BR112015001725B1 - Métodos para a detecção de um analito em uma amostra - Google Patents

Métodos para a detecção de um analito em uma amostra Download PDF

Info

Publication number
BR112015001725B1
BR112015001725B1 BR112015001725-8A BR112015001725A BR112015001725B1 BR 112015001725 B1 BR112015001725 B1 BR 112015001725B1 BR 112015001725 A BR112015001725 A BR 112015001725A BR 112015001725 B1 BR112015001725 B1 BR 112015001725B1
Authority
BR
Brazil
Prior art keywords
analyte
support
light source
external light
molecule
Prior art date
Application number
BR112015001725-8A
Other languages
English (en)
Other versions
BR112015001725A2 (pt
Inventor
Pablo DEL PINO GONZÁLEZ DE LA HIGUERA
Beatriz Pelaz Garcia
Ester POLO TOBAJAS
Jesús Martínez De La Fuente
Valeria GRAZÚ BONAVÍA
Victor Parro Garcia
Original Assignee
Universidad De Zaragoza
Fundación Agencia Aragonesa Para La Investigación Y El Desarrollo
Consejo Superior De Investigaciones Científicas
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Universidad De Zaragoza, Fundación Agencia Aragonesa Para La Investigación Y El Desarrollo, Consejo Superior De Investigaciones Científicas filed Critical Universidad De Zaragoza
Publication of BR112015001725A2 publication Critical patent/BR112015001725A2/pt
Publication of BR112015001725B1 publication Critical patent/BR112015001725B1/pt

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/17—Systems in which incident light is modified in accordance with the properties of the material investigated
    • G01N21/25—Colour; Spectral properties, i.e. comparison of effect of material on the light at two or more different wavelengths or wavelength bands
    • G01N21/29—Colour; Spectral properties, i.e. comparison of effect of material on the light at two or more different wavelengths or wavelength bands using visual detection
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/17—Systems in which incident light is modified in accordance with the properties of the material investigated
    • G01N21/55—Specular reflectivity
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/17—Systems in which incident light is modified in accordance with the properties of the material investigated
    • G01N21/55—Specular reflectivity
    • G01N21/552—Attenuated total reflection
    • G01N21/553—Attenuated total reflection and using surface plasmons
    • G01N21/554—Attenuated total reflection and using surface plasmons detecting the surface plasmon resonance of nanostructured metals, e.g. localised surface plasmon resonance
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/75—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated
    • G01N21/77—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated by observing the effect on a chemical indicator
    • G01N21/78—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated by observing the effect on a chemical indicator producing a change of colour
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
    • G01N33/54326—Magnetic particles
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
    • G01N33/54346—Nanoparticles
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54366—Apparatus specially adapted for solid-phase testing
    • G01N33/54386—Analytical elements
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B82—NANOTECHNOLOGY
    • B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
    • B82Y15/00—Nanotechnology for interacting, sensing or actuating, e.g. quantum dots as markers in protein assays or molecular motors
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/75—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated
    • G01N21/77—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated by observing the effect on a chemical indicator
    • G01N21/78—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated by observing the effect on a chemical indicator producing a change of colour
    • G01N2021/786—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated by observing the effect on a chemical indicator producing a change of colour with auxiliary heating for reaction
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2201/00—Features of devices classified in G01N21/00
    • G01N2201/02—Mechanical
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2201/00—Features of devices classified in G01N21/00
    • G01N2201/06—Illumination; Optics
    • G01N2201/061—Sources
    • G01N2201/06113—Coherent sources; lasers
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S977/00—Nanotechnology
    • Y10S977/902—Specified use of nanostructure
    • Y10S977/932—Specified use of nanostructure for electronic or optoelectronic application
    • Y10S977/953—Detector using nanostructure
    • Y10S977/954—Of radiant energy

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Plasma & Fusion (AREA)
  • Investigating Or Analysing Materials By Optical Means (AREA)
  • Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
  • Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)

Abstract

BIOSSENSORES PARA DETECÇÃO VISUAL, MÉTODOS PARA A DETECÇÃO DE UM ANALITO E USO DE UM BIOSSENSOR. A presente invenção refere-se a um biossensor para a detecção visual de um analito, com base nas propriedades de conversão de luz em calor de nanopartículas metálicas: o analito é visualmente detectado pela alteração de cor nas áreas de suporte (em que o analito está presente), produzida como um resultado do calor gerado pelas nanopartículas metálicas em que as mesmas são irradiadas com uma fonte de luz externa. O uso do dito biossensor em um método para a detecção de analitos também é revelado.

Description

CAMPO DA INVENÇÃO
[001] A presente invenção refere-se ao campo de biotecnologia, especificamente, ao campo de biossensores, mais especificamente, ao campo de biossensores com nanopartículas metálicas como um sistema de transdução de sinal.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
[002] Recentemente, os biossensores foram previstos como alternativas analíticas para métodos convencionais em diferentes campos. Um biossensor é um dispositivo de análise constituído por dois elementos fundamentais: um biorreceptor (um anticorpo, uma sonda de DNA, ou uma célula, etc.) preparado para detectar, especificamente, uma substância, de modo a aproveitar a especificidade de interações biomoleculares e um transdutor ou sensor que pode interpretar a reação de reconhecimento biológico produzido pelo receptor e “traduzir a mesma” em um sinal óptico ou elétrico quantificável. Os recursos mais notáveis de tais dispositivos que os tornam opções altamente atrativas como ferramentas analíticas são sua especificidade, alta sensibilidade, capacidade de resposta que leva a um curto tempo de análise, sua capacidade de serem incluídos em sistemas integrados, facilidade de automatização, capacidade de trabalhar em tempo real, sua versatilidade e baixo custo.
[003] O progresso no campo de biossensores reside na experiência adquirida ao longo dos anos em relação à capacidade de reconhecimento e propriedades de diversas biomoléculas. Diversos instrumentos biológicos na faixa dos mais simples, tais como as enzimas ou anticorpos, até os produtos de modificação genética mais complexos foram usados como elementos de reconhecimento. Por outro lado, os avanços recentes na microeletrônica, nanotecnologia e as propriedades únicas de materiais específicos têm sido primordiais para tais dispositivos.
[004] Apesar do supracitado, os métodos de captação atuais nem sempre podem satisfazer as exigências de confiabilidade e velocidade. O tempo necessário para realizar o ensaio e a sensibilidade da técnica são algumas das limitações mais significativas. Embora o desenvolvimento de tais dispositivos tenha sido focado, principalmente, no campo de diagnóstico clínico, seu interesse em outros campos de aplicação é crescente na atualidade, incluindo os campos ambiental, agroalimentar, químico, farmacêutico e militar.
[005] ‘A presente invenção propõe um biossensor inovador baseado nas propriedades de conversão de luz em calor de nanopartículas de metal.
BREVE DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO
[006] Um primeiro aspecto da presente invenção refere-se a um biossensor para detecção visual de um analito que compreende: a. Uma molécula de reconhecimento (biomolécula de captura) capaz de reconhecer o analito-alvo; b. Um suporte com uma superfície sensível ao calor em que a molécula de reconhecimento da etapa a) é imobilizada ou passível de ser imobilizada; c. Uma fonte de luz externa; d. Uma segunda molécula de reconhecimento (biomolécula de detecção) capaz de reconhecer o analito-alvo; e e. Uma nanopartícula de metal que tem uma faixa de plásmon de superfície; em que o analito é visualmente detectado pela alteração de cor nas áreas de suporte em que o analito está presente, produzida como um resultado do calor gerado pelas nanopartículas de metal quando as mesmas são irradiadas com a fonte de luz externa.
[007] Em uma modalidade preferencial do primeiro aspecto da invenção, o biossensor para a detecção visual de um analito compreende: a. Uma molécula de reconhecimento (biomolécula de captura) capaz de reconhecer o analito-alvo, imobilizado em um suporte com uma superfície sensível ao calor; b. Uma fonte de luz externa; e c. A segunda molécula de reconhecimento (biomolécula de detecção) capaz de reconhecer o analito-alvo, ligada à superfície de uma nanopartícula metálica que tem uma banda de plásmon de superfície; em que o analito é visualmente detectado pela alteração de cor nas áreas de suporte em que o analito está presente, produzido como um resultado do calor gerado pelas nanopartículas metálicas, quando as mesmas são irradiadas com a fonte de luz externa.
[008] Um segundo aspecto da presente invenção se refere a um biossensor para a detecção visual de um analito que compreende: a. Uma molécula de reconhecimento (biomolécula de captura) capaz de reconhecer o analito-alvo; b. Um suporte com uma superfície sensível ao calor; c. Uma fonte de luz externa; d. Uma segunda molécula de reconhecimento (biomolécula de detecção) capaz de reconhecer o analito-alvo, opcionalmente ligada a uma molécula marcadora; e e. Nanopartículas metálicas com uma banda de plásmon de superfície funcionalizada com biomoléculas que reconhecem, especificamente, a biomolécula de detecção ou a molécula marcadora com a qual a biomolécula de detecção foi modificada; em que o analito é visualmente detectado pela alteração de cor nas áreas de suporte em que o analito está presente, produzido como um resultado do calor gerado pelas nanopartículas metálicas, quando as mesmas são irradiadas com a fonte de luz externa.
[009] Um terceiro aspecto da presente invenção se refere a um biossensor para a detecção visual de um analito, conforme definido no segundo aspecto da invenção, que compreende: a. Uma molécula de reconhecimento (biomolécula de captura) capaz de reconhecer o analito-alvo; b. Um suporte com uma superfície sensível ao calor; c. uma fonte de luz externa; d. Uma segunda molécula de reconhecimento (biomolécula de detecção) capaz de reconhecer o analito-alvo, ligada a uma ou várias moléculas de biotina; e e. Nanopartículas metálicas com uma banda de plásmon de superfície funcionalizadas com moléculas de estreptavidina, moléculas de avidina, ou similares, que reconhecem, especificamente, as moléculas de biotina; em que o analito é visualmente detectado pela alteração de cor nas áreas de suporte em que o analito está presente, produzido como um resultado do calor gerado pelas nanopartículas metálicas, quando as mesmas são irradiadas com a fonte de luz externa.
[010] Um quarto aspecto da presente invenção se refere a um biossensor para a detecção visual de um analito conforme definido no segundo aspecto da invenção, que compreende: a. Uma molécula de reconhecimento (biomolécula de captura) capaz de reconhecer o analito-alvo; b. Um suporte com uma superfície sensível ao calor; c. Uma fonte de luz externa; d. Uma segunda molécula de reconhecimento, em que a molécula é um anticorpo (anticorpo de detecção) capaz de reconhecer o analito-alvo; e e. Nanopartículas metálicas com uma banda de plásmon de superfície funcionalizada com anticorpos anti-Fc que se liga ao anticorpo de detecção; em que o analito é visualmente detectado pela alteração de cor nas áreas de suporte em que o analito está presente, produzido como um resultado do calor gerado pelas nanopartículas metálicas, quando as mesmas são irradiadas com a fonte de luz externa.
[011] Em uma modalidade particular de qualquer um dos aspectos da invenção, as moléculas de reconhecimento (biomoléculas de captura e detecção) são selecionadas a partir da lista que consiste em anticorpos, peptídeos, enzimas, polissacarídeos, ácidos nucleicos (DNAs, RNAs), aptâmeros ou peptídeos de ácidos nucleicos (PNAs), de preferência, moléculas de DNA e anticorpos.
[012] Em outra modalidade de qualquer um dos aspectos da invenção, a fonte de luz externa é um laser, em que o laser tem um comprimento de onda igual ao comprimento de onda do máximo da banda de plásmon de superfície da nanopartícula metálica.
[013] Em outra modalidade de qualquer um dentre os dois aspectos da invenção, a nanopartícula metálica é selecionada a partir da lista que consiste em: a. nanopartículas de ouro; b. nanopartículas de prata; ou c. nanopartículas de cobre.
[014] A nanopartícula metálica é, de preferência, uma nanoprisma de ouro triangular.
[015] Em outra modalidade de qualquer um dentre os dois aspectos da invenção, a superfície do suporte compreende um papel sensível ao calor ou uma membrana de celulose, membrana de nitrato de celulose ou membrana de acetato de celulose. Preferencialmente, o papel sensível ao calor tem aderido ao mesmo um segundo suporte selecionado a partir da lista que consiste em vidro, silício, cerâmica, poliestireno, membrana de celulose, membrana de nitrato de celulose ou membrana de acetato de celulose.
[016] Um quinto aspecto da presente invenção se refere ao uso de um biossensor de acordo com o primeiro aspecto da invenção para a detecção visual de um analito, o qual compreende: a. Adicionar a amostra, em que o analito a ser determinado está presente, a um suporte com a molécula de reconhecimento de analito (biomolécula de captura) imobilizada no mesmo; b. Incubar o suporte da etapa a) com nanopartículas metálicas funcionalizadas com uma segunda molécula de reconhecimento de analito (biomolécula de detecção); e c. Colocar opcionalmente o suporte sobre uma superfície sensível ao calor se o suporte ainda não compreender a dita superfície; e d. Irradiar o suporte da etapa b) ou c) com a fonte de luz externa.
[017] Um sexto aspecto da invenção se refere ao uso de um biossensor para a detecção visual de um analito conforme definido no segundo aspecto da invenção, para a detecção de um analito que compreende: a. Adicionar a amostra, em que o analito a ser determinado está presente, a um suporte com a molécula de reconhecimento de analito (biomolécula de captura) imobilizada no mesmo; b. Incubar o suporte da etapa a) com uma segunda molécula de reconhecimento de analito (biomolécula de detecção) opcionalmente marcada com um marcador; c. Incubar o suporte da etapa b) com nanopartículas metálicas funcionalizadas com uma biomolécula que reconhece, especificamente, a biomolécula de detecção ou o marcador com o qual a biomolécula de detecção foi modificada; e d. Opcionalmente, colocar o suporte sobre uma superfície sensível ao calor se o suporte ainda não compreender a dita superfície; e e. Irradiar o suporte da etapa c) ou d) com a fonte de luz externa.
[018] Uma modalidade preferencial do sexto aspecto da invenção se refere ao uso de um biossensor para a detecção de um analito, o qual compreende: a. Adicionar a amostra, em que o analito a ser determinado está presente, a um suporte com a molécula de reconhecimento de analito (biomolécula de captura) imobilizada no mesmo; b. Incubar o suporte da etapa a) com uma segunda molécula de reconhecimento de analito (biomolécula de detecção) marcada com pelo menos uma molécula de biotina; c. Incubar o suporte da etapa b) com nanopartículas metálicas funcionalizadas com estreptavidina; e d. Colocar opcionalmente o suporte sobre uma superfície sensível ao calor se o suporte ainda não compreender a dita superfície; e e. Irradiar o suporte da etapa c) ou d) com a fonte de luz externa.
[019] Outra modalidade preferencial do sexto aspecto da invenção se refere ao uso de um biossensor para a detecção de um analito, o qual compreende: a. Adicionar a amostra, em que o analito a ser determinado está presente, a um suporte com a molécula de reconhecimento de analito (biomolécula de captura) imobilizada no mesmo; b. Incubar o suporte da etapa a) com uma segunda molécula de reconhecimento (biomolécula de detecção) que será um anticorpo; c. Incubar o suporte da etapa b) com nanopartículas metálicas funcionalizadas com um anticorpo anti-Fc; e d. Opcionalmente, colocar o suporte sobre uma superfície sensível ao calor se o suporte ainda não compreender a dita superfície; e e. Irradiar o suporte da etapa c) ou d) com a fonte de luz externa.
[020] Um sétimo aspecto da invenção se refere ao uso de um biossensor, conforme definido no primeiro aspecto da invenção, para a detecção de um analito, o qual compreende: a. Adicionar, a uma amostra em que o analito a ser determinado está presente, nanopartículas metálicas funcionalizadas com uma segunda molécula de reconhecimento de analito (biomolécula de detecção); b. Extrair o analito ligado às nanopartículas a partir da amostra da etapa a), de preferência, através de um processo de centrifugação; c. Adicionar a extração da etapa b a um suporte com a molécula de reconhecimento de analito (biomolécula de captura) imobilizada no mesmo; d. Colocar opcionalmente o suporte sobre uma superfície sensível ao calor se o suporte ainda não compreender a dita superfície; e e. Irradiar o suporte da etapa c) ou d) com a fonte de luz externa.
[021] Um oitavo aspecto da presente invenção se refere ao uso de um biossensor de acordo com qualquer um dos aspectos anteriores ou modalidades para a detecção de aditivos, fármacos, microrganismos patogênicos, componentes alimentícios, pesticidas, compostos tóxicos ou na análise de demanda de oxigênio bioquímico.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[022] A Figura 1 mostra o diagrama do sistema de reconhecimento da presente invenção.
[023] A Figura 2: a Figura 2a mostra o reconhecimento de CEA + anticorpo anti-CEA 3C6-nanoprismas. A Figura 2b mostra o reconhecimento de anticorpo anti-CEA 3C6-biotina + estreptavidina-nanoprismas.
[024] A Figura 3: a Figura 3a mostra reconhecimento de anticorpo anti-CEA 3C1 + CEA + anticorpo anti-CEA 3C6-nanoprismas. A Figura 3b mostra reconhecimento de anticorpo anti-CEA 3C1 + CEA+ anticorpo anti-CEA 3C6- biotina + estreptavidina-nanoprismas.
[025] A Figura 4 mostra reconhecimento de anticorpo anti-CEA 3C1 + CEA+ anticorpo anti-CEA 3C6 nanopartículas de ouro.
[026] A Figura 5 mostra reconhecimento de anticorpo anti-CEA 3C1 + CEA + anticorpo anti-CEA 3C6-nanoprismas de ouro com tempos de irradiação diferentes e distâncias diferentes entre a superfície e o laser. A Figura 5a mostra o tempo de irradiação de 10 segundos em uma distância maior. A Figura 5b mostra o tempo de irradiação de 2 segundos em uma distância mais curta.
[027] A Figura 6 mostra reconhecimento de anticorpo anti-CEA 3C1 + CEA + anticorpo anti-CEA 3C6-nanoprismas (em tampão PBS e em amostras de plasma sanguíneo).
[028] A Figura 7 mostra reconhecimento de anticorpo anti-CEA 3C1 + CEA + anticorpo anti-CEA 3C6-nanoprismas de ouro em amostras de plasma sanguíneo e detecção por meio de câmera infravermelha.
[029] A Figura 8 mostra os três diagramas de projeto do biossensor descrito no Exemplo 5.
DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO
[030] A presente invenção se refere a um biossensor que compreende (i) uma molécula de reconhecimento (biomolécula de captura) capaz de reconhecer o analito-alvo; (ii) um suporte com uma superfície sensível ao calor; (iii) uma fonte de luz externa; (iv) uma segunda molécula de reconhecimento (biomolécula de detecção) capaz de reconhecer o analito-alvo e (v) uma nanopartícula metálica que tem uma banda de plásmon de superfície, caracterizado pelo fato de que o analito é visualmente detectado pela alteração de cor nas áreas de suporte em que o analito está presente, produzido como um resultado do calor gerado pelas nanopartículas metálicas, quando as mesmas são irradiadas com a fonte de luz externa.
[031] O biossensor da presente invenção usa as propriedades de conversão de luz em calor de nanopartículas metálicas como um sistema de transdução de sinal. A base para o uso desse sistema como uma identificação em biossensores é devido à presença da banda de absorção de plásmon de superfície. Essas bandas de absorção são produzidas quando a frequência da luz que atinge a nanopartícula está em ressonância com a frequência de oscilação coletiva dos elétrons na banda de condução de partícula, causando excitação. Esse fenômeno é conhecido como “ressonância de plásmon de superfície localizada” (LSPR). A posição no espectro da banda de ressonância depende muito da estrutura (oca ou sólida), tamanho e formato da partícula, assim como do meio dielétrico em que a partícula é encontrada. A LSPR conduz a altos coeficientes de extinção molar (~3x1011 M-1 cm-1), com uma eficiência equivalente a 106 moléculas de fluoróforo e um aumento significante no campo elétrico local próximo à nanopartícula.
[032] As nanopartículas metálicas, tais como nanopartículas de ouro, prata ou cobre, têm esse efeito de ressonância de plásmon de superfície. Quando irradiadas com uma fonte de luz externa de alta intensidade com a frequência adequada, tal como um laser, essas partículas são capazes de liberar parte da energia absorvida na forma de calor, causando um aumento de temperatura localizado em torno de sua superfície.
[033] Essa geração de calor controlada é a base do sistema de detecção inovador que tem sido desenvolvido. Esse calor gerado causa uma mudança perceptível em uma superfície sensível ao calor adequadamente selecionada. Nesse sentido, os inventores da presente invenção descobriram que, surpreendentemente, um limite de detecção da ordem de picogramas é obtido nos experimentos conduzidos com o uso da alteração de cor nas áreas de suporte em que o analito está presente, produzido pelas nanopartículas metálicas, quando as mesmas são irradiadas com a fonte de luz externa como o meio de detecção. Portanto, o Exemplo 4 da presente invenção ilustra como um limite de detecção foi obtido com o uso da detecção visual da presente invenção, sendo que o dito limite tem uma ordem inferior e, portanto, uma sensibilidade maior, àquela alcançada nos experimentos conduzidos com o uso de uma câmera infravermelha com o meio de detecção. Esse resultado surpreendente ocasionou o desenvolvimento de um biossensor que tem as características a seguir: (i) alta sensibilidade, (ii) alta seletividade ou especificidade, de modo que o biossensor interaja exclusivamente com o analito de interesse e não com outros analitos que têm propriedades similares; (iii) alta confiabilidade de modo que não haja problemas de ruído no sistema de transdução devido à amostra a ser analisada; (iv) baixo custo de produção; (v) curto tempo de análise, o qual possibilita ações rápidas, se necessário; (vi) pré-tratamento de amostra, o qual acarreta economias de tempo, material e reagente, é desnecessário; (vii) manuseio simples, de modo que não seja exigido pessoal qualificado para usar o biossensor; (viii) capacidade de executar as análises em tempo real, e (ix) portátil para possibilitar a realização de análise in situ.
[034] Portanto, um primeiro aspecto da presente invenção se refere a um biossensor para a detecção visual de um analito que compreende: a. Uma molécula de reconhecimento (biomolécula de captura) capaz de reconhecer o analito-alvo; b. Um suporte com uma superfície sensível ao calor, em que a molécula de reconhecimento (biomolécula de captura) da etapa a) é imobilizada no mesmo; c. Uma fonte de luz externa; d. Uma segunda molécula de reconhecimento (biomolécula de detecção) capaz de reconhecer o analito-alvo; e e. Uma nanopartícula metálica que tem uma banda de plásmon de superfície; em que o analito é visualmente detectado pela alteração de cor nas áreas de suporte em que o analito está presente, produzido como um resultado do calor gerado pelas nanopartículas metálicas, quando as mesmas são irradiadas com a fonte de luz externa.
[035] Deve-se enfatizar o fato de que no contexto da presente invenção a detecção visual é compreendida como qualquer detecção que pode ser distinguida a olho nu, sem a necessidade de usar qualquer tipo de instrumentação para a detecção, tal como uma câmera infravermelha.
[036] Portanto, em uma modalidade preferencial do primeiro aspecto da invenção, o biossensor para a detecção visual de um analito compreende: a. Uma molécula de reconhecimento (biomolécula de captura) capaz de reconhecer o analito-alvo; b. Um suporte com uma superfície sensível ao calor, em que a molécula de reconhecimento (biomolécula de captura) da etapa a) é imobilizada no mesmo; c. Uma fonte de luz externa; d. Uma segunda molécula de reconhecimento (biomolécula de detecção) capaz de reconhecer o analito-alvo; e e. Uma nanopartícula metálica que tem uma banda de plásmon de superfície; em que o biossensor não compreende qualquer tipo de instrumentação capaz de detectar a conversão de luz em calor das nanopartículas metálicas, quando as mesmas são irradiadas com a fonte de luz externa.
[037] Em outra modalidade preferencial do primeiro aspecto da invenção, o biossensor compreende: a. Uma molécula de reconhecimento (biomolécula de captura) capaz de reconhecer o analito-alvo, imobilizado em um suporte com uma superfície sensível ao calor; b. Uma fonte de luz externa; e c. Uma segunda molécula de reconhecimento (biomolécula de detecção) capaz de reconhecer o analito-alvo, ligada à superfície de uma nanopartícula metálica que tem uma banda de plásmon de superfície; em que o analito é visualmente detectado pela alteração de cor nas áreas de suporte em que o analito está presente, produzido como um resultado do calor gerado pelas nanopartículas metálicas, quando as mesmas são irradiadas com a fonte de luz externa.
[038] No contexto da presente invenção, fonte de luz externa é compreendida como qualquer fonte de radiação eletromagnética com energia entre 380 nm e 1100 nm, com a capacidade de causar excitação da banda LSPR de partículas metálicas à base de ouro, prata, cobre ou qualquer uma de suas ligas ou estados oxidados, de preferência, na faixa infravermelha próxima (entre 750 e 1100 nm), devido ao fato de que a absorção de energia pelas biomoléculas interferentes presentes na amostra, as quais absorvem na faixa visível do espectro (hemoglobina, etc.), não corre nessa faixa de energia. A fonte de luz externa pode ser uma fonte de luz monocromática ou policromática, de preferência, uma fonte de luz monocromática.
[039] No contexto da presente invenção, nanopartícula metálica que tem uma banda de plásmon de superfície é compreendida como qualquer aglomerado mono- ou policristalino de átomos de metal em qualquer um de seus estados de oxidação, ou qualquer uma de duas ligas, com todas as dimensões geométricas entre 1 e 1.000 nm, de preferência, entre 1 e 200 nm. Em uma modalidade preferencial da invenção, os ditos átomos de metal são metais nobres. Em uma modalidade mais preferencial da invenção, os ditos átomos de metal são átomos de ouro, prata ou cobre. Em uma modalidade até mais preferencial da invenção, os mesmos são átomos de prata ou ouro tubulares ou triangulares.
[040] No contexto da presente invenção, molécula de reconhecimento ou biomolécula de captura é compreendida como qualquer molécula com capacidade para reconhecer, especificamente, um analito específico através de qualquer tipo de interação química ou biológica.
[041] No contexto da presente invenção, segunda molécula de reconhecimento ou biomolécula de detecção é compreendida como qualquer molécula com capacidade para reconhecer, especificamente, um analito específico através de qualquer tipo de interação química ou biológica.
[042] As moléculas usadas como elementos de reconhecimento nos biossensores da presente invenção precisam ter uma afinidade suficientemente seletiva para o reconhecimento de um analito específico na presença de outros compostos, adicionalmente a ser estáveis no decorrer do tempo e conservar sua estrutura, assim como sua atividade biológica, uma vez imobilizadas no suporte e na superfície das nanopartículas.
[043] Os anticorpos, peptídeos, enzimas, proteínas, polissacarídeos, ácidos nucleicos (DNAs), aptâmeros ou peptídeos de ácidos nucleicos (PNAs) podem ser usados como moléculas de reconhecimento no sistema desenvolvido.
[044] Na maioria dos casos, os biorreceptores mais amplamente usados são ácidos nucleicos, anticorpos ou fragmentos de anticorpo, sendo que os anticorpos ou fragmentos de anticorpo são aqueles que têm dado origem ao número maior de técnicas úteis para diagnóstico. O motivo está na flexibilidade do sistema imunológico para produzir uma quantidade virtualmente ilimitada de anticorpos com seletividades diferentes e uma alta afinidade para seu antígeno correspondente. Atualmente, é possível obter anticorpos ou fragmentos de anticorpo monoclonais a partir de virtualmente qualquer molécula independentemente do tamanho. Por outro lado, uma das vantagens oferecidas pelos anticorpos é a homogeneidade estrutural dessas proteínas, a qual é independente de sua especificidade. Isso permite padronizar métodos em relação ao uso dos mesmos como reagentes imunoquímicos, tais como a conservação e imobilização dos mesmos sobre a superfície do transdutor. Os fragmentos de anticorpo (fragmento Fab ou Fv de cadeia única) que conservam a estrutura e a capacidade de reconhecimento de antígeno, assim como anticorpos recombinantes, tais como minicorpos ou anticorpos monoclonais de segunda geração, podem ser preparados como moléculas de reconhecimento por meio do uso de técnicas de biologia molecular.
[045] Por outro lado, os aptâmeros são moléculas que podem substituir anticorpos, em determinadas aplicações, devido a seu tamanho pequeno e baixa imunogenicidade. Os aptâmeros são ácidos nucleicos de filamento único que têm formatos tridimensionais bem definidos que permitem que os mesmos se liguem à molécula-alvo de uma maneira similar aos anticorpos. Os aptâmeros combinam as características ideais de moléculas pequenas (baixa imunogenicidade, alta difusão, etc.) e de anticorpos (alta especificidade e afinidade, e estabilidade química). Outra vantagem em relação a anticorpos monoclonais é que os mesmos são quimicamente sintetizados em vez de serem biologicamente expressados.
[046] Os ácidos nucleicos têm capacidade para detectar variações em uma única base em uma sequência de DNA complementar. Os mesmos podem ser usados em processos de sequenciamento de gene, análise de expressão de gene e na detecção de mutações e alterações de DNA associadas a doenças específicas, uma vez que é possível construir sinteticamente sequências de nucleotídeo que correspondem à estrutura de genes identificados anteriormente. Atualmente, o uso dos mesmos está sendo substituído por filamentos de PNA, devido ao fato de que têm uma estabilidade biológica maior (contra degradação por diversas enzimas) e estabilidade química (mais resistentes às variações em pH ou força iônica). Adicionalmente, visto que, diferente de DNA, os mesmos não contêm unidades de 2'-desoxi-D-ribose e nem ligações de fosfodiéster, têm uma estrutura neutra que reduz a repulsão eletrostática durante a hibridização, estabelecendo ligações mais fortes; adicionalmente ao fato de ter uma adsorção não específica inferior.
[047] O elemento de reconhecimento (biomolécula de captura) do sensor será normalmente imobilizado em um suporte com uma superfície sensível ao calor através de retenção física no interior de uma matriz (armadilha), adsorção física em uma matriz por meio de interações iônicas ou hidrofóbicas ou ligação por meio de ligação covalente.
[048] Nesse sentido, no contexto da presente invenção, o suporte com uma superfície sensível ao calor é compreendido como qualquer superfície com capacidade para experimentar uma mudança estrutural quando aquecida, resultando na revelação de imagem. O papel térmico, o qual irá ocasionar um sinal de revelação após ser submetido a um aumento de temperatura devido à sua sensibilidade ao calor, será, de preferência, usado como a superfície sensível ao calor. O papel térmico é considerado como qualquer papel que tem uma camada térmica que incorpora um corante, um sensibilizador e um revelador de cor (independentemente dos componentes químicos com os quais o mesmo tem sido preparado) com capacidade para reagir um com o outro, dando origem a uma imagem após ser submetido a um aumento de temperatura. Em outra modalidade preferencial, qualquer polímero inteligente que, após ser submetido a um estímulo externo, tal como mudança de temperatura, provoca uma resposta nas propriedades do polímero, tais como: contração, flexão, alteração de cor, mudança de estado, luminescência, etc., será usado como a superfície sensível ao calor. Os tipos de polímeros sensíveis à temperatura incluem: PNIPAM, poli(N-isopropilacrilamida), poli(N-vinilpiperidina) ou poli(N- vinilcaprolactam).
[049] Em uma modalidade da invenção, o suporte com uma superfície sensível ao calor do sistema compreende pelo menos um suporte sensível ao calor, em que o reconhecimento molecular ocorre, tal como uma membrana produzida de celulose ou derivados da mesma (nitrato de celulose, acetato de celulose, etc.) ou papel sensível ao calor.
[050] Em outra modalidade da invenção, o suporte com uma superfície sensível ao calor do sistema compreende dois suportes. Um primeiro suporte em que a biomolécula de captura será imobilizada, e sendo que o dito suporte é uma membrana produzida de celulose ou derivados da mesma (nitrato de celulose, acetato de celulose, etc.) ou outros materiais, tais como poliestireno, cerâmica, silício ou vidro. Um segundo suporte que consiste em uma superfície sensível ao calor, o qual ocasionará o sinal de revelação após ser submetido a um aumento de temperatura, será aderido a esse primeiro suporte.
[051] Um segundo aspecto da presente invenção se refere a um biossensor para a detecção visual de um analito que compreende: a. Uma molécula de reconhecimento (biomolécula de captura) capaz de reconhecer o analito-alvo; b. Um suporte com uma superfície sensível ao calor; c. Uma fonte de luz externa; d. Uma segunda molécula de reconhecimento (biomolécula de detecção) capaz de reconhecer o analito-alvo, opcionalmente ligada a uma molécula marcadora; e e. Nanopartículas metálicas com uma banda de plásmon de superfície funcionalizada com biomoléculas que reconhecem, especificamente, a biomolécula de detecção ou o marcador com o qual a biomolécula de detecção foi modificada; em que o analito é visualmente detectado pela alteração de cor nas áreas de suporte, em que o analito está presente, produzido como um resultado do calor gerado pelas nanopartículas metálicas, quando as mesmas são irradiadas com a fonte de luz externa.
[052] Novamente, é observado que a detecção visual é compreendida como qualquer detecção que pode ser distinguida a olho nu, sem a necessidade de usar qualquer tipo de instrumentação para a detecção, tal como uma câmera infravermelha. Portanto, o biossensor do segundo aspecto da invenção não compreende qualquer tipo de instrumentação com capacidade para detectar a conversão de luz em calor das nanopartículas metálicas, quando as mesmas são irradiadas com a fonte de luz externa.
[053] No contexto da presente invenção, as moléculas marcadoras são compreendidas como aquelas moléculas que são reconhecidas por afinidade para uma interação do tipo ligante-proteína ou para reconhecimento molecular por hibridização entre filamentos de ácido nucleico. No primeiro caso, compreende-se que a biomolécula de detecção é modificada com um antígeno, hormônio, vitamina, etiqueta de poli-histidina, ou domínios de lectina, entre outros. Portanto, compreende-se que os NPs são funcionalizados com anticorpos, aptâmeros, receptores, proteínas de ligação, ácidos tricarboxílicos modificados com íons de metal divalentes, ou açúcares com capacidade para interagir especificamente com o marcador da biomolécula de detecção, respectivamente. No segundo caso, compreende-se que tanto a biomolécula de detecção e como o NP de ouro são funcionalizados com filamentos de ácido nucleico de ocorrência natural complementar (ácido desoxirribonucleico ou DNA, ácido ribonucleico ou RNA) ou filamentos de ácido nucleico artificial (ácido nucleico de peptídeo ou PNA, morfolinas, etc.) ou combinações de ambos (DNA-DNA, PNA-DNA, DNA-PNA, PNA-PNA, etc.)
[054] Um terceiro aspecto da presente invenção se refere a um biossensor para a detecção visual, conforme definido no segundo aspecto da invenção, que compreende: a. Uma molécula de reconhecimento (biomolécula de captura) capaz de reconhecer o analito-alvo; b. Um suporte com uma superfície sensível ao calor; c. Uma fonte de luz externa; d. Uma segunda molécula de reconhecimento (biomolécula de detecção) capaz de reconhecer o analito-alvo, ligada a uma ou várias moléculas de biotina; e e. Nanopartículas metálicas com uma banda de plásmon de superfície funcionalizadas com moléculas de estreptavidina, moléculas de avidina, ou similares, que reconhecem, especificamente, as moléculas de biotina; em que o analito é visualmente detectado pela alteração de cor nas áreas de suporte, em que o analito está presente, produzido como um resultado do calor gerado pelas nanopartículas metálicas, quando as mesmas são irradiadas com a fonte de luz externa.
[055] Um quarto aspecto da presente invenção se refere a um biossensor para a detecção visual, conforme definido no segundo aspecto da invenção, que compreende: a. Uma molécula de reconhecimento (biomolécula de captura) capaz de reconhecer o analito-alvo; b. Um suporte com uma superfície sensível ao calor; c. Uma fonte de luz externa; d. Uma segunda molécula de reconhecimento (anticorpo de detecção) capaz de reconhecer o analito-alvo; e e. Nanopartículas metálicas com uma banda de plásmon de superfície funcionalizadas com anticorpos anti-Fc ou anti-IgG que se ligam ao anticorpo de detecção; em que o analito é visualmente detectado pela alteração de cor nas áreas de suporte, em que o analito está presente, produzido como um resultado do calor gerado pelas nanopartículas metálicas, quando as mesmas são irradiadas com a fonte de luz externa.
[056] O dispositivo proposto é um sistema de reconhecimento do tipo “sanduíche”, entre uma molécula de “reconhecimento”, biomolécula de captura (se for uma proteína, tal como um anticorpo, uma sonda de DNA, sonda de PNA, etc.), imobilizada sobre o suporte em que o reconhecimento de analito irá ocorrer, e uma segunda detecção molécula, biomolécula de detecção, (um segundo anticorpo, ou uma sonda de DNA complementar) ligada à superfície da nanopartícula metálica, se de maneira direta ou indireta através da proteína e/ou marcador leitor. Com a funcionalização dos suportes e das nanopartículas com as moléculas de reconhecimento correspondentes, uma série de analitos pode ser detectada seguindo a mesma estratégia.
[057] Adicionalmente, o segundo ao quarto aspectos da presente invenção se refere especificamente a um sistema de detecção universal. De fato, de acordo com o terceiro aspecto da invenção, é verificado como, através do uso de biomoléculas de detecção marcadas com biotina e da funcionalização das nanopartículas metálicas com estreptavidina, as mesmas nanopartículas conjugadas com essa proteína podem ser usadas para reconhecimento de analito diferente com base na interação de avidina-biotina, evitando, assim, de ter que preparar o conjugado de nanopartícula-biomolécula de detecção para cada analito a ser determinado. Outro exemplo seria o quarto aspecto da invenção, em que um sistema de detecção com base na funcionalização das nanopartículas metálicas com um anticorpo anti-Fc capaz de reconhecer a região de Fc de qualquer outro anticorpo poderia usar as mesmas nanopartículas para o reconhecimento de analito diferente, desde que a biomolécula de detecção desse sistema fosse um anticorpo.
[058] Portanto, o dispositivo da presente invenção permite a análise de múltiplas amostras em um único ensaio com um limite de sensibilidade da ordem de picogramas.
[059] Em uma modalidade somente ilustrativa da presente invenção, a detecção de um analito em uma amostra específica pode ser realizada imobilizando-se a molécula de reconhecimento (biomolécula de captura) em uma primeira etapa sobre um suporte, por exemplo, sobre uma membrana de nitrato de celulose. Então, uma segunda etapa é realizada adicionando-se a amostra em que o analito a ser determinado está presente ao suporte, sendo deixado tempo suficiente para que o reconhecimento de antígeno-anticorpo ocorra. Finalmente, em uma terceira etapa, o suporte é incubado com as nanopartículas funcionalizadas com a segunda molécula de reconhecimento (biomolécula de detecção). Após o reconhecimento molecular, o suporte é colocado em uma superfície sensível ao calor, desde que o suporte já não tenha uma superfície sensível ao calor, para que seja irradiado com a fonte de luz externa, por exemplo, um laser de emissão de infravermelho próximo, sendo que o analito é, assim, detectado.
[060] No caso do segundo ao quarto aspecto da presente invenção, o ensaio consiste em uma etapa adicional. Por exemplo, no caso do uso do dispositivo conforme definido no terceiro aspecto da invenção, na terceira etapa, o suporte é incubado com uma solução da molécula de reconhecimento (biomolécula de detecção), por exemplo, um anticorpo secundário marcado com biotina. Após executar as lavagens correspondentes, uma quarta etapa de incubação com as nanopartículas funcionalizadas com estreptavidina é realizada, para irradiar finalmente o suporte com o laser emissor, uma vez que as nanopartículas excedentes são removidas por lavagem do dito suporte.
[061] No caso do quarto aspecto da invenção, em que a nanopartícula tem sido funcionalizada com anticorpos anti-Fc após a etapa de incubação com a amostra, para capturar o analito a ser determinado, uma terceira etapa de incubação com um anticorpo como a biomolécula de detecção é realizada. Após executar as lavagens correspondentes, em uma quarta etapa, as nanopartículas funcionalizadas com o anticorpo anti-Fc são adicionadas, para finalmente irradiar o suporte com o laser emissor, uma vez que o dito suporte é lavado.
[062] Uma possibilidade para aperfeiçoar o limite de detecção do biossensor da presente invenção consiste em primeiramente executar o reconhecimento de analito na amostra adicionando-se as nanopartículas funcionalizadas diretamente na amostra. Portanto, uma vez que o reconhecimento de antígeno-anticorpo tem ocorrido, o analito com as nanopartículas pode ser extraído por meio de centrifugação. Essa etapa permite a concentração do analito independentemente do volume de amostra e permite a extração do analito a partir dos componentes restantes da amostra em que o mesmo se encontra. O restante do método seria executado da mesma forma, conforme descrito acima, uma vez que as nanopartículas com o analito são recuperadas, as mesmas seriam incubadas com a superfície de detecção em que a molécula de reconhecimento tem sido imobilizada.
[063] Portanto, com o biossensor descrito com base nas propriedades das nanopartículas metálicas com uma banda de plásmon de superfície como o sistema de transdução (no efeito de ressonância de plásmon de superfície), é possível detectar diversos analitos diretamente em uma amostra de maneira rápida e seletiva em concentrações muito baixas da ordem de picogramas.
[064] Por outro lado, a presente invenção também se refere a biossensores úteis em métodos de detecção de analito não exclusivamente visual. Especificamente, a presente invenção se refere a um biossensor (doravante “biossensor de pilha termoelétrica 1”) que compreende: a. Uma molécula de reconhecimento (biomolécula de captura) capaz de reconhecer o analito-alvo; b. Um suporte em que a molécula de reconhecimento da etapa a) é imobilizada; c. Uma fonte de luz externa; d. Uma segunda molécula de reconhecimento (biomolécula de detecção) capaz de reconhecer o analito-alvo; e. Uma pilha termoelétrica; e f. Uma nanopartícula metálica que tem uma banda de plásmon de superfície; em que o analito é detectado quando a pilha termoelétrica detecta a conversão de luz em calor das nanopartículas metálicas, quando as mesmas são irradiadas com a fonte de luz externa.
[065] A montagem desse tipo de biossensor é ilustrada na Figura 8 e no Exemplo 5.
[066] Em outra modalidade preferencial da invenção, o biossensor de pilha termoelétrica 1 compreende: a. Uma molécula de reconhecimento (biomolécula de captura) capaz de reconhecer o analito-alvo, imobilizada em um suporte com uma superfície sensível ao calor; b. Uma fonte de luz externa; e c. Uma segunda molécula de reconhecimento (biomolécula de detecção) capaz de reconhecer o analito-alvo, ligada à superfície de uma nanopartícula metálica que tem uma banda de plásmon de superfície.
[067] Outro aspecto da presente invenção se refere a um biossensor (doravante “biossensor de pilha termoelétrica 2”) que compreende: a. Uma molécula de reconhecimento (biomolécula de captura) capaz de reconhecer o analito-alvo; b. Um suporte; c. Uma fonte de luz externa; d. Uma segunda molécula de reconhecimento (biomolécula de detecção) capaz de reconhecer o analito-alvo, opcionalmente ligada a uma molécula marcadora; e. Uma pilha termoelétrica; e f. Nanopartículas metálicas com uma banda de plásmon de superfície funcionalizada com biomoléculas que reconhecem, especificamente, a biomolécula de detecção ou o marcador com o qual a biomolécula de detecção foi modificada; em que o analito é detectado quando a pilha termoelétrica detecta a conversão de luz em calor das nanopartículas metálicas, quando as mesmas são irradiadas com a fonte de luz externa.
[068] Um aspecto adicional da presente invenção se refere ao biossensor de pilha termoelétrica 2, conforme tem sido definido, que compreende: a. Uma molécula de reconhecimento (biomolécula de captura) capaz de reconhecer o analito-alvo; b. Um suporte; c. Uma fonte de luz externa; d. Uma segunda molécula de reconhecimento (biomolécula de detecção) capaz de reconhecer o analito-alvo, ligada a uma ou várias moléculas de biotina; e. Uma pilha termoelétrica; e f. Nanopartículas metálicas com uma banda de plásmon de superfície funcionalizadas com moléculas de estreptavidina, moléculas de avidina ou similares, que reconhecem, especificamente, as moléculas de biotina.
[069] Outro aspecto adicional da presente invenção se refere ao biossensor de pilha termoelétrica 2, conforme tem sido definido, que compreende: a. Uma molécula de reconhecimento (biomolécula de captura) capaz de reconhecer o analito-alvo; b. Um suporte; c. Uma fonte de luz externa; d. Uma segunda molécula de reconhecimento (anticorpo de detecção) capaz de reconhecer o analito-alvo; e. Uma pilha termoelétrica; e f. Nanopartículas metálicas com uma banda de plásmon de superfície funcionalizadas com anticorpos anti-Fc ou anti-IgG que se ligam ao anticorpo de detecção.
[070] O dispositivo proposto é um sistema de reconhecimento do tipo “sanduíche” entre uma molécula de “reconhecimento”, biomolécula de captura (se for uma proteína, tal como um anticorpo, uma sonda de DNA, PNA, etc.), imobilizada no suporte em que o reconhecimento de analito irá ocorrer, e uma segunda molécula de detecção, biomolécula de detecção, (um segundo anticorpo ou uma sonda de DNA complementar) ligada à superfície da nanopartícula metálica se maneira direta ou indireta através da proteína e/ou marcador leitor. Com a funcionalização dos suportes e das nanopartículas com as moléculas de reconhecimento correspondentes, uma série de analitos pode ser detectada seguindo a mesma estratégia.
[071] Adicionalmente, os últimos dois aspectos da presente invenção especificamente se referem a um sistema de detecção universal. De fato, de acordo com esses aspectos da invenção, pode ser verificado como, através do uso de biomoléculas de detecção marcadas com biotina e da funcionalização das nanopartículas metálicas com estreptavidina, as mesmas nanopartículas conjugadas com essa proteína podem ser usadas para reconhecimento de analito diferente com base na interação de avidina-biotina, evitando, assim, de ter que preparar o conjugado de nanopartícula-biomolécula de detecção para cada analito a ser determinado. O sistema de detecção com base na funcionalização das nanopartículas metálicas com um anticorpo anti-Fc capaz de reconhecer a região de Fc de qualquer outro anticorpo poderia usar as mesmas nanopartículas para o reconhecimento de analito diferente, desde que a biomolécula de detecção desse sistema fosse um anticorpo.
[072] Adicionalmente, a presente invenção se refere aos métodos de detecção de analito a seguir.
[073] (1) Método para a detecção de um analito que compreende: a. Adicionar a amostra, em que o analito a ser determinado está presente, a um suporte com a molécula de reconhecimento de analito (biomolécula de captura) imobilizada no mesmo; b. Incubar o suporte da etapa a) com nanopartículas metálicas funcionalizadas com uma segunda molécula de reconhecimento de analito (biomolécula de detecção); c. Irradiar o suporte da etapa b) ou c) com a fonte de luz externa; e d. Detectar o analito com o uso de uma pilha termoelétrica capaz de detectar a conversão de luz em calor das nanopartículas metálicas, quando as mesmas são irradiadas com a fonte de luz externa.
[074] (2) Método para a detecção de um analito que compreende: a. Adicionar a amostra, em que o analito a ser determinado está presente, a um suporte com a molécula de reconhecimento de analito (biomolécula de captura) imobilizada no mesmo; b. Incubar o suporte da etapa a) com uma segunda molécula de reconhecimento de analito (biomolécula de detecção) ligada a pelo menos uma molécula marcadora; c. Incubar o suporte da etapa b) com nanopartículas metálicas funcionalizadas com pelo menos uma molécula que se liga especificamente ao marcador; d. Irradiar o suporte da etapa c) ou d) com a fonte de luz externa; e e. Detectar o analito com o uso de uma pilha termoelétrica capaz de detectar a conversão de luz em calor das nanopartículas metálicas, quando as mesmas são irradiadas com a fonte de luz externa.
[075] Em uma modalidade preferencial do método indicado acima, a molécula marcadora é biotina e a molécula que se liga especificamente ao marcador é avidina ou estreptavidina ou a molécula marcadora é avidina ou estreptavidina e a molécula que se liga especificamente ao marcador é biotina.
[076] (3) Método para a detecção de um analito que compreende: a. Adicionar a amostra, em que o analito a ser determinado está presente, a um suporte com a molécula de reconhecimento de analito (biomolécula de captura) imobilizada no mesmo; b. Incubar o suporte da etapa a) com uma segunda molécula de reconhecimento (biomolécula de detecção), a qual é um anticorpo de detecção; c. Incubar o suporte da etapa b) com nanopartículas metálicas funcionalizadas com anticorpos anti-Fc; d. Irradiar o suporte da etapa c) com a fonte de luz externa; e e. Detectar o analito com o uso de uma pilha termoelétrica capaz de detectar a conversão de luz em calor das nanopartículas metálicas, quando as mesmas são irradiadas com a fonte de luz externa.
[077] (4) Método para a detecção de um analito que compreende: a. Adicionar a uma amostra, em que o analito a ser determinado está presente, nanopartículas metálicas funcionalizadas com uma segunda molécula de reconhecimento de analito (biomolécula de detecção); b. Extrair o analito com as nanopartículas a partir da amostra da etapa a); c. Adicionar a extração da etapa b a um suporte com a molécula de reconhecimento de analito (biomolécula de captura) imobilizada no mesmo; d. Irradiar o suporte da etapa c) com a fonte de luz externa; e e. Detectar o analito com o uso de uma pilha termoelétrica capaz de detectar a conversão de luz em calor das nanopartículas metálicas, quando as mesmas são irradiadas com a fonte de luz externa.
[078] Os biossensores da presente invenção podem ser usados, mas sem qualquer tipo de limitação, para a detecção de aditivos, fármacos, microrganismos patogênicos, componentes alimentícios, pesticidas, compostos tóxicos ou na análise da demanda de oxigênio bioquímico. Os biossensores da presente invenção podem ser usados para a detecção de qualquer tipo de analito tanto de maneira qualitativa como quantitativa.
[079] Os exemplos a seguir servem para somente ilustrar a presente invenção.
EXEMPLOS EXEMPLO 1: SÍNTESE DE NANOPARTÍCULAS METÁLICAS
[080] - Síntese de nanopartículas de ouro: A síntese de nanopartículas de ouro foi realizada seguindo o método descrito por Turkevich et al. “A study of the nucleation e growth processes in the synthesis de colloidal gold”, Discussions of the Faraday Society 1951, 11, 55 a 75. De acordo com esse método, 200 ml de uma solução de ácido tetracloroáurico a 0,01% em água são aquecidos até 100 °C sob agitação, e 5 ml de uma solução de citrato de trissódio a 1% são subsequentemente adicionados como um agente de redução. Uma vez que as nanopartículas são formadas, a solução de cor vermelha é deixada sob agitação até alcançar a temperatura ambiente. As nanopartículas de ouro esféricas com um diâmetro de 14 a 16 nm com uma banda de plásmon de superfície em 519 nm são obtidas.
[081] - Síntese de nanoprismas de ouro triangulares: A síntese de nanoprismas de ouro triangulares foi realizada seguindo o método descrito por Pelaz et al. “Tailoring the synthesis and heating ability of gold nanoprisms for bioapplications”, Langmuir 2012, 28, 8965 a 8970. De acordo com esse método, 100 ml de uma solução 2 mM de ácido tetracloroáurico são misturados com 120 ml de uma solução 0,5 mM de Na2S2O3, deixando a mesma sob agitação durante 9 minutos, depois disso, uma segunda adição de um volume entre 20 a 50 ml da solução de 0,5 mM de Na2S2O3 é executada. Os nanotriângulos de outro com um tamanho que compreende entre 100 a 160 nm com uma banda de plásmon de superfície entre 750 a 1075 nm são obtidos. Antes de conjugá-los com biomoléculas diferentes, os nanoprismas precisam ser passivados por meio da ligação com polietileno glicol (HS-PEG-COOH, 5.000 g/mol). Com essa finalidade, 10 ml da solução de nanoprisma são incubados com 1 mg de PEG em uma solução de NaOH, pH 12, de um dia para o outro. Finalmente, esses nanoprismas são centrifugados durante 15 minutos em 10.000 rpm para remover reagentes em excesso.
[082] - Síntese de nanoprismas de prata triangulares: A síntese foi realizada seguindo o método descrito por Zhang, Q et al, “A systematic study of the synthesis of silver nanoplates: Is citrate a “Magic” reagent?”, Journal of the American Chemical Society 2011, 133 (46), 18931 a 18939. De acordo com esse método, 24,14 mL de água Milli Q são adicionados a uma solução aquosa de nitrato de prata (0,05 M, 50 ul), citrato de trissódio (75 mM, 0,5 ml) e peróxido de hidrogênio (30% em peso, 60 ul) e são misturados agitando-se vigorosamente em temperatura ambiente. Finalmente, uma solução de boroidreto de sódio (NaBH4, 100 mM, 250 ul) é rapidamente adicionada para formar esses nanoprismas. Após cerca de 3 minutos, a solução coloidal altera a partir de uma cor amarela escura para a formação de pequenas partículas de prata para uma cor azulada gerada pelos nanoprismas finais. Os nanotriângulos de prata de 70 nm com uma banda de plásmon de superfície em 700 nm são obtidos.
[083] - Síntese de nanocubos de cobre: A síntese foi realizada seguindo o método descrito por Murphy et al. “Solution-phase synthesis of Cu2O nanocubes”, Nano Letters 2002, 3 (2), 231 a 234. De acordo com esse método, 0,25 mL de uma solução de CuSO4 aquosa é adicionado a 9 ml de uma solução aquosa de CTAB (brometo de cetil-trimetil amônio) com uma concentração variável de 0,01 a 0,1 M. Em seguida, 0,5 mL de uma solução aquosa 0,1 M de ascorbato de sódio é adicionado à solução de Cu(II)-CTAB. As soluções foram aquecidas durante 5 minutos a 55 °C. Uma vez que esse tempo tem transcorrido, 0,2 ml de 0,5 M de hidróxido de sódio é adicionado, causando a aparência imediata de uma cor amarela na solução. As soluções são mantidas a 55 °C durante 10 minutos e são deixadas resfriar em temperatura ambiente. Após 30 minutos, as soluções se transformam em uma cor marrom avermelhada, amarela clara ou amarela escura dependendo da concentração de CTAB usada. As partículas são centrifugadas em 6000 rpm durante 15 minutos e são, então, resuspensas em água. Esse processo é repetido duas vezes para remover o tensoativo. Nesse ponto, os nanocubos em solução têm uma cor vermelha-tijolo em todos os casos. Os nanocubos de cobre com um tamanho de cerca de 420 nm, com diferentes mudanças em sua geometria, de acordo com a quantidade do tensoativo de CTAB usado na síntese, são obtidos.
EXEMPLO 2: FUNCIONALIZAÇÃO DE NANOPARTÍCULAS METÁLICAS
[084] Diferentes tipos de nanopartículas sintetizadas com diversos elementos de reconhecimento, tais como anticorpos, DNA ou PNA, foram funcionalizadas para colocar a presente invenção em prática. Alguns exemplos de funcionalização são descritos abaixo.
[085] - Funcionalização de nanoprismas de ouro triangulares com anticorpos: A funcionalização foi realizada imobilizando-se o anticorpo nos grupos carboxila presentes na superfície da nanopartícula através de química de carbodiimida. Primeiramente, 0,5 mg de nanopartícula é ativada com 1,5 μmoles de EDC e 3,5 μmoles de sulfo-NHS em um volume final de 1 ml de 10 mM de MES, pH 6, durante 30 minutos a 37 °C. Os reagentes em excesso podem ser removidos por centrifugação em 6.000 rpm durante 5 minutos, depois disso, as partículas são suspensas em 10 mM de MES, pH 6, ou por meio do uso de uma coluna de filtração de gel. Uma vez que os grupos carboxila das nanopartículas são ativados, os mesmos são incubados com 2,5 μg de anticorpo em um volume final de 1 ml de 10 mM de MES, pH 6, durante 1 hora a 37 °C. Após a ligação do anticorpo, a superfície da nanopartícula é bloqueada com 50 mM de PEG aminado 750 Da (a-metóxi-w-amino polietileno glicol). Finalmente, as nanopartículas são purificadas após vários ciclos de centrifugação em 6.000 rpm durante 5 minutos.
[086] - Funcionalização de nanoprismas de ouro triangulares com estreptavidina: A funcionalização foi realizada mobilizando-se as moléculas de estreptavidina nos grupos carboxila presentes na superfície da nanopartícula através de química de carbodiimida. Primeiramente, 0,5 mg de nanopartículas é ativada com 1,5 umoles de EDC (1-etil-3-(3-dimetilaminopropil) carbodiimida) e 3,5 umoles de sulfo-NHS (sulfo-N-hidroxisuccinimida) em um volume final de 1 ml de 10 mM de MES, pH 6, durante 30 minutos a 37 °C. Os reagentes em excesso podem ser removidos por centrifugação em 6.000 rpm durante 5 minutos, depois disso, as partículas são suspensas em 10 mM de MES, pH 6, ou por meio do uso de uma coluna de filtração de gel. Uma vez que os grupos carboxila das nanopartículas são ativados, os mesmos são incubados com 1,25 μg de estreptavidina em um volume final de 1 ml de 10 mM de MES, pH 6, durante 1 hora a 37 °C. Após a ligação da proteína, a superfície da nanopartícula é bloqueada com 50 mM de PEG aminado 750 Da (a-metóxi-w-amino polietileno glicol). Finalmente, as nanopartículas são purificadas após vários ciclos de centrifugação em 6.000 rpm durante 5 minutos.
EXEMPLO 3: DETECÇÃO DO MARCADOR CEA EM UMA AMOSTRA COM O USO DO BIOSSENSOR DA PRESENTE INVENÇÃO.
[087] Uma vez que os nanoprismas de ouro são sintetizados e caracterizados (tanto por microscopia eletrônica de transmissão e varredura como por espectroscopia visível por ultravioleta), os mesmos foram funcionalizados com anticorpos anti-CEA monoclonais, Ab3C6 (antígeno anti- carcinoembriônico de camundongo monoclonal 4CA30-3C6, HyTest) e também com a proteína estreptavidina. Para verificar que as moléculas imobilizadas nos nanoprismas mantiveram sua atividade biológica, a biomolécula correspondente foi imobilizada em diferentes concentrações (o marcador CEA ou o anticorpo conjugado à biotina) em uma membrana de nitrocelulose; após a incubação com as nanopartículas funcionalizadas, as membranas depositadas sobre a superfície sensível ao calor foram irradiadas com o laser.
[088] O reconhecimento de CEA + anticorpo anti-CEA 3C6- nanoprismas é ilustrado na Figura 2a.
[089] O reconhecimento de anticorpo anti-CEA 3C6-Biotina + Estreptavidina-nanoprismas é ilustrado na Figura 2b.
[090] Quando o reconhecimento molecular ocorre, os nanoprismas de ouro ficam localizados na membrana, e após serem irradiados com o laser, a energia absorvida pelas nanopartículas é liberada na forma de calor, sendo que um sinal na superfície sensível ao calor é registrado (consulte as Figuras 2a e 2b). Em ambos os casos, os sinais obtidos após a irradiação das amostras com o laser indicam que o reconhecimento de antígeno-anticorpo ou estreptavidina-biotina tinha ocorrido e, portanto, as biomoléculas conjugadas ao nanoprisma mantiveram sua atividade. Por outro lado, tanto as superfícies em que o reconhecimento ocorre como a superfície da nanopartícula tinham sido passivadas de tal modo que as interações não específicas não ocorressem quando não houvesse proteína imobilizada na membrana de nitrocelulose, conforme pode ser visto na amostra 0.
[091] O elemento de reconhecimento do sensor, nesse caso, anticorpo anti-CEA Ab3C1, antígeno anti-carcinoembriônico de camundongo monoclonal 4CA30-3C1, HyTest, foi imobilizado na superfície de detecção seguindo-se diversas metodologias. Foi ligado a superfícies de vidro por meio de ligações covalentes, assim como por meio de adsorção física em diferentes membranas de celulose e nitrocelulose. Os resultados obtidos com o uso de membranas de nitrocelulose com o anticorpo adsorvido na superfície são mostrados abaixo. As duas estratégias descritas acima foram testadas; os nanoprismas funcionalizados com o anticorpo foram diretamente usados e os nanoprismas funcionalizados com estreptavidina após a adição do anticorpo conjugado à biotina anti-CEA 3C6 foram usados. Diferentes amostras com uma concentração decrescente de marcador de tumor CEA diluído em PBS foram analisadas. Após a execução das etapas de reconhecimento descritas no método experimental e, uma vez que as membranas estavam secas, as mesmas foram depositadas sobre a superfície sensível ao calor, nesse caso, em papel térmico, para serem irradiadas durante alguns segundos com um laser emissor de infravermelho próximo (com um comprimento de onda de 1.000 nm).
[092] O reconhecimento de anticorpo anti-CEA 3C1 + CEA + anticorpo anti-CEA 3C6-Nanoprismas é ilustrado na Figura 3a. O reconhecimento de anticorpo anti-CEA 3C1 + CEA + anticorpo anti-CEA 3C6- Biotina + Estreptavidina-Nanoprismas é ilustrado na Figura 3b.
[093] Conforme pode ser visto nas figuras anteriores, o sinal produzido na superfície sensível ao calor gerado pela irradiação dos nanoprismas, uma vez que o reconhecimento de analito ocorre, é mais intenso para o sistema de anticorpo 3C1-CEA-Ab3C6-nanoprisma que para o sistema de anticorpo 3C1-CEA-Ab3C6 Biotina-Estreptavidina-nanoprisma de ouro. Contudo, uma concentração de 0,5 ng de CEA/ml é detectada em ambos os casos. Por outro lado, como um controle negativo, foi verificado que quando o mesmo experimento é executado com o uso de nanopartículas de ouro esféricas de 16 nm de diâmetro funcionalizadas com anticorpo anti-CEA 3C6 (as quais não têm uma banda de absorção no comprimento de onda de emissão do laser usado), nenhum sinal foi, conforme mostrado na Figura 4 (consulte a Figura 4 em que o reconhecimento de anticorpo anti-CEA 3C1 + CEA+ anticorpo anti-CEA 3C6-nanopartículas de ouro é mostrado, em que as nanopartículas de ouro esféricas de 16 nm de diâmetro que não têm uma banda de absorção no comprimento de onda de emissão do laser usado foram usadas.
[094] Para aperfeiçoar a sensibilidade do método, diferentes parâmetros, tais como tempo de irradiação da amostra com o laser e a distância do dito laser a partir da superfície de detecção, podem ser variados. A Figura 5 mostra como, para uma distância menor entre o laser e a superfície, menos tempo de irradiação é necessário e um sinal mais intenso é obtido.
[095] A Figura 5 ilustra o reconhecimento de anticorpo anti-CEA 3C1 + CEA + anti-CEA Ab 3C6-nanoprismas de ouro com diferentes tempos de irradiação e diferentes distâncias entre a superfície e o laser. Um tempo de irradiação de 10 segundos em uma distância de 0,5 cm é usado na Figura 5a; um tempo de irradiação de 2 segundos em 0,1 cm é usado na Figura 5b.
[096] Finalmente, o mesmo experimento do tipo “sanduíche” (Ab3C1 + CEA + Ab3C6-nanoprismas de ouro) foi realizado para detectar o marcador de tumor CEA em amostras de plasma sanguíneo para verificar a especificidade do sistema, assim como o limite de detecção do analito em uma amostra complexa. Foi comparado com os resultados obtidos para a determinação de CEA dissolvido em tampão de PBS. Um limite de detecção de 10 pg de CEA/ml foi obtido em ambos os casos, conforme pode ser visto na Figura 6. Adicionalmente, nenhum tipo de interação não específica foi obtido no controle ou na amostra de plasma.
EXEMPLO 4. EXEMPLO COMPARATIVO COM O USO DE UMA CÂMERA INFRAVERMELHA COMO MEIO DE DETECÇÃO.
[097] As mesmas amostras preparadas para o Exemplo 3 foram usadas nesse experimento. O elemento de reconhecimento do sensor, nesse caso, anticorpo anti-CEA Ab3C1, foi imobilizado por meio de adsorção física em uma membrana de nitrocelulose. Diferentes amostras com uma concentração decrescente de marcador de tumor CEA diluído em plasma sanguíneo foram, então, analisadas. Após a execução das etapas de reconhecimento por meio das nanopartículas funcionalizadas com o anticorpo anti-CEA Ab3C6 descrito no método experimental e, uma vez que as membranas estavam secas, as mesmas foram depositadas em papel térmico.
[098] Um laser emissor de infravermelho próximo em um comprimento de onda de 1.000 nm foi usado para irradiar as nanopartículas. Uma câmera de formação de imagem térmica infravermelha (câmera IR), com capacidade para transformar o calor gerado pelas nanopartículas irradiadas em uma medição quantificável, foi usada como um sistema para detectar o calor gerado pelas nanopartículas após serem irradiadas com o laser.
[099] O aumento de temperatura foi verificado com a câmera IR após irradiar as amostras preparadas para detectar o antígeno de CEA de plasma sanguíneo em diferentes concentrações. Após ser irradiada durante alguns segundos com o laser, a câmera IR registrou um aumento de temperatura de 2 a 3 °C para a amostra de 0,05 ng de CEA/ml, mas nenhum sinal foi obtido no caso da amostra de 0,01 ng de CEA/ml. Para essas mesmas concentrações de analito, um sinal foi detectado no caso de papel térmico depois que foram irradiados com o laser.
[0100] Um limite de detecção menor foi obtido por meio da detecção visual com o uso do suporte em uma superfície sensível ao calor, tal como papel térmico, que quando com o uso da câmera infravermelha como o meio de detecção.
[0101] A Figura 7 compara o reconhecimento de anticorpo anti-CEA 3C1 + CEA + anti-CEA Ab 3C6-nanoprismas de ouro entre a detecção visual por meio de papel térmico (Figura 7a) e a câmera IR como o sistema de detecção (Figura 7b).
EXEMPLO 5. EXPERIMENTOS DE DETECÇÃO COM PILHA TERMOELÉTRICA:
[0102] Nesse caso, o calor gerado pelas nanopartículas após serem irradiadas pelo laser foi medido por meio de uma pilha termoelétrica capaz de transformar o aumento de temperatura gerado em uma área específica em torno da mesma em um sinal elétrico quantificável.
[0103] Com o projeto descrito na Figura 8, (em uma potência de 350 mW) tanto as amostras concentradas como as amostras diluídas foram irradiadas com o laser na membrana e na lamínula de vidro. O primeiro problema que foi encontrado é que se o laser atinge diretamente a pilha, um sinal de fundo muito alto é obtido (então, foi necessário aumentar a temperatura o suficiente para ser distinguível do sinal de fundo). Uma resposta também é obtida se somente a membrana ou a lamínula sem nanopartículas for irradiada (vidro gera um sinal maior que a membrana de nitrocelulose). Uma resposta que foi similar ao controle foi obtida com a amostra diluída, enquanto que o aumento de temperatura poderia ser perfeitamente medido com a amostra concentrada. Precisa ser levado em conta o fato de que, nesse projeto, a amostra estava 3 a 4 cm distante do laser, assim, a sensibilidade será menor se estive diretamente em contato com o laser.
[0104] A calibração com diferentes concentrações de nanopartícula depositadas na membrana de nitrocelulose para os projetos representados na Figura 8, diagramas 2 e 3, foi tentada. No caso do diagrama 2, os resultados não foram obtidos devido ao fato de que a amostra não poderia ser irradiada de uma maneira reproduzível com o laser naquela posição. O experimento foi realizado com o projeto conforme indicado no diagrama 3.
[0105] Três soluções de 140 μg/ml, 14 μg/ml e 1,4 μg/ml de NNs foram preparadas e 1 μl de cada foi depositado em membranas de nitrocelulose (140 ng, 14 ng e 1,4 ng de NNs ^ 6x109, 6x108 e 6x107 nanopartículas). As mesmas foram irradiadas com o laser durante alguns segundos e a leitura foi executada com a pilha termoelétrica antes e depois de colocar a amostra. O sinal de fundo foi registrado entre as amostras. Um sinal que foi um pouco maior que o sinal de fundo foi registrado para a solução mais diluída (1,4 ng de NNs); um sinal claramente distinguível foi obtido com a amostra de 14 ng; a amostra mais concentrada rendeu um sinal muito alto. Para uma calibração que ajusta uma faixa linear, uma série de soluções de baixa concentração teria que ser usada devido ao fato de que, após um determinado valor de concentração, um aumento de temperatura exponencial é obtido com a concentração de nanopartícula.

Claims (21)

1. MÉTODO PARA A DETECÇÃO DE UM ANALITO EM UMA AMOSTRA, caracterizado por compreender as etapas de: (a1) adicionar a amostra que compreende o analito a um suporte possuindo uma primeira molécula de reconhecimento de analito imobilizada no mesmo, em que o suporte compreende uma superfície sensível ao calor; (b1) incubar o suporte da etapa (a1) com nanopartículas metálicas funcionalizadas com uma segunda molécula de reconhecimento de analito; e (c1) irradiar o suporte da etapa (b1) com uma fonte de luz externa; ou (a2) adicionar a amostra que compreende o analito a um suporte possuindo uma primeira molécula de reconhecimento de analito imobilizada no mesmo, em que o suporte não compreende uma superfície sensível ao calor; (b2) incubar o suporte da etapa (a2) com nanopartículas metálicas funcionalizadas com uma segunda molécula de reconhecimento de analito; (c2) colocar o suporte da etapa (b2) em uma superfície sensível ao calor, e (d2) irradiar o suporte da etapa (c2) com uma fonte de luz externa.
2. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo analito ser um aditivo, um fármaco, um microrganismo patogênico, um componente alimentício, um pesticida, um composto tóxico ou para análise da demanda bioquímica de oxigênio.
3. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo analito ser visualmente detectado por uma mudança de cor na área de suporte em que o analito está presente; e em que a mudança de cor é produzida como resultado do calor gerado pelas nanopartículas metálicas quando são irradiadas com a fonte de luz externa.
4. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pela superfície sensível ao calor compreender qualquer superfície capaz de sofrer uma mudança estrutural quando aquecida, resultando no desenvolvimento da imagem.
5. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pela fonte de luz externa ser capaz de causar excitação da banda de absorção de plásmon de superfície das nanopartículas metálicas.
6. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pela fonte de luz externa produzir radiação de comprimento de onda entre 750 nm e 110 nm.
7. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pela fonte de luz externa ser uma fonte de luz monocromática ou policromática.
8. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelas nanopartículas metálicas compreendem ouro, prata ou cobre.
9. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pela superfície sensível ao calor ser um papel térmico ou um polímero sensível à temperatura.
10. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo polímero sensível à temperatura compreender poli(N-isopropilacrilamida), poli(N-vinilpiperidina) ou poli(N-vinilcaprolactam).
11. MÉTODO PARA A DETECÇÃO DE UM ANALITO EM UMA AMOSTRA, caracterizado por compreender as etapas de: (a3) adicionar a amostra que compreende o analito a um suporte com uma primeira molécula de reconhecimento de analito imobilizada no mesmo, em que o suporte compreende uma superfície sensível ao calor; (b3) incubar o suporte da etapa (a3) com uma segunda molécula de reconhecimento de analito ligada a pelo menos uma molécula marcadora; (c3) incubar o suporte da etapa (b3) com nanopartículas metálicas funcionalizadas com pelo menos uma molécula que se liga especificamente à molécula marcadora; e (d3) irradiar o suporte da etapa (c3) com uma fonte de luz externa; ou (a4) adicionar a amostra que compreende o analito a um suporte com uma primeira molécula de reconhecimento de analito imobilizada no mesmo, em que o suporte não compreende uma superfície sensível ao calor; (b4) incubar o suporte da etapa (a4) com uma segunda molécula de reconhecimento de analito que se liga a pelo menos uma molécula marcadora; (c4) incubar o suporte da etapa (b4) com nanopartículas metálicas funcionalizadas com pelo menos uma molécula que se liga especificamente à molécula marcadora; (d4) colocar o suporte da etapa (c4) sobre uma superfície sensível ao calor; e (e4) irradiar o suporte da etapa (d4) com uma fonte de luz externa.
12. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo analito ser visualmente detectado por uma mudança de cor na área de suporte em que o analito está presente; e em que a mudança de cor é produzida como resultado do calor gerado pelas nanopartículas metálicas quando são irradiadas com a fonte de luz externa.
13. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pela molécula marcadora ser a biotina, e pelo menos uma molécula que se liga especificamente ao marcador ser a avidina ou estreptavidina, ou em que a molécula marcadora é a avidina ou estreptavidina, e a molécula que se liga especificamente ao marcador é a biotina.
14. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pela superfície sensível ao calor compreender qualquer superfície capaz de experimentar uma mudança estrutural quando aquecida, resultando no desenvolvimento da imagem.
15. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pela fonte de luz externa ser capaz de causar excitação da banda de absorção de plásmon de superfície das nanopartículas metálicas.
16. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pela fonte de luz externa produzir radiação de comprimento de onda entre 750 nm e 110 nm.
17. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pela fonte de luz externa ser uma fonte de luz monocromática ou policromática.
18. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelas nanopartículas metálicas compreenderem ouro, prata ou cobre.
19. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pela superfície sensível ao calor ser um papel térmico ou um polímero sensível à temperatura.
20. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo polímero sensível à temperatura compreender poli(N-isopropilacrilamida), poli(N-vinilpiperidina) ou poli(N-vinilcaprolactam).
21. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo analito ser um aditivo, um fármaco, um microrganismo patogênico, um componente alimentício, um pesticida, um composto tóxico ou para a análise da demanda bioquímica de oxigênio.
BR112015001725-8A 2012-07-26 2013-07-26 Métodos para a detecção de um analito em uma amostra BR112015001725B1 (pt)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
ES201231209A ES2440368B1 (es) 2012-07-26 2012-07-26 Biosensor con nanoparticulas metálicas
ESP201231209 2012-07-26
PCT/ES2013/070549 WO2014016465A1 (es) 2012-07-26 2013-07-26 Biosensor con nanoparticulas metálicas

Publications (2)

Publication Number Publication Date
BR112015001725A2 BR112015001725A2 (pt) 2017-07-04
BR112015001725B1 true BR112015001725B1 (pt) 2022-08-09

Family

ID=49301525

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
BR112015001725-8A BR112015001725B1 (pt) 2012-07-26 2013-07-26 Métodos para a detecção de um analito em uma amostra

Country Status (18)

Country Link
US (1) US10197566B2 (pt)
EP (1) EP2878950B1 (pt)
JP (1) JP6305402B2 (pt)
CN (1) CN104813158B (pt)
BR (1) BR112015001725B1 (pt)
CY (1) CY1119325T1 (pt)
DK (1) DK2878950T3 (pt)
ES (2) ES2440368B1 (pt)
HK (1) HK1213055A1 (pt)
HR (1) HRP20171128T1 (pt)
HU (1) HUE033318T2 (pt)
LT (1) LT2878950T (pt)
PL (1) PL2878950T3 (pt)
PT (1) PT2878950T (pt)
RS (1) RS56289B1 (pt)
RU (1) RU2658052C2 (pt)
SI (1) SI2878950T1 (pt)
WO (1) WO2014016465A1 (pt)

Families Citing this family (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10794904B2 (en) 2013-03-15 2020-10-06 Nicoya Lifesciences Inc. Self-referencing sensor for chemical detection
DE102014103360A1 (de) 2014-03-12 2015-09-17 Leibniz-Institut Für Neue Materialien Gemeinnützige Gmbh Vorrichtung für die korrelative Raster-Transmissionselektronenmikroskopie (STEM) und Lichtmikroskopie
ES2553027B1 (es) 2014-06-03 2016-09-13 Consejo Superior De Investigaciones Cientificas Un sistema para aplicaciones de biodetección
DE102014108331A1 (de) 2014-06-13 2015-12-17 Leibniz-Institut Für Neue Materialien Gemeinnützige Gesellschaft Mit Beschränkter Haftung Spezifische Proteinmarkierung sowie Verfahren zur Identifizierung der statistischen Verteilung der Proteinstöchiometrie
DE102014108825A1 (de) 2014-06-24 2015-12-24 Leibniz-Institut Für Neue Materialien Gemeinnützige Gesellschaft Mit Beschränkter Haftung Vorrichtung und Verfahren für die stöchiometrische Analyse von Proben
KR101685076B1 (ko) * 2015-06-03 2016-12-09 연세대학교 산학협력단 광전도성 바이오센서
RU2616879C1 (ru) * 2016-03-04 2017-04-18 федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Российский университет дружбы народов" (РУДН) Флуоресцентный оптический ДНК-биосенсор
WO2018133039A1 (zh) * 2017-01-20 2018-07-26 深圳市新产业生物医学工程股份有限公司 制备抗体对的方法、试剂盒及试剂盒的应用和制备抗体对的系统
DK3596232T3 (da) 2017-03-12 2023-08-07 Ilytica Llc Digitale molekylanalyser
KR101973120B1 (ko) * 2017-12-06 2019-04-26 삼성중공업 주식회사 배관 누출 감지 장치
RU2684276C1 (ru) * 2018-03-05 2019-04-05 федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Российский университет дружбы народов" (РУДН) Флуоресцентный оптический ДНК-сенсор
CN116626286B (zh) * 2022-09-07 2024-07-19 北京航空航天大学 基于热成像的智能手机适配体传感器检测分析方法和装置

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5767860A (en) * 1980-10-15 1982-04-24 Fuji Photo Film Co Ltd Material for multilayer analysis
US5017494A (en) * 1986-04-02 1991-05-21 Seiko Instruments & Electronics Ltd. Bio-thermo tip sensor
US6361944B1 (en) * 1996-07-29 2002-03-26 Nanosphere, Inc. Nanoparticles having oligonucleotides attached thereto and uses therefor
FI115166B (fi) * 2001-12-31 2005-03-15 Biofons Oy Diagnostisia menetelmiä
JP4787938B2 (ja) * 2003-03-28 2011-10-05 ザ・プロウボウスト・フェロウズ・ファウンデーション・スカラーズ・アンド・ザ・アザー・メンバーズ・オブ・ボード・オブ・ザ・カレッジ・オブ・ザ・ホリー・アンド・アンデバイデッド・トリニティ・オブ・クイーン 銀ナノ粒子を用いた検体検出用センサ
RU2372117C2 (ru) * 2003-09-18 2009-11-10 Аркюо Медикал, Инк. Способ опто-термо-механического воздействия на биологическую ткань и устройство для его осуществления
CN1902324A (zh) * 2003-11-03 2007-01-24 伊西康公司 比色底物、比色传感器和使用方法
US20060046311A1 (en) * 2004-08-26 2006-03-02 Intel Corporation Biomolecule analysis using Raman surface scanning
US8633140B2 (en) * 2009-02-27 2014-01-21 The Regents Of The University Of Michigan Functionalized polydiacetylene sensors
US8476007B2 (en) * 2010-02-19 2013-07-02 Indian Institute Of Technology Bombay Optical fiber probe

Also Published As

Publication number Publication date
EP2878950B1 (en) 2017-04-26
SI2878950T1 (sl) 2017-11-30
PT2878950T (pt) 2017-08-01
ES2641441T3 (es) 2017-11-10
EP2878950A1 (en) 2015-06-03
CN104813158A (zh) 2015-07-29
JP6305402B2 (ja) 2018-04-04
HUE033318T2 (en) 2017-11-28
ES2440368B1 (es) 2015-03-06
RU2658052C2 (ru) 2018-06-19
CY1119325T1 (el) 2018-02-14
WO2014016465A1 (es) 2014-01-30
CN104813158B (zh) 2018-02-13
RU2015102212A (ru) 2016-09-20
PL2878950T3 (pl) 2017-11-30
LT2878950T (lt) 2017-12-27
RS56289B1 (sr) 2017-12-29
BR112015001725A2 (pt) 2017-07-04
ES2440368R1 (es) 2014-05-08
WO2014016465A9 (es) 2015-03-12
ES2440368A2 (es) 2014-01-28
DK2878950T3 (da) 2017-08-14
JP2015522828A (ja) 2015-08-06
HK1213055A1 (zh) 2016-06-24
US10197566B2 (en) 2019-02-05
HRP20171128T1 (hr) 2017-11-03
US20150293084A1 (en) 2015-10-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
BR112015001725B1 (pt) Métodos para a detecção de um analito em uma amostra
Hang et al. Visible-light and near-infrared fluorescence and surface-enhanced Raman scattering point-of-care sensing and bio-imaging: A review
Cheng et al. Au@ Pd nanopopcorn and aptamer nanoflower assisted lateral flow strip for thermal detection of exosomes
Mittal et al. Biosensors for breast cancer diagnosis: A review of bioreceptors, biotransducers and signal amplification strategies
Szlag et al. Molecular affinity agents for intrinsic surface-enhanced Raman scattering (SERS) sensors
Tang et al. Plasmon-based colorimetric nanosensors for ultrasensitive molecular diagnostics
Tang et al. Nanopore-based strategy for selective detection of single carcinoembryonic antigen (CEA) molecules
Li et al. A fluorescence and surface-enhanced Raman spectroscopic dual-modal aptasensor for sensitive detection of cyanotoxins
Jiang et al. Electrochemiluminescence biosensor based on 3-D DNA nanomachine signal probe powered by protein-aptamer binding complex for ultrasensitive mucin 1 detection
Ye et al. An enzyme-free signal amplification technique for ultrasensitive colorimetric assay of disease biomarkers
Sonawane et al. Surface modification chemistries of materials used in diagnostic platforms with biomolecules
Kordasht et al. Multifunctional aptasensors based on mesoporous silica nanoparticles as an efficient platform for bioanalytical applications: Recent advances
KR101153748B1 (ko) 바이오센서로 유용한 새로운 형태의 금／은 코어쉘 복합체
Jung et al. Self-directed and self-oriented immobilization of antibody by protein G− DNA conjugate
Wang et al. Mixed monolayers on gold nanoparticle labels for multiplexed surface-enhanced Raman scattering based immunoassays
Xu et al. Ultrasensitive detection of severe fever with thrombocytopenia syndrome virus based on immunofluorescent carbon dots/SiO2 nanosphere-based lateral flow assay
He et al. Aptamer recognition induced target-bridged strategy for proteins detection based on magnetic chitosan and silver/chitosan nanoparticles using surface-enhanced Raman spectroscopy
Zhu et al. Hydrophobic plasmonic nanoacorn array for a label-free and uniform SERS-based biomolecular assay
Yaraki et al. Recent advances in metallic nanobiosensors development: colorimetric, dynamic light scattering and fluorescence detection
Wang et al. Biosynthesized quantum dot for facile and ultrasensitive electrochemical and electrochemiluminescence immunoassay
Yang et al. Integrating reliable Pt–S bond-mediated 3D DNA nanomachine with magnetic separation in a homogeneous electrochemical strategy for exosomal MicroRNA detection with low background and high sensitivity
Ng Carbon dots as optical nanoprobes for biosensors
Yang et al. An aptamer-mediated CdSe/ZnS QDs@ graphene oxid composite fluorescent probe for specific detection of insulin
Yang et al. Magnetic colloid antibodies accelerate small extracellular vesicles isolation for point-of-care diagnostics
Zhang et al. ICP-MS and photothermal dual-readout assay for ultrasensitive and point-of-care detection of pancreatic cancer exosomes

Legal Events

Date Code Title Description
B06U Preliminary requirement: requests with searches performed by other patent offices: procedure suspended [chapter 6.21 patent gazette]
B09A Decision: intention to grant [chapter 9.1 patent gazette]
B09X Republication of the decision to grant [chapter 9.1.3 patent gazette]
B16A Patent or certificate of addition of invention granted [chapter 16.1 patent gazette]

Free format text: PRAZO DE VALIDADE: 20 (VINTE) ANOS CONTADOS A PARTIR DE 26/07/2013, OBSERVADAS AS CONDICOES LEGAIS