CN110343247A - 一种过氧化物拟酶用高分子纳米材料及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种过氧化物拟酶用高分子纳米材料及其制备方法，属于高分子纳米材料以及催化药物技术领域。本发明制备的过氧化物拟酶用高分子纳米材料为三价铁离子掺杂型聚吡啶高分子纳米材料，可催化低浓度过氧化氢产生大量活性氧物质(ROS)，并且本发明的过氧化物拟酶用高分子纳米材料还可以在近红外光的照射下进一步提高ROS的产生，而且本发明的过氧化物拟酶用高分子纳米材料可以与谷胱甘肽(GSH)发生氧化还原反应，降低谷胱甘肽含量，减少活性氧物质(ROS)的损失，实现协同，达到理想的抗菌效果。

Description

一种过氧化物拟酶用高分子纳米材料及其制备方法
技术领域
本发明属于高分子纳米材料以及催化药物技术领域，具体是一种过氧化物拟酶用高分子纳米材料及其制备方法。
背景技术
天然酶的一些固有缺陷如易变性、成本高等，大大限制了其在生物医学、食品安全以及环境保护等领域的实际应用。因此，利用生物或化学方法模拟天然酶不仅具有重要的科学意义，而且具有巨大的实际应用价值。近年来，随着纳米科学的飞速发展，研究者发现某些纳米材料本身就具有内在的模拟某些生物酶催化活性的能力，因此它们被称之为纳米酶。纳米酶的发现改变了以往人们关于无机纳米材料是一种生物惰性物质的传统观念，揭示了纳米材料内在的生物效应及新特性，丰富了模拟酶的研究，也大大拓展了纳米材料的应用范围。与天然酶或者传统的模拟酶相比，纳米模拟酶既是一种酶，又是一类纳米材料，因此它们除了具有类似酶的催化性能之外，还具有纳米材料本身的物理和化学特性(如光、电、磁等)，是一类双功能甚至多功能的纳米材料，而且有着大的比表面积，更易于进行化学修饰。因此，近几年来，纳米酶在生物医学等领域受到了研究人员的极大关注。
对于过氧化物的催化在医药卫生等领域应用十分广泛，但天然过氧化物酶价格不菲且对于使用条件要求也比较高。在纳米技术的推动下，多功能纳米材料如包括V2O5、石墨烯量子点等在内的金属纳米结构、金属硫化物/氧化物或其纳米复合材料、功能化聚合物和碳纳米材料具有过氧化物酶模拟能力。基于其具有过氧化物酶模拟能力，可以尝试将过氧化物拟酶应用于抗菌领域。
据报道，包括V2O5、和石墨烯量子点在内的纳米材料具有过氧化物酶模拟能力，可用于协助H2O2进行抗菌应用。例如，石墨烯量子点能够催化低浓度的H2O2产生羟基自由基(·OH)，其具有比H2O2更高的抗菌活性，同时避免较高浓度H2O2的毒性。更重要的是，与天然酶相反，过氧化物酶样纳米材料可以防止蛋白质变性或蛋白酶消化。但不幸的是，过氧化物酶样纳米材料的进一步应用仍然受到以下限制：(1)许多报道的过氧化物酶样纳米材料的内在生物毒性仍然是最重要的问题之一；(2)据报道，基于纳米材料的单一模式抗菌过程难以高效地完全消除耐药菌。多种抗菌药物联合治疗模式成为提高抗菌效率的有效途径，可能诱导有效的协同效应。因此，探索具有多重抗菌能力的新型生物相容性过氧化物酶样纳米材料具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种过氧化物拟酶用高分子纳米材料及其制备方法，以解决现有技术中的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种过氧化物拟酶用高分子纳米材料，其特征在于，所述提过氧化物拟酶用高分子纳米材料主要包括以下重量份数的原料组分：32～50份三氯化铁和10～12份3,4-二氨基吡啶。
作为优化，所述过氧化物拟酶用高分子纳米材料的粒径为5nm～200nm，水体系的电势为+10.0mV～+80.0mV，平均分子量为12.0kDa～25.0kDa，优选为12.0kDa-18.0kDa。
作为优化，所述3,4-二氨基吡啶为单分子晶体。
作为优化，一种过氧化物拟酶用高分子纳米材料的制备方法主要包括以下制备步骤：
(1)使用三氯化铁晶体和水，配制三氯化铁的水溶液；
(2)将三氯化铁水溶液与3,4-二氨基吡啶混合，形成混合溶液，反应，除杂；
(3)对步骤(2)所得物质进行指标检测。
作为优化，一种过氧化物拟酶用高分子纳米材料的制备方法主要包括以下制备步骤：
(1)将三氯化铁晶体和水混合，配制三氯化铁的水溶液；
(2)将三氯化铁水溶液与3,4-二氨基吡啶混合，形成混合溶液，然后在搅拌加热至37℃的条件下反应24小时，再将反应溶液置于分子量为12.0kDa的透析袋中透析24小时；
(3)对步骤(2)所得物质进行指标检测。
作为优化，所述三氯化铁与水的摩尔比为0.1～2.0，优选为0.1～1.0。
作为优化，所述三氯化铁与3,4-二氨基吡啶的摩尔比为1.0～20.0，优选为2.0～10.0。
作为优化，所述过氧化物拟酶用高分子纳米材料可应用于抗菌领域，优选为外创伤抗菌治疗。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
(1)本发明中，一方面，过氧化物拟酶用高分子纳米材料可以催化有机体环境(如细菌)中的过氧化氢产生大量活性氧物质(ROS)，从而达到杀死细菌的作用；另一方面，离子掺杂型聚吡啶高分子纳米材料还能与谷胱甘肽发生反应，降低谷胱甘肽在细菌内的含量水平，从而减少了谷胱甘肽对活性氧物质的消耗，产生更多更有效的活性氧物质，达到增强抗菌治疗的效果。
(2)本发明中，过氧化物拟酶用高分子纳米材料在近红外光作用下具有更强的催化效果。在近红外光的照射下，过氧化物拟酶用高分子纳米材料会加速催化过氧化氢产生更多的活性氧物质，实现内外协同，达到非常好的杀菌治疗效果。
(3)本发明中，过氧化物拟酶用高分子纳米材料的形貌非常均一，同时材料还具有很好的生物相容性。
(4)本发明中过氧化物拟酶用高分子纳米材料具有良好的稳定性，便于存放，且价格低廉可大量制备。
附图说明
图1为本发明实施例1中制备的过氧化物拟酶用高分子纳米材料的透射电镜图；
图2为本发明实施例1中制备的过氧化物拟酶用高分子纳米材料的X射线能谱图；
图3为本发明实施例1中制备的过氧化物拟酶用高分子纳米材料的红外光谱图；
图4为本发明实施例1中制备的过氧化物拟酶用高分子纳米材料动力学机制检测效果图；
图5为本发明实施例1中制备的过氧化物拟酶用高分子纳米材料作为过氧化物拟酶的的催化效果图；
图6为空白、单纯过氧化氢、单纯铁离子掺杂型聚吡啶高分子纳米材料、单纯近红外光、过氧化氢与铁离子掺杂型聚吡啶高分子纳米材料、铁离子掺杂型聚吡啶高分子纳米材料加过氧化氢加近红外光对活性氧物质影响的荧光增强对比图，其中Fe-PDAP代表铁离子掺杂型聚吡啶高分子纳米材料、TA代表可以与活性氧物质结合的荧光物质、NIR代表近红外光；
图7为不同浓度的实施例1制备得到的过氧化物拟酶用高分子纳米材料与谷胱甘肽作用效果图
图8为本发明实施例1中制备的过氧化物拟酶用高分子纳米材料对大肠杆菌活力的影响图；
图9为实本发明实施例1中这制备的过氧化物拟酶用高分子纳米材料与过氧化氢和近红外光协同杀菌效果图；
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
一种过氧化物拟酶用高分子纳米材料，主要包括以下重量份数的原料组分：35份三氯化铁和12份3,4-二氨基吡啶。
一种过氧化物拟酶用高分子纳米材料的制备方法，所述过氧化物拟酶用高分子纳米材料的制备方法的制备方法主要包括以下制备步骤：
(1)称取20mmoL三氯化铁溶于100mL，于转速为280r/min的条件下，搅拌混合30min后，配制三氯化铁的水溶液；
(2)将三氯化铁水溶液与3,4-二氨基吡啶混合，形成混合溶液，然后在搅拌加热至37℃的条件下反应24小时，再将反应溶液置于分子量为12.0kDa的透析袋中透析24小时；
(3)对步骤(2)所得物质进行指标检测。
作为优化，三氯化铁与3,4-二氨基吡啶的摩尔比为4.0。
作为优化，过氧化物拟酶用高分子纳米材料可应用于抗菌领域，优选为外创伤抗菌治疗。
利用投射电子显微镜对本实施例得到的过氧化物拟酶用高分子纳米材料进行表征，结果如图1所示，从图中可以看出过氧化物拟酶用高分子纳米材料形貌均一呈梭型且粒径处在5nm-200nm之间。
利用X射线能谱对本实例得到的过氧化物拟酶用高分子纳米材料进行表征，结果如图2所示，从图中可以看出离子掺杂型聚吡啶高分子纳米材料中含有大量的C、Fe、O、Cl、H等元素，说明三氯化铁与3,4-二氨基吡啶聚合在一起。
利用红外谱仪(Thermo FT-IR200)对本实施例得到的离子掺杂型聚吡啶高分子纳米材料进行表征，结果如图3所示，3410cm-1、825cm-12380cm-1和688cm-1是三氯化铁特征吸收峰；3150cm-1、1640cm-1、1410cm-1和688cm-1是3,4-二氨基吡啶特征吸收峰，可以看出三氯化铁与3,4-二氨基吡啶的特征峰都出现在过氧化物拟酶用高分子纳米材料的红外谱图中。
酶动力学机制检测效果评价：
本实例说明过氧化物拟酶用高分子纳米材料可以作为过氧化氢拟酶符合过氧化物酶的动力学机制，可以作为过氧化物拟酶使用。
具体检测过程为：以pH＝4.0的NaAc-HAc缓冲液作为溶剂，实施例1得到的过氧化物拟酶用高分子纳米材料浓度为40ug/mL,过氧化氢的浓度为40mM，过氧化氢3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)设置为梯度浓度：0.2mM、0.3mM、0.4mM、0.5mM、0.6mM、0.7mM和0.8mM。将过氧化物拟酶用高分子纳米材料、TMB和过氧化氢各取1.00mL,混合，用紫外分光光度计测定在652nm处10s内的吸光度变化情况。将过氧化氢浓度改为30mM继续测定。结果如图4A图4B所示，实施例1得到的过氧化物拟酶用高分子纳米材料的酶动力学机制符合过氧化物酶的酶动力学机制，说明过氧化物拟酶用高分子纳米材料可以作为过氧化物拟酶使用。
作为过氧化物拟酶的效果评价：
本实例说明过氧化物拟酶用高分子纳米材料可以作为过氧化物拟酶催化低浓度的过氧化氢生成活性氧物质。
具体检测过程为：
将过氧化物拟酶用高分子纳米材料和过氧化氢以及显色剂3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)在室温黑暗条件下放置30分钟，然后用紫外分光光度计测其紫外吸光度，分别测定过氧化物拟酶用高分子纳米材料对浓度、PH、温度、过氧化氢浓度的依赖性，并将其与辣根过氧化物酶(HRP)进行比较。最终过氧化物拟酶用高分子纳米材料浓度为33ug/mL时，过氧化氢浓度为65uM/mL,结果如图5A、图5B、图5C、图5D所示，表明过氧化物拟酶用高分子纳米材料TMB显色时最适宜PH、温度、过氧化氢浓度分别是4.0-6.0、40℃-50℃、20mmol/L-35mmol/L，并且比辣根过氧化物酶具有更好的环境适应性。
协同效果评价：
本实例说明铁离子掺杂型聚吡啶高分子纳米材料在近红外光的照射下，可以增强酶催化效果。
具体检测过程为：以pH＝7.4、浓度为0.01M的PBS缓冲溶液为溶剂，铁离子掺杂型聚吡啶高分子纳米材料最终浓度为0.1mg/mL，H2O2最终浓度为100mM，荧光探针TA为5mM。在37℃条件下，避光震荡20min，需要照射将近红外光组照射10min近红外光，其他组继续避光震荡10min。
利用Dual-FL荧光光谱仪对本实施例各个样品在探针435nm特征吸收峰进行荧光强度测定，如图6所示，纯铁离子掺杂型聚吡啶高分子纳米材料与纯过氧化氢的荧光强度很低，但铁离子掺杂型聚吡啶高分子纳米材料加过氧化氢具有明显效果，被近红外光照射后，效果进一步加强。说明铁离子掺杂型聚吡啶高分子纳米材料在近红外光照射下可以产生更多活性氧物质。
与谷胱甘肽作用效果评价：
本实例说明过氧化物拟酶用高分子纳米材料可以与谷胱甘肽发生作用，降低GSH含量，减少活性氧物质的损失。
具体检测过程为：以pH＝7.4、浓度为0.01M的PBS缓冲溶液为溶剂，GSH浓度为50μM,与不同浓度的过氧化物拟酶用高分子纳米材料在30℃下震荡反应3小时。用紫外分光光度计与谷胱甘肽试剂盒测定谷胱甘肽损失量，结果如图7所示，过氧化物拟酶用高分子纳米材料可以有效的降低谷胱甘肽含量，减少活性氧物质的损失。
对大肠杆菌细菌活力影响的评价：
以下实例用于说明实例1中的到的过氧化物拟酶用高分子纳米材料对大肠杆菌活力的影响。
(1)大肠杆菌的培养
首先，将型号为ATCC25922的大肠杆菌培养在新鲜的培养液中，放置于37℃的恒温摇床中孵育。
(2)细菌活力的测定
待细菌生长到一定数量之后，将细菌稀释至106，一组加入浓度为100μg/mL的从实施例1中得到的过氧化物拟酶用高分子纳米材料，一组不加入。共孵育20min，再各取100.0μL共孵育液，加到新鲜培养基DMEM中，放置于37℃的恒温培养箱中培育12小时。取出，观察大肠杆菌成活情况，如图8所示，图8A为加入过氧化物拟酶用高分子纳米材料的大肠杆菌，图8B为不加人过氧化物拟酶用高分子纳米材料的大肠杆菌。因此说明单纯的过氧化物拟酶用高分子纳米材料对细菌的活力影响不大，说明过氧化物拟酶用高分子纳米材料具有很好的生物相容性。
对大肠杆菌进行协同抗菌治疗效果的评价：
以下实例用于说明实施例1中过氧化物拟酶用高分子纳米材料对大肠杆菌的抗菌协同治疗效果。
(1)大肠杆菌的培养
首先，将型号为ATCC25922大肠杆菌培养在新鲜的培养液中，放置于37℃的恒温摇床中孵育
(2)协同治疗效果评估
待细菌生长到一定数量之后，将细菌稀释至106，对细菌用过氧化物拟酶用高分子纳米材料、过氧化氢与近红外光同时处理。其中，空白对照组其他条件一样，只是不加入过氧化物拟酶用高分子纳米材料、过氧化氢。待两种方法处理完之后，将细菌继续孵育12小时，最后通过对形成的细菌菌落数进行测定，评估两种方法对细菌活力的抑制作用。
如图9A和图9B所示，当采用过氧化物拟酶用高分子纳米材料、过氧化氢和近红外光同时处理细菌之后，细菌存活率(图9A)远远小于对照组(图9B)，说明过氧化物拟酶用高分子纳米材料、过氧化氢和近红外光照射协同治疗对大肠杆菌的会产生明显的抗菌治疗效果。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (8)

1.一种过氧化物拟酶用高分子纳米材料，其特征在于，所述提过氧化物拟酶用高分子纳米材料主要包括以下重量份数的原料组分：32～50份三氯化铁和10～12份3,4-二氨基吡啶。
2.根据权利要求1所述的一种过氧化物拟酶用高分子纳米材料，其特征在于，所述过氧化物拟酶用高分子纳米材料的粒径为5nm～200nm，过氧化物拟酶用高分子纳米材料导电水体系的电势为+10.0mV～+80.0mV，过氧化物拟酶用高分子纳米材料导电水体系的平均分子量为12.0kDa～25.0kDa，优选为12.0kDa-18.0kDa。
3.根据权利要求2所述的一种过氧化物拟酶用高分子纳米材料，其特征在于，所述3,4-二氨基吡啶为单分子晶体。
4.一种过氧化物拟酶用高分子纳米材料的制备方法，其特征在于，主要包括以下制备步骤：
(1)使用三氯化铁晶体和水，配制三氯化铁的水溶液；
(2)将三氯化铁水溶液与3,4-二氨基吡啶混合，形成混合溶液，反应，除杂；
(3)对步骤(2)所得物质进行指标检测。
5.根据权利要求4所述的一种过氧化物拟酶用高分子纳米材料的制备方法，其特征在于，主要包括以下制备步骤：
(1)将三氯化铁晶体和水混合，配制三氯化铁的水溶液；
(2)将三氯化铁水溶液与3,4-二氨基吡啶混合，形成混合溶液，然后在搅拌加热至37℃的条件下反应24小时，再将反应溶液置于分子量为12.0kDa的透析袋中透析24小时；
(3)对步骤(2)所得物质进行指标检测。
6.根据权利要求5所述的一种过氧化物拟酶用高分子纳米材料的制备方法，其特征在于，所述三氯化铁与水的摩尔比为0.1～2.0，优选为0.1～1.0。
7.根据权利要求6所述的一种过氧化物拟酶用高分子纳米材料的制备方法，其特征在于，所述三氯化铁与3,4-二氨基吡啶的摩尔比为1.0～20.0，优选为2.0～10.0。
8.根据权利要求7所述的一种过氧化物拟酶用高分子纳米材料的制备方法，其特征在于，所述过氧化物拟酶用高分子纳米材料可应用于抗菌领域，优选为外创伤抗菌治疗。
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