CN1635150A - 耐药菌检测芯片及其制备方法和应用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属微生物检验领域，涉及一种常见耐药菌检测芯片及其制备方法和应用方法。本发明利用DNA芯片的方法，将已经合成的用于检测临床常见耐药菌的寡核苷酸探针固定于载玻片表面形成点阵，通过将待测样本的DNA片断与芯片杂交，可获取大量与细菌鉴定以及耐药性相关的基因序列信息，将临床标本中存在的常见致病细菌鉴定到菌种，从而同期实现临床常见致病菌的鉴定以及主要耐药谱的检测，本发明检测过程简便、快速，检测灵敏、特异，能明显缩短疾病的诊断时间，为感染性疾病患者的救治赢得宝贵时间。
Description
技术领域
本发明属微生物检验领域，涉及耐药菌快速检测的方法，特别是一种常见耐药菌检测芯片及其制备方法和应用方法。
背景技术
近年发展起来的DNA芯片检测技术，利用或借助微电子芯片技术的集约化和平行处理原理，可以快速、高效地获取或处理大量的生命信息(包括基因的识别、基因突变检测、基因表达谱检测和对外来分子的识别等)，在生物学研究如，生命科学、医学诊断、新药筛选和司法鉴定等研究中发挥了重要作用。
当前，感染性疾病仍然是威胁人类健康和生命的重要疾病，据2003年世界卫生组织将健康报告，2002年全球62.25亿人口中，感染性疾病占死亡原因的第二位(26.2％)，仅次于心血管病(29.2％)，而在致残或劳动力丧失的原因中则高居榜首(30％)。感染性疾病治愈率低、病死率高的主要原因有以下两方面：一是病原诊断不及时，未能早期正确进行抗感染治疗，二是细菌耐药性严重，治疗困难。临床医疗工作中，在未能明确病原前，常予以经验治疗，然而即使是基于循证医学拟定的经验治疗方案亦有较高的主观性和盲目性。在欧洲一个大系列临床调查结果发现对感染者的经验治疗方案属不恰当者占25％，属此种情况者由于抗感染治疗方案不正确导致42％～60％的病死率，而治疗方案正确者病死率仅17.7％。不恰当的治疗往往表现为滥用广谱抗菌药，其结果除疗效差外，尚导致耐药菌的明显增多，以致治疗更为困难，医疗费用亦大幅上升。
造成临床上抗感染治疗不恰当的根本原因在于目前病原诊断水平低、费时间。以细菌而言，细菌检出及细菌药敏测定需4～5日，至少3日，血培养常需5～7日。感染病原菌耐药，又缺乏病原和药敏的资料，不能及时正确针对性抗感染治疗，是导致耐药菌感染治疗失败的主因。近年来，日益增多的耐药菌感染出现在细菌中，多重耐药的非发酵菌、肠杆菌科细菌和葡萄球菌感染逐年增多，以假单胞菌、不动杆菌等非发酵菌为例，已经自20世纪90年代的占革兰阴性杆菌的23％～25％至目前的约35％，且为重症监护室感染的第1、2位病原菌，常呈多重耐药，其所致肺部感染、血流感染的病死率可达20％～40％。此均给治疗带来了很大的困难。
临床上重要的耐药菌在革兰阳性菌中是甲氧西林耐药葡萄球菌、万古霉素耐药肠球菌和青霉素不敏感肺炎链球菌，而产β-内酰胺酶是革兰阴性杆菌耐药的重要机制，其中最重要的机制之一是产超广谱β-内酰胺酶(extended spectrumβ-lactamases，ESBLs)。
研究报道，耐甲氧西林葡萄球菌的主要耐药机制是由于葡萄球菌胞膜上的青霉素结合蛋白(penicillin binding proteins，PBPs)发生改变。耐甲氧西林葡萄球菌产生的青霉素结合蛋白称为PBP2a或PBP2’。由于PBP2a与β-内酰胺类抗生素的亲和力极低且能替代其它PBPs的功能，使得耐甲氧西林葡萄球菌能够在高浓度β-内酰胺类抗生素存在的环境中生存。编码PBPs的结构基因为mecA，该基因位于耐甲氧西林葡萄球菌的环状染色体上，受mec1和mecR1基因调控。
耐万古霉素肠球菌的耐药机制主要是由于肠球菌携带了vanA、vanB、vanC、vanD、vanE等耐药基因后，细胞壁的生物合成途径发生了改变，使其合成的肽聚糖前体与万古霉素等糖肽类抗生素亲和力下降，从而导致肠球菌对万古霉素耐药。目前研究较多的是vanA、vanB、vanC。携带vanA的肠球菌对万古霉素及替考拉宁均高度耐药，而携带vanB的肠球菌对万古霉素呈不同程度的耐药，但对替考拉宁敏感，携带vanC的肠球菌对万古霉素低度耐药，对替考拉宁敏感，通常以前两者较为多见，最具临床意义。
青霉素不敏感肺炎链球菌的耐药机制主要是由于编码PBPs的基因pbp1a，pbp2x和pbp2b发生变异，它们的编码产物与青霉素的亲和力下降，从而导致肺炎链球菌对青霉素耐药。该过程的发生，是一个上述3个基因逐步变异而导致耐药程度逐步提高，且存在多条变异途径的渐进过程，其中pbp2b的变异是高度耐药所必需的。
ESBLs主要有TEM型、SHV型和CTX-M型、OXA型和其他型。TEM、SHV型是在广谱酶TEM-1、2、SHV-1的基础上发生1～5个氨基酸产生点突变而来，由于氨基酸的改变引起底物谱的扩大从而导致细菌对第三代头孢菌素和单环β-内酰胺类抗生素的耐药。SHV、TEM家族的组内同源性较高，与普通的广谱酶序列仅相差一至几个氨基酸，其中TEM家族在国内较少报道，CTX-M按基因序列同源性可分为4～5个组，组间同源性较低，均为ESBLs，是国内肠杆菌科细菌最常见的型别。
传统的病原学诊断及其耐药性检测主要依赖于形态学、培养等方法，其成本相对较低，方法也不复杂。但最大的缺点在于耗时长，近年来虽然出现了快速培养的技术，但大大提高了成本，也难于在短时间内同时获取细菌鉴定与药敏试验数据，仍然不能满足临床需要。常用的耐药性检测方法有纸片扩散法、肉汤稀释法、琼脂稀释法、E-试验法等，这些方法均须在获得纯培养的细菌后才能进行，因此，耐药性检测在病原学检测基础上至少还需要增加一天的时间以获取结果。鉴于此，耐药菌的快速诊断成为临床微生物学的一个重要发展方向。
分子生物学检测技术是以病原菌的核酸为研究对象，通过鉴定的病原和耐药基因的核酸分子来进行病原学诊断。如核酸杂交技术，靶基因的扩增技术等，但是这些技术共同的缺点在于能够检测的靶位点较少，实用性较差，有些技术需要进行RNA操作，技术复杂，操作要求高，在临床上难以推广应用。
发明内容
本发明的目的是克服上述已有技术的不足，提供一种常见耐药菌检测芯片及其制备方法。本发明的进一步目的是提供耐药菌检测芯片的应用方法，以实现对临床常见致病细菌鉴定以及主要耐药性测定的敏感、特异、快速的检测。
本发明利用DNA芯片的方法，将已经合成的用于检测常见耐药菌的寡核苷酸探针固定于载玻片表面形成点阵，通过将待测样本的DNA片断与芯片杂交，即可获取大量与细菌鉴定以及耐药性相关的基因序列信息，从而同期实现临床常见致病菌的鉴定以及主要耐药谱的检测，为感染病的治疗提供参考。
本发明通过下述技术方案实现：一种耐药细菌检测芯片，在一张经修饰的载玻片上，固定有一系列寡核苷酸点阵探针，其特征在于：
(1)所说的探针是针对不同细菌23S rRNA基因特异序列及其主要耐药基因包括mecA基因、PBP2B基因、vanA基因、vanB基因、SHV基因和CTX-M基因的特异序列或突变位点而设计的；
(2)每一探针的熔解温度(Tm)相近；
(3)突变位点尽可能位于探针的中间；
所说的探针主要针对23S rRNA基因，mecA基因，PBP2B基因，vanA基因，vanB基因，SHV基因，CTX-M基因。
针对不同细菌23S基因各自特异序列设计的探针如表1所示
表1.菌种检测探针序列
编号 探针 序列
1 通用探针 NH2-poly(T)16-GACCGATAGTGAACCAGTACCG
2 金葡菌 NH2-poly(T)16-CGGAGTTACAAAGGACGACAT
3 葡萄球菌通用探针 NH2-poly(T)16-GTAGGACACTCTATACGGAGAC
4 肠球菌通用探针 NH2-poly(T)16-GAGGTAGACGCAGAGAACTGAA
5 粪肠球菌 NH2-poly(T)16-CGAAATGCTR(A/G)ACAACACCTAG
6 屎肠球菌 NH2-poly(T)16-CGAAATGTGGAAGACACCTA
7 肺炎链球菌1 NH2-poly(T)16-AGAAGAATGATTTGGGAAGATC
8 肺炎链球菌2 NH2-poly(T)16-GTAGGACTGCAATGTGGACTC
9 大肠埃希菌1 NH2-poly(T)16-CCAGAGCCTGAATCAGTGTGT
10 大肠埃希菌2 NH2-poly(T)16-CCAGAGCCTGAATCAGTATGTG
11 铜绿假单胞菌 NH2-poly(T)16-GCTTCATTGATTTTAGCGGAAC
12 变形杆菌属1 NH2-poly(T)16-AGCAGTGTCAGGAGAACGGTCT
13 变形杆菌属2 NH2-poly(T)16-AGCCCCGTATCTGAAGATGCT
14 洋葱伯克霍尔德菌 NH2-poly(T)16-GTATTGTTAGCCGAACGCTCT
15 嗜麦芽窄食单胞菌 NH2-poly(T)16-CCCTGTATCTGAAAGGGCCA
16 阴沟肠杆菌 NH2-poly(T)16-CCCGTACACGAAAATGCAC
17 鲍曼不动杆菌 NH2-poly(T)16-ACGAAAGGGCACACATAATGAT
18 脆弱拟杆菌 NH2-poly(T)16-ACGGCATGTGTGGGGTT
19 阴沟肠杆菌2 NH2-poly(T)16-AAAGTCGCACGGTACAGG
20 阴沟肠杆菌3 NH2-poly(T)16-CACGAAAGCACACAGGCT
21 普通变形杆菌 NH2-poly(T)16-CAATAGCAGCATCAGGAGAA
22 摩氏摩根菌 NH2-poly(T)16-TCTGAAAGCACTGGTGTTGT
23 弗劳地柠檬酸杆菌 NH2-poly(T)16-AAAAGTGCATGTGTTGTGAAC
24 洛菲不动杆菌 NH2-poly(T)16-AGGGCTTATATGATGATGTCG
25 产气肠杆菌 NH2-poly(T)16-AATGCACAGGTTGTGAACTC
26 肺炎克雷伯菌4 NH2-poly(T)16-AATGCACAGGCTGTGAACTC
27 伤寒沙门菌 NH2-poly(T)16-AAAGCGCATATGCTGTGA
28 其他沙门菌属 NH2-poly(T)16-AAAGCGCATGTGCTGTGA
29 肺炎克雷伯菌3 NH2-poly(T)16-CCCGTACACCAAAATGCA
30 分枝杆菌 NH2-poly(T)16-CGGCTGAGAGGCAGTCAG
31 消化链球菌 NH2-poly(T)16-CAGAATAGAGACACTTTAAGAAGAG
32 消化球菌 NH2-poly(T)16-AAAGATATAGCGTTTTAGCAGAAT
33 李斯特菌 NH2-poly(T)16-ACGGAGTTACAAAAGAAAGTTATAA
针对不同耐药基因特异序列或突变位点而设计的探针如下述表2所示：
表2.耐药基因检测探针
编号 探针 序列(5’＞3’)
34 mecA NH2-poly(T)16-GCGCTATAGATTGAAAGGATC
35 vanAN NH2-poly(T)16-GCGCGTTCAGGCTCATC
36 vanBN NH2-poly(T)16-GCGGGCATCGCCGTTC
37 pbp2bm NH2-poly(T)16-CTCAGGCTTACGGTTCATTC
38 CTX-M-1组 NH2-poly(T)16-AGCTGGTGACATGGATGAAA
39 CTX-M-13组 NH2-poly(T)16-ACCGCCATTCCCGGCGA
40 SHV-1(1-12) NH2-poly(T)16-GGAGCTGGCGAGCG
41 SHV-1(1-11) NH2-poly(T)16-CTGGCGAGCGGGGT
42 SHV-11 NH2-poly(T)16-CTGGCGAACGGGGT
43 SHV-12 NH2-poly(T)16-GGAGCTAGCAAGCGGG
44 SHV通用探针 NH2-poly(T)16-TTATCGCCGATAAGACCG
探针长度相近为20mer。
上述耐药细菌检测芯片的制作方法包括如下步骤：
(1)根据所设计的寡核苷酸探针进行探针的合成；
(2)用去离子水将合成的探针稀释，并与点样溶液(spotting solution)等体积混合，使终浓度为75pmol/μl；
(3)载玻片表面使用醛基修饰；
(4)利用Cartesian公司的微阵列芯片制作系统将探针点阵在经醛基修饰的载玻片表面；
(5)置于相对湿度70％，室温条件下经48～72小时进行固定；
(6)室温下将载玻片浸入0.2％SDS中振荡数分钟，再浸入双蒸水中振荡数分钟，再浸入100℃双蒸水30秒，晾干，备用；
所说的寡核苷酸探针的5’末端需附加一定长度16mer的连接臂(Poly T)，该连接臂的5’末端需进行氨基修饰；
上述耐药细菌检测芯片的应用方法包括以下步骤：
(一)标本处理：
(1)取1～1.5ml临床标本1,500rpm离心5分钟，吸取上清，弃沉淀；
(2)12,000rpm离心5分钟，弃上清，加入1.5ml ddH2O重悬沉淀；
(3)12,000rpm离心5分钟，弃上清，再加入1.5ml ddH2O重悬沉淀；
(4)12,000rpm离心5分钟，弃上清，加入100μl STET、2μl溶葡萄球菌酶(1mg/ml)振荡混匀，经37℃10分钟，95℃10分钟处理；
(5)5,000rpm离心1分钟，留取上清作为扩增模板，获得待测标本的DNA，置4℃保存备用。
(二)荧光标记：
获得待测标本的DNA后，进行荧光标记处理：
(1)取制备好的标本DNA溶液2μl与23μl PCR扩增体系混匀(扩增体系包括2.5μl 10×PCR反应缓冲液5nmol dATP，5nmol dTTP，5nmol dGTP，5nmol dCTP，各15pmol的上游及下游引物，其中一条引物有Cy3或Cy5标记，1.25U DNA聚合酶)，通过以下热循环过程制备荧光标记的标本DNA目的片段：
95℃ 5min
95℃ 30S |
55℃ 30S | 重复40个循环
72℃ 30S |
72℃ 5min
(2)芯片杂交
(3)检测信号分析，最后用General Scanning公司的芯片信号分析系统Scanarray3000扫描并分析结果；
所说的芯片杂交是：
取含荧光标记标本DNA目的片段样品2μl，与13μl Easy Hyb杂交液(罗氏公司)混匀，98℃变性7min，冰浴后取15μl滴于芯片表面，覆盖盖玻片，置于40℃湿盒中杂交60min，然后在洗液I中室温避光漂洗10min，晾干。
所说的上游和下游引物如表3所示：
表3 23s RNA基因引物序列及耐药基因引物序列
| 基因 | 引物序列 | Tm | 产物长度(bp) |
| 23s rRNA基因 | 5’-GCGATTTCYGAAYGGGGRAACCC-3’ | 68.7 | 350～420 |
| 5’-CY5-AGTACCGTGAGGGAAAGGCGAA-3’ | 64.9 | ||
| mecA基因 | 5’-CY3-GGTTACGGACAAGGTGAAATACTG-3 | 60.0 | 93 |
| 5’-GTGAGGTGCGTTAATATTGCCATTA-3 | 62.8 | ||
| VanA/B基因 | 5’-GGGCTGCGATATTCAAAGCTC-3 | 61.6 | 294 |
| 5’-CY3-GCACACCCGACCTCACAGC-3 | 61.6 | ||
| PBP2b基因 | 5’-TGACCATTGATTTGGCYTTCCAAG-3 | 62.2 | 651 |
| 5’-CY3-GCATGGGCGTRTAGTTATCAAACTG-3 | 59.9 | ||
| SHV基因 | ACC GCT GGG AAA CGG AAC T | 61.7 | 306 |
| Cy3-CCC GCA GAT AAA TCA CCA CAA T | 61.5 | ||
| CTX-M-1组基因 | CGA TAA CGT GGC GAT GAA TAA G | 58 | 456 |
| Cy3-TTA GCC GCC GAC GCT AAT A | 58 | ||
| CTX-M-13组基因 | CTG CTT AAT CAG CCT GTC GAG A | 58 | 475 |
| Cy3-CCG CAA TAT CAT TGG TGG TG | 58 |
上表中所列各对引物均采用Cy3或Cy5标记其中一条引物的5’端，除23s rRNA基因引物采用Cy5标记外，其余引物均采用Cy3标记。
本发明具有如下优点：
(1)本发明的耐药细菌检测芯片可将临床常见耐药菌的鉴定与耐药谱测定同步完成，检测过程简便、快速；
(2)本发明的耐药细菌检测芯片具有检测灵敏、特异，可将临床标本中存在的常见致病细菌鉴定到菌种；
(3)本发明的耐药细菌检测芯片所用探针设计方法简单，易行，可根据实际需要扩展检测细菌的范围；
(4)采用2种不同的荧光分别标记鉴定引物和耐药基因引物，可在后续分析中采用两种激发光进行扫描，在实现细菌鉴定与耐药谱测定同步检测的同时，将两类杂交信息分别进行分析，提高分析的特异性。
附图说明
图1是本发明包括43种探针的耐药细菌检测芯片用于检测实际临床标本的结果，显示，所检测标本中有携带mecA基因的金葡菌，即甲氧西林耐药金葡菌，表明本发明将菌种鉴定与耐药基因检测同步进行，一次检测获得病原学诊断的完整数据的特点，具有非常高的实用意义。
其中，左图为菌种鉴定扫描图，是635nm扫描结果，最左侧一排纵向探针为通用探针，其阳性提示存在细菌扩增产物，探针3为葡萄球菌通用探针，其阳性表示存在葡萄球菌属扩增产物，探针2为金葡菌探针，其阳性表示存在金葡菌扩增产物，结果显示所检测的标本含有金葡菌；
右图为耐药基因检测结果扫描图，所示探针为mecA基因探针，其阳性表示所检测标本中含有mecA基因。
图2为芯片探针的分布示意图。
图3为芯片点样的示意图，矩阵即如图分布.
具体实施方式
实施例1 探针设计和芯片制作
根据不同细菌已知的23S rRNA基因序列以及耐药基因序列，设计长度相近的探针，约20mer。如表1和表2所示。
将合成的寡核苷酸探针溶于离子水中，并与点样溶液(spotting solution)等体积混合，使终浓度为75pmol/μl；利用Cartesian公司的微阵列芯片制作系统将探针点阵在经醛基修饰的载玻片表面；置于相对湿度70％，室温条件下经48～72小时进行固定；然后，室温下将载玻片浸入0.2％SDS中振荡数分钟，再浸入双蒸水中振荡数分钟，再浸入100℃双蒸水30秒，晾干，备用。
实施例2 标本DNA目的片段的荧光标记
设计两对引物，并将每对引物中一条的5’端标记Cy3或Cy5，利用PCR扩增产生荧光标记的标本DNA目的片段，其中模板为细菌基因组DNA，23s RNA基因引物序列及耐药基因引物序列见表3。扩增体系如下：标本DNA溶液2μl与23μl PCR扩增体系混匀(扩增体系包括2.5μl 10×PCR反应缓冲液5nmol dATP，5nmoldTTP，5nmol dGTP，5nmol dCTP，各15pmol的上游及下游引物，)。此体系在95℃保温5min，然后以95℃30S，55℃30S，72℃30S循环40次，最后72℃保温5min。
实施例3 标记的目的片段与芯片杂交
取含荧光标记标本DNA目的片段样品2μl，与13μl Easy Hyb杂交液(罗氏公司)混匀，99℃变性5min，冰浴后取15μl滴于芯片表面，覆盖盖玻片，置于40℃湿盒中杂交60min，然后在洗液I(1×SSC，0.1％SDS)中室温避光漂洗10min，晾干。
实施例4 信号检测和分析
杂交后DNA芯片用General Scanning公司的芯片信号分析系统Scanarray3000进行扫描分析，采用635nm和532nm波长同时扫描芯片，记录扫描图像。以635nm波长激发的杂交信号判读菌种鉴定结果，以532nm波长激发的杂交信号判读耐药结果。然后与相应临床标本的常规检测结果进行对比。
实施例5 临床血标本检测
50份血标本按前述方法进行标本处理、制备模板DNA、目的片段的荧光标记，并采用本发明制备的芯片进行杂交以及信号检测与分析。结果显示，芯片检测结果与临床常规检测结果的符合率为100％。用本发明耐药细菌检测芯片检测有耐药细菌存在的临床标本敏感性可达90％以上，特异性可达100％。证实本发明耐药细菌检测芯片，从临床标本处理、PCR扩增(标本DNA目的片段的荧光标记)，到获得检测结果仅需4小时的时间，可大大缩短疾病的诊断时间，为感染性疾病患者的救治赢得宝贵时间。
本发明还可用于尿、胸水、腹水、脑脊液标本检测。
表4是检测结果与临床微生物实验室常规检测结果对比(血标本芯片与常规检测方法比较)。
表4
细菌名称 常规方法检 芯片方法检出 符合份数
出例数 例数
革兰阴性菌 36 36 36
甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌 3 3 3
甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌 2 2 2
甲氧西林敏感凝固酶阴性葡萄球菌 20 20 20
甲氧西林耐药凝固酶阴性葡萄球菌 1 1 1
屎肠球菌 7 7 7
青霉素不敏感肺炎链球菌 1 1 0
李斯特菌 2 2 2
革兰阴性菌 14 14 14
大肠埃希菌 4 4 4
肺炎克雷伯菌 3 3 3
铜绿假单胞菌 2 2 2
洋葱伯克霍尔德菌 3 3
甲型副伤寒杆菌 1 1 1
摩根摩根菌 1 1 1
合计 50 50 50
SEQUENCE LISTING
<110>复旦大学附属华山医院；中国科学院上海微系统与信息技术研究所
<120>耐药菌检测芯片及其制备方法和应用方法
<130>20041019
<160>33
<170>PatentIn version 3.3
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tttttttttt ttttttacgg agttacaaaa gaaagttata a 41
Claims (9)
1、一种耐药细菌检测芯片，在一张经修饰的载玻片上，固定有一系列寡核苷酸点阵探针，其特征在于：
(1)所说的探针是针对不同细菌23S rRNA基因特异序列及其主要耐药基因包括mecA基因、PBP2B基因、vanA基因、vanB基因、SHV基因和CTX-M基因的特异序列或突变位点设计的；
(2)每一探针的熔解温度(Tm)相近；
(3)突变位点尽可能位于探针的中间；
2、按权利要求1所述的耐药细菌检测芯片，其特征在于：所说的探针主要针对23SrRNA基因，mecA基因，PBP2B基因，vanA基因，vanB基因，SHV基因，CTX-M基因。
3、按权利要求1所述的耐药细菌检测芯片，其特征在于：所说的针对不同细菌23S基因特异序列设计的探针如下表所示：
编号 探针 序列
1 通用探针 NH2-poly(T)16-GACCGATAGTGAACCAGTACCG
2 金葡菌 NH2-poly(T)16-CGGAGTTACAAAGGACGACAT
3 葡萄球菌通用探针 NH2-poly(T)16-GTAGGACACTCTATACGGAGAC
4 肠球菌通用探针 NH2-poly(T)16-GAGGTAGACGCAGAGAACTGAA
5 粪肠球菌 NH2-poly(T)16-CGAAATGCTR(A/G)ACAACACCTAG
6 屎肠球菌 NH2-poly(T)16-CGAAATGTGGAAGACACCTA
7 肺炎链球菌1 NH2-poly(T)16-AGAAGAATGATTTGGGAAGATC
8 肺炎链球菌2 NH2-poly(T)16-GTAGGACTGCAATGTGGACTC
9 大肠埃希菌1 NH2-poly(T)16-CCAGAGCCTGAATCAGTGTGT
10 大肠埃希菌2 NH2-poly(T)16-CCAGAGCCTGAATCAGTATGTG
11 铜绿假单胞菌 NH2-poly(T)16-GCTTCATTGATTTTAGCGGAAC
12 变形杆菌属1 NH2-poly(T)16-AGCAGTGTCAGGAGAACGGTCT
13 变形杆菌属2 NH2-poly(T)16-AGCCCCGTATCTGAAGATGCT
14 洋葱伯克霍尔德菌 NH2-poly(T)16-GTATTGTTAGCCGAACGCTCT
15 嗜麦芽窄食单胞菌 NH2-poly(T)16-CCCTGTATCTGAAAGGGCCA
16 阴沟肠杆菌 NH2-poly(T)16-CCCGTACACGAAAATGCAC
17 鲍曼不动杆菌 NH2-poly(T)16-ACGAAAGGGCACACATAATGAT
18 脆弱拟杆菌 NH2-poly(T)16-ACGGCATGTGTGGGGTT
19 阴沟肠杆菌2 NH2-poly(T)16-AAAGTCGCACGGTACAGG
20 阴沟肠杆菌3 NH2-poly(T)16-CACGAAAGCACACAGGCT
21 普通变形杆菌 NH2-poly(T)16-CAATAGCAGCATCAGGAGAA
22 摩氏摩根菌 NH2-poly(T)16-TCTGAAAGCACTGGTGTTGT
23 弗劳地柠檬酸杆菌 NH2-poly(T)16-AAAAGTGCATGTGTTGTGAAC
24 洛菲不动杆菌 NH2-poly(T)16-AGGGCTTATATGATGATGTCG
25 产气肠杆菌 NH2-poly(T)16-AATGCACAGGTTGTGAACTC
26 肺炎克雷伯菌4 NH2-poly(T)16-AATGCACAGGCTGTGAACTC
27 伤寒沙门菌 NH2-poly(T)16-AAAGCGCATATGCTGTGA
28 其他沙门菌属 NH2-poly(T)16-AAAGCGCATGTGCTGTGA
29 肺炎克雷伯菌3 NH2-poly(T)16-CCCGTACACCAAAATGCA
30 分枝杆菌 NH2-poly(T)16-CGGCTGAGAGGCAGTCAG
31 消化链球菌 NH2-poly(T)16-CAGAATAGAGACACTTTAAGAAGAG
32 消化球菌 NH2-poly(T)16-AAAGATATAGCGTTTTAGCAGAAT
33 李斯特菌 NH2-poly(T)16-ACGGAGTTACAAAAGAAAGTTATAA
4、按权利要求1所述的耐药细菌检测芯片，其特征在于：所述的针对不同耐药基因特异序列或突变位点设计的探针如下表所示：
编号 探针 序列(5’＞3’)
34 mecA NH2-poly(T)16-GCGCTATAGATTGAAAGGATC
35 vanAN NH2-poly(T)16-GCGCGTTCAGGCTCATC
36 vanBN NH2-poly(T)16-GCGGGCATCGCCGTTC
37 pbp2bm NH2-poly(T)16-CTCAGGCTTACGGTTCATTC
38 CTX-M-1组 NH2-poly(T)16-AGCTGGTGACATGGATGAAA
39 CTX-M-13组 NH2-poly(T)16-ACCGCCATTCCCGGCGA
40 SHV-1(1-12) NH2-poly(T)16-GGAGCTGGCGAGCG
41 SHV-1(1-11) NH2-poly(T)16-CTGGCGAGCGGGGT
42 SHV-11 NH2-poly(T)16-CTGGCGAACGGGGT
43 SHV-12 NH2-poly(T)16-GGAGCTAGCAAGCGGG
44 SHV通用探针 NH2-poly(T)16-TTATCGCCGATAAGACCG探针长度相近为20mer。
5、按权利要求1或2或3或4所述的耐药细菌检测芯片的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)根据所设计的寡核苷酸探针进行探针的合成；
(2)用去离子水将合成的探针稀释，并与点样溶液(spotting solution)等体积混合，使终浓度为75pmol/μl；
(3)载玻片表面使用醛基修饰；
(4)利用Cartesian公司的微阵列芯片制作系统将探针点阵在经醛基修饰的载玻片表面；
(5)置于相对湿度70％，室温条件下经48～72小时进行固定；
(6)室温下将载玻片浸入0.2％SDS中振荡数分钟，再浸入双蒸水中振荡数分钟，再浸入100℃双蒸水30秒，晾干，备用。
6、按权利要求5所述的耐药细菌检测芯片的制备方法，其特征在于所说的寡核苷酸探针的5’末端需附加一定长度16mer的连接臂(Poly T)，该连接臂的5’末端需进行氨基修饰。
7、按权利要求1所述的耐药细菌检测芯片的应用方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)标本处理：取1～1.5ml临床标本1,500rpm离心5分钟，吸取上清，弃沉淀；
12,000rpm离心5分钟，弃上清，加入1.5ml ddH2O重悬沉淀；12,000rpm离心5分钟，弃上清，再加入1.5ml ddH2O重悬沉淀；12,000rpm离心5分钟，弃上清，加入100μl STET、2μl溶葡萄球菌酶(1mg/ml)振荡混匀，经37℃10分钟，95℃10分钟处理；5,000rpm离心1分钟，留取上清作为扩增模板，获得待测标本的DNA，置4℃保存备用；
(2)荧光标记：获得待测标本的DNA后，进行荧光标记处理：
取制备好的标本DNA溶液2μl与23μl PCR扩增体系混匀，所述扩增体系包括2.5μl 10×PCR反应缓冲液5nmol dATP，5nmol dTTP，5nmol dGTP，5nmol dCTP，各15pmol的上游及下游引物，其中一条引物有Cy3或Cy5标记，1.25U DNA聚合酶，通过以下热循环过程制备荧光标记的标本DNA目的片段：在95℃保温5min，然后以95℃30S，55℃30S，72℃30S循环40次，最后72℃保温5min；
(3)芯片杂交；
(4)检测信号分析，最后用General Scanning公司的芯片信号分析系统Scanarray3000扫描并分析结果；
8、按权利要求7所述的耐药细菌检测芯片的应用方法，其特征在于所说的芯片杂交是：
取含荧光标记标本DNA目的片段样品2μl，与13μl Easy Hyb杂交液混匀，98℃变性7min，冰浴后取15μl滴于芯片表面，覆盖盖玻片，置于40℃湿盒中杂交60min，然后在洗液中室温避光漂洗10min，晾干。
9、按权利要求7所述的耐药细菌检测芯片的应用方法，其特征在于所说的上游和下游引物如下： 基因 引物序列 Tm
产物长度(bp)
23s rRNA基因
5’-GCGATTTCYGAAYGGGGRAACCC-3’
68.7
350～420
5’-CY5-AGTACCGTGAGGGAAAGGCGAA-3’
64.9
mecA基因
5’-CY3-GGTTACGGACAAGGTGAAATACTG-3
60.0
93
5’-GTGAGGTGCGTTAATATTGCCATTA-3
62.8
VanA/B基因
5’-GGGCTGCGATATTCAAAGCTC-3
61.6
294
5’-CY3-GCACACCCGACCTCACAGC-3
61.6
PBP2b基因
5’-TGACCATTGATTTGGCYTTCCAAG-3
62.2
651
5’-CY3-GCATGGGCGTRTAGTTATCAAACTG-3
59.9
SHV基因
ACC GCT GGG AAA CGG AAC T
61.7
306
Cy3-CCC GCA GAT AAA TCA CCA CAA T
61.5
CTX-M-1组基因
CGA TAA CGT GGC GAT GAA TAA G
58
456
Cy3-TTA GCC GCC GAC GCT AAT A 58
CTX-M-13组基因
CTG CTT AAT CAG CCT GTC GAG A
58
475
Cy3-CCG CAA TAT CAT TGG TGG TG 58
表中所列各对引物均采用Cy3或Cy5标记其中一条引物的5’端，除23s rRNA基因引物采用Cy5标记外，其余引物均采用Cy3标记。
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| C10 | Entry into substantive examination | ||
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| C14 | Grant of patent or utility model | ||
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Granted publication date: 20070314 Termination date: 20141021 |
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| EXPY | Termination of patent right or utility model |