CN110694064B - 一种具有抗菌功能的自激发级联反应金属有机框架纳米粒子的制备方法 - Google Patents

一种具有抗菌功能的自激发级联反应金属有机框架纳米粒子的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种具有抗菌功能的自激发级联反应金属有机框架纳米粒子的制备方法。将氨基对苯二甲酸和六水合氯化铁溶解于乙醇中，加热一段时间后得到金属有机框架粒子，再将该粒子分散到水中，同时加入氨基对苯二甲酸、六水合氯化铁和葡萄糖氧化酶，加热一段时间，从而得到包埋有葡萄糖氧化酶的金属有机框架纳米粒子，该粒子可以催化葡萄糖通过级联反应生成高活性的羟基自由基，具有很好的抗菌性能。本发明制备方法简单，材料来源广泛，得到的具有自激发级联反应金属有机框架纳米粒子具有良好的稳定性和杀死耐药菌等特点，具有良好应用前景。

Description

一种具有抗菌功能的自激发级联反应金属有机框架纳米粒子 的制备方法
技术领域
本发明属于抗菌纳米材料制备领域，涉及一种具有抗菌功能的自激发级联反应金属有机框架纳米粒子的制备方法。
背景介绍
纳米酶是一类具有类似天然酶生物催化能力的纳米材料。模拟过氧化物酶的纳米酶是其中重要的一类，有着广泛的应用前景。这一类纳米酶以磁性纳米粒子为代表，除此以外还有五氧化二钒(V2O5)，硫化铜(CuS)，金(Au)，氧化石墨烯(GO)等。在这类纳米酶中，相当一部分的机理涉及到高毒性的羟基自由基的产生，因而也为该类材料带来广泛的生物应用，比如抗菌，抗癌等。值得注意的是，部分金属有机框架纳米粒子同样具有类似过氧化物酶的催化活性，比如已经报道的Materials of Institute Lavoisier(MIL)系列，PorousCoordination Network(PCN)系列等。但其在抗菌领域却少有应用，特别是MIL粒子，由于其配为中心是铁离子，可以通过芬顿反应高效地产生羟基自由基，具有潜在的应用前景。
虽然目前报道了很多模拟过氧化物酶纳米粒子对抗耐药细菌，但通常并不能发挥其最大的活性。这主要是由于该类纳米酶大多在pH＝3-4这个范围才具有最高活性，而且发生细菌感染的部位，通常pH值并不会变得很低，接近中性。其次，往往需要额外添加大量的双氧水才能使得其产生足够的羟基自由基对抗细菌，但也会对正常组织产生强烈的毒性，大量的双氧水也使得体系不易控制。因此，设计一种催化活性高、细胞毒性小的过氧化物酶纳米粒子具有重要意义。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供一种具有抗菌功能的自激发级联反应金属有机框架纳米粒子的制备方法。本发明制备的负载葡萄糖氧化酶的金属有机框架纳米粒子可以自激发级联反应，达到杀死耐药菌的目的，同时降低其生物毒性。
本发明采用以下技术方案实现：
一种具有抗菌功能的自激发级联反应金属有机框架纳米粒子的制备方法，包括以下步骤：
1)将有机配体和六水合氯化铁(FeCl3·6H2O)溶解于乙醇中，使其浓度分别为0.9-3.6mg/mL以及1.35-5mg/mL，于40℃-60℃水浴中静置反应1h-3h。反应结束后离心去除上清液，加入乙醇洗涤粒子3次。
2)将步骤1)所得的金属有机框架粒子分散到水中,加入有机配体，FeCl3·6H2O以及葡萄糖氧化酶(GOx)使其浓度分别为0.9-3.6mg/mL，1.35-5mg/mL以及0.5-2.5mg/mL，于35℃-45℃静置反应1h-3h，反应结束后离心去除上清液，加入水洗涤粒子3次从而得到自激发级联反应金属有机框架纳米粒子。
上述技术方案中，进一步地，所述的有机配体是对苯二甲酸或氨基对苯二甲酸。
本发明的原理是：在本发明抗菌功能的自激发级联反应金属有机框架纳米粒子的制备方法中，由于有机配体难溶于水，故步骤2)无法直接得到本发明的粒子，但可以在步骤1)得到的粒子表面缓慢生长，从而实现葡萄糖氧化酶(GOx)的负载并最终得到级联反应金属有机框架纳米粒子。葡萄糖氧化酶可以将葡萄糖转化成双氧水，同时伴随着葡萄糖酸的产生，降低pH值，激发含铁的金属有机框架纳米粒子产生高的芬顿反应活性，利用双氧水高效反应产生羟基自由基，羟基自由基具有非常高的氧化能力，会对细菌的磷脂、蛋白质以及DNA等生物大分子进行氧化，从而达到杀死细菌的目的。
本发明的有益效果在于：
原料来源广泛，制备过程简单可控，可以放大规模；可以自发产生低pH环境，激发含铁金属有机框架纳米粒子的高芬顿反应活性，可以在细菌感染下利用无毒的葡萄糖高效产生羟基自由基杀灭细菌；产生的羟基自由基对耐药菌也具有很强的杀伤作用，在预防细菌感染方面具有良好的应用前景。
葡萄糖氧化酶一方面催化葡萄糖提供双氧水，进而产生羟基自由基；另一方面可以产生葡萄糖酸减低pH值来激发纳米酶的催化活性。因此，本发明制备的负载葡萄糖氧化酶的金属有机框架纳米粒子可以自激发级联反应，达到杀死耐药菌的目的，同时降低其生物毒性。
附图说明
图1a)是不负载GOx的金属有机框架纳米粒子的扫描电镜照片，b)是负载有GOx的自激发级联反应金属有机框架纳米粒子的扫描电镜照片。
图2a)是自激发级联反应金属有机框架纳米粒子的反应活性与pH值的关系，b)是该粒子的反应活性与温度的关系。
图3)是自激发级联反应金属有机框架纳米粒子以及葡萄糖在PBS中反应导致的pH变化。
图4是利用二甲基吡啶氮氧化物检测自激发级联反应金属有机框架纳米粒子在酸性和中性两个条件下的羟基自由基的生成情况。
图5是自激发级联反应金属有机框架纳米粒子的抗菌情况。
图6是自激发级联反应金属有机框架纳米粒子抑制菌膜形成作用的结晶紫染色结果。
图7是自激发级联反应金属有机框架纳米粒子抑制菌膜形成作用的扫描电镜图。
具体实施方式
以下结合实例进一步说明本发明，但这些实例并不用来限制本发明。
实施例1
1)将氨基对苯二甲酸和六水合氯化铁(FeCl3·6H2O)溶解于乙醇中，使其浓度分别为0.9mg/mL以及1.35mg/mL，于40℃水浴中静置反应1.5h。反应结束后离心去除上清液，加入乙醇洗涤粒子3次，扫描电镜照片见图1a。
2)将步骤1)所得的金属有机框架粒子分散到水中,加入有机配体，FeCl3·6H2O以及GOx使其浓度分别为0.9mg/mL，1.35mg/mL以及0.5mg/mL，于40℃静置反应1h，反应结束后离心去除上清液，加入水洗涤粒子3次从而得到自激发级联反应金属有机框架纳米粒子。
实施例2
步骤同实施例1，但在步骤1)中用对苯二甲酸代替氨基对苯二甲酸，成功制得了自激发级联反应金属有机框架纳米粒子。
实施例3
步骤同实施例1，但在步骤1)中用均苯三甲酸代替氨基对苯二甲酸，成功制得了自激发级联反应金属有机框架纳米粒子。
本发明方法制备的具有抗菌功能的自激发级联反应金属有机框架纳米粒子的电镜照片见图1b。图1a为不负载GOx的金属有机框架纳米粒子的扫描电镜照片。从图中可知，负载GOx前后粒子形态均为梭形，但负载GOx后粒子粒径更加均匀。
图2a)是自激发级联反应金属有机框架纳米粒子的反应活性与pH值的关系，b)是该粒子的反应活性与温度的关系。从图中可知，该粒子在pH＝4以及37℃具有最优的级联反应活性。
为验证自激发级联反应金属有机框架纳米粒子的自激发功能，测定该粒子以及葡萄糖在PBS中反应导致的pH变化，将40μg/mL的自激发级联反应金属有机框架纳米粒子以及10mM葡萄糖加入0.5mM的磷酸缓冲液，测其pH值随时间的变化，其结果见图3。从图中可知，在4h内，该粒子可以将pH值由中性降低到4左右。
利用一种特异性检测羟基自由基的试剂二甲基吡啶氮氧化物来检测该粒子在酸性和中性条件下生成羟基自由基的情况，粒子浓度为30μg/mL，葡萄糖浓度为30mmol/L，二甲基吡啶氮氧化物的浓度为30mmol/L，粒子先与葡萄糖反应30分钟，再加入二甲基吡啶氮氧化物反应8分钟，结果见图4。从图中可知，该粒子在pH＝4的条件下最终反应得到羟基自由基，而在中性条件下则不会产生。
为检测该粒子抗菌性能，将其与耐甲氧西林金黄葡萄球菌共培养5h后，通过稀释涂板计数测定细菌数量，以不负载葡萄糖氧化酶的粒子(MIL@MIL)作为对照，培养基中葡萄糖浓度为12.5mmol/L，粒子的浓度为5,10,20,40,60，80μg/mL，耐甲氧西林金黄葡萄球菌的初始浓度为106cfu/mL，抗菌结果见图5。从图中可知，5μg/mL的该粒子便可以显著地杀伤耐药菌。
为检测该微球抑制菌膜形成的作用，将粒子与耐甲氧西林金黄葡萄球菌共培养48h，培养基中葡萄糖浓度为12.5mmol/L，粒子浓度为80μg/mL，耐甲氧西林金黄葡萄球菌的初始浓度为106cfu/mL，培养时间为48h，结晶紫染色结果见图6b，扫描电镜图片见图7b，以不加粒子为空白，其结晶紫染色结果见图6a，扫描电镜图片见图7a。由图6和图7都可以证明该粒子可以显著地抑制耐药细菌生物膜的形成。

Claims (3)

1.一种具有抗菌功能的自激发级联反应金属有机框架纳米粒子的制备方法，包括以下步骤：
1)将有机配体和FeCl3·6H2O溶解于乙醇中，使其浓度分别为0.9-3.6mg/mL和1.35-5mg/mL，于40℃-60℃水浴中静置反应1h-3h，反应结束后离心去除上清液，加入乙醇洗涤粒子，离心去除上清液得到金属有机框架粒子；
2)将步骤1)所得的金属有机框架粒子分散到水中,加入有机配体，FeCl3·6H2O以及葡萄糖氧化酶(GOx)使其浓度分别为0.9-3.6mg/mL，1.35-5mg/mL以及0.5-2.5mg/mL，于35℃-45℃静置反应1h-3h，反应结束后离心去除上清液，加入水洗涤粒子，离心去除上清液从而得到级联反应金属有机框架纳米粒子。
2.根据权利要求1所述的具有抗菌功能的自激发级联反应金属有机框架纳米粒子的制备方法，其特征在于，所述的有机配体是对苯二甲酸、氨基对苯二甲酸或者均苯三甲酸。
3.一种具有抗菌功能的自激发级联反应金属有机框架纳米粒子，其特征在于，采用如权利要求1或2所述的方法制备得到。
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