CN1902324A

CN1902324A - 比色底物、比色传感器和使用方法

Info

Publication number: CN1902324A
Application number: CN 200480039730
Authority: CN
Inventors: M·C·桑德斯; G·J·科尔帕斯; D·L·埃利斯-布斯拜; J·M·哈弗尔德
Original assignee: Ethicon SAS; ECI Biotech Inc
Current assignee: Johnson and Johnson Medical SAS; Ethicon Inc; ECI Biotech Inc
Priority date: 2003-11-03
Filing date: 2004-11-03
Publication date: 2007-01-24

Abstract

本文描述了包含至少一种附着到肽上的比色组分的底物，以及检测所述底物的修饰的方法。还描述了通过使底物接触样品，检测蛋白的存在或不存在的方法，所述蛋白例如，由微生物生产的蛋白。如果样品含有目标蛋白，则底物被修饰，且产生可视的颜色变化，从而指示蛋白在样品中的存在或不存在。本发明还表征了用于检测微生物和/或蛋白在样品中的存在或不存在的生物传感器和试剂盒。

Description

比色底物、比色传感器和使用方法

相关申请

本申请要求2003年11月3日提交的美国临时申请号60/516,688和2004年6月9日提交的美国临时申请号60/578,502的利益。上述申请的所有教导都在这里引作参考。

发明背景

在美国，伤口的感染是保健支出的主要原因。所有外科手术伤口中的大约5％会被微生物感染，且对于进行腹部外科手术的患者，该数字明显更高(约10-20％)。细菌物种，例如葡萄球菌，是从感染的伤口中最经常分离出的生物。这可能是因为，人是环境中的葡萄球菌的天然储存库，在任意给定的时间，都有最高达50％的人群被其定居。定居率在医院场所明显更高，包括在保健人员之间和患者之间。而且，当频繁使用抗生素时，由于存在于医院环境中的强选择性压力，在医院环境中的定居生物可能对许多形式的抗微生物治疗都是抗性的。葡萄球菌通常作为无害的共生体而被携带，但是在表皮破口的情况下，它们可以造成严重的、甚至威胁生命的感染。

葡萄球菌是外科手术伤口感染的最常见病原；其它的包括但不限于，酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、奇异变形菌(Proteus mirabilis)、粘质沙雷氏菌(Serratiamarcescens)、阴沟肠杆菌(Enterobacter clocae)、Acetinobacteranitratus、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)和大肠杆菌(Escherichia coli)。

医院最关心微生物造成的外科手术后感染。预防这样的感染的最常见的方法是施用预防性的抗生素药物。尽管通常是有效的，但该策略具有培育细菌的抗性菌株的意外作用。正是由于它会促进抗性菌株的生长的原因，所以不鼓励预防性抗生素的常规使用。

胜于使用常规的预防，更好的方法是进行良好的伤口管理，即在外科手术之前、过程中和之后，保持该区域没有细菌，并在愈合过程中，仔细地监控该部位的感染。正常的监控方法包括，密切观察伤口部位以确定缓慢愈合，炎症和脓的病征，以及测量患者的温度，以确定发烧的病征。不幸地，许多症状仅仅在已经感染后才是明显的。而且，在患者出院后，他/她负责监控他们自己的保健，而感染的症状对于非专业的患者可能是不明显的。

可以检测出症状发展之前的早期感染的方法、系统或生物传感器，对于患者和保健人员都是有利的。这样的方法或生物传感器应当对存在于伤口中的低水平的微生物是敏感的，以有利于早期检测。如果患者可以在出院后准确地监控伤口的状况，则可以足够早地启动合适的抗微生物治疗，以预防更严重的感染。

发明概述

已经发现，当通过蛋白修饰时，可以标记底物，以产生可视的颜色变化。还已经发现，分子(例如，微生物分泌的、在微生物的细胞表面上表达的或在感染了病毒或朊病毒的细胞的表面上表达的蛋白)可以用作检测样品中存在或不存在微生物的标记，所述样品例如，伤口或体液。因此，本发明表征了通过蛋白修饰的底物，检测这样的修饰的方法，检测蛋白的方法，以及整合了所述底物的物品。

本发明有许多实施方案。在一些实施方案中，本发明包括一种底物，其包含至少一种附着到肽上的比色组分。底物可以附着到固体支持物上。“比色组分”在本文中定义为能提供颜色或荧光的任何组分，例如，但不限于，染料。

在一些实施方案中，本发明包括一种底物，其包含至少两种附着到肽上的比色组分，其中比色组分包括至少两种不同的颜色。在一些实施方案中，包含至少一种比色组分的底物附着在有色的固体支持物上。

本发明包括，检测本文所述的底物的修饰的方法。在一个实例中，该方法包含下述步骤：a)在会导致底物的修饰的条件下，将样品暴露于底物，和b)检测修饰或修饰的不存在。在一些实施方案中，底物包含具有至少一种比色组分的肽。更具体地，底物附着在固体支持物上。修饰包含，切割至少一部分底物，其中该部分包含一种比色组分，且该切割会导致可检测的信号(例如，可视的颜色变化)。例如，可以从底物切割下具有一种比色组分的底物的比色组分，且比色组分可以从底物扩散开。因此，底物的修饰可以通过颜色的丧失来指示。

在另一个实例中，可以从底物切割下具有一种比色组分的底物的比色组分，且可以在收集器上收集比色组分。在一些实施方案中，收集器是捕获膜或支持物，其能改变颜色，作为收集器收集切割的底物的结果。因此，底物的修饰可以通过临近底物的捕获膜上的颜色变化来指示。

在另一个实例中，底物包含两种比色组分，一种比色组分可以是第一种颜色，例如，蓝色，且第二种比色组分可以是第二种颜色，例如，黄色。当存在于相同底物上时，未修饰的底物可以显示绿色。如果修饰了相同底物(例如，酶促地从底物切割下黄色比色组分)，则底物可以显示蓝色。因此，底物的修饰可以通过从绿至蓝的颜色变化来指示。

如本文进一步描述的，具有一种比色组分的底物可以附着到有色的固体支持物上。肽比色组分可以是第一种颜色，例如黄色，且固体支持物可以是第二种颜色，例如蓝色。固体支持物与未修饰的底物的组合可以显示绿色。如果修饰了底物(例如，酶促地从底物切割下黄色比色组分)，则固体支持物与修饰的底物的组合可以显示蓝色。因此，底物的修饰可以通过从绿至蓝的颜色变化来指示。

在其它的实施方案中，本发明包括，使用本文所述的方法，检测酶在样品中的存在或不存在的方法。如本文所述的，酶可以由微生物特异性地生产或分泌。因此，酶的检测与微生物的存在或不存在相关联。

在其它的实施方案中，本发明包括生物传感器，其用于使用本文所述的方法，检测蛋白、酶或微生物的存在或不存在。

在另一个实施方案中，本发明包括用于检测蛋白、酶或微生物的试剂盒。试剂盒可以包含，用于检测例如微生物在样品中的存在或不存在的生物传感器，和至少一种用于检测微生物的试剂。生物传感器可以包含固体支持物和至少一种可检测地标记的底物，其中可检测地标记的底物包括能特异性地与酶反应的肽，且底物还包含一种或多种附着到肽上的比色组分。可检测地标记的底物可以结合在固体支持物上。任选地，试剂盒包括收集器。

如本文所述的，本发明允许检测蛋白、酶和微生物，包括会造成感染的那些。本发明可以有利地用于多种作用，包括在保健场所提供效用。例如，在保健场所，本发明允许用户鉴别微生物在伤口中的存在，从而可以在确立感染之前，采取预防措施。这允许选择性地应用预防药物，其可以减少它们的使用的一些负面的副作用，例如培育微生物的抗性菌株。本发明提供的效用的另一个实例是，它允许患者监控他或她出院后伤口的状况，从而如果检测到病原微生物，他/她就可以寻求医疗护理或采取预防措施。

本发明提供了样品中的蛋白、酶或微生物的迅速且低成本的检测，这基于底物的修饰，后者会导致可检测的颜色变化，从而消除了检测底物的修饰对昂贵装置的需要。实现本发明所需的原材料是低廉的。另外，本发明的方法和物品能提供便携的检测微生物存在的方法，从而消除了在实验室或医院场所进行检测或部分检测的需要。

附图简述

本专利或申请文献含有至少一副彩色绘制的图。在请求并支付必需的费用后，专利局会提供具有彩色附图的本专利或专利申请公开文本的复印件。

图1说明了活性蓝4在水中的光谱。

图2说明了活性黄86在水中的光谱。

图3说明了REMAZOL亮蓝R在水中的光谱。

图4说明了活性黑5在水中的光谱。

图5说明了包含本发明的传感器的实验室标本收集容器的照片。

图6说明了两个包含本发明的传感器的棉拭的照片。

图7说明了包含本发明的传感器的标尺的照片。

图8说明了暴露于伤口流体后的图22A所示的标尺，该流体含有来自对传感器特异性的微生物的蛋白。

图9说明了包含本发明的传感器的刚性毛细管探头。

图10说明了一个实施方案，其中底物包含2种不同的比色组分。

图11说明了本发明的一个实施方案的示意图，其中镍树脂附着到包含比色组分的肽上。

图12说明了本发明的一个实施方案的示意图，其中带电荷的膜附着到包含比色组分的肽上。

图13包括在表面上具有切割的标记的肽的传感器和收集器的照片。

图14包括在表面上具有切割的标记的肽的传感器和收集器的照片。

图15显示了双标记的肽在水中的UV/可见光谱图。

图16说明了各种传感器的相对荧光图，其中传感器已经用环氧乙烷(ETO)灭菌，和/或暴露于假单胞菌(Pseudomonas)。

图17说明了各种传感器的相对荧光图，其中传感器已经用环氧乙烷(ETO)灭菌，和/或暴露于肠球菌(Enterococcus)。

发明详述

本发明包括用于检测蛋白、酶或微生物在样品中存在或不存在的组合物和方法。本发明包括底物，一般是蛋白或肽，其包含能产生可检测的信号的比色组分，当底物已经经历修饰时，该信号会指示。修饰的原因可以是，底物接触蛋白，例如酶，并导致底物的修饰，例如，通过酶切割。

在一些实施方案中，可检测的信号包括可视的信号或可视的颜色变化。如本文使用的，“可视的信号”包括无需任何类型的检测装置或增强装置(例如荧光计)即可感知的颜色变化。在其它的实施方案中，可检测的信号是从一种非荧光的颜色或色调至另一种的颜色变化。

在一些实施方案中，本发明包括底物，其包含至少一种附着到肽上的比色组分。在其它的实施方案中，底物附着到固体支持物上。在一些实施方案中，当与蛋白相互作用时，肽会经历修饰。例如，蛋白可以是酶，且修饰可以包括能切割肽的酶。在一些实施方案中，肽是合成的，而在其他实施方案中，它是天然存在的。

在一些实施方案中，肽可以直接用于检测特定蛋白酶的存在，或通过使用信号放大方法间接使用，其中报告酶与特定肽缀合，且水解导致催化过程的活化，从而导致产生可检测的信号(例如，可视的颜色变化)。

肽

肽的实例包括本文所述的那些底物，以及本领域已知能通过与蛋白的相互作用发生修饰的那些肽。Mitchell C.Sanders在2001年5月3日提交的美国专利申请号09/848,781，标题为A Device forDetecting Bacterial Contamination and Method of Use和Mitchell C.Sanders等在2002年5月28日提交的美国临时申请号60/383,847，标题为Method for Detecting Microorganisms，描述了这样的肽，它们的教导在本文整体引入。

合适的肽的具体实例包括：

LLGDFFRKSKEKIGKEFKRIVXRIKDFLRNLVPRTES(在本文中称作“SEQ ID NO：1”)，其中SEQ ID NO：1的“X”成员可以是任意的氨基酸；

KAAHKSALKSAE(在本文中称作“SEQ ID NO：2”或“Papa1”)；

KKASEAAHKSALKSAE(在本文中称作“SEQ ID NO：3”或“Papa2”)；

CHHHASEAAHKSALKSAE(在本文中称作“SEQ ID NO：4”或“Papa3”)；

KHLGGGALGGGAKE(在本文中称作“SEQ ID NO：5”或“Pala1”)；

KHLGGGGGAKE(在本文中称作“SEQ ID NO：6”或“Papg1”)；

ACCDEYLQTKE(在本文中称作“SEQ ID NO：7”或“P1”)；

ADTVEPTGAKE(在本文中称作“SEQ ID NO：8”或“P2”)；

KLPHKLSWSADNP(在本文中称作“SEQ ID NO：9”或“P3”)；

PVPSTPPTPSPSTP(在本文中称作“SEQ ID NO：10”或“A1”)；

NMLSEVERE(在本文中称作“SEQ ID NO：11”或“M1”)；

KQNMLSEVERADTE(在本文中称作“SEQ ID NO：12”或“M2”)；

NEAIQEDQVQYE(在本文中称作“SEQ ID NO：13”或“Ssp1”)；

ETKVEENEAIQK(在本文中称作“SEQ ID NO：14”或“Ssp2”或“SAP2”)；

DSRPVRRRRRPRVSK(在本文中称作“SEQ ID NO：15”或“T1”)；

KVSRRRRRGGD(在本文中称作“SEQ ID NO：16”或“T2”)；

KKASEVSRRRRRGGK(在本文中称作“SEQ ID NO：17”或“T3”)；

CHHHASEVSRRRRRGGK(在本文中称作“SEQ ID NO：18”或“T4”)；

KEKIGKEFKRIVQE(在本文中称作“SEQ ID NO：19”或“LL1”)；

KVQRIKDFLRNLVE(在本文中称作“SEQ ID NO：20”或“LL2”)；

EAAGAMFLEAIPK(在本文中称作“SEQ ID NO：21”或“CPI1”)；

EGAMFLEAIPMSIPK(在本文中称作“SEQ ID NO：22”或“CPI2”)；

CGAMFLEAIPMSIPAAAHHHHH(在本文中称作“SEQ IDNO：23”或“CPI3”)；

KARRRRRGGGAMFLEAIPMSIPCGC(在本文中称作“SEQ IDNO：24”或“CPI4”)；

VSRRRRRGGDGDGC(在下文中称作“SEQ ID NO：25”或“JMH001”)；

GGDGDGC(在本文中称作“SEQ ID NO：26”或“JMH002”)；

VSRRRRRGGDGKGDAC(在本文中称作“SEQ ID NO：27”或“JMH003”)；

NEAIQEDQVQARRAKARRAC(在本文中称作“SEQ ID NO：28”或“JMH004”)；

QVQARRAKARRAC(在本文中称作“SEQ ID NO：29”或“JMH005”)；

GGDGKGDAC(在本文中称作“SEQ ID NO：30”或“JMH006”)；

QVQARRRAKARRRAC(在本文中称作“SEQ ID NO：31”或“JMH007”)；

VSRRRRRGGKGC(在本文中称作“SEQ ID NO：32”或“JMH008”)；

SVTRRRRRGGRASGGC(在本文中称作“SEQ ID NO：33”或“DEB001”)；

SEAIQEDQVQYCAAAHHHHH(在本文中称作“SEQ ID NO：34”或“SSP3”)；

KARRRRRGGDGDGCGC(在本文中称作“SEQ ID NO：35”或“T5”)；

HHHHHSRRRRRGGCGC(在本文中称作“SEQ ID NO：36”或“T6”)；

HHHHHSVQRIKDFLRNLVCGC(在本文中称作“SEQ ID NO：37”或“LL3”)；

RRRRRSVQRIKDFLRNLVCGC(在本文中称作“SEQ ID NO：38”或“LL4”)；

HHHHHAAHKSALKSACGC(在本文中称作“SEQ ID NO：39”或“Papa4”)；

RRRRRAAHKSALKSACGC(在本文中称作“SEQ ID NO：40”或“Papa5”)；

Alt衍生的肽，例如，PGTKLYTVPW-芘(其可以结合葡萄球菌细菌的表面；序列PGTKLYTVPW在本文中称作“SEQ ID NO：41”)；

肽聚糖，例如，N-乙酰葡糖胺-[b-1，4-N乙酰基胞壁酸、N-乙酰基胞壁酰-L-丙氨酸或脂磷壁酸；和

含有用于检测溶血素的染料的脂囊泡(许多溶血素会形成有序的蛋白复合物，其是孔形成性毒素，且可以通过染料从脂囊泡的释放和染料随后扩散到疏水固体底物上检测到)。在本发明的一些实施方案中，SEQ ID NO：1的“X”成员是鸟氨酸。

本文描述的这样的底物可以从商业途径得到，例如Sigma-Aldrich，Corp.(St.Louis，MO)，或可以使用本领域的技术人员已知的方法生产(例如，分离、纯化或合成)。

在一些实施方案中，能通过与蛋白的相互作用发生修饰的肽包含氨基酸序列，例如本文列出的序列之一，或与本文列出的序列之一具有至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的序列，如使用本文所述的序列对比程序和参数确定的。

在一些实施方案中，将其它的侧基附着到肽链的一个氨基酸上。例如，DEB001可以包括结合在肽链的一个或多个丝氨酸上的二苄醚保护基。保护基是用于保护氨基酸不与比色组分反应的化学基团。保护基的使用，允许用两种比色组分标记在一个肽中的相同类型的氨基酸。例如，可以用二苄醚基团保护DEB001中的一个丝氨酸基团，而未保护的丝氨酸可以与一种比色组分反应。可以去除保护基，且第二个丝氨酸可以与不同的颜色组分反应，从而产生具有两种不同的颜色组分的底物。

本发明的肽也包括上述的肽的片段和序列变体。变体包括由生物中相同的遗传基因座编码的基本上同源的肽，即等位基因变体，以及其它的变体。变体也包括由生物中的其它遗传基因座衍生的肽。变体还包括与这些肽基本上同源或相同、但是源自另一种生物的肽(即直向同源物)，通过化学合成生产的肽，或通过重组方法生产的肽。

为了最佳的对比目的，通过比对序列，可以确定两个氨基酸序列的百分比同一性(例如，可以将缺口导入第一个序列的序列中)。然后，对比在对应位置处的氨基酸，且2个序列之间的百分比同一性是序列共享的相同位置的数目的函数(即，％同一性＝相同的位置的#/位置的总#x 100)。在某些实施方案中，为对比目的比对的氨基酸序列的长度是参照序列长度的至少30％，优选地，至少40％，更优选地，至少60％，甚至更优选地，至少70％、80％、90％或100％。通过众所周知的方法，例如，使用数学算法，可以实现两个序列的实际对比。这样的数学算法的优选的非限制性的实例记载在Karlin等，90PROC.NAT’L ACAD.SCI.USA 5873-77(1993)，其在这里引作参考。这样的算法整合在BLAST程序(2.2版)中，如Schaffer等，29NUCLEIC ACIDS RES.2994-3005(2001)所述，其在这里引作参考。当使用BLAST和Gapped BLAST程序时，可以使用各程序的默认参数。在一个实施方案中，检索的数据库是非冗余的数据库，且用于序列对比的参数可以设定为：无过滤程序(no filters)；期望值(Expectvalue)为10；字符大小(Word Size)为3；矩阵(Matrix)为BLOSUM62；且缺口成本(Gap Costs)对于存在(Existence)为11，而对于延伸(Extension)为1。

在另一个实施方案中，使用GCG软件包(可以从Accelrys，Inc.of San Diego，CA得到，在http://www.accelrys.com，从2001年8月31日起)中的GAP程序，使用Blossom 63矩阵或PAM250矩阵，缺口权重为12、10、8、6或4，长度权重为2、3或4，可以确定2个氨基酸序列之间的百分比同一性。在另一个实施方案中，使用50的缺口权重和3的长度权重，可以确定两个核酸序列之间的百分比同一性。本文描述了其它的优选的序列对比方法。

本发明还包括这样的肽，其具有低程度的同一性，但是具有足够的相似性，以便执行一种或多种由本发明的核酸分子编码的肽执行的相同功能(例如，充当微生物生产的蛋白的底物的能力)。通过保守的氨基酸取代，可以确定相似性。这样的取代是，用另一种类似特性的氨基酸取代肽中的给定氨基酸。保守取代可能是表型沉默的。一般地，视作保守取代的是脂族氨基酸Ala、Val、Leu和Ile中的彼此替换；羟基残基Ser和Thr的互换；酸性残基Asp和Glu的交换；酰胺残基Asn和Gln之间的取代；碱性残基Lys和Arg的交换；和芳族残基Phe和Tyr之间的替换。关于哪个氨基酸变化可能是表型沉默的指导，参见Bowie等，247SCIENCE 1306-10(1990)，其在这里引作参考。

功能变体也可以含有能导致功能上无变化或不显著的变化的类似氨基酸的取代。或者，这样的取代可以正面地或负面地在一定程度上影响功能。无功能的变体一般含有一个或多个不保守的氨基酸取代、缺失、插入、倒位或截短，或关键残基或关键区域中的取代、插入、倒位或缺失。

通过本领域已知的方法，例如定位诱变或丙氨酸-扫描诱变(Cunningham等，244SCIENCE 1081-85(1989)，其在这里引作参考)，可以鉴别出底物的修饰必需的本发明的肽中的氨基酸。后一种方法能将单个的丙氨酸突变导入分子中的每个残基处(每个分子一个突变)。

本发明也包括各种上述的肽或其功能变体的氨基酸序列的肽片段。例如，片段可以源自包含Pala1的多肽。有用的片段包括能保留作为微生物生产的蛋白的底物的能力的那些片段。

片段可以是离散的(未融合到其它的氨基酸或肽上)，或可以在更大的肽中的。而且，几个片段可以包含在一个更大的肽中。在一个实施方案中，为在宿主中的表达设计的片段可以具有异源的融合在肽片段的氨基末端的前肽和肽原区，和融合在该片段的羧基末端的其它区域。

使用标准的重组蛋白技术(见，例如，AUSUBEL等，CURRENTPROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY(1998)，其所有的教导在这里引作参考)，可以生产底物的肽。另外，使用重组技术，也可以产生本发明的蛋白。如果需要，通过测试足量供给的待测蛋白和底物，可以测定修饰的准确位点，且可以定义蛋白的更具体的底物。该底物也可以用于测定目标微生物的存在。

比色组分

底物用至少一种比色组分标记。一般地，比色组分是能附着到底物、蛋白或肽上的活性染料。在一些实施方案中，底物用至少两种比色组分标记(例如，至少2、3、4、5、7、10、15或更多的比色组分)。如果底物被修饰(例如，从底物切割肽和/或一种或多种比色组分)，比色组分就能产生信号(例如，可视的颜色变化)。这样，比色组分用作为标记或标签，以指示修饰的存在或不存在。在一些实施方案中，信号是可视的颜色变化。在其它的实施方案中，信号是在光谱的可见带(例如，从～700nm至～400nm)中可检测到的颜色变化。通过将更大量的比色组分附着到底物上，可以产生更可视的颜色或颜色变化。在其它的实施方案中，用至少两种不同的比色组分标记了底物。这样的实施方案允许产生两种或更多种不同的色调变化的可能性。

许多类型的染料，例如活性染料和纤维活性染料(在本文中简单地称作“活性染料；”活性染料可以是比色的或荧光的)，可以商业地得到(从染料生产商，例如DyStar Textilfarben GmbH&Co.Deutschland KG，Frankfurt，德国和化学公司，例如Sigma Aldrich，Acros，Molecular Probes，和ICN)，且适用作比色组分。为检测方法、应用或物品选择的染料的类型或具体种类将取决于染料的性质(例如，摩尔消光系数)和要使用它的环境。

活性染料是有色的化合物，其含有一个或两个反应基，后者能形成染料和蛋白、肽、底物、比色组分、固体支持物或收集器之间的共价键。大约80％的所有活性染料是基于偶氮发色团。纤维活性染料是有色的化合物，其具有一个反应基，后者能与纤维形成共价键。这些染料在历史上已经用于纺织工业。其它的合适的染料的实例包括经美国食品和药品管理局(U.S.Food and Drug Administration)批准用于食物、药物、化妆品或医疗器械(例如，隐形眼镜或缝线)的那些(例如，罂红、活性黑5、活性蓝21、活性橙78、活性黄15、活性蓝19、活性蓝4、活性红11、活性黄86、活性蓝163、活性红180)；单-和二卤素三嗪染料(例如，单-和二-氟三嗪染料；单-和二-氯三嗪染料；单-(m′-羧基吡啶)三嗪；活性蓝4；活性黄86；PROCION系染料、颜料和着色物质的染料，其可以从BASF得到；和CIBACRON^TM系的煤焦沥青色，其可以从Ciba-Geigy得到)；2，4，5trihalogenopyriminidines；2，3二卤喹喔啉；N-羟基磺基琥珀酰亚胺基(磺基-NHS)酯官能化的染料；N-羟基琥珀酰亚胺基(NHS)官能化的染料；乙烯砜染料(例如，REMAZOL系的煤焦油染料，例如REMAZOL蓝，由DyStar Textilfarben GmbH&Co.DeutschlandKG生产；和活性黑5)；和磺酰氯染料(例如，丽丝胺若丹明和dabsylchloride)；四氟代苯基酯官能化的染料；异硫氰酸酯官能化的染料；和碘乙酰基官能化的染料。本发明还包括结构上与本文列出的染料等同的染料。

罂红(也称作FD&C蓝1、酸性蓝9、亮蓝FCF或N-乙基-N-[4-[[4-[乙基[(3-磺基苯基)甲基]氨基]苯基](2-磺基苯基)亚甲基]-2，5-亚环己烯-1-基]-3-磺基-，内盐，二钠盐，CAS编号[3844-45-9])的结构是：

通过本领域的技术人员已知的方法，可以制备出该染料的磺酰氯形式。罂红的磺酰氯的两种可能的异构体的化学结构是：

这些染料的名称是N-乙基-N-[4-[[4-[乙基[(3-(氯磺酰基)苯基)甲基]氨基]苯基](2-磺基苯基)亚甲基]-2，5-亚环己烯-1-基]-3-磺基-，内盐，钠盐和N-乙基-N-[4-[[4-[乙基[(3-磺基苯基)甲基]氨基]苯基](2-(氯磺酰基)苯基)亚甲基]-2，5-亚环己烯-1-基]-3-磺基-，内盐，钠盐。

已知磺酰氯能优先与伯胺基团反应，例如在赖氨酸基团或肽和蛋白的N-末端上发现的那些。因而，上述的染料可以直接用于标记肽。或者，通过本领域的技术人员已知的方法，可以进一步化学地修饰磺酰氯形式的罂红，以呈现其它的官能团，例如NHS酯、碘琥珀酰亚胺或其它的反应基。其它染料的这样的化学修饰的实例，记载在美国专利5,393,514，美国专利5,846,737和美国专利5,798,276中，其所有教导都在这里引作参考。

纤维活性染料是基于氯或氟离去基团化学性质的，且称作氯-或氟-三嗪基染料。在各种温度范围下，活性染料从非常低的反应性变化至高反应性的(例如CIBRACRON^TM F和PROCIONMX)。反应基是三嗪基环(具有3个氮的6侧环)。认为该反应是亲核的双分子取代机制。它是特异性的碱催化的底物的亲核官能团向染料的反应基的亲电子中心的加成。活性蓝4和活性黄86具有下面的结构：

活性蓝4 活性黄86

三嗪染料活性蓝4在水中的UV/可见光谱显示在图1，而三嗪染料活性黄86的光谱显示在图2。

乙烯砜染料能通过亲核加成机理进行反应，其中在加成步骤之前经常存在消除步骤，从而导致乙烯中间体的形成。一般地，存在碱催化的离核的离去基团的消除，然后是碱催化的底物的亲核官能团的加成。REMAZOL染料是使用反应基：-SO₂-CH₂-CH₂-OSO₃Na的乙烯砜染料的实例。活性蓝19和活性黑5具有下面的结构：

活性蓝19 活性黑5

(REMAZOL亮蓝R) (REMAZOL黑B)

REMAZOL亮蓝R在水中的UV/可见光谱显示在图3，而REMAZOL黑B乙烯砜的光谱显示在图4。

磺酰氯是反应性的磺酸衍生物。磺酰氯化合物与含有伯胺的分子的反应继续进行，丢失氯，并形成氨磺酰键。磺酰氯染料丽丝胺若丹明B磺酰氯(即，呫吨，9-[4-(氯磺酰基)-2-磺基苯基]-3，6-双(二乙基氨基)-，内盐，可以从Molecular Probes，Inc.，Eugene，Oregon，得到，CAS编号/名称：62796-29-6)的结构是：

丽丝胺若丹明B磺酰氯

N-羟基磺基琥珀酰亚胺基(磺基-NHS)酯官能化的染料是水溶性的，且可以与含有伯胺的分子反应，以形成酰胺键，其中丢失磺基-NHS基团。N-羟基琥珀酰亚胺基(NHS)官能化的染料也可以与胺基反应。用NHS酯官能化的染料BODIPYFL，SSE(即，4，4-二氟-5，7-二甲基-4-硼-3a，4a-二氮杂-s-indacene-3-丙酸，磺基琥珀酰亚胺基酯，钠盐；可以从Molecular Probes，Eugene，Oregon得到)的结构是：

BODIPYFL，SSE

通过本领域已知的方法，可以将比色组分附着到底物上，例如Greg Hermanson在BIOCONJUGATE TECHNIQUES(1996)所述的那些，其可以从Academic Press，San Diego，CA得到，其中的教导在这里整体引作参考。在一些实施方案中，比色组分共价地附着在肽上。例如，当附着第一种比色组分时(例如，附着到丝氨酸基团上的三嗪染料或附着到半胱氨酸基团上的乙烯砜染料)，可以使用保护基来封闭肽链上的一个附着位点。附着第一种比色组分后，去除保护基，以附着第二种比色组分。可以使用表面活性剂(例如Triton-X)来促进比色组分向肽链的附着和/或提高溶解度。

用比色组分标记底物的程度是变化的，且取决于许多因素，例如，要使用底物的应用的需要、生产要求和本发明的操作人员的意愿。表征标记底物的水平或量的一种方法包括，称作它的“染料/底物比”。如本文使用的，术语“染料/底物”比是染料的摩尔浓度与底物的摩尔浓度的摩尔比，且是表征底物的标记水平和标记反应的效率的方法。例如，1.0的染料/底物比表示，平均每个底物被一个比色组分标记。低染料/底物比表示底物的不完全标记(即，许多肽没有附着于其上的染料)。在一些实施方案中，染料/底物比的范围取决于要用颜色组分标记的肽上的氨基酸的数目。例如，如果要标记2个位点，则完全的标记反应会产生约2的染料/底物比。合适的染料/底物比取决于准确的应用。例如，染料/底物比可以影响信号的清晰度，底物向固体支持物的附着，和生物传感器的其它方面，这可以根据本发明的操作人员的需要而改变。

通过实验可以确定合适的染料/底物比。例如，可以合成底物肽，以添加或减去多余的氨基酸基团，后者是合适的附着比色组分的靶。这样，可以改变染料/底物比，并可以测试得到的底物，以确定哪个比率能产生对于给定的应用可接受的结果。例如，CPI4在一端含有2个半胱氨酸基团，后者是乙烯砜染料的良好靶。这允许每个肽上附着2个比色组分。通过添加第二个比色组分，由底物产生的所得信号会比向底物仅仅附着一个比色组分时更亮(即，具有更大的颜色强度和/或更明显的对比)。对于特定的应用，该更亮的颜色可以更有利。例如，深蓝色染料可以容易地在固体支持物上看到，但是黄色染料可能需要更多的染料/肽，以产生理想的颜色水平。但是，如果或当肽附着到固体支持物上时，肽一端上过多的染料可能产生空间位阻，所以，对于每种底物和/或应用，存在最佳的染料/底物比或比率范围。

固体支持物

在一些实施方案中，底物附着到固体支持物上。合适的固体支持物的实例包括伤口敷料(例如，绷带或纱布)、需要无菌或没有微生物污染的任何材料、含有或收集样品的物品(例如，尿液收集袋、血液收集袋、血浆收集袋、试管、体液收集管、试管、导管、棉拭、棉拭托架、浸渍片或微量培养板孔)、聚合物、膜、树脂、玻璃、海绵、刚性探头或毛细管、护理尺(care ruler)的点、圆盘、显示器、过滤器、透镜、泡沫、布、纸、擦子、缝线和袋子。在本发明的一些实施方案中，固体支持物由适于灭菌的材料制成。合适的灭菌固体支持物的方法的实例包括γ照射处理和环氧乙烷处理。在一些实施方案中，固体支持物包括比色组分和/或固体支持物由有色材料制成。

在优选的实施方案中，固体支持物是医疗产品，其接触患者或来自医学患者的身体组织或流体样品。例如，在一些实施方案中，固体支持物是医疗装置或产品，其具有允许接近流体样品(例如，身体或伤口流体)的取样孔、将流体吸入装置或产品的芯吸试剂、在其中进行检测的测定室和允许操作人员观察信号的观察孔，所述信号能指示微生物的存在。在其它的实施方案中，固体支持物是用于下述用途的材料：清洁伤口表面，测量伤口闭合的距离，从伤口得到样品，和/或将标本转移至临床微生物学设备。这样的固体支持物能提供由保健提供者使用的诊断或护理点(point of care)(POC)装置，以定量或定性任意的感染性的或病原性的微生物在伤口中的存在。例如，这样的实施方案可以用于确定伤口是否具有10⁵CFU/ml伤口病原体(或更多)。认为10⁵CFU/ml伤口病原体是关键定居，其暗示着伤口的慢性感染。

图5说明了实验室标本收集容器的照片。传感器500的蓝色指示着一种或多种特定类型的微生物在实验室标本容器中的存在。类似地，将传感器置于棉拭样品容器中，以指示微生物在已经置于容器中的样品中的存在。

在一些实施方案中，将含有伤口病原体的特异性标记的传感器结合到置于藻酸盐或棉拭(例如，棉花或聚氨基甲酸酯棉拭)背面的环上。棉拭从伤口沿着主干的外侧向上吸取流体。流体然后经过棉拭的顶部，流向环传感器，且如果目标微生物蛋白存在于流体中，传感器就会产生信号(例如，颜色变化)。在单色染料标记的肽的情况下，将自由扩散的颜色收集进膜中，该膜以强亲和力优先结合染料离去基团。在酶原-肽缀合物的情况下，肽的水解会导致酶原的活化，或酶原向能清楚地见到的区域中的运动，从而产生颜色信号的放大。

图6说明了2个棉拭照片。左侧的棉拭尚未暴露于流体样品，而右侧的棉拭已经暴露。附着到右侧的棉拭上的传感器已经改变了颜色，这指示着金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)在样品中的存在。

在另一个实施方案中，将传感器整合进薄的、柔性的且干净的塑料标尺之上或其中，该标尺具有两个用途：测量伤口床(wound bed)的间距和检测特定类型的微生物的存在，以确定患者是否具有初期的感染。在一些实施方案中，标尺包括位于中央的通道，以及可以提供阳性的和/或阴性的对照颜色的一个或多个颜色图，感染传感器或在有害微生物存在的情况下能产生可视信号的传感器，和/或具有用于记载患者信息(例如，患者的识别编号、就诊日期和/或时间)的线的区域。任选地，标尺可以包含对一种或多种伤口病原体物种特异性的传感器和/或能检测许多病原体的广谱传感器。在使用中，可以将标尺/传感器组合拍照，以为护理人员(caregiver)提供患者图表的永久记录。图7说明了这样的标尺的照片。图8说明了暴露于伤口流体后的标尺，该流体含有来自对传感器特异性的微生物的蛋白，且传感器已经经历了颜色变化，从而指示微生物的存在。

在另一个实施方案中，将传感器包含在伤口清洗擦子或海绵上，后者可以用于例如清洁伤口和检测微生物的存在。海绵或擦子包含吸收性的材料，例如布、纸、棉花、海绵或无纺纤维材料。传感器可以以能提供均匀的覆盖的模式附着或整合到擦子或海绵上，以用于检测来自感染的伤口的蛋白。在一些实施方案中，传感器以波纹、网孔、栅格或点等图案印到材料上。优选地，从伤口流体的一般颜色，可以容易地鉴别出由底物产生的信号。在一些实施方案中，擦子或海绵也用于涂敷治疗或抗生素物质。

在另一个实施方案中，将传感器置于用于对伤口流体取样的圆柱形刚性探头或毛细管的顶部。探头的刚性足以对伤口施加压力，以压迫并将流体抽入含有传感器的中空室中。在一些实施方案中，探头包含广谱的传感器，一系列的特异性的传感器，或二者。在一些实施方案中，室由软或硬的干净材料制成(例如玻璃、聚硅氧烷或具有类似性质的其它材料)。探头的内室能通过毛细管作用抽上流体，且也含有膜过滤器，其包含比色传感器，后者对每种微生物或目标病原体是特异性的，和/或能形成可以检测广谱微生物的传感器。任选地，探头或毛细管包括吸收剂芯，其包含聚氨基甲酸酯或其它的合适的材料，其用于将样品流体抽入膜传感器区域。图9说明了刚性毛细管探头900，其包含传感器902。

在另一个实施方案中，将传感器整合进置于伤口上的细条、薄膜、网孔或缝线材料中，以收集液体。在一些实施方案中，传感器能在检测目标微生物存在的数分钟内，产生信号。在一些实施方案中，条、膜、网孔或缝线由非吸收性的材料(例如，尼龙或聚乙烯纤维)制成。在其它的实施方案中，条、膜、网孔或缝线由吸收性的材料(例如，聚氨基甲酸酯)制成。在使用中，薄膜、网孔或缝线可以置于常用于将棉拭样品运输到实验室的塑料或玻璃试管托架中，从而为护理人员提供传感器系统，并为医院实验室内的验证性读数提供容器。

在一些实施方案中，护理点(POC)传感器装置可以整合进用于将样品(例如，组织或活组织检查样品)转移到实验室的标本袋或罐中。在其它的实施方案中，将肽植入到薄膜上，和/或直接浸渍到样品罐或袋上。任选地，将非离子型去污剂(例如，HECAMEG、TRINTON X100或TWEEN)和/或其它试剂(例如，缓冲剂，例如PIPES(pKa＝6.76)，DNAse I，和/或无孔的玻璃或金属珠)包含在POC传感器和/或标本袋或罐中，以控制传感器的最佳活性，从组织样品水解DNA，并预防它变成太粘的，通过温和的回荡浸渍组织，渗透组织样品以促进任何目标微生物的检测，和/或提高活组织检查/组织样品的均匀性。

在一些实施方案中，POC装置是一次性用品，它将一次性使用，然后置于生物危害废物中。在高压灭菌后，该装置会被破坏，而患者的信息会被保密。

在一些实施方案中，将底物粘附、附着、偶联或结合到固体支持物上。这样做的方法是本领域已知的。例如，底物可以通过非共价相互作用(例如，疏水相互作用、亲水相互作用、静电相互作用或通过吸着过程)或通过共价结合，附着到固体支持物上。在其它的实施方案中，底物包括疏水的离去基团，且非共价地结合到固体支持物的疏水表面上。在其它的实施方案中，通过二硫键或伯胺、硫醇基、羧基、羟基，或使用交联剂(例如，磺基EMCS(N-Maleimidocaproyloxysulfoxuccinimide酯)，其购自Pierce Biotechnology，Inc.，Rockford，Illinois)，将亲水的或疏水的底物偶联到表面上。在另一个实施方案中，使用非必需的反应末端例如游离的胺、羧酸或硫醇基，其不会影响底物与微生物生产的蛋白的相互作用，将底物偶联到固体支持物上。在～4℃，在调节至pH～4.5的蒸馏水中，使用例如10-倍摩尔过量的N-乙基-N′-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐或N-环己基-N′-2-(4′-甲基-吗啉)乙基碳二亚胺-对甲苯磺酸盐将游离的胺偶联到底物的羧基上～2小时，以促进形成肽键的缩合反应。可以用二硫苏糖醇或Tris(2-羧乙基)膦还原硫醇基，然后用N-e-马来酰亚胺基己酸(N-e-maleimidocaproic acid)偶联到表面上的游离氨基上(见D.G.Griffith等，N-Polymethylenecarboxymaleimides：Anew class of probesfor membrane sulfhydryl groups，134FEBS LETT.261-63(1981)，其在这里引作参考)。在另一个实施方案中，通过肽的氨基酸和固体支持物之间的吸引相互作用，将底物附着到固体支持物上。例如，可以将具有连续的组氨酸残基的肽结合到含有通过共价附着的NTA固定化的镍离子的树脂(例如，SEPHAROSE)上。在另一个实例中，固体支持物具有极性电荷(例如，带负电荷的膜)，且至少一部分底物(例如，底物肽链的一个或多个肽)具有与固体支持物相反的极性电荷。这些相反的电荷能提供底物向固体支持物的附着。

在一些实施方案中，底物修饰包含切割至少一部分底物，其中该部分包含一种比色组分，且该切割会导致可视的颜色变化。例如，如果底物包括蓝色和黄色比色组分，则未切割的底物可以显示绿色。蛋白切割包含黄色比色组分的一部分底物后，从紧邻存在的未切割的部分，去除切割的部分，从而剩下未切割的部分显示蓝色。可视的颜色变化指示着样品中微生物的存在，而颜色变化的缺失则指示着微生物的不存在。

图5说明了本发明的一个实施方案的示意图。未修饰的底物包含肽、黄色比色组分和蓝色比色组分。未修饰的底物具有绿色色调。通过蛋白酶修饰后，切割了包含黄色比色组分的一部分肽，剩下仅仅具有蓝色比色组分的底物。因此，底物的修饰会产生由绿至蓝的颜色变化形式的信号。

在一些实施方案中，底物的修饰包括切割肽的一个肽键。在其它的实施方案中，底物的修饰包括从肽切割至少一种比色化合物，从而产生可视的颜色变化。在另一个实施方案中，底物的修饰包括水解肽中的至少一个肽键，并导致至少一部分肽从底物切割掉。切割的部分包括至少一种比色组分，从而导致可视的颜色变化。

用于从紧邻存在的未切割的部分去除底物的切割部分的准确机理可以变化。例如，切割的部分可以扩散、吸附和/或迁移进周围的环境(例如，例如伤口敷料)，或可以用液体洗掉。

收集器

在一些实施方案中，使用收集器来去除切割的部分，从而使信号是可检测的。如本文使用的，“收集器”是固体或表面，其具有吸引底物的切割部分的性质。在这些实施方案中，一个或多个切割部分可以具有比底物和/或固体支持物的其它部分更高的对收集器的吸引力或亲和力，从而切割的部分能从底物迁移、吸附和/或扩散并朝向收集器或远离底物或修饰的底物的未切割部分的一些点。在一些实施方案中，切割的部分的迁移距离是足够的，从而会产生可检测的信号。在一些实施方案中，切割的部分的迁移会导致可检测的信号。

在一些实施方案中，底物的切割的部分可以被捕获到收集器上。在其它的实施方案中，切割的部分被捕获到有色的收集器上。在其它的实施方案中，底物的修饰会导致切割的部分被捕获到有色的收集器的表面上，从而产生或指示固体支持物的颜色变化。即，一旦释放出底物的切割的部分，它就会通过一种或多种力(例如，静电力或磁力，或化学结合力)被吸引到收集器上。在另一个实施方案中，收集器会造成切割的部分从底物迁移足够的距离，从而使固体支持物的颜色是可检测的。

作为非限制性的实例，底物可以包括第一种比色组分(例如，附着到肽上的黄色比色组分)。修饰可以包括切割底物，从而使得第一种切割的肽部分包含第一种比色组分，且第二种切割的肽部分不包含比色组分。第一种切割的肽部分可以被吸引向收集器，从而导致收集器的可视的颜色变化(例如，收集器可以显示更多的黄色)。如果底物最初附着到固体支持物上，则固体支持物和底物的未切割的部分的组合可以表现出颜色变化(例如，显示更少的黄色或变成无色)。

在另一个非限制性的实例中，第一个和第二个切割的部分可以存在于液体中，且包含比色组分(例如，黄色)的第一个部分向收集器的迁移可以导致液体表现出颜色变化(例如，显示更少的黄色或变成无色)。

在另一个非限制性的实例中，未修饰的底物可以包含至少两种比色组分(例如，黄色和蓝色比色组分)，且修饰可以导致第一个切割的部分包含黄色比色组分，且第二个部分包含蓝色比色组分。在第一种比色组分的相当大迁移之前，第一种和第二种比色组分的紧密邻近可以提供绿色的外观。随着第一个部分向收集器的迁移，各颜色变得更明显。例如，如果第二个部分附着到固体支持物上，则随着第一个部分向收集器迁移，并远离固体支持物和第二个部分，固体支持物和第二个部分的组合可以改变颜色(例如，变成更蓝的色调)。例如，如果将原始底物包含在液体中，则液体会紧在修饰后继续表现出绿色。但是，随着第一个切割的部分向收集器迁移，剩余的流体和第二个切割的部分的组合可以改变颜色(例如，变成更蓝的色调)。任选地或另外地，底物的修饰可以导致收集器产生颜色变化(例如，随着黄色的第一个切割的部分收集到收集器的表面上，收集器表现出更黄的颜色)。

在一些实施方案中，修饰会导致可视的预定模式的颜色变化。例如，修饰可以导致形状(例如，符号、字母或词)的出现、消失和/或颜色变化。这可以如下实现，例如，将底物以特定图案(例如，星形、十字形或加号)附着到固体支持物上。例如，固体支持物材料可以是蓝色，且具有黄色比色组分的底物可以以星形排列到固体支持物上。在修饰之前，固体支持物表现出具有蓝色背景，其具有绿色星形(星的绿色色调源自底物的黄色色调和固体支持物的蓝色色调的混合)。修饰会导致黄色比色组分从底物的切割，且通过绿色星形的褪色来指示，从而剩下固体支持物显示蓝色。在另一个实施方案中，采用收集器，以切割的部分会被吸引到收集器的预定区域的方式进行收集。例如，底物可以包含黄色比色组分，且收集器可以包含蓝色材料。底物的修饰会导致黄色比色组分以预定的形状(例如十字形状)收集到收集器上。这样，通过具有绿色外观的十字形的出现(由于组合的收集器的蓝色色调和比色组分的黄色)，来指示底物的修饰。在另一个实施方案中，底物的修饰会导致固体支持物和收集器上的一种或多种预定形状的出现、消失和/或可视的颜色变化。任选地，使用许多不同类型的底物、收集器表面和固体支持物表面，从而可以检测许多修饰和/或微生物。本发明包括，使用超过一种形状，形状的组合，和一种或多种收集器和/或固体支持物的色移，这是本领域的技术人员熟知的。

本文所述的实施例无意以任何方式进行限制，且本发明也包括固体支持物的其它组合，比色组分的类型和数目，和诱导迁移的吸引的和/或排斥的收集器。

在一个实施方案中，本发明包括检测底物的修饰的方法，其中未修饰的底物包含具有至少一种比色组分的肽，其中该方法包含下述步骤：a)在能导致底物的修饰的条件下，将底物暴露给样品，其中底物的修饰包含切割至少一部分肽，所述肽包含至少一种比色组分，且切割的部分能向收集器迁移，其中迁移会导致可视的颜色变化；和b)检测可视的颜色变化的存在或不存在，其中可视的颜色变化指示着底物的修饰，且可视的颜色变化的的不存在指示着底物的修饰的不存在。

图11说明了本发明的金属螯合实施方案的示意图。比色组分，在该情况下是染料，包含在肽上，该肽附着在镍树脂固体支持物上。蛋白酶能切割一部分肽，且切割的部分具有比原始表面更大的对膜收集器的亲和力。随着染料向收集器迁移，剩余的肽和固体支持物会产生可视的颜色变化。任选地，随着染料迁移向或到收集器上，收集器会产生信号。

图12说明了本发明的一个实施方案，其中带电的膜偶联到包含比色组分的底物上。蛋白酶会切割一部分肽，且切割的部分具有比原始表面更大的对膜收集器的亲和力。随着染料向收集器迁移，剩余的底物和固体支持物会产生可视的颜色变化。任选地，随着染料向它迁移，收集器会产生信号。

收集器可以由任意的合适的能促进底物的切割的部分迁移的材料制成。例如，收集器可以包含膜、树脂、聚合物、膜、玻璃或螯合材料。在一些实施方案中，将收集器附着到固体表面上，例如伤口敷料(例如，绷带或纱布)、需要无菌或没有微生物污染的任何材料、含有或收集样品的物品(例如，尿液收集袋、血液收集袋、血浆收集袋、试管、体液收集管、试管、导管、棉拭、浸渍片或微量培养板孔)、聚合物、膜、树脂、玻璃、海绵、圆盘、显示器、过滤器、透镜、泡沫、布、纸、缝线和袋子。在本发明的一些实施方案中，固体支持物由适于灭菌的材料制成。合适的灭菌收集器的方法的实例包括γ照射处理。在一些实施方案中，收集器包括比色组分，或由有色材料制成。

作为它们的正常生长过程的一部分，许多微生物会分泌许多蛋白到它们的生长环境中或造成许多蛋白被分泌到它们的生长环境中，所述蛋白为例如酶。这些蛋白具有许多功能，包括，但不限于，营养物的释放，针对宿主防御的保护，细胞外膜合成(在细菌中)和/或维持，和尚未确定的其它功能。许多微生物还在它们的细胞表面上生产蛋白，其暴露于细胞外环境(并与其相互作用)。许多这样的蛋白对分泌它们的微生物是特异性的，且同样，可以用作存在那些微生物的特异性标记。本发明包括方法和/或系统，其可以检测这些生产的和/或分泌的蛋白的存在，且可以同样地用于指示生产/分泌性微生物的存在。或者，本发明提供了方法和/或系统，其可以检测这些生产的和/或分泌的蛋白的不存在，从而指示生产/分泌性微生物的不存在。这样的检测方法和/或系统可以用于检测或诊断微生物和/或感染(例如，伤口感染)的存在。

在一些实施方案中，微生物会生产能修饰底物的蛋白。本发明包括检测微生物在样品中存在或不存在的方法。例如，该方法可以包含下述步骤：a)在会导致微生物对底物的修饰的条件下，使样品接触底物，和b)检测修饰或修饰的不存在。微生物生产的、分泌的或表达的蛋白能修饰底物。在一些实施方案中，修饰包含切割至少一部分底物，其中该部分包含一种比色组分，且切割会导致可视的颜色变化，从而指示微生物在样品中的存在，且修饰的不存在指示微生物的不存在。

如本文所述的微生物检测系统通过鉴别蛋白，例如对待测的微生物特异性的分泌的酶，可以适合用于检测一种特异性的微生物。或者，系统可以被设计用于同时鉴别超过一种微生物物种(例如，至少2、至少5或至少10种不同的微生物物种)，例如经常感染伤口的那些。优选地，通过鉴别对某些类型的病原微生物常见、但是对非病原微生物不常见的那些蛋白，可以实现该目标。例如，使用微生物基因组数据库的基于计算机的生物信息筛选，可以鉴别出这样的蛋白。

通过设计合成的底物，其能特异性地与存在于细胞表面上或分泌进微生物生长环境中的蛋白反应，可以检测微生物的存在。可以用可检测的标记来标记这些合成的底物，从而在它们各自的蛋白能特异性地与它们反应的条件下，底物会经历由可检测的标记指示的修饰。例如，可检测的标记可以产生可视的颜色变化。

通过本发明的各实施方案可以检测的微生物的实例包括细菌、病毒和真菌。优选地，微生物是细菌。细菌的实例包括但不限于葡萄球菌(例如，金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidi)或腐生葡萄球菌(Staphylococcus saprophyticus))、链球菌(例如，酿脓链球菌、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)或无乳链球菌(Streptococcus agalactiae))、肠球菌(例如，粪肠球菌或屎肠球菌(Enterococcus faecium))、棒杆菌(例如，白喉棒杆菌(Corynebacterium diptheriae))、芽孢杆菌(例如，炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis))、利斯特氏菌(例如，单核细胞增生利斯特氏菌(Listeria monocytogenes))、梭菌(例如，产气荚膜梭菌(Clostridiumperfringens)、破伤风梭菌(Clostridium tetanus)、肉毒梭菌(Clostridiumbotulinum)、艰难梭菌(Clostridium diffcile))、奈瑟氏球菌(例如，脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)或淋病奈瑟氏球菌(Neisseria gonorrhoeae))、大肠杆菌、志贺氏菌物种、沙门氏菌物种、耶尔森氏菌(例如，鼠疫耶尔森氏菌(Yersinia pestis)、假结核耶尔森氏菌(Yersinia pseudotuberculosis)或小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersinia enterocolitica))、霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、弯曲杆菌物种(例如，空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)或胚胎弯曲杆菌(Campylobacter fetus))、幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)、假单胞菌(例如，铜绿假单胞菌或鼻疽伯克霍尔德氏菌(Pseudomonasmallei))、流感嗜血菌(Haemophilus influenzae)、百日咳博德特氏菌(Bordetella pertussis)、肺炎枝原体(Mycoplasma pneumoniae)、解脲尿枝原体(Ureaplasma urealyticum)、侵肺军团菌(Legionellapneumophila)、苍白密螺旋体(Treponema pallidum)、问号钩端螺旋体(Leptospira interrogans)、布氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi)、分枝杆菌(例如，结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)或麻风分枝杆菌(Mycobacterium leprae))、放线菌物种、诺卡氏菌物种、衣原体(例如，鹦鹉热衣原体(Chlamydia psittaci)、砂眼衣原体(Chlamydia trachomatis)或肺炎衣原体(Chlamydia pneumoniae))、立克次氏体(例如，立氏立克次氏体(Rickettsia ricketsii)、普氏立克次氏体(Rickettsiaprowazekii)或螨立克次氏体(Rickettsia akari))、布鲁氏菌(例如，流产布鲁氏菌(Brucella abortus)、马尔他布鲁氏菌(Brucella melitensis)或猪布鲁氏菌(Brucella suis))、奇异变形菌、粘质沙雷氏菌、阴沟肠杆菌、Acetinobacter anitratus、肺炎克雷伯氏菌和土拉热弗朗西丝氏菌(Francisella tularensis)。优选地，细菌是下述的一种或多种：葡萄球菌、链球菌、肠球菌、芽孢杆菌、梭菌、大肠杆菌、耶尔森氏菌、假单胞菌、奇异变形菌、粘质沙雷氏菌、阴沟肠杆菌、Acetinobacter anitratus、肺炎克雷伯氏菌或麻风分枝杆菌。更优选地，细菌是下述的一种或多种：金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、酿脓链球菌、铜绿假单胞菌、粪肠球菌、奇异变形菌、粘质沙雷氏菌、阴沟肠杆菌、Acetinobacter anitratus、肺炎克雷伯氏菌和/或大肠杆菌。

本发明的实施方案也可以用于检测一种或多种类型的真菌。优选地，真菌是能造成性质破坏的那些和/或能造成哺乳动物疾病的那些。真菌的实例包括犁头霉属(Absidia)、支顶孢属(Acremonium)、链格孢属(Alternaria)、Apophysomyces、节皮菌属(Arthroderma)、曲霉属(Aspergillus)、短柄霉属(Aureobasidium)、团担子菌属(Basidiobolus)、白僵菌属(Beauveria)、Bipolaris、芽生菌属(Blastomyces)、葡萄座腔菌属(Botryosphaeria)、假丝酵母属(Candida)、Capronia、耳霉属(Conidiobolus)、Cladophialophora、枝孢属(Cladosporium)、Clavispora、球孢菌属(Coccidioides)、旋孢霉属(Cochliobolus)、Cokeromyces、盾壳霉属(Coniothyrium)、隐球酵母属(Cryptococcus)、小克银汉霉属(Cunninghamella)、弯孢属(Curvularia)、Emericella、附球菌属(Epicoccum)、表皮癣菌属(Epidermophyton)、外瓶柄霉属(Exophiala)、Exserohilum、Fennellia、Fonsecaea、镰孢属(Fusarium)、赤霉属(Gibberella)、长蠕孢属(Helminthosporium)、组织胞浆菌属(Histoplasma)、Hortaea、Hyphopichia、伊氏酵母属(Issatchenkia)、克鲁维氏酵母属(Kluyveromyces)、Lacazia、Lasiodiplodia、小球腔菌属(Leptosphaeria)、Lewia、马杜拉分支菌属(Madurella)、小孢子菌属(Microsporum)、被孢霉属(Mortierella)、毛霉属(Mucor)、球腔菌属(Mycosphaerella)、丛赤壳菌属(Nectria)、Neosartorya、Neotestudina、Ochroconis、副球孢子菌属(Paracoccidioides)、青霉属(Penicillium)、瓶霉属(Phialophora)、毕赤氏酵母属(Pichia)、Plectosphaerella、Pseudallesheria、Pyrenochaeta、根霉属(Rhizopus)、糖酵母属(Saccharomyces)、瓶霉属(Saksenaea)、Scedosporium、Setosphaeria、Sporothrix、Stephanoascus、葡萄穗霉属(Stachybotrys)(例如，Stachybotrys chartarum或Stachybotrys echinata)、共头霉属(Syncephalastrum)、发癣菌属(Trichophyton)、瓶霉属(Wangliella)和Yarrowia。

这些细菌和真菌列表仅仅包含本发明可以适用的微生物的实例，并不意味着是穷尽性的。本发明可以用于任何现在已知的细菌和真菌，以及将来发现的任意物种。

在一些实施方案中，能与底物相互作用、以产生修饰的蛋白是酶。由于小量的酶可以催化大量的底物的转换，所以基于酶的检测系统能提供灵敏的实验。在其它的实施方案中，蛋白是病原体特异性的酶。如本文使用的，“病原体特异性的酶”是由病原微生物生产和/或分泌、但是非病原微生物不生产和/或分泌的酶。

本发明包括检测酶在样品中存在或不存在的方法。在一个实例中，该方法包含下述步骤：a)在会导致酶修饰底物的条件下，使样品接触底物，和b)检测修饰或修饰的不存在。在一些实施方案中，修饰包含水解肽中的至少一个肽键，并导致从底物切割至少一部分肽，其中从底物切割的肽部分包含一种比色组分，且其中切割会导致可视的颜色变化，从而指示酶在样品中的存在，且修饰的不存在会指示酶在样品中的不存在。

在酶代表用于开发检测微生物的试剂的靶的范围内，所述微生物能生产所述酶并将它们呈递到细胞表面，或将所述酶分泌进它们的生长环境，可以将所述酶分类。如本文所述的，将酶分成9类：溶素(即，能起裂解宿主细胞的作用的酶)、自溶素、外毒素、基质结合酶、脂酶；细胞壁酶(即，能参与细菌细胞壁组分的合成和周转的酶，所述组分包括肽聚糖)、蛋白酶(即，能特异性地或非特异性地切割肽、多肽或蛋白的酶)、水解酶(即，能将聚合分子分解成它们的亚单位的酶)、代谢酶(即，用于执行细胞的各种管家功能的酶，例如将营养物分解成对细胞有用的组分)或毒力因子酶(即，细菌细胞造成感染所需的酶)。

在其上/其中检测微生物存在或不存在的潜在样品的实例包括：伤口；体液(例如，例如血液、尿、唾液或伤口流体例如脓)；一根毛发；一块指甲；一块壳；一片鳞；一片羽毛；一块组织(例如，医学组织样品或一块肉、鱼肉或家禽)；其上/其中包括微生物的任何物品(例如，植入动物体内的物品、导管、尿液收集袋、血液收集袋、血浆收集袋、圆盘、显示器、过滤器、透镜、泡沫、布、纸、缝线、棉拭、棉拭托架、浸渍片、海绵、聚合物品、由树脂制成的物品、玻璃物品、试管或微量培养板孔)；隐形眼镜溶液；海绵；聚合材料；膜；由树脂或玻璃制成的物品；或来自房屋或建筑物区域的棉拭(例如，保健场所的检查室或手术室、浴室、厨房或加工或生产场所)。

在其它的实施方案中，本发明包括用于检测蛋白、酶或微生物的存在或不存在的生物传感器。这些生物传感器可以整合本文所述的本发明的方法。在一个实例中，生物传感器包含固体支持物和结合在固体支持物上的至少一种可检测地标记的底物。在一个实施方案中，将底物共价地结合到固体支持物上。在另一个实施方案中，通过固体支持物和底物之间的疏水的、亲水的和/或静电相互作用，将底物粘附或附着到固体支持物上。在另一个实施方案中，通过吸附或吸收，将底物粘附或附着到固体支持物上。在其它的实施方案中，底物包括肽和附着到肽上的至少2种比色组分。肽能特异性地与目标蛋白相互作用，或与其反应。在一些实施方案中，比色组分共价地附着在肽上。

在一些实施方案中，生物传感器包括至少一种能特异性地与蛋白、酶或微生物相互作用或与其反应的底物和至少2种共价地附着在肽上的比色组分。相互作用或反应会导致底物产生可检测的信号，以指示蛋白的存在。在其它的实施方案中，生物传感器能检测一种或多种(例如，至少～2、至少～5、至少～10、至少～20、至少～30、至少～50、至少～75或至少～100)本文所述的蛋白，并产生信号(例如，可视的颜色变化)，以指示蛋白的存在。

在一些实施方案中，本发明包括用于检测至少2种蛋白的存在的生物传感器，其包括第一种蛋白和第二种蛋白。例如，本发明的生物传感器可以包含一种或多种底物(例如，至少～2、至少～5、至少～10、至少～20、至少～30、至少～50、至少～75或至少～100种底物)，其能与一种或多种生产的和/或分泌的蛋白相互作用。在一个实例中，生物传感器包含固体支持物、至少一种可检测地标记的第一种底物和至少一种可检测地标记的第二种底物。可检测地标记的底物附着在固体支持物上。第一种底物包含第一种肽和附着到第一种肽上的至少2种比色组分。第一种底物能特异性地与第一种蛋白反应。同样地，第二种底物包括第二种肽和至少2种比色组分，且第二种底物能特异性地与第二种蛋白反应。

在一些实施方案中，附着到第一种和第二种底物上的4种比色组分中的至少3种是不同的。在这些多色的实施方案中，生物传感器可以经历2种或更多种不同的可视的颜色变化，以指示一种或多种截然不同的蛋白和/或微生物的存在。例如，如果一种类型的底物被设计用于与一种类型的蛋白反应，而第二种类型的底物被设计用于与不同的蛋白反应，且两种类型的底物都包含在固体支持物上，则大量的颜色变化可以被设计用于指示许多不同的蛋白和/或微生物物种的存在。

在一个实施方案中，生物传感器用于保健或家庭使用场所，且适用于检测伤口中的微生物。在其它的实施方案中，生物传感器用于农业场所。在农业场所中的生物传感器的一个实例是，用于检测微生物在食品(例如，肉、鱼肉或家禽产品)中的存在的传感器。

在一些实施方案中，使生物传感器直接接触动物身体(例如，人身体)。在其它的实施方案中，使生物传感器直接接触动物身体上的伤口。在其中样品是伤口或体液的那些实施方案中，可以使用无菌的覆盖物或无菌层，来预防伤口或体液直接接触生物传感器后造成的污染。在其它的实施方案中，无菌的覆盖物具有使其适于灭菌的性质，而无菌的覆盖物不会妨碍蛋白/底物相互作用。合适的灭菌生物传感器的方法的实例包括用γ照射处理。在另一个实施方案中，通过敷料观察生物传感器(例如，通过敷料中的观察窗)。

制备本发明的生物传感器的一种方法是，首先测定能与表征待测微生物的特定蛋白相互作用的特定底物。用一种或多种比色组分标记测定的特定底物，并使其附着到固体支持物上。如果底物接触目标微生物分泌或表达的特定蛋白，那么蛋白会以导致这样的修饰的检测的方式修饰底物。例如，如本文所述的，修饰可以产生可视的颜色变化。

优选地，与样品接触的生物传感器部分不会过度地粘附到样品上，从而使得能够从样品上容易地取下生物传感器。例如，如果生物传感器包含伤口敷料，那么敷料与伤口接触足以使蛋白与底物反应的时间，然后从伤口取下敷料，而不对伤口或周围的组织造成进一步的损害。

本发明可以用于检测本文所述的任何病原体-特异性的酶的存在或不存在。例如，该方法和/或生物传感器可以用于检测病原细菌分泌的脂酶的存在或不存在。已经发现，某些细菌能将脂酶分泌进它们的环境中，作为它们的生存和/或毒力机理的一部分。脂酶用于破坏生长环境中的脂类，以释放营养物。脂酶也在解除感染期间的哺乳动物宿主防御中起作用。这些分泌的酶的合成底物可以用于检测能分泌它们的那些病原细菌的存在。通过使用底物，其包含至少一种合成的脂类和2种或更多种比色组分，可能建立底物，其能随着分泌的脂酶对它们的水解而改变颜色。该颜色变化反应会形成微生物传感器的基础，所述微生物传感器可以整合进保健产品等项目中(例如，伤口敷料)。

在另一个实例中，本发明可以用于通过检测微生物有关的或生产的自溶酶的存在或不存在，来检测微生物的存在或不存在。自溶素是能降解肽聚糖(细菌细胞外膜的一种组分)的酶。自溶酶用于破坏肽聚糖，即使是亲本生物的，用作为细胞分裂和周转功能的一部分，或用作为破坏竞争细菌的细胞壁的手段。当用2种或更多种比色组分标记时，包含合成的肽聚糖亚单位(例如，但不限于，N-乙酰基-β-d-氨基葡糖苷)的底物用作指示剂，其可以形成传感器的基础。

在另一个实例中，本发明的方法和/或生物传感器可以用于检测β半乳糖苷酶在微生物(例如，细菌)细胞表面上的存在或不存在。大多数细菌物种能表达β半乳糖苷酶，作为参与作为能源的乳糖代谢的胞质酶。但是，某些物种的链球菌能在细胞表面上显示该酶。因而，包含能作为β半乳糖苷酶的底物的分子和至少2种比色组分的底物，(包括，但不限于，邻硝基苯基β-D-吡喃型半乳糖苷)，可以用作检测环境中的微生物(例如，链球菌)的工具。

在一些实施方案中，本发明表征了用于检测蛋白、酶和/或微生物的试剂盒。这些试剂盒整合了本发明的方法和生物传感器。在一个实例中，试剂盒包含用于检测蛋白在样品中的存在或不存在的生物传感器，和至少一种用于检测该物质的试剂。在一些实施方案中，试剂盒包含收集器。

下面给出了用于开发检测微生物的测定的方法和使用该测定检测能产生该酶的病原细菌的方法的一个实例，所述的微生物能生产至少一种分泌或呈递到微生物表面上的蛋白。由于本领域已知其它方法，所以该方法无意以任何方式进行限制。

步骤1)定义能唯一地标识目标微生物的氨基酸序列。或者，可以确定特定组的病原体独有的(一个或多个)氨基酸序列，所述病原体例如，伤口-特异性的病原体。

选择氨基酸序列，例如，蛋白、肽或多肽(标记序列)，其能唯一地表征或标记目标微生物或微生物组(例如，伤口-特异性的病原体)的存在。使用生物信息学的方法，例如，如下面详细描述的，可以进行该选择。可以确定特定微生物独有的一个或多个氨基酸序列。

步骤2)得到足够的蛋白，以确定有利于酶对底物的最佳修饰的条件。

使用标准的蛋白纯化技术，例如Ausubel(同上)所述的，从待测微生物生长的胞外培养基，或从微生物的细胞膜，分离蛋白。

或者，如果不知道能编码该蛋白的遗传序列或能编码该蛋白的遗传序列的位置，则分离和克隆能编码步骤1的标记氨基酸的遗传序列，或首先确定遗传序列，然后如前进行。

步骤3)确定微生物生长和生产呈递到细胞表面上的或由细胞分泌的蛋白的条件。

确定特定目标微生物的生长和它的独特的活性蛋白向培养基中的表达所需的培养基。还确定将特定蛋白从无活性的前体形式转化成活性形式，是否需要第二种分子，例如酶。为了确定是否已经以活性形式分泌了蛋白，为微生物培养物样品提供选择的潜在底物，并测定这些底物的切割。例如，通过组合能生产蛋白的微生物和在合适培养基中的底物，并在轻柔振荡下，在～37℃温育，可实现该目的。在预定时间(例如，～0.1、～0.3、～1.0、～3.0、～5.0、～24和～48小时)，离心样品，沉淀微生物，并取出小量等分试样用作SDS-PAGE凝胶样品。时间进程完成后，在约10-15％梯度SDS-PAGE小凝胶上运行样品。然后，使用Bio-Rad半干转印迹(transblotting)装置，将蛋白转移至Immobilon Pseq(转移缓冲液，～10％CAPS，～10％甲醇pH～11.0，～15V，进行～30分钟)。转移蛋白后，用考马斯蓝R-250(约0.25％考马斯亮蓝R-250，～50％甲醇，～10％乙酸)对印迹染色，并脱色(高脱色～5分钟，～50％甲醇，～10％乙酸；低脱色直到完成，～10％甲醇，～10％乙酸)，然后从N-末端测序。或者，可以在质谱仪上运行样品，以对切割位点作图。

任选地，将微生物在生长培养基中生产的蛋白与从临床样品采集的样品进行对比，以确保微生物在要检测它们的环境中能生产该蛋白。例如，可以用在样品中生长的微生物生产的蛋白，分析和对比在从医院患者的伤口位点采集的样品中发现的蛋白。这样，可以证实微生物能在实际的测试样品或环境中生产蛋白，且该蛋白可以形成检测方法的基础。

步骤4)鉴别活性蛋白的任意特异性的底物。潜在的底物的实例包括蛋白、肽、多肽、脂类和肽聚糖亚单位。用可检测的标记来标记每种底物，例如，本文所述的可检测的标记或本领域已知的任何其它的可检测的标记。

步骤5)通过确定蛋白的活性或结合位点(例如，使用如上所述的比色组分)，然后确定用于生产活性或结合位点的遗传序列，并克隆确定的遗传序列，以产生更特异性的底物，来提高蛋白-底物相互作用的特异性(任选的)。

步骤6)提供生物传感器，其包含一种或多种上面鉴别出的可检测地标记的底物，用于检测目标病原菌的蛋白酶。

可以将底物附着到固体支持物上，例如，伤口敷料，或能容纳蛋白和底物的物品，例如，体液收集管或袋，微量培养板孔或试管。如果需要，固体支持物可以提供许多衍生的结合位点，用于偶联底物，例如，衍生的平板上(XENOBIND^TM结合平板，购自Xenopore Corp.，Hawthorne，New Jersey)的琥珀酰亚胺基酯标记的伯胺位点。任选地，偶联，例如，牛血清清蛋白，会封闭固体支持物上的未占用的活性位点。

使蛋白接触底物，并监控可检测地标记的底物中的修饰反应，如本文所述。底物的修饰指示着，微生物生产和/或分泌的蛋白存在于反应中。另外，底物修饰的不存在指示着蛋白不存在于样品中。如果微生物或蛋白来自伤口，那么底物的修饰指示着微生物存在于伤口中，而底物修饰的不存在指示着特定细菌不存在于伤口中。

实施例

现在，通过下面的实施例会解释本发明，其无意以任何方式进行限制。

实施例1：一些金属螯合实施方案

在该实施例中，基于连续的组氨酸残基结合含有通过共价地附着的NTA固定化的镍离子的树脂(例如，SEPHAROSE)的能力，纯化了组氨酸-标记的肽。

将CPI3、Papa4和LL3肽用活性黑5在半胱氨酸位点上标记。将SSP3肽用活性蓝4在丝氨酸位点上标记。纯化和表征后，在约室温，将4种肽结合到在磷酸缓冲盐水(PBS)pH～7.4中的NTA树脂上～2小时。然后，用PBS充分地冲洗树脂。NTA树脂能产生高水平的肽结合(非常深的蓝色)，而无非特异性的结合，如通过与非-组氨酸标记的肽或游离的活性染料非常小的结合所证实的。

在～37℃，用铜绿假单胞菌(PA14)切割在NTA树脂上的CPI3和Papa4肽，用粘质沙雷氏菌切割SSP3肽，并用酿脓链球菌切割LL3肽。将传感器表面的肽切除部分特别地设计成含有染料组分，并收集到分开的带正电荷的膜上(膜SB-6407，购自Pall Corporation，East Hills，New York)。活性黑5带有负电荷，其被吸引到收集器膜上。该相互作用能在收集器膜上产生从白色至蓝色的颜色变化。将由收集器膜组成的对照样品加到没有细菌的树脂中。当与对照相比时，在收集器膜上用细菌得到了强色差。该实验的概念显示在图11。暴露于细菌后，对照膜保持无颜色，或清楚地具有比暴露于细菌的收集器膜更少的颜色。

将用活性黑5标记的CPI3肽附着到NTA树脂上，并充分冲洗。然后，在过滤器离心管中干燥树脂，并散布到粘性塑料片上。将树脂浸泡在PBS中，并充分冲洗，以去除松散地结合的材料。然后，通过将收集器膜(膜SB-6407，购自Pall Corporation，East Hills，NewYork)置于表面上，制备了对照和实验传感器。这样，得到了使用NTA树脂来结合表面上的肽的传感器。在～37℃，将传感器之一暴露于铜绿假单胞菌(PA14)，并将带有染料的切割肽收集到收集器膜上。对照仅仅暴露于PBS。暴露于细菌的传感器表达了清楚的颜色，而对照显示出较少的颜色变化或没有颜色变化。

实施例2：一些带电荷的膜实施方案

在该实施例中，使用带负电荷的膜(膜ICE-450，购自PallCorporation，East Hills，New York)来结合肽，后者含有位于肽末端的带正电荷的区域(即，肽的精氨酸)。用带负电荷的染料标记了肽，当包含在肽的切割部分时，该染料对带负电荷的膜具有低亲和力，但是对带正电荷的收集器膜(膜SB-6407，购自Pall Corporation，East Hills，New York)具有高亲和力。该设计显示在图12。

将CPI4、Papa5和T5肽用活性黑5在半胱氨酸位点标记。纯化和表征后，将3种肽结合到在磷酸缓冲盐水(PBS)pH～7.4中的带负电荷的ICE-450膜上过夜。然后，用PBS冲洗膜。接着，将带正电荷的膜(膜SB-6407，购自Pall Corporation，East Hills，New York)置于在PBS中的肽结合膜的任一侧，以去掉任何松散地粘附的材料。通过将它收集到带正电荷的膜上，去除非特异性地结合的材料。以此方式清洗肽结合的膜，直到不能看到颜色从膜脱离。

在～37℃，用铜绿假单胞菌(PA14)切割在带负电荷的传感器膜上的CPI4和Papa5肽，并用大肠杆菌切割T5肽。还用酿脓链球菌切割了在带负电荷的传感器膜上的CPI4肽。将从传感器表面切割掉的肽设计成含有染料组分，并用分开的带正电荷的膜(膜SB-6407，购自Pall Corporation，East Hills，New York)收集。该相互作用能在收集器膜上产生从白色至蓝色的颜色变化。将由收集器膜组成的对照样品加到仅有PBS的传感器中。实验结果显示在图13。当与上述的所有肽的对照相比时，在收集器膜上用细菌得到了颜色变化。

在另一个实施方案中，按照与上述相同的方案，将活性黑5标记的肽吸附到P4纸膜(购自Fisher Scientific International Inc.，Hampton，New Hampshire)上。使用的肽是Papa4和LL3，二者都含有组氨酸标记。在～37℃，用铜绿假单胞菌(PA14)切割了Papa4和LL3P4膜传感器，并将肽的切割部分收集到SB-6407膜上。对照由向传感器膜仅仅添加PBS组成。结果显示在图14。当与上述的所有肽的对照相比时，在收集器膜上用细菌得到了颜色变化。

实施例3：用活性染料标记肽

用活性染料标记了许多肽底物。使用乙烯砜染料靶向肽上的半胱氨酸基团。使用单-和二-氯三嗪染料靶向肽上的丝氨酸基团。使用磺酰氯和N-羟基磺基琥珀酰亚胺基(磺基-NHS)酯染料靶向肽上的胺基。

用活性黑5标记肽CPI4的标记方法的实例显示在表1。CPI4含有2个半胱氨酸基团，其在碱性条件下由活性黑5(REMAZOL染料)靶向。下面的表证明，通过改变标记条件，可以得到不同的标记水平(如染料/肽比所证实的)。肽在水中是～5mg/ml，活性黑5在水中是～5mg/ml，且Na₂CO₃在水中是～10mg/ml。标记是在～37℃，～18小时。

表1

肽(uL)	染料(uL)	Na₂CO₃(uL)	染料/肽比
肽(uL)	染料(uL)	Na₂CO₃(uL)	染料/肽比	100	300	60	2.0
100	300	80	1.9	100	300	60	2.0
100	300	80	1.9	100	300	100	1.6
100	200	100	0.9	100	300	100	1.6
100	200	100	0.9	100	100	100	0.6

也在碱性条件下，用三嗪染料标记肽。三嗪染料优先靶向丝氨酸基团。在一组反应条件下，对每种染料得到了表2的结果。肽在水中是～5mg/ml，染料在水中是～10mg/ml，Na₂CO₃在水中是～10mg/ml。标记是在～37℃，18小时。

表2

肽	肽(uL)	染料	染料(uL)	Na₂CO₃(uL)	染料/肽比
肽	肽(uL)	染料	染料(uL)	Na₂CO₃(uL)	染料/肽比	JMH003	100	活性黄86	100	15	0.56
JMH003	100	CIBACRON^TM亮黄3G-P	100	80	0.21	JMH003	100	活性黄86	100	15	0.56
JMH003	100	CIBACRON^TM亮黄3G-P	100	80	0.21	JMH001	100	活性蓝4	100	30	1.19
JMH001	100	活性红2	100	100	0.66	JMH001	100	活性蓝4	100	30	1.19

表2证实，可能用许多不同的三嗪染料标记肽，以得到不同的颜色。根据特定用途和需要的染料/肽比，可以改进如表1所示的每种染料的标记条件。

实施例4：双标记的肽

该实施例涉及本发明的一个实施方案，其中底物包含至少2种比色组分。该肽包含2种靶氨基酸，以用2种有色的染料标记。如果染料靶向2种不同的氨基酸，例如丝氨酸和半胱氨酸，则不需要保护基。使肽与一种有色的染料反应，纯化它，浓缩它，然后使它与第二种有色的染料反应，可以进行标记。通过同时与两种能靶向不同的氨基酸的有色的染料的反应，然后纯化它，浓缩它，也可以进行标记。

使用肽JMH001。使用蓝色的染料(例如，活性黑5，它是REMAZOL染料)来靶向在肽的一端的半胱氨酸基团，并使用黄色的染料(例如，活性黄86，它是三嗪染料)来靶向在肽的另一端的丝氨酸基团。在2个步骤中，进行该特定的反应。使活性黑5与在pH～10碳酸盐缓冲液中的JMH001反应，其中染料比肽约2-5摩尔过量。纯化后，使标记的肽与活性黄86反应，染料和Na₂CO₃约5摩尔过量。在用活性黄86标记之前，活性黑5-标记的JMH001(中心管)显示蓝色。纯化的双标记的肽(具有活性黑5和活性黄86的JMH001)显示绿色。

图15显示了双标记的JMH001的UV/可见光谱。在～595nm观察到活性黑5最大吸光度，而在大约～400nm观察到活性黄86最大吸光度。用于该特定标记的染料/肽计算是，活性黑5为～0.4，而活性黄86为～1.4。活性黄86的染料/蛋白比超过～1.0可能是由于消光系数的差异，因为它是以未纯化的形式使用的。例如，活性黑5的高标记水平不会与高度标记的活性黄86产生绿色，因为活性黑5具有比活性黄86更大的消光系数。对于双标记的肽，可以最优化2种染料的选择和标记条件，以得到需要的二者的混合色。

实施例5：双标记的肽的切割

用活性黑5和CIBACRON^TM亮黄3G-P标记了肽CPI3，从而在P4纸上生成浅蓝色的肽。通过改变活性黑5和CIBACRON^TM亮黄3G-P的标记水平，可以产生更绿色的肽。将双标记的CPI3肽吸附到P4纸上，并充分地冲洗。将带正电荷的膜(膜SB6407，购自PallCorporation，East Hills，New York)置于P4膜的任一侧，以吸除任何松散吸附的材料。完全冲洗膜后，将P4上的双标记的CPI3与染料收集器膜(膜SB6407，购自Pall Corporation，East Hills，NewYork)置于～100μl PBS中，作为对照。将P4上的双标记的CPI3和染料收集器膜(膜SB6407，购自Pall Corporation，East Hills，New York)置于～75μl PBS和～25μl过夜生长的铜绿假单胞菌(PA14)中。在～37℃，将样品静置～18小时。暴露于细菌的双标记的CPI3/P4膜的染料收集器膜显示出颜色变化，而对照收集器膜保持白色。暴露于细菌的样品的收集器膜似乎表现出蓝色和黄色染料，从而CPI3肽的两个切割部分都可能迁移到膜上，或该肽的黄色部分保持在P4纸上，但是颜色非常浅。当相同的双标记的CPI3底物通过它的组氨酸标记附着到NTA树脂上并用PA14切割时，收集器膜显示蓝色，而NTA树脂也显示一些残留的蓝色，带一点黄色。

实施例6：肽和支持物上的比色组分

在一些实施方案中，底物和固体支持物都包含比色组分。在其它的实施方案中，在肽的切割后，去除包含比色组分的肽的切割部分，且在支持物上可以看到剩余的染料颜色。这样，底物的修饰会产生可视的信号，其包含从混合染料颜色至固体支持物颜色的颜色变化。任选地，信号包含捕获收集器上的肽的切割部分。这样，通过修饰，产生了2个信号：一个表达在固体支持物上，一个表达在收集器上。

为了说明该双-染料实施方案，用丽丝胺若丹明B磺酰氯和dabsylchloride对胺标记的P4纸染色，以分别生成粉红色和黄色膜。简而言之，将～10μl溶于二甲基甲酰胺(DMF)中的～5mg/ml染料溶液加入～190μl DMF，并与胺标记的P4纸在室温反应过夜。充分冲洗并用带正电荷的SB-6407膜去除染料后，在室温，将用活性黑5标记的CPI4(染料/肽比为2.0)吸附到来自～5μl比～95μl PBS溶液中的膜上过夜。充分冲洗并用带正电荷的SB-6407膜去除染料后，得到的膜显示出紫色(由蓝色和粉红色的混合产生)和深绿色(由蓝色和黄色的混合产生)的混合色。

实施例7：传感器的灭菌和操作

通过2-氯代三苯甲基氯化物树脂(一种“超酸敏感的”树脂，购自Bachem，Bubendorf，瑞士)上的标准的Fmoc/Boc偶联化学，来制备肽。在该方法中，使用α-N 9-芴基甲基氧羰基(Fmoc)保护的氨基酸，来制备肽；主要用丁氧基氧羰基(Boc)或叔丁基(t-Bu)保护侧链官能团，尽管也可以使用其它的酸敏感的保护基。通过向表面逐步添加氨基酸，使肽从珠子上生长。氨基羧酸部分首先偶联到珠子表面上的游离反应基(一般地，胺)，从而产生酰胺键。在溶于二甲基甲酰胺(DMF)中的30％哌啶溶液中，去除碱敏感的Fmoc基团20分钟，充分地洗涤珠子，然后导入下一个氨基酸。继续该方法，会导致构建需要的在珠子上从C-末端一直到N-末端生长的聚酰胺结构。

然后，在最后氨基酸的Fmoc去保护后，使树脂与含有磺酰氯基团的丽丝胺若丹明B反应。磺酰氯能迅速地与伯胺基团反应，产生磺酰胺。通过用DMF、丙酮和异丙醇充分洗涤，去除游离的未反应的染料。一旦洗涤物没有染料，则将侧链保护的肽从溶于二氯甲烷(DCM)中的1％三氟乙酸(TFA)溶液中的珠子上去偶联。2-氯代三苯甲基氯化物树脂会在非常低浓度的酸中释放肽。一般地，在非常酸性的条件(约80-100％TFA)下，从Wang-型树脂生长肽；这些条件不仅仅会从珠子上去偶联肽，还会去保护肽的侧基。在该情况下，使用溶于DCM中的1％TFA，足以从珠子去偶联染料-标记的肽，而不会显著丧失侧链保护基。这会产生大分子，其在C-末端仅仅具有一个活性羧酸官能团。然后，使用与制备肽主链相同的偶联方法，使该保护的标记的肽在胺-标记的纸上反应。然后，使用85％TFA、5％水、5％苯硫基甲烷和5％苯酚，完全去保护这些肽纸，从而产生用粉红色染料标记的活性肽传感器。

在导管灭菌常用的条件下，用环氧乙烷(ETO)灭菌样品。尽管在ETO灭菌后，信号会减少约21％，但在假单胞菌或肠球菌存在下，染料缀合物具有相同的反应动力学，分别如图16和17所示。这表明，使用ETO可以灭菌传感器，而不显著减少对细菌提取物的灵敏度或反应性。一个非常令人感兴趣的发现是，用环氧乙烷处理的样品具有更低的背景信号。这暗示着，该灭菌方法能减少未整合的染料的浸出。

实施例8：推过(push through)测定

CPI3肽是5-组氨酸标记形式的用于检测多种病原体的广谱肽CPI2。将半胱氨酸基团添加到N-末端上，以允许用染料进行标记：

CPI3 [Ac]-CGAMFLEAIPMSIPAAAHHHHH-[OH]。

在半胱氨酸基团上，用四甲基若丹明碘乙酰胺(TMRIA)染料(购自Molecular Probes，Eugene，Oregon)标记CPI3肽。在TMRIA染料过量的PBS pH 7.4中，进行标记反应。计算染料/肽比为约1.0。

通过肽上的5-组氨酸标记，将用TMRIA染料标记的大约1mgCPI3结合到1ml镍-氨三乙酸(Ni-NTA)琼脂糖珠子(购自Qiagen，Valencia，California)上。基本上所有的CPI3都结合到Ni-NTA珠子上，如通过溶液的颜色丧失所证实的。

将50μl珠子体积的CPI3-TMRIA置于管中，并加入200μ1×10⁴或1×10⁵cfu/mL粪肠球菌，且使其在室温温育5分钟。细菌蛋白酶会切割CPI3，从而从Ni-NTA珠子释放染料-肽片段。通过用微量离心机(microfuge)短时间离心，从溶液分离珠子。从管取出对应的体积和细菌浓度(例如，100μl1×10⁵cfu/μl)，以得到10⁵、10⁶、10⁷cfu等价物，并置于1ml注射器的顶部。使用没有添加细菌的磷酸缓冲盐水作为对照。然后，将注射器置于由滤纸衬里的聚偏1，1-二氟乙烯(PVDF)膜上的匹配大小的O-环顶部，并用柱塞压迫，迫使液体通过膜。染料-肽片段被保留在PVDF膜的表面，仅仅未染色的液体通过滤纸。5分钟后，暴露于10⁷cfu/mL液体的PVDF膜表现出最亮的颜色反应，而暴露于10⁶cfu/mL液体的PVDF膜表现出比暴露于10⁷cfu/mL液体的膜更少的颜色反应。5分钟后，暴露于10⁵cfu/mL液体的PVDF膜表现出比暴露于10⁶cfu/mL液体的膜更少的颜色反应，而暴露于0cfu/mL液体的膜未表现出可辨别的颜色反应。

实施例9：SAP2

在37℃，在有金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、酿脓链球菌、大肠杆菌和粪肠球菌存在下，温育包含SAP2的传感器60分钟。使用340激发和490nm发射的荧光共振能转移(FRET)，测量得到的信号强度。仅仅金黄色葡萄球菌样品能水解肽，从而激活猝灭的EDANS分子的荧光。这暗示着，SAP2适用于可以特异性地检测金黄色葡萄球菌的存在的传感器中。

等同方案

尽管已经参考其优选实施方案，具体地显示和描述了本发明，但本领域的技术人员能够认识到，可以在其中进行各种形式和细节的变化，而不背离所附权利要求书包含的本发明的范围。

序列表

<110>Ethicon，Inc.

Expressive Constructs，Inc.

Sanders，Michell C.

Colpas，Gerard J.

Ellis-Busby，Diane L.

Havard，Jennifer M.

<120>比色底物、比色传感器和使用方法

<130>3265.1011003

<150>60/516,688

<151>2003-11-03

<150>60/578,502

<151>2004-06-09

<160>41

<170>FastSEQ for Windows Version 4.0

<210>1

<211>37

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成的肽序列

<221>VARIANT

<222>22

<223>Xaa＝任意氨基酸

<400>1

Leu Leu Gly Asp Phe Phe Arg Lys Ser Lys Glu Lys Ile Gly Lys Glu

1 5 10 15

Phe Lys Arg Ile Val Xaa Arg Ile Lys Asp Phe Leu Arg Asn Leu Val

20 25 30

Pro Arg Thr Glu Ser

35

<210>2

<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成的肽序列

<400>2

Lys Ala Ala His Lys Ser Ala Leu Lys Ser Ala Glu

1 5 10

<210>3

<211>16

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成的肽序列

<400>3

Lys Lys Ala Ser Glu Ala Ala His Lys Ser Ala Leu Lys Ser Ala Glu

1 5 10 15

<210>4

<211>18

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成的肽序列

<400>4

Cys His His His Ala Ser Glu Ala Ala His Lys Ser Ala Leu Lys Ser

1 5 10 15

Ala Glu

<210>5

<211>14

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成的肽序列

<400>5

Lys His Leu Gly Gly Gly Ala Leu Gly Gly Gly Ala Lys Glu

1 5 10

<210>6

<211>11

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成的肽序列

<400>6

Lys His Leu Gly Gly Gly Gly Gly Ala Lys Glu

1 5 10

<210>7

<211>11

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成的肽序列

<400>7

Ala Cys Cys Asp Glu Tyr Leu Gln Thr Lys Glu

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<210>8

<211>11

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成的肽序列

<400>8

Ala Asp Thr Val Glu Pro Thr Gly Ala Lys Glu

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<210>9

<211>13

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成的肽序列

<400>9

Lys Leu Pro His Lys Leu Ser Trp Ser Ala Asp Asn Pro

1 5 10

<210>10

<211>14

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成的肽序列

<400>10

Pro Val Pro Ser Thr Pro Pro Thr Pro Ser Pro Ser Thr Pro

1 5 10

<210>11

<211>9

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成的肽序列

<400>11

Asn Met Leu Ser Glu Val Glu Arg Glu

1 5

<210>12

<211>14

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成的肽序列

<400>12

Lys Gln Asn Met Leu Ser Glu Val Glu Arg Ala Asp Thr Glu

1 5 10

<210>13

<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成的肽序列

<400>13

Asn Glu Ala Ile Gln Glu Asp Gln Val Gln Tyr Glu

1 5 10

<210>14

<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成的肽序列

<400>14

Glu Thr Lys Val Glu Glu Asn Glu Ala Ile Gln Lys

1 5 10

<210>15

<211>15

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成的肽序列

<400>15

Asp Ser Arg Pro Val Arg Arg Arg Arg Arg Pro Arg Val Ser Lys

1 5 10 15

<210>16

<211>11

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成的肽序列

<400>16

Lys Val Ser Arg Arg Arg Arg Arg Gly Gly Asp

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<211>15

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成的肽序列

<400>17

Lys Lys Ala Ser Glu Val Ser Arg Arg Arg Arg Arg Gly Gly Lys

1 5 10 15

<210>18

<211>17

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成的肽序列

<400>18

Cys His His His Ala Ser Glu Val Ser Arg Arg Arg Arg Arg Gly Gly

1 5 10 15

Lys

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<211>14

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成的肽序列

<400>19

Lys Glu Lys Ile Gly Lys Glu Phe Lys Arg Ile Val Gln Glu

1 5 10

<210>20

<211>14

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成的肽序列

<400>20

Lys Val Gln Arg Ile Lys Asp Phe Leu Arg Asn Leu Val Glu

1 5 10

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<211>13

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成的肽序列

<400>21

Glu Ala Ala Gly Ala Met Phe Leu Glu Ala Ile Pro Lys

1 5 10

<210>22

<211>15

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成的肽序列

<400>22

Glu Gly Ala Met Phe Leu Glu Ala Ile Pro Met Ser Ile Pro Lys

1 5 10 15

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<211>22

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成的肽序列

<400>23

Cys Gly Ala Met Phe Leu Glu Ala Ile Pro Met Ser Ile Pro Ala Ala

1 5 10 15

Ala His His His His His

20

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<211>25

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成的肽序列

<400>24

Lys Ala Arg Arg Arg Arg Arg Gly Gly Gly Ala Met Phe Leu Glu Ala

1 5 10 15

Ile Pro Met Ser Ile Pro Cys Gly Cys

20 25

<210>25

<211>14

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成的肽序列

<400>25

Val Ser Arg Arg Arg Arg Arg Gly Gly Asp Gly Asp Gly Cys

1 5 10

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<211>7

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成的肽序列

<400>26

Gly Gly Asp Gly Asp Gly Cys

1 5

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<211>16

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成的肽序列

<400>27

Val Ser Arg Arg Arg Arg Arg Gly Gly Asp Gly Lys Gly Asp Ala Cys

1 5 10 15

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<211>20

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成的肽序列

<400>28

Asn Glu Ala Ile Gln Glu Asp Gln Val Gln Ala Arg Arg Ala Lys Ala

1 5 10 15

Arg Arg Ala Cys

20

<210>29

<211>13

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成的肽序列

<400>29

Gln Val Gln Ala Arg Arg Ala Lys Ala Arg Arg Ala Cys

1 5 10

<210>30

<211>9

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成的肽序列

<400>30

Gly Gly Asp Gly Lys Gly Asp Ala Cys

1 5

<210>31

<211>15

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成的肽序列

<400>31

Gln Val Gln Ala Arg Arg Arg Ala Lys Ala Arg Arg Arg Ala Cys

1 5 10 15

<210>32

<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成的肽序列

<400>32

Val Ser Arg Arg Arg Arg Arg Gly Gly Lys Gly Cys

1 5 10

<210>33

<211>16

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成的肽序列

<400>33

Ser Val Thr Arg Arg Arg Arg Arg Gly Gly Arg Ala Ser Gly Gly Cys

1 5 10 15

<210>34

<211>20

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成的肽序列

<400>34

Ser Glu Ala Ile Gln Glu Asp Gln Val Gln Tyr Cys Ala Ala Ala His

1 5 10 15

His His His His

20

<210>35

<211>16

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成的肽序列

<400>35

Lys Ala Arg Arg Arg Arg Arg Gly Gly Asp Gly Asp Gly Cys Gly Cys

1 5 10 15

<210>36

<211>16

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成的肽序列

<400>36

His His His His His Ser Arg Arg Arg Arg Arg Gly Gly Cys Gly Cys

1 5 10 15

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<211>21

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成的肽序列

<400>37

His His His His His Ser Val Gln Arg Ile Lys Asp Phe Leu Arg Asn

1 5 10 15

Leu Val Cys Gly Cys

20

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<211>21

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成的肽序列

<400>38

Arg Arg Arg Arg Arg Ser Val Gln Arg Ile Lys Asp Phe Leu Arg Asn

1 5 10 15

Leu Val Cys Gly Cys

20

<210>39

<211>18

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成的肽序列

<400>39

His His His His His Ala Ala His Lys Ser Ala Leu Lys Ser Ala Cys

1 5 10 15

Gly Cys

<210>40

<211>18

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成的肽序列

<400>40

Arg Arg Arg Arg Arg Ala Ala His Lys Ser Ala Leu Lys Ser Ala Cys

1 5 10 15

Gly Cys

<210>41

<211>36

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成的肽序列

<400>41

Leu Leu Gly Asp Phe Phe Arg Lys Ser Lys Glu Lys Ile Gly Lys Glu

1 5 10 15

Phe Lys Arg Ile Val Arg Ile Lys Asp Phe Leu Arg Asn Leu Val Pro

20 25 30

Arg Thr Glu Ser

35

Claims

1.检测底物的修饰的方法，其包含下述步骤：

a)在会导致底物的修饰的条件下，将未修饰的底物暴露于样品，该未修饰的底物包含肽和第一种比色组分，该第一种比色组分偶联在肽上；和

b)检测底物的修饰或底物修饰的不存在，其中修饰包含从底物切割第一种比色组分，并导致可视的颜色变化。

2.根据权利要求1的方法，其中所述第一种比色组分共价地结合在肽上。

3.根据权利要求1或2的方法，其中所述修饰包含水解肽键，并导致一部分肽从底物脱离。

4.根据权利要求1-3中的任一项的方法，其中所述底物包含至少一个下述的成员：肽序列LLGDFFRKSKEKIGKEFKRIVXRIKDFLRNLVPRTES、肽序列KAAHKSALKSAE、肽序列KKASEAAHKSALKSAE、肽序列CHHHASEAAHKSALKSAE、肽序列KHLGGGALGGGAKE、肽序列KHLGGGGGAKE、肽序列ACCDEYLQTKE、肽序列ADTVEPTGAKE、肽序列KLPHKLSWSADNP、肽序列PVPSTPPTPSPSTP、肽序列NMLSEVERE、肽序列KQNMLSEVERADTE、肽序列NEAIQEDQVQYE、肽序列ETKVEENEAIQK、肽序列DSRPVRRRRRPRVSK、肽序列KVSRRRRRGGD、肽序列KKASEVSRRRRRGGK、肽序列CHHHASEVSRRRRRGGK、肽序列KEKIGKEFKRIVQE、肽序列KVQRIKDFLRNLVE、肽序列EAAGAMFLEAIPK、肽序列EGAMFLEAIPMSIPK、肽序列CGAMFLEAIPMSIPAAAHHHHH、肽序列KARRRRRGGGAMFLEAIPMSIPCGC、肽序列VSRRRRRGGDGDGC、肽序列GGDGDGC、肽序列VSRRRRRGGDGKGDAC、肽序列NEAIQEDQVQARRAKARRAC、肽序列QVQARRAKARRAC、肽序列GGDGKGDAC、肽序列QVQARRRAKARRRAC、肽序列VSRRRRRGGKGC、肽序列SVTRRRRRGGRASGGC、肽序列SEAIQEDQVQYCAAAHHHHH、肽序列KARRRRRGGDGDGCGC、肽序列HHHHHSRRRRRGGCGC、肽序列HHHHHSVQRIKDFLRNLVCGC、肽序列RRRRRSVQRIKDFLRNLVCGC、肽序列HHHHHAAHKSALKSACGC、肽序列RRRRRAAHKSALKSACGC、肽序列PGTKLYTVPW、Alt衍生的肽、肽聚糖、脂磷壁酸和脂囊泡。

5.根据权利要求1-4中的任一项的方法，其中所述第一种比色组分是下述的一个成员：染料；活性染料；纤维活性染料；适用于隐形眼镜的染料；适用于缝线的染料；单卤素三嗪染料；二卤素三嗪染料；2，4，5trihalogenopyriminidine染料；2，3二卤喹喔啉染料；N-羟基磺基琥珀酰亚胺基(磺基-NHS)酯官能化的染料；N-羟基琥珀酰亚胺基(NHS)官能化的染料；乙烯砜染料；磺酰氯染料；四氟代苯基酯官能化的染料；异硫氰酸酯官能化的染料；和碘乙酰基官能化的染料。

6.根据权利要求1-5中的任一项的方法，其中所述可视的颜色变化是颜色丧失。

7.根据权利要求1-6中的任一项的方法，其中所述未修饰的底物还包含第二种比色组分，其不同于第一种比色组分。

8.根据权利要求1-7中的任一项的方法，其中所述肽偶联到固体支持物上。

9.根据权利要求8的方法，其中所述底物的修饰会导致固体支持物的色调变得更可见。

10.根据权利要求8或9的方法，其中所述肽共价地附着到固体支持物上。

11.根据权利要求8-10中的任一项的方法，其中所述固体支持物选自：伤口敷料、灭菌的材料、含有样品的物品、收集样品的物品、聚合物、膜、树脂、玻璃、海绵、圆盘、显示器、过滤器、透镜、泡沫、布、纸、缝线和袋子。

12.根据权利要求1-11中的任一项的方法，其中所述样品是下述的至少一种：受试者的伤口表面、体液、一根毛发、一块指甲、一块壳、一片鳞、一片羽毛、一块组织、植入动物体内的物品、导管、尿液收集袋、血液收集袋、血浆收集袋、圆盘、显示器、过滤器、透镜、泡沫、布、纸、缝线、棉拭、浸渍片、海绵、聚合物品、由树脂制成的物品、玻璃物品、试管、微量培养板孔、一部分隐形眼镜溶液、海绵、聚合材料、膜、由树脂制成的物品、由玻璃制成的物品和棉拭。

13.根据权利要求1-12中的任一项的方法，其中所述底物的修饰包括切割一部分肽，以生产切割的部分，所述切割的部分包含第一种比色组分，该修饰导致切割的部分向收集器的迁移，且迁移导致可视的颜色变化。

14.根据权利要求13的方法，其中所述收集器包含至少一种选自下述的材料：膜、树脂、聚合物、膜、玻璃或螯合材料。

15.根据权利要求1-14中的任一项的方法，其中使用底物的修饰来指示选自下述的细菌酶的存在：溶素、自溶素、脂酶、外毒素、细胞壁酶、基质结合酶、蛋白酶、水解酶、毒力因子酶和代谢酶。

16.用于检测蛋白的存在或不存在的生物传感器，该生物传感器包含能特异性地与蛋白反应的肽，和偶联到肽上的第一种比色组分。

17.根据权利要求16的生物传感器，其中所述第一种比色组分共价地结合在肽上。

18.根据权利要求16或17的生物传感器，其中所述底物包括至少一个下述的成员：肽序列LLGDFFRKSKEKIGKEFKRIVXRIKDFLRNLVPRTES、肽序列KAAHKSALKSAE、肽序列KKASEAAHKSALKSAE、肽序列CHHHASEAAHKSALKSAE、肽序列KHLGGGALGGGAKE、肽序列KHLGGGGGAKE、肽序列ACCDEYLQTKE、肽序列ADTVEPTGAKE、肽序列KLPHKLSWSADNP、肽序列PVPSTPPTPSPSTP、肽序列NMLSEVERE、肽序列KQNMLSEVERADTE、肽序列NEAIQEDQVQYE、肽序列ETKVEENEAIQK、肽序列DSRPVRRRRRPRVSK、肽序列KVSRRRRRGGD、肽序列KKASEVSRRRRRGGK、肽序列CHHHASEVSRRRRRGGK、肽序列KEKIGKEFKRIVQE、肽序列KVQRIKDFLRNLVE、肽序列EAAGAMFLEAIPK、肽序列EGAMFLEAIPMSIPK、肽序列CGAMFLEAIPMSIPAAAHHHHH、肽序列KARRRRRGGGAMFLEAIPMSIPCGC、肽序列VSRRRRRGGDGDGC、肽序列GGDGDGC、肽序列VSRRRRRGGDGKGDAC、肽序列NEAIQEDQVQARRAKARRAC、肽序列QVQARRAKARRAC、肽序列GGDGKGDAC、肽序列QVQARRRAKARRRAC、肽序列VSRRRRRGGKGC、肽序列SVTRRRRRGGRASGGC、肽序列SEAIQEDQVQYCAAAHHHHH、肽序列KARRRRRGGDGDGCGC、肽序列HHHHHSRRRRRGGCGC、肽序列HHHHHSVQRIKDFLRNLVCGC、肽序列RRRRRSVQRIKDFLRNLVCGC、肽序列HHHHHAAHKSALKSACGC、肽序列RRRRRAAHKSALKSACGC、肽序列PGTKLYTVPW、Alt衍生的肽、肽聚糖、脂磷壁酸和脂囊泡。

19.根据权利要求中16-18的任一项的生物传感器，其中第一种比色组分是下述的一个成员：染料；活性染料；纤维活性染料；适用于隐形眼镜的染料；适用于缝线的染料；单卤素三嗪染料；二卤素三嗪染料；2，4，5trihalogenopyriminidine染料；2，3二卤喹喔啉染料；N-羟基磺基琥珀酰亚胺基(磺基-NHS)酯官能化的染料；N-羟基琥珀酰亚胺基(NHS)官能化的染料；乙烯砜染料；磺酰氯染料；四氟代苯基酯官能化的染料；异硫氰酸酯官能化的染料；和碘乙酰基官能化的染料。

20.根据权利要求16-19中的任一项的生物传感器，还包含偶联到肽上的第二种比色组分，该第一种比色组分不同于第一种比色组分。

21.根据权利要求16-20中的任一项的生物传感器，还包含固体支持物，所述肽偶联到该固体支持物上。

22.根据权利要求21的生物传感器，其中所述肽共价地附着到固体支持物上。

23.根据权利要求21或22的生物传感器，其中所述固体支持物选自：伤口敷料、灭菌的材料、含有样品的物品、收集样品的物品、聚合物、膜、树脂、玻璃、海绵、圆盘、显示器、过滤器、透镜、泡沫、布、纸、缝线和袋子。

24.根据权利要求16-23中的任一项的生物传感器，还包含收集器，其包含选自下述的至少一种材料：膜、树脂、聚合物、膜、玻璃或螯合材料。

25.根据权利要求16-24中的任一项的生物传感器，其中所述肽包含能特异性地与选自下述的酶反应的序列：溶素、自溶素、脂酶、外毒素、细胞壁酶、基质结合酶、蛋白酶、水解酶、毒力因子酶和代谢酶。

26.用于检测蛋白的试剂盒，其包含根据权利要求16-25中的任一项的生物传感器和至少一种试剂。