200℃에서 2시간 이상 진행한다.
본 발명에 따른 일례로 2)단계 후 제조된 구형 실리카 자성입자의 주사전자현미경 사진이 도 1, 도 4 내지 도 6에, 입도 분석 결과가 도 2에 개시되어 있다. 또한, 도 1, 도 2 및 도 4 내지 도 6을 참조하면, 본 발명에 따른 제조방법에서 2)단계를 거쳐 제조된 실리카 자성입자가 형태가 구형이며, 균일하게 입자 크기가 1 내지 20 ㎛ 범위 내에서 일정하게 제조되는 것을 확인할 수 있다. 또한 도 3의 제타 전위 분석 결과를 참조하면 제조된 구형 실리카 자성입자 표면에 히드록시기(-OH)가 존재함을 알 수 있다. 즉, 표면의 히드록시(OH)기로 인하여 제타전위를 측정하면 음의 값을 나타나게 되며, 그 값은 도 3과 같이 -30mV에서 -60mV의 수치를 보인다.
반면에 비교예로서 지방산을 대신하여 황산 암모늄 수용액을 사용하여 실리 카 자성입자를 제조한 경우 도 7에 나타낸 바와 같이 입자의 크기가 균일하지 못하였으며 제조 공정의 반복에 따른 재현성이 낮아 입자의 크기를 균일하게 제어하기 어려운 것을 확인하였다.
본 발명에 따른 제조방법에서, 3) 단계는 상기 2) 단계에서 제조한 구형의 실리카 자성입자와 다양한 기능기 도입용 화합물을 접촉시켜 기능기가 도입된 구형의 기능성 실리카 자성입자를 제조하는 단계이다. 3) 단계는 2) 단계에서 제조된 구형의 실리카 자성입자를 용매에 분산시킨 후 기능기 도입용 화합물과 접촉시킴으로써 실리카 자성입자 표면에 기능기 도입용 화합물이 결합되는 반응을 통하여 이루어질 수 있다. 2)단계에서 제조된 구형의 실리카 자성입자는 표면에 히드록시기(-OH)가 형성되어 있어 다양한 기능기 도입용 화합물과의 결합 반응이 가능하다. 상기 3)단계 반응 시 용매에 제한을 둘 필요는 없으며, 물, 탄화수소계 용매, 할로겐화 탄화수소 용매 등을 단독 또는 혼합하여 사용할 수 있다.
본 발명에 있어서 기능기의 종류에는 아민기, 카복실산기, 에폭시기, (C1~C30)알킬기, 스트렙타비딘(Streptavidin)기, 바이오틴(Biotin)기 및 이미노디아세트산(Iminodiacetic acid)기로부터 선택되는 1종 이상이 있으며, 반드시 이에 한정하는 것은 아니다.
본 발명에 따른 제조방법에서 아민기 도입용 화합물은 아민기(-NH2, -NH-,
Figure 112008080562654-pat00001
) 중 하나 이상이 치환된 알킬기를 갖는 실란 화합물을 사용할 수 있다. 상기 실란화합물로는 아미노프로필디이소프로필에톡시실 란(Aminopropyldiisopropylethoxysilane), 아미노프로필트리메톡시실란(Aminopropyltrimethoxysilane), 아미노프로필트리에톡시실란(Aminopropyltriethoxysilane), 아미노프로필메틸디에톡시실란(Aminopropylmethyldiethoxysilane), 아미노페닐트리메톡시실란(Aminophenyltrimethoxysilane), 페닐아미노프로필트리메톡시실란(Phenylaminopropyltrimethoxysilane), 아미노에틸아미노프로필트리메톡시실란(Aminoethylaminopropyltrimethoxysilane), 아미노에틸아미노프로필트리에톡시실란(Aminoethylaminopropyltriethoxysilane), 아미노에틸아미노프로필메틸디메톡시실란(Aminoethylaminopropylmethyldimethoxysilane), 아미노에틸아미노이소부틸메틸디메톡시실란(Aminoethylaminoisobutylmethyldimethoxysilane), 트리메톡시실릴프로필디에틸렌트리아민(Trimethoxysilylpropyldiethylenetriamine) 또는 이들의 혼합물을 사용할 수 있으나, 반드시 이에 한정하는 것은 아니다.
본 발명에 따른 제조방법에서 카복실산기 도입용 화합물은 트리메톡시실릴프로필에틸렌디아민 트리아세트산(Trimethoxysilylpropylethylenediamine triacetic acid)이 바람직하지만, 반드시 이에 한정하는 것은 아니다. 카복실산기 도입은 상기 아민기가 도입된 실리카 자성입자에 숙시닉안하이드라이드(Succinic Anhydride) 등의 디카복실산 무수물을 반응시켜 도입할 수도 있다.
본 발명에 따른 제조방법에서 에폭시기 도입용 화합물에는 글리시드옥시기 또는 에폭시기를 갖는 실란화합물이 있으며, 구체적으로는 글리시드옥시프로필 트리메톡시 실란(Glycidoxypropyltrimethoxysilane), 글리시드옥시프로필 트리에톡시 실란(Glycidoxypropyltriethoxysilane), 글리시드옥시프로필 메틸 디메톡시 실란 (Glycidoxypropylmethyldimethoxysilane), 글리시드옥시프로필 메틸 디에톡시 실란 (Glycidoxypropylmethyldiethoxysilane), 글리시드옥시프로필 메틸 디메톡시 실란 (Glycidoxypropylmethyldimethoxysilane), 글리시드옥시프로필 디메틸 에톡시 실란 (Glycidoxypropyldimethylethoxysilane), 에폭시 시클로 헥실 에틸 트리메톡시 실란 (Epoxycyclohexylethyltrimethoxysilane) 또는 이들의 혼합물을 사용할 수 있으나, 반드시 이에 한정하는 것은 아니다.
본 발명에 따른 제조방법에서 (C1~C30)알킬기 도입용 화합물은 (C1~C30)알킬기를 갖는 실란 화합물을 사용할 수 있으며, 구체적으로는 트리메톡시(C1~C30)알킬실란(Trimethoxyalkylsilane), 트리에톡시(C1~C30)알킬실란(Triethoxyalkylsilane) 또는 이들의 혼합물을 사용할 수 있고, 이에 해당하는 화합물로는 트리메톡시옥타데실실란(Trimethoxyoctadecylsilane), 트리에톡시옥타데실실란(Triethoxyoctadecylsilane) 및 이들의 혼합물이 바람직하지만, 반드시 이에 한정하는 것은 아니다.
본 발명에 따른 제조방법에서 스트렙타비딘(Streptavidin)기는 상기 아민기가 도입된 실리카 자성입자에 스트렙타비딘(Streptavidin)을 반응시킴으로써 도입될 수 있으나, 반드시 이에 한정하는 것은 아니다.
본 발명에 따른 제조방법에서 바이오틴(Biotin)기는 상기 아민기가 도입된 실리카 자성입자에 바이오틴(Biotin)을 반응시킴으로써 도입될 수 있으나, 반드시 이에 한정하는 것은 아니다.
본 발명에 따른 제조방법에서 이미노디아세트산(Iminodiacetic acid)기는 상기 에폭시기가 도입된 실리카 자성입자에 이미노디아세토니트릴(Iminodiacetonitrile)을 반응시킴으로써 도입될 수 있으나, 반드시 이에 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 제조방법에 따라 제조되는 기능기가 도입된 기능성 실리카 자성입자는 수십 내지 수백 나노미터 크기의 자성입자가 실리카로 쌓여 있고 실리카 표면에 다양한 기능기를 유도하는 기능기층이 형성된다. 상기 기능기가 아민기(-NH2, -NH-,
Figure 112008080562654-pat00002
)인 경우 제타전위를 측정하면 양의 값을 나타내며, 실시예 7에 따른 아민기 도입의 경우 그 값은 도 8과 같이 + 20mV에서 +50mV의 수치를 보인다. 카복실산기가 도입된 실리카 자성입자의 경우는 카복실산기(COOH)로 인하여 제타전위를 측정하면 음의 값을 나타내며, -30mV에서 -60mV의 수치를 보인다. 에폭시기 또는 (C1~C30)알킬기가 도입된 실리카 자성입자의 경우는 기능기가 전위가 없기 때문에 전위가 나타나지 않는다. 스트렙타비딘(Streptavidin)기가 도입된 실리카 자성입자의 경우는 스트렙타비딘으로 인하여 제타전위를 측정하면 음의 값을 나타내며, -30mV에서 -60mV의 수치를 보인다. 바이오틴(Biotin)기가 도입된 실리카 자성입자의 경우는 바이오틴이 전위가 없기 때문에 전위가 나타나지 않는다. 이미노디아세트산(Iminodiacetic acid)기가 도입된 실리카 자성입자의 경우는 2개의 카복실산기(COOH)로 인하여 제타전위를 측정하면 음의 값을 나타내며, -30mV에서 -60mV의 수치를 보인다.
본 발명에 따른 제조방법으로 제조된 구형 실리카 자성입자는 다양한 형태의 바이오 물질을 분리하는데 사용될 수 있다.
구체적으로 본 발명에 따른 바이오물질 분리 방법은 하기의 제조단계를 포함한다.
구형 실리카 자성입자와 바이오 물질과의 결합을 유도하여 구형 실리카 자성입자 및 바이오 물질의 복합체를 형성하는 단계;
외부 자기장을 이용하여 상기 복합체를 분리하는 단계; 및
분리된 복합체로부터 바이오 물질을 수득하는 단계.
상기 바이오 물질로는 플라스미드 DNA, 지노믹 DNA, cDNA, PCR 반응 생성 DNA(Polymerase chain reaction DNA), RNA, siRNA, 라이보자임(ribozymes), 업타머(aptamers), 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide), DNA 프라이머(primers), 단백질, 펩타이드, 폴리펩타이드, 아미노산, 재조합 단백질, 항체, 지질 또는 세포 등이 있으나 반드시 이에 한정하지는 않는다.
일반적으로 자성입자를 핵산 분리에 사용하기 위해서는 자성입자를 실리카로 코팅하여야 한다. 실리카를 이용한 핵산 분리방법은 카오트로픽(Chaotropic)시약을 이용하여 분리하는데 이는 널리 알려진 방법이다(R. Boom et al., J. Clin. Microbiol., Vol 28(3), p495-503 (1990)). 자성입자를 실리카로 코팅하면 카오트로픽 시약을 이용하여 핵산과 결합하게 되고, 외부자력을 이용하여 실리카 자성입자를 분리함으로써 핵산을 분리하게 된다.
발명에 따른 제조방법으로 제조된 구형 실리카 자성입자는 다양한 형태의 핵 산을 분리하는데 사용될 수 있다. 상기 핵산으로는 플라스미드 DNA, 지노믹 DNA, cDNA, PCR 반응 생성 DNA(Polymerase chain reaction DNA), RNA, siRNA, 라이보자임(ribozymes), 업타머(aptamers), 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide) 또는 DNA 프라이머(primers) 등이 있다.
본 발명에 따른 구형 실리카 자성입자를 이용하여 핵산을 분리 정제하는 방법은 다음과 같다. 첫 번째 단계는 분리하고자 하는 핵산이 포함된 시료에 본 발명에서의 구형 실리카 자성입자를 혼합하여 핵산이 실리카 자성입자에 결합하게 한다. 이때 결합버퍼(binding buffer)를 사용할 수 있는데, 결합버퍼는 구체적으로 카오트로픽(chaotropic) 시약을 예로 들 수 있다. 카오트로픽 시약에는 구아니딘염, 우레아, 염화물, 요오드화물, 과염소산염, (이소)티오시안산염 등이 포함되며, 구체적인 화합물로는 소디움 퍼크로레이트(Sodium perchlorate), 구아니딘 하이드로클로라이드(Guanidine hydrochloride), 구아니딘 이소티오시아네이트(Guanidine isothiocyanate), 포타슘 요오드(Potassium iodide), 포타슘 티오시아네이트(Potassium thiocyanate), 소디움 클로라이드(Sodium chloride), 소디움 이소티오시아네이트(Sodium isothiocyanate), 마그네슘 클로라이드(Magnesium chloride), 소디움 요오드(Sodium iodide) 등이 있으나 이에 한정하는 것은 아니다. 카오트로픽 시약은 1 내지 8 M(mol/L) 농도로 사용하는 것이 바람직하다.
핵산 분리 두 번째 단계는 핵산이 결합된 실리카 자성입자를 분리하는 단계로서, 외부 자력으로 핵산이 결합된 실리카 자성입자를 용기 벽면에 모으고, 결합되지 않은 나머지 물질을 분리, 세척한다.
세 번째 단계는 외부 자력을 제거하고, 핵산이 결합된 실리카 자성입자로부터 핵산을 분리하는 단계로서, 실리카 자성입자에 결합된 핵산을 분리버퍼(Elusion buffer; tris-(hydroxymethyl)amino methane buffer)를 사용하여 핵산을 분리한다.
본 발명에 의해 제조된 구형 실리카 자성입자는 자성입자를 함유하고 부가적으로 표면에 기능기를 갖는 실리카 입자로서 입자의 크기 분포가 균일하고 입자가 구형인 장점이 있으며, 바이오 물질 분리용 시약 및 바이오 물질 검출 시약으로 사용될 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 보다 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 미리스트산을 사용한 구형 실리카 자성입자의 제조
2L 플라스크에 시클로헥산(Cyclohexane) 400ml를 넣고 계면활성제인 폴리옥시에틸렌 노닐페놀 에테르(Polyoxyethylene Nonylphenol Ether, Dongnam Chem., Korea, MONOPOL NP 1018, 수평균분자량(Mn): 585)를 48ml와 소디움실리케이트(Sodium silicate) 1.5M농도 수용액 16ml을 넣고 초음파로 30분간 분산시킨다. 상기 용액에 산화철 자성입자(Magnetite; SEAHAN, Korea, SMT-02H, 평균 입경 300nm) 0.4g을 넣고 초음파로 30분간 분산시킨다. 미리스트산(Myristic Acid) 5.5g을 시클로헥산 40ml에 녹여 미리스트산 용액을 제조한 후, 상기 에멀젼 용액을 교반하면서 30분 동안 미리스트산 용액을 적가(dropping)한다. 적가 후 상온에서 2시간 동안 300rpm으로 교반하여 반응을 완전히 진행하여 실리카 자성입자를 얻는다. 반응을 종료한 후에 반응기 내용물을 필터를 사용하여 분리하고, 에탄올과 초순수를 사용하여 2회 이상 세척한다. 수득한 실리카 자성입자를 건조기에 넣어 160℃에서 2시간 건조시킨다.
제조된 구형 실리카 자성입자의 주사전자현미경(SEM) 분석 결과는 도 1과 같다. 도 1에서 제조된 구형 실리카 자성입자의 입자 크기는 도 2에서 평균 1.56㎛인 것을 확인할 수 있다. 또한 형태가 구형인 것을 알 수 있고, 실리카 내부에 산화철 자성입자가 포함되어 있는 것을 볼 수 있다. 제조된 실리카 자성입자의 제타전위는 도 3과 같이 - 39.8mV로 측정되어 실리카 표면에 히드록시기가 있음을 알 수 있다.
<실시예 2> 팔미트산을 사용한 구형 실리카 자성입자의 제조
미리스트산 용액 대신에 팔미트산(Palmitic Acid) 6g을 시클로헥산 40ml에 녹여서 제조한 팔미트산 용액을 사용한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 조건으로 진행하여 구형 실리카 자성입자를 제조하였다.
제조된 실리카 자성입자의 제타전위는 - 33.3mV로 측정되어 실리카 표면에 히드록시기가 있음을 알 수 있다.
<실시예 3> 스테아르산을 사용한 구형 실리카 자성입자의 제조
미리스트산 용액 대신에 스테아르산(Stearic Acid) 6.8g을 시클로헥산 40ml에 녹여서 제조한 스테아르산 용액을 사용한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 조건으로 진행하여 구형 실리카 자성입자를 제조하였다.
제조된 실리카 자성입자의 제타전위는 - 47.0mV로 측정되어 실리카 표면에 히드록시기가 있음을 알 수 있다.
<실시예 4> 라우르산을 사용한 구형 실리카 자성입자의 제조
미리스트산 용액 대신에 라우르산(Lauric Acid) 4.8g을 시클로헥산 40ml에 녹여서 제조한 라우르산 용액을 사용한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 조건으로 진행하여 구형 실리카 자성입자를 제조하였다.
제조된 실리카 자성입자의 주사전자현미경(SEM) 분석 결과는 도 4와 같으며, 제조된 실리카 자성입자의 입자 크기는 약 1 - 10㎛이고 구형인 것을 확인할 수 있다. 또한 구형 실리카 내부에 산화철 자성입자(평균 입경 : 300nm)가 포함되어 있는 것을 볼 수 있다. 제조된 실리카 자성입자의 제타전위는 - 48.1mV로 측정되어 실리카 표면에 히드록시기가 있음을 알 수 있다.
<실시예 5> 올레산을 사용한 구형 실리카 자성입자의 제조
미리스트산 용액 대신에 올레산(Oleic Acid) 6.8g을 시클로헥산 40ml에 녹여 서 제조한 올레산 용액을 사용한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 조건으로 진행하여 구형 실리카 자성입자를 제조하였다.
제조된 실리카 자성입자의 주사전자현미경(SEM) 분석 결과는 도 5와 같으며, 제조된 실리카 자성입자의 입자 크기는 약 1 - 10㎛이고 형태가 구형이며 균일한 것을 확인할 수 있다. 제조된 실리카 자성입자의 제타전위는 - 30.1mV로 측정되어 실리카 표면에 히드록시기가 있음을 알 수 있다.
<실시예 6> 미리스트산을 사용한 구형 실리카 자성입자의 제조(스케일 업)
2L 플라스크에 시클로헥산(Cyclohexane) 1200ml를 넣고 계면활성제인 폴리옥시에틸렌 노닐페놀 에테르(Polyoxyethylene Nonylphenol Ether, Dongnam Chem., Korea, MONOPOL NP 1018, 수평균분자량(Mn): 585)를 144ml와 소디움실리케이트(Sodium silicate) 1.5M농도 수용액 48ml을 넣고 초음파로 30분간 분산시킨다. 상기 용액에 산화철 자성입자(Magnetite; SEAHAN, Korea, SMT-02H, 평균입경 300nm) 0.6g을 넣고 초음파로 30분간 분산 시킨다. 미리스트산(Myristic Acid) 16.5g을 시클로헥산 80ml에 녹이고, 이 용액을 상기 에멀션 용액이 있는 반응기에 교반하면서 30분 동안 서서히 첨가하는 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 조건으로 진행하여 구형 실리카 자성입자를 제조하였다.
제조된 실리카 자성입자의 주사전자현미경(SEM) 분석 결과는 도 6과 같으며, 제조된 실리카 자성입자의 입자 크기는 약 1 - 20㎛인 것을 확인할 수 있다. 또한 형태가 구형인 것을 알 수 있고, 실리카 내부에 산화철 자성입자(평균 입경 300nm) 가 포함되어 있는 것을 볼 수 있다. 제조된 실리카 자성입자의 제타전위는 - 33.9mV로 측정되어 실리카 표면에 히드록시기가 있음을 알 수 있다.
<비교예 1> 황산 암모늄 수용액을 사용한 구형 실리카 자성입자의 제조
1L 플라스크에 시클로헥산(Cyclohexane) 800ml를 넣고 계면활성제인 폴리옥시에틸렌 노닐페놀 에테르(Polyoxyethylene Nonylphenol Ether)를 64ml와 소디움실리케이트(Sodium silicate) 1.5M농도 수용액 16ml을 넣고 초음파로 30분간 분산시킨다. 상기 용액에 산화철 자성입자(Magnetite; SEAHAN, Korea, SMT-02H, 평균입경 300nm) 0.6g을 넣고 초음파로 30분간 분산 시킨다. 상기 용액에 교반기를 설치하고 상온에서 교반 시킨다. 상기 용액을 교반하면서 암모니움 설페이트(Ammonium sulfate) 1.5M 농도 수용액 16ml을 반응기에 첨가한다. 플라스크의 온도를 상온에서 2시간 이상 교반하여 반응을 충분히 진행시켜 실리카 자성입자를 얻는다. 반응을 종료한 후에 반응기 내용물을 필터를 사용하여 분리하고, 에탄올과 초순수를 사용하여 2회 이상 세척한다. 수득한 실리카 자성입자를 건조기에 넣어 120도에서 2시간 건조시킨다.
제조된 실리카 자성입자의 주사전자현미경(SEM) 분석 결과는 도 7과 같으며, 제조된 실리카 자성입자의 입자 크기는 약 1 내지 10 ㎛인 것을 확인할 수 있다. 그러나 실리카 자성 입자 크기 분포는 실시예 1의 결과에 비해 균일하지 못한 것을 알 수 있다.
<실시예 7> 아민기가 도입된 구형 실리카 자성입자의 제조
250ml 플라스크를 준비하고 먼저 플라스크 내부를 질소로 치환한다. 옥타데센(Octadecene, Aaldrich) 100ml 를 플라스크에 넣고, 실시예 1에서 제조한 구형 실리카 자성입자 1 g을 반응 플라스크에 첨가하고 초음파로 1시간 분산시킨다. 실시예 1에서 제조한 구형 실리카 자성입자를 분산한 후에 플라스크를 맨틀에 장착하고 아미노프로필트리에톡시실란(Aminopropyltriethoxysilane, Aldrich, USA) 500ul를 첨가하고 80℃ 에서 1시간 반응 시킨다. 반응이 종료되면 메탄올과 초순수를 사용하여 3회 세척한다.
제조된 아민기가 도입된 구형 실리카 자성입자의 제타전위는 도 8과 같이 + 20.0mV로 측정되어 실리카 표면에 아민기가 있음을 알 수 있다.
<실시예 8> 카복실산기가 도입된 구형 실리카 자성입자의 제조
250ml 플라스크를 준비하고 먼저 플라스크 내부를 질소로 치환한다. 옥타데센(Octadecene, Aaldrich) 100ml 를 플라스크에 넣고, 실시예 7에서 제조한 아민기가 도입된 구형 실리카 자성입자 1 g을 반응 플라스크에 첨가하고 초음파로 1시간 분산시킨다. 그리고 옥타데센(Octadcene) 20 ml에 숙시닉안하이드라이드(Succinic anhydride, Aldrich) 4.9 g을 첨가하여 3시간에 걸쳐 초음파를 사용하여 용해시킨다. 아민기가 도입된 구형 실리카 자성입자가 분산된 플라스크에 숙시닉안하이드라이드 용액을 첨가한 후에 반응 플라스크를 맨틀에 장착하고 80℃ 에서 1시간 반응시킨다. 반응이 종료되면 메탄올과 초순수를 사용하여 3회 세척한다.
제조된 카복실산기가 도입된 구형 실리카 자성입자의 제타전위는 - 49.9 mV로 측정되어 실리카 표면에 카복실산기가 있음을 알 수 있다.
<실시예 9> 에폭시기가 도입된 구형 실리카 자성입자의 제조
250ml 플라스크를 준비하고 먼저 플라스크 내부를 질소로 치환한다. 옥타데센(Octadecene, Aaldrich) 100ml 를 플라스크에 넣고, 실시예 1에서 제조한 구형 실리카 자성입자 1 g을 반응 플라스크에 첨가하고 초음파로 1시간 분산 시킨다. 구형 실리카 자성입자를 분산한 후에 플라스크를 맨틀에 장착하고 글리시드옥시프로필 트리메톡시실란 (3-Glycidoxypropyl trimethoxysilane, Aldrich, USA) 200ul를 첨가하고 80℃ 에서 1시간 반응 시킨다. 반응이 종료되면 메탄올과 초순수를 사용하여 3회 세척한다.
제조된 에폭시기가 도입된 구형 실리카 자성입자는 에폭시기가 전위가 없기 때문에 제타전위가 나타나지 않고, 이를 확인하기 위하여 에폭시기에 반응성이 있는 폴리에틸렌이민(PEI;Polyethyleneimine, MW=600, Alfa)를 4ml 반응시켜 제타전위를 측정하니 + 17.3mV로 측정되어 실리카 표면에 에폭시기가 있음을 알 수 있다.
<실시예 10> (C18)알킬기가 도입된 구형 실리카 자성입자의 제조
250ml 플라스크를 준비하고 먼저 플라스크 내부를 질소로 치환한다. 옥타데센(Octadecene, Aaldrich) 100ml 를 플라스크에 넣고, 실시예 1에서 제조한 구형 실리카 자성입자 1 g을 반응 플라스크에 첨가하고 초음파로 1시간 분산 시킨다. 구 형 실리카 자성입자를 분산한 후에 플라스크를 맨틀에 장착하고 트리메톡시옥타데실실란 (Trimethoxy octadecylsilane, Aldrich) 500ul를 첨가하고 80℃ 에서 1시간 반응 시킨다. 반응이 종료되면 메탄올과 초순수를 사용하여 3회 세척한다. 제조된 (C18)알킬기가 도입된 구형 실리카 자성입자는 (C18)알킬기가 전위가 없으므로 제타전위가 나타나지 않았다.
<실시예 11> 스트렙타비딘기가 도입된 구형 실리카 자성입자의 제조
250ml 플라스크를 준비하고 먼저 플라스크 내부를 질소로 치환한다. pH 11의 소디움카보네이트 용액(Sodium carbonate, 100mM 농도) 100ml를 플라스크에 넣고, 실시예 9에서 제조한 에폭시기가 도입된 구형 실리카 자성입자 1 g을 반응 플라스크에 첨가하고 초음파로 1시간 분산 시킨다. 에폭시기가 도입된 구형 실리카 자성입자가 분산된 플라스크에 스트렙타비딘 0.5mg을 첨가한 후에 반응 플라스크를 맨틀에 장착하고 60℃ 에서 1시간 반응시킨다. 반응이 종료되면 메탄올과 초순수를 사용하여 3회 세척하고 제조된 스트렙타비딘기가 도입된 구형 실리카 자성입자는 안정성을 위하여 PBS(Phosphate buffered saline) 버퍼에 분산시킨다.
제조된 스트렙타비딘기가 도입된 구형 실리카 자성입자의 제타전위는 - 42.9 mV로 측정되어 실리카 표면에 스트렙타비딘기가 있음을 알 수 있다.
<실시예 12> 바이오틴기가 도입된 구형 실리카 자성입자의 제조
250ml 플라스크를 준비하고 먼저 플라스크 내부를 질소로 치환한다. 디클로 로메탄(Dichloromethane, Aaldrich) 50ml 를 플라스크에 넣고, 실시예 7에서 제조한 아민기가 도입된 구형 실리카 자성입자 1 g을 반응 플라스크에 첨가하고 초음파로 1시간 분산시킨다. 그리고 디클로로메탄(Dichloromethane) 100 ml 에 바이오틴(Biotin, 이성화학, Korea) 1.0 g을 첨가하여 바이오틴 용액을 제조한다. 아민기가 도입된 구형 실리카 자성입자가 분산된 플라스크에 상기 바이오틴 용액과 DIC (Diisopropylcarbodiimide, Acros) 0.5 ml을 첨가한 후에 반응 플라스크를 맨틀에 장착하고 60℃ 에서 2시간 반응시킨다. 반응이 종료되면 메탄올과 초순수를 사용하여 3회 세척한다. 제조된 바이오틴기가 도입된 구형 실리카 자성입자는 바이오틴이 전위가 없으므로 제타전위가 나타나지 않았다.
<실시예 13> 이미노디아세트산기가 도입된 구형 실리카 자성입자의 제조
250ml 플라스크를 준비하고 먼저 플라스크 내부를 질소로 치환한다. pH 11의 소디움카보네이트 용액(Sodium carbonate, 100 mM 농도) 100ml를 플라스크에 넣고, 실시예 9에서 제조한 에폭시기가 도입된 구형 실리카 자성입자 1 g을 반응 플라스크에 첨가하고 초음파로 1시간 분산시킨다. 그리고 소디움카보네이트 용액 10 ml 에 이미노디아세토니트릴(Iminodiacetonitrile, Aldrich) 0.5g을 첨가하여 이미노디아세토니트릴 용액을 제조한다. 에폭시기가 도입된 구형 실리카 자성입자가 분산된 플라스크에 이미노디아세토니트릴(Iminodiacetonitrile, Aldrich) 용액을 첨가한 후에 반응 플라스크를 맨틀에 장착하고 60℃ 에서 1시간 반응시킨다. 반응이 종료되면 메탄올과 초순수를 사용하여 3회 세척한다.
제조된 이미노디아세트산기가 도입된 구형 실리카 자성입자의 제타전위는 - 38.3 mV로 측정되어 실리카 표면에 이미노디아세트산기가 있음을 알 수 있다.
<실시예 14> 구형 실리카 자성입자를 사용하여 핵산의 분리
제조한 구형 실리카 자성입자와 핵산의 분리 효율을 분석하기 위하여 다음의 실험을 하였다.
1.5ml 튜브에 준비된 표준 플라스미드 핵산(pGEM T-easy 벡터가 도입된 대장균 세포 배양액으로부터 분리한 표준 핵산) 2ug을 넣고 실시예 1, 실시예 4, 실시예 5 및 실시예 6의 실리카 자성입자 및 비교를 위하여 비교예 1에서 제조한 실리카 자성입자, Promega 제품(MagneSil PMPs, Cat. No. MD1360), 및 QIAGEN 제품(EZ DNA Blood 350ul Kit, Cat. No. 951054)을 각각 10mg 씩 넣은 후에 500ul 반응용액(4M 농도 구아니딘 하이드로클로라이드, 0.8M 농도 포타슘 아세테이트(pH 4.2))를 넣고 잘 섞어 준다. 상온에서 5분간 방치하여 실리카 자성입자와 플라스미드 핵산이 잘 결합할 수 있도록 한다. 네오디움 자석을 이용하여 실리카 자성입자와 상등액을 분리하고 마이크로 피펫을 이용하여 상등액을 완전히 제거한다. 1ml 세척용액(80% 에탄올)을 넣고 작 섞어준다. 자석을 이용하여 실리카 자성입자와 상등액을 분리하고 마이크로 피펫을 이용하여 상등액을 완전히 제거한다. 동일한 세척과정을 한 번 더 반복한다. 잔존 세척 용액을 제거하기 위하여 60℃ 오븐에서 5분간 건조시킨다.
완전히 건조된 실리카 자성입자에 초순수 100 ㎕를 넣고 잘 섞어준다. 상온 에서 5분간 방치하여 실리카 자성입자로부터 플라스미드 핵산이 잘 용리될 수 있도록 한다. 자석을 이용하여 실리카 자성입자를 분리하고, 상등액을 마이크로 피펫으로 취한 후, 새로운 1.5 ㎖ 튜브에 옮겨 담는다. 자외선 흡광 광도계를 이용하여 플라스미드 핵산의 분리 수율을 계산하여 다음 표 1과 같이 정리하였다.
[표 1] 다양한 실리카 자성입자를 사용한 핵산 분리 효율
Figure 112008080562654-pat00003
상기 표 1의 결과로부터 알 수 있는 바와 같이 본 발명의 실시예에 따른 구형 실리카 자성입자는 비교예 및 시판되는 제품에 비해 플라스미드 핵산 분리 수율이 우수한 것으로 나타났다.
도 1은 실시예 1에서 제조한 구형 실리카 자성입자의 주사전자현미경(SEM) 사진이다.
도 2는 실시예 1에서 제조한 구형 실리카 자성입자의 입도 분석 결과이다.
도 3는 실시예 1에서 제조한 구형 실리카 자성입자의 제타전위 분석 결과이다.
도 4는 실시예 4에서 제조한 구형 실리카 자성입자의 주사전자현미경(SEM) 사진이다.
도 5는 실시예 5에서 제조한 구형 실리카 자성입자의 주사전자현미경(SEM) 사진이다.
도 6은 실시예 6에서 제조한 구형 실리카 자성입자의 주사전자현미경(SEM) 사진이다.
도 7은 비교예 1에서 제조한 구형 실리카 자성입자의 주사전자현미경(SEM) 사진이다.
도 8은 실시예 7에서 제조한 아민기가 도입된 구형 실리카 자성입자의 제타전위 분석 결과이다.

Claims (25)

1) 비극성용매에 계면활성제, 가용성규산염 수용액, 자성입자를 첨가한 후, 초음파로 분산하여 에멀젼(Emulsion)을 제조하는 단계; 및
2) 상기 에멀젼에 지방산(Fatty Acid)을 첨가하여 실리카 자성입자를 제조하는 단계;
를 포함하는 구형 실리카 자성입자의 제조방법.
제 1 항에 있어서,
비극성 용매는 시클로헥산(Cyclohexane), 헥산(Hexane), 헵탄(Heptane) 및 옥탄(Octane)으로부터 선택된 1종 이상인 구형 실리카 자성입자의 제조방법.
제 1 항에 있어서,
상기 계면활성제는 비이온성 계면활성제, 양이온성 계면활성제 및 음이온성 계면활성제로 구성된 군으로부터 선택되는 구형 실리카 자성입자의 제조방법.
제 3 항에 있어서,
비이온성 계면활성제는 폴리옥시에틸렌 데실 에테르(Polyoxyethylene Decyl Ether), 폴리옥시에틸렌 라우릴 에테르(Polyoxyethylene Lauryl Ether), 폴리옥시에틸렌 세틸 에테르(Polyoxyethylene Cetyl Ether), 폴리옥시에틸렌 올레일 에테 르(Polyoxyethylene Oleyl Ether), 폴리옥시에틸렌 스테아릴 에테르(Polyoxyethylene Stearyl Ether), 폴리옥시에틸렌 옥틸 데실 에테르(Polyoxyethylene Octyl Decyl Ether), 폴리옥시에틸렌 트리데실 에테르(Polyoxyethylene Tridecyl Ether), 폴리옥시에틸렌 노닐페놀 에테르(Polyoxyethylene Nonylphenol Ether), 폴리옥시에틸렌 옥틸페놀 에테르(Polyoxyethylene Octylphenol Ether), 폴리옥시에틸렌 페닐 에테르(Polyoxyethylene Phenyl Ether), 폴리옥시에틸렌 소비탄 에스테르(Polyoxyethylene Sorbitan Ester), 소비탄 모노라우레이트(Sorbitan Monolaurate), 소비탄 모노팔미테이트(Sorbitan Monopalmitate), 소비탄 모노스테레이트(Sorbitan Monosterate), 소비탄 트리올레이트(Sorbitan Trioleate), 폴리옥시에틸렌 글리콜(Polyoxyethylene Glycol), 폴리옥시에틸렌 올레일 에스테르(Polyoxyethylene Oleyl Ester) 및 이의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택되고,
양이온성 계면활성제는 도데실 암모니움 클로라이드(Dodecyl ammonium Chloride), 세틸트리메틸암모니움 브로마이드(Cetyltrimethylammonium bromide), 알킬암모니움 메소설페이트(Alkylammonium Methosulfate), 알킬디메틸 암모니움 클로라이트(Alkyl Dimethyl Ammonium Chloride), 및 이의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택되며,
음이온성 계면활성제는 소디움 스테아레이트(Sodium stearate), 소디움 라우레이트(Sodium Laurate), 소디움 팔미테이트(Sodium Palmitate), 포타슘 스테아레이트(Potassium Stearate), 포타슘 라우레이트(Potassium Laurate), 포타슘 팔미테 이트(Potassium Palmitate), 소디움 라우릴 설페이트(Sodium Lauryl sulfate), 소디움 도데실 벤젠 설포네이트(Sodium dodecylbenzene sulfonate) 및 이의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택되는 구형 실리카 자성입자의 제조방법.
제 3 항에 있어서,
상기 계면활성제는 비극성용매 100 중량부에 대하여 5 내지 30 중량부의 함량으로 사용되는 구형 실리카 자성입자의 제조방법.
제 5 항에 있어서,
상기 계면활성제는 비이온성 계면활성제이고 비극성용매 100 중량부에 대하여 10 내지 25 중량부의 함량으로 사용되는 구형 실리카 자성입자의 제조방법.
제 6 항에 있어서,
상기 계면활성제는 폴리옥시에틸렌 노닐페놀 에테르(Polyoxyethylene Nonylphenol Ether)인 구형 실리카 자성입자의 제조방법.
제 1 항에 있어서,
가용성규산염 수용액은 규산나트륨(Sodium Silicates) 수용액, 규산칼륨(Potassium Silicates) 수용액 또는 규산리튬(Lithium Silicates) 수용액으로부터 선택되는 구형 실리카 자성입자의 제조방법.
제 8 항에 있어서,
상기 가용성규산염 수용액은 비극성용매 100 중량부에 대하여 1 내지 20 중량부의 함량으로 사용되는 구형 실리카 자성입자의 제조방법.
제 9 항에 있어서,
상기 가용성규산염 수용액은 규산나트륨 수용액이고 비극성용매 100 중량부에 대하여 1 내지 10 중량부의 함량으로 사용되는 구형 실리카 자성입자의 제조방법.
제 8 항에 있어서,
상기 가용성규산염 수용액의 농도는 0.1mol/L 내지 5mol/L인 구형 실리카 자성입자의 제조방법.
제 1 항에 있어서,
자성입자는 산화철, 페라이트(Ferrite), 철, 코발트, 망간, 크롬, 니켈, 아연 또는 이들의 혼합물로 이루어진 1종 이상의 입자인 구형 실리카 자성입자의 제조방법.
제 12 항에 있어서,
상기 자성입자는 비극성용매 100 중량부에 대하여 0.01 내지 1.0 중량부의 함량으로 사용되는 구형 실리카 자성입자의 제조방법.
제 13 항에 있어서,
상기 자성입자는 산화철 입자이고 비극성용매 100 중량부에 대하여 0.01 내지 0.5 중량부의 함량으로 사용되는 구형 실리카 자성입자의 제조방법.
제 1 항에 있어서,
지방산(Fatty Acid)은 하기 화학식 1의 화합물로부터 선택되는 1종 이상인 구형 실리카 자성입자의 제조방법.
[화학식 1]
R-COOH
(상기 화학식 1에서 R은 C8~C20의 직쇄 또는 분지쇄의 알킬기로부터 선택되고, 상기 알킬기는 탄소 사슬 내에 1 이상의 이중결합 또는 1이상의 삼중결합을 포함할 수 있으며 히드록시기로 더 치환될 수 있다.)
제 15 항에 있어서,
지방산(Fatty Acid)은 미리스트산(Myristic Acid), 팔미트산(Palmitic Acid), 라우르산(Lauric Acid), 스테아르산(Stearic Acid), 리놀레산(Linoleic Acid), 리놀렌산(Linolenic Acid), 리시놀레산(Ricinoleic Acid), 올레산(Oleic Acid) 및 이들의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택되는 구형 실리카 자성입자의 제조방법.
제 16 항에 있어서,
상기 지방산(Fatty Acid)은 비극성용매 100 중량부에 대하여 0.1 내지 10 중량부의 함량으로 사용되는 구형 실리카 자성입자의 제조방법.
제 17 항에 있어서,
상기 지방산(Fatty Acid)은 미리스트산(Myristic Acid)이고 비극성용매 100 중량부에 대하여 1 내지 5 중량부의 함량으로 사용되는 구형 실리카 자성입자의 제조방법.
제 1 항에 있어서,
상기 2) 단계 후 실리카 자성입자 표면에 기능기를 도입하는 단계를 더 포함하는 구형 실리카 자성입자의 제조방법.
제 19 항에 있어서,
상기 기능기는 아민기, 카복실산기, 에폭시기, (C1~C30)알킬기, 스트렙타비딘(Streptavidin)기, 바이오틴(Biotin)기 및 이미노디아세트산(Iminodiacetic acid)기로부터 선택되는 1종 이상인 구형 실리카 자성입자의 제조방법.
제 20 항에 있어서,
상기 아민기는 아미노프로필디이소프로필에톡시실란(Aminopropyldiisopropylethoxysilane), 아미노프로필트리메톡시실란(Aminopropyltrimethoxysilane), 아미노프로필트리에톡시실란(Aminopropyltriethoxysilane), 아미노프로필메틸디에톡시실란(Aminopropylmethyldiethoxysilane), 아미노페닐트리메톡시실란(Aminophenyltrimethoxysilane), 페닐아미노프로필트리메톡시실란(Phenylaminopropyltrimethoxysilane), 아미노에틸아미노프로필트리메톡시실란(Aminoethylaminopropyltrimethoxysilane), 아미노에틸아미노프로필트리에톡시실란(Aminoethylaminopropyltriethoxysilane), 아미노에틸아미노프로필메틸디메톡시실란(Aminoethylaminopropylmethyldimethoxysilane), 아미노에틸아미노이소부틸메틸디메톡시실란(Aminoethylaminoisobutylmethyldimethoxysilane), 트리메톡시실릴프로필디에틸렌트리아민(Trimethoxysilylpropyldiethylenetriamine) 또는 이들의 혼합물로부터 도입되고;
상기 카복실산기는 트리메톡시실릴프로필에틸렌디아민 트리아세트산(Trimethoxysilylpropylethylenediamine triacetic acid)로부터 도입되거나, 실리카 자성입자에 아민기를 도입한 후 숙시닉안하이드라이드(Succinic Anhydride)와의 반응으로부터 도입되며;
상기 에폭시기는 글리시드옥시프로필 트리메톡시 실 란(Glycidoxypropyltrimethoxysilane), 글리시드옥시프로필 트리에톡시 실란(Glycidoxypropyltriethoxysilane), 글리시드옥시프로필 메틸 디메톡시 실란 (Glycidoxypropylmethyldimethoxysilane), 글리시드옥시프로필 메틸 디에톡시 실란 (Glycidoxypropylmethyldiethoxysilane), 글리시드옥시프로필 메틸 디메톡시 실란 (Glycidoxypropylmethyldimethoxysilane), 글리시드옥시프로필 디메틸 에톡시 실란 (Glycidoxypropyldimethylethoxysilane), 에폭시 시클로 헥실 에틸 트리메톡시 실란 (Epoxycyclohexylethyltrimethoxysilane) 또는 이들의 혼합물로부터 도입되고;
상기 (C1~C30)알킬기는 트리메톡시(C1~C30)알킬실란, 트리에톡시(C1~C30)알킬실란(Triethoxyoctadecylsilane) 또는 이들의 혼합물로부터 도입되며;
상기 스트렙타비딘(Streptavidin)기는 실리카 자성입자에 아민기를 도입한 후 스트렙타비딘(Streptavidin)과의 반응으로부터 도입되고;
상기 바이오틴(Biotin)기는 실리카 자성입자에 아민기를 도입한 후 바이오틴(Biotin)과의 반응으로부터 도입되며;
상기 이미노디아세트산(Iminodiacetic acid)기는 실리카 자성입자에 에폭시기를 도입한 후 이미노디아세토니트릴(Iminodiacetonitrile)과의 반응으로부터 도입되는 구형 실리카 자성입자의 제조방법.
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