CN114921437B - 海洋链霉菌脂肪酶突变体及其应用 - Google Patents

海洋链霉菌脂肪酶突变体及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种海洋链霉菌脂肪酶突变体及其应用，所述海洋链霉菌脂肪酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。本发明通过对海洋链霉菌属脂肪酶的第40位和第237位进行单点突变和双点突变，发现其双突变体G40D/T237R脂肪酶在酯化合成甘油酯时，偏甘油酯/甘油三酯的比例可达到7.51，远远超过野生型脂肪酶的偏甘油酯/甘油三酯的比例，具有更好的合成偏甘油酯的酯化活力，可以广泛应用于偏甘油酯的生产。

Description

海洋链霉菌脂肪酶突变体及其应用
技术领域
本发明属于基因工程以及酶工程技术领域，具体地说，本发明涉及一种海洋链霉菌脂肪酶的突变体及其应用。
背景技术
脂肪酶(triacylglycerol lipase，E.C.3.1.1.3)，又称三酰基甘油水解酶，是一类能够催化甘油酯类物质水解成甘油和游离脂肪酸的酶。除此之外，脂肪酶还能催化醇解、酸解、氨解、甘油解、酯化以及酯交换等多种反应，是高效的生物催化剂。同时脂肪酶还具有立体专一性、区域专一性、底物选择性和位点选择性以及催化过程温和，能耗低，副产物少，环境友好等特点，因此在食品、制药、环境、造纸、纺织、洗涤剂、皮革加工、生物柴油、生物传感器以及精细化工等各个领域都有着广泛的应用。
偏甘油酯是甘油二酯和甘油单酯的统称，作为一类多元醇型非离子型表面活性剂，被广泛应用于食品、医药、化妆品、洗涤剂、日用化工、塑料以及纺织等各个领域。
偏甘油酯的合成主要分为化学法和酶法。传统的化学法因其需要在高温的条件下反应，会使脂肪酸发生氧化和碳化，破坏一些不饱和脂肪酸，从而影响产品的质量。另外化学法生成的副产物较多，且所用的很多催化剂并非食品安全级别，后续的处理复杂。而生物酶法反应条件温和，底物选择性强，副产物少，安全性高，对环境友好，在一定程度上弥补了化学合成工艺的不足，是目前偏甘油酯绿色合成的主要途径，也是近年来国内外学者研究的热点之一。
脂肪酸与甘油在脂肪酶的催化下可以酯化生成甘油二酯和甘油单酯，同时还有甘油三酯的生成，由于甘油三酯的分离较为困难，给后续产物的分离纯化带来困难。所以在酯化过程中，提高产物中偏甘油酯的含量，降低甘油三酯的含量至关重要。
发明内容
基于此，本发明的目的之一在于提供一种海洋链霉菌脂肪酶突变体，该突变体在酯化过程中，更倾向于催化生成偏甘油酯。
实现上述发明目的的具体技术方案包括如下：
一种海洋链霉菌脂肪酶突变体，所述海洋链霉菌脂肪酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
本发明还提供了上述海洋链霉菌脂肪酶突变体的编码基因，所述核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
本发明还提供了上述海洋链霉菌脂肪酶突变体的固定化酶。
本发明还提供了上述海洋链霉菌脂肪酶突变体、其编码基因、固定化酶在制备偏甘油酯中的应用。
本发明还提供了一种插入有上述编码基因的重组表达载体。
本发明还提供了一种转入有上述重组表达载体的重组工程菌株。
本发明还提供了一种海洋链霉菌脂肪酶突变体的制备方法，其是将上述重组工程菌株进行表达、纯化，即得。
本发明还提供了上述重组表达载体、或重组工程菌株在制备偏甘油酯中的应用。
本发明还提供了一种制备偏甘油酯的方法，其是使用上述海洋链霉菌脂肪酶突变体、或海洋链霉菌脂肪酶突变体的固定化酶，催化脂肪酸与甘油发生酯化反应。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
1、在本发明中，通过对海洋链霉菌属脂肪酶的第40位和第237位进行单点突变和双点突变，发现其双突变体G40D/T237R脂肪酶在酯化合成甘油酯时，偏甘油酯/甘油三酯的比例可达到7.51，远远超过野生型脂肪酶的偏甘油酯/甘油三酯的比例(1.21)，因此，本发明的双突变体G40D/T237R脂肪酶具有更好的合成偏甘油酯(甘油二酯和甘油单酯)的酯化活力，可以广泛应用于偏甘油酯的生产。
2、将本发明的双突变体G40D/T237R脂肪酶进行固定化后，在反应温度为65℃，甘油和油酸摩尔比为1：1，加酶量2%(w/w)的条件下反应24h，酯油酸的转化率可达90.29%，偏甘油酯的含量为70.82%。且固定化脂肪酶G40D/T237R在循环使用5次后，仍保持90%的活力。
附图说明
图1为本发明实施例1中海洋链霉菌脂肪酶与底物对接模型催化口袋氨基酸组成的结构图。
图2为本发明实施例2中海洋链霉菌脂肪酶及其单点突变的蛋白纯化图。
图3为本发明实施例2中海洋链霉菌脂肪酶及其双点突变的蛋白纯化图。
图4为本发明实施例3中海洋链霉菌脂肪酶及其突变体合成甘油酯组分的相对含量柱状图。
图5为本发明实施例5中温度对海洋链霉菌脂肪酶突变体固定化酶酯化反应的影响。
图6为本发明实施例5中底物摩尔比对海洋链霉菌脂肪酶突变体固定化酶酯化反应的影响。
图7为本发明实施例5中加酶量对海洋链霉菌脂肪酶突变体固定化酶酯化反应的影响。
图8为本发明实施例6中海洋链霉菌脂肪酶突变体固定化酶的重复利用性结果。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明公开内容的理解更加透彻全面。
除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。本发明所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
在本发明的其中一个方面，提供了一种酯化产物对偏甘油酯具有积累偏好性的海洋链霉菌属脂肪酶突变体，通过对海洋链霉菌属脂肪酶进行蛋白结构分析，运用定点突变的方法而获得的6个单点突变(T237A、T237E、T237F、T237Q、T237R、T237Y)和5个双点突变(G40D/T237R、G40E/T237R、G40W/T237R、G40R/T237D、G40R/T237E)的脂肪酶突变体，通过大肠杆菌重组表达、蛋白纯化以及酯化活力的评估分析，筛选出酯化产物积累偏好性最佳的突变体为G40D/T237R，为突变体的广泛应用奠定基础。
其中，海洋链霉菌脂肪酶(野生型脂肪酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示)的突变体G40D/T237R，其氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，编码所述氨基酸序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
SEQ ID NO.1(海洋链霉菌脂肪酶的编码基因)：
Gccacggccacggccgccacgccagctgctgaggctacttcccgaggttggaacgactattcttgtaagccctctgctgcccatcctagacctgttgttcttgtacatggcaccttcggtaactcaattgacaactggcttgttttggctccatacttggtaaatagaggttactgcgtcttttctctggactacggtcaacttcctggtgttccattctttcatggacttggtcctatcgacaagtccgccgaacaattggacgttttcgttgataaggtactagacgccactggagcccccaaggctgatctggtcggtcacagtcaaggtggtatgatgccaaactactacctgaaattcttaggaggggcagataaggttaacgcattggttggaatagctccagataatcacggcaccactttactaggcctaactaaattgttaccctttttcccaggggttgaaaaatttatttctgacaataccccagggttagcagaccaagtcgctggttccccttttattacaaaattgacagccggaggtgatactgtgccaggagttagatacaccgtcattgcaactaaatatgatcaggtggttacaccttatcgtactcagtatttggatggacctaacgtcagaaatgtcttgctgcaggatctttgtccagtggatttgtcagaacacgtagccatcggaactatcgataggatagcttttcatgaggtggctaatgcactggatccagctagagcaacacctacaacctgtgcttctgtgattggctga
SEQ ID NO.2(海洋链霉菌脂肪酶的氨基酸序列)：
ATATAATPAAEATSRGWNDYSCKPSAAHPRPVVLVHGTFGNSIDNWLVLAPYLVNRGYCVFSLDYGQLPGVPFFHGLGPIDKSAEQLDVFVDKVLDATGAPKADLVGHSQGGMMPNYYLKFLGGADKVNALVGIAPDNHGTTLLGLTKLLPFFPGVEKFISDNTPGLADQVAGSPFITKLTAGGDTVPGVRYTVIATKYDQVVTPYRTQYLDGPNVRNVLLQDLCPVDLSEHVAIGTIDRIAFHEVANALDPARATPTTCASVIG*
SEQ ID NO.3(海洋链霉菌脂肪酶突变体的编码基因，其中下划线核苷酸为突变核苷酸)：
gccacggccacggccgccacgccagctgctgaggctacttcccgaggttggaacgactattcttgtaagccctctgctgcccatcctagacctgttgttcttgtacatggcaccttcgataactcaattgacaactggcttgttttggctccatacttggtaaatagaggttactgcgtcttttctctggactacggtcaacttcctggtgttccattctttcatggacttggtcctatcgacaagtccgccgaacaattggacgttttcgttgataaggtactagacgccactggagcccccaaggctgatctggtcggtcacagtcaaggtggtatgatgccaaactactacctgaaattcttaggaggggcagataaggttaacgcattggttggaatagctccagataatcacggcaccactttactaggcctaactaaattgttaccctttttcccaggggttgaaaaatttatttctgacaataccccagggttagcagaccaagtcgctggttccccttttattacaaaattgacagccggaggtgatactgtgccaggagttagatacaccgtcattgcaactaaatatgatcaggtggttacaccttatcgtactcagtatttggatggacctaacgtcagaaatgtcttgctgcaggatctttgtccagtggatttgtcagaacacgtagccatcggaaggatcgataggatagcttttcatgaggtggctaatgcactggatccagctagagcaacacctacaacctgtgcttctgtgattggctga
SEQ ID NO.4(海洋链霉菌脂肪酶突变体的氨基酸序列，其中下划线氨基酸为突变点)：
ATATAATPAAEATSRGWNDYSCKPSAAHPRPVVLVHDTFGNSIDNWLVLAPYLVNRGYCVFSLDYGQLPGVPFFHGLGPIDKSAEQLDVFVDKVLDATGAPKADLVGHSQGGMMPNYYLKFLGGADKVNALVGIAPDNHGTTLLGLTKLLPFFPGVEKFISDNTPGLADQVAGSPFITKLTAGGDTVPGVRYTVIATKYDQVVTPYRTQYLDGPNVRNVLLQDLCPVDLSEHVAIGRIDRIAFHEVANALDPARATPTTCASVIG*
以下结合附图和具体实施例详细说明本发明。
实施例1海洋链霉菌脂肪酶突变体的构建及表达
对海洋微生物Streptomycetessp.Strain W007来源的脂肪酶MAS1(氨基酸序列为SEQID NO.2，由华南理工大学制备，保存于华南理工大学)进行结构分析，通过分子对接后酶与底物的复合物模型，发现其催化结合口袋中氨基酸的组成如图1所示，箭头指向的位置是237位氨基酸的Thr位点和40位氨基酸的Gly位点。
为了增强催化口袋中对底物TAG的空间位阻效应，改变其底物选择性，使用定点突变构建海洋链霉菌脂肪酶MAS1突变体，一共构建了6个单点突变体，分别为T237A、T237E、T237F、T237Q、T237R、T237Y，其突变位点是237位的苏氨酸(Thr)；以及5个双点突变体，分别为G40D/T237R、G40E/T237R、G40W/T237R、G40R/T237D、G40R/T237E，其双点突变体的突变位点是237位的苏氨酸(Thr)和40位的甘氨酸(Gly)。
利用QuikChange Primer Design在线网页(https://www.agilent.com/store/
primerDesignProgram.jsp)设计上述突变体的正反向引物(如表1所示)。
表1 正反向引物序列
以含有海洋链霉菌脂肪酶MAS1野生型质粒pET22b(+)(采用常规的质粒构建方法构建而得)为模板，使用重叠延伸PCR进行扩增。所述重叠延伸PCR的反应体系如表2(单点突变体)和表3(双点突变体)所示，反应程序如表4所示。
表2 反应体系
表3 反应体系
表4 反应程序
PCR扩增结束后，获得含有单点突变体T237A、T237E、T237F、T237Q、T237R、T237Y以及双点突变体G40D/T237R、G40E/T237R、G40W/T237R、G40R/T237D、G40R/T237E的质粒，并用Dpn I消化野生型质粒模板。
实施例2海洋链霉菌脂肪酶及其突变体的重组表达及纯化
包括以下步骤：
(1)、大肠杆菌表达工程菌的构建
将实施例1中构建的突变体质粒转化大肠杆菌DH5α(DE3)中，涂布于含有AMP抗性(终浓度为100 mg/mL)的LB平板过夜培养。待其长出后，挑取3-5个转化子，进行测序。将测序正确的转化子扩增培养后，使用生工生物工程(上海)股份有限公司的质粒提取试剂盒提取质粒，将载体转化至表达菌株大肠杆菌BL21(DE3)，涂布于含有AMP抗性的平板过夜培养。
(2)、种子液制备
挑取上述平板中的单菌落接种到5 mL含AMP(终浓度为100 mg/mL)抗性的LB培养基中，37℃，200 rpm过夜培养后，转接至装有150 mL含AMP(终浓度为100 mg/mL)抗性的LB液体培养基中，37℃，200 rpm培养至对数生长期时。
(3)、发酵罐发酵
将上述种子液接种到5L发酵罐中，通过调节温度、pH、溶氧、转速以及补料速率，在其达到对数生长期时添加IPTG并降温至25℃进行诱导。
(4)、粗酶液的制备
发酵16-24 h后，将菌液在4℃下，12000 rpm，离心20 min，弃上清液。使用40 mM咪唑浓度平衡缓冲液(Buffer A)将菌体重悬，使用低温超高压连续细胞破碎仪将菌体高压破碎(1024 Bra，4次循环)。待破碎完成后将样品12000 rpm，4℃冷冻离心10 min，上清液经0.45μm滤膜过滤后置于冰上备用。
(5)、蛋白纯化
将Ni Sepharose 6 NTA FF预装金属螯合层析柱依次用超纯水和Buffer A冲洗至A280和电导率平衡后，把步骤(4)的粗酶液样品以1 mL/min的流速上样，然后继续用BufferA冲洗层析柱至平衡。最后使用300mM咪唑浓度洗脱缓冲液(Buffer B)将目的蛋白洗脱，并收集洗脱液。样品的纯度由SDS-PAGE检测，结果见图2和图3。由图2和图3可知，野生型和所有的突变体蛋白分子量均为29 kDa左右，与理论分子量一致，说明所有的突变体均已在大肠杆菌中成功表达。
再将Hiprep 26/10 Desalting预装脱盐柱依次用超纯水和20 mM，pH 7.0的磷酸盐缓冲液冲洗至A280和电导率平衡后，以3 mL/min的流速将经过亲和层析纯化的样品上样并继续使用该缓冲液冲洗至蛋白洗脱，收集洗脱液。洗脱液中蛋白浓度采用Bradford蛋白浓度测定试剂盒进行测定，确定浓度。
(6)、冻干酶粉制备
将上述纯化后的部分突变体酶液用10 kDa超滤离心管浓缩至一定的浓度后，置于冻干机中进行冻干，收集酶粉，4℃保存备用。
实施例3海洋链霉菌脂肪酶及其突变体酯化合成甘油酯
称取5g底物(甘油与油酸摩尔比为1:3)于10mL具塞三角瓶中，添加1mg的脂肪酶(实施例2制备的各种脂肪酶突变体以及海洋链霉菌脂肪酶)后，将其置于65℃的恒温油浴磁力搅拌器中反应，转速为200 rpm，于不同的反应时间(1、3、6、9、12、24 h)提取油样，使用配备有Waters示差检测器的HPLC测定甘油酯和脂肪酸含量。步骤如下：
(1)、样品的制备
将50 µL样品溶于1 mL流动相(体积比21:1:0.003的正己烷、异丙醇和甲酸混合液)中，混匀后用无水硫酸钠除水，于转速为12,000 rpm的离心机高速离心2 min后进行液相色谱分析。
(2)、检测条件
色谱柱为Phenomenex Luna 5u Silica(2)100A(250 mm×4.60 mm)，柱温为 30℃，流速为1 mL/min，进样量为10 µL。
各种物质的出峰顺序为：甘油三酯(TAG)，脂肪酸(FFA)，1,3-甘油二酯(1,3-DAG)，1,2-甘油二酯(1,2-DAG)，甘油单酯(MAG)，各种组分的区分是通过利用标准品进行定性的，其含量是按照面积归一化法进行计算的。
反应达到平衡后，统计结果，如图4和表5所示。
表5 海洋链霉菌脂肪酶及其突变体合成甘油酯组分的相对含量
从表5可知，除了双突变体脂肪酶G40W/T237R、G40R/T237D、G40R/T237E的酯化率未达到50%，其他脂肪酶突变体的酯化率均超过50%。与WT相比，所有脂肪酶突变体生成甘油二酯和甘油三酯的比例(DAG/TAG)均有所提高。
其中，双突变体脂肪酶G40D/T237R的酯化率达到53.18%，偏甘油酯的含量为46.4%(野生型为36.14%)，偏甘油酯/甘油三酯的比例可达到7.51，相比于野生型的1.21，是其6.21倍。
实施例4海洋链霉菌脂肪酶突变体的固定化酶的制备
包括以下步骤：
1、称取5 g树脂ECR8806于500 mL的锥形瓶中，加入100 mg(50 mL)纯化后的突变体脂肪酶MAS1-G40D/T237R，置于恒温摇床中(30℃、150 rpm)震荡吸附8 h倒入布氏漏斗中进行抽滤，滤去上清液，得到固定化酶；
2、用与液体酶相同的缓冲液(20 mM，pH 7.0的磷酸盐缓冲液)冲洗固定化酶，直至清洗后的滤液中检测不出蛋白；
3、将固定化酶平铺于筛网中，置于真空干燥箱中，35℃干燥8 h，即得。
实施例5海洋链霉菌脂肪酶突变体的固定化酶制备偏甘油酯的反应条件优化
采用单因素实验探究反应温度(55℃，60℃，65℃，70℃，75℃，80℃)、底物摩尔比(1：4，1：3，1：2，1：1，2：1，3：1)、加酶量(0.5%，1%，2%，3%，4%，5%(w/w))对固定化脂肪酶MAS1-G40D/T237R酯化合成偏甘油酯量以及酯化率的影响，以确定最佳的反应条件。
按实施例3的步骤进行实验，结果分别如图5~7所示。
从图5~7结果可知，对脂肪酶突变体进行固定化后，固定化酶最适反应温度为65℃，最适反应底物摩尔比为1:1，最适加酶量为2%(w/w)。
在底物摩尔比1:1，反应温度65℃，加酶量2%(w/w)的条件下反应时间为24 h，油酸的转化率可达90.29%，偏甘油酯的含量为70.82%。
实施例6海洋链霉菌脂肪酶突变体的固定化酶的重复利用性试验
在实施例5的最优反应条件下，利用固定化脂肪酶MAS1-G40D/T237R催化甘油和油酸酯化反应，反应24h后，将反应体系中的物质置于离心机中10000 rpm离心3 min，去除上层油相，再加入反应体系物质总量3倍体积的正己烷清洗下层未反应的甘油以及酶，1000rpm离心3 min去除清洗后的正己烷，重复清洗三次，然后使用氮气吹入清洗干净的底物和酶的表面，将其残余的正己烷挥发干净。即可用于下一个含有新油酸的反应中，新的循环反应加入的甘油量需要减去剩余的甘油量，保持每个反应中甘油与油酸的摩尔比相同，置于最适反应条件下反应24 h。
将第一次反应后产物中油酸的转化率定为100%，之后每循环反应一次，测定油酸转化率，并除以第一次循环的转化率。以此来评价固定化脂肪酶的重复利用性。
结果如图8所示，从图8可知，海洋链霉菌脂肪酶突变体的固定化酶在重复使用5次后，仍能保持90%以上的酶活力。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 华南理工大学
<120> 海洋链霉菌脂肪酶突变体及其应用
<130> 1
<160> 26
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 798
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gccacggcca cggccgccac gccagctgct gaggctactt cccgaggttg gaacgactat 60
tcttgtaagc cctctgctgc ccatcctaga cctgttgttc ttgtacatgg caccttcggt 120
aactcaattg acaactggct tgttttggct ccatacttgg taaatagagg ttactgcgtc 180
ttttctctgg actacggtca acttcctggt gttccattct ttcatggact tggtcctatc 240
gacaagtccg ccgaacaatt ggacgttttc gttgataagg tactagacgc cactggagcc 300
cccaaggctg atctggtcgg tcacagtcaa ggtggtatga tgccaaacta ctacctgaaa 360
ttcttaggag gggcagataa ggttaacgca ttggttggaa tagctccaga taatcacggc 420
accactttac taggcctaac taaattgtta ccctttttcc caggggttga aaaatttatt 480
tctgacaata ccccagggtt agcagaccaa gtcgctggtt ccccttttat tacaaaattg 540
acagccggag gtgatactgt gccaggagtt agatacaccg tcattgcaac taaatatgat 600
caggtggtta caccttatcg tactcagtat ttggatggac ctaacgtcag aaatgtcttg 660
ctgcaggatc tttgtccagt ggatttgtca gaacacgtag ccatcggaac tatcgatagg 720
atagcttttc atgaggtggc taatgcactg gatccagcta gagcaacacc tacaacctgt 780
gcttctgtga ttggctga 798
<210> 2
<211> 265
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Ala Thr Ala Thr Ala Ala Thr Pro Ala Ala Glu Ala Thr Ser Arg Gly
1 5 10 15
Trp Asn Asp Tyr Ser Cys Lys Pro Ser Ala Ala His Pro Arg Pro Val
20 25 30
Val Leu Val His Gly Thr Phe Gly Asn Ser Ile Asp Asn Trp Leu Val
35 40 45
Leu Ala Pro Tyr Leu Val Asn Arg Gly Tyr Cys Val Phe Ser Leu Asp
50 55 60
Tyr Gly Gln Leu Pro Gly Val Pro Phe Phe His Gly Leu Gly Pro Ile
65 70 75 80
Asp Lys Ser Ala Glu Gln Leu Asp Val Phe Val Asp Lys Val Leu Asp
85 90 95
Ala Thr Gly Ala Pro Lys Ala Asp Leu Val Gly His Ser Gln Gly Gly
100 105 110
Met Met Pro Asn Tyr Tyr Leu Lys Phe Leu Gly Gly Ala Asp Lys Val
115 120 125
Asn Ala Leu Val Gly Ile Ala Pro Asp Asn His Gly Thr Thr Leu Leu
130 135 140
Gly Leu Thr Lys Leu Leu Pro Phe Phe Pro Gly Val Glu Lys Phe Ile
145 150 155 160
Ser Asp Asn Thr Pro Gly Leu Ala Asp Gln Val Ala Gly Ser Pro Phe
165 170 175
Ile Thr Lys Leu Thr Ala Gly Gly Asp Thr Val Pro Gly Val Arg Tyr
180 185 190
Thr Val Ile Ala Thr Lys Tyr Asp Gln Val Val Thr Pro Tyr Arg Thr
195 200 205
Gln Tyr Leu Asp Gly Pro Asn Val Arg Asn Val Leu Leu Gln Asp Leu
210 215 220
Cys Pro Val Asp Leu Ser Glu His Val Ala Ile Gly Thr Ile Asp Arg
225 230 235 240
Ile Ala Phe His Glu Val Ala Asn Ala Leu Asp Pro Ala Arg Ala Thr
245 250 255
Pro Thr Thr Cys Ala Ser Val Ile Gly
260 265
<210> 3
<211> 798
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gccacggcca cggccgccac gccagctgct gaggctactt cccgaggttg gaacgactat 60
tcttgtaagc cctctgctgc ccatcctaga cctgttgttc ttgtacatgg caccttcgat 120
aactcaattg acaactggct tgttttggct ccatacttgg taaatagagg ttactgcgtc 180
ttttctctgg actacggtca acttcctggt gttccattct ttcatggact tggtcctatc 240
gacaagtccg ccgaacaatt ggacgttttc gttgataagg tactagacgc cactggagcc 300
cccaaggctg atctggtcgg tcacagtcaa ggtggtatga tgccaaacta ctacctgaaa 360
ttcttaggag gggcagataa ggttaacgca ttggttggaa tagctccaga taatcacggc 420
accactttac taggcctaac taaattgtta ccctttttcc caggggttga aaaatttatt 480
tctgacaata ccccagggtt agcagaccaa gtcgctggtt ccccttttat tacaaaattg 540
acagccggag gtgatactgt gccaggagtt agatacaccg tcattgcaac taaatatgat 600
caggtggtta caccttatcg tactcagtat ttggatggac ctaacgtcag aaatgtcttg 660
ctgcaggatc tttgtccagt ggatttgtca gaacacgtag ccatcggaag gatcgatagg 720
atagcttttc atgaggtggc taatgcactg gatccagcta gagcaacacc tacaacctgt 780
gcttctgtga ttggctga 798
<210> 4
<211> 265
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Ala Thr Ala Thr Ala Ala Thr Pro Ala Ala Glu Ala Thr Ser Arg Gly
1 5 10 15
Trp Asn Asp Tyr Ser Cys Lys Pro Ser Ala Ala His Pro Arg Pro Val
20 25 30
Val Leu Val His Asp Thr Phe Gly Asn Ser Ile Asp Asn Trp Leu Val
35 40 45
Leu Ala Pro Tyr Leu Val Asn Arg Gly Tyr Cys Val Phe Ser Leu Asp
50 55 60
Tyr Gly Gln Leu Pro Gly Val Pro Phe Phe His Gly Leu Gly Pro Ile
65 70 75 80
Asp Lys Ser Ala Glu Gln Leu Asp Val Phe Val Asp Lys Val Leu Asp
85 90 95
Ala Thr Gly Ala Pro Lys Ala Asp Leu Val Gly His Ser Gln Gly Gly
100 105 110
Met Met Pro Asn Tyr Tyr Leu Lys Phe Leu Gly Gly Ala Asp Lys Val
115 120 125
Asn Ala Leu Val Gly Ile Ala Pro Asp Asn His Gly Thr Thr Leu Leu
130 135 140
Gly Leu Thr Lys Leu Leu Pro Phe Phe Pro Gly Val Glu Lys Phe Ile
145 150 155 160
Ser Asp Asn Thr Pro Gly Leu Ala Asp Gln Val Ala Gly Ser Pro Phe
165 170 175
Ile Thr Lys Leu Thr Ala Gly Gly Asp Thr Val Pro Gly Val Arg Tyr
180 185 190
Thr Val Ile Ala Thr Lys Tyr Asp Gln Val Val Thr Pro Tyr Arg Thr
195 200 205
Gln Tyr Leu Asp Gly Pro Asn Val Arg Asn Val Leu Leu Gln Asp Leu
210 215 220
Cys Pro Val Asp Leu Ser Glu His Val Ala Ile Gly Arg Ile Asp Arg
225 230 235 240
Ile Ala Phe His Glu Val Ala Asn Ala Leu Asp Pro Ala Arg Ala Thr
245 250 255
Pro Thr Thr Cys Ala Ser Val Ile Gly
260 265
<210> 5
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
agctatccta tcgatagctc cgatggctac gtgtt 35
<210> 6
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
aacacgtagc catcggagct atcgatagga tagct 35
<210> 7
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
catgaaaagc tatcctatcg atctctccga tggctacgtg ttctgac 47
<210> 8
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gtcagaacac gtagccatcg gagagatcga taggatagct tttcatg 47
<210> 9
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
gaaaagctat cctatcgata aatccgatgg ctacgtgttc tg 42
<210> 10
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
cagaacacgt agccatcgga tttatcgata ggatagcttt tc 42
<210> 11
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
catgaaaagc tatcctatcg atctgtccga tggctacgtg ttctgac 47
<210> 12
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
gtcagaacac gtagccatcg gacagatcga taggatagct tttcatg 47
<210> 13
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
aaagctatcc tatcgatcct tccgatggct acgtgttctg a 41
<210> 14
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
tcagaacacg tagccatcgg aaggatcgat aggatagctt t 41
<210> 15
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
gaaaagctat cctatcgata tatccgatgg ctacgtgttc tg 42
<210> 16
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
cagaacacgt agccatcgga tatatcgata ggatagcttt tc 42
<210> 17
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
gaaaagctat cctatcgata tctccgatgg ctacgtgttc tg 42
<210> 18
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
cagaacacgt agccatcgga gatatcgata ggatagcttt tc 42
<210> 19
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
ccagttgtca attgagttat cgaaggtgcc atgtacaag 39
<210> 20
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
cttgtacatg gcaccttcga taactcaatt gacaactgg 39
<210> 21
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
gccagttgtc aattgagttc tcgaaggtgc catgtacaag 40
<210> 22
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
cttgtacatg gcaccttcga gaactcaatt gacaactggc 40
<210> 23
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
agttgtcaat tgagttacgg aaggtgccat gtacaag 37
<210> 24
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
cttgtacatg gcaccttccg taactcaatt gacaact 37
<210> 25
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
gccagttgtc aattgagttc cagaaggtgc catgtacaag a 41
<210> 26
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
tcttgtacat ggcaccttct ggaactcaat tgacaactgg c 41

Claims (8)

1.一种海洋链霉菌脂肪酶突变体，其特征在于，所述海洋链霉菌脂肪酶突变体的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
2.权利要求1所述的海洋链霉菌脂肪酶突变体的固定化酶。
3.权利要求1所述的海洋链霉菌脂肪酶突变体、或权利要求2所述的固定化酶在以甘油和油酸为底物制备偏甘油酯中的应用。
4.一种插入有权利要求1所述海洋链霉菌脂肪酶突变体的编码基因的重组表达载体。
5.一种转入有权利要求4所述的重组表达载体的重组工程菌株。
6.权利要求4所述的重组表达载体、或权利要求5所述的重组工程菌株在以甘油和油酸为底物制备偏甘油酯中的应用。
7.一种海洋链霉菌脂肪酶突变体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将权利要求5所述的重组工程菌株进行表达、纯化，即得。
8.一种制备偏甘油酯的方法，其特征在于，使用权利要求1所述的海洋链霉菌脂肪酶突变体或权利要求2所述的固定化酶，催化油酸与甘油发生酯化反应。
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Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103952385A (zh) * 2014-04-30 2014-07-30 华南理工大学 一种来源于海洋放线菌的热稳定脂肪酶及其应用
CN110468117A (zh) * 2019-09-07 2019-11-19 华南理工大学 一种有机溶剂耐受的脂肪酶突变体及其应用
CN110540980A (zh) * 2019-09-07 2019-12-06 华南理工大学 一种海洋链霉菌脂肪酶突变体及其应用
CN110540979A (zh) * 2019-09-07 2019-12-06 华南理工大学 一种双氧水耐受的脂肪酶突变体及其应用
CN112592909A (zh) * 2020-09-30 2021-04-02 广州永华特医营养科技有限公司 一种甘油酯脂肪酶smg1突变体及其编码基因与应用

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB0905367D0 (en) * 2009-03-27 2009-05-13 Danisco Method
US20200255813A1 (en) * 2017-07-09 2020-08-13 Igc Bio, Inc. Pross optimized enzymes

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103952385A (zh) * 2014-04-30 2014-07-30 华南理工大学 一种来源于海洋放线菌的热稳定脂肪酶及其应用
CN110468117A (zh) * 2019-09-07 2019-11-19 华南理工大学 一种有机溶剂耐受的脂肪酶突变体及其应用
CN110540980A (zh) * 2019-09-07 2019-12-06 华南理工大学 一种海洋链霉菌脂肪酶突变体及其应用
CN110540979A (zh) * 2019-09-07 2019-12-06 华南理工大学 一种双氧水耐受的脂肪酶突变体及其应用
CN112592909A (zh) * 2020-09-30 2021-04-02 广州永华特医营养科技有限公司 一种甘油酯脂肪酶smg1突变体及其编码基因与应用

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Zhao Z et al..Crystal structure of a lipase from Streptomyces sp. strain W007 - implications for thermostability and regiospecificity.FEBS J.2017,第284卷(第20期),第3506-3519页. *
Zhao Z et al..Structural Basis for the Regiospecificity of a Lipase from Streptomyces sp. W007.Int J Mol Sci.2022,第23卷(第10期),第1-13页. *
赵泽鑫.基于结构信息和生物计算的MAS1和PCL脂肪酶分子改造研究.中国博士学位论文全文数据库 基础科学辑 2021年.2021,(第02期),第9页最后一段，第13页第1段，第16页最后一段，第44页最后两段和第45页前三行. *

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