CN101045945A - 检测多种常见细菌病原体的基因芯片、制备方法、试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明涉及检测多种常见细菌病原体的基因芯片，包括固相载体和固定在该载体上的寡聚核苷酸探针，其中寡聚核苷酸探针包括检测探针，芯片样品点的布局为低密度布局，样品点少于200个；所述的寡聚核苷酸检测探针分别是从金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、绿脓杆菌、屎肠球菌、粪肠球菌、大肠杆菌、阴沟肠杆菌、克雷伯氏肺炎球菌、鲍氏不动杆菌的基因组对应的核苷酸序列中选取的DNA。上述芯片和样品处理试剂、杂交、显色试剂、说明书组成检测试剂盒。本发明方法能在短时间内检测大量感染细菌病原体的病人的临床样本，检测效率是传统检测手段的数十倍。本发明提供了完整的探针排布，优化方案。此方案依据实例调整，具有合理性。芯片可大规模生产，无污染。

Description

检测多种常见细菌病原体的基因芯片、制备方法、试剂盒

技术领域

本发明涉及生物工程技术及医学诊断领域，具体涉及九种常见细菌病原体的基因芯片、芯片的制备方法和检测用试剂盒。

背景技术

本发明所述的九种常见细菌病原体如下：

金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)

表皮葡萄球菌(staphyloccus epidermidis)

绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)

屎肠球菌(Enterococcus faecium)

粪肠球菌(Enterococcus faecalis)

大肠杆菌uidA 211bp(Escherichia Coli)

阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae ECL)

克雷伯氏肺炎球菌Hemolysin gene(Klebsiella pneumoniae)

鲍氏不动杆菌(Acinobacter baumannii)

细菌病原体的存在，严重威胁着人类的身体健康。本发明针对多种常见细菌病原体进行检测，尤其对烧伤感染的检测更具临床意义。烧伤创面由于存在大量的坏死与变性组织，是细菌感染的温床。当细菌局限于表面渗出液或液化的坏死组织时，对全身的影响较小，但如果侵入到邻近活组织且达到一定菌量时，就会出现全身症状，一般称为“烧伤创面侵袭性感染”，或称“烧伤创面脓毒症”。清创可以减少创面细菌数量，局部选用敏感的外用药也可以控制细菌创面入侵而发生侵袭性感染。但是目前，由于缺乏敏感、快速的检测手段，临床金葡菌脓毒症的早期诊断十分困难，误诊的病例时有发生，严重影响了烧伤后脓毒症的救治。

核酸探针技术涉及三部分，即待测核酸，固相载体(硝酸纤维素膜)和用同位素，酶，荧光标记的核酸探针。核酸探针技术有原位杂交(直接在组织切片或细胞涂片上进行杂交反应)，斑点杂交(将待测的核酸或细胞裂解物，经过变性后直接点到固相膜上)，Southern杂交等，利用酶底物反应或放射自显影可见预期条带。探针技术敏感性高，检测一个单基因需104拷贝，能检测低至10-13ngDNA。特异性强，可以从混合标本中正确鉴定出目的病原微生物。

基因芯片技术是在核酸杂交，测序的基础上发展起来的，把已知序列的探针有序地固定在膜上，每个点就代表某个特定基因，然后将样本中的靶基因进行生物素标记，与基因芯片进行杂交，来对基因序列及功能进行研究。基因芯片技术包括四个基本技术环节：芯片制备，样品制备，生物分子反应及信号的检测与分析。在整个过程中，基因芯片就犹如一面超高倍率放大镜，能迅速发现病原体的有无。

总的来说，基因芯片技术由于同时将大量探针固定于支持物上，所以可以一次性对样品大量序列进行检测和分析，从而解决了传统核酸印迹杂交技术操作繁杂、自动化程度低、操作序列数量少、检测效率低等不足。基因芯片技术具有高度并行性、多样性、微型化和自动化这四大特点。高度并行性有利于基因芯片所示图谱的快速对照和阅读，效率大为提高；多样性则提供了多种样品测定；微型化的好处在于对样品的需要量非常少，而且还能节省试剂用量，降低成本；自动化使得人力投入减少并保证了质量。同时，它还具有操作简便、信息综合处理能力强、结果可靠和仪器配套齐全等优势，它集中了现在所有细菌诊断技术的优点，降低了假阳性和假阴性的发生率问题，提高了特异性。

生物芯片的出现主要用于对广泛的基因群进行同时的平行测定，以期对基因的表达和功能进行鸟瞰式的分析和观察。现有的生物芯片研制方向过分强调高密度的平行分析，使得这一领域的研究结果主要只能应用在高投资的实验室工作。也因其昂贵价格而不能成为一种在临床医学及其它生化分析中可以广泛推广的技术。其实在医学和一些其他应用性学科中，所需要的一次平行检测点一般是十分有限的，并非成千上万个点，因此，低密度“生物芯片”出现正是为这一需求提供了一个新型的、低价的、可进行平行测定的技术平台。2002年在国际著名生物科学杂志“自然：生物技术”(Nature Biotechnology，20：8，2002)的一篇标题为“变化了的DNA芯片市场期望”的报道中也已经终于认识到：对于未来几年的DNA芯片市场，其主要的需求将会来自“低密度芯片”。因此，本项目的前期研究具有符合事物发展的前瞻性，我们将在本项目执行中进一步扩展前期研究的成果并在细菌感染测定中得到应用，以提高现有的检测水平和临床救治能力。

发明内容

本发明的目的是提供一种检测多种常见细菌病原体的基因芯片，以弥补传统的检测方法技术存在的不足。本发明的检测方法操作方便，克服了现有检测方式单一和费时费力的问题，可有效快速解决感染细菌病原体的检测问题，具有高效性、特异性、灵敏性的特点，提高了现有的检测效率。

本发明的更进一步的目的是提供多种常见感染细菌病原体的基因芯片的制备方法。

本发明还有一个目的是提供用于多种常见细菌病原体的试剂盒。

为达到上述的目的，本发明的技术方案如下：本发明检测多种细菌病原体的基因芯片，包括固相载体和固定在该载体上的寡聚核苷酸探针，其中寡聚核苷酸探针包括检测探针和质量控制探针，芯片样品点的布局为低密度布局，样品点少于200个；所述的寡聚核苷酸检测探针分别是从金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、绿脓杆菌、屎肠球菌、粪肠球菌、大肠杆菌、阴沟肠杆菌、克雷伯氏肺炎球菌、鲍氏不动杆菌的基因组对应的核苷酸序列中选取的DNA或cDNA片段。

所述的从金黄色葡萄球菌基因组的核苷酸序列中选取的DNA片段具有如SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2所示的碱基序列；从表皮葡萄球菌基因组的核苷酸序列中选取的DNA片段具有如SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4所示的碱基序列；从绿脓杆菌基因组的核苷酸序列中选取的DNA片段具有如SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：6所示的碱基序列；从屎肠球菌基因组的核苷酸序列中选取的DNA片段具有如SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8所示的碱基序列；从粪肠球菌基因组的核苷酸序列中选取的DNA片段具有如SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10所示的碱基序列；从大肠杆菌基因组的核苷酸序列中选取的DNA片段具有如SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12所示的碱基序列；从阴沟肠杆菌基因组的核苷酸序列中选取的DNA片段具有如SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：14所示的碱基序列；从克雷伯氏肺炎球菌基因组的核苷酸序列中选取的DNA片段具有如SEQ ID NO：15或SEQ ID NO：16所示的碱基序列；从鲍氏不动杆菌基因组的核苷酸序列中选取的DNA片段具有如SEQ ID NO：17或SEQ ID NO：18所示的碱基序列。

检测多种细菌病原体的基因芯片的制备方法，包括以下的步骤：

(1)探针的设计：根据所述的金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、绿脓杆菌、屎肠球菌、粪肠球菌、大肠杆菌、阴沟肠杆菌、克雷伯氏肺炎球菌、鲍氏不动杆菌的基因序列与NCBI数据库中的序列比对，选择出种内保守性高、种间特异性高的序列作为探针，它们分别具有如权利要求2所述的碱基序列；

(2)探针的合成：将设计的寡核苷酸探针进行人工合成，采用PAGE方式纯化

(3)芯片的制备：包括切膜、贴膜，然后将上述得到的目的探针点膜，再经交联、存膜即得芯片，其中点膜后得样品点直径在50μm-2000μm。

用于检测九种常见细菌病原体的试剂盒，主要包括：上述的基因芯片、待测样品处理试剂、杂交、显色试剂和说明书。

本发明方法能在短时间内检测大量感染病人的临床样本，快速准确地获取样品中的信息，检测效率是传统检测手段的数十倍。

本发明提供了一整套感染细菌探针的制备方法，方法简便。

本发明提供了一整套芯片的制备杂交显色过程。

本发明提供了完整的探针排布，优化方案。此方案依据实例调整，具有合理性。

芯片可大规模生产，无污染。此发明质量、精度、效率，比传统细菌检测方法均有提高，加工、操作，使用简便。

附图说明

图1为：芯片点样布局设计示意图；

图为2；检测9种常见细菌病原体同时杂交实验芯片布局示意图；

图为3；检测9种常见细菌病原体同时杂交实验结果；

图4为；检测9种常见细菌病原体同时杂交实验芯片布局示意图；

图5为；检测9种常见细菌病原体同时杂交实验结果；

图6为；检测烧伤感染病人临床样本的杂交实验芯片布局示意图；

图7为：检测烧伤感染病人临床样本的杂交实验结果。

具体实施方式

以下详细说明实验的过程与操作

一：探针设计与合成

1.1检测细菌病原体探针设计

通过文献检索及美国国家生物信息中心(NCBI)的比对获得感染细菌病原体基因探针。首先我们要明确芯片上需要什么样的探针才能检测出样本里的致病菌。根据文献检索可以得到各种致病菌的特异基因序列，在NCBI数据库中比对，根据金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、绿脓杆菌、屎肠球菌、粪肠球菌、大肠杆菌、阴沟肠杆菌、克雷伯氏肺炎球菌、鲍氏不动杆菌的基因序列与NCBI数据库中的序列比对，选择出种内保守性高、种间特异性高的序列输入软件Primo Multiplex 3.4 Multiplex PCR PrimerDesign，设定好参数，运行程序，(5’PRIMER 0-200 3’PRIMER-200-0 TM：57℃TM FormulaNearest N ％GC 50 ANYCheck primer-primer dimmer Avoid backgroung primingMultiplex PCR 5 Specificity Medium其余参数为默认值.)选取长度合适的计算结果，最终作为病毒探针片段。

以下是9种常见细菌病原体探针的核酸序列及合成序列所设计的引物：

Staphylococcus aureus金黄色葡萄球菌

DEFINITION Staphylococcus aureus nuclease(nuc)gene，partial cds

SEQ ID NO：1：

ACAATACACATGAACAACATTTAAGAAAAAGTGAAGCACAAGCGAAAAAAGAGAAATTAAA

TATTTGGAGCGAAGACAACGCTGATTCAGGTC

引物

SEQ ID NO：19正义链：5′-ACAATACACATGAACAAC-3′

SEQ ID NO：20反义链：5′-ACAATACACATGAACAAC-3′

SEQ ID NO：2：

ACACCTGAAACAAAGCATCCTAAAAAAGGTGTAGAGAAATATGGTCCTGAAGCAAGTG

CATTTACGAAAAAAATGGTAGAAAATGCAAAGAAAATTGAAGTCGAGTTTGACAAAGGTC

AAAGAACTGATAAATATGGACGTGGCTTAGCG

引物

SEQ ID NO：21正义链：5′-ACACCTGAAACAAAGCATCC-3′

SEQ ID NO：22反义链：5′-CGCTAAGCCACGTCCATATT-3′

staphyloccus epidermidis表皮葡萄球菌

DEFINITION Staphylococcus epidermidis strain SR1 clone step.1003c09 genomic sequence

SEQ ID NO：3：CTTGAGATG TATAGAATTCAAAATATTTACCATTTGCATAGTCTGATTG

CTCAAAGTCT

SEQ ID NO：4：

GAAGAGCCACATTTAAAATATAAATCAGATAAAATTGTAGAAAATTACCACAAACTTTGGG

GTAAAGAAGCATCG

上述两个序列为人工合成得到。

Pseudomonas aeruginosa绿脓杆菌

DEFINITION Pseudomonas aeruginosa clone X13 16S ribosomal RNA gene，partial sequence

SEQ ID NO：5：

TTTCGCACCTCAGTGTCAGTATCAGTCCAGGTGGTCGCCTTCGCCACTGGTGTTCCTTCCT

ATATCTACGCATTTCACCGCTACACAGGAAATTCCACCACCCTCTACCGTACTCTAGCTCA

GTAGTTTTGGATGCAGTTCCCAGGTTGAGCCCGGGGATTTCACATC CAACTTGCTG AACC

引物

SEQ ID NO：23正义链：5′-TGCGCCACTAAGATCTCAAG-3′

SEQ ID NO：24反义链：5′-GTGCCTGCAGCCGCGGTAAT-3′

SEQ ID NO：6：

ATATTCCCCACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGACCGTGTCTCAGTTCCAGTGTGACTGA

TCATCCTCTCAGACCAGTTACGGATCGTCGCCTTGGTAGGCCTTTACCCCACC

引物

SEQ ID NO：25正义链：5′-ATATTCCCCACTGCTGCCTC-3′

SEQ ID NO：26反义链：5′-GGTGGGGTAAAGGCCTAC-3′

Enterococcusfaecium屎肠球菌

DEFINITION Enterococcus faecium genomic DNA fragment

SEQ ID NO：7：

CCACGCCTTCTACAATTGCTTGAGGTGCGTGATCTCCGCCCATTGCATCTACGGCAATTTT

CATTGTTTCCACTCCTTTTTCCGTCA

引物

SEQ ID NO：27正义链：5′-CCACGCCTTCTACAATTGC-3′

SEQ ID NO：28反义链：5′-TGACGGAAAAAGGAGTGG-3′

SEQ ID NO：8：

ATCTGCATCTGGTTGGCTTTGAAGGCTTCCATGATTACTTCTTTTTCCTGATTCTTCATTTT

ACCATGTAACAAGCCAACTTCATATTTTGGTGCAAATAGTTCACGAAGTTTTTCATAGATT

TCCACTGCATTTTTTACATCTAATGCTTCTGATTCTTCAATCAGCGGACAGATGA

引物

SEQ ID NO：29正义链：5′-ATCTGCATCTGGTTGGCTTTG-3′

SEQ ID NO：30反义链：5’-TCATCTGTCCGCTGATTGAAG-3’

Enterococcusfaecalis粪肠球菌

DEFINITION Enterococcus faecalis gelatinase(gelE)DNA，complete cds

SEQ ID NO：9：

AAGGGAAATAAAATTTTATACATTTTAGGTACAGGCATCTTTGTTGGAAGTTCATGTCTAT

TTTCTTCACTTTTTGTAGCCGCAGAAGAACAAGTTTATTCAGAAAGTGAAGTTTCA

引物

SEQ ID NO：31正义链：5′-AAGGGAAATAAAATTTTATAC-3′

SEQ ID NO：32反义链：5′-TGAAACTTCA CTTTCTGAAT-3′

SEQ ID NO：10：

GCGTTATGGTGAAACAAGTACACCAACAGGAAAAACGTATGCTTCCTCTTTAGATGTAGTT

GGTCATGAAATGACACATGGTGTGACGGAACATACTGCCGGTTTAGAATATT

引物

SEQ ID NO：33正义链：5′-GCGTTATGGTGAAACAAGT-3′

SEQ ID NO：34反义链：5′-AATATTCTAAACCGGCAGTA-3′

Escherichia Coli大肠杆菌uidA 211bp

DEFINITION uidA＝beta-glucuronidase[Escherichia coli，Genomic，1812nt].

SEQ ID NO：11：

TGTGGAGTATTGCCAACGAACCGGATACCCGTCCGCAAGGTGCACGGGAATATTTCGCGC

CACTGGCGGAAGCAACGCGTAAACTCGACCCGACGCGTCCGATCACCTGCGTCAATGTAA

TGTTCTGCGACGCTCACACCGATACCATCAG

引物

SEQ ID NO：35正义链：5′-TGTGGAGTATTGCCAACGAAC-3′

SEQ ID NO：36反义链：5′-CTGATGGTATCGGTGTGAGC-3′

SEQ ID NO：12：

ATTCAGTCTGGATCGCGAAAACTGTGGAATTGAGCAGCGTTGGTGGGAAAGCGCGTTACA

AGAAAGCCGGGCAATTGCTGTGCCAGGCAGTTTTAACGA

引物

SEQ ID NO：37正义链：5′-ATTCAGTCTGGATCGCGA-3′

SEQ ID NO：38反义链：5′-TCGTTAAAACTGCCTGGCAC-3′

Enterobacter cloacae ECL阴沟肠杆菌

DEFINITION Enterobacter cloacae ampR gene for transcriptional activator and ampC gene for classC beta-lactamase，strain OUDhyp

SEQ ID NO：13：

ATCGCTTCGCTAACCATCGTGCGCAGGAGAAGCTGAGAATCGGCGTGGTGGGTACGTTTG

CCATCGGGGTTTTATTCTCACAGCTGGACGATTTTCGCCGTGGCTATCCGCACATCGATCTT

CA

引物

SEQ ID NO：39正义链：5′-ATTCGTCCGTGACCATGC-3′

SEQ ID NO：40反义链：5′-GCTAACAGAT GGGTAAAC-3′

SEQ ID NO：14：

ATTCGTCCGTGACCATGCTGGAGGCCGCTCAGGCAGGGGTGGGCATTGCCATTGCGCCTG

TCGATATGTTTACCCATCTGTTAGC

引物

SEQ ID NO：41正义链：5′-ATCGCTTCGCTAACCATCG-3′

SEQ ID NO：42反义链：5′-TGAAGATCGATGTGCGGATAG-3′

Klebsiellapneumoniae克雷伯氏肺炎球菌Hemolysin gene

DEFINITION Klebsiella pneumoniae hemolysin gene，complete cds

SEQ ID NO：15：

AATACAACCGCATCTATTATCCGCTCAATCCAGGCTATGCCGCGACGCGCCAGGATCGTT

GGGTTGACCATCCGCCGCAATTCTTCGGTCCACACG

引物

SEQ ID NO：43正义链：5′-AATACAACCGCATCTATTA-3′

SEQ ID NO：44反义链：5′-CGTGTGGACCGAAGAATTG-3′

SEQ ID NO：16：

ATGCCACTTATCCCGACAGCCCGGAGCGTTTTTCGATTGGCGCGCCGCTGGGGCGCGGTT

TACGTCTCAACCGGTTGGGGATCCACCACGAGCGACTGCCGCCCGGGCGGCGCACCTCGT

ACCCGCACGCGGAGAGCGATGAGGAAGAGTTC

引物

SEQ ID NO：45正义链：5′-ATGCCACTTATCCCGACA-3′

SEQ ID NO：46反义链：5′-GAACTCTTCCTCATCGCTCT-3′

Acinobacter baumannii鲍氏不动杆菌

DEFINITION Acinetobacter baumannii strain CIP 7034 RNA polymerase subunit B(rpoB)gene，complete

cds

SEQ ID NO：17：

AAACGTGGTGATAAACTTTCTGAAGATTTATTATCTGGTTTAGAGCTTGTTGATTTACTTG

AAATTCAACCAGCAGATGAAGCAATCGCTGAGCGTTTAACTCAAATTCAA

引物

SEQ ID NO：47正义链：5′-CTAATGGCGGTGGTTCAACT-3′

SEQ ID NO：48反义链：5′-CGATTTCTGCGCTCTTCTCT-3′

SEQ ID NO：18：

CGTGTACGTTCTGTTGGTGAAATGACAGAGAACCAATTCCGTGTAGGTTTAGTTCGTGTTG

AGCGTGCTGTTAAAGAGCGTTTAAGCCAAGCAGAAACAGATAAC

引物

SEQ ID NO：49正义链：5′-CGTGTACGTTCTGTTGGTGA-3′

SEQ ID NO：50反义链：5′-GTTATCTGTT TCTGCTTGGC-3′

以下是阳性内参探针的靶序列

SEQ ID NO：51：

ACAGTCAATACCCGCTACGCGCGTCTGAGTTCAACTTGGTTGAGCCGTTAAACTGCATTCA

GATTCGCCAGCTTCGGATTGCTACAGTGGGTCGATATCTGAGAACATCACGACGTCGATAT

GGGTCTTTCTACCCTCGAGGTGGCGCGATGAAGGTTTTTCATCTACTCAGACCGCTGATCC

CT

将上述病原体片段输入软件Primo Multiplex 3.4 Multiplex PCR Primer Design，设定好参数，运行程序，(5’PRIMER 0-200 3’PRIMER-200-0 TM：57℃TM Formula NearestN％GC 50 ANYCheck primer-primer dimmer Avoid backgroung priming Multiplex PCR5 Specificity Medium其余参数为默认值.)选取长度合适的计算结果，最终作为病毒探针片段。

1.2探针的制备

目前，oligo DNA合成一般都采用固相亚磷酰胺三酯法合成DNA片段，此方法具有高效、快速偶联等优点，已在DNA化学合成中广泛使用。DNA化学合成不同于酶促的DNA合成过程从5’向3’方向延伸，而是由3’端开始。具体的反应步骤如下：

保护基

用三氯乙酸(Trichloroacetic Acid，TCA)脱去连结在CPG(Controlled Pore Glass)上的核苷酸的保护基团DMT(二甲氧基三苯甲基)，获得游离的5’-羟基端，以供下一步缩合反应。

活化

将亚磷酰胺保护的核苷酸单体与四氮唑活化剂混合并进入合成柱，形成亚磷酰胺四唑活性中间体(其3’-端已被活化，但5’-端仍受DMT保护)，此中间体将与GPG上的已脱保护基的核苷酸发生缩合反应。

连接

亚磷酰胺四唑活性中间体遇到CPG上已脱保护基的核苷酸时，将与其5’-羟基发生亲合反应，缩合并脱去四唑，此时合成的寡核苷酸链向前延长一个碱基。

封闭

缩合反应后，为了防止连在CPG上的未参与反应的5’-羟基在随后的循环反应中被延伸，常通过乙酰化来封闭此端羟基，一般乙酰化试剂是用乙酸酐和N-甲基咪唑等混合形成的。

氧化

缩合反应时核苷酸单体是通过亚磷酯键与连在CPG上的寡核苷酸连接，而亚磷酯键不稳定，易被酸、碱水解，此时常用碘的四氢呋喃溶液将亚磷酰转化为磷酸三酯，得到稳定的寡核苷酸。

经过以上五个步骤后，一个脱氧核苷酸就被连到CPG的核苷酸上，同样再用三氯乙酸脱去新连上的脱氧核苷酸5’-羟基上的保护基团DMT后，重复以上的活化、连接、封闭、氧化过程即可得到DNA片段粗品。最后对其进行切割、脱保护基(一般对A、C碱基采用苯甲酰基保护；G碱基用异丁酰基保护；T碱基不必保护；亚磷酸用腈乙基保护)、纯化(常用的有HAP，PAGE，HPLC，C18，OPC等方法)、定量等合成后处理即可得到符合实验要求的寡核苷酸片段。

二：芯片制备

得到纯化的探针片断后，配置探针溶液，准备芯片点样。

芯片制作：1.切膜：选用合适的硝酸纤维素膜或尼龙膜，于切膜机中准确裁剪成方形芯片。规格1.5cm×1.5cm。

2.贴膜：将芯片用胶固定于(1-2)cmx(1-2)cm的芯片方皿中，使之紧贴芯片方皿底部，放置2分钟，胶凝固后，芯片平整地贴于芯片方皿底部，在芯片方皿的边框上作一定向标志或编号。

3.点膜：对探针分布进行合理布局，设阳性、阴性对照点。再将已配制好的探针溶液逐个加入与已布局好的点样针相应位置的探针盘孔中。每种探针点两针，点样时将点样仪推拉杆推到吸样位置，点样针与探针盘孔对准，按下顶部按钮，吸取探针(样品)液，停留3-5秒，吸样完毕，放松按钮，点样针架自动弹起。然后将点样仪推拉杆推到点样位置，此时已吸液的点样针对准芯片方皿中的膜片，按下按钮，停留3-5秒，放松按钮，点样针架自动弹起。重复此操作1-3次，点样完毕。

4.存膜：点样完毕，待芯片自然干燥，将芯片方皿放置紫外灯下照射10min，封装4℃保存。

5.芯片布局

芯片定性控制主要指从芯片制备到样本处理，到杂交扫描各环节的监控，目前主要的控制系统有：

(1)空白点：是不含任何基因片段的空白点样液，作为芯片制备过程中的污染监控指标。本实验中采用1倍的点样buffer。

(2)  阴性内参：是一段与检测基因没有同源性的其他基因片段，作为杂交过程中非特异性杂交的监控指标。

(3)  阳性内参：对于本实验中的常见细菌病原体的检测，可以使用改造过的一段其他基因片段，在9种常见细菌病原体引物扩增的同时可以扩增该序列片段，在样本抽提时加入检测体系中，用于监控核酸抽提，PCR扩增标记，芯片制备，芯片杂交。

(4)芯片杂交监控：用生物素点于芯片上，监控显色过程。

一、细菌感染基因芯片点样设计示意图见附图1：

○：1为金黄色葡萄球菌；2为表皮葡萄球菌；5为绿脓杆菌；7为鲍氏不动菌；10为克雷伯氏肺炎球菌；11为阴沟肠杆菌；13为屎肠球菌；14为粪肠球菌；15为大肠杆菌。

◇：空白：3、4、6、9(采用1倍的点样buffer)

：阴性内参：16(霍乱DNA序列探针，监控非特异性杂交显色过程)

*：阳性内参：12(监控除样品处理外，PCR扩增及杂交、显色全过程)

◆：芯片杂交监控：8(用生物素点于芯片上，监控显色过程)

三：试剂盒组成

1.1样本处理试剂

本试剂包括：1％Triton X-100，10mM Tris(pH8.0)，1mM EDTA

1.2杂交试剂

1)20×SSC：NaCl 17.55％；柠檬酸三钠·2H2O 8.82％；PH＝7.0

2)1M PBS：NaCl 0.8％；KCl 0.02％；Na2HPO4·12H2O 0.144％；KH2PO4·12H2O 0.024％；PH＝6.4

3)0.1M EDTA：EDTA 3.72％

4)预杂交液：取甲酰胺(DMF)50ml；20×SSC 25ml；50×Denhartds 10ml；鱼精DNA(10mg/ml)5ml；1M PBS(PH＝6.4)5ml；0.1M EDTA 5ml

5)杂交液：取甲酰胺45ml；20×SSC 25ml；50×Denhartds 2ml；鱼精DNA(10mg/ml)2ml；1M PBS(PH＝6.4)2ml；20％硫酸葡聚糖钠25ml

6)1M Tris-HCl PH＝7.5：Tris12.1％；MgCl20.1 9％；Triton X-100 0.05％(体积比)；NaCl 5.8％；

7)封闭液：称取3g BSA溶于70ml蒸馏水中，加入10ml 1M Tris-HCl PH＝7.5(配制试剂6)

8)酶联液：Tris-HCl 0.1M PH＝7.5；MgCl2 2mM；Triton X-100 0.05％(体积比)；NaCl1.0M；

9、底物溶液：Tris-HCl 0.1M PH＝9.5；MgCl2 5mM；NaCl 0.1M；

10)洗涤液：(1)2×SSC配方：配制250ml

量取20×SSC 25ml加入10％SDS 2.5ml，加蒸馏水至250ml；

(2)0.1×SSC配方：配制250ml

量取20×SSC 1.25ml加入10％SDS 2.5ml，加蒸馏水至250ml；

11)5-溴-4-氮-3-吲哚磷酸(BCIP)：称取10mg BCIP溶于200μl DMF中

12)氮蓝四唑(NBT)：称取15mg NBT溶于200μl 70％DMF中

1.3其它试剂

PCR MIX：引物、生物素、dATP、dTTP、dCTP、dGTP、dUTP、10×PCR buffer、无菌纯水。

Taq酶

PCR阴性对照    1ml×3管

PCR阳性对照    1ml×3管

1.4采样工具：棉拭子、无菌试管

1.5点好探针的芯片    18张

四：样本处理

(1)选取病人的未结痂创口或感染部位，充分暴露。

(2)将棉拭子置于创面或感染部位，轻轻向外转动3-5圈。

(3)将棉拭子放入标有病人编号的取样管中，塞紧管塞。

(4)在超净工作台中向取样管中加入1-2ml生理盐水，混匀。

(5)10000-13000rpm离心3-5分钟，用移液器小心去除上清。

(6)向离心沉淀物中加入50-150μl的TritonX-100 buffer，混匀；

(7)在水浴锅中煮沸5-10min；

(8)10000-13000rpm离心3-5min，将全部上清转移到新的灭菌EP管中；

(9)从EP管中取1-3μl用作PCR扩增模板

样品存放：制备的样品在2℃-8℃条件下保存不超过24小时，若需长期保存应置-70℃以下，但应避免反复冻融。

五：扩增标记

反应体系为60μl

试剂名称	加样量(μl)
		无菌纯水	34.3
10xPCR Buffer	6
		(dATP+dCTP+dGTP)10mM	0.6
dTTP 2mM	1.5
		dUTP 2mM	1.5
Bio-11-dUTP	1.5
		Taq酶0.5U/μl	6
P1+P2+......(x对引物，等体积混合)	6.6
		核酸模板	2

以上试剂混合均匀，置热盖PCR仪中，进行35-40个热循环扩增。程序如下：

功能	温度	时间	循环数
				预变性	94℃	2min	1

				变性	94℃	30s	35-40
退火	56℃	30s
			延伸	72℃	60s
				最终延伸	72℃	10min	1
保存	4℃	任意长度	1

6：杂交显色与结果阅读

4.1预杂交  在装有基因芯片的方形小皿边上写上样本编号。向小皿中加入400-600μl预杂交液，置杂交仪上，于40-45℃，预杂交30-40min，振荡频率：IV。使用真空泵吸去预杂交液。

4.2杂交  将样本中提取的核酸经PCR扩增，取扩增产物25-40μl，置1.5ml离心管中，100℃煮沸5-15min使变性，-20℃骤冷5-10min。加入350μl杂交液，振荡混匀，加入已经过预杂交的基因芯片的小皿中，置杂交仪上，于50-55℃振荡杂交1hr，振荡频率：IV。吸去杂交液。

4.3洗涤  分别用2×SSC，0.1×SDS和0.1×SSC，0.1×SDS洗涤液各400-500μl将杂交芯片洗涤2-3次，洗涤时振荡，吸去余液。

4.4封闭  向杂交芯片中加入300-500μl封闭液，置杂交仪上，于40-45℃封闭2-400min，振荡频率：IV，吸去封闭液。

4.5酶联  取300-500μl洗涤液(酶联缓冲液)中，加入1-4μl AV-AP(最好用SAv-AP)，振荡混匀，加入杂交芯片中，置杂交仪上，于40-45℃酶联反应10-30min，振荡频率：IV。吸去反应液，用洗涤液400-500μl将杂交芯片洗涤3-5次，吸去洗涤液。

4.6显色  加入显色液显色(300-500μl底物液+2μl BCIP+1-3μl NBT)，置杂交仪上，避光、常温或40-45℃显色，振荡频率：IV，随时观察杂交芯片上各点显色情况及本底深浅。

4.7用EDTA液终止显色，或者用自来水及蒸溜水终止显色并反复冲洗芯片，观察显色状况。

4.8放于芯片阅读仪上阅读结果。

*洗涤时，加入洗涤液后，振荡2-5分钟，吸去洗液。

结果阅读

1.将芯片放入芯片阅读仪内。

2.设置基因点阵、分辨率、阴性上限、阳性上限、模板设置等项。

3.观察结果，调整后打印结果。

为进一步说明本发明用于检测九种感染细菌病原体的基因芯片及其检测方法，特举以下的临床应用实施例进行说明，该实施例是为了解释而不是以任何方式限制本发明。

应用实例1

样本的处理过程：

(1)选取病人的未结痂创口或感染部位，充分暴露。

(2)将棉拭子置于创面或感染部位，轻轻向外转动3圈。

(3)将棉拭子放入标有病人编号的取样管中，塞紧管塞。

(4)取灭菌的1.5ml EP管，为被检样品处理管；阴性对照由试剂盒提供，在试剂盒中已标出，另装于试剂盒中1.5ml EP管。阳性对照由试剂盒提供，在处理样本前加入被检样品管作为阳性内参。

(5)在超净工作台中向每个取样管中加入2ml生理盐水，阴性对照相同操作，一份样本换用一个吸头。

(6)10000rpm离心3分钟，用移液器小心去除上清。

(7)向离心沉淀物中加入80μl的TritonX-100 buffer，混匀。

(8)在水浴锅中煮沸6min。

(9)10000rpm离心3min，将全部上清转移到新的灭菌EP管中。

(10)从EP管中取2μl用作PCR扩增模板。

样品存放：制备的样品在2℃-8℃条件下保存不超过24小时，若需长期保存应置-70℃以下，但应避免反复冻融。

应用实例2

检测9种常见细菌病原体同时杂交实验

9种常见细菌病原体DNA的PCR扩增标记

PCR程序

2.探针定量

用紫外分光光度计定量

金黄色葡萄球菌                     61ng/μl

表皮葡萄球菌                       100ng/μl

绿脓杆菌                           34.8ng/μl

屎肠球菌                           61.5ng/μl

粪肠球菌                           101.9ng/μl

大肠杆菌                           65.9ng/μl

阴沟肠杆菌                         136.6ng/μl

克雷伯氏肺炎球菌                   36ng/μl

鲍氏不动杆菌                       76.3ng/μl

探针稀释成20ng/μl，探针的点样量为2ng

阴性内参为霍乱的PCR产物制成的探针。

3.点膜

芯片探针排布见附图2

探针的点样量为2ng

1为金黄色葡萄球菌；2为表皮葡萄球菌；3为绿脓杆菌；4为鲍氏不动杆菌；5为克雷伯氏肺炎球菌；6为阴沟肠杆菌；7为屎肠球菌；8为粪肠球菌；9为大肠杆菌；10为阴性内参。

4.交联

把点好样的芯片放入在紫外灯下照射10min后待用。

5.PCR标记产物变性：

PCR循环后的产物置PCR仪中99℃加热变性8min，然后迅速放入-20℃冰箱中骤冷10min。

6.杂交：

6.1预杂交：

在装有基因芯片的方形小皿上写上样品编号，向小皿中加入450μl预杂交液，置杂交仪上，于40℃预杂交35分钟，振荡频率：IV。使用真空泵吸去预杂交液。

6.2杂交：

取经PCR扩增的标记物25μl，置1.5ml离心管中，100℃煮沸10分钟使变性，然后迅速置-20℃冰箱中骤冷8分钟。加入400μl杂交液，振荡混匀，加入已经过预杂交的基因芯片的小皿中，置杂交仪上，于50℃振荡杂交1hr，振荡频率：IV。用真空泵吸去杂交液。

6.3洗涤：

分别用2×SSC，0.1×SDS和0.1×SSC，0.1×SDS洗涤液各400μl将杂交芯片洗涤3次，洗涤时振荡，吸去余液。

6.4封闭：

向杂交芯片中加入350μl封闭液，置杂交仪上，于40℃封闭25min，振荡频率：IV，吸去封闭液。

6.5酶联：

取350μl酶联缓冲液，按1∶1200的比例加入SAv-AP，振荡混匀，加入杂交芯片中，置杂交仪上，于40℃酶联反应15min，振荡频率：IV。吸去反应液，用酶联缓冲液400μl将杂交芯片洗涤5次，吸去洗涤液。

6.6显色：

加入显色液显色(350μl底物液+2μl BCIP+2μlNBT)，置杂交仪上，避光、常温或42℃显色，振荡频率：IV，随时观察杂交芯片上各点显色情况及本底深浅。

6.7终止显色：

用EDTA液终止显色，或者用自来水及蒸溜水终止显色并反复冲洗芯片，观察显色状况。

7.结果观察见附图3

由上图可看出，按照本试剂盒的检测方法操作，芯片杂交后各点的显色情况较好。

芯片阅读结果：

9种常见细菌病原体感染检验结果(基因芯片)报告单

检验项目	检验值	正常值	结果
				金黄色葡萄球菌绿脓杆菌表皮葡萄球菌屎肠球菌粪肠球菌大肠杆菌阴沟肠杆菌克雷伯氏肺炎球菌鲍氏不动杆菌	0.6471.3710.7291.0290.8491.0490.6490.9460.749	＜0.36＜0.65＜0.29＜0.5＜0.43＜0.63＜0.56＜0.51＜0.37	(+)(+)(+)(+)(+)(+)(+)(+)(+)

初筛结果：(+)                       确诊结果：(+)                     报告者：

应用实例3

检测9种常见细菌病原体同时杂交实验

9种常见细菌病原体DNA的PCR扩增标记

PCR程序

2.探针定量

用紫外分光光度计定量

金黄色葡萄球菌                 61ng/μl

表皮葡萄球菌                   100ng/μl

绿脓杆菌                       34.8ng/μl

屎肠球菌                       61.5ng/μl

粪肠球菌                       101.9ng/μl

大肠杆菌                       65.9ng/μl

阴沟肠杆菌                     136.6ng/μl

克雷伯氏肺炎球菌               36ng/μl

鲍氏不动杆菌                   76.3ng/μl

探针稀释成20ng/μl，探针的点样量为1.5ng

阴性内参为霍乱的PCR产物制成的探针。

点膜

芯片探针排布见附图4

探针的点样量为2ng

 1为金黄色葡萄球菌；2为表皮葡萄球菌；3为绿脓杆菌；4为鲍氏不动杆菌；5为克雷伯氏肺炎球菌；6为阴沟肠杆菌；7为屎肠球菌；8为粪肠球菌；9为大肠杆菌；10为阴性内参。

4.交联

把点好样的芯片放入在紫外灯下照射10min后待用。

5.PCR标记产物变性：

PCR循环后的产物置PCR仪中99℃加热变性10min，然后迅速放入-20℃冰箱中骤冷10min。

6.杂交：

6.1预杂交：

在装有基因芯片的方形小皿上写上样品编号，向小皿中加入500μl预杂交液，置杂交仪上，于42℃预杂交40分钟，振荡频率：IV。使用真空泵吸去预杂交液。

6.2杂交：

取经PCR扩增的标记物30μl，置1.5ml离心管中，100℃煮沸10分钟使变性，然后迅速置-20℃冰箱中骤冷10分钟。加入450μl杂交液，振荡混匀，加入已经过预杂交的基因芯片的小皿中，置杂交仪上，于52℃振荡杂交1hr，振荡频率：IV。用真空泵吸去杂交液。

6.3洗涤：

分别用2×SSC，0.1×SDS和0.1×SSC，0.1×SDS洗涤液各450μl将杂交芯片洗涤2次，洗涤时振荡，吸去余液。

6.4封闭：

向杂交芯片中加入400μl封闭液，置杂交仪上，于42℃封闭30min，振荡频率：IV，  吸去封闭液。

6.5酶联：

取400μl酶联缓冲液，按1∶1200的比例加入SAv-AP，振荡混匀，加入杂交芯片中，置杂交仪上，于42℃酶联反应20min，振荡频率：IV。吸去反应液，用酶联缓冲液450μl将杂交芯片洗涤3次，吸去洗涤液。

6.6显色：

加入显色液显色(400μl底物液+2μl BCIP+2μlNBT)，置杂交仪上，避光、常温或42℃显色，振荡频率：IV，随时观察杂交芯片上各点显色情况及本底深浅。

6.7终止显色：

用EDTA液终止显色，或者用自来水及蒸溜水终止显色并反复冲洗芯片，观察显色状况。

7.结果观察见附图5

由上图可看出，按照本试剂盒的检测方法操作，芯片杂交后各点的显色情况较好。

芯片阅读结果

9种常见细菌病原体感染检验结果(基因芯片)报告单

检验项目	检验值	正常值	结果
				金黄色葡萄球菌绿脓杆菌表皮葡萄球菌屎肠球菌粪肠球菌大肠杆菌阴沟肠杆菌克雷伯氏肺炎球菌鲍氏不动杆菌	0.7051.2690.6820.8310.7561.1030.7080.6960.801	＜0.36＜0.65＜0.29＜0.5＜0.43＜0.63＜0.56＜0.51＜0.37	(+)(+)(+)(+)(+)(+)(+)(+)(+)

初筛结果：(+)                    确诊结果：(+)                    报告者：

应用实例4

检测烧伤感染病人临床样本的杂交实验

处理后的烧伤感染病人临床样本细菌DNA的PCR扩增标记

PCR程序

2.探针定量

用紫外分光光度计定量

金黄色葡萄球菌                 61ng/μl

表皮葡萄球菌                   100ng/μl

绿脓杆菌                       34.8ng/μl

屎肠球菌                       61.5ng/μl

粪肠球菌                       101.9ng/μ1

大肠杆菌                       65.9ng/μl

阴沟肠杆菌                     136.6ng/μl

克雷伯氏肺炎球菌               36ng/μl

鲍氏不动杆菌                   76.3ng/μl

探针稀释成20ng/μl，探针的点样量为2ng

阴性内参为霍乱的PCR产物制成的探针。

点膜

芯片探针排布见附图6

探针的点样量为2ng

1为金黄色葡萄球菌；2为表皮葡萄球菌；3为绿脓杆菌；4为鲍氏不动杆菌；5为克雷伯氏肺炎球菌；6为阴沟肠杆菌；7为屎肠球菌；8为粪肠球菌；9为大肠杆菌；1 0为阴性内参。

4.交联

把点好样的芯片放入在紫外灯下照射8min后待用。

5.PCR标记产物变性：

PCR循环后的产物置PCR仪中99℃加热变性10min，然后迅速放入-20℃冰箱中骤冷8min。

6.杂交：

6.1预杂交：

在装有基因芯片的方形小皿上写上样品编号，向小皿中加入600μl预杂交液，置杂交仪上，于41℃预杂交40分钟，振荡频率：IV。使用真空泵吸去预杂交液。

6.2杂交：

取经PCR扩增的标记物40μl，置1.5ml离心管中，100℃煮沸10分钟使变性，然后迅速置-20℃冰箱中骤冷10分钟。加入450μl杂交液，振荡混匀，加入已经过预杂交的基因芯片的小皿中，置杂交仪上，于50℃振荡杂交1.5hr，振荡频率：IV。用真空泵吸去杂交液。

6.3洗涤：

分别用2×SSC，0.1×SDS和0.1×SSC，0.1×SDS洗涤液各500μl将杂交芯片洗涤5次，洗涤时振荡，吸去余液。

6.4封闭：

向杂交芯片中加入450μl封闭液，置杂交仪上，于41℃封闭30min，振荡频率：IV，吸去封闭液。

6.5酶联：

取450μl酶联缓冲液，按1∶1200的比例加入SAv-AP，振荡混匀，加入杂交芯片中，置杂交仪上，于42℃酶联反应20min，振荡频率：IV。吸去反应液，用酶联缓冲液400μl将杂交芯片洗涤5次，吸去洗涤液。

6.6显色：

加入显色液显色(400μl底物液+2μl BCIP+3μlNBT)，置杂交仪上，避光、常温或42℃显色，振荡频率：IV，随时观察杂交芯片上各点显色情况及本底深浅。

6.7终止显色：

用EDTA液终止显色，或者用自来水及蒸溜水终止显色并反复冲洗芯片，观察显色状况。

7.结果观察见附图7

由上图可看出，按照本试剂盒的检测方法操作，芯片杂交后各点的显色情况较好。

芯片阅读结果：

9种常见细菌病原体感染检验结果(基因芯片)报告单

检验项目	检验值	正常值	结果
				金黄色葡萄球菌绿脓杆菌表皮葡萄球菌屎肠球菌粪肠球菌大肠杆菌阴沟肠杆菌克雷伯氏肺炎球菌鲍氏不动杆菌	0.6520.9690.0820.1310.1160.8430.6170.5250.597	＜0.36＜0.65＜0.29＜0.5＜0.43＜0.63＜0.56＜0.51＜0.37	(+)(+)(-)(-)(-)(+)(+)(+)(+)

初筛结果：(+)                    确诊结果：(+)                    报告者：

                     SEQUENCE LISTING

<110>北京爱普益生物科技有限公司

<120>检测多种常见细菌病原体的基因芯片、制备方法、试剂盒

<130>SGF

<160>51

<170>PatentIn version 3.2

<210>1

<211>93

<212>DNA

<213>金黄色葡萄球菌

<400>1

acaatacaca tgaacaacat ttaagaaaaa gtgaagcaca agcgaaaaaa gagaaattaa    60

atatttggag cgaagacaac gctgattcag gtc                                 93

<210>2

<211>150

<212>DNA

<213>金黄色葡萄球菌

<400>2

acacctgaaa caaagcatcc taaaaaaggt gtagagaaat atggtcctga agcaagtgca    60

tttacgaaaa aaatggtaga aaatgcaaag aaaattgaag tcgagtttga caaaggtcaa    120

agaactgata aatatggacg tggcttagcg                                     150

<210>3

<211>59

<212>DNA

<213>表皮葡萄球菌

<400>3

cttgagatgt atagaattca aaatatttac catttgcata gtctgattgc tcaaagtct     59

<210>4

<211>75

<212>DNA

<213>表皮葡萄球菌

<400>4

 gaagagccac atttaaaata taaatcagat aaaattgtag aaaattacca caaactttgg   60

 ggtaaagaag catcg                                                    75

<210>5

<211>182

<212>DNA

<213>绿脓杆菌

<400>5

tttcgcacct cagtgtcagt atcagtccag gtggtcgcct tcgccactgg tgttccttcc    60

tatatctacg catttcaccg ctacacagga aattccacca ccctctaccg tactctagct    120

cagtagtttt ggatgcagtt cccaggttga gcccggggat ttcacatcca acttgctgaa    180

cc                                                                   182

<210>6

<211>114

<212>DNA

<213>绿脓杆菌

<400>6

atattcccca ctgctgcctc ccgtaggagt ctggaccgtg tctcagttcc agtgtgactg    60

atcatcctct cagaccagtt acggatcgtc gccttggtag gcctttaccc cacc          114

<210>7

<211>87

<212>DNA

<213>屎肠球菌

<400>7

ccacgccttc tacaattgct tgaggtgcgt gatctccgcc cattgcatct acggcaattt    60

tcattgtttc cactcctttt tccgtca                                        87

<210>8

<211>178

<212>DNA

<213>屎肠球菌

<400>8

atctgcatct ggttggcttt gaaggcttcc atgattactt ctttttcctg attcttcatt    60

ttaccatgta acaagccaac ttcatatttt ggtgcaaata gttcacgaag tttttcatag    120

atttccactg cattttttac atctaatgct tctgattctt caatcagcgg acagatga      178

<210>9

<211>117

<212>DNA

<213>粪肠球菌

<400>9

aagggaaata aaattttata cattttaggt acaggcatct ttgttggaag ttcatgtcta    60

ttttcttcac tttttgtagc cgcagaagaa caagtttatt cagaaagtga agtttca       117

<210>10

<211>113

<212>DNA

<213>粪肠球菌

<400>10

gcgttatggt gaaacaagta caccaacagg aaaaacgtat gcttcctctt tagatgtagt    60

tggtcatgaa atgacacatg gtgtgacgga acatactgcc ggtttagaat att           113

<210>11

<211>151

<212>DNA

<213>大肠杆菌

<400>11

tgtggagtat tgccaacgaa ccggataccc gtccgcaagg tgcacgggaa tatttcgcgc    60

 cactggcgga agcaacgcgt aaactcgacc cgacgcgtcc gatcacctgc gtcaatgtaa   120

tgttctgcga cgctcacacc gataccatca g                                   151

<210>12

<211>99

<212>DNA

<213>大肠杆菌

<400>12

attcagtctg gatcgcgaaa actgtggaat tgagcagcgt tggtgggaaa gcgcgttaca    60

agaaagccgg gcaattgctg tgccaggcag ttttaacga                           99

<210>13

<211>124

<212>DNA

<213>阴沟肠杆菌

<400>13

atcgcttcgc taaccatcgt gcgcaggaga agctgagaat cggcgtggtg ggtacgtttg    60

ccatcggggt tttattctca cagctggacg attttcgccg tggctatccg cacatcgatc    120

ttca                                                                 124

<210>14

<211>85

<212>DNA

<213>阴沟肠杆菌

<400>14

attcgtccgt gaccatgctg gaggccgctc aggcaggggt gggcattgcc attgcgcctg    60

tcgatatgtt tacccatctg ttagc                                          85

<210>15

<211>96

<212>DNA

<213>克雷伯氏肺炎球菌

<400>15

aatacaaccg catctattat ccgctcaatc caggctatgc cgcgacgcgc caggatcgtt    60

gggttgacca tccgccgcaa ttcttcggtc cacacg                              96

<210>16

<211>152

<212>DNA

<213>克雷伯氏肺炎球菌

<400>16

atgccactta tcccgacagc ccggagcgtt tttcgattgg cgcgccgctg gggcgcggtt    60

tacgtctcaa ccggttgggg atccaccacg agcgactgcc gcccgggcgg cgcacctcgt    120

acccgcacgc ggagagcgat gaggaagagt tc                                  152

<210>17

<211>111

<212>DNA

<213>鲍氏不动杆菌

<400>17

aaacgtggtg ataaactttc tgaagattta ttatctggtt tagagcttgt tgatttactt    60

gaaattcaac cagcagatga agcaatcgct gagcgtttaa ctcaaattca a             111

<210>18

<211>105

<212>DNA

<213>鲍氏不动杆菌

<400>18

cgtgtacgtt ctgttggtga aatgacagag aaccaattcc gtgtaggttt agttcgtgtt    60

gagcgtgctg ttaaagagcg tttaagccaa gcagaaacag ataac                    105

<210>19

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>19

acaatacaca tgaacaac                                                  18

<210>20

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>20

acaatacaca tgaacaac                                                  18

<210>21

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>21

acacctgaaa caaagcatcc                                                20

<210>22

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>22

cgctaagcca cgtccatatt                                                20

<210>23

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>23

tgcgccacta agatctcaag                                                20

<210>24

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>24

gtgcctgcag ccgcggtaat                                                20

<210>25

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>25

atattcccca ctgctgcctc                                               20

<210>26

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>26

ggtggggtaa aggcctac                                                 18

<210>27

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>27

ccacgccttc tacaattgc                                                19

<210>28

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>28

tgacggaaaa aggagtgg                                                 18

<210>29

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>29

atctgcatct ggttggcttt g                                             21

<210>30

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>30

tcatctgtcc gctgattgaa g                                             21

<210>31

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>31

aagggaaata aaattttata                                              20

<210>32

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>32

tgaaacttca ctttctgaat                                              20

<210>33

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>33

gcgttatggt gaaacaagt                                               19

<210>34

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>34

aatattctaa accggcagta                                              20

<210>35

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>35

tgtggagtat tgccaacgaa c                                            21

<210>36

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>36

ctgatggtat cggtgtgagc                                              20

<210>37

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>37

attcagtctg gatcgcga                                                18

<210>38

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>38

tcgttaaaac tgcctggcac                                              20

<210>39

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>39

attcgtccgt gaccatgc                                                18

<210>40

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>40

gctaacagat gggtaaac                                                18

<210>41

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>41

atcgcttcgc taaccatcg                                               19

<210>42

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>42

tgaagatcga tgtgcggata g                                            21

<210>43

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>43

aatacaaccg catctatta                                               19

<210>44

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>44

cgtgtggacc gaagaattg                                                  19

<210>45

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>45

atgccactta tcccgaca                                                   18

<210>46

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>46

gaactcttcc tcatcgctct                                                 20

<210>47

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>47

ctaatggcgg tggttcaac                                                  19

<210>48

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>48

cgatttctgc gctcttctct                                                 20

<210>49

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>49

cgtgtacgtt ctgttggtga                                                 20

<210>50

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>50

gttatctgtt tctgcttggc                                              20

<210>51

<211>185

<212>DNA

<213>阳性内参

<400>51

acagtcaata cccgctacgc gcgtctgagt tcaacttggt tgagccgtta aactgcattc  60

agattcgcca gcttcggatt gctacagtgg gtcgatatct gagaacatca cgacgtcgat  120

atgggtcttt ctaccctcga ggtggcgcga tgaaggtttt tcatctactc agaccgctga  180

tccct                                                              185

Claims (4)

1、检测多种常见细菌病原体的基因芯片，包括固相载体和固定在该载体上的寡聚核苷酸探针，其中寡聚核苷酸探针包括检测探针和质量控制探针，其特征在于：芯片样品点的布局为低密度布局，样品点少于200个；所述的寡聚核苷酸检测探针分别是从金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、绿脓杆菌、屎肠球菌、粪肠球菌、大肠杆菌、阴沟肠杆菌、克雷伯氏肺炎球菌、鲍氏不动杆菌的基因组对应的核苷酸序列中选取的DNA或cDNA片段。

2、如权利要求1所述的检测多种常见细菌病原体的基因芯片，其特征在于：所述的从金黄色葡萄球菌基因组的核苷酸序列中选取的DNA片段具有如SEQ ID NO：1或SEQ IDNO：2所示的碱基序列；从表皮葡萄球菌基因组的核苷酸序列中选取的DNA片段具有如SEQID NO：3或SEQ ID NO：4所示的碱基序列；从绿脓杆菌基因组的核苷酸序列中选取的DNA片段具有如SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：6所示的碱基序列；从屎肠球菌基因组的核苷酸序列中选取的DNA片段具有如SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8所示的碱基序列；从粪肠球菌基因组的核苷酸序列中选取的DNA片段具有如SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10所示的碱基序列；从大肠杆菌基因组的核苷酸序列中选取的DNA片段具有如SEQ ID NO：11或SEQ IDNO：12所示的碱基序列；从阴沟肠杆菌基因组的核苷酸序列中选取的DNA片段具有如SEQID NO：13或SEQ ID NO：14所示的碱基序列；从克雷伯氏肺炎球菌基因组的核苷酸序列中选取的DNA片段具有如SEQ ID NO：15或SEQ ID NO：16所示的碱基序列；从鲍氏不动杆菌基因组的核苷酸序列中选取的DNA片段具有如SEQ ID NO：17或SEQ ID NO：18所示的碱基序列。

3、制备权利要求1所述的检测多种常见细菌病原体的基因芯片的方法，其特征是包括以下的步骤：

(1)探针的设计：根据所述的金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、绿脓杆菌、屎肠球菌、粪肠球菌、大肠杆菌、阴沟肠杆菌、克雷伯氏肺炎球菌、鲍氏不动杆菌的基因序列与NCBI数据库中的序列比对，选择出种内保守性高、种间特异性高的序列作为探针，它们分别具有如权利要求2所述的碱基序列；

(2)探针的合成：经过保护、活化、连接、封闭和氧化五个步骤后，一个脱氧核苷酸就被连到核苷酸上，同样再用三氯乙酸脱去新连上的脱氧核苷酸5’-羟基上的保护基团后，重复以上的活化、连接、封闭、氧化过程即可得到DNA片段粗品；最后对其进行切割、脱保护基，纯化、定量等合成后处理即可得到符合要求的寡核苷酸片段；

(3)芯片的制备：包括切膜、贴膜，然后将上述得到的目的探针点膜，再经交联、存膜即得芯片，其中点膜后得样品点直径在50μm-2000μm。

4、用于检测多种常见细菌病原体的试剂盒，其特征是主要包括：权利要求2所述的基因芯片、待测样品处理试剂、杂交、显色试剂和说明书。

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