KR102225519B1 - 칸디다 안타티카 리파제 b의 변이체 및 이의 이용 - Google Patents

칸디다 안타티카 리파제 b의 변이체 및 이의 이용 Download PDF

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Abstract

본 발명은 가수분해(hydrolysis), 에스터화 반응(esterification) 및 아미노화 반응(amidation) 활성별로 특화된 칸디다 안타티카 유래의 리파제 B(Candida antarctica lipase B, CalB)의 변이체 및 이의 이용에 관한 것이다. 본 발명에 따른 CalB의 변이체는 CalB에 비해 향상된 가수분해(hydrolysis), 에스터 반응(esterification) 및 아미노화 반응(amidation) 활성을 나타내므로, 이를 이용하여 지방산 또는 트리글리세라이드로부터 기능성 화장품용 오일인 왁스에스터와 유사세라마이드 생산 효율을 개선할 수 있다.

Description

칸디다 안타티카 리파제 B의 변이체 및 이의 이용{Variants of Candida antartica Lipase B and Their Use}
본 발명은 가수분해(hydrolysis), 에스터화 반응(esterification) 및 아미노화 반응(amidation) 활성별로 특화된 칸디다 안타티카(Candida antarctica) 유래의 리파제 B(Candida antarctica lipase B, CalB)의 변이체 및 이의 이용에 관한 것이다.
리파제는 생물촉매 반응에 가장 많이 사용되는 효소이다. 리파제의 생물학적 기능은 기본적으로 지방(triacylglyceride)을 지방산(fatty acid)과 글리세롤(glycerol)로 분해하는 것이다. 자연계에 존재하는 기질의 다양성으로 인해 리파제는 매우 광범위한 기질 특이성을 갖도록 진화하였고 지방 분해(hydrolysis) 뿐만 아니라 에스터화 반응(esterification), 산분해(acidolysis), 에스터 교환(interesterification, transesterification), 아미노분해(aminolysis), 과가수분해(perhydrolysis) 등의 활성을 가지고 있다. 리파제는 매우 안정한 효소로서 수용액뿐만 아니라 유기용매, 이온성액체, 초임계 유체, DES(deep eutectic solvent) 등 다양한 액상 환경에서 반응을 수행하는 것으로 보고되었다.
리파제의 종류는 매우 다양하지만 CalB(Candida antarctica lipase B)는 유기용매상에서 유기합성용 효소로 가장 많이 연구된 리파제이다. 특히 전세계적인 효소회사인 노보자임사가 CalB의 고정화 효소인 Novozym435라는 제품명으로 고가에 판매(>100만원/kg)하고 있다. CalB의 분자량은 33 kD이며 pI는 6.0, α/β 구조의 Ser-His-Asp catalytic triad를 갖는 전형적인 리파제이지만 불완전한 뚜껑(lid) 구조를 가지고 있기 때문에 일반적인 리파제와 다른 계면 활성(interfacial activation) 특성을 보인다. Novozym435는 시판 리파제중 가장 안정적이고 지방의 개질 및 유도체 생산, 바이오디젤 생산, 광학이성질체 분리 반응(racemic resolution), 폴리머 축합 또는 분해 반응 등 다양한 반응의 생물촉매로 이용되고 있다.
이러한 CalB의 다양한 유용성 때문에 이를 대량 생산하기 위해서 무수히 많은 연구가 진행되어 왔다. CalB의 재조합 생산은 노보자임스사에서는 곰팡이인 아스파질러스(Aspergillus)를 이용하여 분비생산하고 있으며 분비생산성은 약 2~3 g/L 수준으로 알려져 있다(Can. J. Bot. 73:869, 1995). 일반적으로 사용하는 대장균 시스템에서는 CalB는 발현이 매우 어려운 단백질로 알려져 있으며 발현 생산성이 리터당 수 밀리그램에서 수백 밀리그램 수준이다(AMB 72:1024, 2006; Prot Exp purif. 62:90, 2008; JBB 121:303, 2016). 리파제와 같은 산업효소를 저비용으로 생산하고 활용하기 위해서는 분비생산이 유리하므로 효모 Saccharomyces cerevisiae나 Pichia pastoris를 이용하여 리터당 수 그램 수준으로 분비생산한 것으로 보고되어 있다(J. Biotech. 102:303, 2016; PLOS one 8:e53939, 2013). 그러나 시판되고 있는 효소가 지나치게 고가이며 바이오디젤 등의 값싼 물질을 CalB를 이용하여 생산하기 위해서는 고활성의 CalB 개발과 저비용 재조합 생산시스템 개발이 필요하다.
CalB의 개량은 주로 내열성 개량에 집중되었으며(Protein Eng 16:599, 2003; Enzyme Microb Technol 47:1, 2010; BB 109:867, ABB 169:351, 2013; J Biotechnol. 20;192, 2014) 효소의 활성 개량 연구도 보고되었다(J Microbiol Biotechnol. 17:1308, 2007). 이와 관련하여, 본 발명자들은 효모표면 발현 방법을 이용하여 CalB를 분자진화하고 스크리닝하여 고활성의 효소 CalB14를 개발(한국특허 제10-0475133호)한 바 있으며, 이를 효모 단백질융합인자 기술을 이용하여 재조합 대량생산(한국특허 제10-0626753호)하였다. 또한, CalB14가 가수분해 활성은 우수하나 에스터화 반응(esterification) 효율도 같은 수준으로 개선되지 못한 약한 단점을 보완하기 위하여 추가적인 개량을 통해 71번째 아미노산 페닐알라닌(F)이 세린(S)으로 치환된 CalB1411과 80번째 아미노산 트레오닌(T)이 알라닌(A)로 치환된 CalB1422를 개발하였다(한국특허 제10-1460228호).
그러나, 위와 같은 노력에서 불구하고 여전히 CalB의 에스터화 반응을 비롯하여 아미노화 반응 효율은 산업적으로 이용하기에는 낮은 수준이다.
이에, 본 발명자들은 80번째, 219번째 아미노산에 변이가 도입된 CalB의 278번째 아미노산에 20종의 아미노산으로 포화 돌연변이(saturation mutagenesis)를 추가로 도입하고 이로부터 활성별로 특화된 변이체 6종을 선별하였으며, 이의 우수한 가수분해, 에스터화 반응 및 아미노화 반응을 확인하였다. 또한, 반응별로 최적화된 변이체를 이용하면 지방산 또는 트리글리세라이드로부터 기능성 화장품용 오일인 왁스에스터와 유사세라마이드 생산 효율이 개선됨을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 서열번호 1의 아미노산 서열에서 80번째 아미노산이 알라닌(A)으로 치환 및 219번째 아미노산이 글루타민(Q)으로 치환 중 어느 하나 이상의 치환을 포함하는, CalB의 변이체를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 하나의 목적은 상기 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 하나의 목적은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 하나의 목적은 상기 변이체, 상기 폴리뉴클레오티드 및 상기 벡터 중 어느 하나 이상을 포함하여 CalB의 변이체를 생산하는 미생물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 하나의 목적은 상기 미생물을 배지에서 배양하는 단계; 및 배양된 배지 또는 미생물에서 CalB의 변이체를 회수하는 단계를 포함하는, CalB의 변이체 생산 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 하나의 목적은 지방산 및 중성지방으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 기질과 상기 CalB의 변이체를 반응시켜 기질을 왁스에스터로 전환하는 단계를 포함하는, 왁스에스터 생산 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 i) 지방산 및 중성지방으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 기질과 아미노 알콜을 상기 CalB의 변이체를 이용하여 아미노화 반응시켜 지방산 아미드를 생산하는 단계; 및 ii) 생산된 지방산 아미드에 기질을 추가로 첨가하고 상기 CalB의 변이체를 이용하여 에스터화 반응을 유도하여 유사세라마이드를 생산하는 단계;를 포함하는 유사세라마이드 생산 방법을 제공하는 것이다.
이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 발명에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 발명에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 발명의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 발명의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.
상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 하나의 양태는 서열번호 1의 아미노산 서열에서 80번째 아미노산이 알라닌(A)으로 치환 및 219번째 아미노산이 글루타민(Q)으로 치환 중 어느 하나 이상의 치환을 포함하는, CalB의 변이체를 제공하는 것이다.
본 발명에서 용어, "리파제"는 지방(triacylglyceride)을 지방산(fatty acid)과 글리세롤(glycerol)로 분해하는 효소로, 자연계에 존재하는 기질의 다양성으로 인해 리파제는 매우 광범위한 기질 특이성을 갖도록 진화하였고 지방 분해(hydrolysis) 뿐만 아니라 에스터화 반응(esterification), 산분해(acidolysis), 에스터 교환(interesterification, transesterification), 아미노분해(aminolysis), 과가수분해(perhydrolysis) 등의 기능을 보유한 것으로 알려져 있다. 리파제 중에서도 칸디다 안타티카(Candida antarctica) 유래의 CalB는 의약품 및 정밀 화학제품의 합성에 가장 많이 사용되는 효소이다.
본 발명에서 상기 서열번호 1은 칸디다 안타티카(Candida antarctica) 유래의 리파제 B(CalB)의 아미노산 서열을 의미하나, 이에 제한되지 않으며 상기 아미노산 또는 염기와 동일한 활성을 갖는 서열은 제한 없이 포함될 수 있다. 또한, 본 발명에서의 CalB는 비록 서열번호 1의 아미노산을 포함하는 단백질이라고 정의하였으나, 서열번호 1의 아미노산 서열 앞뒤로의 무의미한 서열 추가 또는 자연적으로 발생할 수 있는 돌연변이, 혹은 이의 잠재성 돌연변이(silent mutation)를 제외하는 것이 아니며, 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 단백질과 서로 동일 또는 상응하는 활성을 가지는 경우라면, 본 발명의 CalB에 해당됨은 당업자에게 자명하다. 구체적으로, 본 발명의 CalB는 서열번호 1의 아미노산 서열 또는 이와 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 상동성 또는 동일성을 갖는 아미노산 서열로 구성되는 단백질일 수 있다. 또한, 이러한 상동성 또는 동일성을 가지며 상기 단백질에 상응하는 효능을 나타내는 아미노산 서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 단백질도 본 발명의 변이 대상이 되는 단백질의 범위 내에 포함됨은 자명하다.
즉, 본 발명에서 '특정 서열번호로 기재된 아미노산 서열을 갖는 단백질 또는 폴리펩티드', '특정 서열번호로 기재된 아미노산 서열을 포함하는 단백질 또는 폴리펩티드'라고 기재되어 있다 하더라도, 해당 서열번호의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드와 동일 혹은 상응하는 활성을 가지는 경우라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 단백질도 본 발명에서 사용될 수 있음은 자명하다. 예를 들면, '서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드'는, 이와 동일 혹은 상응하는 활성을 가지는 경우라면 '서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드'에 속할 수 있음은 자명하다.
본 발명에서 용어, "변이체(variant)"는 하나 이상의 아미노산이 보존적 치환(conservative substitution) 및/또는 변형(modification)에 있어서 상기 열거된 서열(the recited sequence)과 상이하나, 상기 단백질의 기능(functions) 또는 특성(properties)이 유지되는 단백질을 지칭한다. 변이체는 수 개의 아미노산 치환, 결실 또는 부가에 의해 식별되는 서열(identified sequence)과 상이하다. 이러한 변이체는 일반적으로 상기 단백질의 아미노산 서열 중 하나 이상의 아미노산을 변형하고, 상기 변형된 단백질의 특성을 평가하여 식별될 수 있다. 즉, 변이체의 능력은 본래 단백질(native protein)에 비하여 증가되거나, 변하지 않거나, 또는 감소될 수 있다. 또한, 일부 변이체는 N-말단 리더 서열 또는 막전이 도메인(transmembrane domain)과 같은 하나 이상의 부분이 제거된 변이체를 포함할 수 있다. 다른 변이체는 성숙 단백질 (mature protein)의 N- 및/또는 C-말단으로부터 일부분이 제거된 변이체를 포함할 수 있다. 상기 용어 "변이체"는 변이형, 변형, 변이된 단백질, 변이형 폴리펩티드, 변이 등의 용어(영문 표현으로는 modification, modified protein, modified polypeptide, mutant, mutein, divergent, variant 등)가 사용될 수 있으며, 변이된 의미로 사용되는 용어라면 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 목적상, 상기 변이체는 천연의 야생형 또는 비변형 단백질 대비 변이된 단백질의 활성이 증가된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 용어 "보존적 치환(conservative substitution)"은 한 아미노산을 유사한 구조적 및/또는 화학적 성질을 갖는 또 다른 아미노산으로 치환시키는 것을 의미한다. 상기 변이체는 하나 이상의 생물학적 활성을 여전히 보유하면서, 예를 들어 하나 이상의 보존적 치환을 가질 수 있다. 이러한 아미노산 치환은 일반적으로 잔기의 극성, 전하, 용해도, 소수성, 친수성 및/또는 양친매성(amphipathic nature)에서의 유사성에 근거하여 발생할 수 있다. 예를 들면, 전하를 띠는 곁사슬(electrically charged amino acid)을 갖는 아미노산 중 양으로 하전된(염기성) 아미노산은 알지닌, 리신, 및 히스티딘을, 음으로 하전된(산성) 아미노산은 글루탐산 및 아르파르트산을 포함하고; 전하를 띠지 않는 곁사슬(uncharged amino acid)을 갖는 아미노산 중 비극성 아미노산(nonpolar amino acid)은 글리신, 알라닌, 발린, 루이신, 이소루이신, 메티오닌, 페닐알라닌, 트립토판 및 프롤린을 포함하고, 극성(polar) 또는 친수성(hydrophilic) 아미노산은 세린, 트레오닌, 시스테인, 티로신, 아스파라긴 및 글루타민을 포함하고, 상기 비극성 아미노산 중 방향족 아미노산은 페닐알라닌, 트립토판 및 티로신을 포함한다.
또한, 변이체는 폴리펩티드의 특성과 2차 구조에 최소한의 영향을 갖는 아미노산들의 결실 또는 부가를 포함할 수 있다. 예를 들면 폴리펩티드는 번역-동시에(co-translationally) 또는 번역-후에(post-translationally) 단백질의 이전(transfer)에 관여하는 단백질 N-말단의 시그널(또는 리더) 서열과 컨쥬게이트 할 수 있다. 또한 상기 폴리펩티드는 폴리펩티드를 확인, 정제, 또는 합성할 수 있도록 다른 서열 또는 링커와 컨쥬게이트 될 수 있다.
상기 '다른 아미노산으로 치환'은 치환 전의 아미노산과 다른 아미노산이면 제한되지 않는다. 즉, 서열번호 1의 아미노산 서열의 80번째 아미노산인 트레오닌 및 219번째 아미노산인 루이신 중 어느 하나 이상이 다른 아미노산 잔기로 치환된 것이라면 제한되지 않는다. 한편, 본 발명에서 '특정 아미노산이 치환되었다'고 표현하는 경우, 다른 아미노산으로 치환되었다고 별도로 표기하지 않더라도 치환 전의 아미노산과 다른 아미노산으로 치환되는 것임은 자명하다.
상기 변이체는 서열번호 1의 아미노산 서열에서 80번째 아미노산인 트레오닌 및 219번째 아미노산인 루이신 중 어느 하나 이상이 치환 전 아미노산과 다른 아미노산으로 치환된 것일 수 있다. 또는 상기 변이체는 전하를 띠지 않는 곁사슬(uncharged amino acid)을 갖는, 치환 전 아미노산과 다른 아미노산으로 치환된, 변이체일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
구체적으로, 상기 변이체는 서열번호 1의 아미노산 서열에서 80번째 아미노산인 트레오닌이 알라닌으로 치환 및 219번째 아미노산인 루이신이 글루타민으로 치환 중 어느 하나 이상의 치환을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 변이체는 서열번호 1의 아미노산 서열에서 278번째 아미노산이 글리신(G), 알라닌(A), 티로신(T), 아스파르트산(D) 및 히스티딘(H)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 치환을 더 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 제공하는 CalB의 변이체는, 상기에서 설명한 CalB 활성을 갖는 단백질 중 특이적 위치의 아미노산이 치환되어, CalB 활성이 변이 전 단백질 대비 증가된 변이체를 의미할 수 있다.
상기 서열번호 1의 아미노산 서열에서 80번째, 219번째 또는 278번째 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 변이체는 서열번호 2 내지 7 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있고, 구체적으로는 서열번호 2 내지 7 중 어느 하나의 아미노산 서열로 필수적으로 구성되는(consisting essentially of) 것일 수 있으며, 보다 구체적으로는 서열번호 2 내지 7 중 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기 변이체는 서열번호 2 내지 7 중 어느 하나의 아미노산 서열에서 80번째, 219번째 또는 278번째 아미노산 중 선택된 하나 이상의 아미노산은 고정되고, 이와 80% 이상의 상동성 또는 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 구체적으로, 본 발명의 변이체는 서열번호 2 내지 7 중 어느 하나의 아미노산 서열과 적어도 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 상동성 또는 동일성을 가지는 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 또한, 이러한 상동성 또는 동일성을 가지며 상기 단백질에 상응하는 효능을 나타내는 아미노산 서열이라면 80번째, 219번째 또는 278번째 아미노산 위치 이외에, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 단백질도 본 발명의 범위 내에 포함됨은 자명하다.
본 발명에서 용어 '상동성(homology)' 또는 '동일성(identity)'은 두 개의 주어진 아미노산 서열 또는 염기 서열과 관련된 정도를 의미하며 백분율로 표시될 수 있다. 용어 상동성 및 동일성은 종종 상호교환적으로 이용될 수 있다.
보존된(conserved) 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 서열 상동성 또는 동일성은 표준 배열 알고리즘에 의해 결정되며, 사용되는 프로그램에 의해 확립된 디폴트 갭 페널티가 함께 이용될 수 있다. 실질적으로, 상동성을 갖거나(homologous) 또는 동일한(identical) 서열은 일반적으로 서열 전체 또는 전체-길이의 적어도 약 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90%를 따라 중간 또는 높은 엄격한 조건(stringent conditions)에서 하이브리드할 수 있다. 하이브리드화는 폴리뉴클레오티드에서 코돈 대신 축퇴 코돈을 함유하는 폴리뉴클레오티드 또한 고려된다.
임의의 두 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열이 상동성, 유사성 또는 동일성을 갖는지 여부는, 예를 들어, Pearson et al (1988)[Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85]: 2444에서와 같은 디폴트 파라미터를 이용하여 "FASTA" 프로그램과 같은 공지의 컴퓨터 알고리즘을 이용하여 결정될 수 있다. 또는, EMBOSS 패키지의 니들만 프로그램(EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277)(버전 5.0.0 또는 이후 버전)에서 수행되는 바와 같은, 니들만-운치(Needleman-Wunsch) 알고리즘(Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453)이 사용되어 결정될 수 있다(GCG 프로그램 패키지 (Devereux, J., et al, Nucleic Acids Research 12: 387 (1984)), BLASTP, BLASTN, FASTA (Atschul, [S.] [F.,] [ET AL, J MOLEC BIOL 215]: 403 (1990); Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, [ED.,] Academic Press, San Diego,1994, 및 [CARILLO ETA/.](1988) SIAM J Applied Math 48: 1073을 포함한다). 예를 들어, 국립 생물공학 정보 데이터베이스 센터의 BLAST, 또는 ClustalW를 이용하여 상동성, 유사성 또는 동일성을 결정할 수 있다.
폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 상동성, 유사성 또는 동일성은, 예를 들어, Smith and Waterman, Adv. Appl. Math (1981) 2:482 에 공지된 대로, 예를 들면, Needleman et al. (1970), J Mol Biol. 48:443과 같은 GAP 컴퓨터 프로그램을 이용하여 서열 정보를 비교함으로써 결정될 수 있다. 요약하면, GAP 프로그램은 두 서열 중 더 짧은 것에서의 기호의 전체 수로, 유사한 배열된 기호(즉, 뉴클레오티드 또는 아미노산)의 수를 나눈 값으로 정의한다. GAP 프로그램을 위한 디폴트 파라미터는 (1) 일진법 비교 매트릭스(동일성을 위해 1 그리고 비-동일성을 위해 0의 값을 함유함) 및 Schwartz and Dayhoff, eds., Atlas Of Protein Sequence And Structure, National Biomedical Research Foundation, pp. 353-358 (1979)에 의해 개시된 대로, Gribskov et al(1986) Nucl. Acids Res. 14: 6745의 가중된 비교 매트릭스(또는 EDNAFULL(NCBI NUC4.4의 EMBOSS 버전) 치환 매트릭스); (2) 각 갭을 위한 3.0의 페널티 및 각 갭에서 각 기호를 위한 추가의 0.10 페널티(또는 갭 개방 패널티 10, 갭 연장 패널티 0.5); 및 (3) 말단 갭을 위한 무 페널티를 포함할 수 있다.
또한, 임의의 두 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열이 상동성, 유사성 또는 동일성을 갖는지 여부는 정의된 엄격한 조건하에서 써던 혼성화(Southern hybridization) 실험에 의해 서열을 비교함으로써 확인할 수 있으며, 정의되는 적절한 혼성화 조건은 해당 기술 범위 내이고, 당업자에게 잘 알려진 방법(예컨대, J. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989; F.M. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York)으로 결정될 수 있다.
본 발명에서 용어, "CalB(Candida antarctica lipase B)의 변이체"는 CalB의 활성을 가지는 변이형 폴리펩티드, CalB 변이형 폴리펩티드, CalB 활성을 갖는 변이형 폴리펩티드, CalB 활성 변이체, CalB 변이체, 변이형 CalB 등과 혼용되어 사용될 수 있다. 또한 상기 단백질은 칸디다 안타티카(Candida antarctica) 유래일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 CalB의 변이체는 서열번호 1의 아미노산 서열에서 80번째, 219번째 또는 278번째 위치에서 변이를 포함할 수 있으며, 서열번호 1에 아미노산이 부가, 결실된 아미노산 서열이라고 해도 서열번호 1의 N-말단으로부터 80번째, 219번째 또는 278번 아미노산에 상응하는 위치의 아미노산이 치환된 변이체면 본 발명의 범위에 포함된다. 상기 칸디다 안타티카(Candida antarctica) 유래 단백질의 변이체는 서열번호 1의 아미노산 서열에서 80번째, 219번째 또는 278번째 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 것이며, 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하거나 야생형 미생물 유래 변이 전 CalB에 비하여 강화된 활성을 갖는 CalB일 수 있다. 이와 같은 CalB의 변이체는 상기에서 설명한 서열번호 1 및/또는 상기 서열번호 1과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상의 상동성 또는 동일성을 가지는 아미노산에서 서열번호 1의 80번째, 219번째 또는 278번째에 상응하는 위치의 아미노산이 변이된 것을 의미한다.
상기 80번째 아미노산 변이는 80번째 아미노산이 알라닌으로 치환되는 것일 수 있고, 상기 219번째 아미노산 변이는 219번째 아미노산이 글루타민으로 치환되는 것일 수 있으며, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 단백질 또는 야생형 미생물 유래 변이 전 CalB에 비하여 강화된 활성을 갖는 것일 수 있다.
상기 278번째 아미노산 변이는 278번째 아미노산이 글리신, 알라닌, 티로신, 아스파르트산 및 히스티딘으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나로 치환되는 것일 수 있으며, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 단백질 또는 야생형 미생물 유래 변이 전 CalB에 비하여 강화된 활성을 갖는 것일 수 있다.
본 발명의 목적상 상기 CalB의 변이체를 포함하는 미생물의 경우, CalB의 가수분해(hydrolysis), 에스터 반응(esterification) 및 아미노화 반응(amidation) 활성이 증가하는 것을 특징으로 한다. 이는 야생형 미생물이 상기 CalB 활성을 나타내지 못하거나, CalB 활성을 나타내더라도 미미한 활성을 나타내는 것에 반해, 본 발명의 CalB의 변이체를 통해 CalB 활성을 증가시킬 수 있다는 것에 의의가 있다.
본 발명의 다른 하나의 양태는 상기 CalB의 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
상기 CalB의 변이체에 대해서는 전술한 바와 같다.
본 발명에서 용어, "폴리뉴클레오티드"는 뉴클레오티드 단위체(monomer)가 공유결합에 의해 길게 사슬모양으로 이어진 뉴클레오티드의 중합체(polymer)로 일정한 길이 이상의 DNA 또는 RNA 가닥으로서, 보다 구체적으로는 상기 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 단편을 의미한다.
본 발명의 CalB의 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는, 본 발명의 CalB 활성을 갖는 변이형 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열이라면 제한없이 포함될 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 코돈의 축퇴성(degeneracy)으로 인하여 또는 상기 폴리펩티드를 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여, 폴리펩티드의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위 내에서 코딩 영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있다. 보다 구체적으로, 서열번호 1의 아미노산 서열에서 80번째, 219번째 또는 278번째 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 CalB의 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열이라면 제한 없이 포함할 수 있다.
또한 공지의 유전자 서열로부터 조제될 수 있는 프로브, 예를 들면, 상기 염기서열의 전체 또는 일부에 대한 상보 서열과 엄격한 조건 하에 하이드리드화하여, 서열번호 1의 아미노산 서열에서 80번째, 219번째 또는 278번째 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 CalB 활성을 가지는 단백질을 코딩하는 서열이라면 제한없이 포함될 수 있다. 상기 "엄격한 조건(stringent condition)"이란 폴리뉴클레오티드 간의 특이적 혼성화를 가능하게 하는 조건을 의미한다. 이러한 조건은 문헌(예컨대, J. Sambrook et al., 상동)에 구체적으로 기재되어 있다. 예를 들어, 상동성 또는 동일성이 높은 유전자끼리, 40% 이상, 구체적으로는 90% 이상, 보다 구체적으로는 95% 이상, 더욱 구체적으로는 97% 이상, 특히 구체적으로는 99% 이상의 상동성 또는 동일성을 갖는 유전자끼리 하이브리드화하고, 그보다 상동성 또는 동일성이 낮은 유전자끼리 하이브리드화하지 않는 조건, 또는 통상의 써던 하이브리드화(Southern hybridization)의 세척 조건인 60 ℃, 1ХSSC, 0.1% SDS, 구체적으로는 60 ℃, 0.1ХSSC, 0.1% SDS, 보다 구체적으로는 68 ℃, 0.1ХSSC, 0.1% SDS에 상당하는 염 농도 및 온도에서, 1회, 구체적으로는 2회 내지 3회 세정하는 조건을 열거할 수 있다.
혼성화는 비록 혼성화의 엄격도에 따라 염기 간의 미스매치 (mismatch)가 가능할지라도, 두 개의 핵산이 상보적 서열을 가질 것을 요구한다. 용어, "상보적"은 서로 혼성화가 가능한 뉴클레오티드 염기 간의 관계를 기술하는데 사용된다. 예를 들면, DNA에 관하여, 아데노신은 티민에 상보적이며 시토신은 구아닌에 상보적이다. 따라서, 본 발명은 또한 실질적으로 유사한 핵산 서열뿐만 아니라 전체 서열에 상보적인 단리된 핵산 단편을 포함할 수 있다.
구체적으로, 상동성 또는 동일성을 가지는 폴리뉴클레오티드는 55 ℃의 Tm 값에서 혼성화 단계를 포함하는 혼성화 조건을 사용하고 상술한 조건을 사용하여 탐지할 수 있다. 또한, 상기 Tm 값은 60 ℃, 63 ℃ 또는 65 ℃일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니고 그 목적에 따라 당업자에 의해 적절히 조절될 수 있다.
폴리뉴클레오티드를 혼성화하는 적절한 엄격도는 폴리뉴클레오티드의 길이 및 상보성 정도에 의존하고 변수는 해당기술분야에 잘 알려져 있다(Sambrook et al., supra, 9.50-9.51, 11.7-11.8 참조).
본 발명의 다른 하나의 양태는 상기 CalB의 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공한다.
상기 CalB의 변이체 및 폴리뉴클레오티드에 대해서는 전술한 바와 같다.
본 발명에서 사용된 용어 "벡터"는 적합한 숙주 내에서 목적 폴리펩티드를 발현시킬 수 있도록 적합한 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 상기 목적 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 염기서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 상기 조절 서열은 전사를 개시할 수 있는 프로모터, 그러한 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합부위를 코딩하는 서열, 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함할 수 있다. 벡터는 적당한 숙주세포 내로 형질전환된 후, 숙주 게놈과 무관하게 복제되거나 기능할 수 있으며, 게놈 그 자체에 통합될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 벡터는 특별히 한정되지 않으며, 당업계에 알려진 임의의 벡터를 이용할 수 있다. 통상 사용되는 벡터의 예로는 천연 상태이거나 재조합된 상태의 플라스미드, 코스미드, 바이러스 및 박테리오파지를 들 수 있다. 예를 들어, 파지 벡터 또는 코스미드 벡터로서 pWE15, M13, MBL3, MBL4, IXII, ASHII, APII, t10, t11, Charon4A, 및 Charon21A 등을 사용할 수 있으며, 플라스미드 벡터로서 pRS416, pRS426, pRS415, pRS425, YEp13, YEp24, YCp50, pBR계, pUC계, pBluescriptII계, pGEM계, pTZ계, pCL계 및 pET계 등을 사용할 수 있다.
일례로 세포 내 염색체 삽입용 벡터를 통해 염색체 내에 목적 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 염색체 내로 삽입할 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드의 염색체 내로의 삽입은 당업계에 알려진 임의의 방법, 예를 들면, 상동재조합(homologous recombination)에 의하여 이루어질 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다. 상기 염색체 삽입 여부를 확인하기 위한 선별 마커(selection marker)를 추가로 포함할 수 있다. 선별 마커는 벡터로 형질전환된 세포를 선별, 즉 목적 핵산 분자의 삽입 여부를 확인하기 위한 것으로, 약물 내성, 영양 요구성, 세포 독성제에 대한 내성 또는 표면 폴리펩티드의 발현과 같은 선택가능 표현형을 부여하는 마커들이 사용될 수 있다. 선택제(selective agent)가 처리된 환경에서는 선별 마커를 발현하는 세포만 생존하거나 다른 표현 형질을 나타내므로, 형질전환된 세포를 선별할 수 있다.
본 발명의 다른 하나의 양태는 상기 CalB의 변이체, 상기 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 중 어느 하나 이상을 포함하여, CalB의 변이체를 생산하는 미생물을 제공한다.
상기 CalB의 변이체, 폴리뉴클레오테드 및 벡터에 대해서는 전술한 바와 같다.
본 발명에서 용어 "CalB의 변이체를 생산하는 미생물"이란, CalB의 변이체 생산능이 없거나 약한 모균주에 CalB의 변이체 생산능이 부여된 미생물을 의미한다. 구체적으로, 상기 미생물은 서열번호 1의 아미노산 서열 내 하나 이상의 아미노산 변이를 포함하는 CalB의 변이체를 발현하는 미생물로서, 상기 아미노산 변이는 서열번호 1의 아미노산 서열에서 80번째, 219번째 또는 278번째 아미노산이 다른 아미노산으로 치환되고, 증대된 CalB 활성을 갖는, 변이형 폴리펩티드를 발현하는 미생물일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 용어, 단백질이 "발현되도록/되는"은 목적 단백질이 미생물 내에 도입되거나, 미생물 내에서 발현되도록 변형된 상태를 의미하며, 상기 목적 단백질이 미생물 내 존재하는 단백질인 경우 내재적 또는 변형 전에 비하여 그 활성이 강화된 상태를 의미한다. 본 발명의 목적상 "목적 단백질"은 전술한 CalB 활성을 갖는 단백질의 변이체일 수 있다.
구체적으로, "단백질의 도입"은, 미생물이 본래 가지고 있지 않았던 특정 단백질의 활성을 나타나게 되는 것 또는 해당 단백질의 내재적 활성 또는 변형 전 활성에 비하여 향상된 활성을 나타나게 되는 것을 의미한다. 예를 들어, 특정 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 미생물 내 염색체로 도입되거나, 특정 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터가 미생물 내로 도입되어 이의 활성이 나타나는 것일 수 있다. 또한, "활성의 강화"는 미생물이 가진 특정 단백질의 내재적 활성 또는 변형 전 활성에 비하여 활성이 향상된 것을 의미한다. 상기 "내재적 활성"은 자연적, 또는 인위적 요인에 의한 유전적 변이로 미생물의 형질이 변화하는 경우, 형질 변화 전 모균주가 본래 가지고 있던 특정 단백질의 활성을 말한다.
구체적으로, 본 발명의 활성 강화는 상기 단백질 변이체를 코딩하는 유전자의 세포 내 카피수 증가, 상기 단백질 변이체를 암호화하는 유전자의 발현 조절 서열에 변이를 도입하는 방법, 상기 단백질 활성을 갖는 단백질 변이체를 암호화하는 유전자 발현 조절 서열을 활성이 강력한 서열로 교체하는 방법, 염색체상의 단백질 활성을 갖는 자연형 단백질을 코딩하는 유전자를 상기 단백질 변이체를 암호화하는 유전자로 대체하는 방법, 상기 단백질 변이체의 활성이 강화되도록 상기 단백질 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 유전자에 변이를 추가적으로 도입시키는 방법 및 미생물에 단백질 변이체를 도입하는 방법으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 방법으로 이루어질 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
상기에서 유전자의 카피수 증가는, 특별히 이에 제한되지 않으나, 벡터에 작동 가능하게 연결된 형태로 수행되거나, 숙주세포 내의 염색체 내로 삽입됨으로써 수행될 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 단백질 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 작동 가능하게 연결된, 숙주와 무관하게 복제되고 기능할 수 있는 벡터가 숙주세포 내에 도입되는 것일 수 있다. 또는, 상기 폴리뉴클레오티드가 작동 가능하게 연결된, 숙주세포 내의 염색체 내로 상기 폴리뉴클레오티드를 삽입시킬 수 있는 벡터가 숙주세포의 염색체 내에 도입되는 것일 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드의 염색체 내로의 삽입은 당업계에 알려진 임의의 방법, 예를 들면, 상동재조합에 의하여 이루어질 수 있다.
다음으로, 폴리뉴클레오티드의 발현이 증가하도록 발현 조절서열을 변형하는 것은, 특별히 이에 제한되지 않으나, 상기 발현 조절서열의 활성을 더욱 강화하도록 핵산 서열을 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합으로 서열상의 변이를 유도하여 수행하거나, 더욱 강한 활성을 갖는 핵산 서열로 교체함에 의하여 수행될 수 있다. 상기 발현 조절서열은, 특별히 이에 제한되지 않으나, 프로모터, 오퍼레이터 서열, 리보좀 결합부위를 코딩하는 서열, 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열 등을 포함할 수 있다.
상기 폴리뉴클레오티드 발현 단위의 상부에는 본래의 프로모터 대신 강력한 프로모터가 연결될 수 있으며 이에 한정되는 것은 아니다. 원핵 생물에 대해 공지된 강력한 프로모터의 예에는 cj1 내지 cj7 프로모터(대한민국 등록특허 제10-0620092호), lac 프로모터, trp 프로모터, trc 프로모터, tac 프로모터, 람다 파아지 PR 프로모터, PL 프로모터, tet 프로모터, gapA 프로모터, SPL7 프로모터, SPL13(sm3) 프로모터(대한민국 등록특허 제10-1783170호), O2 프로모터(대한민국 등록특허 제10-1632642), tkt 프로모터 및 yccA 프로모터 등이 있고, 진핵 생물에 대해 공지된 프로모터의 예에는 번역 신장 인자 1(TEF1), 글리세롤-3-인산 탈수소 효소 1(GPD1), 3-포스포글리세레이트 키나제 또는 다른 글리콜분해 효소, 예컨대 에놀라제, 글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제, 헥소키나제, 피루베이트 데카르복실라제, 포스포프룩토키나제, 글루코스-6-포스페이트 이소머라제, 3-포스포글리세레이트 뮤타제, 피루베이트 키나제, 트리오스포스페이트 이소머라제, 포스포글루코스 이소머라제, 및 글루코키나제에 대한 프로모터를 포함할 수 있고, 성장 조건에 의해 제어되는 전사의 추가의 이점을 갖는 유도성 프로모터인 다른 효모 프로모터의 예에는 알콜 데히드로게나제 2, 이소시토크로뮴 C, 산 포스파타제, 질소 대사와 연관된 분해 효소, 메탈로티오네인, 글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제, 및 말토스 및 갈락토스 이용을 담당하는 효소에 대한 프로모터가 있고, 효모 발현에 사용하기에 적합한 벡터 및 프로모터는 EP 073657에 추가로 기재되어 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 효모 인핸서도 효모 프로모터와 함께 유리하게 사용된다.
아울러, 염색체상의 폴리뉴클레오티드 서열의 변형은, 특별히 이에 제한되지 않으나, 상기 폴리뉴클레오티드 서열의 활성을 더욱 강화하도록 핵산 서열을 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합으로 발현 조절서열상의 변이를 유도하여 수행하거나, 더욱 강한 활성을 갖도록 개량된 폴리뉴클레오티드 서열로 교체함에 의하여 수행될 수 있다.
이와 같은 단백질 활성의 도입 및 강화는, 상응하는 단백질의 활성 또는 농도가 야생형이나 비변형 미생물 균주에서의 단백질의 활성 또는 농도를 기준으로 하여 일반적으로 최소 1%, 10%, 25%, 50%, 75%, 100%, 150%, 200%, 300%, 400% 또는 500%, 최대 1000% 또는 2000%까지 증가되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 용어 "비변형 미생물"은 미생물에 자연적으로 발생할 수 있는 돌연변이를 포함하는 균주를 제외하는 것이 아니며, 천연형 균주 자체이거나, 상기 CalB의 변이체를 포함하지 않는 미생물, 또는 상기 CalB의 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터로 형질전환되지 않은 미생물을 의미한다.
본 발명에서 상기 CalB의 변이체를 포함하거나, 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 미생물은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터로 형질전환에 의해 제조되는 재조합 미생물일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 용어 "형질전환"은 표적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 숙주세포 내에 도입하여 숙주세포 내에서 상기 폴리뉴클레오티드가 코딩하는 단백질이 발현할 수 있도록 하는 것을 의미한다. 형질전환된 폴리뉴클레오티드는 숙주세포 내에서 발현될 수 있기만 한다면, 숙주세포의 염색체 내에 삽입되어 위치하거나 염색체 외에 위치하거나 상관없이 이들 모두를 포함할 수 있다. 또한, 상기 폴리뉴클레오티드는 표적 단백질을 코딩하는 DNA 및 RNA를 포함한다. 상기 폴리뉴클레오티드는 숙주세포 내로 도입되어 발현될 수 있는 것이면, 어떠한 형태로 도입되는 것이든 상관없다. 예를 들면, 상기 폴리뉴클레오티드는 자체적으로 발현되는데 필요한 모든 요소를 포함하는 유전자 구조체인 발현 카세트 (expression cassette)의 형태로 숙주세포에 도입될 수 있다. 상기 발현 카세트는 통상 상기 폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결되어 있는 프로모터 (promoter), 전사 종결신호, 리보좀 결합부위 및 번역 종결신호를 포함할 수 있다. 상기 발현 카세트는 자체 복제가 가능한 발현 벡터 형태일 수 있다. 또한, 상기 폴리뉴클레오티드는 그 자체의 형태로 숙주세포에 도입되어 숙주세포에서 발현에 필요한 서열과 작동 가능하게 연결되어 있는 것일 수도 있으며, 이에 한정되지 않는다.
상기 숙주세포 내로 도입하는 방법은 당 분야에서 공지된 바와 같이 숙주 세포에 따라 적합한 표준 기술을 선택하여 수행할 수 있다. 이런 방법에는 전기천공법(electroporation), 인산칼슘(CaPO4) 침전, 염화칼슘(CaCl2) 침전, 미세주입법(microinjection), 폴리에틸렌글리콜(PEG)법, DEAE-덱스트란법, 양이온 리포좀법, 및 초산 리튬-DMSO법 등이 포함될 수 있으나 이들로 제한되는 것은 아니다.
또한, 상기에서 용어 "작동 가능하게 연결"된 것이란 본 발명의 목적 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 전사를 개시 및 매개하도록 하는 프로모터 서열과 상기 유전자 서열이 기능적으로 연결되어 있는 것을 의미한다.
본 발명에서 용어, "CalB의 변이체를 생산하는 미생물"은 자연적 또는 인위적으로 유전적 변형이 일어난 미생물을 모두 포함하며, 외부 유전자가 삽입되거나 내재적 유전자의 활성이 강화되거나 불활성화되는 등의 원인으로 인해서 특정 기작이 약화되거나 강화된 미생물로서, 목적하는 CalB의 변이체 생산을 위하여 유전적 변이가 일어나거나 활성을 강화시킨 미생물일 수 있다. 본 발명의 목적상 상기 CalB의 변이체를 생산하는 미생물은 상기 CalB의 변이체를 포함하여, 배지 중의 탄소원으로부터 목적하는 CalB의 변이체를 야생형이나 비변형 미생물과 비교하여 과량으로 생산할 수 있는 미생물을 의미할 수 있다. 본 발명에서 상기 "CalB의 변이체를 생산하는 미생물"은 "CalB의 변이체 생산능을 갖는 미생물" 또는 "CalB 변이체 생산 미생물"과 혼용되어 사용될 수 있다.
상기 CalB의 변이체를 생산하는 미생물은 재조합 미생물일 수 있다. 상기 재조합 미생물은 전술한 바와 같다.
상기 CalB의 변이체를 생산하는 미생물은 CalB 또는 CalB의 변이체를 생산할 수 있다면 그 종류가 특별히 제한되지 않으나, 효모일 수 있고, 보다 구체적으로 피치아 파스토리스 (Pichia pastoris), 사카로마이세스 세레비지에 (Saccharomyces cerevisiae), 쉬조사카로마세스 (Schizosaccharomyces), 뉴로스포라 크라사 Neurosporacrassa) 등일 수 있고, 보다 구체적으로는 사카로마이세스 세레비지에일 수 있으나, CalB 또는 CalB의 변이체를 생산할 수 있는 효모에 속하는 미생물은 제한 없이 포함될 수 있다.
본 발명의 다른 하나의 양태는 상기 CalB의 변이체, 상기 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 중 어느 하나 이상을 포함하여, CalB의 변이체를 생산하는 미생물을 배지에서 배양하는 단계; 및 배양된 배지 또는 미생물에서 CalB의 변이체를 회수하는 단계를 포함하는, CalB의 변이체 생산 방법을 제공한다.
상기 CalB의 변이체, 폴리뉴클레오티드, 벡터 및 CalB의 변이체를 생산하는 미생물에 대해서는 전술한 바와 같다.
본 발명에서 용어, "배양"은 상기 미생물을 적당히 조절된 환경 조건에서 생육시키는 것을 의미한다. 본 발명의 배양과정은 당업계에 알려진 적당한 배지와 배양조건에 따라 이루어질 수 있다. 이러한 배양 과정은 선택되는 균주에 따라 당업자가 용이하게 조정하여 사용할 수 있다. 구체적으로 상기 배양은 회분식, 연속식 및 유가식일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 용어, "배지"는 상기 미생물을 배양하기 위해 필요로 하는 영양물질을 주성분으로 혼합한 물질을 의미하며, 생존 및 발육에 불가결한 물을 비롯하여 영양물질 및 발육인자 등을 공급한다. 구체적으로, 본 발명의 미생물의 배양에 사용되는 배지 및 기타 배양 조건은 통상의 미생물의 배양에 사용되는 배지라면 특별한 제한 없이 어느 것이나 사용할 수 있으나, 본 발명의 미생물을 적당한 탄소원, 질소원, 인원, 무기화합물, 아미노산 및/또는 비타민 등을 함유한 통상의 배지 내에서 호기성 조건 하에서 온도, pH 등을 조절하면서 배양할 수 있다.
본 발명에서 상기 탄소원으로는 글루코오스, 프룩토오스, 수크로오스, 말토오스 등과 같은 탄수화물; 만니톨, 소르비톨 등과 같은 당 알콜, 피루브산, 락트산, 시트르산 등과 같은 유기산; 글루탐산, 메티오닌, 리신 등과 같은 아미노산 등이 포함될 수 있다. 또한, 전분 가수분해물, 당밀, 블랙스트랩 당밀, 쌀겨울, 카사버, 사탕수수 찌꺼기 및 옥수수 침지액 같은 천연의 유기 영양원을 사용할 수 있으며, 구체적으로는 글루코오스 및 살균된 전처리 당밀(즉, 환원당으로 전환된 당밀) 등과 같은 탄수화물이 사용될 수 있으며, 그 외의 적정량의 탄소원을 제한 없이 다양하게 이용할 수 있다. 이들 탄소원은 단독으로 사용되거나 2 종 이상이 조합되어 사용될 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 질소원으로는 암모니아, 황산암모늄, 염화암모늄, 초산암모늄, 인산암모늄, 탄산안모늄, 질산암모늄 등과 같은 무기질소원; 글루탐산, 메티오닌, 글루타민 등과 같은 아미노산, 펩톤, NZ-아민, 육류 추출물, 효모 추출물, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 카세인 가수분해물, 어류 또는 그의 분해생성물, 탈지 대두 케이크 또는 그의 분해 생성물 등과 같은 유기 질소원이 사용될 수 있다. 이들 질소원은 단독으로 사용되거나 2 종 이상이 조합되어 사용될 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 인원으로는 인산 제1칼륨, 인산 제2칼륨, 또는 이에 대응되는 소디움-함유 염 등이 포함될 수 있다. 무기화합물로는 염화나트륨, 염화칼슘, 염화철, 황산마그네슘, 황산철, 황산망간, 탄산칼슘 등이 사용될 수 있으며, 그 외에 아미노산, 비타민 및/또는 적절한 전구체 등이 포함될 수 있다. 이들 구성성분 또는 전구체는 배지에 회분식 또는 연속식으로 첨가될 수 있다. 그러나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서, 미생물의 배양 중에 수산화암모늄, 수산화칼륨, 암모니아, 인산, 황산 등과 같은 화합물을 배지에 적절한 방식으로 첨가하여, 배지의 pH를 조정할 수 있다. 또한, 배양 중에는 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다. 또한, 배지의 호기 상태를 유지하기 위하여, 배지 내로 산소 또는 산소 함유 기체를 주입하거나 혐기 및 미호기 상태를 유지하기 위해 기체의 주입 없이 혹은 질소, 수소 또는 이산화탄소 가스를 주입할 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.
배지의 온도는 20 ℃ 내지 50 ℃, 구체적으로는 30 ℃ 내지 37 ℃일 수 있으나 이로 제한되지 않는다. 배양 기간은 유용 물질의 원하는 생성량이 수득될 때까지 계속될 수 있으며, 구체적으로는 10 시간 내지 100 시간일 수 있으나 이로 제한되지 않는다.
상기 배양에 의하여 생산된 CalB의 변이체는 배지 중으로 배출되거나 미처 배출되지 못하고 세포 내에 잔류할 수 있다.
상기 CalB의 변이체 생산 방법은 배양된 미생물 또는 배지에서 CalB의 변이체를 회수하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 상기 배양 단계에서 생산된 CalB의 변이체를 회수하는 방법은 배양방법에 따라 당해 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 배양액으로부터 목적하는 CalB의 변이체을 수집(collect)하는 것일 수 있다. 예를 들면, 원심분리, 여과, 음이온 교환 크로마토그래피, 결정화 및 HPLC 등이 사용될 수 있으며, 당해 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 배지 또는 미생물로부터 목적하는 CalB의 변이체를 회수할 수 있다.
또한, 상기 회수 단계는 정제 공정을 포함할 수 있으며, 당해 분야에 공지된 적합한 방법, 예를 들면 막을 이용한 여과 등을 이용하여 수행될 수 있다. 따라서, 상기의 회수되는 CalB의 변이체는 정제된 형태 또는 CalB의 변이체를 함유한 미생물 발효액일 수 있다(Introduction to Biotechnology and Genetic Engineering, A. J. Nair., 2008).
본 발명의 방법에 따라 생산된 CalB의 변이체는 효소 그 자체로 반응에 직접 사용될 수 있지만, 불용성 담체(matrix)에 물리적 또는 화학적 방법에 의하여 고정시킨 '고정화 효소(immobilized enzyme)'로 제조하여 사용할 수도 있다. 상기 고정화 효소(immobilized enzyme)는 효소반응이 완료된 후에 반응물과 효소의 분리가 용이하므로 반복 사용이 가능하고, 반응조건(유기용매, 반응온도 등)에 대한 효소의 안정성을 증대시킬 수 있다는 장점이 있다. 따라서 효소의 재사용에 따른 경제성 증가 및 효소반응 조건을 광범위하게 유지하기 위해서는 고정화 효소를 사용하는 것이 보다 바람직하다. 리파제 효소를 아크릴수지(아크릴레진), 직물 막, 폴리프로필렌, 셀라이트, 규조토 등의 담체에 고정시키는 기술이 널리 알려져 있으며, 그 중에서도 아크릴수지에 고정된 CalB는 Novozym 435TM으로서 상업화되어 시판되고 있다. 본 발명에서는 리파제 효소를 고정화하는 방법 및 담체 선택 등에 특별한 제한을 두지 않으며, 당해 기술분야에서 통상적으로 알려진 방법에 의해 제조하여 사용할 수 있다. 또한, 효소반응속도를 보다 증가시켜 짧은 시간내에 전환율을 높이기 위해서는 상기 고정화 효소는 나노미터(nm) 내지 마이크로미터(㎛) 크기로 미세 분말화하여 사용하는 것이 좋다.
참고로 현재까지 알려진 효소 고정화 방법을 간단히 설명하면 하기와 같은 바, 효소 고정화 방법은 크게 물리적 방법과 화학적 방법으로 대두될 수 있다.
상기 물리적 고정화 방법은 흡착법, 졸-겔법, 포괄법, 미세캡슐화법, 막(membrane) 이용법 등이 있다. 상기 흡착법은 활성탄, 실리카겔, 전분, 점토에 흡착시키는 방법과 메조포어 분자체에 흡착시키는 방법으로, 이때 흡착시키는 원리는 정전기적인 인력을 적용하는 것이다. 상기 졸-겔법은 졸-겔 형성에 의하여 효소를 졸-겔 구조 안에 고정시키는 방법으로, 효소 주위에 졸-겔의 무기 지지체 연결 구조가 형성되고 효소가 상기 무기 지지체 연결 구조 내의 기공 안에 존재하도록 하는 것이다. 상기 포괄법은 지지체의 미세한 격자내부에 효소가 들어가게 하여 누출되지 않는 상태로 고정시키는 방법으로, 원료로 사용되는 알긴산, 펙틴, 키토산, 폴리아크릴아미드(polyacrylamide), 우레탄 중합체(urethane polymer) 등의 지지체로부터 효소가 빠져 나오지 않도록 해야 함과 동시에 효소의 기질들이 자유롭게 드나들 수 있도록 하는 구조를 만든다.
상기 화학적 고정화 방법에는 이온교환법, 공유결합법, 가교법 등이 있다. 상기 이온교환법은 이온교환기를 갖는 수불용성 담체에 효소를 이온결합시켜서 고정하는 방법으로, 다당류와 합성 고분자 유도체가 담체로 사용된다. 상기 공유결합법은 수불용성 담체에 효소를 공유결합시켜서 고정하는 방법이며, 효소와 담체 간에 별도의 연결물질을 이용하기도 하기도 하는데 이는 일종의 유동적 스페이서(flexible spacer)를 붙이는 방법으로, 이렇게 하면 효소가 고정화 담체 표면에 약간의 거리를 두고 결합하므로 효소가 기질과 만나서 반응할 때 고유의 효소활성을 가질 수 있게 된다. 상기 가교법은 둘 이상의 작용기를 갖는 시약을 사용하여 효소끼리 결합시켜서 고정하는 방법으로, 이온결합법과는 다르게 수불용성 담체를 사용하지 않고 효소를 고정화하는데 이때 시약으로는 글루타르알데히드(glutaraldehyde), 시아누릭 클로라이드(cyanuric chloride), 헥사메틸렌 디이소시아네이트(hexamethylene diisocyanate), N,N'-에틸렌 비스말레이미드(N,N'-ethylene bismaleimide) 등을 많이 사용한다.
본 발명의 다른 하나의 양태는 지방산 및 중성지방으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 기질과 상기 CalB의 변이체를 반응시켜 기질을 왁스에스터로 전환하는 단계를 포함하는, 왁스에스터 생산 방법을 제공한다.
상기 CalB의 변이체는 전술한 바와 같다.
본 발명에서, 용어 "왁스에스터(wax ester)"란, 고급 지방산과 고급 알콜의 에스테르가 주성분이며 피부를 유연하게 하거나 보호하는 기능이 있는 화장품 원료를 의미한다. 왁스에스터는 실온에서 존재하는 성상에 따라 액체상과 고체상으로 나눌 수 있으며, 액체상 왁스엑스터에는 호호바오일(Simmondsia Chonensis(Jojoba) Seed Oil), 라놀린(Lanolin) 등이 있고, 고체상 왁스에스터에는 비즈왁스(Beeswax), 칸데릴라 왁스(Euphorbia Cerifera(candelilla) Wax), 카나우바왁스(Copernicia Cerifera(Carnauda) Wax), 합성재팬왁스(Synthetic Japan Wax) 등이 있다.
상기 왁스 에스터 생산 방법에서, 다양한 지방산 또는 식물 유래의 다양한 중성지방을 기질로 사용할 수 있으며, 지방산, 중성지방 및 이들의 혼합물 중 어느 하나 이상의 형태로 첨가될 수 있다.
상기 지방산 또는 중성지방은 화장품 원료를 제조하기 위해 사용할 수 있는 것이면 특별한 제한은 없다. 예를 들면, 트리팔미틴(tripalmitin), 팔미틱 산(palmitic acid), 세틸 알콜(cetyl alcohol), 이소프로판올(isopropanol), 헥산올(hexanol), 데카놀(decanol), 트리카프로인(Tricaproin), 트리카프린(Tricaprin), 헥사노익 산(hexanoic acid), 도데칸 산(dodecanoic acid), 올레익 산(oleic acid) 및 이들의 혼합물일 수 있으며, 이에 제한되지 않는다. 상기 지방산 및
상기 CalB의 변이체는 기질 대비 0.01 내지 30% (w/v), 구체적으로 0.5 내지 5% (w/v)로 첨가되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 실시예에서, 본 발명에 따른 CalB의 변이체는 상기 왁스에스터로의 전환 반응이 끝난 후 산물을 회수하고 새로운 기질을 반복 첨가하여 반응시켰을 시, 30사이클 이상 반복 진행하였을 때 모두 95%이상의 왁스에스터 전환율을 보였으며, 효소의 안정성에도 문제가 없는 것으로 확인되었다(도 16 및 도 17).
본 발명의 또 다른 하나의 양태는 i) 지방산 및 중성지방으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 기질과 아미노 알콜을 상기 CalB의 변이체를 이용하여 아미노화 반응시켜 지방산 아미드를 생산하는 단계; 및 ii) 생산된 지방산 아미드에 기질을 추가로 첨가하고 상기 CalB의 변이체를 이용하여 에스터화 반응시켜 유사세라마이드를 생산하는 단계;를 포함하는 유사세라마이드 생산 방법을 제공한다.
상기 CalB의 변이체, 지방산 및 중성지방은 전술한 바와 같다.
본 발명에서 용어, "유사세라마이드"란, 천연 세라마이드의 단점을 보완하고 상용화가 가능한 천연 유래의 세라마이드를 모방한, 개선된 물성과 성질을 갖는 세라마이드를 의미한다. 세라마이드는 피부 각질층을 구성하는 각질세포 간 지질의 많은 부분을 차지하는 구성성분으로서 수분증발을 억제하고 각질층의 구조을 유지하는 기능을 한다. 각질층에서 세라마이드의 함량이 감소하게 되면, 수분증발이 증가하고 다양한 피부질환이 악화되는 것으로 알려져 있으며 또한 피부의 노화가 진행되거나 외적인 자극에 의해 각질층 내의 세라마이드 함량이 감소하면 외부에서 세라마이드를 보충하여 피부를 정상상태로 회복시킬 수 있는 것으로 알려져 있다. 따라서 천연으로부터 세라마이드를 함유하는 다양한 동식물에 대한 연구가 진행되었으나 천연 세라마이드는 추출의 어려움 등으로 대량 생산이 어렵고 원료가 고가인 점이 상용화하기에는 부적합하다. 이뿐만 아니라 천연 세라마이드는 화장품에 사용되는 여러 가지의 용매에 대한 용해도가 낮아서 제품을 만들 때 사용할 수 있는 양이 제한되어 있어서 효능을 나타내는데 한계가 있다. 이에, 유사세라마이드는 천연세라마이드의 단점을 보완하여 제조된 것이다.
상기 유사세라마이드 생산 방법에서, 다양한 지방산 또는 식물 유래의 다양한 중성지방을 기질로 사용할 수 있으며, 지방산, 중성지방 및 이들의 혼합물 중 어느 하나 이상의 형태로 첨가될 수 있다.
상기 지방산 또는 중성지방에 다양한 아미드 알콜을 리파제를 이용하여 결합시켜 아미드화(amidation) 시키면 지방산 아미드가 제조되고 여기에 또 하나의 지방산이 에스터화 반응(esterification)하면 유사세라마이드가 제조된다. 리파제를 이용한 유사세라마이드의 제조방법은 아미드화와 에스터 반응을 단일 단계 반응을 통해 동시 진행할 수 있으며, 또는 1단계 아미드화 반응에서 생성된 지방산 아미드를 정제 및/또는 생성된 수분, 그리고 미반응 아미노 알콜 등을 제거한 후 기질을 추가하여 에스터 반응시키는 2단계 효소 반응으로 생산할 수도 있다.
상기 아미드 알콜은 화장품 원료를 제조하기 위해 사용할 수 있는 것이면 특별한 제한은 없으나, 예를 들면, 3-amino-1,2-propanediol, 3-amino-1-propanol, 2-amino-1-butanol, 1-amino-2-propanol, 2-amino-2-ethyl-1,3-propanediol, 2-amino-2-ethyl-1,3-propanediol 및 2-amino-1,3- propanediol일 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.
상기 단계 i)에서 기질과 아미노 알콜은 1 내지 2:1 또는 1:0.5 내지 2몰비로 혼합되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 CalB의 변이체는 기질 대비 0.01 내지 30% (w/v), 구체적으로 5 내지 10% (w/v)로 첨가되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 왁스에스터 또는 유사세라마이드 제조 방법에 있어서, 원료 용해를 위해 용매를 더 첨가할 수 있으며, 상기 용매는 특별한 제한은 없으나, 예를 들면, 헥산(hexane), TAA(ter-amyl alcohol) 및 이들의 혼합물일 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 따른 CalB의 변이체는 CalB에 비해 향상된 가수분해(hydrolysis), 에스터 반응(esterification) 및 아미노화 반응(amidation) 활성을 나타내므로, 이를 이용하여 지방산 또는 트리글리세라이드로부터 기능성 화장품용 오일인 왁스에스터와 유사세라마이드 생산 효율을 개선할 수 있다.
도 1은 CalB1422-278 변이체의 선별 과정을 나타낸 도이다.
도 2는 유가식 발효를 통한 CalB 변이체 발현균주의 세포성장도를 나타낸 도이다.
도 3은 유가식 발효를 통해 배지내로 분비된 CalB 변이체의 SDS-PAGE를 분석한 도이다.
도 4는 유가식 발효를 통해 생산된 각 CalB 변이체의 리파제 활성을 나타낸 도이다.
도 5는 6종 CalB1422-278 변이체의 흡착고정화를 나타낸 도이다.
도 6은 CalB1422-278 변이체의 가수분해(hydrolysis) 활성, 에스터화 (esterification) 활성 및 에스터전이(transesterification) 활성을 비교한 도이다.
도 7은 지방산을 기질로 이용할 때의 고정화 효소량의 최적화를 나타낸 도이다.
도 8은 중성지방을 기질로 이용할 때의 고정화 효소량의 최적화를 나타낸 도이다.
도 9는 TG와 fatty alcohol의 기질 몰비의 영향을 나타낸 도이다.
도 10은 TG와 isopropanol의 기질 몰비의 영향을 나타낸 도이다.
도 11은 CalB1422-278 변이체의 지방산 왁스에스터 전환활성을 비교한 도이다.
도 12는 CalB1422-278 변이체의 중성지방 왁스에스터 전환활성을 비교한 도이다.
도 13은 CalB1422-278 변이체의 fatty alcohol의 기질 길이에 따른 왁스에스터 생산성을 비교한 도이다.
도 14는 CalB1422-278 변이체의 중성지방내 지방산 길이에 따른 왁스에스터 생산성을 비교한 도이다.
도 15는 CalB1422-278 변이체의 지방산 길이에 따른 왁스에스터 생산성을 비교한 도이다.
도 16은 Non-solvent 시스템에서의 고정화효소 안정성을 평가한 도이다.
도 17은 Solvent 시스템에서의 고정화효소 안정성을 평가한 도이다.
도 18은 리파제를 이용한 유사세라마이드 제조 방법을 나타낸 도이다.
도 19는 CalB1422-278 변이체별 지방산 아미드 생산 속도를 비교한 도이다.
도 20는 CalB1422-278 변이체의 중성지방 소모 속도를 비교한 도이다.
도 21은 아미노알콜을 비교한 도이다.
도 22는 유사세라마이드 전환반응용 용매 선정 과정을 나타낸 도이다.
도 23은 아미노알콜과 중성지방의 최적 비율 선정 과정을 나타낸 도이다.
도 24는 지방산과 아미노알콜의 최적 농도비를 분석한 도이다.
도 25는 지방산을 이용한 유사세라마이드 전환효율(A) 및 반응액 TLC 분석(B)을 나타낸 도이다.
도 26은 중성지방을 이용한 단일단계 반응물을 나타낸 도이다.
도 27은 1단계 반응후 중성지방(A) 및 지방산(B) 첨가시 유사세라마이드의 전환을 비교한 도이다.
이하 본 발명을 실시예에 의해 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것은 아니며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어 명백할 것이다.
실시예 1. 포화 돌연변이(Saturation mutagenesis) 기술을 이용한 CalB1422-278 변이체 제조
칸디다 안타티카(Candida antarctica) 유래의 리파제 B(CalB)의 219번째 위치의 아미노산인 루이신을 글루타민으로 치환하고, 278번째 위치의 루이신을 프롤린으로 치환한 고활성의 효소 CalB14(한국특허 제10-0475133호)에서, 에스터화 반응(esterification) 효율을 증대시키기 위해 80번째 위치의 아미노산인 트레오닌을 알라닌으로 치환한 CalB1422(한국특허 제10-1460228호)에서 278번째 아미노산의 포화 돌연변이를 위하여 해당하는 위치에 무작위적 뉴클레오티드를 포함하는 프라이머를 제작하였다(서열번호 8 및 9). 해당 프라이머를 이용하여 무작위 변이가 도입되도록 PCR을 수행하였으며 세포내 재조합(in vivo recombination)을 통해 효모에 형질전환하였다. 형질전환체들은 1% 트리부티린(tributyrin)을 함유한 선택배지(SD-ura, 0.67% 아미노산이 결여된 효모 기질, 0.77% 우라실이 결핍된 영양 보충물, 2% 포도당)에서 투명환을 형성하는 가수분해(hydrolysis) 활성을 바탕으로 1차 선별되었다(도 1). 선택된 균주로부터 유전자를 회수한 후 염기서열 분석을 통해 각각의 변이를 확인하였다. 각각 다른 특정한 성질을 가지는 아미노산 하나씩을 선별하여 최종적으로 6종의 변이체를 확보 하였다(표 1).
Class 치환된 아미노산
Nonpolar G, A, L
Polar Y
Acidic D
Basic H
실시예 2. 유가식발효를 통한 각 변이체의 대량생산 및 효소고정화
상기 실시예 1로부터 선별된 6 종의 CalB1422-278 변이체를 대량생산하기 위하여 5 L 발효조를 이용하여 유가식 발효를 수행하였다. 본 배양에 들어가기 전에 50 ㎖ YNB(0.67 % 아미노산이 결여된 효모기질, 0.5 % 카사미노에시드, 2 % 글루코스) 배지에 초기 배양한 후 다시 200 ㎖의 YEPD 액체배지(2 % 포도당, 3 % 효모추출물, 1.5 % 펩톤)에서 배양하여 활성화하고 1.8 L의 본 배양액(2 % 포도당, 3 % 효모추출물, 1.5 % 펩톤)에 접종하여 30 ℃에서 발효하였다. 배양 중 포도당이 완전히 소모되면 공급배지(30 % 포도당, 5 % 효모 추출물)를 균체의 성장에 따라 시간당 2 g/L에서 20 g/L로 점차로 추가하면서 45 시간 동안 발효하였다. 배양 중 세포의 성장 정도는 시간 별로 시료를 취하여 600 nm 파장에서 흡광도를 측정하였고(도 2), 배지에 분비 생산된 리파제의 양과 활성을 SDS-PAGE와 pNPP법으로 분석하였다(도 3, 도 4).
그 결과, 분비 생산된 단백질의 양은 각 변이체마다 200-630 mg/L로 상이하게 나타났으며, 배양상등액의 리파제 활성도 2,700-84,000 U/L의 값을 나타내었다. 각 단백질별 고유활성도(specific activity)는 6.4-128.3 U/mg으로 계산되었으며, 278-H와 278-A는 CalB1422(278-P) 대비 높은 고유활성도를 갖는 것으로 확인되었다(표 2).
278 Mutant Cell growth
(A600)		 Secreted protein
(mg/mL)		 Lipase activity
(U/L)		 Specific activity
(U/mg)
L 140 0.42 2673 6.4
A 208 0.63 84240 133.7
G 180 0.57 13230 23.2
Y 204 0.63 28620 45.4
H 172 0.24 30780 128.3
D 148 0.40 24840 62.1
P (CALB1422) 148 0.27 31995 118.5
발효 생산된 각 단백질의 고정화를 위하여 6000 rpm으로 20 분간 원심분리한 후 0.1 ㎛ 크기의 여과막을 통과시켜 균체를 완전히 제거하였다. 회수한 배양상등액은 20 mM Tris-HCl 버퍼(pH 7.5)를 반복적으로 첨가하여 한외여과(분자량 30kDa 컷-오프) 막을 통과시키는 방법으로 배양액을 농축하였다. 단백질의 고정화는 아크릴레진(Lewatit VP OC 1600, Lanxess)에 흡착하는 방법을 이용하여 수행하였다. 고정화는 레진 중량 1 g당 25 mg의 단백질을 고정화하였으며, 18 ℃에서 24시간 흡착반응으로 수행되었다. 24시간 후 반응상등액의 SDS-PAGE와 정량분석을 통해 6종의 단백질 모두 70% 이상 흡착고정화 되었음을 확인하였다(도 5).
실시예 3. CalB1422-278 변이체의 활성비교
리파제는 물의 존재하에서 지방에 존재하는 지방산의 에스터 결합을 분리하는 가수분해 활성(hydrolysis)뿐만 아니라, 두 물질간의 에스터 결합을 유도하는 합성(ester synthesis) 활성을 보유하고 있다. 특히 합성활성 중 에스터화(esterification)와 전이에스터화(trans-esterficiation) 반응은 다양한 화학물질의 생산에 널리 사용되어 산업적 응용성을 가진다. 상기 실시예 2에서 생산된 고정화된 CalB1422-278 변이체의 분해활성(트리뷰티린을 이용한 pH 적정법)과 더불어 합성활성을 확인하기 위하여 에스터화(Propyl-laurate 전환활성), 전이에스터화(FAME 전환활성) 반응을 수행하였다. 양성대조군으로는 SIGMA-ALDRICH社에서 판매중인 CalB-L 액상효소를 사용하였다.
도 6에서 확인할 수 있듯이, 가수분해 활성은 278번째 아미노산이 치환된 대부분의 변이체(P, G, A, Y, H)에서 증가된 활성을 나타났으며, 특히 Y로 치환된 변이효소가 CalB-L대비 6.5배 향상된 활성을 보였다. 하지만 L과, D로 치환된 경우 시판효소와 유사한 활성을 나타내었다. 그러므로 가수분해 반응에는 CalB1422-278Y변이체가 최적화되었음을 알 수 있다.
반면에 에스터화 반응(esterification) 활성은 278L>278H>278P, 278G, 278A>278Y, 278D 순으로 확인되었으며 CalB1422-278L의 경우 최대 활성인 12,150 PLU/g으로 확인되었다.
에스터 교환(transesterification) 활성 분석 결과에서는 278P로 치환된 변이체가 가장 높은 활성을 보였으며 278P>278A>278G, 278Y>278D>278L>278H 순으로 확인되었다.
상기와 같이 각각의 반응에 따라서 변이체별로 다른 활성을 나타내므로 각 반응을 사용하는 공정에서 각각의 변이체를 선택적으로 사용하면 반응효율 향상을 기대할 수 있다.
실시예 4. 고정화 효소를 이용한 왁스에스터 생산 최적화
4-1. 고정화 효소량(CalB1422)의 최적화
지방산과 중성지방을 각각 기질로 사용하여 왁스에스터(wax ester)를 생산할 때 필요한 최적 효소량을 확인하였다. 지방산 알콜(fatty alcohol)은 세틸 알콜(cetyl alcohol)을 사용하였고 지방산은 팔미틱 산(palmitic acid), 또는 중성지방(tripalmitin)을 직접 이용하여 최적의 효소량을 찾고자 하였다. 효소량을 기질 대비 1~5% (w/v)로 하여 왁스에스터 생산성을 평가하였다. 각각 기질의 몰비는 1:1이며 기질용해를 위해 헥산(hexane)을 동일 부피 첨가하여 50 ℃에서 반응하였다. 반응속도는 지방산의 경우 지방산이 반응에 소모되면서 나타나는 산가(acid value)의 감소 정도로 측정하였으며 중성지방의 경우 생성된 왁스에스터의 양을 가스크로마토그라피를 이용하여 측정하였다.
그 결과, 지방산을 기질로 사용한 경우 도 7에서 보는 바와 같이 효소량이 증가할수록 산가의 감소속도가 빠르며 3%(w/v) 이상인 경우 약 1시간 이내에 80% 이상의 전환률을 보였고, 효소량을 0.5%(w/v)만 사용하여도 5시간 이내에 80% 전환율을 보였다.
중성지방을 기질로 사용한 경우에도 도 8에서 보는 바와 같이 효소량을 5%(w/v) 사용한 경우 전환속도가 가장 빨라 2시간 이내에 90% 이상의 왁스에스터 전환이 확인되었고, 효소량을 1%(w/v) 사용하여도 5시간 이내에 90% 전환율이 확인되었다.
따라서, 효소의 비용을 고려하여 1%(w/v) 수준으로 사용하여도 전환이 가능하지만 고정화 효소는 반복 재사용이 가능하므로 반응시간 단축을 위해서 효소량은 3~5% 수준이 적당함을 확인하였다.
4-2. 중성지방과 지방 알콜(fatty alcohol)의 기질 몰비 최적화
중성지방인 트리팔미틴(tripalmitin)과 세틸 알콜(cetyl alcohol) 또는 이소프로판올(isopropanol)을 사용하여 최적의 기질 비율을 확인하기 위하여 기질의 몰비를 1:1, 1.25:1, 1.5:1, 1:1.25, 1:1.5(TG: cetyl alcohol 또는 isopropanol)로 공급하고, 효소 5%, 반응온도 50 ℃에서 왁스에스터 전환실험을 진행하였다.
그 결과, 도 9와 10에서 보는 바와 같이 기질 몰비에 따라 왁스에스터의 생산성에 차이가 있었으며 알콜의 농도 또는 중성지방의 농도가 높을 경우 전환율이 감소하는 것을 확인할 수 있었다.
따라서, 기질 몰비는 1:1로 동등하게 공급하는 것이 적절함을 확인하였다.
실시예 5. 지방산의 왁스에스터 전환을 위한 CalB1422-278 변이체 선별
지방산의 왁스에스터 전환용 최적 CalB1422-278 변이체 선별을 위해 변이 효소별 왁스에스터 전환율을 비교하였다. 사용한 효소는 CalB14, CalB1422, 그리고 CalB1422-278 변이체 6종(278L, 278A, 278D, 278H, 278G, 278Y)이었으며, 지방산(fatty acid)과 지방산 알콜(fatty alcohol)을 기질로 이용하여 왁스에스터 전환을 시도하였고 전환율은 지방산의 감소에 따른 산가 감소로 측정하였다(도 11). 이때의 반응조건은 세틸 알콜과 팔미틱 산을 몰비 1:1로 투입하고 50 ℃에서 약 5시간 반응시킨 후 시간마다 시료를 채취하여 산가를 확인하였다. 고정화 효소는 변이효소간의 차이를 확인하기 위하여 0.5%(w/v)를 사용하였다.
그 결과, 예상한 바와 같이 에스터화 반응(esterification) 활성이 높은 278L, 278A, 278G가 높은 효율로 왁스에스터를 생성하였으며 278D가 가장 효율이 낮았다.
실시예 6. 중성지방의 왁스에스터 전환을 위한 CalB1422-278 변이체 선별
중성지방의 왁스에스터 전환용 최적 CalB1422-278 변이체 선별을 위해 변이 효소별 왁스에스터 전환율을 비교하였다. 사용한 효소는 CalB1422, 그리고 CalB1422-278 변이체 6종(278L, 278A, 278D, 278H, 278G, 278Y)이었으며, 중성지방(Tripalmitin)과 세틸 알콜을 기질로 이용하여 왁스에스터 전환율을 비교하였다(도 12). 고정화 효소량은 기질 대비 2%(w/v)를 사용하였다. 반응조건은 세틸 알콜과 트리팔미틴을 몰비 1:1로 투입하고 50 ℃에서 6시간 동안 반응시켰으며 시간마다 시료를 취하여 왁스에스터 수율을 비교하였다.
그 결과, 지방산을 사용한 왁스에스터에서 전환활성(esterification)이 가장 우수하였던 278L이 중성지방을 사용한 경우(에스터교환(transesterification))에는 가장 전환율이 저조하였고 에스터교환 활성이 높았던 CalB1422, 278A, 278G의 전환율이 우수하였다.
실시예 7. CalB1422-278 변이체의 기질별 왁스에스터 생산성 비교
7-1. 지방산 알콜의 길이별 생산성 비교
지방산은 트리팔미틴을 그대로 사용하고 길이가 짧은 지방 알콜인 헥산올(C6)과 중간 길이의 데카놀(C10)을 이용하여 생산성을 비교하였다. 반응시 효소량은 5%, 반응 온도는 60 ℃로 유지하였다.
그 결과, 도 13과 같이 기질이 짧을수록 반응효율이 우수하였으며, 효소에 따른 경향성은 기질 길이에 관계없이 CalB1422, A, G>H>D>Y>L 순서로 우수함을 확인하였다. 이러한 경향성은 길이가 긴 세틸 알콜(C16)에서도 동일하게 나타났다.
7-2. 중성지방내 지방산 길이에 따른 생산성 비교
지방산은 세틸 알콜(C16)로 고정하고, 중성지방에 포함된 지방산의 길이에 따른 전환율을 비교하였다. 중성지방인 트리팔미틴(C16)의 생산성을 확인했기 때문에, 짧은 길이의 중성지방인 트리카프로인(C6)과 중간 길이의 트리카프린(C10)을 이용하여 생산성을 비교하였다. 반응시 효소량은 5%, 반응 온도는 60 ℃로 유지하였다.
그 결과, 도 14에서 보는 바와 같이 기질이 짧을수록 전환율이 우수하였으나 효소 종류에 따른 전환율은 큰 차이가 없었다.
7-3. 지방산 길이에 따른 생산성 비교
지방 알콜은 세틸 알콜(C16)로 고정하고 지방산의 길이를 짧은 길이의 지방산인 헥사노익 산(C6)과 중간길이의 도데칸 산(C12)을 이용하여 왁스에스터 전환율을 비교하였다. 반응시 효소량은 0.5%, 반응 온도는 50 ℃로 유지하였다.
그 결과, 도 15에서 보는 바와 같이 기질이 짧을수록 비교적 빠른 전환율을 보였고 중성지방을 사용한 경우와 달리 278L이 가장 좋고 278D가 가장 낮은 활성을 보였다.
실시예 8. 고정화 효소의 안정성 평가
상온에서 액상으로 존재하는 기질인 올레 산과 세틸 알콜을 대상으로 45 ℃에서의 비용매(non-solvent) 방식과 상온에서 고체상으로 존재하는 팔미틱 산과 세틸 알콜을 대상으로 45 ℃에서의 용매 방식을 사용하여, 연속반복 생산 시스템을 구현하여 효소의 반복사용 가능성을 확인하였다. 먼저 상온에서 액상기질인 올레익 산과 세틸 알콜을 대상으로 한 45 ℃에서의 비용매 방식은 탱크형 반응기(stirred tank reactor)를 이용하였다. 효소는 고정화 CalB1422-278L을 부피 대비 1%를 투입하였고 반응시간은 1 사이클당 2시간으로 하였다. 2시간의 반응이 끝난 후 산물을 회수하고 새로운 기질을 반복 첨가하여 반응을 수행하였다.
그 결과, 30사이클 이상 반복 진행하였을 때 모두 95%이상의 왁스에스터 전환율을 보였으며, 효소의 안정성에도 문제가 없는 것으로 확인되었다(도 16).
또한, 상온에서 고체상 기질인 팔미틱 산과 세틸 알콜을 대상으로 한 45 ℃에서의 용매 방식에서의 효소 안정성도 확인하였다. 사용한 용매는 헥산(hexane)이며 기질 부피 대비 100%를 첨가하여 비용매 방식과 동일하게 반응시켰다.
14회의 반복 실험 결과 95%이상의 왁스에스터 전환율을 보였으며, 효소의 안정성에도 큰 문제가 없는 것으로 확인되었다(도 17).
실시예 9. 지방산 및 지방산알콜을 이용한 왁스에스터 제조
실시예 5의 효소 8종(CalB14, CalB1422, CalB1422-278 변이체 6종(278L, 278A, 278D, 278H, 278G, 278Y))을 이용하여 지방산과 지방산 알코올로부터 에스터 반응(esterification)을 통해 왁스에스터를 제조하기 위하여 하기 표 3에서 보는 바와 같이 동일 몰수의 지방산과 지방산 알코올을 혼합하여 최적효소, 반응기 및 전환방식을 확인하였다. 반응기는 50도가 유지되는 혼합탱크 반응기 (STR, Stirred Tank Reactor)와 고정상효소컬럼반응기(PBR, Packed-bed Reactor)를 사용하였으며 에스터 반응중 생성되는 수분 제거를 위해서 분자채(molecular sieve) 또는 감압방식을 사용하였다.
그 결과, 각각의 전환율은 기질의 종류 및 반응방식에 따라 차이가 있으나 하기 표 3과 같이 이소부틸 올레이트(isobutyl oleate)를 제외한 대부분의 왁스에스터를 70% 이상의 전환률로 제조하는 것이 가능하였다.
NO. Fatty acid Fatty alcohol Major wax ester 효소/ 반응시스템 전환률 (%) 구조식
1 hexanoic acid (C6) 2-ethylhexanol (C8) 2-ethylhexyl hexanoate
(C14)		 CalB1422-L
CalB1422-P
/STR		 89.5
Figure 112020082818980-pat00001
2 octanoic acid (C8) octanol (C8) octanyl octanoate
(C16)		 CalB1422-A
/STR, 감압		 91.7
Figure 112020082818980-pat00002
3 dodecanoic acid (C12) hexanol (C6) hexyl dodecanoate
(C18)		 CalB1422-L
CalB1422-P
/STR		 84.2
Figure 112020082818980-pat00003
4 palmitic acid (C16) isopropanol (C3) isopropyl palmitate
(C19)		 CalB1422-L
/STR		 60.7
Figure 112020082818980-pat00004
5 benzoic acid(C7) lauryl alcohol(C12) Lauryl benzoate
(C19)		 CalB1422-A
/STR, 감압		 87.8
Figure 112020082818980-pat00005
6 dodecanoic acid (C12) 2-ethylhexanol (C8) 2-ethylhexyl dodecanoate
(C20)		 CalB1422-L
CalB1422-P
/STR		 75.7
Figure 112020082818980-pat00006
7 stearic acid (C18) glycerol Glyceryl stearate
(C21)		 CalB1422-L
CalB1422-P
/STR		 92.3
Figure 112020082818980-pat00007
8 oleic acid (C18:1) isopropanol (C3) isopropyl oleate
(C21:1)		 CalB1422-L
/STR		 71.8
Figure 112020082818980-pat00008
9 oleic acid (C18:1) propanol (C3) propyl oleate
(C21:1)		 CalB1422-L
/STR		 86.6
Figure 112020082818980-pat00009
10 oleic acid (C18:1) dodecanol (C12) Dodecyl oleate CalB1422-A
/STR, 감압		 94.8
Figure 112020082818980-pat00010
11 stearic acid (C18) butanol (C4) butyl stearate
(C22)		 CalB1422-L
CalB1422-P
/STR		 83
Figure 112020082818980-pat00011
12 hexanoic acid (C6) hexadecanol (C16) hexadecyl hexanoate
(C22)
CalB1422-A
/STR
 83.6
Figure 112020082818980-pat00012
13 oleic acid (C18:1) butanol (C4) butyl oleate
(C22:1)		 CalB1422-L
/STR		 89.1
Figure 112020082818980-pat00013
14 oleic acid (C18:1) isobutanol (C4) isobutyl oleate
(C22:1)		 CalB1422-L
/STR		 28.1
Figure 112020082818980-pat00014
15 palmitic acid (C16) 2-ethylhexanol (C8) 2-ethylhexyl palmitate
(C24)		 CalB1422-L
/PBR		 97.5
Figure 112020082818980-pat00015
16 dodecnoic acid (C12) hexadecanol (C16) hexadecyl dodecanoate
(C28)		 CalB1422-L
/STR		 84.2
Figure 112020082818980-pat00016
17 dodecanoic acid (C12) hexadecanol (C16) hexadecyl dodecanote
(C28)		 CalB1422-L
/STR		 85.6
Figure 112020082818980-pat00017
18 tetradecanoic acid (C14) tetradecanol (C14) tetradecyl tetradecanoate
(C28)		 CalB1422-P
/STR		 87.5
Figure 112020082818980-pat00018
19 dodecanoic acid (C12) octadecanol (C18) octadecyl dodecanoate
(C30)		 CalB1422-L
/STR		 82.0
Figure 112020082818980-pat00019
20 tetradecanoic acid (C14) hexadecanol (C16) hexadecyl tetradecanoate(C30) CalB1422-L
/STR		 87.5
Figure 112020082818980-pat00020
21 oleic acid (C18:2) dodecanol (C12) dodecyl oleate
(C30:2)		 CalB1422-L
/STR, molecular
sieve		 92.0
Figure 112020082818980-pat00021
22 tetradecanoic acid (C14) octadecanol (C18) octadecyl tetradecanoate
(C32)		 CalB1422-L
/STR		 78.8
Figure 112020082818980-pat00022
23 methyl palmitate (C16) hexadecanol (C16) hexadecyl palmitate
(C32)		 CalB1422-P
/STR		 86.4
Figure 112020082818980-pat00023
24 stearic acid (C18) hexadecanol (C16) hexadecyl stearate
(C34)		 CalB1422-L
/STR		 82.5
Figure 112020082818980-pat00024
25 palmitic acid (C16) octadecanol (C18) octadecyl palmitate(C34)
CalB1422-L
/STR		 71.4
Figure 112020082818980-pat00025
26 oleic acid (C18:1) hexadecanol (C16) hexadecyl oleate
(C34:1)		 CalB1422-L
/STR		 82.0
Figure 112020082818980-pat00026
27 erucic acid (C22:1) dodecanol (C12) dodecyl erucate
(C34:1)		 CalB1422-L
/STR, molecular
sieve 첨가		 90.0
Figure 112020082818980-pat00027
28 stearic acid (C18) octadecanol (C18) octadecyl stearate
(C36)		 CalB1422-L
/STR		 78.5
Figure 112020082818980-pat00028
29 oleic acid (C18:1) oleyl alcohol (C18:1) oleyl oleate
(C36:2)		 CalB1422-A
/STR, molecular
sieve 첨가		 91.0
Figure 112020082818980-pat00029
30 erucic acid (C22:1) hexadecanol (C16) hexadecyl erucate
(C38:1)		 CalB1422-L
/STR, molecular
sieve 첨가		 90.0
Figure 112020082818980-pat00030
31 erucic acid (C22:1) oleyl alcohol (C18:1) oleyl erucate
(C40:2)		 CalB1422-L
/STR, molecular
sieve 첨가		 90.0
Figure 112020082818980-pat00031
실시예 10. 중성지방 및 지방산알콜을 이용한 왁스에스터 및 왁스에스터 복합체 제조
실시예 5의 효소 8종(CalB14, CalB1422, CalB1422-278 변이체 6종(278L, 278A, 278D, 278H, 278G, 278Y))을 이용하여 중성지방과 지방산 알코올로부터 전이에스터 반응(transesterification)을 통해 왁스에스터를 제조하기 위하여 하기 표 4에서 보는 바와 같이 중성지방과 3몰의 지방산 알코올을 혼합하여 최적효소, 반응기 및 전환방식을 확인하였다. 반응기는 50 ℃가 유지되는 혼합탱크 반응기(STR, Stirred Tank Reactor)와 고정상효소컬럼반응기(PBR, Packed-bed Reactor)를 사용하였다.
그 결과, 각각의 전환율은 기질의 종류 및 반응방식에 따라 차이가 있으나 하기 표 4와 같이 지방산을 기질로 이용하는 경우보다 증가된 전환효율로 대부분의 중성지방으로부터 왁스에스터의 제조가 가능하였다.
NO. TG Fatty alcohol Major wax ester 효소/반응시스템 전환률 (%) 구조식
1 Tripalmitin (C16) isopropanol (C3) isopropyl palmitate
(C19)		 CalB1422-L
/STR		 98.5
Figure 112020082818980-pat00032
2 Tricaproin (C6) hexadecanol (C16) hexadecyl hexanoate
(C22)
CalB1422-P
/STR
 98.0
Figure 112020082818980-pat00033
3 Tricaprin (C10) hexadecanol (C16) hexadecyl decanoate(C26)
CalB1422-P
/STR
 96.0
Figure 112020082818980-pat00034
4 Tripalmitin (C16) hexanol (C6) hexyl palmitate CalB1422-P
/STR
 99.0
Figure 112020082818980-pat00035
5 Tripalmitin (C16) decanol (C6) decyl palmitate CalB1422-P
/STR
 99.0
Figure 112020082818980-pat00036
6 Tripalmitin (C16) hexadecanol (C16) hexadecyl palmitate
(C32)		 CalB1422-L
/STR		 98.0
Figure 112020082818980-pat00037
7 triolein (C18:1) hexadecanol (C16) hexadecyl oleate
(C34:1)		 CalB1422-L
/STR		 85.0
Figure 112020082818980-pat00038
8 coconut oil benzoyl alcohol(C7) benzoyl laurate
(C19)		 CalB1422-A
/STR		 90.0
Figure 112020082818980-pat00039
benzoyl myristate
(C21)
Figure 112020082818980-pat00040
benzoyl oleate
(C25)
Figure 112020082818980-pat00041
9 soybean oil hexadecanol (C16) hexadecyl linolate CalB1422-L
/STR		 90.0
Figure 112020082818980-pat00042
hexadecyl oleate
Figure 112020082818980-pat00043
hexadecyl palmitate
Figure 112020082818980-pat00044
10 palm oil hexadecanol (C16) hexadecyl palmitate CalB1422-L
/STR		 92.0
Figure 112020082818980-pat00045
hexadecyl oleate
Figure 112020082818980-pat00046
hexadecyl linolate
Figure 112020082818980-pat00047
11 auranthio oil hexadecanol (C16) hexadecyl palmitate CalB1422-P
/STR		 95.0
Figure 112020082818980-pat00048
hexadecyl (4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)-docosa-4,7,10,13,16,19-hexaenoate (DHA)
Figure 112020082818980-pat00049
hexadecyl (5E,8E,11E,14E,17E)-icosa-5,8,11,14,17-pentaenoate (EPA)
Figure 112020082818980-pat00050
12 auranthio oil oleyl alcohol (C18:1) oleyl palmitate CalB1422-A
/STR		 95.6
Figure 112020082818980-pat00051
oleyl DHA
Figure 112020082818980-pat00052
oleyl EPA
Figure 112020082818980-pat00053
13 krill oil hexadecanol (C16) hexadecyl oleate CalB1422-P
/STR
 97.6
Figure 112020082818980-pat00054
hexadecyl palmitate
Figure 112020082818980-pat00055
hexadecyl (5E,8E,11E,14E,17E)-icosa-5,8,11,14,17-pentaenoate (EPA)
Figure 112020082818980-pat00056
14 coconut oil hexadecanol (C16) hexadecyl dodecanoate CalB1422-P
/STR		 99.0
Figure 112020082818980-pat00057
hexadecyl myristate
Figure 112020082818980-pat00058
hexadecyl oleate
Figure 112020082818980-pat00059
15 mustard oil oleic acid (C18:1) oleyl oleate CalB1422-P
/STR		 96.0
Figure 112020082818980-pat00060
oleyl erucate
Figure 112020082818980-pat00061
oleyl eicosanoate
Figure 112020082818980-pat00062
16 rice bran oil hexadecanol (C16) hexadecyl oleate CalB1422-P
/STR		 95.0
Figure 112020082818980-pat00063
hexadecyl linolate
Figure 112020082818980-pat00064
hexadecyl plamitate
Figure 112020082818980-pat00065
실시예 11. CalB1422-278 변이체를 이용한 유사세라마이드 제조
리파제를 이용한 유사세라마이드의 제조방법은 도 18과 같다. 다양한 지방산 또는 식물 유래의 다양한 중성지방을 기질로 이용할 수 있으며 여기에 다양한 아미노 알콜(amine alcohol)을 리파제를 이용하여 결합(amidation) 시키면 지방산 아미드가 제조되고 여기에 또 하나의 지방산이 에스터화 반응되면 유사세라마이드가 제조된다. 리파제를 이용한 유사세라마이드의 제조방법은 아미노화(amidation)와 에스터화 반응을 1단계 반응으로 동시 진행할 수 있으며 1단계에서 생성된 지방산 아미드를 정제하여 2차 지방산 추가 에스터화 반응하는 2단계 효소 반응으로 생산할 수도 있다.
11-1. 유사세라마이드 제조를 위한 CalB1422-278 변이체 선별
유사세라마이드를 생산하기 위한 최적의 효소 선정을 위하여 CalB1422 및 CalB1422-278 변이체 6종(L, G, A, Y, D, H)을 이용하여 아미노화 반응 효율을 비교하였다. 기질로는 중성지방(대두유)과 3-amino-1-propanol을 기질 몰비 2:1로 혼합하고, 각각의 효소는 기질 대비 5%(w/v)를 사용하여 50 ℃에서 약 66시간 반응하면서 시간대별로 생성되는 지방산 아미드와 소모되는 중성지방의 양을 GC와 TLC를 통하여 확인하였다.
그 결과, 도 19와 20에서 보는 바와 같이 278A가 가장 빠른 반응속도로 지방산 아미드의 생성과 중성지방의 소모속도를 보였고 278L과 278G도 유사 활성을 보였다. 따라서 CalB1422-278A 변이체는 아미드화 반응(amidation)에 최적화되어있음을 알 수 있었다.
11-2. 아미노알콜의 비교
중성지방(대두유)로부터 유사세라마이드 제조를 위한 아미노화 반응에는 다양한 아미노알콜의 사용이 가능하다. 최적의 아미노 알콜을 선정하기 위하여 7 종류의 아미노알콜(3-amino-1,2-propanediol, 3-amino-1-propanol, 2-amino-1-butanol, 1-amino-2-propanol, 2-amino-2-ethyl-1,3-propanediol, 2-amino-2-ethyl-1,3-propanediol, 2-amino-1,3- propanediol)을 중성지방 대비 1:1의 몰비로 동일 부피의 용매(hexane)에 용해하고 고정화 효소 10%(w/v)를 넣고 50 ℃에서 약 68시간동안 반응하였다. 그 결과 도 21에서 보는 바와 같이 3-amino-1,2-propanediol, 3-amino-1-propanol, 그리고 1-amino-2-propanol 이 아미노화 효율이 높았다.
11-3. 효소반응을 위한 최적 용매의 선정
효소반응에서 가장 많이 사용되는 헥산과 TAA(ter-amyl alcohol)과 헥산을 50%씩 섞은 용매를 비교하였다. 헥산은 TAA에 비해 끓는점이 낮아 반응 후 정제가 용이한 장점이 있으나 아미노 알콜이 헥산에 잘 용해되지 않는 문제가 있다. 이를 개선하기 위하여 중성지방(대두유)를 사용하여 용매의 효과를 비교하였다.
그 결과, 도 22에서 보는 바와 같이 헥산만 사용한 경우, 2종의 TG 모두 반응이 매우 느리고 유사세라마이드 생성 역시 느린 단점이 확인된 반면 TAA 및 헥산 혼합 용매를 사용한 경우 중성지방의 소모속도가 빠르고 유사세라마이드의 생성 농도도 높음을 확인하였다.
11-4. 기질 몰비 최적화
유사세라마이드 생산을 위한 단일단계 반응 최적화를 위하여 기질(중성지방 또는 지방산)과 아미노알콜의 몰비의 영향을 분석하였다. 먼저 아미노알콜과 중성지방의 몰비를 1:1, 1.5:1, 2:1 로 앞서 언급된 방법과 동일한 방법으로 전환반응을 수행하고 결과물을 TLC 분석하였다. 그 결과, 도 23에서 보는 바와 같이 기질 몰비 1.5:1 일 때 TG 기질의 소모 속도가 빠름을 알 수 있고 생성되는 유사세라마이드의 양도 최대량으로 만들어지는 것을 확인하였다. 1:1일 경우 지방산이 과량으로 투입되어 반응속도는 빠르지만 기질이 완전히 소모되지 않고 디글리세리드(diglyceride)나 모노글리세리드(monoglyceride) 형태로 잔류하였으며 2:1인 경우는 아미노알콜 대비 지방산의 양이 부족하여 중성지방의 소모 속도가 느려지고 유사세라마이드의 생성도 느려짐을 확인하였다. 지방산을 이용한 효소반응에서는 아미노알콜과 지방산의 몰비를 1:0.75, 1:1, 1:1.5, 1:2로 조정하여 상기한 방법과 동일한 조건으로 실험을 수행하였으며 가스크로마토그라피를 이용하여 분석하였다(도 24).
그 결과, 기질 몰비가 최소 1:1에서 반응이 진행되었으며 지방산 농도비가 높을수록 지방산 아미드로의 전환속도가 빠름을 확인하였다. 그러나 지방산이 아미노알콜에 비해 지나치게 과량이면 1차 아미노화 반응뿐만 아니라 2차 에스터화 반응도 동시에 일어나 유사세라마이드가 동시에 생성되었다.
따라서, 아미노화 반응만을 최대로 높이기 위해서는 지방산과 아미노알콜의 농도비가 1:1.5 정도가 적당함을 확인하였다.
실시예 12. 지방산을 이용한 유사세라마이드 생산
지방산을 기질로 유사세라마이드를 생산을 위해 아미노화 반응과 에스터화 반응을 2단계로 나누어 반응을 진행하였다. 1차 반응에서 지방산과 아미노 알콜이 아미노화 과정을 거쳐 지방산 아미드가 생성되고 생성된 지방산 아미드 다시 2차 반응에서 지방산과 에스터화 반응을 통해 유사세라마이드로 전환되었다. 1차 반응에서 지방산은 팔미트산과 3-아미노-1-프로판올(3-amino-1-propanol)을 1:1로 혼합하여 고정화 효소 CalB1422-278A를 기질 부피의 10%(w/v)로 넣어주고 50도에서 반응을 진행하였다. 가스크로마토그라피와 TLC를 이용하여 지방산 소모량과 지방산 아미드 및 유사세라마이드의 생성량을 확인하였다.
그 결과, 도 25와 같이 1차 아미노화 반응은 25시간 후에 거의 대부분 기질이 모두 소모되었음을 알 수 있었다. 또한, 2차 반응 기질로 미리스틱 산(myristic acid)을 동일 몰수로 첨가하고 위와 동일한 조건에서 반응을 진행한 결과 약 50~60% 정도의 기질이 소모되었다.
따라서, 1차 아미노화 반응 효율은 >95% 이상이었으며 2차 에스터화 반응 전환효율은 >60% 정도임을 확인하였다.
지방산을 이용한 유사 세라마이드의 구체적인 제조예는 하기 표 5와 같다.
NO. Fatty acid Amine alcohol Major pseudo-ceramide 효소/반응시스템 전환률 (%) 구조식
1 palmitic acid (C16)
myristic acid (C14)		 3-amino-1,2-propanediol 3-hexadecanamido-2-hydroxypropyl tetradecanoate CalB1422-L
CalB1422-P
/STR		 62.0
Figure 112020082818980-pat00066
2 methyl palmitate 3-amino-1-propanol 3-hexadecanamidopropyl hexadecanoate CalB1422-L
/STR		 15.0
Figure 112020082818980-pat00067
3 ethyl palmitate 3-amino-1-propanol 3-hexadecanamidopropyl hexadecanoate CalB1422-L/STR 15.0
Figure 112020082818980-pat00068
4 ethyl oleate 3-amino-1-propanol 3-[(9E)-octadec-9-enamido]propyl (9E)-octadec-9-enoate CalB1422-L
/STR		 16.7
Figure 112020082818980-pat00069
5 ethyl palmitate
palmitic acid		 3-amino-1-propanol 3-hexadecanamidopropyl hexadecanoate CalB1422-L
/STR		 22.2
Figure 112020082818980-pat00070
6 ethyl oleate
oleic acid		 3-amino-1-propanol 3-[(9E)-octadec-9-enamido]propyl (9E)-octadec-9-enoate CalB1422-L
/STR		 25.0
Figure 112020082818980-pat00071
실시예 13. 중성지방을 이용한 유사세라마이드 생산
중성지방을 이용한 단일단계 유사세라마이드 전환을 위해 대두유와 아미노 알콜(3-amino-1-propanol)을 1:1.5 로 혼합하여 최적화된 조건으로 반응하여 시간별로 생성되는 지방산 아미드와 유사세라마이드의 양을 TLC와 GC로 확인하였다. 그 결과, 도 26에서보는 바와 같이 단일단계 반응에서도 유사세라마이드는 생산되었지만, 디글리세리드, 모노글리세리드 및 지방산이 상당량 잔류하였으며 GC 확인 결과 생성된 지방산 아미드가 충분한 반응시간 후에도 완전히 유사세라마이드로 전환되지 않았다. 단일단계 전환반응에서 미반응 지방산 아미드가 잔류하는 문제를 해결하고 유사세라마이드 전환수율을 높이기 위하여 2단계 반응을 시도하였다. 1차 반응에서 생성된 수분, 그리고 미반응 아미노 알콜 등을 증류를 통해 제거한 후 2차 반응을 진행하였다. 증류 후 최종산물을 다시 헥산에 용해하여 50 ℃에서 추가반응을 진행하였다. 2단계 반응에서는 1단계 반응에서 미반응 상태로 잔류하고 있는 지방산 아미드를 유사세라마이드로 추가 전환하기 위해서 잔류 지방산 아미드 양을 정량하고 이와 동일한 몰수의 지방산을 첨가하는 방식으로 진행하였다. 이를 위해서 중성지방(대두유)을 추가하거나 특정 지방산을 추가하는 방법을 비교하였다.
그 결과, 도 27에서 보는 바와 같이 2차 반응에서 중성지방 또는 지방산을 추가 첨가하면 지방산 아미드가 급격히 줄고 유사세라마이드가 증가하여 중성지방으로부터 최종 80% 이상의 유사세라마이드가 제조되는 것을 확인하였다.
중성지방을 이용한 유사 세라마이드 복합체의 구체적인 제조예는 하기 표 6과 같다.
NO. oils Amine alcohol Major pseudo-ceramide 효소/반응시스템 전환률 (%) 구조식
1 1차 camellia oil
2차 oleic acid		 3-amino-1-propanol 3-[(9E,12E)-octadeca-9,12-dienamido]propyl (9E)-octadec-9-enoate 1차 CalB1422-L
2차 CalB1422-P
/STR		 87.0
Figure 112020082818980-pat00072
3-[(9E)-octadec-9-enamido]propyl (9E)-octadec-9-enoate
Figure 112020082818980-pat00073
3-hexadecanamidopropyl (9E)-octadec-9-enoate
Figure 112020082818980-pat00074
2 1차 peanut oil
2차 oleic acid		 3-amino-1-propanol 3-[(9E,12E)-octadeca-9,12-dienamido] propyl (9E)-octadec-9-enoate 1차 CalB1422-L
2차 CalB1422-P
/STR		 87.0
Figure 112020082818980-pat00075
3-[(9E)-octadec-9-enamido]propyl (9E)-octadec-9-enoate
Figure 112020082818980-pat00076
3-hexadecanamidopropyl (9E)-octadec-9-enoate
Figure 112020082818980-pat00077
3 1차 torreya oil
2차 oleic acid		 3-amino-1-propanol 3-[(9E,12E)-octadeca-9,12-dienamido] propyl (9E)-octadec-9-enoate 1차 CalB1422-L
2차 CalB1422-P
/STR		 87.0
Figure 112020082818980-pat00078
3-[(9E)-octadec-9-enamido]propyl (9E)-octadec-9-enoate
Figure 112020082818980-pat00079
3-hexadecanamidopropyl (9E)-octadec-9-enoate
Figure 112020082818980-pat00080
4 1차 auranthio oil
2차 oleic acid		 3-amino-1-propanol 3-hexadecanamidopropyl (9E)-octadec-9-enoate 1차 CalB1422-L
2차 CalB1422-P
/STR, (molecular
sieve 첨가		 96.0
Figure 112020082818980-pat00081
3-[(4E,7E,10E,13E,16E,19E)-docosa-4,7,10,13,16,19-hexaenamido]propyl (9E)-octadec-9-enoate
Figure 112020082818980-pat00082
3-[(5E,8E,11E,14E,17E)-icosa-5,8,11,14,17-pentaenamido]propyl (9E)-octadec-9-enoate
Figure 112020082818980-pat00083
5 1차 macadamia oil
2차 oleic acid		 3-amino-1-propanol 3-[(9E)-octadec-9-enamido]propyl (9E)-octadec-9-enoate 1차 CalB1422-L
2차 CalB1422-P
/STR		 86.0
Figure 112020082818980-pat00084
3-hexadecanamidopropyl (9E)-octadec-9-enoate
Figure 112020082818980-pat00085
3-[(9E)-hexadec-9-enamido]propyl (9E)-octadec-9-enoate
Figure 112020082818980-pat00086
ethaolamine 2-[(9Z)-octadec-9-enamido]ethyl (9Z)-octadec-9-
enoate		 70.0
Figure 112020082818980-pat00087
3-[(9E)-hexadec-9-enamido]propyl (9E)-octadec-9-enoate
Figure 112020082818980-pat00088
2-pentadecanamidoethyl (9Z)-octadec-9-enoate
Figure 112020082818980-pat00089
serinol 3-hydroxy-2-[(9Z)-octadec-9-enamido]propyl (9Z)-octadec-9-enoate 89.0
Figure 112020082818980-pat00090
2-[(7E)-hexadec-7-enamido]-3-hydroxypropyl (9Z)-octadec-9-enoate
Figure 112020082818980-pat00091
2-hexadecanamido-3-hydroxypropyl (9Z)-octadec-9-enoate
Figure 112020082818980-pat00092
6 oleic acid phytosphingosine (9Z)-N-[(2S,3S,4R)-1,3,4-trihydroxyoctadecan-2-yl]octadec-9-enamide CalB1422-A
/STR, molecular
sieve 첨가		 95.0
Figure 112020082818980-pat00093
7 macadamia oil phytosphingosine (9Z)-N-[(2S,3S,4R)-1,3,4-trihydroxyoctadecan-2-yl]octadec-9-enamide CalB1422-A
/STR		 98.9
Figure 112020082818980-pat00094
N-[(2S,3S,4R)-1,3,4-trihydroxyoctadecan-2-yl]hexadecanamide
Figure 112020082818980-pat00095
(9E)-N-[(2S,3S,4R)-1,3,4-trihydroxyoctadecan-2-yl]hexadec-9-enamide
Figure 112020082818980-pat00096
8 krill oil
oleic acid		 3-amino-1-propanol 3-hexadecanamidopropyl (9E)-octadec-9-enoate 1차 CalB1422-A
2차 CalB1422-P
/STR		 74.0
Figure 112020082818980-pat00097
3-[(9E)-octadec-9-enamido]propyl (9E)-octadec-9-enoate
Figure 112020082818980-pat00098
3-[(4E,7E,10E,13E,16E,19E)-docosa-4,7,10,13,16,19-hexaenamido]propyl (9E)-octadec-9-enoate
Figure 112020082818980-pat00099
9 coconut oil
oleic acid		 3-amino-1-propanol 3-dodecanamidopropyl (9E)-octadec-9-enoate 1차 CalB1422-A
2차 CalB1422-P
/STR		 83.0
Figure 112020082818980-pat00100
3-tetradecanamidopropyl (9E)-octadec-9-enoate
Figure 112020082818980-pat00101
3-[(9E)-octadec-9-enamido]propyl (9E)-octadec-9-enoate
Figure 112020082818980-pat00102
10 rice bran oil
oleic acid		 3-amino-1-propanol 3-[(9E)-octadec-9-enamido]propyl (9E)-octadec-9-enoate 1차 CalB1422-L
2차 CalB1422-P
/STR, (molecular
sieve 첨가		 92.0
Figure 112020082818980-pat00103
3-[(9E,12E)-octadeca-9,12-dienamido]propyl (9E)-octadec-9-enoate
Figure 112020082818980-pat00104
3-hexadecanamidopropyl (9E)-octadec-9-enoate
Figure 112020082818980-pat00105
11 rice bran oil
mustard oil		 3-amino-1-propanol 3-[(9E)-octadec-9-enamido]propyl (9E)-octadec-9-enoate 1차 CalB1422-L
2차 CalB1422-P
/STR		 91.0
Figure 112020082818980-pat00106
Figure 112020082818980-pat00107
3-[(9E,12E)-octadeca-9,12-dienamido]propyl (9E)-octadec-9-enoate
3-[(9E)-octadec-9-enamido]propyl (13Z)-docos-13-enoate
Figure 112020082818980-pat00108
3-[(9E,12E)-octadeca-9,12-dienamido]propyl (13Z)-docos-13-enoate
Figure 112020082818980-pat00109
각각의 반응별 CalB1422-278 변이체의 상대활성을 하기 표 7에 나타내었다. CalB1422-278 변이체는 가수분해(hydrolysis), 에스터화 반응(esterification), 에스터교환(transesterification) 활성별로 비교하였을 경우 확연한 차이를 보여주고 있으며 이러한 특성은 왁스에스터 생성반응에서도 확인되었다. 그러나 유사세라마이스 생성반응에서는 CalB1422-278 변이체별 상대활성차이는 적었다.
반응 활성구분 CalB1422-278 변이체의 상대활성
상위20% 상위40% 하위20%
Enzyme activity Hydrolysis Y G, P H, A, L, D
Esterification L, H P, G, A Y, D
Transesterification P, A G, Y, D, L, H
왁스에스터
생성반응		 Esterification L, A G, H, P, Y D
Transesterification P, A, G H, D, Y L
유사세라마이드
생성반응		 Esterification L, A G, H, P, Y D
Transesterification L, G, A Y, P, H D
따라서 본 발명에서 제공하는 CalB1422-278 변이체를 생산공정에 효과적으로 이용하기 위해서는 각 변이체를 반응에 적용하여 효과를 비교해서 최적 효소를 선택하는 것이 바람직하다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology <120> Variants of Candida antartica Lipase B and Their Use <130> KPA191118-KR-P1 <160> 10 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 317 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> CalB <400> 1 Leu Pro Ser Gly Ser Asp Pro Ala Phe Ser Gln Pro Lys Ser Val Leu 1 5 10 15 Asp Ala Gly Leu Thr Cys Gln Gly Ala Ser Pro Ser Ser Val Ser Lys 20 25 30 Pro Ile Leu Leu Val Pro Gly Thr Gly Thr Thr Gly Pro Gln Ser Phe 35 40 45 Asp Ser Asn Trp Ile Pro Leu Ser Ala Gln Leu Gly Tyr Thr Pro Cys 50 55 60 Trp Ile Ser Pro Pro Pro Phe Met Leu Asn Asp Thr Gln Val Asn Thr 65 70 75 80 Glu Tyr Met Val Asn Ala Ile Thr Thr Leu Tyr Ala Gly Ser Gly Asn 85 90 95 Asn Lys Leu Pro Val Leu Thr Trp Ser Gln Gly Gly Leu Val Ala Gln 100 105 110 Trp Gly Leu Thr Phe Phe Pro Ser Ile Arg Ser Lys Val Asp Arg Leu 115 120 125 Met Ala Phe Ala Pro Asp Tyr Lys Gly Thr Val Leu Ala Gly Pro Leu 130 135 140 Asp Ala Leu Ala Val Ser Ala Pro Ser Val Trp Gln Gln Thr Thr Gly 145 150 155 160 Ser Ala Leu Thr Thr Ala Leu Arg Asn Ala Gly Gly Leu Thr Gln Ile 165 170 175 Val Pro Thr Thr Asn Leu Tyr Ser Ala Thr Asp Glu Ile Val Gln Pro 180 185 190 Gln Val Ser Asn Ser Pro Leu Asp Ser Ser Tyr Leu Phe Asn Gly Lys 195 200 205 Asn Val Gln Ala Gln Ala Val Cys Gly Pro Leu Phe Val Ile Asp His 210 215 220 Ala Gly Ser Leu Thr Ser Gln Phe Ser Tyr Val Val Gly Arg Ser Ala 225 230 235 240 Leu Arg Ser Thr Thr Gly Gln Ala Arg Ser Ala Asp Tyr Gly Ile Thr 245 250 255 Asp Cys Asn Pro Leu Pro Ala Asn Asp Leu Thr Pro Glu Gln Lys Val 260 265 270 Ala Ala Ala Ala Leu Leu Ala Pro Ala Ala Ala Ala Ile Val Ala Gly 275 280 285 Pro Lys Gln Asn Cys Glu Pro Asp Leu Met Pro Tyr Ala Arg Pro Phe 290 295 300 Ala Val Gly Lys Arg Thr Cys Ser Gly Ile Val Thr Pro 305 310 315 <210> 2 <211> 317 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CalB1422 278L <400> 2 Leu Pro Ser Gly Ser Asp Pro Ala Phe Ser Gln Pro Lys Ser Val Leu 1 5 10 15 Asp Ala Gly Leu Thr Cys Gln Gly Ala Ser Pro Ser Ser Val Ser Lys 20 25 30 Pro Ile Leu Leu Val Pro Gly Thr Gly Thr Thr Gly Pro Gln Ser Phe 35 40 45 Asp Ser Asn Trp Ile Pro Leu Ser Ala Gln Leu Gly Tyr Thr Pro Cys 50 55 60 Trp Ile Ser Pro Pro Pro Phe Met Leu Asn Asp Thr Gln Val Asn Ala 65 70 75 80 Glu Tyr Met Val Asn Ala Ile Thr Thr Leu Tyr Ala Gly Ser Gly Asn 85 90 95 Asn Lys Leu Pro Val Leu Thr Trp Ser Gln Gly Gly Leu Val Ala Gln 100 105 110 Trp Gly Leu Thr Phe Phe Pro Ser Ile Arg Ser Lys Val Asp Arg Leu 115 120 125 Met Ala Phe Ala Pro Asp Tyr Lys Gly Thr Val Leu Ala Gly Pro Leu 130 135 140 Asp Ala Leu Ala Val Ser Ala Pro Ser Val Trp Gln Gln Thr Thr Gly 145 150 155 160 Ser Ala Leu Thr Thr Ala Leu Arg Asn Ala Gly Gly Leu Thr Gln Ile 165 170 175 Val Pro Thr Thr Asn Leu Tyr Ser Ala Thr Asp Glu Ile Val Gln Pro 180 185 190 Gln Val Ser Asn Ser Pro Leu Asp Ser Ser Tyr Leu Phe Asn Gly Lys 195 200 205 Asn Val Gln Ala Gln Ala Val Cys Gly Pro Gln Phe Val Ile Asp His 210 215 220 Ala Gly Ser Leu Thr Ser Gln Phe Ser Tyr Val Val Gly Arg Ser Ala 225 230 235 240 Leu Arg Ser Thr Thr Gly Gln Ala Arg Ser Ala Asp Tyr Gly Ile Thr 245 250 255 Asp Cys Asn Pro Leu Pro Ala Asn Asp Leu Thr Pro Glu Gln Lys Val 260 265 270 Ala Ala Ala Ala Leu Leu Ala Pro Ala Ala Ala Ala Ile Val Ala Gly 275 280 285 Pro Lys Gln Asn Cys Glu Pro Asp Leu Met Pro Tyr Ala Arg Pro Phe 290 295 300 Ala Val Gly Lys Arg Thr Cys Ser Gly Ile Val Thr Pro 305 310 315 <210> 3 <211> 317 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CalB1422 278G <400> 3 Leu Pro Ser Gly Ser Asp Pro Ala Phe Ser Gln Pro Lys Ser Val Leu 1 5 10 15 Asp Ala Gly Leu Thr Cys Gln Gly Ala Ser Pro Ser Ser Val Ser Lys 20 25 30 Pro Ile Leu Leu Val Pro Gly Thr Gly Thr Thr Gly Pro Gln Ser Phe 35 40 45 Asp Ser Asn Trp Ile Pro Leu Ser Ala Gln Leu Gly Tyr Thr Pro Cys 50 55 60 Trp Ile Ser Pro Pro Pro Phe Met Leu Asn Asp Thr Gln Val Asn Ala 65 70 75 80 Glu Tyr Met Val Asn Ala Ile Thr Thr Leu Tyr Ala Gly Ser Gly Asn 85 90 95 Asn Lys Leu Pro Val Leu Thr Trp Ser Gln Gly Gly Leu Val Ala Gln 100 105 110 Trp Gly Leu Thr Phe Phe Pro Ser Ile Arg Ser Lys Val Asp Arg Leu 115 120 125 Met Ala Phe Ala Pro Asp Tyr Lys Gly Thr Val Leu Ala Gly Pro Leu 130 135 140 Asp Ala Leu Ala Val Ser Ala Pro Ser Val Trp Gln Gln Thr Thr Gly 145 150 155 160 Ser Ala Leu Thr Thr Ala Leu Arg Asn Ala Gly Gly Leu Thr Gln Ile 165 170 175 Val Pro Thr Thr Asn Leu Tyr Ser Ala Thr Asp Glu Ile Val Gln Pro 180 185 190 Gln Val Ser Asn Ser Pro Leu Asp Ser Ser Tyr Leu Phe Asn Gly Lys 195 200 205 Asn Val Gln Ala Gln Ala Val Cys Gly Pro Gln Phe Val Ile Asp His 210 215 220 Ala Gly Ser Leu Thr Ser Gln Phe Ser Tyr Val Val Gly Arg Ser Ala 225 230 235 240 Leu Arg Ser Thr Thr Gly Gln Ala Arg Ser Ala Asp Tyr Gly Ile Thr 245 250 255 Asp Cys Asn Pro Leu Pro Ala Asn Asp Leu Thr Pro Glu Gln Lys Val 260 265 270 Ala Ala Ala Ala Leu Gly Ala Pro Ala Ala Ala Ala Ile Val Ala Gly 275 280 285 Pro Lys Gln Asn Cys Glu Pro Asp Leu Met Pro Tyr Ala Arg Pro Phe 290 295 300 Ala Val Gly Lys Arg Thr Cys Ser Gly Ile Val Thr Pro 305 310 315 <210> 4 <211> 317 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CalB1422 278A <400> 4 Leu Pro Ser Gly Ser Asp Pro Ala Phe Ser Gln Pro Lys Ser Val Leu 1 5 10 15 Asp Ala Gly Leu Thr Cys Gln Gly Ala Ser Pro Ser Ser Val Ser Lys 20 25 30 Pro Ile Leu Leu Val Pro Gly Thr Gly Thr Thr Gly Pro Gln Ser Phe 35 40 45 Asp Ser Asn Trp Ile Pro Leu Ser Ala Gln Leu Gly Tyr Thr Pro Cys 50 55 60 Trp Ile Ser Pro Pro Pro Phe Met Leu Asn Asp Thr Gln Val Asn Ala 65 70 75 80 Glu Tyr Met Val Asn Ala Ile Thr Thr Leu Tyr Ala Gly Ser Gly Asn 85 90 95 Asn Lys Leu Pro Val Leu Thr Trp Ser Gln Gly Gly Leu Val Ala Gln 100 105 110 Trp Gly Leu Thr Phe Phe Pro Ser Ile Arg Ser Lys Val Asp Arg Leu 115 120 125 Met Ala Phe Ala Pro Asp Tyr Lys Gly Thr Val Leu Ala Gly Pro Leu 130 135 140 Asp Ala Leu Ala Val Ser Ala Pro Ser Val Trp Gln Gln Thr Thr Gly 145 150 155 160 Ser Ala Leu Thr Thr Ala Leu Arg Asn Ala Gly Gly Leu Thr Gln Ile 165 170 175 Val Pro Thr Thr Asn Leu Tyr Ser Ala Thr Asp Glu Ile Val Gln Pro 180 185 190 Gln Val Ser Asn Ser Pro Leu Asp Ser Ser Tyr Leu Phe Asn Gly Lys 195 200 205 Asn Val Gln Ala Gln Ala Val Cys Gly Pro Gln Phe Val Ile Asp His 210 215 220 Ala Gly Ser Leu Thr Ser Gln Phe Ser Tyr Val Val Gly Arg Ser Ala 225 230 235 240 Leu Arg Ser Thr Thr Gly Gln Ala Arg Ser Ala Asp Tyr Gly Ile Thr 245 250 255 Asp Cys Asn Pro Leu Pro Ala Asn Asp Leu Thr Pro Glu Gln Lys Val 260 265 270 Ala Ala Ala Ala Leu Ala Ala Pro Ala Ala Ala Ala Ile Val Ala Gly 275 280 285 Pro Lys Gln Asn Cys Glu Pro Asp Leu Met Pro Tyr Ala Arg Pro Phe 290 295 300 Ala Val Gly Lys Arg Thr Cys Ser Gly Ile Val Thr Pro 305 310 315 <210> 5 <211> 317 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CalB1422 278Y <400> 5 Leu Pro Ser Gly Ser Asp Pro Ala Phe Ser Gln Pro Lys Ser Val Leu 1 5 10 15 Asp Ala Gly Leu Thr Cys Gln Gly Ala Ser Pro Ser Ser Val Ser Lys 20 25 30 Pro Ile Leu Leu Val Pro Gly Thr Gly Thr Thr Gly Pro Gln Ser Phe 35 40 45 Asp Ser Asn Trp Ile Pro Leu Ser Ala Gln Leu Gly Tyr Thr Pro Cys 50 55 60 Trp Ile Ser Pro Pro Pro Phe Met Leu Asn Asp Thr Gln Val Asn Ala 65 70 75 80 Glu Tyr Met Val Asn Ala Ile Thr Thr Leu Tyr Ala Gly Ser Gly Asn 85 90 95 Asn Lys Leu Pro Val Leu Thr Trp Ser Gln Gly Gly Leu Val Ala Gln 100 105 110 Trp Gly Leu Thr Phe Phe Pro Ser Ile Arg Ser Lys Val Asp Arg Leu 115 120 125 Met Ala Phe Ala Pro Asp Tyr Lys Gly Thr Val Leu Ala Gly Pro Leu 130 135 140 Asp Ala Leu Ala Val Ser Ala Pro Ser Val Trp Gln Gln Thr Thr Gly 145 150 155 160 Ser Ala Leu Thr Thr Ala Leu Arg Asn Ala Gly Gly Leu Thr Gln Ile 165 170 175 Val Pro Thr Thr Asn Leu Tyr Ser Ala Thr Asp Glu Ile Val Gln Pro 180 185 190 Gln Val Ser Asn Ser Pro Leu Asp Ser Ser Tyr Leu Phe Asn Gly Lys 195 200 205 Asn Val Gln Ala Gln Ala Val Cys Gly Pro Gln Phe Val Ile Asp His 210 215 220 Ala Gly Ser Leu Thr Ser Gln Phe Ser Tyr Val Val Gly Arg Ser Ala 225 230 235 240 Leu Arg Ser Thr Thr Gly Gln Ala Arg Ser Ala Asp Tyr Gly Ile Thr 245 250 255 Asp Cys Asn Pro Leu Pro Ala Asn Asp Leu Thr Pro Glu Gln Lys Val 260 265 270 Ala Ala Ala Ala Leu Tyr Ala Pro Ala Ala Ala Ala Ile Val Ala Gly 275 280 285 Pro Lys Gln Asn Cys Glu Pro Asp Leu Met Pro Tyr Ala Arg Pro Phe 290 295 300 Ala Val Gly Lys Arg Thr Cys Ser Gly Ile Val Thr Pro 305 310 315 <210> 6 <211> 317 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CalB1422 278D <400> 6 Leu Pro Ser Gly Ser Asp Pro Ala Phe Ser Gln Pro Lys Ser Val Leu 1 5 10 15 Asp Ala Gly Leu Thr Cys Gln Gly Ala Ser Pro Ser Ser Val Ser Lys 20 25 30 Pro Ile Leu Leu Val Pro Gly Thr Gly Thr Thr Gly Pro Gln Ser Phe 35 40 45 Asp Ser Asn Trp Ile Pro Leu Ser Ala Gln Leu Gly Tyr Thr Pro Cys 50 55 60 Trp Ile Ser Pro Pro Pro Phe Met Leu Asn Asp Thr Gln Val Asn Ala 65 70 75 80 Glu Tyr Met Val Asn Ala Ile Thr Thr Leu Tyr Ala Gly Ser Gly Asn 85 90 95 Asn Lys Leu Pro Val Leu Thr Trp Ser Gln Gly Gly Leu Val Ala Gln 100 105 110 Trp Gly Leu Thr Phe Phe Pro Ser Ile Arg Ser Lys Val Asp Arg Leu 115 120 125 Met Ala Phe Ala Pro Asp Tyr Lys Gly Thr Val Leu Ala Gly Pro Leu 130 135 140 Asp Ala Leu Ala Val Ser Ala Pro Ser Val Trp Gln Gln Thr Thr Gly 145 150 155 160 Ser Ala Leu Thr Thr Ala Leu Arg Asn Ala Gly Gly Leu Thr Gln Ile 165 170 175 Val Pro Thr Thr Asn Leu Tyr Ser Ala Thr Asp Glu Ile Val Gln Pro 180 185 190 Gln Val Ser Asn Ser Pro Leu Asp Ser Ser Tyr Leu Phe Asn Gly Lys 195 200 205 Asn Val Gln Ala Gln Ala Val Cys Gly Pro Gln Phe Val Ile Asp His 210 215 220 Ala Gly Ser Leu Thr Ser Gln Phe Ser Tyr Val Val Gly Arg Ser Ala 225 230 235 240 Leu Arg Ser Thr Thr Gly Gln Ala Arg Ser Ala Asp Tyr Gly Ile Thr 245 250 255 Asp Cys Asn Pro Leu Pro Ala Asn Asp Leu Thr Pro Glu Gln Lys Val 260 265 270 Ala Ala Ala Ala Leu Asp Ala Pro Ala Ala Ala Ala Ile Val Ala Gly 275 280 285 Pro Lys Gln Asn Cys Glu Pro Asp Leu Met Pro Tyr Ala Arg Pro Phe 290 295 300 Ala Val Gly Lys Arg Thr Cys Ser Gly Ile Val Thr Pro 305 310 315 <210> 7 <211> 317 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CalB1422 278H <400> 7 Leu Pro Ser Gly Ser Asp Pro Ala Phe Ser Gln Pro Lys Ser Val Leu 1 5 10 15 Asp Ala Gly Leu Thr Cys Gln Gly Ala Ser Pro Ser Ser Val Ser Lys 20 25 30 Pro Ile Leu Leu Val Pro Gly Thr Gly Thr Thr Gly Pro Gln Ser Phe 35 40 45 Asp Ser Asn Trp Ile Pro Leu Ser Ala Gln Leu Gly Tyr Thr Pro Cys 50 55 60 Trp Ile Ser Pro Pro Pro Phe Met Leu Asn Asp Thr Gln Val Asn Ala 65 70 75 80 Glu Tyr Met Val Asn Ala Ile Thr Thr Leu Tyr Ala Gly Ser Gly Asn 85 90 95 Asn Lys Leu Pro Val Leu Thr Trp Ser Gln Gly Gly Leu Val Ala Gln 100 105 110 Trp Gly Leu Thr Phe Phe Pro Ser Ile Arg Ser Lys Val Asp Arg Leu 115 120 125 Met Ala Phe Ala Pro Asp Tyr Lys Gly Thr Val Leu Ala Gly Pro Leu 130 135 140 Asp Ala Leu Ala Val Ser Ala Pro Ser Val Trp Gln Gln Thr Thr Gly 145 150 155 160 Ser Ala Leu Thr Thr Ala Leu Arg Asn Ala Gly Gly Leu Thr Gln Ile 165 170 175 Val Pro Thr Thr Asn Leu Tyr Ser Ala Thr Asp Glu Ile Val Gln Pro 180 185 190 Gln Val Ser Asn Ser Pro Leu Asp Ser Ser Tyr Leu Phe Asn Gly Lys 195 200 205 Asn Val Gln Ala Gln Ala Val Cys Gly Pro Gln Phe Val Ile Asp His 210 215 220 Ala Gly Ser Leu Thr Ser Gln Phe Ser Tyr Val Val Gly Arg Ser Ala 225 230 235 240 Leu Arg Ser Thr Thr Gly Gln Ala Arg Ser Ala Asp Tyr Gly Ile Thr 245 250 255 Asp Cys Asn Pro Leu Pro Ala Asn Asp Leu Thr Pro Glu Gln Lys Val 260 265 270 Ala Ala Ala Ala Leu His Ala Pro Ala Ala Ala Ala Ile Val Ala Gly 275 280 285 Pro Lys Gln Asn Cys Glu Pro Asp Leu Met Pro Tyr Ala Arg Pro Phe 290 295 300 Ala Val Gly Lys Arg Thr Cys Ser Gly Ile Val Thr Pro 305 310 315 <210> 8 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CalB1422 F <400> 8 gcggctgcgc tcccggcgnn ngcggctgca 30 <210> 9 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CalB1422 R <400> 9 ggctgcagcc gcnnncgccg ggagcgcagc 30 <210> 10 <211> 317 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CalB1422 <400> 10 Leu Pro Ser Gly Ser Asp Pro Ala Phe Ser Gln Pro Lys Ser Val Leu 1 5 10 15 Asp Ala Gly Leu Thr Cys Gln Gly Ala Ser Pro Ser Ser Val Ser Lys 20 25 30 Pro Ile Leu Leu Val Pro Gly Thr Gly Thr Thr Gly Pro Gln Ser Phe 35 40 45 Asp Ser Asn Trp Ile Pro Leu Ser Ala Gln Leu Gly Tyr Thr Pro Cys 50 55 60 Trp Ile Ser Pro Pro Pro Phe Met Leu Asn Asp Thr Gln Val Asn Ala 65 70 75 80 Glu Tyr Met Val Asn Ala Ile Thr Thr Leu Tyr Ala Gly Ser Gly Asn 85 90 95 Asn Lys Leu Pro Val Leu Thr Trp Ser Gln Gly Gly Leu Val Ala Gln 100 105 110 Trp Gly Leu Thr Phe Phe Pro Ser Ile Arg Ser Lys Val Asp Arg Leu 115 120 125 Met Ala Phe Ala Pro Asp Tyr Lys Gly Thr Val Leu Ala Gly Pro Leu 130 135 140 Asp Ala Leu Ala Val Ser Ala Pro Ser Val Trp Gln Gln Thr Thr Gly 145 150 155 160 Ser Ala Leu Thr Thr Ala Leu Arg Asn Ala Gly Gly Leu Thr Gln Ile 165 170 175 Val Pro Thr Thr Asn Leu Tyr Ser Ala Thr Asp Glu Ile Val Gln Pro 180 185 190 Gln Val Ser Asn Ser Pro Leu Asp Ser Ser Tyr Leu Phe Asn Gly Lys 195 200 205 Asn Val Gln Ala Gln Ala Val Cys Gly Pro Gln Phe Val Ile Asp His 210 215 220 Ala Gly Ser Leu Thr Ser Gln Phe Ser Tyr Val Val Gly Arg Ser Ala 225 230 235 240 Leu Arg Ser Thr Thr Gly Gln Ala Arg Ser Ala Asp Tyr Gly Ile Thr 245 250 255 Asp Cys Asn Pro Leu Pro Ala Asn Asp Leu Thr Pro Glu Gln Lys Val 260 265 270 Ala Ala Ala Ala Leu Pro Ala Pro Ala Ala Ala Ala Ile Val Ala Gly 275 280 285 Pro Lys Gln Asn Cys Glu Pro Asp Leu Met Pro Tyr Ala Arg Pro Phe 290 295 300 Ala Val Gly Lys Arg Thr Cys Ser Gly Ile Val Thr Pro 305 310 315

Claims (11)

  1. 서열번호 1의 아미노산 서열에서 80번째 아미노산이 알라닌(A)으로 치환되고; 219번째 아미노산이 글루타민(Q)으로 치환되고; 278번째 아미노산이 류신(L), 글리신(G), 알라닌(A), 티로신(T), 아스파르트산(D) 및 히스티딘(H)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 치환을 포함하는, CalB(Candida antarctica lipase B)의 변이체.
  2. 제1항에 있어서, 상기 CalB의 변이체는 서열번호 2 내지 서열번호 7의 아미노산 서열로 이루어진 것인, CalB의 변이체.
  3. 제1항에 있어서, 상기 CalB는 칸디다 안타티카(Candida antarctica) 유래인 것인, 변이체.
  4. 제1항의 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
  5. 제4항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
  6. 제1항의 변이체, 제4항의 폴리뉴클레오티드 및 제5항의 벡터 중 어느 하나 이상을 포함하여, CalB의 변이체를 생산하는 미생물.
  7. 제1항의 변이체, 제4항의 폴리뉴클레오티드 및 제5항의 벡터 중 어느 하나 이상을 포함하여, CalB의 변이체를 생산하는 미생물을 배지에서 배양하는 단계; 및
    배양된 배지 또는 미생물에서 CalB의 변이체를 회수하는 단계를 포함하는, CalB의 변이체 생산 방법.
  8. 지방산 및 중성지방으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 기질과 제1항의 CalB의 변이체를 반응시켜 기질을 왁스에스터로 전환하는 단계를 포함하는, 왁스에스터 생산 방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 CalB의 변이체는 서열번호 3 내지 7 또는 서열번호 10의 아미노산 서열로 이루어진 것인, 왁스에스터 생산 방법.
  10. i) 지방산 및 중성지방으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 기질과 아미노 알콜을 제1항의 CalB의 변이체를 이용하여 아미노화 반응시켜 지방산 아미드를 생산하는 단계; 및
    ii) 생산된 지방산 아미드에 기질을 추가로 첨가하고 제1항의 CalB의 변이체를 이용하여 에스터화 반응시켜 유사세라마이드를 생산하는 단계;를 포함하는 유사세라마이드 생산 방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 CalB의 변이체는 서열번호 2 내지 5, 서열번호 7 또는 서열번호 10의 아미노산 서열로 이루어진 것인, 유사세라마이드 생산 방법.
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