CN112403411B - 自组装纳米颗粒、自组装复合纳米颗粒及制备方法和应用 - Google Patents

自组装纳米颗粒、自组装复合纳米颗粒及制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种自组装纳米颗粒、自组装复合纳米颗粒及制备方法和应用，属于纳米材料技术领域。所述的自组装纳米颗粒是由亚铁离子(Fe2+)与核苷酸在水溶液中通过配位作用自组装形成。所述的制备方法是将Fe2+溶液加入到核苷酸溶液中，得到的混合溶液孵育反应，离心去除上清液，加水洗涤沉淀并离心去除上清液，得到所述自组装纳米颗粒。所述的自组装纳米颗粒，不仅具有过氧化物酶的模拟活性，可以催化过氧化氢生成羟基自由基，而且能够包埋负载生物酶，得到一种自组装复合纳米颗粒。本发明所需试剂简单易得，制备方法操作方便，条件温和易控，便于大规模生产，有良好的应用前景。

Description

自组装纳米颗粒、自组装复合纳米颗粒及制备方法和应用
技术领域
本发明属于纳米材料技术领域，具体涉及一种自组装纳米颗粒、自组装复合纳米颗粒及制备方法和应用。
背景技术
天然酶是具有催化活性的一系列特殊有机物，不仅在生命体中发挥着重要作用，而且在生物化工、疾病诊疗、食品与环境等领域都有着广泛的应用前景。然而大多数天然酶是由蛋白质组成，容易受环境影响而变性失活，因此其制备、纯化和储存的工艺繁琐，成本较高，限制了天然酶的应用范围。
纳米酶是一种以纳米材料为基础的人工酶，具有成本低、适合大规模生产、稳定性高等优点，在许多领域能够替代天然酶进行催化作用。包括贵金属、金属氧化物和金属有机骨架等多种纳米材料，已经被证实具有模拟酶性质，尤其是模拟过氧化物酶的催化活性。同时，由于纳米材料的可修饰性与组装行为，可被视为天然酶等生物大分子固定化的理想载体材料，保护生物大分子的功能，提高酶催化反应效率和稳定性等等。然而目前，大多数纳米酶和纳米载体的制备都涉及复杂的制备纯化过程、严苛的实验条件以及对有毒有机溶剂的使用。另外，由于一种纳米材料往往只具有单一功能，为了将多种生物催化转化结合起来，实现复合生物材料的协同传感、抗菌、治疗等多种功能，通常需要多步复合构建及后修饰对不同纳米材料或生物材料进行调控组装。因此，开发出简单有效的纳米材料合成方法，用于制备一种同时兼具纳米酶催化功能和纳米载体封装功能的纳米材料是很有必要的，基于这种方法制备的纳米材料将具有更好的应用前景。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术的不足，提供一种制备原料来源广泛、工艺简单、条件温和易控的自组装纳米颗粒、自组装复合纳米颗粒及制备方法和应用。
为了实现上述目的，本发明的技术方案具体如下：
本发明提供一种自组装纳米颗粒，其是由亚铁离子(Fe2+)与核苷酸通过配位作用自组装形成的纳米颗粒。
在上述技术方案中，优选的是：所述核苷酸为鸟苷-5'-单磷酸(GMP)盐、2'-脱氧鸟苷-5'-单磷酸(dGMP)盐、鸟苷-5'-二磷酸(GDP)盐、腺苷-5'-单磷酸(AMP)盐、尿苷-5'-单磷酸(UMP)盐或肌苷-5'-单磷酸(IMP)盐。
本发明还提供一种自组装纳米颗粒的制备方法，包括以下步骤：
将Fe2+溶液加入到核苷酸溶液中，得到的混合溶液孵育反应，离心去除上清液，加水洗涤沉淀并离心去除上清液，得到所述自组装纳米颗粒。
在上述技术方案中，优选的是：所述混合溶液中，Fe2+溶液浓度为0.1～100mM，核苷酸溶液浓度为0.1～100mM，Fe2+与核苷酸的摩尔比为(0.1-100)：1。进一步优选的是：所述混合溶液中，Fe2+溶液浓度为10mM，核苷酸溶液浓度为10mM，Fe2+与核苷酸的摩尔比为1：1。
在上述技术方案中，优选的是：所述孵育反应的温度为4～30℃，孵育反应的时间为10～100分钟。进一步优选的是：所述孵育反应的温度为20℃，孵育反应的时间为60分钟。
在上述技术方案中，优选的是：所述加水洗涤沉淀并离心的次数为1-5次。进一步优选的是：所述加水洗涤沉淀并离心的次数为2次。
本发明还提供一种自组装复合纳米颗粒，包括本发明所述的自组装纳米颗粒和生物酶。
在上述技术方案中，优选的是：所述生物酶为葡萄糖氧化酶。
本发明还还提供一种自组装复合纳米颗粒的制备方法，包括以下步骤：
将Fe2+溶液加入到核苷酸和生物酶混合溶液中，得到的混合溶液孵育反应，离心去除上清液，加水洗涤沉淀并离心去除上清液，得到所述自组装复合纳米颗粒。
在上述技术方案中，优选的是：所述混合溶液中，Fe2+溶液浓度为0.1～100mM，核苷酸溶液浓度为0.1～100mM，生物酶溶液浓度为0.1～10mg/mL。进一步优选的是：所述混合溶液中，Fe2+溶液浓度为10mM，核苷酸溶液浓度为10mM，生物酶溶液浓度为1mg/mL。
在上述技术方案中，优选的是：所述孵育反应的温度为4～30℃，时间为10～100分钟。进一步优选的是：所述孵育反应的温度为20℃，时间为60分钟。
在上述技术方案中，优选的是：所述加水洗涤沉淀并离心的次数为1-5次。进一步优选的是：所述加水洗涤沉淀并离心的次数为2次。
本发明还提供了一种上述技术方案中所述的自组装纳米颗粒在模拟过氧化物酶中的应用。
本发明还提供了一种上述技术方案所述的自组装纳米颗粒或自组装复合纳米颗粒在抗菌中的应用。
本发明的有益效果是：
本发明通过简单的一锅反应，将Fe2+与核苷酸配位结合，制备得到Fe2+-核苷酸自组装纳米颗粒，不仅具有模拟过氧化物酶的性质，可以催化过氧化氢生成羟基自由基，而且能够原位包埋负载生物酶，得到具有多重催化功能的自组装复合纳米颗粒。兼具催化功能和载体功能的Fe2+-核苷酸自组装纳米颗粒，在抵抗细菌感染等生物分析与诊疗领域具有良好的应用前景。
本发明对操作人员没有特殊技术要求，所需试剂为商业化产品且来源广泛，所需操作过程简单可控，容易掌握和重复，可以放大规模生产。
附图说明
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细说明。
图1为Fe2+-GMP自组装纳米颗粒的扫描电镜照片(A)和透射电镜照片(B)。
图2为Fe2+-GMP自组装纳米颗粒的X光电子能谱测试图。
图3为(A)Fe2+-GMP自组装纳米颗粒催化H2O2氧化TMB溶液在652nm的实时吸收值，(B)利用二甲基吡啶氮氧化物检测Fe2+-GMP自组装纳米颗粒催化H2O2生成羟基自由基的情况。
图4为负载葡萄糖氧化酶的Fe2+-GMP自组装复合纳米颗粒的扫描电镜照片(A)和透射电镜照片(B)。
图5为负载葡萄糖氧化酶的Fe2+-GMP自组装复合纳米颗粒级联催化氧化TMB溶液在652nm的实时吸收值。
图6为抗菌实验中(A)大肠杆菌和(B)金黄色葡萄球菌的存活率，(C)大肠杆菌和(D)金黄色葡萄球菌形成的菌落照片。
具体实施方式
下面将结合实施例与附图对本发明作进一步阐述，以下实施例仅为本发明的优选实施例，以便于更好地理解本发明，因而不应视为限定本发明的范围。所述方法均为常规方法，所述原料均能从公开商业途径获得。
实施例1
一种自组装纳米颗粒的制备方法与表征
将1mL FeCl2水溶液(20mM)加入到1mL鸟苷-5'-单磷酸(GMP)二钠盐水溶液(20mM)中，在常温(20℃)下混合均匀。静置反应60分钟后，转速13300g离心10分钟去除上清液，得到粗产品，加入2mL水重悬洗涤并离心两次，得到最终产物，为淡黄色固体。
对制备得到的自组装纳米颗粒进行表征分析。如图1所示，图1A是产物的扫描电镜照片，图1B是透射电镜照片，结果表明，Fe2+-GMP自组装产物是平均粒径在100纳米左右的纳米颗粒。如图2，Fe2+-GMP自组装纳米颗粒的X光电子能谱测试图中Fe 2p和Fe 3p谱峰位置表明，自组装纳米颗粒中铁元素的价态保持在二价Fe2+形式。
实施例2
步骤同实施例1，但用2'-脱氧鸟苷-5'-单磷酸(dGMP)二钠盐代替鸟苷-5'-单磷酸(GMP)二钠盐，成功制备自组装纳米颗粒。
实施例3
步骤同实施例1，但用鸟苷-5'-二磷酸(GDP)二钠盐代替鸟苷-5'-单磷酸(GMP)二钠盐，成功制备自组装纳米颗粒。
实施例4
步骤同实施例1，但用腺苷-5'-单磷酸(AMP)二钠盐代替鸟苷-5'-单磷酸(GMP)二钠盐，成功制备自组装纳米颗粒。
实施例5
步骤同实施例1，但用尿苷-5'-单磷酸(UMP)二钠盐代替鸟苷-5'-单磷酸(GMP)二钠盐，成功制备自组装纳米颗粒。
实施例6
步骤同实施例1，但用肌苷-5'-单磷酸(IMP)二钠盐代替鸟苷-5'-单磷酸(GMP)二钠盐，成功制备自组装纳米颗粒。
实施例7
自组装纳米颗粒模拟过氧化物酶催化性质的检测
在0.5mL醋酸钠缓冲液(NaAc，20mM，pH 4.0)加入0.2mL Fe2+-GMP自组装纳米颗粒(0.5mg/mL)和0.2mL 3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB,2mM)溶液。再加入0.1mL过氧化氢(H2O2，10mM)溶液，混合溶液立即用紫外可见吸收分光光度计动态监测652nm的吸收值(A652)。空白组步骤同上，但是用0.2mL H2O代替0.2mL Fe2+-GMP自组装纳米颗粒(0.5mg/mL)。实验结果如图3A所示，自组装纳米颗粒能够模拟过氧化物酶，催化H2O2氧化TMB使其显色。
利用特异性检测羟基自由基的试剂二甲基吡啶氮氧化物(DMPO)检测Fe2+-GMP自组装纳米颗粒催化H2O2生成羟基自由基的情况，Fe2+-GMP自组装纳米颗粒浓度为0.1mg/mL，DMPO的浓度为10mM，H2O2浓度为10mM,Fe2+-GMP自组装纳米颗粒先与H2O2反应30分钟，再加入DMPO反应5分钟。对照组直接在Fe2+-GMP自组装纳米颗粒中加入DMPO反应5分钟；空白组只含有DMPO溶液。电子自旋共振(ESR)结果如图3B所示，Fe2+-GMP自组装纳米颗粒能够催化H2O2生成羟基自由基，而对照组和空白组都没有羟基自由基。
实施例8
一种自组装复合纳米颗粒的制备方法与表征
将1mL FeCl2水溶液(20mM)加入到GMP(20mM)和葡萄糖氧化酶(GOx，2mg/mL)的混合溶液中，在常温(20℃)下混合均匀。静置反应60分钟后，转速13300g离心10分钟去除上清液，得到粗产品，加入2mL水重悬洗涤并离心两次，得到最终产物，为淡黄色固体。
对制备得到的自组装复合纳米颗粒进行表征分析。如图4所示，图4A是GOx@Fe2+-GMP自组装复合纳米颗粒的扫描电镜照片，图4B是透射电镜照片，结果表明，GOx@Fe2+-GMP自组装产物是平均粒径在100纳米左右的纳米颗粒。
实施例9
GOx@Fe2+-GMP自组装复合纳米颗粒酶级联催化性质的检测
在0.5mL醋酸钠缓冲液(NaAc，20mM，pH 4.0)加入0.2mL GOx@Fe2+-GMP自组装复合纳米颗粒(0.5mg/mL)和0.2mL 3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB,2mM)溶液。再加入0.1mL葡萄糖(10mM)溶液，混合溶液立即用紫外可见吸收分光光度计动态监测652nm的吸收值(A652)。空白组步骤同上，但是用0.2mL H2O代替0.2mL GOx@Fe2+-GMP自组装复合纳米颗粒(0.5mg/mL)。实验结果如图5所示，GOx@Fe2+-GMP自组装复合纳米颗粒具有酶级联催化性质，其中GOx能够催化葡萄糖氧化，产生葡萄糖酸和H2O2，而Fe2+-GMP具有模拟过氧化物酶的性质，能够进一步催化H2O2氧化TMB使其显色。结果表明Fe2+-GMP自组装纳米颗粒不仅自身具有模拟酶的性质，而且可以原位包埋负载GOx，稳定GOx且保持酶活性，使模拟酶与生物酶的催化活性级联协同。
实施例10
自组装纳米颗粒和自组装复合纳米颗粒的抗菌性能检测
将大肠杆菌(E.coli)和金黄色葡萄球菌(S.aureus)的单菌落转移到液体LuriaBertani肉汤，37℃培养8小时，用液体培养基将细菌稀释至1×107CFU/mL，分别加入以下6组(I-VI)样品或对照组进行生长抑制研究：I)葡萄糖；II)Fe2+-GMP和葡萄糖；III)Fe2+-GMP和H2O2，IV)GOx@Fe2+-GMP，V)葡萄糖和GOx，VI)GOx@Fe2+-GMP和葡萄糖，37℃培养5小时，通过监测600nm(OD600)处的吸收值来评估细菌的浓度，通过稀释涂板计数测定细菌数量。其中，葡萄糖、GOx、H2O2、Fe2+-GMP和GOX@Fe2+-GMP的浓度分别为10mM、3.3μg/mL、2mM、10μg/mL和10μg/mL。抗菌结果如图6，Fe2+-GMP自组装纳米颗粒在H2O2存在下可以显著地杀伤细菌，而GOx@Fe2+-GMP自组装复合纳米颗粒在葡萄糖存在下可以显著地杀伤细菌，二者都具有明显的抗菌性能。
上述自组装纳米颗粒和自组装复合纳米颗粒的制备实施例中：混合溶液中Fe2+溶液浓度、核苷酸溶液浓度、生物酶溶液浓度；孵育反应的温度、时间，及加水洗涤沉淀并离心的次数均可以是前述限定范围内的任意值，均能够制备得到自组装颗粒或自组装复合纳米颗粒，这里不再一一举例。
还需要说明的是，本发明的具体实施例只是用来示例性说明，并不以任何方式限定本发明的保护范围，本领域的相关技术人员可以根据上述一些说明加以改进或变化，但所有这些改进和变化都应属于本发明权利要求的保护范围。

Claims (8)

1.一种自组装纳米颗粒，其特征在于，其是由亚铁离子（Fe2+）与核苷酸通过配位作用自组装形成的纳米颗粒；
所述核苷酸为鸟苷-5'-单磷酸盐、2'-脱氧鸟苷-5'-单磷酸盐、鸟苷-5'-二磷酸盐、腺苷-5'-单磷酸盐、尿苷-5'-单磷酸盐或肌苷-5'-单磷酸盐。
2.一种权利要求1所述的自组装纳米颗粒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
将Fe2+溶液加入到核苷酸溶液中，得到的混合溶液孵育反应，离心去除上清液，加水洗涤沉淀并离心去除上清液，得到所述自组装纳米颗粒。
3.根据权利要求2所述的自组装纳米颗粒的制备方法，其特征在于，
所述混合溶液中，Fe2+溶液浓度为0.1~100 mM，核苷酸溶液浓度为0.1~100 mM， Fe2+与核苷酸的摩尔比为（0.1-100）：1；
所述孵育反应的温度为4~30°C，孵育反应的时间为10~100分钟；
所述加水洗涤沉淀并离心的次数为1-5次。
4.一种自组装复合纳米颗粒，其特征在于，包括：权利要求1所述的自组装纳米颗粒和生物酶；
所述生物酶为葡萄糖氧化酶。
5.一种权利要求4所述的自组装复合纳米颗粒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
将Fe2+溶液加入到核苷酸和生物酶混合溶液中，得到的混合溶液孵育反应，离心去除上清液，加水洗涤沉淀并离心去除上清液，得到所述自组装复合纳米颗粒。
6.根据权利要求5所述的自组装复合纳米颗粒的制备方法，其特征在于，
所述混合溶液中，Fe2+溶液浓度为0.1~100 mM，核苷酸溶液浓度为0.1~100 mM，生物酶溶液浓度为0.1~10 mg/mL；
所述孵育反应的温度为4~30°C，时间为10~100分钟；
所述加水洗涤沉淀并离心的次数为1-5次。
7.一种权利要求1所述的自组装纳米颗粒在模拟过氧化物酶中的应用。
8.一种权利要求1所述的自组装纳米颗粒或权利要求4所述的自组装复合纳米颗粒在抗菌中的应用。
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Synthesis and X-ray Study of the Structure of [Fe(5’-GMP(H2O)5]3H2O and [Mn(5’-IMP(H2O)5]2H2O，and their relevance and Nucleotide Suger Conformations;M. V. CAPPARELLI et al.,;《 Inorganica Chimica Acta》;ELSEVIER;19861231;第L47页右栏第2段 *

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