KR20230004036A - CalB 효소 고정화 자성나노입자를 이용한 에스테르의 가수분해 방법 - Google Patents

CalB 효소 고정화 자성나노입자를 이용한 에스테르의 가수분해 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR20230004036A
KR20230004036A KR1020210085802A KR20210085802A KR20230004036A KR 20230004036 A KR20230004036 A KR 20230004036A KR 1020210085802 A KR1020210085802 A KR 1020210085802A KR 20210085802 A KR20210085802 A KR 20210085802A KR 20230004036 A KR20230004036 A KR 20230004036A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
magnetic nanoparticles
enzyme
calb
silica
mnps
Prior art date
Application number
KR1020210085802A
Other languages
English (en)
Inventor
장정호
이하율
Original Assignee
한국세라믹기술원
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 한국세라믹기술원 filed Critical 한국세라믹기술원
Priority to KR1020210085802A priority Critical patent/KR20230004036A/ko
Publication of KR20230004036A publication Critical patent/KR20230004036A/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/008—Preparation of nitrogen-containing organic compounds containing a N-O bond, e.g. nitro (-NO2), nitroso (-NO)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
    • C12N11/14—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an inorganic carrier
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)

Abstract

본 발명은 CalB 효소 고정화 자성나노입자의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명에서 효소 고정화에 사용한 자성나노입자(magnetite, Fe3O4)는 10~100nm의 크기를 가지며 초상자성의 특성을 가져, 물질의 분리와 재사용이 가능하며, 대량 생산, 효율성, 단순성 등의 장점을 가지고 있다. 이러한 자성나노입자에 실리카 전구체를 이용하여 코팅을 하게 되면, 기능성 실란가교제(silane coupling agent)를 이용한 입자의 표면개질이 용이하며, 산화화학적 안정성이 증가한다. 따라서 이러한 고정화 기술을 통해 CalB 효소의 용이한 회수와 효소 재활용을 통해, 상기 효소의 사용을 공정 과정에서 현저히 절감할 수 있다.

Description

CalB 효소 고정화 자성나노입자를 이용한 에스테르의 가수분해 방법 {Method for esterolysis using CalB enzyme-immobilized magnetic nanoparticles}
본 발명은 CalB 효소 고정화 자성나노입자를 이용한 에스테르의 가수분해 방법에 관한 것이다.
리파제는 생물촉매 반응에 가장 많이 사용되는 효소이다. 리파제의 생물학적 기능은 기본적으로 지방(triacylglyceride)을 지방산(fatty acid)과 글리세롤(glycerol)로 분해하는 것이다. 자연계에 존재하는 기질의 다양성으로 인해 리파제는 매우 광범위한 기질 특이성을 갖도록 진화하였고 지방 분해(hydrolysis) 뿐만 아니라 에스터화 반응(esterification), 산분해(acidolysis), 에스터 교환(interesterification, transesterification), 아미노분해(aminolysis), 과가수분해(perhydrolysis) 등의 활성을 가지고 있다. 리파제는 매우 안정한 효소로서 수용액뿐만 아니라 유기용매, 이온성액체, 초임계 유체, DES(deep eutectic solvent) 등 다양한 액상 환경에서 반응을 수행하는 것으로 보고되었다.
CalB(Candida antarctica lipase B) 효소는 비 수성 배지에서 탁월한 성능을 발휘하며 우수한 가수분해, 에스테르화 및 에스테르교환 작용으로 인해 다양한 산업 분야에서 사용되고 있다. 그럼에도 불구하고 CalB 효소의 산업적 적용은 온도 및 pH 변화에 대한 낮은 활성과 안정성으로 인해 제한된다. 또한, 생산비용이 너무 비싸고 반응 후 회수율이 너무 낮아 재사용이 어려운 것으로 알려져 있다.
이러한 문제점을 해결하기 위해 불용성 담체를 이용한 효소 고정화 기술이 개발되고 있다. 현재 시판되고 있는 고정화 CalB 효소는 Novozyme® 435로 고정화에 사용되는 고분자 수지의 단가가 높기 때문에 고정화 CalB 효소의 가격이 매우 높다는 단점이 있다. 최근에는 실리카, 폴리머, 탄소, 금속, 자성 입자 등 다양한 고체 캐리어를 사용하여 리파아제를 고정시킬 수 있다고 보고되었다.
이에, 본 발명자들은 효소의 재활용률이 높은 CalB 효소 고정화 자성나노입자를 제조하고 이를 활용하여 4-nitrophenyl alkyl esters를 통해 대량으로 4-nitrophenol이 생성되게 하는 esterolysis 방법을 개발하여 본 발명을 완성하게 되었다.
대한민국 등록특허 제10-2225519호 (칸디다 안타티카 리파제 B의 변이체 및 이의 이용) 대한민국 등록특허 제10-1273964호 (단백질 Ｇ다합체가 고정화된 자성실리카 나노입자 및 이의 제조방법과 이를 이용한 검출용 면역센서 및 이를 이용한 면역검출방법)
본 발명의 목적은 CalB 효소 고정화 자성나노입자를 이용한 빠른 회수와 재사용이 가능한 에스테르의 가수분해 방법을 제공하는 데에 있다. 즉 본 발명의 목적은 CalB 효소 고정화 자성나노입자를 이용하여 기존의 공정으로 회수하지 못했던 CalB 효소 회수공정을 수행하되 매우 신속하고 편리하게 회수하는 방법을 적용하여 에스테르의 가수분해 방법을 제공하는 데에 있다.
본 발명은 CalB(Candida antarctica lipase B) 효소 고정화 자성나노입자를 이용한 에스테르의 분해방법에 관한 것이다.
바람직하게는, (제1단계) 나노자성체 산화물을 포함하는 실리카 코팅된 나노입자를 준비하는 단계;
(제2단계) 상기 실리카 코팅된 자성나노입자를 실란 가교제로 표면처리하는 단계;
(제3단계) 상기 실란 가교제로 표면처리된 실리카 코팅된 자성나노입자에 CalB(Candida antarctica lipase B) 효소를 고정화시키는 단계; 및
(제4단계) 4-니트로페닐 알킬 에스테르(4-nitrophenyl alkyl esters) 화합물에 CalB 효소 고정화 자성나노입자를 반응하여 4-니트로페놀(4-nitrophenol)이 생성된 반응산물을 얻는 단계;
를 포함할 수 있다.
본 발명의 방법에서, 상기 자성나노체 산화물은 철족금속 원소(Fe, Ni, Co), 희토류 원소(La, Ce, Pr, Nd, Pm, Sm, Eu, Gd, Tb, Dy, Ho, Er, Tm, Yb, Lu), 화폐금속 원소(Cu, Ag, Au), 아연족 원소(Zn, Cd, Hg), 알루미늄족 원소(Al, Ga, In, Tl), 알칼리토금속 원소(Ca, Sr, Ba, Ra) 또는 백금족 원소(Pt, Pd)에의 산화물 또는 이들의 합금의 산화물일 수 있다.
상기 자성나노입자는 TEOS(tetraethly orthosilicate), TMOS(tetramethyl orthosilicate), TBOS(tetrabuthyl orthosilicate) 및 이들의 혼합물로부터 선택된 실리카 전구체로 코팅된 것이 특징이다.
상기 실란 가교제는 3-아미노프로필 트리에톡시실란(3-Aminopropyl triethoxysilane), 카르복시에틸 실란티올 나트륨염 (Carboxyethyl silanetriol, sodium salt) 또는 3-클로로필트리에톡시실란 (3-Chloropropyltriethoxysilane)에서 선택될 수 있다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명의 자성나노입자는 강자성을 띠는 입자로서 일반적으로 수 나노미터에서 수백 나노미터의 크기를 갖는 입자를 의미한다.
본 발명에서 제조한 CalB 효소 고정화 자성나노입자는 이하 Si-MNPs@CalB라고도 한다.
본 발명의 일 양태는 a) FeCl2·4H2O와 FeCl3·6H2O의 혼합수용액에 암모니아수를 첨가하여 상기 이온들을 동시에 침전시켜 자성나노입자(magnetite, Fe3O4)를 합성하는 단계; 및 b) 염기용액상에서 실리카 전구체를 사용하여 솔-젤 법(sol-gel process)으로 상기 자성나노입자 표면을 실리카로 코팅시키는 단계; C) 상기 실리카로 코팅된 자성나노입자의 표면을 실란 가교제(silane couplig agent)를 사용하여 개질하는 단계; d) 실란 가교제로 개질된 자성나노입자의 표면에 CalB(Candida antarctica lipase B) 효소를 고정화여 Si-MNPs@CalB를 제조하는 단계; 및 e) 4-nitrophenyl alkyl esters 화합물에 Si-MNPs@CalB를 반응시켜 4-nitrophenol이 생성된 반응산물을 얻는 단계;를 포함한다.
상기 자성나노입자(magnetic nanoparticles, MNPs)는 FeCl2·4H2O와 FeCl3·6H2O을 각각 증류수에 녹여 1~3M Fe2 + 용액과 0.5~2M Fe3 + 용액을 제조하고, 1~3M Fe2 + 용액 10mL 기준 0.5~2M Fe3 + 용액 30~50mL를 혼합한 용액에 0.6~0.8M NH4OH를 적가하여 용액의 pH를 11로 맞춘 후 0.5~2시간 동안 교반하여 제조할 수 있고, 합성된 입자를 자석을 이용하여 분리한 후, 에탄올로 2~3회 세척하고 진공 건조하여 사용할 수 있다.
본 발명의 방법에 있어서, 자성나노체 산화물은 철족금속 원소(Fe, Ni, Co), 희토류 원소(La, Ce, Pr, Nd, Pm, Sm, Eu, Gd, Tb, Dy, Ho, Er, Tm, Yb, Lu), 화폐금속 원소(Cu, Ag, Au), 아연족 원소(Zn, Cd, Hg), 알루미늄족 원소(Al, Ga, In, Tl), 알칼리토금속 원소(Ca, Sr, Ba, Ra) 또는 백금족 원소(Pt, Pd)에의 산화물 또는 이들의 합금의 산화물일 수 있다. 보다 더 자세하게는 자철광(magnetite; Fe3O4), 헤마타이트(hematite; α-Fe2O3), 마그헤마이트(maghemite; γ-Fe2O3), 니켈, 코발트 및 그들의 화합물로부터 이루어진 군에서 선택된 1종인 것일 수 있다.
본 발명에서 상기 자성나노입자는 TEOS(tetraethly orthosilicate), TMOS(tetramethyl orthosilicate), TBOS(tetrabuthyl orthosilicate) 및 이들의 혼합물로부터 선택된 실리카 전구체로 코팅될 수 있다. 바람직하기는, 상기 자성나노입자는 TEOS(tetraethly orthosilicate)로 코팅될 수 있다.
상기 실리카 코팅된 자성나노입자(silica coated magnetic nanoparticle, Si-MNPs)는 다음과 같이 제조할 수 있다. 이를 위해, 사이클로헥산 및 올레산이 100:5 내지 100:10의 중량비로 혼합된 용액에 자성나노입자(MNPs) 0.2~0.4 중량부를 첨가하여 분산하고, 비이온성 계면활성제로서 폴리(옥시에틸렌)노닐페닐에테르(또는 노닐 페놀 에톡실레이트라고도 함) 5~20 중량부를 새로운 사이클로헥산 100~300 중량부에 넣고, 자성나노입자 분산용액과 혼합하여 교반시키면서 염화암모늄 20~30 중량부와 실리카 전구체 4~8 중량부를 넣고 12~48시간 동안 20~35℃의 상온에서 교반할 수 있다. 교반 반응 후에는 메탄올(methanol)을 넣어 층을 분리시킨 후, 원심분리시켜 침전물을 얻고, 에탄올을 이용하여 침전물을 2~3회 세척한 후, 진공 건조를 12~48시간 동안 하여 20~30nm의 사이즈를 갖는 실리카 코팅된 자성나노입자를 얻을 수 있다.
상기 실란 가교제는 3-아미노프로필 트리에톡시실란(3-Aminopropyl triethoxysilane), 카르복시에틸 실란티올 나트륨염 (Carboxyethyl silanetriol, sodium salt) 또는 3-클로로필트리에톡시실란 (3-Chloropropyltriethoxysilane)으로부터 선택될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
실리카 코팅 자성나노입자의 표면개질은 다음의 방법으로 제조할 수 있다. 실리카 코팅된 자성나노입자 1 중량부 기준 100~300배 중량부의 유기용매를 첨가하고 0.5~2시간 동안 교반하고, 실란 가교제를 1종 이상 첨가하고, 110~121℃에서 12~48시간 동안 환류하여 수행할 수 있다. 상기 유기용매로는 톨루엔을 사용할 수 있다. 이 후 표면개질된 입자를 자석을 이용하여 분리한 후, 에탄올을 이용하여 2~3회 세척한 후, 진공 건조하여 표면개질된 실리카 코팅 자성나노입자를 얻을 수 있다.
본 발명에서는 CalB 효소 회수를 용이하게 하기 위해 자성 나노 입자를 효소 고정 지지체로 사용한다. 상기 자성나노입자는 실리카 코팅 후 효소와의 결합이 용이하도록 다양한 기능성 (-NH2, -CO0H, -Cl) 실란 가교제를 사용하여 표면을 개질하며, 이 후 CalB 효소를 고정시키기 위해, NHS/EDC 커플링 방법을 이용하는데, 실란가교제로 표면개질된 실리카 코팅된 자성나노입자에 EDC (1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide)와 NHS (Nhydroxysuccinimide)기를 동시에 첨가한 후 CalB 효소를 추가하는 공정을 적용한다.
보다 바람직하게는 NHS/EDC 커플링을 위해 100 중량부의 실란가교제로 표면개질된 실리카 코팅된 자성나노입자를 PBS(phosphate buffer saline)에 혼합하여 분산시킨 후, EDC 300~400 중량부와 NHS 20~40 중량부를 동시에 첨가한 뒤, CalB 효소(20~40mg/mL)를 추가적으로 가해줄 수 있다.
이 때, PBS나 CalB 효소는 동일 또는 1:0.5 내지 1:2의 중량비 상태로 혼합하는 것이 좋으며, 실란가교제로 표면개질된 실리카 코팅된 자성나노입자와 비교하여 10~30배 중량이 첨가될 수 있다. CalB 효소는 증류수 또는 PBS에 용해하여 사용할 수 있다.
또한, 본 발명에서는 4-nitrophenyl alkyl esters 화합물로서 4 개의 기질 (4-nitrophenyl butyrate (PNPB, C4), 4-nitrophenyl octanoate (PNPO, C8), 4-nitrophenyl dodecanoate(PNPD, C12) 또는 4-nitrophenyl palmitate(PNPP, C16))을 이용하여, 자성나노입자에 고정된 CalB 효소가 C4 내지 C16의 사슬의 촉매 가수 분해 반응을 수행한다.
본 발명은 CalB 효소 고정화 자성나노입자를 이용한 에스테르의 가수분해 방법에 관한 것이다.
본 발명에서 효소 고정화에 사용한 자성나노입자(magnetite, Fe3O4)는 10~100nm의 크기를 가지며 초상자성의 특성을 가져, 물질의 분리와 재사용이 가능하며, 대량 생산, 효율성, 단순성 등의 장점을 가지고 있다. 이러한 자성나노입자에 실리카 전구체를 이용하여 코팅을 하게 되면, 기능성 실란가교제(silane coupling agent)를 이용한 입자의 표면개질이 용이하며, 산화화학적 안정성이 증가한다. 따라서 이러한 고정화 기술을 통해 CalB 효소의 용이한 회수와 효소 재활용을 통해, 상기 효소의 사용을 공정 과정에서 현저히 절감할 수 있다. 또한 이로 인해 본 발명에서 CalB 효소 고정화 자성나노입자를 이용함으로써 저비용으로 4-nitrophenyl alkyl esters의 분해 효과, 아세트아미노펜의 중산산물 또는 살충제 등으로 유용하게 사용되는 4-nitrophenol 등의 제조를 용이하게 수행할 수 있다.
도 1은 개질된 실리카 코팅 자성나노입자 표면의 CalB 효소 고정화 공정도이다.
도 2a는 Si-MNP 및 Si-MNPs@CalB의 투과 전자 현미경 (TEM) 이미지를 보여준다.
도 2b는 각각 CalB 효소, Si-MNPs 및 Si-MNPs@CalB의 Fourier transform-infrared (FT-IR) 스펙트럼과 Si-MNPs 및 Si-MNPs@CalB의 입자 크기 분포를 비교한 결과를 보여준다.
도 2c는 Si-MNPs 및 Si-MNPs@CalB의 vibrating sample magnetometer(VSM) 측정 결과 및 최종 제조된 제품의 사진이다.
도 3은 4-nitrophenyl alkyl esters의 가수분해 경로를 개략적으로 나타낸 그림이다.
도 4는 기질별 native CalB의 lineweaver plot 그래프이다.
도 5는 기질별 CalB 효소가 고정화된 실리카 코팅 자성나노입자의 lineweaver plot 그래프이다.
도 6은 Si-MNPs@CalB의 재사용 효율을 나타내는 그래프이다.
이하 본 발명의 바람직한 실시예를 상세히 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명은 여기서 설명되는 실시예에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화될 수도 있다. 오히려, 여기서 소개되는 내용이 철저하고 완전해지도록, 당업자에게 본 발명의 사상을 충분히 전달하기 위해 제공하는 것이다.
< 실시예 1. Si-MNPs@CalB의 제조>
실시예 1-1. 자성나노입자의 합성
실온(25℃)에서 FeCl2·4H2O와 FeCl3·6H2O을 각각 증류수에 녹여 2M Fe2 + 용액과 1M Fe3 + 용액을 제조하였다. 2M Fe2 + 용액 10mL와 1M Fe3 + 용액 40mL를 혼합한 용액에 0.7M NH4OH를 한 방울씩 천천히 적가시킨 후, 용액의 pH를 11로 맞추었다. 이때 용액의 색은 갈색에서 검정색으로 변하게 된다. 한 시간 동안 교반하고 합성된 입자를 자석을 이용하여 분리한 후, 에탄올(ethanol)로 2~3회 세척하고 24시간 동안 진공 건조하여 자성나노입자(magnetic nanoparticles, MNPs)를 합성하였다.
실시예 1-2. 실리카 코팅된 자성나노입자의 합성( Si - MNPs )
MNPs 300mg을 cyclohexane 100g에 올레산(oleic acid) 8g을 넣고 1시간 동안 분산시켰다. 다음 cyclohexane 200g에 Igepal CO-520 10g을 분산시킨 용액에 MNPs 분산용액을 넣어주고 교반시키면서 NH4OH 16g과 Tetraethyl- orthosilicate(TEOS) 6 g을 넣고 24시간 동안 상온에서 교반하였다. 반응 후 메탄올(methanol)을 넣어 층을 분리시킨 후, 원심분리시켜 얻은 침전물은 에탄올을 이용하여 2~3회 세척한 후, 진공 건조를 24시간 동안 하여 20~30nm의 사이즈를 갖는 실리카 코팅된 자성나노입자(silica coate magnetic nanoparticle, Si-MNPs)를 제조하였다.
실시예 1-3. 실리카 코팅 자성나노입자의 표면 개질((Si-MNPs@cross-linkers)
각 둥근 플라스크에 제조된 Si-MNPs 1.0 g에 toluene 200 g을 넣고 1시간 정도 교반 후, 3-Aminopropyl triethoxysilane 1.0 g, Carboxyethyl silanetriol 1.0 g, 3-Chloropropyl triethoxysilane 1.0 g을 각각 개별로 넣고 온도 120 ℃에서 24시간 동안 환류하였다(reflux). 반응 후 표면개질된 입자를 자석을 이용하여 분리한 후, 에탄올을 이용하여 2~3회 세척한 후, 진공 건조하여 실리카 코팅 자성나노입자의 표면을 개질하였다.
실시예 1-4. 개질된 실리카 코팅 자성나노입자에 CalB 효소 고정화(Si-MNPs@CalB)
효소 고정화를 위한 커플링 반응은 EDC(1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide)와 NHS(Nhydroxysuccinimide) 커플링 반응을 통해 수행했다. 먼저, 50 mg의 Si-MNPs@CO2H를 2 mL의 PBS 용액 (phosphate buffer saline, 10 mM, pH 7.2)에 첨가했다. 그 후, 잘 분산된 용액에 EDC (173mg)와 NHS (22mg)를 동시에 첨가한 뒤, 2 g의 CalB 효소 (28.3 mg/mL)를 추가적으로 가해준다. 반응 혼합물은 실온에서 24 시간 동안 교반한 뒤, Si-MNPs@CalB 입자를 자석을 이용하여 분리하고 진공에서 24 시간 동안 건조시켰다.
이렇게 제조된 각 효소들의 특성을 확인하였다. 도 1의 과정으로 효소 고정화를 실시하여 제조한 각 효소는 다음의 도 2와 같은 형상 또는 특징을 갖는다.
도 2a는 Si-MNP 및 Si-MNPs@CalB의 투과 전자 현미경 (TEM) 이미지를 보여준다. Si-MNP의 평균 입경은 17nm이고, 구형 입자를 형성하기 위해 실리카층으로 완전히 코팅된 것으로 확인된다. Si-MNPs@CalB는 효소가 Si-MNP에 고정되어 있기 때문에 입자 크기가 17nm에서 약 20nm로 증가하는 것을 확인할 수 있다.
도 2b는 각각 CalB 효소, Si-MNPs 및 Si-MNPs@CalB의 Fourier transform-infrared (FT-IR) 스펙트럼과 Si-MNPs 및 Si-MNPs@CalB의 입자 크기 분포를 비교한 결과를 보여준다. 1,100cm-1 및 800cm-1에서 관찰된 Si-MNPs@CalB의 피크는 Si-O-Si의 비대칭 및 대칭 스트레칭 vibration이다. Fe-O와 O-H의 vibration은 각각 470 cm-1과 3,400 cm-1에서 보였다. Si-MNPs@CalB 및 free CalB 효소의 FT-IR 스펙트럼과 달리 CalB 효소의 N-H vibration은 각각 1,630cm-1 및 1,545cm-1에서 나타난다. 이것은 CalB 효소가 Si-MNP에 고정되었음을 의미한다. 입자 크기는 Si-MNP에 CalB 효소를 고정시킨 후 16.5nm에서 20.5nm로 증가한 것으로 확인된다.
도 2c는 Si-MNPs 및 Si-MNPs@CalB의 vibrating sample magnetometer(VSM) 측정 결과 및 최종 제조된 제품의 사진을 제시하고 있다. Si-MNPs 및 Si-MNPs @ CalB의 saturation magnetization는 각각 14.5 emu / g 및 11 emu / g이며, Si-MNPs@CalB의 magnetic susceptibility이 Si-MNP보다 낮은 이유는 CalB 효소의 고정화 때문이다.
< 실시예 2. 4- nitrophenyl alkyl esters( PNPE )의 Estrolysis >
도 3의 경로와 같이 다음의 방법으로 Estrolysis를 실시하였다.
실시예 2-1. 0.1M Tris -HCl buffer의 제조
Trizma base 12.114 g을 증류수 700 mL에 넣어 잘 녹인 후, 3M HCl을 사용하여 pH meter로 pH 7.2를 맞춰주면서 용액의 최종부피가 1000mL가 되도록한다.
실시예 2-2. PNPE solution의 제조
PNPE의 종류인 4-nitrophenyl butyrate(PNPB), 4-nitrophenyl octanoate(PNPO), 4-nitrophenyl dodecanoate(PNPD), 4-nitrophenyl palmitate(PNPP)를 기질로 사용하였다. 기질은 Tetrahydrofuran(THF)에 녹인 후 사용하였다. 측정하고자 하는 농도에 맞춰 0.1M Tris-HCl buffer에 기질을 희석시켜 사용한다.
실시예 2-3. PNPE 가수분해
Si-MNPs@CalB 0.5 mg을 1 mL의 PNPE 용액에 넣어 시간별로 상온(25℃)에서 shaking 하여 가수분해되어 생성된 4-nitrophenol(PNP)을 UV-Vis spectrum 400 nm에서 측정한다.
상기 흡광도 결과를 통해 다음을 확인하였다. Si-MNPs@CalB의 다양한 효소촉매상수 (Km, Vmax 및 Kcat)는 Michaelis-Menten 방정식과 Lineweaver-Burk 플롯을 사용하여 계산하였고, 4-nitrophenyl alkyl esters 기질 간의 상관관계를 계산했다. 에스테르화 효소의 촉매상수는 알킬 사슬의 길이에 따라 평가되었다.
이에 대한 각 결과는 표 1과 도 4 및 도 5에 나타내었으며, 이 결과는 Si-MNPs@CalB이 효소로서의 기능을 잘 발휘하고 있음을 설명하고 있다.
하기의 표 1은 CalB 효소가 고정화된 실리카코팅 자성나노입자의 기질별 Michaelis-Menten parameters 결과이다.
Figure pat00001
표 1에서 alkyl esters 기질의 알킬 체인의 길이가 길수록 Si-MNPs@CalB 소재와의 반응 친화력이 점점 감소하는 경향성을 나타낸다. Michaelis-Menten 상수인 Km 은 기질과의 친화성을 나타내는데, 값이 작을수록 기질과 촉매의 친화성이 크다는 것을 의미한다. 또한, 반응속도를 나타내는 Vmax 는 분당 얼마나 많은 기질의 농도가 반응을 하는 것을 나타내는데, 기질의 알킬 체인의 길이가 짧을수록 Vmax는 증가한다. 반응물인 alkyl esters 기질이 생성물인 4-nitrophenol(PNP)로 전환되는 값을 나타내는 turn-over 상수, kcat은 alkyl esters 기질의 알킬 체인이 짧을수록 전환효율이 크다는 것을 나타낸다.
<실시예 3. 효소의 재활용 성능 확인>
PNPE 가수분해 효소반응을 반복해서 수행하면서, 회수된 효소를 재사용하였다. 그 결과 도 6에 개시된 바와 같이 5회 사용까지도 효소 사용이 거의 줄어들지 않음을 확인할 수 있다.
이상과 같은 결과로 인해 본 발명에서 CalB 효소 고정화 자성나노입자를 이용함으로써 저비용으로 4-nitrophenyl alkyl esters의 분해 효과, 아세트아미노펜의 중산산물 또는 살충제 등으로 유용하게 사용되는 4-nitrophenol 등의 제조를 용이하게 수행할 수 있음을 제시하며, 고정화 되지 않은 CalB 효소는 회수도 어려울 뿐만 아니라 재사용성이 매우 낮은 것임에 반해, CalB 효소 고정화 자성나노입자는 5회 이상까지의 재사용을 해도 80% 이상의 효능을 유지함을 확인하였다.

Claims (4)

  1. (제1단계) 나노자성체 산화물을 포함하는 실리카 코팅된 나노입자를 준비하는 단계;
    (제2단계) 상기 실리카 코팅된 자성나노입자를 실란 가교제로 표면처리하는 단계;
    (제3단계) 상기 실란 가교제로 표면처리된 실리카 코팅된 자성나노입자에 CalB(Candida antarctica lipase B) 효소를 고정화시키는 단계; 및
    (제4단계) 4-니트로페닐 알킬 에스테르(4-nitrophenyl alkyl esters) 화합물에 CalB 효소 고정화 자성나노입자를 반응하여 4-니트로페놀(4-nitrophenol)이 생성된 반응산물을 얻는 단계;
    를 포함하는 것을 특징으로 하는 CalB 효소 고정화 자성나노입자를 이용한 에스테르의 가수분해 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 자성나노체 산화물은 철족금속 원소(Fe, Ni, Co), 희토류 원소(La, Ce, Pr, Nd, Pm, Sm, Eu, Gd, Tb, Dy, Ho, Er, Tm, Yb, Lu), 화폐금속 원소(Cu, Ag, Au), 아연족 원소(Zn, Cd, Hg), 알루미늄족 원소(Al, Ga, In, Tl), 알칼리토금속 원소(Ca, Sr, Ba, Ra) 또는 백금족 원소(Pt, Pd)에의 산화물 또는 이들의 합금의 산화물인 것을 특징으로 하는 것인 CalB 효소 고정화 자성나노입자의 제조방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 자성나노입자는 TEOS(tetraethly orthosilicate), TMOS(tetramethyl orthosilicate), TBOS(tetrabuthyl orthosilicate) 및 이들의 혼합물로부터 선택된 실리카 전구체로 코팅된 것임을 특징으로 하는 것인 CalB 효소 고정화 자성나노입자를 이용한 에스테르의 가수분해 방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 실란 가교제는 3-Aminopropyl triethoxysilane, Carboxyethyl silanetriol, sodium salt 3-Chloropropyltriethoxysilane 또는 Bis(triethoxysilylpropyl) disulfide에서 선택되는 것을 특징으로 하는 것인 CalB 효소 고정화 자성나노입자를 이용한 에스테르의 가수분해 방법.
KR1020210085802A 2021-06-30 2021-06-30 CalB 효소 고정화 자성나노입자를 이용한 에스테르의 가수분해 방법 KR20230004036A (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020210085802A KR20230004036A (ko) 2021-06-30 2021-06-30 CalB 효소 고정화 자성나노입자를 이용한 에스테르의 가수분해 방법

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020210085802A KR20230004036A (ko) 2021-06-30 2021-06-30 CalB 효소 고정화 자성나노입자를 이용한 에스테르의 가수분해 방법

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20230004036A true KR20230004036A (ko) 2023-01-06

Family

ID=84923988

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020210085802A KR20230004036A (ko) 2021-06-30 2021-06-30 CalB 효소 고정화 자성나노입자를 이용한 에스테르의 가수분해 방법

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR20230004036A (ko)

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101273964B1 (ko) 2010-12-30 2013-06-11 주식회사 중겸 단백질 ｇ다합체가 고정화된 자성실리카 나노입자 및 이의 제조방법과 이를 이용한 검출용 면역센서 및 이를 이용한 면역검출방법
KR102225519B1 (ko) 2019-09-05 2021-03-11 한국생명공학연구원 칸디다 안타티카 리파제 b의 변이체 및 이의 이용

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101273964B1 (ko) 2010-12-30 2013-06-11 주식회사 중겸 단백질 ｇ다합체가 고정화된 자성실리카 나노입자 및 이의 제조방법과 이를 이용한 검출용 면역센서 및 이를 이용한 면역검출방법
KR102225519B1 (ko) 2019-09-05 2021-03-11 한국생명공학연구원 칸디다 안타티카 리파제 b의 변이체 및 이의 이용

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Thangaraj et al. Effect of silica coating on Fe3O4 magnetic nanoparticles for lipase immobilization and their application for biodiesel production
Fang et al. Immobilization of pectinase onto Fe3O4@ SiO2–NH2 and its activity and stability
Mohamed et al. Immobilization of horseradish peroxidase on Fe3O4 magnetic nanoparticles
Wu et al. In situ preparation of magnetic Fe3O4-chitosan nanoparticles for lipase immobilization by cross-linking and oxidation in aqueous solution
Ates et al. Magnetic-propelled Fe 3 O 4–chitosan carriers enhance L-asparaginase catalytic activity: a promising strategy for enzyme immobilization
Hong et al. Stabilization of α-chymotrypsin by covalent immobilization on amine-functionalized superparamagnetic nanogel
US8697020B2 (en) Silica magnetic particles having a spherical form and a process for preparing the same
Wang et al. Immobilization of glucose oxidase using CoFe2O4/SiO2 nanoparticles as carrier
Cui et al. Facile synthesis of amino-silane modified superparamagnetic Fe3O4 nanoparticles and application for lipase immobilization
Huang et al. Catalysis of Rice Straw Hydrolysis by the Combination of Immobilized Cellulase from Aspergillus niger on β‐Cyclodextrin‐Fe3O4 Nanoparticles and Ionic Liquid
Durdureanu-Angheluta et al. Progress in the synthesis and characterization of magnetite nanoparticles with amino groups on the surface
Tarasi et al. Laccase immobilization onto magnetic β-cyclodextrin-modified chitosan: improved enzyme stability and efficient performance for phenolic compounds elimination
Shukoor et al. Fabrication of a silica coating on magnetic γ-Fe2O3 nanoparticles by an immobilized enzyme
Markova et al. Synthesis and properties of core–shell fluorescent hybrids with distinct morphologies based on carbon dots
Asmat et al. Tailoring a robust nanozyme formulation based on surfactant stabilized lipase immobilized onto newly fabricated magnetic silica anchored graphene nanocomposite: Aggrandized stability and application
KR102387805B1 (ko) 복합구조 메조결정 나노입자 및 그의 제조방법
CN110694064B (zh) 一种具有抗菌功能的自激发级联反应金属有机框架纳米粒子的制备方法
Wu et al. Preparation and characterization of tannase immobilized onto carboxyl-functionalized superparamagnetic ferroferric oxide nanoparticles
Li et al. Immobilization of horseradish peroxidase on polyglycerol-functionalized magnetic Fe 3 O 4/nanodiamond nanocomposites and its application in phenol biodegradation
Zhang et al. Preparation of a magnetically recoverable biocatalyst support on monodisperse Fe 3 O 4 nanoparticles
Vaz et al. Synthesis and characterization of biocatalytic γ-Fe2O3@ SiO2 particles as recoverable bioreactors
KR101347205B1 (ko) 맞춤형 효소고정 금-자성 실리카나노입자, 상기 입자의 제조방법 및 상기 입자를 이용한 연속식 바이오매스 가수분해방법
Lee et al. Immobilization of glucose oxidase onto cobalt based on silica core/shell nanoparticles as carrier
CN111063500A (zh) 一种改性磁性纳米颗粒、非极性溶剂基磁性液体及制备方法和用途
Mahmood et al. Lipase Immobilization on oleic acid− pluronic (L-64) block copolymer coated magnetic nanoparticles, for hydrolysis at the oil/water interface

Legal Events

Date Code Title Description
E902 Notification of reason for refusal