ES2641441T3 - Biosensor con nanopartículas metálicas - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a un biosensor donde la detección del analito se realiza de forma visual por el cambio de color en las zonas del soporte en que el analito esté presente producido por las nanopartículasal ser irradiadas con una fuente de luz externa.

Description

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DESCRIPCION

Biosensor con nanopartfculas metalicas Campo de la tecnica

La presente invencion se refiere al campo de la biotecnologfa, concretamente al campo de los biosensores, mas concretamente al campo de los biosensores con nanopartfculas metalicas como sistema de transduccion de senales.

Antecedentes de la invencion

En los ultimos anos los biosensores se han contemplado como alternativas analtticas a los metodos convencionales en diferentes campos. Un biosensor es un dispositivo de analisis compuesto por dos elementos fundamentales: un receptor biologico (un anticuerpo, una sonda de ADN, o una celula...) preparado para detectar espedficamente una sustancia aprovechando la especificidad de las interacciones biomoleculares y un transductor o sensor, capaz de interpretar la reaccion de reconocimiento biologico que produce el receptor y “traducirla” en una senal cuantificable, optica o electrica. Las caractensticas mas destacables de estos dispositivos, que los convierten en opciones altamente atractivas como herramientas analtticas son: su especificidad, alta sensibilidad, capacidad de respuesta que conduce a un corto tiempo de analisis, su capacidad de inclusion en sistemas integrados, facilidad de automatizacion, capacidad de trabajar en tiempo real, su versatilidad y bajo coste.

El avance en el campo de los biosensores se apoya en la experiencia adquirida durante anos sobre las propiedades y capacidad de reconocimiento de diversas biomoleculas. Como elementos de reconocimiento se han utilizado numerosos instrumentos biologicos, desde los mas simples como enzimas o anticuerpos, hasta productos de ingeniena genetica mas complejos. Por ejemplo, Haes Aj et al. “Detection of a biomarker for Alzheimer's disease from synthetic and clinical samples using a nanoscale optical biosensor”, Journal of the American Chemical Society 2005, 127(7), 2264-2271), describen un biosensor adecuado para la deteccion de ligandos difusibles derivados de amiloide-p, ADDL. Por otro lado, los ultimos avances en la microelectronica, la nanotecnologfa y las propiedades unicas de determinados materiales han sido claves para este tipo de dispositivos.

A pesar de ello, los actuales metodos de deteccion no siempre pueden responder a las demandas de fiabilidad y rapidez. El tiempo necesario para la realizacion del ensayo y la sensibilidad de la tecnica son algunas de las limitaciones mas importantes. Aunque el desarrollo de estos dispositivos se ha centrado principalmente en el campo del diagnostico clmico; hoy en dfa esta aumentado su interes en otros ambitos de aplicacion que incluyen el medioambiental, agroalimentario, qmmico, farmaceutico y militar.

La presente invencion propone un nuevo biosensor basado en las propiedades de conversion de luz a calor de las partfculas metalicas.

Breve descripcion de la invencion

Un primer aspecto de la presente invencion se refiere a un biosensor para la deteccion visual de un analito que comprende:

a. una molecula de reconocimiento (biomolecula de captura), capaz de reconocer el analito diana, inmovilizada sobre un soporte con una superficie termosensible;

b. una fuente de luz externa; y

c. una nanopartfcula metalica que tiene una banda de plasmon de superficie funcionalizada con una segunda molecula de reconocimiento (biomolecula de deteccion), capaz de reconocer el analito diana;

en el que el termino “superficie termosensible” se entiende como cualquier superficie capaz de experimentar un cambio estructural cuando se calienta, dando como resultado el desarrollo de imagenes.

Un segundo aspecto de la presente invencion se refiere a un biosensor para la deteccion visual de un analito que comprende:

a. una molecula de reconocimiento (biomolecula de captura), capaz de reconocer el analito diana, inmovilizada sobre un soporte con una superficie termosensible;

b. una fuente de luz externa;

c. una segunda molecula de reconocimiento (biomolecula de deteccion), capaz de reconocer el analito diana, opcionalmente unida a una molecula de marcador; y

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d. nanopartfculas metalicas con una banda de plasmon de superficie funcionalizadas con biomoleculas que reconocen espedficamente la biomolecula de deteccion o la molecula de marcador con la que se modifico la biomolecula de deteccion;

en el que el termino “superficie termosensible” se entiende como cualquier superficie capaz de experimentar un cambio estructural cuando se calienta, dando como resultado el desarrollo de imagenes.

Un tercer aspecto de la presente invencion se refiere a un biosensor para la deteccion visual de un analito tal como se definio en el segundo aspecto de la invencion, que comprende:

a. una molecula de reconocimiento (biomolecula de captura), capaz de reconocer el analito diana, inmovilizada sobre un soporte con una superficie termosensible;

b. una fuente de luz externa;

c. una segunda molecula de reconocimiento (biomolecula de deteccion), capaz de reconocer el analito diana, unida a una o varias moleculas de biotina; y

d. nanopartfculas metalicas con una banda de plasmon de superficie funcionalizadas con moleculas de estreptavidina, moleculas de avidina o similares, que reconocen espedficamente las moleculas de biotina;

en el que el termino “superficie termosensible” se entiende como cualquier superficie capaz de experimentar un cambio estructural cuando se calienta, dando como resultado el desarrollo de imagenes.

Un cuarto aspecto de la presente invencion se refiere a un biosensor para la deteccion visual de un analito tal como se definio en el segundo aspecto de la invencion, que comprende:

a. una molecula de reconocimiento (biomolecula de captura), capaz de reconocer el analito diana, inmovilizada sobre un soporte con una superficie termosensible;

b. una fuente de luz externa;

c. una segunda molecula de reconocimiento en la que la molecula es un anticuerpo (anticuerpo de deteccion), capaz de reconocer el analito diana; y

d. nanopartfculas metalicas con una banda de plasmon de superficie funcionalizadas con anticuerpos anti-Fc que se unen al anticuerpo de deteccion;

en el que el termino “superficie termosensible” se entiende como cualquier superficie capaz de experimentar un cambio estructural cuando se calienta, dando como resultado el desarrollo de imagenes.

En una realizacion particular de cualquiera de los aspectos de la invencion, las moleculas de reconocimiento (biomoleculas de captura y deteccion) se seleccionan de la lista que consiste en anticuerpos, peptidos, enzimas, polisacaridos, acidos nucleicos (ADN, ARN), aptameros o acidos nucleicos peptfdicos (ANP). Preferiblemente moleculas de ADN y anticuerpos.

En otra realizacion de cualquiera de los aspectos de la invencion, la fuente de luz externa es un laser, en la que el laser presenta una longitud de onda igual a la longitud de onda del maximo de la banda del plasmon de superficie de la nanopartfcula metalica.

En otra realizacion de cualquiera de los dos aspectos de la invencion, la nanopartfcula metalica se selecciona de la lista que consiste en:

a. nanopartfculas de oro;

b. nanopartfculas de plata; o

c. nanopartfculas de cobre.

Preferiblemente la nanopartfcula metalica es un nanoprisma de oro triangular.

En otra realizacion de cualquiera de los dos aspectos de la invencion, la superficie del soporte comprende un papel termosensible o una membrana de celulosa, membrana de nitrato de celulosa o membrana de acetato de celulosa. Preferiblemente, el papel termosensible presenta adherido al mismo un segundo soporte seleccionado de la lista que consiste en vidrio, silicio, ceramica, poliestireno, membrana de celulosa, membrana de nitrato de celulosa o

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membrana de acetato de celulosa.

Un quinto aspecto de la presente invencion se refiere al uso de un biosensor segun el primer aspecto de la invencion para la deteccion visual de un analito que comprende:

a. anadir la muestra, en la que esta presente el analito que va a determinarse, a un soporte con una superficie termosensible con la molecula de reconocimiento del analito (biomolecula de captura) inmovilizada sobre el mismo;

b. incubar el soporte de la etapa a) con nanopartfculas metalicas con una banda de plasmon de superficie funcionalizadas con una segunda molecula de reconocimiento del analito (biomolecula de deteccion); y

c. irradiar el soporte de la etapa b) con la fuente de luz externa;

en el que el termino “superficie termosensible” se entiende como cualquier superficie capaz de experimentar un cambio estructural cuando se calienta, dando como resultado el desarrollo de imagenes.

Un sexto aspecto de la invencion se refiere al uso de un biosensor para la deteccion visual de un analito tal como se definio en el segundo aspecto de la invencion, para la deteccion de un analito que comprende:

a. anadir la muestra, en la que esta presente el analito que va a determinarse, a un soporte con una superficie termosensible con la molecula de reconocimiento del analito (biomolecula de captura) inmovilizada sobre el mismo;

b. incubar el soporte de la etapa a) con una segunda molecula de reconocimiento del analito (biomolecula de deteccion) opcionalmente marcada con un marcador;

c. incubar el soporte de la etapa b) con nanopartfculas metalicas con una banda de plasmon de superficie funcionalizadas con una biomolecula que reconoce espedficamente la biomolecula de deteccion o el marcador con el que se modifico la biomolecula de deteccion; y

d. irradiar el soporte de la etapa c) con la fuente de luz externa;

en el que el termino “superficie termosensible” se entiende como cualquier superficie capaz de experimentar un cambio estructural cuando se calienta, dando como resultado el desarrollo de imagenes.

Una realizacion preferida del sexto aspecto de la invencion se refiere al uso de un biosensor para la deteccion de un analito que comprende:

a. anadir la muestra, en la que esta presente el analito que va a determinarse, a un soporte con una superficie termosensible con la molecula de reconocimiento del analito (biomolecula de captura) inmovilizada sobre el mismo;

b. incubar el soporte de la etapa a) con una segunda molecula de reconocimiento del analito (biomolecula de deteccion) marcada con al menos una molecula de biotina;

c. incubar el soporte de la etapa b) con nanopartfculas metalicas con una banda de plasmon de superficie funcionalizadas con estreptavidina; y

d. irradiar el soporte de la etapa c) con la fuente de luz externa;

en el que el termino “superficie termosensible” se entiende como cualquier superficie capaz de experimentar un cambio estructural cuando se calienta, dando como resultado el desarrollo de imagenes.

Otra realizacion preferida del sexto aspecto de la invencion se refiere al uso de un biosensor para la deteccion de un analito que comprende:

a. anadir la muestra, en la que esta presente el analito que va a determinarse, a un soporte con una superficie termosensible con la molecula de reconocimiento del analito (biomolecula de captura) inmovilizada sobre el mismo;

b. incubar el soporte de la etapa a) con una segunda molecula de reconocimiento (biomolecula de deteccion) que sera un anticuerpo;

c. incubar el soporte de la etapa b) con nanopartfculas metalicas con una banda de plasmon de superficie funcionalizadas con un anticuerpo anti-Fc; y

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d. irradiar el soporte de la etapa c) con la fuente de luz externa;

en el que el termino “superficie termosensible” se entiende como cualquier superficie capaz de experimentar un cambio estructural cuando se calienta, dando como resultado el desarrollo de imagenes.

Un septimo aspecto de la invencion se refiere al uso de un biosensor tal como se definio en el primer aspecto de la invencion, para la deteccion de un analito que comprende:

a. anadir a una muestra, en la que esta presente el analito que va a determinarse, nanopartmulas metalicas con una banda de plasmon de superficie funcionalizadas con una segunda molecula de reconocimiento del analito (biomolecula de deteccion);

b. extraer el analito unido a las nanopartmulas de la muestra de la etapa a), preferentemente a traves de un procedimiento de centrifugacion;

c. anadir la extraccion de la etapa b) a un soporte con una superficie termosensible con la molecula de reconocimiento del analito (biomolecula de captura) inmovilizada sobre el mismo;

d. irradiar el soporte de la etapa c) con la fuente de luz externa;

en el que el termino “superficie termosensible” se entiende como cualquier superficie capaz de experimentar un cambio estructural cuando se calienta, dando como resultado el desarrollo de imagenes.

Un octavo aspecto de la presente invencion se refiere al uso de un biosensor segun cualquiera de las realizaciones o aspectos anteriores, para la deteccion de aditivos, farmacos, microorganismos patogenos, componentes de los alimentos, pesticidas, compuestos toxicos o en el analisis de la demanda bioqmmica de oxfgeno.

Breve descripcion de las figuras

La figura 1 muestra el esquema del sistema de reconocimiento de la presente invencion.

Figura 2: la figura 2a muestra el reconocimiento CEA + anticuerpo anti-CEA 3C6-nanoprismas. La figura 2b muestra el reconocimiento anticuerpo anti-CEA 3C6-biotina + estreptavidina-nanoprismas.

Figura 3: la figura 3a muestra el reconocimiento anticuerpo anti-CEA 3C1 + CEA + anticuerpo anti-CEA 3C6- nanoprismas. La figura 3b muestra el reconocimiento anticuerpo anti-CEA 3C1 + CEA+ anticuerpo anti-CEA 3C6- biotina + estreptavidina-nanoprismas.

La figura 4 muestra el reconocimiento anticuerpo anti-CEA 3C1 + CEA + anticuerpo anti-CEA 3C6-nanopartfculas de oro.

La figura 5 muestra el reconocimiento anticuerpo anti-CEA 3C1 + CEA + anticuerpo anti-CEA 3C6-nanoprismas de oro con distintos tiempos de irradiacion y diferente distancia entre la superficie y el laser. La figura 5a muestra un tiempo de irradiacion de 10 segundos a una distancia mayor. La figura 5b muestra un tiempo de irradiacion 2 segundos a una distancia menor.

La figura 6 muestra el reconocimiento anticuerpo anti-CEA 3C1 + CEA + anticuerpo anti-CEA 3C6-nanoprismas (en tampon PBS y en muestras de plasma sangumeo).

La figura 7 muestra el reconocimiento anticuerpo anti-CEA 3C1 + CEA + anticuerpo anti-CEA 3C6-nanoprismas de oro en muestras de plasma sangumeo y deteccion mediante camara de infrarrojos.

La figura 8 muestra los tres esquemas de diseno del biosensor descrito en el ejemplo 5.

Descripcion de la invencion

La presente invencion se refiere a un biosensor que comprende (i) una molecula de reconocimiento (biomolecula de captura), capaz de reconocer el analito diana; (ii) un soporte con una superficie termosensible; (iii) una fuente de luz externa; (iv) una segunda molecula de reconocimiento (biomolecula de deteccion), capaz de reconocer el analito diana y (v) una nanopartmula metalica que tiene una banda de plasmon de superficie, caracterizado porque la deteccion del analito se realiza de forma visual por el cambio de color en las zonas del soporte en las que este presente el analito, producido como consecuencia del calor generado por las nanopartmulas metalicas al irradiarse con la fuente de luz externa.

El biosensor de la presente invencion utiliza como sistema de transduccion de senales las propiedades de

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conversion de luz a calor de las nanopartfculas metalicas. La base para la utilizacion de este sistema como marcaje en biosensores se debe a la presencia de la banda de absorcion de plasmon de superficie. Estas bandas de absorcion se producen cuando la frecuencia de la luz incidente sobre la nanopartfcula se encuentra en resonancia con la frecuencia de oscilacion colectiva de los electrones de la banda de conduccion de la partfcula, produciendo su excitacion. Este fenomeno se conoce como “resonancia localizada de plasmon de superficie” (LSPR). La posicion en el espectro de la banda de resonancia depende en gran medida de la forma, tamano y estructura (hueca o maciza) de la partfcula, asf como del medio dielectrico en el que se encuentra la partfcula. La LSPR conduce a altos coeficientes de extincion molar (~3x1011 M-1cm-1), con una eficacia equivalente a 106 moleculas de fluoroforo y un aumento significativo del campo electrico local proximo a la nanopartfcula.

Nanopartfculas metalicas tales como nanopartfculas de oro, plata o de cobre, presentan este efecto de resonancia de plasmon de superficie. Cuando se irradian por una fuente de luz externa de alta intensidad con la frecuencia adecuada, tal como un laser, estas partfculas son capaces de liberar parte de la energfa absorbida en forma de calor, produciendo un aumento localizado de la temperatura alrededor de su superficie.

Esta generacion controlada de calor es la base del nuevo sistema de deteccion que se ha desarrollado. Este calor generado provoca un cambio perceptible en una superficie termosensible adecuadamente seleccionada. En este sentido, los inventores de la presente invencion han descubierto que sorprendentemente se obtiene un lfmite de deteccion del orden de picogramos en los experimentos realizados utilizando como medio de deteccion el cambio de color en las zonas del soporte en las que esta presente el analito producido por las nanopartfculas metalicas al irradiarse con la fuente de luz externa. Asf, el ejemplo 4 de la presente invencion ilustra como se obtuvo un lfmite de deteccion usando la deteccion visual de la presente invencion, teniendo dicho lfmite un orden menor, y por lo tanto una mayor sensibilidad, que el logrado en los experimentos realizados utilizando una camara de infrarrojos como medio de deteccion. Este sorprendente resultado dio lugar al desarrollo de un biosensor que tiene las siguientes caractensticas: (i) alta sensibilidad, (ii) alta selectividad o especificidad, de modo que el biosensor interacciona exclusivamente con el analito de interes y no con otros analitos que tengan propiedades similares; (iii) alta fiabilidad de modo que no habra problemas de ruido en el sistema de transduccion debido a la muestra a analizar; (iv) bajo coste de produccion; (v) tiempo de analisis corto que permite actuaciones rapidas en caso necesario; (vi) el tratamiento previo de la muestra no es necesario, lo que supone un ahorro de tiempo, materiales y reactivos; (vii) manipulacion sencilla, de modo que no se requiere personal cualificado para usar el biosensor; (viii) capacidad para realizar los analisis en tiempo real, y (ix) portatil para permitir la realizacion de analisis in situ.

Por lo tanto, un primer aspecto de la presente invencion se refiere a un biosensor para la deteccion visual de un analito que comprende:

a. una molecula de reconocimiento (biomolecula de captura), capaz de reconocer el analito diana, inmovilizada sobre un soporte con una superficie termosensible;

b. una fuente de luz externa; y

c. una nanopartfcula metalica que tiene una banda de plasmon de superficie funcionalizada con una segunda molecula de reconocimiento (biomolecula de deteccion), capaz de reconocer el analito diana;

en el que el termino “superficie termosensible” se entiende como cualquier superficie capaz de experimentar un cambio estructural cuando se calienta, dando como resultado el desarrollo de imagenes.

Se enfatiza el hecho de que, en el contexto de la presente invencion, se entiende como deteccion visual cualquier deteccion que pude distinguirse a simple vista sin necesidad de emplear ningun tipo de instrumentacion para su deteccion tal como una camara de infrarrojos.

En el contexto de la presente invencion se entiende como fuente de luz externa cualquier fuente de radiacion electromagnetica con energfa entre 380 nm y 1100 nm, con la capacidad de excitar la banda LSPR de partfculas metalicas basadas en oro, plata, cobre o cualquiera de sus aleaciones o estados oxidados, preferiblemente en el rango del infrarrojo cercano (entre 750 y 1100 nm) debido a que en ese rango de energfas no se produce la absorcion de energfa por parte de biomoleculas interferentes presentes en la muestra que absorben en el rango visible del espectro (hemoglobina, etc.). La fuente de luz externa puede ser una fuente de luz monocromatica o policromatica, preferiblemente una fuente de luz monocromatica.

En el contexto de la presente invencion se entiende como nanopartfcula metalica que tiene una banda de plasmon de superficie cualquier agrupacion mono o policristalina de atomos metalicos en cualquiera de sus estados de oxidacion, o cualquiera de sus aleaciones, que tiene todas sus dimensiones geometricas entre 1 y 1000 nm, preferiblemente entre 1 y 200 nm. En una realizacion preferida de la invencion dichos atomos metalicos son metales nobles. En una realizacion mas preferida de la invencion dichos atomos metalicos son atomos de oro, plata o cobre. En una realizacion aun mas preferida de la invencion, son atomos de oro o plata con forma tubular o triangular.

En el contexto de la presente invencion se entiende como molecula de reconocimiento o biomolecula de captura

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cualquier molecula capaz de reconocer de forma espedfica un analito espedfico mediante cualquier tipo de interaccion qmmica o biologica.

En el contexto de la presente invencion se entiende como segunda molecula de reconocimiento o biomolecula de deteccion cualquier molecula capaz de reconocer de forma espedfica un analito espedfico mediante cualquier tipo de interaccion qmmica o biologica.

Las moleculas utilizadas como elementos de reconocimiento en los biosensores de la presente invencion deben tener afinidad suficientemente selectiva para reconocer un analito espedfico, en presencia de otros compuestos, ademas de permanecer estables a lo largo del tiempo y conservar su estructura asf como su actividad biologica una vez inmovilizadas sobre el soporte y sobre la superficie de las nanopartmulas.

En el sistema desarrollado pueden utilizarse como moleculas de reconocimiento anticuerpos, peptidos, enzimas, protemas, polisacaridos, acidos nucleicos (ADN), aptameros o acidos nucleicos peptfdicos (ANP).

En la mayona de los casos los biorreceptores mas ampliamente utilizados son acidos nucleicos, anticuerpos o fragmentos de anticuerpos, siendo los anticuerpos o fragmentos de anticuerpos los que han dado lugar al mayor numero de tecnicas utiles para el diagnostico. La razon se encuentra en la flexibilidad del sistema inmunitario para producir una cantidad practicamente ilimitada de anticuerpos con selectividades diferentes y una alta afinidad por su correspondiente antigeno. Actualmente, es posible obtener anticuerpos monoclonales o fragmentos de anticuerpos de practicamente cualquier molecula con independencia de su tamano. Por otro lado, una de las ventajas ofrecidas por los anticuerpos es la homogeneidad estructural de estas protemas, que es independiente de su especificidad. Esto permite estandarizar metodos relacionados con el uso de los mismos como reactivos inmunoqmmicos, tales como la conservacion o inmovilizacion de los mismos sobre la superficie del transductor. Mediante el uso de tecnicas de biologfa molecular pueden prepararse, como moleculas de reconocimiento, fragmentos de anticuerpo (Fab o fragmento Fv de cadena sencilla) que conservan la estructura y la capacidad de reconocimiento del antfgeno; asf como anticuerpos recombinantes, tales como anticuerpos monoclonales de segunda generacion o minicuerpos.

Por otro lado, los aptameros son moleculas que pueden sustituir a los anticuerpos en determinadas aplicaciones debido a su pequeno tamano y su baja inmunogenicidad. Los aptameros son acidos nucleicos monocatenarios que tienen formas tridimensionales bien definidas que les permiten unirse a la molecula diana de una forma similar a los anticuerpos. Los aptameros combinan las caractensticas optimas de las moleculas pequenas (baja inmunogenicidad, alta difusion, etc.) y de los anticuerpos (alta especificidad y afinidad, y estabilidad qmmica). Otra ventaja con respecto a los anticuerpos monoclonales es que se sintetizan qmmicamente en lugar de expresarse biologicamente.

Los acidos nucleicos son capaces de detectar variaciones de una sola base en una secuencia de ADN complementaria. Pueden utilizarse en procedimientos de secuenciacion genica, analisis de la expresion genica y en la deteccion de mutaciones y alteraciones del ADN asociadas con enfermedades espedficas; ya que es posible construir sinteticamente secuencias de nucleotidos que corresponden a la estructura de genes previamente identificados. Actualmente, se esta sustituyendo el uso de los mismos por cadenas de ANP dado que presentan una mayor estabilidad biologica (frente a la degradacion por diversas enzimas) y estabilidad qmmica (son mas resistentes a variaciones de pH o fuerza ionica). Ademas, dado que, al contrario que el ADN, no contienen ni unidades de 2'-desoxi-D-ribosa ni enlaces fosfodiester, presentan una estructura neutra, lo que reduce la repulsion electrostatica durante la hibridacion, estableciendo enlaces mas fuertes; ademas de presentar una adsorcion inespedfica menor.

El elemento de reconocimiento (biomolecula de captura) del sensor se inmovilizara normalmente sobre un soporte con una superficie termosensible, mediante retencion ffsica en el interior de una matriz (atrapamiento), adsorcion ffsica sobre una matriz por medio de interacciones ionicas o hidrofobas, o union por medio de enlace covalente.

En este sentido, en el contexto de la presente invencion se entiende como soporte con superficie termosensible cualquier superficie capaz de experimentar un cambio estructural al calentarse, dando como resultado el desarrollo de imagenes. Preferiblemente se utilizara como superficie termosensible, papel termico que dara lugar a una senal de desarrollo tras someterse a un aumento de temperatura debido a su sensibilidad al calor. Se considera papel termico cualquier papel que tiene una capa termica que incorpora un colorante, un sensibilizador y un desarrollador de color (independientemente de los componentes qmmicos con los que se haya preparado) capaces de reaccionar entre sf dando lugar a una imagen, tras someterse a un aumento de temperatura. En otra realizacion preferida, se utilizara como superficie termosensible cualquier poffmero inteligente que, tras someterse a un esffmulo externo tal como un cambio de temperatura, da lugar a una respuesta en las propiedades del poffmero tal como: contraccion, flexion, cambio de color, cambio de estado, luminiscencia, etc. Los tipos de poffmeros sensibles a la temperatura incluyen: PNIPAM, poli(N-isopropilacrilamida), poli(N-vinilpiperidina) o poli(N-vinilcaprolactama).

En una realizacion de la invencion el soporte con una superficie termosensible del sistema comprende al menos un soporte termosensible en el que tiene lugar el reconocimiento molecular, tal como una membrana compuesta por celulosa o derivados de la misma (nitrato de celulosa, acetato de celulosa, etc.) o papel termosensible.

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En otra realizacion de la invencion el soporte con una superficie termosensible del sistema comprende dos soportes. Un primer soporte en el que se inmovilizara la biomolecula de captura, y dicho soporte es una membrana compuesta por celulosa o derivados de la misma (nitrato de celulosa, acetato de celulosa, etc.), u otros materiales tales como poliestireno, ceramica, silicio o vidrio. Un segundo soporte que consiste en una superficie termosensible que dara lugar a la senal de desarrollo tras someterse a un aumento de temperatura se adherira a este primer soporte.

Un segundo aspecto de la presente invencion se refiere a un biosensor para la deteccion visual de un analito que comprende:

a. una molecula de reconocimiento (biomolecula de captura), capaz de reconocer el analito diana, inmovilizada sobre un soporte con una superficie termosensible;

b. una fuente de luz externa;

c. una segunda molecula de reconocimiento (biomolecula de deteccion), capaz de reconocer el analito diana, opcionalmente unida a una molecula de marcador; y

d. nanopartfculas metalicas con una banda de plasmon de superficie funcionalizadas con biomoleculas que reconocen espedficamente la biomolecula de deteccion o la molecula de marcador con la que se modifico la biomolecula de deteccion;

en el que el termino “superficie termosensible” se entiende como cualquier superficie capaz de experimentar un cambio estructural cuando se calienta, dando como resultado el desarrollo de imagenes. De nuevo se hacer notar que se entiende como deteccion de forma visual cualquier deteccion que puede distinguirse a simple vista sin necesidad de emplear ningun tipo de instrumentacion para su deteccion tal como una camara de infrarrojos. Por lo tanto, el biosensor del segundo aspecto de la invencion no comprende ningun tipo de instrumentacion capaz de detectar la conversion de luz a calor de las nanopartfculas metalicas al irradiarse con la fuente de luz externa.

En el contexto de la presente invencion se entiende como moleculas de marcador las moleculas que se reconocen mediante afinidad por una interaccion de tipo ligando-protema o por reconocimiento molecular mediante hibridacion entre cadenas de acidos nucleicos. En el primer caso se entiende que la biomolecula de deteccion esta modificada con un antfgeno, hormona, vitamina, cola de polihistidina o dominios de lectina, entre otros. Se entiende por lo tanto que las NP estan funcionalizadas con anticuerpos, aptameros, receptores, protemas de union, acidos tricarboxflicos modificados con iones metalicos divalentes, o azucares capaces de interaccionar de forma espedfica con el marcador de la biomolecula de deteccion, respectivamente. En el segundo caso se entiende que tanto la biomolecula de deteccion como la NP de oro estan funcionalizadas con cadenas complementarias de acidos nucleicos que se producen de manera natural (acido desoxirribonucleico o ADN, acido ribonucleico o ARN) o acidos nucleicos artificiales (acido nucleico peptfdico o ANP, morfolinas, etc.) o combinaciones de ambos (ADN-ADN, ANP- ADN, ADN-ANP, ANP-ANP, etc.).

Un tercer aspecto de la presente invencion se refiere a un biosensor para la deteccion visual de un analito tal como se definio en el segundo aspecto de la invencion, que comprende:

a. una molecula de reconocimiento (biomolecula de captura), capaz de reconocer el analito diana, inmovilizada sobre un soporte con una superficie termosensible;

b. una fuente de luz externa;

c. una segunda molecula de reconocimiento (biomolecula de deteccion), capaz de reconocer el analito diana, unida a una o varias moleculas de biotina; y

d. nanopartfculas metalicas con una banda de plasmon de superficie funcionalizadas con moleculas de estreptavidina, avidina o similares, que reconocen espedficamente las moleculas de biotina;

en el que el termino “superficie termosensible” se entiende como cualquier superficie capaz de experimentar un cambio estructural cuando se calienta, dando como resultado el desarrollo de imagenes.

Un cuarto aspecto de la presente invencion se refiere a un biosensor para la deteccion visual de un analito tal como se definio en el segundo aspecto de la invencion, que comprende:

a. una molecula de reconocimiento (biomolecula de captura), capaz de reconocer el analito diana, inmovilizada sobre un soporte con una superficie termosensible;

b. una fuente de luz externa;

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c. una segunda molecula de reconocimiento en la que la molecula es un anticuerpo (anticuerpo de deteccion), capaz de reconocer el analito diana; y

d. nanopartmulas metalicas con una banda de plasmon de superficie funcionalizadas con anticuerpos anti-Fc que se unen al anticuerpo de deteccion;

en el que el termino “superficie termosensible” se entiende como cualquier superficie capaz de experimentar un cambio estructural cuando se calienta, dando como resultado el desarrollo de imagenes.

El dispositivo propuesto es un sistema de reconocimiento tipo “sandwich”, entre una molecula de “reconocimiento”, biomolecula de captura (ya sea una protema tal como un anticuerpo, una sonda de ADN, sonda de ANP, etc.), inmovilizada sobre el soporte en el que tendra lugar el reconocimiento del analito, y una segunda molecula de deteccion, biomolecula de deteccion (un segundo anticuerpo, o una sonda de ADN complementaria) unida a la superficie de la nanopartmula metalica ya sea de forma directa o de forma indirecta a traves de la protema lectora y/o marcador. Funcionalizando los soportes y las nanopartmulas con las correspondientes moleculas de reconocimiento, pueden detectarse varios analitos siguiendo la misma estrategia.

Adicionalmente, los aspectos segundo a cuarto de la presente invencion se refieren espedficamente a un sistema universal de deteccion. De hecho segun el tercer aspecto de la invencion se verifica que, utilizando biomoleculas de deteccion marcadas con biotina y funcionalizando las nanopartmulas metalicas con estreptavidina, se pueden utilizar las mismas nanopartmulas conjugadas con esta protema para el reconocimiento de diferentes analitos basandose en la interaccion avidina-biotina, evitando de esta manera tener que preparar el conjugado nanopartmula- biomolecula de deteccion para cada analito que va a determinarse. Otro ejemplo sera el cuarto aspecto de la invencion, en el que un sistema de deteccion basado en la funcionalizacion de las nanopartmulas metalicas con un anticuerpo anti-Fc, capaz de reconocer la region Fc de cualquier otro anticuerpo, podra utilizar las mismas nanopartmulas para el reconocimiento de diferentes analitos, siempre que la biomolecula de deteccion de este sistema sea un anticuerpo.

Por lo tanto, el dispositivo de la presente invencion permite el analisis de multiples muestras en un solo ensayo con un lfmite de sensibilidad del orden de picogramos.

En una realizacion meramente ilustrativa de la presente invencion, la deteccion de un analito en una muestra espedfica se puede llevar a cabo inmovilizando en una primera etapa la molecula de reconocimiento (biomolecula de captura) sobre un soporte, por ejemplo sobre una membrana de nitrato de celulosa. Despues se lleva a cabo una segunda etapa anadiendo la muestra, en la que esta presente el analito que va a determinarse, al soporte, dejando tiempo suficiente para que se produzca el reconocimiento antfgeno-anticuerpo. Finalmente, en una tercera etapa, se incuba el soporte con las nanopartmulas funcionalizadas con la segunda molecula de reconocimiento (biomolecula de deteccion). Tras el reconocimiento molecular, se coloca el soporte sobre una superficie termosensible, siempre que el soporte no tenga ya una superficie termosensible, para irradiarse con la fuente de luz externa, por ejemplo un laser de emision en el infrarrojo cercano, detectandose de esta forma el analito.

En el caso de los aspectos segundo a cuarto de la presente invencion, el ensayo consiste en una etapa adicional. Por ejemplo, en el caso de utilizar el dispositivo tal como se definio en el tercer aspecto de la invencion, en la tercera etapa se incuba el soporte con una disolucion de la molecula de reconocimiento (biomolecula de deteccion), por ejemplo un anticuerpo secundario marcado con biotina. Tras realizar los lavados correspondientes, se lleva a cabo una cuarta etapa de incubacion con las nanopartmulas funcionalizadas con estreptavidina, para finalmente irradiar el soporte con el laser de emision una vez eliminadas mediante lavado las nanopartmulas en exceso de dicho soporte.

En el caso del cuarto aspecto de la invencion, en el que se ha funcionalizado la nanopartmula con anticuerpos anti- Fc tras la etapa de incubacion con la muestra, para la captura del analito que va a determinarse, se lleva a cabo una tercera etapa de incubacion con un anticuerpo como biomolecula de deteccion. Tras realizar los lavados correspondientes, en una cuarta etapa, se anaden las nanopartmulas funcionalizadas con el anticuerpo anti-Fc, para finalmente irradiar el soporte con el laser de emision una vez lavado dicho soporte.

Una posibilidad para mejorar el lfmite de deteccion del biosensor de la presente invencion consiste en realizar en primer lugar el reconocimiento del analito en la muestra anadiendo las nanopartmulas funcionalizadas directamente sobre la muestra. Asf, una vez producido el reconocimiento antfgeno-anticuerpo, puede extraerse el analito con las nanopartmulas mediante centrifugacion. Esta etapa permite concentrar el analito independientemente del volumen de muestra y permite extraer el analito del resto de componentes de la muestra en la que se encuentra. El resto del metodo se realizara de la misma forma que se ha descrito anteriormente, una vez recuperadas las nanopartmulas con el analito, se incubaran con la superficie de deteccion en la que se ha inmovilizado la molecula de reconocimiento.

Por lo tanto, con el biosensor descrito basado en las propiedades de las nanopartmulas metalicas con una banda de plasmon de superficie, como sistema de transduccion (en el efecto de resonancia de plasmon de superficie), es posible detectar diversos analitos directamente en una muestra de forma selectiva y rapida, a concentraciones muy

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bajas, del orden de picogramos.

Adicionalmente, los dos ultimos aspectos de la presente invencion se refieren espedficamente a un sistema universal de deteccion. De hecho, segun estos aspectos de la invencion, puede verificarse que utilizando biomoleculas de deteccion marcadas con biotina y funcionalizando las nanopardculas metalicas con estreptavidina; se pueden utilizar las mismas nanopartfculas conjugadas con esta protema para el reconocimiento de diferentes analitos, basandose en la interaccion avidina-biotina, evitando de esta manera tener que preparar el conjugado nanopardcula-biomolecula de deteccion para cada analito que va a determinarse. El sistema de deteccion basado en la funcionalizacion de las nanopartfculas metalicas con un anticuerpo anti-Fc, capaz de reconocer la region Fc de cualquier otro anticuerpo, podra utilizar las mismas nanopartfculas para el reconocimiento de diferentes analitos, siempre que la biomolecula de deteccion de este sistema sea un anticuerpo.

Ademas, la presente invencion se refiere a los siguientes metodos de deteccion de analitos.

(1) Metodo para la deteccion de un analito, que comprende:

a. anadir la muestra, en la que esta presente el analito que va a determinarse, a un soporte con una superficie termosensible con la molecula de reconocimiento del analito (biomolecula de captura) inmovilizada sobre el mismo;

b. incubar el soporte de la etapa a) con nanopartfculas metalicas funcionalizadas con una banda de plasmon de superficie funcionalizadas con una segunda molecula de reconocimiento del analito (biomolecula de deteccion);

c. irradiar el soporte de la etapa b) o c) con la fuente de luz externa; y

d. detectar el analito a traves usando una termopila capaz de detectar la conversion de luz a calor de las nanopartfculas metalicas cuando se irradian con la fuente de luz externa.

(2) Metodo para la deteccion de un analito, que comprende:

a. anadir la muestra, en la que esta presente el analito que va a determinarse, a un soporte con una superficie termosensible con la molecula de reconocimiento del analito (biomolecula de captura) inmovilizada sobre el mismo;

b. incubar el soporte de la etapa a) con una segunda molecula de reconocimiento del analito (biomolecula de deteccion) unida a al menos una molecula de marcador;

c. incubar el soporte de la etapa b) con nanopartfculas metalicas con una banda de plasmon de superficie funcionalizadas con al menos una molecula que se une espedficamente al marcador;

d. irradiar el soporte de la etapa c) o d) con la fuente de luz externa; y

e. detectar el analito usando una termopila capaz de detectar la conversion de luz a calor de las nanopartfculas metalicas al irradiarse con la fuente de luz externa.

En una realizacion preferida del metodo indicado anteriormente, la molecula de marcador es biotina y la molecula que se une espedficamente al marcador es avidina o estreptavidina o la molecula de marcador es avidina o estreptavidina y la molecula que se une espedficamente al marcador es biotina.

(3) Metodo para la deteccion de un analito, que comprende:

a. anadir la muestra, en la que esta presente el analito que va a determinarse, a un soporte con una superficie termosensible con la molecula de reconocimiento del analito (biomolecula de captura) inmovilizada sobre el mismo;

b. incubar el soporte de la etapa a) con una segunda molecula de reconocimiento (biomolecula de deteccion) que es un anticuerpo de deteccion;

c. incubar el soporte de la etapa b) con nanopartfculas metalicas con una banda de plasmon de superficie funcionalizadas con anticuerpos anti-Fc;

d. irradiar el soporte de la etapa c) con la fuente de luz externa y

e. detectar el analito usando una termopila capaz de detectar la conversion de luz a calor de las nanopartfculas metalicas cuando se irradian con la fuente de luz externa.

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(4) Metodo para la deteccion de un analito, que comprende:

a. anadir a una muestra, en la que esta presente el analito que va a determinate, nanopartfculas metalicas con una banda de plasmon de superficie funcionalizadas con una segunda molecula de reconocimiento del analito (biomolecula de deteccion);

b. extraer el analito con las nanopartfculas de la muestra de la etapa a);

c. anadir la extraccion de la etapa b a un soporte con una superficie termosensible con la molecula de reconocimiento del analito (biomolecula de captura) inmovilizada sobre el mismo;

d. irradiar el soporte de la etapa c) con la fuente de luz externa; y

e. detectar el analito usando una termopila capaz de detectar la conversion de luz a calor de las nanopartfculas metalicas cuando se irradian con la fuente de luz externa.

Los biosensores de la presente invencion se pueden utilizar, pero sin limitacion alguna, para la deteccion de aditivos,

farmacos, microorganismos patogenos, componentes de los alimentos, pesticidas, compuestos toxicos o en el

analisis de la demanda bioqmmica de oxfgeno. Los biosensores de la presente invencion se pueden utilizar para la

deteccion de cualquier tipo de analito tanto de forma cualitativa como cuantitativa.

Los siguientes ejemplos sirven meramente para ilustrar la presente invencion.

Ejemplos

Ejemplo 1: Sintesis de nanoparticulas metalicas

- Sintesis de nanoparticulas de oro: La sintesis de nanoparticulas de oro se llevo a cabo siguiendo el metodo descrito por Turkevich et al. “A study of the nucleation and growth processes in the synthesis of colloidal gold”, Discussions of the Faraday Society 1951, 11, 55-75. De acuerdo con este metodo, se calientan 200 ml de una disolucion de acido tetracloroaurico al 0,01% en agua hasta 100°C con agitacion, y posteriormente se anaden 5 ml de una disolucion de citrato de trisodio al 1% como agente reductor. Una vez formadas las nanoparticulas, se deja la disolucion de color rojo con agitacion hasta alcanzar temperatura ambiente. Se obtienen nanoparticulas de oro esfericas que tienen un diametro de 14-16 nm con una banda de plasmon de superficie a 519 nm.

- Sintesis de nanoprismas de oro triangulares: La sintesis de nanoprismas de oro triangulares se llevo a cabo siguiendo el metodo descrito por Pelaz et al. “Tailoring the synthesis and heating ability of gold nanoprisms for bioapplications”, Langmuir 2012, 28, 8965-70. De acuerdo con este metodo, se mezclan 100 ml de una disolucion de acido tetracloroaurico 2 mM con 120 ml de una disolucion de Na2S2O3 0,5 mM, dejandolo con agitacion durante 9 minutos, tras lo cual se realiza una segunda adicion de un volumen de entre 20-50 ml de la disolucion de Na2S2O3 0,5 mM. Se obtienen nanotriangulos de oro que tienen un tamano comprendido entre 100-160 nm con una banda de plasmon de superficie entre 750-1075 nm. Antes de conjugarlos con diferentes biomoleculas, deben pasivarse los nanoprismas mediante la union con polietilenglicol (HS-PEG-COOH, 5000 g/mol). Para ello, se incuban 10 ml de la disolucion de nanoprismas con 1 mg de PEG en una disolucion de NaOH, pH 12, durante la noche. Finalmente se centrifugan estos nanoprismas durante 15 minutos a 10.000 rpm para eliminar el exceso de reactivos.

- Sintesis de nanoprismas de plata triangulares: La sintesis se llevo a cabo siguiendo el metodo descrito por Zhang, Q et al, “A systematic study of the synthesis of silver nanoplates: Is citrate a “Magic” reagent?”, Journal of the American Chemical Society 2011, 133 (46), 18931-18939. De acuerdo con este metodo, se anaden 24,14 ml de agua Milli Q a una disolucion acuosa de nitrato de plata (0,05 M, 50 ul), citrato de trisodio (75 mM, 0,5 ml) y peroxido de hidrogeno (al 30% en peso, 60 ul), y se mezclan agitando vigorosamente a temperatura ambiente. Finalmente se anade rapidamente una disolucion de borohidruro de sodio (NaBH4, 100 mM, 250 ul) para formar estos nanoprismas. Despues de aproximadamente 3 minutos, la disolucion coloidal cambia de un color amarillo oscuro debido a la formacion de pequenas partfculas de plata a un color azulado generado por los nanoprismas finales. Se obtienen nanotriangulos de plata de 70 nm que tienen una banda de plasmon de superficie a 700 nm.

- Sintesis de nanocubos de cobre: La sintesis se llevo a cabo siguiendo el metodo descrito por Murphy et al. “Solution-phase synthesis of Cu2O nanocubes”, Nano Letters 2002, 3 (2), 231-234. De acuerdo con este metodo, se anaden 0,25 ml de una disolucion acuosa de CuSO4 a 9 ml de una disolucion acuosa de CTAB (bromuro de cetil-trimetilamonio) con una concentracion variable de 0,01-0,1 M. A continuacion, se anaden 0,5 ml de una disolucion acuosa de ascorbato de sodio 0,1 M a la disolucion de Cu(II)-CTAB. Se calentaron las disoluciones durante 5 minutos a 55°C. Una vez transcurrido este tiempo, se anaden 0,2 ml de hidroxido de sodio 0,5 M, provocando la aparicion inmediata de un color amarillo en la disolucion. Se mantienen las disoluciones a 55°C durante 10 min y se dejan enfriar a temperatura ambiente. Despues de 30 minutos, las disoluciones pasan a un

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color marron rojizo, amarillo claro o amarillo oscuro, dependiendo de la concentracion de CTAB utilizada. Se centrifugan las partteulas a 6000 rpm durante 15 minutes y luego se resuspenden en agua. Se repite este procedimiento dos veces para la eliminacion del tensioactivo. En este punto los nanocubos en disolucion tienen un color rojo ladrillo en todos los casos. Se obtienen nanocubos de cobre con un tamano de aproximadamente 420 nm, con diferentes cambios en su geometna segun la cantidad del tensioactivo CTAB usada en la smtesis.

Ejemplo 2: Funcionalizacion de nanopartteulas metalicas

Para poner en practica la presente invencion se funcionalizaron diferentes tipos de nanopartteulas sintetizadas con diversos elementos de reconocimiento tales como anticuerpos, ADN o ANP. A continuacion se describen algunos ejemplos de funcionalizacion.

- Funcionalizacion de nanoprismas de oro triangulares con anticuerpos: La funcionalizacion se llevo a cabo mediante inmovilizacion del anticuerpo sobre los grupos carboxilo presentes en la superficie de la nanopartteula, a traves de la qmmica de carbodiimida. En primer lugar se activan 0,5 mg de nanopartteulas con 1,5 |imoles de EDC y 3,5 |imoles de sulfo-NHS en un volumen final de 1 ml de MES 10 mM, pH 6, durante 30 minutos a 37°C. El exceso de reactivos puede eliminarse mediante centrifugacion a 6000 rpm durante 5 minutos, tras lo cual se suspenden las partteulas en MES 10 mM, pH 6, o mediante el uso de una columna de filtracion en gel. Una vez activados los grupos carboxilos de las nanopartteulas, se incuban con 2,5 |ig de anticuerpo en un volumen final de 1 ml de MES 10 mM, pH 6, durante 1 hora a 37°C. Tras la union del anticuerpo, se bloquea la superficie de la nanopartteula con PEG aminado (a-metoxi-ro-amino-polietilenglicol) de 750 Da, 50 mM. Finalmente se purifican las nanopartteulas tras varios ciclos de centrifugacion a 6000 rpm durante 5 minutos.

- Funcionalizacion de nanoprismas de oro triangulares con estreptavidina: La funcionalizacion se llevo a cabo mediante inmovilizacion de las moleculas de estreptavidina sobre los grupos carboxilo presentes en la superficie de la nanopartteula, a traves de la qmmica de carbodiimida. En primer lugar se activan 0,5 mg de nanopartteulas con 1,5 umoles de EDC (1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida) y 3,5 umoles de sulfo-NHS (sulfo-N- hidroxisuccinimida) en un volumen final de 1 ml de MES 10 mM, pH 6, durante 30 minutos a 37°C. El exceso de reactivos puede eliminarse mediante centrifugacion a 6000 rpm durante 5 minutos, tras lo cual se suspenden las partteulas en MES 10 mM, pH 6, o mediante el uso de una columna de filtracion en gel. Una vez activados los grupos carboxilos de las nanopartteulas, se incuban con 1,25 |ig de estreptavidina en un volumen final de 1 ml de MES 10 mM, pH 6, durante 1 hora a 37°C. Tras la union de la protema, se bloquea la superficie de la nanopartteula con PEG aminado (a-metoxi-ro-amino-polietilenglicol) de 750 Da, 50 mM. Finalmente se purifican las nanopartteulas tras varios ciclos de centrifugacion a 6000 rpm durante 5 minutos.

Ejemplo 3: Deteccion del marcador CEA en una muestra utilizando el biosensor de la presente invencion.

Una vez sintetizados y caracterizados los nanoprismas de oro (tanto por microscopia electronica de transmision de barrido como por espectroscopia ultravioleta-visible), se funcionalizaron con anticuerpos monoclonales anti-CEA, Ab3C6 (antfgeno anti-carcinoembrionario de raton monoclonal 4CA30-3C6, HyTest) y tambien con la protema estreptavidina. Para verificar que las moleculas inmovilizadas sobre los nanoprismas manteman su actividad biologica, se inmovilizo la biomolecula correspondiente a diferentes concentraciones (el marcador CEA o el anticuerpo conjugado con biotina) sobre una membrana de nitrocelulosa; tras incubar con las nanopartteulas funcionalizadas se irradiaron con el laser las membranas depositadas sobre la superficie termosensible.

El reconocimiento CEA + anticuerpo anti-CEA 3C6-nanoprismas se ilustra en la figura 2a. El reconocimiento anticuerpo anti-CEA 3C6-biotina + estreptavidina-nanoprismas se ilustra en la figura 2b.

Al producirse el reconocimiento molecular, los nanoprismas de oro quedan ubicados sobre la membrana, y tras irradiarse con el laser, la energfa absorbida por las nanopartteulas se libera en forma de calor registrandose una senal en la superficie termosensible (veanse las figuras 2a y 2b). En ambos casos las senales obtenidas tras irradiar las muestras con el laser indicaban que se habfa producido el reconocimiento antigeno-anticuerpo o estreptavidina- biotina, y por tanto las biomoleculas conjugadas con los nanoprismas manteman su actividad. Por otro lado tanto las superficies en las que tiene lugar el reconocimiento como la superficie de la nanopartteula se habfan pasivado de forma que no se producen interacciones inespedficas cuando no hay protema inmovilizada sobre la membrana de nitrocelulosa, tal como puede observarse en la muestra 0.

El elemento de reconocimiento del sensor, en este caso el anticuerpo anti-CEA Ab3C1, antfgeno anti- carcinoembrionario de raton monoclonal 4CA30-3C1, HyTest, se inmovilizo sobre la superficie de deteccion siguiendo diversas metodologfas. Se unio a superficies de vidrio mediante enlaces covalentes asf como mediante adsorcion ffsica sobre diferentes membranas de celulosa y nitrocelulosa. A continuacion se muestran los resultados obtenidos utilizando membranas de nitrocelulosa con el anticuerpo adsorbido sobre la superficie. Se sometieron a prueba las dos estrategias descritas anteriormente; se utilizaron los nanoprismas funcionalizados con el anticuerpo directamente y se utilizaron los nanoprismas funcionalizados con estreptavidina despues de anadir el anticuerpo anti-CEA 3C6 conjugado con biotina. Se analizaron diferentes muestras con una concentracion decreciente del

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marcador tumoral CEA diluido en PBS. Tras realizar las etapas de reconocimiento descritas en el metodo experimental y una vez secas las membranas, se depositaron sobre la superficie termosensible, en este caso sobre papel termico, para irradiarse durante unos segundos con un laser de emision en el infrarrojo cercano (con una longitud de onda de 1000 nm).

El reconocimiento anticuerpo anti-CEA 3C1 + CEA + anticuerpo anti-CEA 3C6-nanoprismas se ilustra en la figura 3a. El reconocimiento anticuerpo anti-CEA 3C1 + CEA + anticuerpo anti-CEA 3C6-biotina + estreptavidina-nanoprismas se ilustra en la figura 3b.

Como puede observarse en las figuras anteriores, la senal producida en la superficie termosensible generada por la irradiacion de los nanoprismas una vez producido el reconocimiento del analito es mas intensa para el sistema anticuerpo 3C1-CEA-Ab3C6-nanoprismas que para el sistema anticuerpo 3C1-CEA-Ab3C6 biotina-estreptavidina- nanoprismas de oro. Sin embargo, en ambos casos se detecta una concentracion de 0,5 ng de CEA/ml. Por otro lado, como control negativo, se verifico que al realizar el mismo experimento utilizando nanopartmulas de oro esfericas de 16 nm de diametro funcionalizadas con anticuerpo anti-CEA 3C6 (que no tienen una banda de absorcion a la longitud de onda de emision del laser utilizado), no se obtema ninguna senal, tal como se muestra en la figura 4 (vease la figura 4 en la que se muestra el reconocimiento anticuerpo anti-CEA 3C1 + CEA+ anticuerpo anti-CEA 3C6-nanopartmulas de oro, en la que se utilizaron nanopartmulas de oro esfericas de 16 nm de diametro que no tienen banda de absorcion a la longitud de onda de emision del laser utilizado).

Para mejorar la sensibilidad del metodo pueden variarse diferentes parametros tales como el tiempo de irradiacion de la muestra con el laser y la distancia de dicho laser desde la superficie de deteccion. La figura 5 muestra como para una menor distancia entre el laser y la superficie, es necesario menos tiempo de irradiacion y se obtiene una senal mas intensa.

La figura 5 ilustra el reconocimiento anticuerpo anti-CEA 3C1 + CEA + Ac anti-CEA 3C6-nanoprismas de oro con diferentes tiempos de irradiacion y diferentes distancias entre la superficie y el laser. En la figura 5a se utiliza un tiempo de irradiacion de 10 segundos a una distancia de 0,5 cm; en la figura 5b se utiliza un tiempo de irradiacion de 2 segundos a 0,1 cm.

Finalmente se llevo a cabo el mismo experimento de tipo “sandwich” (Ab3C1 + CEA + Ab3C6-nanoprismas de oro) para detectar el marcador tumoral CEA en muestras de plasma sangumeo para verificar la especificidad del sistema asf como el lfmite de deteccion del analito en una muestra compleja. Se comparo con los resultados obtenidos para la determinacion de CEA disuelto en tampon PBS. En ambos casos se obtuvo un lfmite de deteccion de 10 pg de CEA/ml, tal como puede observarse en la figura 6. Ademas, no se obtuvo ningun tipo de interaccion inespedfica ni en el control ni en la muestra de plasma sin CEA.

Ejemplo 4. Ejemplo comparativo utilizando como medio de deteccion una camara de infrarrojos.

Para el presente experimento se utilizaron las mismas muestras preparadas para el ejemplo 3. El elemento de reconocimiento del sensor, en este caso el anticuerpo anti-CEA Ab3C1, se inmovilizo mediante adsorcion ffsica sobre una membrana de nitrocelulosa. A continuacion se analizaron diferentes muestras con una concentracion decreciente del marcador tumoral CEA diluido en plasma sangumeo. Tras realizar las etapas de reconocimiento mediante las nanopartmulas funcionalizadas con el anticuerpo anti-CEA Ab3C6 descritas en el metodo experimental y una vez secas las membranas, se depositaron sobre papel termico.

Se utilizo un laser de emision en el infrarrojo cercano, a una longitud de onda de 1000 nm para irradiar las nanopartmulas. Como sistema para detectar el calor generado por las nanopartmulas tras irradiarse con el laser, se utilizo una camara termica de obtencion de imagenes en el infrarrojo (camara IR), capaz de trasformar el calor generado por las nanopartmulas irradiadas en una medida cuantificable.

Se verifico el aumento de temperatura con la camara IR tras irradiar las muestras preparadas para detectar el antfgeno CEA en plasma sangumeo a diferentes concentraciones. Tras irradiarse unos segundos con el laser, la camara IR registro un aumento de temperatura de 2-3°C para la muestra de 0,05 ng de CEA/ml, pero no se obtuvo ninguna senal en el caso de la muestra de 0,01 ng de CEA/ml. Para estas mismas concentraciones de analito se detecto una senal en el caso del papel termico, tras irradiarse las muestras con el laser.

Se obtuvo un lfmite de deteccion menor mediante la deteccion visual utilizando el soporte sobre una superficie termosensible tal como papel termico que cuando se uso la camara de infrarrojos como medio de deteccion.

La figura 7 compara el reconocimiento anticuerpo anti-CEA 3C1 + CEA + Ac anti-CEA 3C6-nanoprismas de oro entre la deteccion visual mediante papel termico (figura 7a) y la camara IR como sistema de deteccion (figura 7b).

Ejemplo 5. Experimentos de deteccion con termopila:

En este caso se midio el calor generado por las nanopartmulas tras irradiarse por el laser mediante una termopila,

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capaz de transformar el aumento de temperatura, generado en un area espedfica a su alrededor en una senal electrica cuantificable.

Con el diseno descrito en la figura 8 (a una potencia de 350 mW) se irradiaron las muestras tanto concentrada como diluida con el laser en la membrana y en el cubreobjetos de vidrio. El primer problema que se encontro es que si el laser incide directamente en la pila, se obtiene una senal de fondo muy alta (por lo que era necesario un aumento de la temperatura suficiente como para ser distinguible de la senal de fondo). Tambien se obtiene una respuesta si se irradia solo la membrana o el cubreobjetos sin nanopartfculas (el vidrio da una senal mas alta que la membrana de nitrocelulosa). Con la muestra diluida se obtuvo una respuesta que era similar al control, mientras que el aumento de temperatura podfa medirse perfectamente con la muestra concentrada. Hay que tener en cuenta que en este diseno la muestra estaba a 3-4 cm del laser, por lo que la sensibilidad va a ser mas baja que si esta directamente en contacto con el laser.

Se intento realizar una calibracion con diferentes concentraciones de nanopartfculas depositadas sobre la membrana de nitrocelulosa para los disenos representados en la figura 8, esquemas 2 y 3. En el caso del esquema 2, no se obtuvieron resultados ya que no pudo irradiarse la muestra de forma reproducible con el laser en esa posicion. Se llevo a cabo el experimento con el diseno como se indica en el esquema 3.

Se prepararon tres disoluciones de 140 pg/ml, 14 pg/ml y 1,4 pg/ml de NN y se deposito 1 pl de cada una sobre membranas de nitrocelulosa (140 ng, 14 ng y 1,4 ng de NN ^ 6*109, 6*108 y 6*10' nanopartfculas). Se irradiaron con el laser durante unos segundos y se realizo la lectura con la termopila antes y despues de poner la muestra. Entre muestras, se recupero la senal de fondo. Para la disolucion mas diluida (1,4 ng de NN) se registro una senal que era algo superior a la senal de fondo; con la muestra de 14 ng se obtuvo una claramente distinguible; la muestra mas concentrada produjo una senal muy alta. Para realizar una calibracion que se ajuste a un rango lineal, habna que utilizar una serie de disoluciones de baja concentracion, ya que a partir de un determinado valor de concentracion se obtiene un aumento exponencial de la temperatura con la concentracion de nanopartfculas.

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REIVINDICACIONES

Biosensor para la deteccion visual que comprende:

a. una molecula de reconocimiento capaz de reconocer el analito diana, inmovilizada sobre un soporte con una superficie termosensible;

b. una fuente de luz externa; y

c. una nanopardcula metalica que tiene una banda de plasmon de superficie funcionalizada con una segunda molecula de reconocimiento capaz de reconocer el analito diana;

en el que el termino “superficie termosensible” se entiende como cualquier superficie capaz de experimentar un cambio estructural cuando se calienta, dando como resultado el desarrollo de imagenes.

Biosensor para la deteccion visual que comprende:

a. una molecula de reconocimiento capaz de reconocer el analito diana inmovilizada sobre un soporte con una superficie termosensible;

b. una fuente de luz externa;

c. una segunda molecula de reconocimiento capaz de reconocer el analito diana, opcionalmente unida a una molecula de marcador; y

d. nanopartfculas metalicas con una banda de plasmon de superficie funcionalizadas con biomoleculas que reconocen espedficamente la biomolecula de deteccion o el marcador con el que se modifico la biomolecula de deteccion;

en el que el termino “superficie termosensible” se entiende como cualquier superficie capaz de experimentar un cambio estructural cuando se calienta, dando como resultado el desarrollo de imagenes.

Biosensor segun la reivindicacion 2, en el que la molecula de marcador es biotina y la molecula que se une espedficamente al marcador es avidina o estreptavidina o en el que la molecula de marcador es avidina o estreptavidina y la molecula que se une al marcador es biotina.

Biosensor segun la reivindicacion 2, en el que la segunda molecula de reconocimiento es un anticuerpo y la nanopartfcula metalica que tiene una banda de plasmon de superficie esta funcionalizada con un anticuerpo anti-Fc capaz de reconocer la region Fc de la segunda molecula de reconocimiento.

Biosensor segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que las moleculas de reconocimiento se seleccionan de la lista que consiste en anticuerpos, peptidos, enzimas, polisacaridos, acidos nucleicos (ADN), aptameros o acidos nucleicos peptfdicos (ANP).

Biosensor segun la reivindicacion 5, en el que las moleculas de reconocimiento son anticuerpos, ADN o ANP.

Biosensor segun las reivindicaciones 1-6, en el que la fuente de luz externa es una luz monocromatica.

Biosensor segun las reivindicaciones 1-7, en el que la nanopartfcula metalica se selecciona de la lista que consiste en:

a. nanopartfculas de oro

b. nanopartfculas de plata; o

c. nanopartfculas de cobre.

Biosensor segun la reivindicacion 8, en el que la nanopartfcula metalica es un nanoprisma de oro triangular.

Biosensor segun cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la superficie termosensible del soporte es un papel termosensible.

Biosensor segun la reivindicacion 10, en el que el papel termosensible se combina con un soporte seleccionado de la lista que consiste en vidrio, silicio, ceramica, poliestireno, membrana de celulosa, membrana de nitrato de celulosa o membrana de acetato de celulosa.

12.

10

15 13.

20

25

30

14.

35 15.

40

45

50

16.

55

60

Metodo para la deteccion de un analito, que comprende:

a. anadir la muestra en la que esta presente el analito que va a determinate, a un soporte con una superficie termosensible con la molecula de reconocimiento del analito inmovilizada sobre el mismo;

b. incubar el soporte de la etapa a) con nanoparttulas metalicas con una banda de plasmon de superficie funcionalizadas con una segunda molecula de reconocimiento del analito; y

c. irradiar el soporte de la etapa b) con una fuente de luz externa;

en el que el termino “superficie termosensible” se entiende como cualquier superficie capaz de experimentar un cambio estructural cuando se calienta, dando como resultado el desarrollo de imagenes.

Metodo para la deteccion de un analito, que comprende:

a. anadir la muestra, en la que esta presente el analito que va a determinarse, a un soporte con una superficie termosensible con la molecula de reconocimiento del analito inmovilizada sobre el mismo;

b. incubar el soporte de la etapa a) con una segunda molecula de reconocimiento del analito unida a al menos una molecula de marcador;

c. incubar el soporte de la etapa b) con nanopartfculas metalicas con una banda de plasmon de superficie funcionalizadas con al menos una molecula que se une espedficamente al marcador; y

d. irradiar el soporte de la etapa c) con una fuente de luz externa;

en el que el termino “superficie termosensible” se entiende como cualquier superficie capaz de experimentar un cambio estructural cuando se calienta, dando como resultado el desarrollo de imagenes.

Metodo segun la reivindicacion 13, en el que la molecula de marcador es biotina y la molecula que se une espedficamente al marcador es avidina o estreptavidina o en el que la molecula de marcador es avidina o estreptavidina y la molecula que se une espedficamente al marcador es biotina.

Metodo para la deteccion de un analito, que comprende:

a. anadir la muestra, en la que esta presente el analito que va a determinarse, a un soporte con una superficie termosensible con la molecula de reconocimiento del analito inmovilizada sobre el mismo;

b. incubar el soporte de la etapa a) con una segunda molecula de reconocimiento que es un anticuerpo de deteccion;

c. incubar el soporte de la etapa b) con nanopartfculas metalicas con una banda de plasmon de superficie funcionalizadas con anticuerpos anti-Fc; y

d. irradiar el soporte de la etapa c) con una fuente de luz externa;

en el que el termino “superficie termosensible” se entiende como cualquier superficie capaz de experimentar un cambio estructural cuando se calienta, dando como resultado el desarrollo de imagenes.

Metodo para la deteccion de un analito, que comprende:

a. anadir a una muestra, en la que esta presente el analito que va a determinarse, nanopartfculas metalicas con una banda de plasmon de superficie funcionalizadas con una segunda molecula de reconocimiento del analito;

b. extraer el analito con las nanopartfculas de la muestra de la etapa a);

c. anadir la extraccion de la etapa b) a un soporte con una superficie termosensible con la molecula de reconocimiento del analito inmovilizada sobre el mismo;

d. irradiar el soporte de la etapa c) con una fuente de luz externa;

en el que el termino “superficie termosensible” se entiende como cualquier superficie capaz de experimentar un cambio estructural cuando se calienta, dando como resultado el desarrollo de imagenes.

17. Uso de un biosensor segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, para la deteccion de aditivos, farmacos, microorganismos patogenos, componentes de los alimentos, pesticidas, compuestos toxicos o en el analisis de la demanda bioqmmica de oxigeno.