KR101273964B1

KR101273964B1 - 단백질 ｇ다합체가 고정화된 자성실리카 나노입자 및 이의 제조방법과 이를 이용한 검출용 면역센서 및 이를 이용한 면역검출방법

Info

Publication number: KR101273964B1
Application number: KR1020100139645A
Authority: KR
Inventors: 이진형; 장정호; 최홍경; 임명운; 정상희
Original assignee: 주식회사 중겸; 한국세라믹기술원
Priority date: 2010-12-30
Filing date: 2010-12-30
Publication date: 2013-06-11
Also published as: KR20120077616A

Abstract

본 발명은 항체의 Fc 영역에 특이적으로 결합하는 단백질 G 다합체가 고정화된 자성실리카 나노입자, 이를 이용한 면역 검출용 바이오센서 및 이를 이용한 면역검출방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 항체에 결합하는 부위가 증가하는 단백질G의 다합체의 사용을 통해서 면역 검출의 감도를 향상시키는 단백질 G 다합체 고정화 자성실리카 나노입자, 이를 이용한 면역검출용 바이오센서 및 상기 바이오 센서를 이용한 면역검출방법에 관한 것이 개시된다.

Description

단백질 Ｇ다합체가 고정화된 자성실리카 나노입자 및 이의 제조방법과 이를 이용한 검출용 면역센서 및 이를 이용한 면역검출방법{Magnetic nanoparticles the protein multimer G bound that silica was coated and methods for producing thereof and an immunosensor using thereof and an immunity detecting methods using the said immunosensor}

본 발명은 항체의 Fc 영역에 특이적으로 결합하는 단백질 G 다합체가 고정화된 자성실리카 나노입자, 이를 이용한 면역 검출용 바이오센서 및 이를 이용한 면역검출방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 항체에 결합하는 부위가 증가하는 단백질G의 다합체의 사용을 통해서 면역 검출의 감도를 향상시키는 프로테인지 다합체 고정화 자성실리카 나노입자, 이를 이용한 면역검출용 바이오센서 및 상기 바이오 센서를 이용한 면역검출방법에 관한 것이다.

항원-항체 반응을 이용한 면역센서, 진단키트 등의 응용 분야에서 대부분은 항체는 다양한 무기성(inorganic) 고체 물질 표면에 고정화된 형태로 사용된다. 항체의 고유한 결합 특성 및 활성을 손상시키지 않으면서 항체의 활성 부위가 표면에 잘 노출될 수 있도록 다양한 고체기판에 항체를 단분자막 형태 및 배향성을 조절하면서 고정화시키는 기술은 칩이나 센서의 검출 감도와 직접적으로 연결되므로 매우 중요하다. 특히 항체에서 항원에 대한 결합 부위는 F_ab 영역에 존재하기 때문에 항체의 F_ab 영역을 외부로 노출시키도록 항체를 고정화시키는 것은 항체의 성능과 감도를 높이는데 매우 중요하며 F_ab 영역이 노출되지 않은 항체는 항체의 고정화에도 불구하고 그 기능을 상실하게 되어 고정화 양과 상관없이 센서 및 검출에는 아무런 효과가 없다. 결국 항체의 고정화시 고정화양만이 중요한 것이 아니라 배향성이 확보된 고정화가 중요한 요소가 되는 것이다.

또다른 고려할 요소는, 항체의 단분자막으로부터 항원-항체 반응을 감도 높게 측정하기 위해서는 항원-항체간의 결합 반응이 입체제한(steric hindrance)을 최소로 하는 조건에서 높은 수준으로 이루어져야 한다. 입체 제한은 주로 고체 표면에 고정화된 항체분자의 밀도에 의해 발생하며 밀도가 높은 경우 항원 결합 효율이 심각하게 떨어지게 된다. 따라서 고체 표면에서 항체 분자의 밀도를 조절하는 기술이나 혹은 항체 분자의 고정화 밀도가 항원-항체 결합반응에 미치는 효과를 최소화할 수 있는 새로운 단분자막 제조기술이 개발되어야한다. 최근에 이런 기술을 개발하고자 하는 연구가 많이 진행되고 있지만 성과는 아직 미비하고 초보적인 수준에 그치고 있다.

기존 연구를 살펴보면 단순 흡착을 이용한 항체의 고정화에서 배향성을 조절하는 방법으로 이동하고 있으며 그 기본은 항체의 F_c 영역에 많이 존재하는 아미노 그룹을 이용하여 고체표면에 알데하이드 혹은 카르복실 그룹을 이용하여 고정화하는 방법이다. 이 방법의 경우 항체의 고정화양은 많아지지만 상기에서 명시한 입체제한이 나타나며 배향성에서 있어서 특정 tag이나 리간드를 사용하는 것보다는 배향성에 대한 효율이 크지 않은 단점이 있다. 통상적으로 많이 사용되는 다른 방법은 스트렙타비딘-비오틴(streptavidin-biotin) 결합을 이용하는 것으로 스트렙타비딘은 저분자 비타민인 비오틴 4개와 결합할 수 있는 입체구조를 갖고 있으며 비오틴의 아민기는 항체의 고정영역(F_c)에 위치한 탄수화물 부분을 산화시켜 부착시킬 수 있으므로, 고체물질 표면에 고정화된 스트렙타비딘과 항체에 부착된 비오틴이 결합되어 배향성 고정화를 할 수 있다. 하지만 스트렙타비딘 및 비오틴은 비교적 고가의 시료라서 대량 생산 및 상업화에 단점으로 작용한다.

한편 항체의 F_c 영역에 특이적으로 결합하는 단백질A (protein A)와 단백질G (protein G)를 이용하여 항체의 배향성을 확보하는 방법도 소개되고 있다. 항체와 특이적으로 결합하는 미생물 유래 항체결합단백질(단백질A, 단백질G, 단백질A/G, 또는 단백질L)을 이용한 항체고정화 기술은 항원-항체 반응에 참여하지 않는 항체의 특정부위에 강하게 결합하여 해당 항체를 고체기판에 고정함으로써 항원의 접근성을 용이하게 한다(Danczyk R et al., Biotechnol Bioeng 84:215-223, 2003). 상기 단백질들과 항체와의 결합에는 화학적 수식이 필요하지 않으므로 항체의 고유 기능을 해치지 않는 장점이 있다. 그러나, 항체결합 단백질을 고체기판에 고정하는 과정에서 단백질의 배향성 조절이 어려워 항체의 고정 효율을 최적화하는데 문제가 되어 왔다.

또한 최근에 발표된 방법은 골드결합단백질을 코딩하는 유전자와 프로테인에이와 지 (protein A, G)를 코딩하는 유전자를 함유하는 재조합벡터로 형질전환된 미생물에 의해서 발현된 재조합 융합단백질을 고체상에 고정하여 항체의 배향성을 확보하는 방법이 소개되었다 (대한민국 특허 등록번호 10-0965480).

본 발명이 해결하고자 하는 과제는 면역검출에서 고민감도 검출을 위한 민감도 향상을 위한 것으로, 항체의 배향성 확보를 통한 민감도 향상뿐만 아니라 구조적 배열을 통한 입체제한 극복을 동시에 해결하기 위하여 항체의 Fc 영역에 특이적으로 결합하는 단백질 G 다합체가 고정화된 자성실리카 나노입자 및 이의 제조방법을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명에서는 단백질 G 다합체가 고정화된 자성실리카 나노입자를 이용한 면역 검출용 바이오센서 및 이를 이용한 면역검출방법을 제공하는 것을 또 다른 해결과제로 한다.

상기한 과제를 해결한

본 발명의 단백질 G 다합체가 코팅된 실리카 자성나노입자는 중심핵(core)으로 나노자성체 산화물에 실리카 코팅된 자성실리카 나노입자의 표면에 아미노그룹이 도출되어 치환되고, 상기 아미노그룹이 치환된 자성나노입자의 표면을 가교결합시약(cross linking reagent)을 침지시켜 아미노그룹에 아마이드결합을 형성하고, 상기 아마이드결합이 형성된 활성화된 상기 자성실리카 나노입자의 아미노그룹에 단백질 G 다합체가 결합하여 고정화되어 있는 것을 특징으로 한다.

여기서, 상기 나노자성체는 자철광(magnetite; Fe₃O₄ , 헤마타이트(hematite;α-Fe₂O₃), 마그헤마이트(maghemite; γ-Fe₂O₃), 니켈, 코발트 및 그들의 화합물로부터 이루어진 군에서 선택된 1종인 것을 특징으로 한다.

여기서, 상기 단백질 G 다합체는 말단에 시스테인기가 결합되어 있고, 단일(mono-), 이중(di-), 삼중(tri-)의 단백질G 다합체인 것을 특징으로 한다.

여기서, 상기 자성나노입자는 30 ~ 200 의 크기를 가지는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명에서는 실리카 코팅된 자성나노입자의 표면에 아미노 기능화 시키는 단계; 상기 아미노기로 기능화 된 자성나노입자 표면을 가교결합시약(cross linking reagent)을 이용하여 아마이드 결합을 형성하는 단계; 단백질G 다합체의 말단에 결합된 시스테인 그룹의 설퍼히드릴기(sulfhydryl group)를 반응이 가능하도록 환원시키는 단계; 상기 아마이드결합이 형성된 자성나노입자 표면에 상기 환원된 단백질G 다합체를 코팅시키는 단계로 이루어진 실리카코팅 자성나노입자에 단백질G 다합체를 고정화하는 방법을 제공한다.

여기서, 상기 가교결합시약은 SPDP; N-succinimidyl-3-(2-pyridyldithio) propionate, SMPT; succinimidyloxycarbonyl-α-methyl-α-(2-pyridyldithio)toluene, Sulfo-LC-SMPT; Sulfosuccinimidyl-6-[α-methyl-α- (2-pyridyldithio) toluamido] hexanoate, Sulfo-SMCC; Succonimidyla-4-(N-maleimidomethyl)-cyclohexane-1-carboxylate, MBS; m-Maleimidobenzoyl-N-hydroxy-succinimide ester, SIAB; N-succinimidyl(4-iodoacetyl)-aminobenzoate, SMPB; Succinimidyl-4-(ρ-maleimidophenyl)butyrate, GMBS; N-γ-Maleimidobutyryl-oxysuccinimide ester, SIAX; Succinimidyl-6-[6(((iodoacetyl)amino)-hexanoyl)amino]hexanoate, NPIA; ρ-Nitrophenyl iodoacetate 으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명에서는 실리카 코팅 자성나노입자의 표면을 아미노기로 치환시키는 단계; 상기 아미노기로 치환된 자성나노입자의 표면을 가교결합시약(cross linking reagent)을 이용하여 아미노기능기에 아마이드결합을 형성하는 단계; 단백질G 다합체의 말단에 결합된 시스테인 태그에 설퍼히드릴기(sulfhydryl group)를 반응이 가능하도록 환원하는 단계; 상기 아마이드결합이 형성된 아미노기가 표면에 부착된 실리카코팅 자성나노입자에 상기 환원된 단백질G 다합체를 고정화시키는 단계; 및 상기 자성나노입자에 고정된 단백질 G 다합체에 항체를 자기 배향성으로 고정화 하는 단계로 이루어진 단백질 G 다합체가 고정화된 자성실리카 나노입자를 이용한 검출용 면역센서의 제조방법을 제공한다.

또한, 본 발명에서는 중심핵(core)으로 나노자성체 산화물에 실리카 코팅된 자성실리카 나노입자의 표면에 아미노그룹이 도출되어 치환되고, 상기 치환된 아미노그룹에 단백질 G 다합체를 고정화 한 후, 상기 고정화된 단백질 G 다합체에 항체가 고정된 검출용 면역센서를 제공한다.

또한, 본 발명에서는 상기 개시된 면역센서에 고정된 항체에 특이적으로 결합하는 항원을 가하고, 항원-항체 반응에 따라 검출하는 면역검출방법을 제공한다.

본 발명의 단백질G 다합체가 고정화된 실리카코팅 자성입자는 항체의 배향성을 확보하면서 동시에 입체제한을 극복할 수 있는 방법으로 면역검출에 있어서 가장 중요한 민감도를 향상시킬 수 있다. 기존 단백질G 단합체의 경우 많은 단백질G 다합체를 표면에 결합시킨다고 해도 입체적인 제한 때문에 대부분의 단백질G가 항체고정화에 사용되지 못하고 도리어 입체제한 때문에 민감도를 떨어뜨리는 결과를 낳게 되지만 단백질G 다합체를 사용하면 입체적인 제한을 극복하면서 2차원 배열이 아닌 3차원 배열을 통한 항체 고정화로 민감도를 현저히 증가시킬 수 있다.

도 1은 본 발명에 일실시예에 따라, 아미노그룹이 발현된 실리카코팅 자성나노입자의 제작 과정을 도시한 것이다.
도 2는 본 발명의 일실시예에 따라, 아미노그룹이 발현된 실리카코팅 자성나노입자에 단백질G 다합체를 고정화시키는 일련의 과정을 도시한 것이다.
도 3은 본 발명에 따른 실리카코팅 자성입자의 표면에 발현된 아미노그룹을 활성화하기 위해 가교결합시약인 sulfo-SMCC를 처리한 전후의 FT-IR 스펙트라를 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명에 따른 sulfo-SMCC 처리 전후의 TGA 곡선을 나타낸다.
도 5은 본 발명에 따른 단백질G 다합체의 각 농도에 따른 결합효율에 대한 결과를 나타낸다.
도 6은 본 발명에 따른 단백질G 다합체와 아미노그룹으로 표면치환된 실리카코팅 자성입자와의 반응시간에 따른 결합효율 결과를 도시한 것이다.
도 7은 본 발명에 따른 단백질 G 다합체가 고정된 아미노치환 실리카 자성 나노입자에서 마우스 면역글로블린 G(mouse IgG)에 대한 로딩효율의 SDS-폴리아크릴 아미도겔 전기영동분석 결과를 도시한 것이다.
도 8은 본 발명에 따른 최적 조건에 의해 결합된 단백질G 다합체를 통해 고정화된 쥐 유래 면역글로불린과 결합한 쥐 유래 면역글로불린에 대한 FITC-표지 항 쥐 유래 면역글로블린의 농도에 따른 형광 값을 나타낸 것이다.

이하, 본 발명을 보다 상세히 설명하기로 한다.

첨부도면 도 1은 본 발명의 일실시예에 따라, 아미노그룹이 발현된 실리카코팅 자성입자의 제작 과정을 도시한 것이고, 도 2는 본 발명의 일실시예에 따라, 아미노그룹이 발현된 실리카코팅 자성나노입자에 단백질G 다합체를 고정화시키는 일련의 과정을 도시한 것이며, 도 3은 본 발명에 따른 실리카코팅 자성입자의 표면에 발현된 아미노그룹을 활성화하기 위해 가교결합시약인 sulfo-SMCC를 처리한 전후의 FT-IR 스펙트라를 나타낸 것이며, 도 4는 본 발명에 따른 sulfo-SMCC 처리 전후의 TGA 곡선을 나타낸 것이며, 도 5은 본 발명에 따른 단백질G 다합체의 각 농도에 따른 결합효율에 대한 결과를 나타낸 것이며, 도 6은 본 발명에 따른 단백질G 다합체와 아미노그룹으로 표면치환된 실리카코팅 자성입자와의 반응시간에 따른 결합효율 결과를 도시한 것이며, 도 7은 본 발명에 따른 단백질 G 다합체가 고정된 아미노치환 실리카 자성 나노입자에서 마우스 면역글로블린 G(mouse IgG)에 대한 로딩효율의 SDS-폴리아크릴 아미도겔 전기영동분석 결과를 도시한 것이며, 도 8은 본 발명에 따른 최적 조건에 의해 결합된 단백질G 다합체를 통해 고정화된 쥐 유래 면역글로불린과 결합한 쥐 유래 면역글로불린에 대한 FITC-표지 항 쥐 유래 면역글로블린의 농도에 따른 형광 값을 나타낸 것이다.

본 발명은 항체의 F_c 영역에 친화성을 갖는 단백질G로 구성된 다합체를 제공하며 상기 단백질G 다합체는 유전자 재조합 기술을 통해 단백질G 코딩 유전자를 적절한 발현 벡터에 클로닝하여 발현 벡터를 제작하며 이때 단백질G에 대한 코딩 유전자를 단일체의 경우 1회 반복, 이중체의 경우 2회 반복, 삼중체의 경우 3회 반복 연결한 발현 벡터를 각각 제작하여, 상기 발현 벡터를 이용하여 적절한 미생물을 형질전환시키고, 상기 형질전환된 미생물을 배양하여 단백질G 다합체를 생산한 후 세포 외벽을 파괴하고 컬럼을 통해 합성된 단백질G 다합체를 분리한다. 이때 단백질G의 하단에 시스테인잔기가 부착되도록 발현시키게 된다.

본 발명에 사용되는 실리카 코팅 자성나노입자는 첨부도면 도 1에 도시된 바와 같이 자성나노입자의 표면에 실리카를 코팅시켜 제조된다.

아미노그룹으로 치환된 실리카코팅 자성나노입자를 수용상에서 분산시킨 후 zero-length cross linker를 넣어서 표면의 아미노그룹을 활성화시킨다. 이와 동시에 환원제를 첨가하여 단백질G 다합체의 시스테인 잔기의 설퍼하이드릴 그룹을 환원시켜서 반응이 가능하도록 준비시킨다. 이후 환원된 단백질G 다합체와 활성화된 실리카코팅 자성입자를 혼합하여 반응시킨 후 영구자석을 통해 분리하여 세척한다. 이를 통해 단백질G 다합체가 고정화된 실리카코팅 자성입자를 제작하게 된다.

본 발명에 따른 단백질 G 다합체가 고정화된 자성실리카 나노입자는 중심핵(core)으로 나노자성체 산화물에 실리카 코팅된 자성실리카 나노입자의 표면에 아미노그룹이 도출되어 치환되고, 상기 아미노그룹이 치환된 자성나노입자의 표면을 쌍방결합시약(cross linking reagent)에 침지시켜 아미노그룹에 아마이드결합을 형성하고, 상기 아마이드결합이 형성된 상기 자성실리카 나노입자의 아미노그룹에 단백질 G 다합체가 결합하여 고정화되어 이루어진다.

상기 나노자성체는 자성에 반응하는 물질이면 어느 것을 사용하여도 좋으나, 바람직하게는 자철광(magnetite; Fe₃O₄ , 헤마타이트(hematite; α-Fe₂O₃), 마그헤마이트(maghemite; γ-Fe₂O₃), 니켈, 코발트 및 그들의 화합물로부터 이루어진 군에서 선택된 1종을 사용하는 것이 바람직하다.

상기 단백질 G 다합체는 말단에 시스테인 그룹이 결합되어 있고, 이중(di-), 삼중(tri-)의 단백질G 다합체이다.

상기 자성나노입자는 30 ~ 200㎚의 크기를 가지는 것을 사용하는 것이 좋다.

본 발명에 따르면, 첨부도면 도 2에 예시된 바와 같이 상기 개시된 단백질 G 다합체가 고정화된 자성실리카 나노입자는 첨부도면 도 1에 도시된 바와 같은 자성체 나노입자의 표면에 실리카 코팅처리된 자성나노입자의 표면에 아미노그룹을 치환시키는 단계와 상기 아미노그룹이 치환된 자성나노입자의 표면을 설포-에스엠씨씨(sulfo-SMCC; Sulfo succininidyl 4 - (N -maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylate)와 같은 가교결합시약(cross linking reagent)에 침지시켜 아미노그룹에 아마이드결합을 형성하는 단계와 이와는 별도로 단백질G 다합체의 말단에 결합된 시스테인 그룹의 설퍼히드릴기(sulfhydryl group)를 반응이 가능하도록 환원하는 단계와 상기 아마이드결합이 형성된 아미노그룹이 표면에 부착된 실리카코팅 자성나노입자에 상기 환원된 단백질G 다합체를 고정화시키는 단계로 이루어진 과정에 의해 단백질 G 다합체가 자성실리카 나노입자에 고정결합된다.

이와 같이 결합된 단백질 G 다합체가 고정화된 자성실리카 나노입자는 첨부도면 도 2에 개시된 바와 같이 실리카가 표면에 코팅된 자성체 나노입자(Fe₃O₄@SiO₄)의 아미노그룹이 설포-에스엠씨씨(sulfo-SMCC)와 아마이드결합이 이루어지고, 상기 아마이드결합부에 환원처리된 단백질 G 다합체가 결합되어 고정화된 구조로 되는 것이다.

여기서, 상기 나노입자는 자철광(magnetite; Fe₃O₄ , 헤마타이트(hematite; α-Fe₂O₃), 마그헤마이트(maghemite; γ-Fe₂O₃), 니켈, 코발트 및 그들의 화합물로부터 이루어진 군에서 선택된 1종을 사용할 수 있으며, 그 입자크기는 고정화 효율을 높이기 위하여 30 ~ 200㎚의 크기를 가지는 것을 사용하는 것이 바람직하다.

여기서, 상기 단백질 G 다합체는 말단에 시스테인 그룹이 결합되어 있고, 이중(di-), 삼중(tri-)의 단백질G 다합체이다.

여기서, 상기 가교결합시약은 SPDP; N-succinimidyl-3-(2-pyridyldithio) propionate, SMPT; succinimidyloxycarbonyl-α-methyl-α-(2-pyridyldithio)toluene, Sulfo-LC-SMPT; Sulfosuccinimidyl-6-[α-methyl-α- (2-pyridyldithio) toluamido] hexanoate, Sulfo-SMCC; Succonimidyla-4-(N-maleimidomethyl)-cyclohexane-1-carboxylate, MBS; m-Maleimidobenzoyl-N-hydroxy-succinimide ester, SIAB; N-succinimidyl(4-iodoacetyl)-aminobenzoate, SMPB; Succinimidyl-4-(ρ-maleimidophenyl)butyrate, GMBS; N-γ-Maleimidobutyryl-oxysuccinimide ester, SIAX; Succinimidyl-6-[6(((iodoacetyl)amino)-hexanoyl)amino]hexanoate, NPIA; ρ-Nitrophenyl iodoacetate 으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 사용하는 것이 바람직하다.

본 발명에 따르면, 이상에서 개시된 바와 같은 단백질 G 다합체가 고정된 자성 실리카 코팅 나노입자를 이용하여 면역센서를 제조할 수 있다.

이를 보다 상세히 설명하면, 첨부도면 도 3에 도시된 바와 같이, 실리카 코팅 자성나노입자의 표면에 아미노그룹을 치환시키는 단계와, 상기 아미노그룹이 치환된 자성나노입자의 표면을 가교결합시약(cross linking reagent)에 침지시켜 아미노그룹에 아마이드결합을 형성하는 단계와, 단백질G 다합체의 말단에 결합된 시스테인 그룹의 설퍼히드릴기(sulfhydryl group)를 반응이 가능하도록 환원하는 단계와, 상기 아마이드결합이 형성된 아미노그룹이 표면에 부착된 실리카코팅 자성나노입자에, 상기 환원된 단백질G 다합체를 고정화시키는 단계; 및 상기 자성나노입자에 고정된 단백질 G 다합체에 항체를 고정화 하는 단계로 이루어진다.

여기서, 상기 항체는 Rabbit IgG, Hamster IgG, Guinea Pig IgG, Bovine IgG, Sheep IgG, Goat IgG, Pig IgG, Chicken IgG, Mouse IgG 으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.

이와 같이 제조된 면역센서는 중심핵(core)으로 나노자성체 산화물에 실리카 코팅된 자성실리카 나노입자의 표면에 아미노그룹이 도출되어 치환되고, 상기 치환된 아미노그룹에 단백질 G 다합체를 고정화 한 후, 상기 고정화된 단백질 G 다합체에 항체가 고정된다.

본 발명에 따르면, 이상에서 설명된 바와 같은 면역센서를 이용한 면역검출은 면역센서에 고정된 항체에 특이적으로 결합하는 항원을 가하고, 항원-항체 반응에 따라 검출하는 면역검출방법이 제공된다.

이상에서 설명된 바와 같이 상기에 개시된 면역센서에 결합고정되는 항체의 종류에 따라 항원-항체 반응에 따른 다양한 면역검출을 이룰 수 있는 것이다.

이하, 본 발명을 바람직한 실험예를 통하여 보다 상세히 설명하기로 한다. 단, 하기의 실험예로 본 발명이 한정되는 것이 아니며, 이상에서 상술한 바와 같이 적의 선택된 구성들에 따라 다양한 형태로 변형 가능한 것은 자명한 것이다.

<실험방법 및 분석>

1. 실험재료

본 실험에 사용되는 단백질 G 다합체(multimer-protein G)는 (주) 중겸(Joong Kyeom Co. Ltd, korea)에서 개발한 것을 사용하였다.

본 실험에 사용되는 Sulfo-SMCC(Sulfosuccinimidyl 4-( N-maleimidomethyl ) cyclohexane-1-carboxylate), 제바 디설트 스핀컬럼(Zeba Desalt spin column) 및 BCATM Protein Assay kit은 쎄르모 사이언티픽사(Thermo scientific)로부터 구매하여 사용하였다.

본 실험에 사용되는 디엘-디티오쓰레이톨(DL-Ditothreitol; DTT)는 젠디포(GenDEPOT)로부터 구입하여 사용하였다.

본 실험에 사용되는 디메틸설폭사이드(Dimethylsulfoxide; DMSO), 인산염버퍼(Phosphate buffered saline; PBS), 소듐모노베이직모노하이드레이트(Sodium monobasic monohydrate), 소듐포스페이트디베이직(Sodium phosphate dibasic), 도데실설페이트소듐염(Dodecyl sulfate sodium salt), 트윈20(Tween20), 글라이신(Glycine) 및 브로모페놀블루소듐염(Bromophenol blue sodium salt) 및 하이드로클로릭 엑시드(Hydrochloric acid)는 에스아이지엠에이(시그마) 알드리치(SIGMA Aldrich)로부터 구매하여 사용하였다.

본 실험에 사용되는 트리스-아크릴아마이드(Tris-acrylamide), 비스-아크릴아마이드(bis-acrylamide) 및 글리세롤(Glycerol)은 암레스코(Amresco)사로부터 구매하여 사용하였다.

본 실험에 사용되는 소듐클로라이드(Sodium Chloride)는 준세이(JUNSEI)사로부터 구매하여 사용하였다.

2. 분석

가. FT-IR 분석(Fourier Transformation Infrared (FT-IR) Spectroscopy)

FT-IR스펙트럼은 FT-IR-460 PLUS spectrometer (JASCO, Tokyo, Japan)을 사용하여 케이미알(KBr)방법에 의해 4000cm^-1 to 650cm^-1 및 25스캔 범위내에서 기록하였다.

나. TGA(Thermal gravimetric Analysis) 분석

산화철(Iron oxide)의 양은 SDT-Q600 (TA Instruments, Delaware, USA)을 사용하여 측정되었다.

TGA측정은 질소기압하에 상온에서 700℃까지 5℃/min의 비율로 수행하였다.

다. DLS(Dynamic light scattering) 분석

아미노치환 Fe₃O₄@SiO₂의 평균크기는 DLS-8000 (Photal Otsuka electronics, Tokyo, Japan)을 사용하여 측정되었다. 현탁용액은 상온에서 증류수였다.

라. SDS-PAGE(Sodium dodecyl sulfate polyacrlamide gel electrophoresis) 분석

전기영동법에 따른 단백질의 분자량은 SE-250 (Amersham Biosciences, Sweden)을 사용하여 측정하였다.

스테이킹(staking)되고 분리되는 겔농도는 각각 4%와 12.5%였다.

마. UV-Vis 분광광도계 및 형광분광광도계(UV-Vis spectrophotometer & spectrofluorophotometer) 분석

마이크로플레이트 리더(microplate reader)의 측정은 스몰셈플사이즈(small sample size; (Infinite M200, Austria))를 가지는 흡광도 적용법으로 작성되었다.

UV-Vis 분광광도계의 측정조건은 상온에서 흡광도 범위 562㎚, 5초간 쉐이킹(shaking) 하였다.

형광분광광도계의 측정조건은 5초간 쉐이킹하고, 인터그레이션 타임 20초, 5시간 플래시(섬광)수를 기록하였다.

[실험]

1) 아미노기가 치환된 실리카 코팅 자철광나노입자(Fe₃O₄@SiO₂)의 제작

자성나노입자를 제작하기 위하여 계면활성제인 Igepal CO-520 0.22g을 사이클로헥산 4.5mL에 녹인 용액을 준비하고, magnetite와 olieic acid를 사이클로헥산 용액에 넣고 1시간가량 초음파 처리를 하여 분산시킨 후 기 준비된 Igepal이 들어있는 사이클로헥산 용액에 넣고 교반시킨다. 이때 수산화암모늄, APTEOS를 넣고 추가적으로 20분을 더 교반 시킨 후 메탄올을 넣어서 세척하여 최종적으로 아미노기가 치환된 실리카 코팅 자철광나노입자를 얻게 된다.

2) 시스테인-태그된 단백질 G 다합체(cysteine-tagged multimer protein G)의 합성

단백질 G 유전자의 분리를 위하여 Streptococcus dysagalactiae균주로부터 디옥시리보핵산 (deoxyribonucleic acid)을 추출하여 (G-spin^TM genomic DNA extraction kit) F-NdeI PG (5'-ACCATATGACTGACACTTACAAATT A-3')와 R-PG BspEI_cystein_XhoI (5'-ACCTCGAGTTAGCAT CCGGATTCAGTTACCGTAAAGGT-3') 프라이머로 중합효소연쇄반응 (polymerase chain reaction, PCR) 을 통해 증폭하였다.

단백질 G의 유전자가 삽입되어 있는 T&A 클로닝 벡터를 주형 (template)으로 하고 F-LinkerPG (5'-ATACCGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGCGGATCGACTGACACTTACAAATTA-3'), R-PG BspEI_cystein_XhoI 프라이머로 각각 중합효소연쇄반응을 실시한 후 T&A 클로닝 벡터에 삽입하였다. 단백질 G가 클로닝된 T&A 벡터를 BspEI과 XhoI으로 제한효소 처리하고 링커가 붙어있는 단백질 G 유전자가 삽입되어 있는 T&A 벡터는 AgeI과 XhoI으로 제한효소처리 하였다. 절단된 단백질 G가 클로닝된 T&A 벡터에 절단된 링커-단백질 G 복합체를 같은 유전자로 배열하여 결합시켰다.

결합된 다이머 (dimer)유전자를 BspEI과 XhoI 제한효소로 처리하고 절단된 LPG를 계속 결합시키면서 트라이머 (trimer), 테트라머 (tetramer)를 진행시켰다. T&A 벡터에 들어있는 다양한 형태의 유전자들은 NdeI과 XhoI으로 제한효소 처리하여 pET28a 벡터에 결합시켰다. 다양한 형태의 유전자들이 삽입되어있는 pET28a를 발현 호스트인 Escherichia coli BL21 DE3에 형질전환 시킨 후 소듐 도데실 술페이트-폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE)를 통해서 발현의 여부를 확인하였다. 재조합 균주를 카나마이신 (50ug/ml)이 첨가된 200ml LB 배지에 접종하여 37℃에서 배양하고 흡광도가 약 0.4~0.6이 되었을때 IPTG를 최종농도 0.2mM이 되게 첨가하였다. IPTG 첨가 후 3시간동안 배양하고 배양액을 초고속원심분리기 (centrifuge)에서 6000rpm으로 20분간 회전시켜 균주를 수거하였다. 수거된 균주에 PBS 완충액(8g NaCl, 0.21g KCl, 1.42 g Na2HPO4, 0.27 g KH₂PO₄ /1ℓ, pH 7.4)를 20ml 넣고 현탁한 후에 프렌치프레스 (FRENCH PRESS)를 이용하여 균주를 파쇄하였다. 파쇄한 균주는 초고속원심분리기에서 10000rpm으로 20분간 회전시켜 파쇄된 균주의 상층액을 회수하였다. 회수된 상층액은 lysis 완충액 (50mM NaH₂PO₄ _,300mM NaCl, 10mM Imidazole, pH 8.0)으로 평형을 유지시킨 6X히스티딘 친화성 크로마토그래피인 Ni-NTA Shepharose column에 흡착시키고 wash 완충액 (50mM NaH₂PO_4,300mM NaCl, 20mM Imidazole, pH 8.0)을 사용하여 세척하였다. Elution 완충액 (50mM NaH₂PO_4,300mM NaCl, 250mM Imidazole, pH 8.0)을 사용하여 재조합 단백질을 회수하였고 PBS 완충액으로 투석하였다. 각 정제 과정의 단백질들은 소듐 도데실 술페이트-폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의해서 확인한 후 순도가 높은 정제물을 확보하여 단백질 G 다합체로 사용하였다.

3) 아미노기로 치환된 실리카 코팅 자철광나노입자(Fe₃O₄@SiO₂)에 sulfo-SMCC를 가교결합 합성

아미노치환 Fe₃O₄@SiO₂1을 200mM 염화나트륨(pH7.2)과 100mM 인산염버퍼로 이루어진 용액 1.5㎖에 넣어 10초간 교반시킨후, 30분간 초음파분산기를 이용하여 분산을 시킨다. 자석을 이용하여 자성나노 입자를 분리한 후, 아미노기로 기능화된 자성나노입자와 sulfo-SMCC가 잘 결합하기 위해 계면활성제로 사용한 0.1% 트윈20(tween 20)을 포함한 상기에서 분산시키기 위해 사용한 버퍼 160㎕를 이용하여 자성나노 입자를 풀어준다. 가교결합 시약인 50mM sulfo-SMCC 시약을 DMSO (Dimethylsulfoxide) 용매에 용해시킨 후 40㎕를 분산된 자성나노입자 용액에 첨가한다. 약 10초간 혼합된 혼합물을 교반한 후, 상온에서 한시간동안 로테이터 쉐이킹 (rotator shaking)을 이용하여 반응을 시켜준다.

4) 아미노치환 Fe₃O₄@SiO₂에 시스테인-태그된 단백질 G 다합체(cysteine-tagged multimer protein G)의 합성 및 정제 (도 2 참조)

아미노치환 Fe₃O₄@SiO₂의 활성동안 시스테인-태그된 단백질 G(30mM)를 상온에서 30분간 10.91mM DTT로 설퍼히드릴기(sulfhydryl group)를 반응이 가능하도록 환원시킨다.

상기 환원된 단백질 G 다합체(multimer-protein G)는 탈염 스핀 컬럼을 사용하여 버퍼를 활용하여 정제하였다.

자성을 띤 활성화된 아미노치환 Fe₃O₄@SiO₂는 10mM PBS 버퍼(pH7.4)로 5회 세척한 다음, 상기 환원된 단백질 G 다합체를 최종농도 100㎍/㎖가 되도록 추가하여 0.1% 트윈20을 최종농도로 하여 10mM PBS버퍼로 재현탁한다. 이를 교반하고, 1시간동안 로터리쉐이킹하여 인큐베이트한다.

상기 재현탁을 한 다음, 10분간 자성을 띠게 한 후, 자석을 이용하여 단백질 G 다합체가 고정된 Fe₃O₄@SiO₂입자를 정제하고, 정제한 후에 1.5㎖ 10mM PBS버퍼(pH7.4)로 3회 세척한다.

이상의 과정에서 첨부도면 도 2에 도시된 바와 같이 단백질 G 다합체가 자성나노입자에 고정된다.

5) 단백질 G 다합체가 고정화된 자성 실리카 코팅 나노입자(Fe₃O₄@SiO₂)에 마우스 면역글로블린G (mouse IgG)의 고정화

마우스 면역글로블린G의 최종농도를 200㎍/㎖가 되도록 0.1% 트윈20이 들어있는 10mM PBS (pH7.4) 버퍼를 이용하여 희석한 후 상기에서 단백질 G가 코팅된 자성나노입자에 200㎕ 첨가한 후, 상온에서 두시간 동안 로테이터 쉐이킹을 이용하여 반응을 시켜준다. 상기 혼합물을 자석을 이용하여 분리한 후, 10mM PBS (pH7.4)를 이용하여 3번 세척을 해준다.

6) 마우스 면역글로블린G가 고정화 된 자성나노 입자에 FITC가 표지된 염소 항마우스 면역글로블린G의 검출

형광물질인 FITC가 표지된 염소 항마우스 면역글로블린G를 1% BSA (Bovine Serum Albumin)이 녹아있는 10mM 인산염완충용액 (pH 7.4)에 농도별로 희석하여 마우스 면역글로블린G가 고정된 자성나노입자 200㎕를 첨가한 후 상온에서 30분 동안 반응을 시켜준다.

상기 혼합물을 자석을 이용하여 분리한 후, 10mM PBS (pH7.4)를 이용하여 3번 세척을 해준다.

[결과 및 고찰]

1) 아미노치환 Fe₃O₄@SiO₂의 분석(첨부도면 도 3)

(a)는 아미노치환 Fe₃O₄@SiO₂의 나노입자 FT-IR스펙트럼이고, (b)는 sulfo-SMCC가 가교결합된 아미노치환 Fe₃O₄@SiO₂의 나노입자 FT-IR스펙트럼이다.

2) 아미노치환 Fe₃O₄@SiO₂에 sulfo-SMCC의 교차결합 분석(첨부도면 도 4)

(a)는 아미노기로 치환된 실리카 코팅 자성나노 입자의 TGA 곡선이고, (b)는 sulfo-SMCC가 교차결합된 아미노치환 Fe₃O₄@SiO₂의 나노입자의 TGA 곡선이다.

3) 아미노치환 Fe₃O₄@SiO₂의 나노입자에 단백질 G 다합체(multimer-protein G)의 고정화 분석(도 6 및 도 7)

도 6 및 7은 아미노치환 실리카코팅 자성나노 입자에 단백질 G 다합체의 고정화된 로딩효율로서 도6은 농도변화에 따른 효율, 도 7은 반응시간에 따른 효율을 나타낸다.

4) 단백질 G 다합체 고정 아미노치환 Fe₃O₄@SiO₂의 나노입자에 마우스 면역글로블린 G의 고정화 분석(도 7 참조)

(a)는 단백질 G 다합체 고정 아미노치환 Fe₃O₄@SiO₂의 나노입자에 마우스 면역글로블린 G가 고정화 된 후 고정화되지 않고 씻겨서 나온 상층액을 측정한 SDS-PAGE 분석결과이다.

<12.5% SDS-PAGE 분석라인>

M: 분자량 마커(x10³ kDa)

Ctl.: 마우스 면역 글로블린 G 200㎍/㎖

Mono: 모노머(monomer) 단백질 G에 고정화 된 후 마우스 면역글로블린 G 의 상층액

Di: 다이머(dimer) 단백질 G에 고정화 된 후 마우스 면역글로블린 G의 상층액

Tri: 트리머(trimer) 단백질 G에 고정화 된 후 마우스 면역글로블린 G의 상층액

(b)는 마우스 면역글로블린 G의 무거운 체인과 가벼운 체인의 분자량인 50kDa 및 25kDa에 대한 강도를 비교한 값이다.

5) 마우스 면역글로블린G가 고정화 된 자성나노 입자에 FITC가 표지된 염소 항 마우스 면역글로블린G의 검출(도 8 참조)

이상에서 설명된 바와 같은 본 발명에 따른 실험의 결과, 표면이 아민기로 되어진 실리카 코팅된 자성나노입자에 monomer, dimer and trimer protein G (multimer-protein G)를 결합시키고 항체를 고정화 하는 실험을 진행하였고, 바이오센서에서 필요한 최소농도까지 검출이 가능한지 FITC가 표지된 염소 항 마우스 면역글로블린G를 사용하여 광학적으로 확인하는 실험을 진행하였다. 단백질G는 streptococcus group G에서 유전학적 기술을 이용하여 얻어졌으며, 이는 항체고정화에서 더욱더 좋은 배향성을 제공한다.

본 실험에서 사용된 아미노기로 치환된 실리카 코팅 자성나노입자는 평균 사이즈가 170nm 정도 되는 것을 확인하였고, 단백질G 다합체를 고정화 하기 위해 사용된 가교결합 시약으로는 sulfo-SMCC가 사용되어졌으면 가교결합 시약 처리를 통한 아미노기의 활성화를 확인하였다. 단백질G 다합체의 고정화된 효율은 각각 90%, 70%, 50% 정도 되는 것을 확인하였으며, 마우스 면역글로블린G를 고정화한 효율은 71%, 81%, 90%로 trimer protein G로 갈수록 효율이 높아지는 것을 확인하였다. 마지막으로, 광학적으로 확인한 결과 검출범위는 0.05-200, 0.025-200, 0.0025-200g/mL로 trimer protein G가 최소농도까지 검출이 가능하다는 것을 확인하였다.

Claims

중심핵(core)으로 나노자성체 산화물에 실리카 코팅된 자성실리카 나노입자의 표면에 아미노기가 도출되어 치환되고, 상기 아미노기가 치환된 자성나노입자의 표면을 가교결합시약(cross linking reagent)에 침지시켜 아미노기에 아마이드결합을 형성하고, 상기 아마이드결합이 형성된 상기 자성실리카 나노입자의 아미노기에 이중(di-), 삼중(tri-)의 단백질 G 다합체가 결합하여 고정화되어 있는 것을 특징으로 하는 단백질 G 다합체가 고정화된 자성실리카 나노입자.
제 1 항에 있어서,
상기 나노자성체는 자철광(magnetite; Fe₃O₄), 헤마타이트(hematite; α-Fe₂O₃), 마그헤마이트(maghemite; γ-Fe₂O₃), 니켈, 코발트 및 그들의 화합물로부터 이루어진 군에서 선택된 1종인 것을 특징으로 하는 단백질 G 다합체가 고정화된 자성실리카 나노입자
삭제
제 1 항에 있어서,
상기 자성나노입자는 30 ~ 200㎚의 크기를 가지는 것을 특징으로 하는 단백질 G 다합체가 고정화된 자성실리카 나노입자.
제 1 항에 있어서,
상기 가교결합시약은 SPDP; N-succinimidyl-3-(2-pyridyldithio) propionate, SMPT; succinimidyloxycarbonyl-α-methyl-α-(2-pyridyldithio)toluene, Sulfo-LC-SMPT; Sulfosuccinimidyl-6-[α-methyl-α- (2-pyridyldithio) toluamido] hexanoate, Sulfo-SMCC; Succonimidyla-4-(N-maleimidomethyl)-cyclohexane-1-carboxylate, MBS; m-Maleimidobenzoyl-N-hydroxy-succinimide ester, SIAB; N-succinimidyl(4-iodoacetyl)-aminobenzoate, SMPB; Succinimidyl-4-(ρ-maleimidophenyl)butyrate, GMBS; N-γ-Maleimidobutyryl-oxysuccinimide ester, SIAX; Succinimidyl-6-[6(((iodoacetyl)amino)-hexanoyl)amino]hexanoate, NPIA; ρ-Nitrophenyl iodoacetate 으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 단백질 G 다합체가 고정화된 자성실리카 나노입자.
실리카 코팅 자성나노입자의 표면에 아미노그룹을 치환시키는 단계;
상기 아미노그룹이 치환된 자성나노입자의 표면을 가교결합시약(cross linking reagent)에 침지시켜 아미노기에 아마이드결합을 형성하는 단계;
이중(di-), 삼중(tri-)의 단백질G 다합체의 말단에 결합된 시스테인 그룹의 설퍼히드릴기(sulfhydryl group)를 반응이 가능하도록 환원하는 단계;
상기 아마이드결합이 형성된 아미노그룹이 표면에 부착된 실리카코팅 자성나노입자에 상기 환원된 단백질G 다합체를 고정화시키는 단계; 및
상기 자성나노입자에 고정된 단백질 G 다합체에 항체를 자기배향성으로 고정화하는 단계로 이루어진 단백질 G 다합체가 고정화된 자성실리카 나노입자를 이용한 검출용 면역센서의 제조방법.
제 6 항에 있어서,
상기 자성나노입자는 자철광(magnetite; Fe₃O₄ , 헤마타이트(hematite; α-Fe₂O₃), 마그헤마이트(maghemite; γ-Fe₂O₃), 니켈, 코발트 및 그들의 화합물로부터 이루어진 군에서 선택된 1종인 것을 특징으로 하는 단백질 G 다합체가 고정화된 자성실리카 나노입자를 이용한 검출용 면역센서의 제조방법.
제 6 항에 있어서,
상기 단백질 G 다합체는 말단에 시스테인 그룹이 결합되어 있고, 이중(di-), 삼중(tri-)의 단백질G 다합체인 것을 특징으로 하는 단백질 G 다합체가 고정화된 자성실리카 나노입자를 이용한 검출용 면역센서의 제조방법.
제 6 항에 있어서,
상기 자성나노입자는 30 ~ 200㎚의 크기를 가지는 것을 특징으로 하는 단백질 G 다합체가 고정화된 자성실리카 나노입자를 이용한 검출용 면역센서의 제조방법.
제 6 항에 있어서,
상기 가교결합시약은 SPDP; N-succinimidyl-3-(2-pyridyldithio) propionate, SMPT; succinimidyloxycarbonyl-α-methyl-α-(2-pyridyldithio)toluene, Sulfo-LC-SMPT; Sulfosuccinimidyl-6-[α-methyl-α- (2-pyridyldithio) toluamido] hexanoate, Sulfo-SMCC; Succonimidyla-4-(N-maleimidomethyl)-cyclohexane-1-carboxylate, MBS; m-Maleimidobenzoyl-N-hydroxy-succinimide ester, SIAB; N-succinimidyl(4-iodoacetyl)-aminobenzoate, SMPB; Succinimidyl-4-(ρ-maleimidophenyl)butyrate, GMBS; N-γ-Maleimidobutyryl-oxysuccinimide ester, SIAX; Succinimidyl-6-[6(((iodoacetyl)amino)-hexanoyl)amino]hexanoate, NPIA; ρ-Nitrophenyl iodoacetate 으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 단백질 G 다합체가 고정화된 자성실리카 나노입자를 이용한 검출용 면역센서의 제조방법.
제 6 항에 있어서,
상기 항체는 Rabbit IgG, Hamster IgG, Guinea Pig IgG, Bovine IgG, Sheep IgG, Goat IgG, Pig IgG, Chicken IgG, Mouse IgG 으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 검출용 면역센서.
청구항 6 내지 11항 중 어느 한 항 기재의 제조방법에 의해 제조되며, 중심핵(core)으로 나노자성체 산화물에 실리카 코팅된 자성실리카 나노입자의 표면에 단백질 G 다합체를 고정화 한 후, 상기 고정화된 단백질 G 다합체에 항체가 고정된 검출용 면역센서.