CN104813158B - 带有金属纳米颗粒的生物传感器 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了用于分析物可视化检测的生物传感器，其基于金属纳米颗粒将光转化为热的性质：其中当用所述外部光源照射所述金属纳米颗粒时，所述金属纳米颗粒产生的热量使得放置有所述分析物的支架区域产生颜色变化，通过该颜色变化来对所述分析物进行可视化检测。本发明还包含所述生物传感器在检测分析物的方法中的用途。

Description

带有金属纳米颗粒的生物传感器
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及生物传感器领域，更具体而言，涉及带有金属纳米颗粒作为信号传导系统的生物传感器的领域。
背景技术
近年来，生物传感器在不同领域中均被看作是取代传统方法的分析替代方法。生物传感器是一种分析装置，由两个基本部分构成：生物受体(抗体、DNA探针或细胞等)，用于利用生物分子相互作用的特异性来特异性检测物质；以及，转换器或传感器，能够将所述受体产生的生物识别反应诠释并“转换”为可量化光信号或电信号。令这些装置成为具有极大吸引力的分析工具的最大优点，在于其特异性、高敏感度、能缩短分析时间的反应能力、能够在整合系统中进行诱导的能力、自动化之便利、实时操作能力、多功能性、低成本。
依靠在识别能力和各种生物分子性质领域的多年经验，带来了生物传感器领域的进步。许多生物装置，从最简单的例如酶或抗体，到更为复杂的基因工程产物，已被用作识别因子。另一方面，微电子领域、纳米技术和特殊材料独特性质方面的新近进展，已经令所述装置取得了关键性进展。
尽管如此，目前的感应方法并非总能够达到可靠性和速度方面的要求。最大的限制部分在于用于进行试验的必要时间和技术灵敏性。虽然这些装置的进步主要集中在临床诊断领域，如今，其在其他领域的应用也在上升，包括环境、农产品、化学、医药和军事领域。
本发明提供一种基于金属纳米颗粒将光转换为热的性质的新型生物传感器。
发明内容
本发明的第一个方面涉及用于对分析物进行可视化检测的生物传感器，包括：
a.识别分子(捕获生物分子)，能够识别目标分析物；
b.带有热敏表面的支架，步骤a中所述的识别分子固定在或被发现固定在所述表面上；
c.外部光源；
d.第二识别分子(检测生物分子)，能够识别目标分析物；以及
e.具有表面等离子带的金属纳米颗粒；
其中，以所述外部光源照射所述金属纳米颗粒，使其产生热量，使得置有所述分析物的所述支架区域产生颜色变化，从而对所述分析物进行可视化检测。
本发明的第一方面的一个优选实施例中，用于对分析物进行可视化检测的生物传感器，包括：
a.识别分子(捕获生物分子)，能够识别目标分析物，且固定在具有热敏表面的支架上；
b.外部光源；以及
c.能够识别目标分析物的第二识别分子(检测生物分子)，其与具有表面等离子带的金属纳米颗粒相结合；
其中，以所述外部光源照射所述金属纳米颗粒，使其产生热量，使得放置有所述分析物的所述支架区域产生颜色变化，从而对所述分析物进行可视化检测。
本发明的第二个方面涉及用于对分析物进行可视化检测的生物传感器，包括：
a.识别分子(捕获生物分子)，能够识别目标分析物；
b.带有热敏表面的支架，步骤a中所述的识别分子固定在所述表面上；
c.外部光源；
d.第二识别分子(检测生物分子)，能够识别目标分析物，所述目标分析物可选地与标记分子结合；以及
e.具有表面等离子带的金属纳米颗粒，其以能够特异性识别所述检测生物分子或所述检测生物分子的修饰标记分子的生物分子进行功能化；
其中，当用所述外部光源照射所述金属纳米颗粒时，所述金属纳米颗粒产生的热量使得放置有所述分析物的支架区域产生颜色变化，通过该颜色变化来对所述分析物进行可视化检测。
本发明的第三方面涉及如本发明第二方面所述的用于对分析物进行可视化检测的生物传感器，包括：
a.识别分子(捕获生物分子)，能够识别目标分析物；
b.带有热敏表面的支架；
c.外部光源；
d.第二识别分子(检测生物分子)，能够识别目标分析物，所述目标分析物与一种或多种生物素分子结合；以及
e.具有表面等离子带的金属纳米颗粒，其以能够特异性识别所述生物素分子的链霉亲和素分子、抗生物素蛋白分子等进行功能化；
其中，当用所述外部光源照射所述金属纳米颗粒时，所述金属纳米颗粒产生的热量使得放置有所述分析物的支架区域产生颜色变化，通过该颜色变化来对所述分析物进行可视化检测。
本发明的第四方面涉及如本发明第二方面所述的用于对分析物进行可视化检测的生物传感器，包括：
a.识别分子(捕获生物分子)，能够识别目标分析物；
b.带有热敏表面的支架；
c.外部光源；
d.第二识别分子，所述分子为抗体(检测生物分子)，能够识别目标分析物；以及
e.具有表面等离子带的金属纳米颗粒，其以能够与所述检测抗体结合的抗Fc抗体进行功能化；
其中，以所述外部光源照射所述金属纳米颗粒，使其产生热量，从而使得置有所述分析物的所述支架区域产生颜色变化，从而对所述分析物进行可视化检测。
在本发明任一方面的特定实施例中，所述识别分子(捕获和检测生物分子)选自：抗体、多肽、酶、多糖、核酸(DNAs、RNAs)、适体或多肽核酸(PNAs)，优选为DNA分子和抗体。
在本发明的任一方面的又一实施例中，所述外部光源为激光，其中所述激光的波长与所述金属纳米颗粒的表面等离子带的最大波长相等。
在本发明的两方面中任一种的又一实施例中，所述金属纳米颗粒选自：
a.金纳米颗粒；
b.银纳米颗粒；或
c.铜纳米颗粒。
所述金属纳米颗粒优选为三角形纳米金单晶体。
在本发明的两方面中任一种的又一实施例中，所述支架的表面包括热敏纸或纤维素膜、硝酸纤维素膜或醋酸纤维素膜。优选地，所述热敏纸粘附在第二支架上，所述第二支架选自：玻璃、硅、陶瓷、聚苯乙烯、纤维素膜、碳酸纤维素膜或乙酸纤维素膜。
本发明的第五方面涉及将如本发明第一方面所述的生物传感器用于检测分析物的用途，包括：
a.将含有待测定的分析物的样品添加到固定了分析物识别分子(捕获生物分子)的支架上；
b.将步骤a所述支架与以第二分析物识别分子(检测生物分子)功能化的金属纳米颗粒共培养；
c.可选地，若所述支架不包含热敏表面，则将所述支架置于所述热敏表面上；以及
d.以外部光源照射所述步骤b或c中所述支架。
本发明的第六个方面涉及将如本发明第二方面所述的生物传感器用于检测分析物的用途，包括：
a.将含有待测定的分析物的样品添加到固定了分析物识别分子(捕获生物分子)的支架上；
b.将步骤a所述支架与第二分析物识别分子(检测生物分子，可选地标记示踪)共培养；
c.将步骤b所述支架与以能够特异性识别所述检测生物分子或所述检测生物分子的修饰标记功能化的金属纳米颗粒共培养；
d.可选地，若所述支架不包含热敏表面，则将所述支架置于所述热敏表面上；以及
e.以外部光源照射所述步骤c或d中所述支架。
本发明的第六个方面的一个优选实施例，涉及用于检测分析物的生物传感器的用途，包括：
a.将含有待测定的分析物的样品添加到固定了分析物识别分子(捕获生物分子)的支架上；
b.将步骤a所述支架与以至少一种生物素分子进行标记的第二分析物识别分子(检测生物分子)共培养；
c.将步骤b所述支架与以链霉亲和素功能化的金属纳米颗粒共培养；
d.可选地，若所述支架不包含热敏表面，则将所述支架置于所述热敏表面上；以及
e.以外部光源照射所述步骤c或d中所述支架。
本发明的第六个方面的一个优选实施例，涉及用于检测分析物的生物传感器的用途，包括：
a.将含有待测定的分析物的样品添加到固定了分析物识别分子(捕获生物分子)的支架上；
b.将步骤a所述支架与以第二分析物识别分子(检测生物分子，本例中为抗体)共培养；
c.将步骤b所述支架与以抗Fc抗体功能化的金属纳米颗粒共培养；
d.可选地，若所述支架不包含热敏表面，则将所述支架置于所述热敏表面上；以及
e.以外部光源照射所述步骤c或d中所述支架。
本发明的第七个方面涉及用于检测分析物的方法，包括：
a.向含有待测定的分析物的样品中添加以第二分析物识别分子(检测生物分子)功能化的金属纳米颗粒；
b.从步骤a的所述样品中提取与所述纳米颗粒结合的所述分析物，优选为通过离心分离步骤；
c.将步骤b的提取物添加到固定了分析物识别分子(捕获生物分子)的支架上；
d.可选地，若所述支架不包含热敏表面，则将所述支架置于所述热敏表面上；以及
e.以外部光源照射所述步骤c或d中所述支架。
本发明的第八个方面涉及前述任一项所述的生物传感器在检测添加剂、药物、病原微生物、食物成分、杀虫剂、毒性化合物或在生化需氧量分析中的用途。
附图说明
图1展示了本发明的识别系统的示意图。
图2：图2a展示了CEA+抗CEA抗体3C6纳米单晶体识别。图2b展示了抗CEA抗体3C6-生物素-链霉亲和素-纳米单晶体识别。
图3：图3a展示了抗CEA抗体3C1+CEA+抗CEA抗体3C6纳米单晶体识别。图3b展示了抗CEA抗体3C1+CEA+抗CEA抗体3C6-生物素-链霉亲和素纳米单晶体识别。
图4展示了抗CEA抗体3C1+CEA+抗体CEA抗体3C6金纳米颗粒识别。
图5展示了不同照射时间和不同的表面-激光器距离下的抗CEA抗体3C1+CEA+抗体CEA抗体3C6金纳米颗粒识别。图5a展示了较远距离下，照射时间为10秒的结果。图5b展示了较近距离下，照射时间为2秒的结果。
图6展示了激光器距离下的抗CEA抗体3C1+CEA+抗体CEA抗体3C6纳米单晶体识别(在PBS缓冲液中和在血浆样品中)。
图7展示了通过红外相机检测对血浆样品中的抗CEA抗体3C1+CEA+抗CEA抗体3C6金纳米颗粒识别。
图8展示了如实施例5所述的生物传感器三种设计的示意图。
具体实施方式
本发明涉及一种生物传感器，包括(i)识别分子(捕获生物分子)，能够识别目标分析物；(ii)带有热敏表面的支架；(iii)外部光源；(iv)第二识别分子(检测生物分子)，能够识别目标分析物；以及(v)具有表面等离子带的金属纳米颗粒；其特征在于，以所述外部光源照射所述金属纳米颗粒，使其产生热量，使得置有所述分析物的所述支架区域产生颜色变化，从而对所述分析物进行可视化检测
本发明的生物传感器利用金属纳米颗粒将光转化为热的性质作为信号传导系统。该系统能够用作生物传感器中的标记的原理，是因为存在表面等离子吸收带。所述吸收带是在照射纳米颗粒的光线频率与颗粒导带中的电子集体振荡频率共振而引起激发时产生的。该现象称为“局域表面等离子体共振(LSPR)”。颗粒在共振带频谱中的位置极大地取决于颗粒形状、大小和结构(空心或实心)，以及该颗粒所处的电介质。LSPR导致高摩尔吸光度系数(～3x1011M-1cm-1)，其效率等同于106荧光团分子，且显著增加纳米颗粒附近的局域电场。
金属纳米颗粒，例如金、银或铜纳米颗粒，均有该表面等离子体共振效应。当以适当频率的高强度外部光源(例如激光器)加以照射时，该颗粒能够以热能形式释放部分所吸收的能量，造成其表面附近的局域温度升高。
该可控生热是本发明所开发的新型检测系统的基础。所生成的热在适当选定的热敏表面上引起可感知的变化。在此意义上，本发明的发明人发现，令人吃惊地，使用含有分析物的支架区域中金属纳米颗粒受到检测装置外部光源照射后产生的颜色变化进行试验，得到了微微克(picogram)数量级的检出限。因此，本发明实施例4表明，使用本发明的可视化检测所得的检出限，相比于使用红外相机作为检测装置的实验所得的数量级更低，因而敏感性较高。这一令人吃惊的结果导致了具有以下特征的生物传感器的诞生：(i)高敏感性；(ii)高选择性或特异性，由此该生物传感器专门与期望的分析物相互作用，而不与具有相似性质的其他分析物相互作用；(iii)高可靠性，由此传导系统中不会产生由待测样品引起的噪音问题；(iv)低生产成本；(v)短分析时间，能够根据需要迅速操作；(vi)无需预处理样品，从而节约时间、材料和试剂；(vii)操作简单，因此无需专门操作人员就能使用该生物传感器；(viii)实时执行分析的能力，以及(ix)便携，能够进行实地分析。
因此，本发明的第一个方面涉及用于对分析物进行可视化检测的生物传感器，包括：
a.识别分子(捕获生物分子)，能够识别目标分析物；
b.带有热敏表面的支架，步骤a中所述的识别分子(捕获生物分子)固定在所述表面上；
c.外部光源；
d.第二识别分子(检测生物分子)，能够识别目标分析物；以及
e.具有表面等离子带的金属纳米颗粒；
其中，以所述外部光源照射所述金属纳米颗粒，使其产生热量，使得置有所述分析物的所述支架区域产生颜色变化，从而对所述分析物进行可视化检测。
必须指出，本发明的范围内，可视化检测应当理解为任何能够被裸眼分辨而无需使用任何检测装置类型(例如红外相机)的检测。
因此，本发明的第一方面的一个优选实施例中，用于对分析物进行可视化检测的生物传感器，包括：
a.识别分子(捕获生物分子)，能够识别目标分析物，且固定在具有热敏表面的支架上；
b.带有热敏表面的支架，步骤a中所述的识别分子(捕获生物分子)固定在所述表面上；
c.外部光源；
d.第二识别分子(检测生物分子)，能够识别目标分析物；以及
e.具有表面等离子带的金属纳米颗粒；
其中，所述生物传感器不包含能够检测金属纳米颗粒被外部光源照射后的光到热转换的任何类型装置。
本发明的第一方面的又一个优选实施例中，所述生物传感器，包括：
a.识别分子(捕获生物分子)，能够识别目标分析物，且固定在具有热敏表面的支架上；
b.外部光源；以及
c.能够识别目标分析物的第二识别分子(检测生物分子)，其与具有表面等离子带的金属纳米颗粒相结合；
其中，以所述外部光源照射所述金属纳米颗粒，使其产生热量，使得放置有所述分析物的所述支架区域产生颜色变化，从而对所述分析物进行可视化检测。
本发明的范围中，外部光源应当理解为能量在380nm-1100nm之间、能够导致基于金、银、铜或其任何合金或氧化物的金属颗粒的LSPR带激发的任何电磁辐射源，优选为近红外范围内(750-1100nm之间)，因为样品中的干涉生物分子的能量吸收处于可见光谱范围内(例如血红蛋白)，而不会处于近红外范围。该外部光源可以是单色或多色光源，优选为单色光源。
本发明的范围中，具有表面等离子带的金属纳米颗粒应当理解为金属原子任意氧化物或合金的任意单晶体或多晶簇，其所有几何维数均在1-1000nm内，优选为1-200nm内。在本发明的优选实施例中，所述金属原子为贵金属。在一个更优选的实施例中，所述金属原子为金、银或铜原子。在一个更为优选的实施例中，其为管状或三角形金或银原子。
本发明的范围中，识别分子或捕获生物分子应当理解为任何能够通过任何种类的化学或生物相互作用而特异性识别特定分析物的分子。
本发明的范围中，第二识别分子或检测生物分子应当理解为任何能够通过化学或生物相互反应而特异性识别特定分析物的分子
本发明的生物传感器中，用作识别因子的分子必须具备足以在存在其他化合物时识别特定分析物的选择亲和性，并且在固定于支架和纳米颗粒表面上后，能够长久地保持其稳定性、结构和生物活性。
抗体、多肽、酶、蛋白、多糖、核酸(DNAs)、适体或多肽核酸(PNAs)可以用作本发明系统中的识别分子。
大多数情况下，最常用的生物受体为核酸、抗体或抗体片段，所述抗体或抗体片段曾导致产生最多的可用于诊断的技术。其原理在于免疫系统能够灵活且几乎无限产生具有不同选择性且对其对应抗原具有高亲和性的抗体。如今，已经能够从不论大小的几乎任何分子获得单克隆抗体或抗体片段。另一方面，抗体的又一优点在于其蛋白的结构同源性，该同源性独立于其特异性。这允许对其用于免疫化学试剂(例如保留或固定在所述传感器表面)的相关方法进行标准化。可以使用分子生物学技术，制备保留了结构和抗原识别能力的抗体片段(Fab或单链Fv片段)和重组抗体(例如第二代单克隆抗体或微抗体)，用作识别分子。另一方面，适体是因其小尺寸和低免疫原性而能够在某些应用中替代抗体的分子。适体是具有明确三维形状因而能够与目标分子以类似抗体的方式结合的单链核酸。适体结合了小分子(低免疫原性、高扩散作用等)和抗体(高特异性、亲和性和化学稳定性)的优点。单克隆抗体的又一优点，在于其是通过化学合成而非生物表达而成的。
核酸能够检测互补DNA序列中的单个碱基变化。它们可用于基因测序、基因表达分析、与特定疾病相关联的DNA突变和改变检测，因此，可以通过合成构建与已经鉴定的基因对应的核苷酸序列。如今，这已经被PNA链代替，因其生物稳定性(对抗各种酶的降解)和化学稳定性(对pH或离子力变化抗性更高)更高。此外，由于与DNA不同，它们不含2’-脱氧-D-核糖单位，也不含磷酸二酯键，因此具有中性结构，从而降低了杂交反应中的静电排斥；此外，其非特异性吸附也较低。
所述传感器的识别因子(捕获生物分子)一般通过物理性滞留在基质(网格)中，通过离子或疏水相互作用物理性吸附在基质上，或共价键结合，固定在具有热敏表面的支架上。
在此意义上，在本发明的范围中，具有热敏表面的支架应当理解为任何能够在加热后发生结构变化从而显影的表面。热敏纸由于具有温度敏感性，能够在经历温度提高后产生显影信号，因此优选地用作所述热敏表面。热敏纸应当理解为任何具有包含热敏层的纸，所述热敏层包含能在温度升高后相互反应显影的染料、敏化剂和显色剂(以任意化学成分制备均可)。在一个优选实施例中，所述热敏表面可以是任何能够在外部刺激(如温度变化)下产生聚合物性质变化(例如收缩、弯曲、变色、状态变化、发光灯)响应的智能聚合物，温度敏感性聚合物的类型包括：PNIPAM、聚(N-异丙基丙烯酰胺)、聚(N-乙烯哌啶)或聚(N-乙烯己内酰胺)。
本发明的一个实施例中，该系统中具有热敏表面的支架包含至少一个发生分子识别的热敏支架，例如纤维素或其衍生物的膜(硝酸纤维素、乙酸纤维素等)或热敏纸。
本发明的又一实施例中，该系统中具有热敏表面的支架包含两个支架。第一支架上固定有捕获生物分子，且该第一支架是纤维素或其衍生物的膜(硝酸纤维素、乙酸纤维素等)或其他材料，例如聚苯乙烯、陶瓷、硅或玻璃。第二支架由升温后产生显影信号的热敏表面组成，贴附在第一支架上。
本发明的第二个方面涉及用于对分析物进行可视化检测的生物传感器，包括：
a.识别分子(捕获生物分子)，能够识别目标分析物；
b.带有热敏表面的支架；
c.外部光源；
d.第二识别分子(检测生物分子)，能够识别目标分析物，所述目标分析物可选地与标记分子结合；以及
e.具有表面等离子带的金属纳米颗粒，其以能够特异性识别所述检测生物分子或所述检测生物分子的修饰标记分子的生物分子进行功能化；
其中，以所述外部光源照射所述金属纳米颗粒，使其产生热量，使得置有所述分析物的所述支架区域产生颜色变化，从而对所述分析物进行可视化检测。同样地，应当指出，所述可视化检测应当理解为任何能够被裸眼分辨而无需使用任何检测装置类型(例如红外相机)的检测。因此，本发明的第二方面的生物传感器不包括能够检测金属纳米颗粒受到外部光源照射后将光转化为热的任何类型装置。
本发明的范围中，标记分子应当理解为能够通过对于配体-蛋白类相互作用的亲和性或对于核酸链之间的杂交进行分子识别的亲和性加以鉴定的分子。在第一种情况下，应当理解，所述检测生物分子以抗原、激素、维他命、多组氨酸标记或外源凝集素等进行修饰。因此，应当理解，NPs分别以二价金属离子修饰的抗体、适体、受体、结合蛋白、三羧酸进行功能化，或以能够与检测生物分子特异性地相互作用的糖类功能化。在第二种情况下，应当理解，所述检测分子和金NP以天然核酸(脱氧核糖核酸，即DNA；核糖核酸，即RNA)、人造核酸(多肽核酸，即PNA；吗啉等)或其组合(DNA-DNA、PNA-DNA、DNA-PNA、PNA-PNA等)的互补链功能化。
本发明的第三方面涉及如本发明第二方面所述的用于对分析物进行可视化检测的生物传感器，包括：
a.识别分子(捕获生物分子)，能够识别目标分析物；
b.带有热敏表面的支架；
c.外部光源；
d.第二识别分子(检测生物分子)，能够识别与一种或多种生物素分子结合的目标分析物；以及
e.具有表面等离子带的金属纳米颗粒，其以能够特异性识别所述生物素分子的链霉亲和素分子、抗生物素蛋白分子等进行功能化；
其中，当用所述外部光源照射所述金属纳米颗粒时，所述金属纳米颗粒产生的热量使得放置有所述分析物的支架区域产生颜色变化，通过该颜色变化来对所述分析物进行可视化检测。
本发明的第四方面涉及如本发明第二方面所述的用于对分析物进行可视化检测的生物传感器，包括：
a.识别分子(捕获生物分子)，能够识别目标分析物；
b.带有热敏表面的支架；
c.外部光源；
d.第二识别分子，所述分子为抗体(检测生物分子)，能够识别目标分析物；以及
e.具有表面等离子带的金属纳米颗粒，其以与所述检测抗体结合的抗Fc或抗IgG抗体进行功能化；
其中，以所述外部光源照射所述金属纳米颗粒，使其产生热量，使得置有所述分析物的所述支架区域产生颜色变化，从而对所述分析物进行可视化检测。
所述装置是“三明治”式的识别系统，夹在“识别”分子(即“捕获生物分子”，可以是蛋白，例如抗体、DNA探针、PNA探针等，固定在进行分析物识别的支架上)和第二检测分子(即“检测生物分子”，可以是第二抗体或互补DNA探针，通过阅读器(reader)蛋白和/或标记与金属纳米颗粒表面直接或间接结合)之间。通过用相应的识别分子对支架和纳米颗粒进行功能化，可以以相同的策略识别数种分析物。
此外，本发明的第二至第四方面特别涉及一种通用检测系统。事实上，本发明的第三方面中，验证了通过使用生物素标记的检测生物分子，以及使用链霉亲和素功能化金属纳米颗粒，可以使用以该蛋白标记的相同纳米颗粒，基于抗生物素蛋白-生物素相互作用，进行不同分析物的识别，从而无需为需要鉴定的每种分析物分别制备纳米颗粒-检测生物分子缀合物。本发明的第四方面的一个实施例中，基于用能够识别任何其他抗体Fc区域的抗Fc抗体对金属纳米颗粒进行功能化的检测系统，可以使用相同的纳米颗粒进行不同分析物的识别，只要该系统的检测生物分子是抗体即可。
因此，本发明的装置能够在单一试验中以微微克数量级的灵敏度限度分析多个样品。
在本发明仅用作举例证明目的的实施例中，检测特定样品中的分析物可以通过以下步骤完成：在第一步骤中，将识别分子(捕获生物分子)固定在支架上，例如在硝酸纤维素膜上。然后，在第二步骤中，将含有待测分析物的样品添加到支架上，放置时间长度足以发生抗原-抗体识别反应。最后，在第三步骤中，将所述支架与以第二识别分子(检测生物分子)功能化的纳米颗粒共培养。分子识别后，若该支架本身不具有热敏表面，则将支架置于热敏表面上，并以外部光源(例如近红外发射激光器)照射，从而检测分析物。在本发明的第二到第四方面中，该分析包括一个附加步骤。例如，当使用如本发明第三方面中限定的装置时，在第三步骤中，所述支架与识别分子(检测生物分子)，例如生物素标记的第二抗体共培养。在执行相应洗涤后，执行第四步骤，即以用链霉亲和素功能化的纳米颗粒进行培养，最后在洗除所述支架上的过量纳米颗粒后，以发射激光器照射所述支架。
本发明的第四方面中，样品培养步骤后，以抗Fc抗体对纳米颗粒进行功能化，以捕获待测分析物，然后执行与作为检测生物分子的抗体共培养的第三步骤。进行相应洗涤后，在第四步骤中，添加以抗Fc抗体功能化后的纳米颗粒，最后在洗除所述支架后，以发射激光器照射所述支架。
改进本发明的生物传感器的检出限的一种可能方法是，首先通过直接向样品中添加功能化纳米颗粒来执行分析物识别。因此，一旦发生了抗原-抗体识别，则可以用离心的方法来提取与纳米颗粒相结合的分析物。该步骤能够浓缩分析物，无论样品体积如何，并能够从含有分析物的样品剩余成分中提取分析物。该方法的其他步骤可以如上所述地进行，一旦回收了与分析物结合的纳米颗粒，即可在固定了识别分子的感应表面上进行培养。
因此，使用上述基于具有表面等离子带的金属纳米颗粒作为转换系统(通过表面等离子体共振效应)的生物传感器中，可以迅速且选择性地直接在极低浓度样品中检测微微克数量级的各种分析物。
另一方面，本发明还涉及适用于非专门性可视化分析物检测方法的生物传感器。具体而言，本发明涉及一种生物传感器(下文称为“热电堆生物传感器1”)，包括：
a.识别分子(捕获生物分子)，能够识别目标分析物；
b.支架，用于固定步骤a中所述的识别分子；
c.外部光源；
d.第二识别分子(检测生物分子)，能够识别目标分析物；
e.热电堆；以及
f.具有表面等离子带的金属纳米颗粒；
其中，所述金属纳米颗粒受到外源光线照射时，所述热电堆检测到光向热的转换，从而检测所述分析物。该类型生物传感器的组装如实施例5和图8所示。
本发明的又一优选实施例中，所述热电堆生物传感器1包括：
a.识别分子(捕获生物分子)，能够识别目标分析物，且固定在具有热敏表面的支架上；
b.外部光源；以及
c.能够识别目标分析物的第二识别分子(检测生物分子)，其与具有表面等离子带的金属纳米颗粒相结合。
本发明的又一方面，涉及一种生物传感器(下文称为“热电堆生物传感器2”)，包括：
a.识别分子(捕获生物分子)，能够识别目标分析物；
b.支架；
c.外部光源；
d.第二识别分子(检测生物分子)，能够识别目标分析物，可选地，所述目标分析物与标记分子结合；
e.热电堆；以及
f.具有表面等离子带的金属纳米颗粒，其以能够特异性识别所述检测生物分子或所述检测生物分子的修饰标记分子的生物分子进行功能化；
其中，以所述外部光源照射所述金属纳米颗粒，使其产生热量，使得置有所述分析物的所述支架区域产生颜色变化，从而对所述分析物进行可视化检测。
本发明的又一方面，涉及上述热电堆生物传感器2，包括：
a.识别分子(捕获生物分子)，能够识别目标分析物；
b.支架；
c.外部光源；
d.第二识别分子(检测生物分子)，能够识别与一种或多种生物素分子的目标分析物；
e.热电堆；以及
f.具有表面等离子带的金属纳米颗粒，其以能够特异性识别所述生物素分子的链霉亲和素分子、抗生物素蛋白分子等进行功能化。
本发明的又一方面，涉及上述热电堆生物传感器2，包括：
a.识别分子(捕获生物分子)，能够识别目标分析物；
b.支架；
c.外部光源；
d.第二识别分子(检测生物分子)，能够识别目标分析物；
e.热电堆；以及
f.具有表面等离子带的金属纳米颗粒，其以与检测抗体结合的抗Fc或抗IgG抗体等进行功能化。
所述装置是“三明治”式的识别系统，夹在“识别”分子(即“捕获生物分子”，可以是蛋白，例如抗体、DNA探针、PNA探针等，固定在进行分析物识别的支架上)和第二检测分子(即“检测生物分子”，可以是第二抗体或互补DNA探针，通过阅读器(reader)蛋白和/或标记与金属纳米颗粒表面直接或间接结合)之间。通过用相应的识别分子对支架和纳米颗粒进行功能化，可以以相同的策略识别数种分析物。
此外，本发明的最后两个方面特别涉及一种通用检测系统。事实上，本发明的所述方面可以证实，通过使用生物素标记的检测生物分子，以及使用链霉亲和素功能化金属纳米颗粒，可以使用以该蛋白标记的相同纳米颗粒，基于抗生物素蛋白-生物素相互作用，进行不同分析物的识别，从而无需为需要鉴定的每种分析物分别制备纳米颗粒-检测生物分子缀合物。基于用能够识别任何其他抗体Fc区域的抗Fc抗体对金属纳米颗粒进行功能化的检测系统，可以使用相同的纳米颗粒进行不同分析物的识别，只要该系统的检测生物分子是抗体即可。
进一步地，本发明涉及以下分析物检测方法：
(1)用于检测分析物的方法，包括：
a.将含有待测定的分析物的样品添加到固定有分析物识别分子(捕获生物分子)的支架上；
b.将步骤a所述支架与以第二分析物识别分子(检测生物分子)功能化的金属纳米颗粒共培养；
c.以外部光源照射所述步骤b或c中所述支架；以及
d.使用能够检测金属纳米颗粒被外部光源照射后将光转化为热现象的热电堆，从而检测分析物。
用于检测分析物的方法，包括：
a.将含有待测定分析物的样品添加到固定有分析物识别分子(捕获生物分子)的支架上；
b.将步骤a与结合了至少一种标记分子的第二分析物识别分子(检测生物分子)共培养；
c.将步骤b所述支架与以至少一种能与所述标记特异性结合的分子功能化的金属纳米颗粒共培养；
d.以外部光源照射所述步骤b或c中所述支架；以及
e.使用能够检测金属纳米颗粒被外部光源照射后将光转化为热现象的热电堆，检测分析物。
在上述方法的优选实施例中，所述标记分子为生物素，且能够与所述标记特异性结合的分子为抗生物素蛋白或链霉亲和素；或所述标记分子为抗生物素蛋白或链霉亲和素，而能够与所述标记特异性结合的分子为生物素。
(3)用于检测分析物的方法，包括：
a.将含有待测定的分析物的样品添加到固定有分析物识别分子(捕获生物分子)的支架上；
b.将步骤a所述支架与第二分析物识别分子(检测生物分子)共培养，所述第二分析物识别分子为检测抗体；
c.将步骤b所述支架与以抗Fc抗体功能化的金属纳米颗粒共培养；
d.以外部光源照射所述步骤c中所述支架；以及
e.使用能够检测金属纳米颗粒被外部光源照射后将光转化为热现象的热电堆，以检测分析物。
(4).用于检测分析物的方法，包括：
a.向含有待测定的分析物的样品中添加以第二分析物识别分子(检测生物分子)功能化的金属纳米颗粒；
b.提取与步骤a的所述样品结合的纳米颗粒所述分析物；
c.将步骤b的提取物添加到固定有分析物识别分子(捕获生物分子)的支架上；
d.以外部光源照射所述步骤c中所述支架；以及
e.使用能够检测金属纳米颗粒被外部光源照射后将光转化为热现象的热电堆，以检测分析物。
本发明所述的生物传感器的用途可以是，但不限于，检测添加剂、药物、病原微生物、食物成分、杀虫剂、毒性化合物或生化需氧量分析。本发明的生物传感器可用于定量或定性地检测任何类型的分析物。
下列实施例仅用于对本发明进行解释说明。
实施例
实施例1：金属纳米颗粒的合成
-金纳米颗粒的合成：根据如Turkevich et al.“A study of the nucleationand growth processes in the synthesis of colloidal gold”所述的方法，合成金纳米颗粒。根据该方法，取200ml 0.01％四氯金酸水溶液，搅拌加热到100℃，然后加入5ml 1％柠檬酸三钠作为还原剂。一旦形成了纳米颗粒，即继续搅拌红色溶液直至达到室温。球形金纳米颗粒的直径为14-16nm，并具有直径519nm的表面等离子带。
-三角形纳米金单晶体的合成：根据Pelaz et al.“Tailoring the synthesisand heating ability of gold nanoprisms for bioapplications”,Langmuir 2012,28,8965-70所述的方法合成三角形纳米金单晶体。根据该方法，取100ml 2mM四氯金酸溶液，与120ml 0.5mM Na2S2O3溶液混合，搅拌9分钟，然后加入体积为20-50ml的0.5mM Na2S2O3溶液。所得的金纳米三角(nanotriangle)的尺寸在100-160nm之间，表面等离子带则在750-1075nm之间。在以不同生物分子对所述纳米单晶体加以标记之前，必须通过与聚乙二醇(HS-PEG-COOH,5000g/mol)结合来进行钝化。为此，取10ml纳米单晶体溶液，与含1mg PEG、pH12的NaOH溶液共培养过夜。最后，所述纳米单晶体以10000rpm离心15分钟以去除过量试剂。
-三角形纳米银单晶体的合成：根据Zhang,Q et al,“A systematic study ofthe synthesis of silver nanoplates:Is citrate a“Magic”reagent？”,Journal ofthe American Chemical Society 2011,133(46),18931-18939所述的方法进行合成。根据该方法，取24.14mL Milli Q超纯水，添加到硝酸银(0.05M,50uL)、柠檬酸三钠(75mM,0.5mL)和过氧化氢(30％wt,60uL)水溶液中，室温下快速搅拌。最终，快速加入硼氢化钠溶液(NaBH4,100mM,250uL)，以形成纳米单晶体。约3分钟后，由于小颗粒银的形成，胶体溶液从深黄色变为最终纳米单晶体所带有的蓝色。所得的银纳米单晶体直径为70nm，表面等离子带为700nm。
-铜纳米立方体的合成：根据Murphy et al.“Solution-phase synthesis ofCu2O nanocubes”,Nano Letters 2002,3(2),231-234所述方法，进行合成。根据该方法，取0.25mL CuSO4水溶液，加入到0.01-0.1M可变浓度的9mL CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)水溶液中。然后，取0.5mL 0.1M抗坏血酸钠水溶液，加入Cu(II)-CTAB溶液。将所述溶液以55℃加热5分钟。然后，加入0.2mL 0.5M氢氧化钠，使溶液中立即出现黄色。将溶液保持在55℃下10分钟，然后在室温下冷却。30分钟后，溶液转为红棕色、浅黄色或深黄色，取决于所用的CTAB浓度。6000rpm下离心颗粒15分钟，然后用水再悬浮。重复该过程2次，移除表面活性剂。此时，无论是何种情况，溶液中的纳米立方体均为砖红色。所得的铜纳米立方体的大小为420nm，根据合成中所用CTAB表面活性剂的用量具有不同的几何形状。
实施例2：金属纳米颗粒功能化
将用不同识别元件(例如抗体、DNA或PNA)合成的不同种类的纳米颗粒功能化，以实施本发明。功能化的一些实施例如下所述：
-以抗体对三角形纳米金单晶体进行功能化：为了实施功能化，通过碳化二亚胺化学将抗体固定在纳米颗粒表面的羧基上。首先，在37℃下，以含有1.5μm EDC和3.5μm硫-NHS的1ml终体积、pH6的10nM MES激活0.5mg纳米颗粒30分钟。以6000rpm离心5分钟，或使用凝胶管柱层析，以移除过量试剂，然后以pH6的10mM MES再悬浮颗粒。一旦激活了纳米颗粒的羧基，则以含2.5μg抗体、pH为6、终体积为1ml的10mM MES在37℃下培养1小时。待抗体结合后，以50nM 750Da胺化PEG(α-甲氧基-ω-氨基聚乙二醇)封闭纳米颗粒表面。最后，经过6000rpm、5分钟离心循环数次后，对纳米颗粒进行纯化。
-以链霉亲和素对三角形纳米金单晶体进行功能化：为了实施功能化，通过碳化二亚胺化学将链霉亲和素固定在纳米颗粒表面的羧基上。首先，在37℃下，以含有1.5μm EDC(1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳化二亚胺)和3.5μm硫-NHS(硫-N-羟基琥珀酰亚胺)的1ml终体积、pH6的10nM MES激活0.5mg纳米颗粒30分钟。以6000rpm离心5分钟，或使用凝胶管柱层析，以移除过量试剂，然后以pH6的10mM MES悬浮颗粒。一旦激活了纳米颗粒的羧基，则以含1.25μg链霉亲和素、pH为6、终体积为1ml的10mM MES在37℃下培养1小时。待蛋白结合后，以50nM 750Da胺化PEG(α-甲氧基-ω-氨基聚乙二醇)封闭纳米颗粒表面。最后，经过6000rpm、5分钟离心循环数次后，对纳米颗粒进行纯化。
实施例3：使用本发明的生物传感器检测样品中的CEA标记
对纳米金单晶体进行合成并进行表征(扫描穿透式电子显微镜和紫外可见光光谱分析)后，以单克隆抗CEA抗体Ab3C6(单克隆小鼠抗癌胚抗原4CA30-3C6,HyTest)和链霉亲和素蛋白进行功能化。为了验证所述分子固定在纳米单晶体后仍保留其生物活性，以不同浓度将相应生物分子(CEA标记或生物素标记抗体)固定在硝酸纤维素膜上；以功能化纳米颗粒共培养后，用激光照射沉积在热敏表面的膜。
CEA+抗CEA抗体3C6-纳米单晶体识别如图2a所示。抗CEA抗体3C6-生物素+链霉亲和素-纳米单晶体识别如图2b所示。
分子识别发生时，纳米金单晶体位于膜上，而激光照射后，纳米颗粒吸收的能量以热能形式放出，热敏表面上的信号被记录下来(参见图2a和2b)。两种情况下，激光照射样品所得的信号均表明，发生了抗原-抗体或链霉亲和素-生物素识别，因此，纳米单晶体-标记的生物分子保留了它们的活性。另一方面，发生识别的表面和纳米颗粒所在表面均经过钝化，由此当硝酸纤维素膜上未固定蛋白时，则不会发生非特异性相互作用，如样品0所示。
所述传感器的识别因子(在此例中为抗CEA抗体Ab3C1单克隆小鼠抗癌胚抗原4CA30-3C1,HyTest)可用各种方法固定在传感表面上，其通过共价键与玻璃表面结合以及通过物理吸附固定在不同纤维素和硝酸纤维素膜上。使用表面吸附有抗体的硝酸纤维素膜所得的结果如下所示。测试上述两种策略；使用了以抗体直接功能化的纳米单晶体，以及以链霉亲和素在添加了抗CEA生物素标记抗体3C6后进行功能化的纳米单晶体。对以PBS稀释的浓度递减的CEA肿瘤标记的不同样品进行分析。执行如试验方法所述的识别步骤后，一旦膜干燥，则将其置于热敏表面(本例中为热敏纸)上，以近红外发射激光器(波长为1000nm)照射数秒钟。
抗CEA抗体3C1+CEA+抗CEA抗体3C6纳米单晶体的识别如图3a所示。抗CEA抗体3C1+CEA+抗CEA抗体3C6-生物素+链霉亲和素纳米单晶体的识别如图3b所示。
如上述附图中所示，热敏表面上通过照射纳米单晶体而在发生分析物识别时产生的信号，在抗体3C1-CEA-Ab3C6-纳米单晶体系统中比抗体3C1-CEA-Ab3C6生物素-链霉亲和素-金纳米单晶体系统中更为强烈。但是，两种情况下，均检测到0.5ng CEA/ml浓度。另一方面，作为阴性对照，据验证，当使用以抗CEA抗体3C6的16nm直径的球形金纳米颗粒(在所用激光的发射波长下不具有吸收带)进行同一实验时，未得到任何信号，如图4所示(参见图4，其中展示了抗CEA抗体3C1+CEA+抗CEA抗体3C6-金纳米颗粒识别，其中16nm直径的球形金纳米颗粒在所用激光的发射波长下不具有吸收带)。
为了改进方法敏感性，可以改变不同参数，例如样品的激光照射时间和激光器与传感表面之间的距离。图5展示了，激光器与表面之间距离越小，所需照射时间越短，获得的信号越强烈。
图5展示了不同照射时间和不同表面-激光器距离下的抗CEA抗体3C1+CEA+抗CEAAb 3C6-金纳米单晶体的识别。图5a中所用的照射时间为10秒，距离为0.5cm；图5b中的照射时间为2秒，距离为0.1cm。最后，执行同样的“三明治”式实验(Ab3C1+CEA+Ab3C6-金纳米单晶体)，以检测血浆样品中的CEA肿瘤标记，以验证系统特异性以及复合样品种的分析物检出限。该结果与溶于PBS缓冲液中的CEA测定结果相比较。两种情况下得出的检出限均为10pg CEA/ml，如图6所示。此外，对照或无CEA的血浆样品中均未得到任何类型的非特异性相互作用。
实施例4：以红外相机为检测手段的对比实施例
按照实施例3所述制备相同样本，以用于本实施例。所述传感器的识别因子，本例中为抗CEA抗体Ab3C1，通过物理吸附在硝酸纤维素膜上加以固定。对以PBS稀释的浓度递减的CEA肿瘤标记的不同样品进行分析。以抗CEA抗体Ab3C6执行如试验方法所述的识别步骤后，一旦膜干燥，则将其置于热敏纸上。
以近红外发射激光(波长为1000nm)照射纳米颗粒。使用能够将照射后纳米颗粒产生的热量转化为可量化测量值的红外热成像相机(IR相机)，作为检测激光照射后的纳米颗粒产生的热量的系统。
对于为检测不同浓度的血浆CEA抗原而制备的样品，用IR相机来验证照射后的温度增加。以激光照射数秒后，IR相机对0.05ng CEA/ml样品记录下了2-3℃的温度增加，但未记录到0.01ng CEA/ml样品的任何信号。对于相同的分析物浓度，当样品被激光照射后，在热敏纸上检测到了信号。
通过热敏表面(例如热敏纸)支架的可视化检测所得到的检出限，低于使用红外相机作为检测手段所得的检出限。
图7对抗CEA抗体3C1+CEA+抗CEA Ab 3C6-金纳米单晶体的识别的两种检测系统进行了比较，即：热敏纸(图7a)和IR相机(图7b)。
实施例5：以热电堆进行检测试验
在本例中，纳米颗粒受到激光照射后产生的热量，通过热电堆进行测量，所述热电堆能够将其周围特定区域中产生的温度变化转化为可量化的电信号。
如图8中的设计所示，在350mW功率下，以激光照射膜和盖玻片上的高浓和稀释样品。所遇到的第一个问题碍于，若激光直接照到热电堆，则得到极高的背景信号(因此，需要充分提高温度以区别于背景信号)。而且，若仅照射没有纳米颗粒的膜或盖玻片，也会得到反应(玻璃产生的信号高于硝酸纤维素膜)。以稀释样品得到的反应与对照相仿，而从高浓样品上可以完美地测量到温度增加。必须考虑到，该设计中，样品离激光器3-4cm，因此敏感性会低于与激光器直接接触时的敏感性。
以图8中的图表2和3中所示的设计，对硝酸纤维素膜上沉积的不同纳米颗粒浓度进行校准。对于图表2的情况，未得到结果，因为激光器处于该位置时，无法以可重复方式照射样品。根据图表3所示设计进行试验。
制备了140μg/ml、14μg/ml和1.4μg/ml三种NNs溶液，每种取1μl沉积在硝酸纤维素膜上(140ng、14ng和1.4ng NNs→6×109,6×108和6×107纳米颗粒)。以激光照射样品数秒，且在放置样品前后均以热电堆读数。在样品之间测量背景信号。对于稀释度最大的溶液(1.4ng NNs)，记录到了比背景信号略高的信号；对于14ng样品，得到了清晰的可分辨信号；最高浓度的样品得到了极高的信号。对于符合线性范围的校准，必须使用一系列低浓度溶液，因为在某个浓度值以后，温度随纳米颗粒浓度呈指数上升。

Claims (17)

1.用于可视化检测的生物传感器，包括：
a.识别分子，即捕获生物分子，能够识别目标分析物；
b.带有热敏表面的支架，其固定有a项中所述的识别分子；
c.外部光源；
d.第二识别分子，即检测生物分子，能够识别目标分析物；以及
e.具有表面等离子带的金属纳米颗粒；
其中，当用所述外部光源照射所述金属纳米颗粒时，所述金属纳米颗粒产生的热量使得放置有所述分析物的支架区域产生颜色变化，通过该颜色变化来对所述分析物进行可视化检测。
2.用于可视化检测的生物传感器，包括：
a.识别分子，即捕获生物分子，能够识别目标分析物，且固定在具有热敏表面的支架上；
b.外部光源；以及
c.具有表面等离子带的金属纳米颗粒，该金属纳米颗粒用能够识别目标分析物的第二识别分子进行功能化，所述第二识别分子为检测生物分子；
其中，当用所述外部光源照射所述金属纳米颗粒时，所述金属纳米颗粒产生的热量使得放置有所述分析物的支架区域产生颜色变化，通过该颜色变化来对所述分析物进行可视化检测。
3.用于可视化检测的生物传感器，包括：
a.识别分子，即捕获生物分子，能够识别目标分析物；
b.带有热敏表面的支架；
c.外部光源；
d.第二识别分子，即检测生物分子，能够识别目标分析物，所述目标分析物与标记分子结合；以及
e.具有表面等离子带的金属纳米颗粒，该金属纳米颗粒用能够特异性识别所述检测生物分子或所述检测生物分子的修饰标记的生物分子进行功能化；
其中，当用所述外部光源照射所述金属纳米颗粒时，所述金属纳米颗粒产生的热量使得放置有所述分析物的支架区域产生颜色变化，通过该颜色变化来对所述分析物进行可视化检测。
4.根据权利要求3所述的生物传感器，其特征在于，所述标记分子为生物素，且与所述标记特异性结合的分子为抗生物素蛋白或链霉亲和素；或所述标记分子为抗生物素蛋白或链霉亲和素，且与所述标记分子特异性结合的分子为生物素。
5.根据权利要求3所述的生物传感器，其特征在于，所述第二识别分子即为检测生物分子，其是抗体，且所述金属纳米颗粒具有以能够识别所述检测生物分子Fc区域的抗Fc抗体进行功能化的表面等离子带。
6.根据权利要求1-5任一项所述的生物传感器，其特征在于，所述识别分子选自：抗体；多肽；酶；多糖；核酸，即DNAs；适体或多肽核酸，即PNAs。
7.根据权利要求6所述的生物传感器，其特征在于，所述识别分子为抗体、DNAs或PNAs。
8.根据权利要求1所述的生物传感器，其特征在于，所述外部光源为单色光。
9.根据权利要求1所述的生物传感器，其特征在于，所述金属纳米颗粒选自：
a.金纳米颗粒；
b.银纳米颗粒；或
c.铜纳米颗粒。
10.根据权利要求9所述的生物传感器，其特征在于，所述金属纳米颗粒是三角形纳米金单晶体。
11.根据权利要求1所述的生物传感器，其特征在于，所述支架的热敏表面是热敏纸。
12.根据权利要求11所述的生物传感器，其特征在于，所述热敏纸与选自下列的支架相组合：玻璃、硅、陶瓷、聚苯乙烯、纤维素膜、碳酸纤维素膜或乙酸纤维素膜。
13.用于检测分析物的方法，包括：
a.将含有待测定的分析物的样品添加到固定有分析物识别分子的支架上，所述分析物识别分子即为捕获生物分子；
b.将步骤a所述支架与用第二分析物识别分子进行过功能化的金属纳米颗粒共培养，所述第二分析物识别分子即为检测生物分子；
c.若所述支架不包含热敏表面，则将所述支架置于所述热敏表面上；以及
d.用外部光源照射所述步骤c中的所述支架。
14.用于检测分析物的方法，包括：
a.将含有待测定分析物的样品添加到固定有分析物识别分子的支架上，所述分析物识别分子即为捕获生物分子；
b.将步骤a的所述支架与结合了至少一种标记分子的第二分析物识别分子共培养，所述第二分析物识别分子即为检测生物分子；
c.将步骤b的所述支架与用至少一种与所述标记分子特异性结合的分子进行过功能化的金属纳米颗粒共培养；
d.若所述支架不包含热敏表面，则将所述支架置于所述热敏表面上；以及
e.用外部光源照射所述步骤c中的所述支架。
15.根据权利要求14所述方法，其特征在于，所述标记分子为生物素，且与所述标记分子特异性结合的分子为抗生物素蛋白或链霉亲和素；或所述标记分子为抗生物素蛋白或链霉亲和素，且与所述标记特异性结合的分子为生物素。
16.用于检测分析物的方法，包括：
a.将含有待测定的分析物的样品添加到固定了分析物识别分子的支架上，所述分析物识别分子即为捕获生物分子；
b.将步骤a的所述支架与第二分析物识别分子共培养，所述第二分析物识别分子即为检测生物分子，其为检测抗体；
c.将步骤b的所述支架与用抗Fc抗体进行过功能化的金属纳米颗粒共培养；
d.若所述支架不包含热敏表面，则将所述支架置于所述热敏表面上；以及
e.用外部光源照射所述步骤c中的所述支架。
17.用于检测分析物的方法，包括：
a.向含有待测定分析物的样品中添加用第二分析物识别分子进行过功能化的金属纳米颗粒，所述第二分析物识别分子即为检测生物分子；
b.从步骤a的所述样品中提取与所述纳米颗粒结合的所述分析物；
c.将步骤b的提取物添加到固定有分析物识别分子的支架上，所述分析物识别分子即为捕获生物分子；
d.若所述支架不包含热敏表面，则将所述支架置于所述热敏表面上；以及
e.用外部光源照射所述步骤c中的所述支架。
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