CN1174104C

CN1174104C - 人工序列模板引物集及用途

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Publication number: CN1174104C
Application number: CNB011264233A
Authority: CN
Inventors: 卫曹; 曹卫; 张跃建; 宋军
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2001-08-08
Filing date: 2001-08-08
Publication date: 2004-11-03
Anticipated expiration: 2021-08-08
Also published as: CN1405320A

Abstract

本发明提供了一种通过使用人工序列模板检测和/或定量核酸的方法。本发明的人工序列模板引物集包括特异性结合于被检测序列并引发目的核酸扩增反应的寡核苷酸引物对，其中至少一个引物是人工序列模板引物，该人工序列模板引物包括：(a)特异结合区；(b)公用区，该公用区位于人工序列模板引物的5′端并且具有报告分子结合区和公用引物区。本发明还提供了相应的人工序列模板核酸检测方法。本发明可易用、灵敏、准确的检测和/或定量样品中病原体和基因表达。

Description

人工序列模板引物集及用途

技术领域

本发明涉及核酸检测领域，更具体地，涉及一种人工序列模板引物集，以及使用该人工序列模板引物集来检测和/或定量核酸的方法。

背景技术

近来，为了满足快速准确地检测和/或定量病原体(如病毒、细菌、真菌)，以及正常和不正常基因中的特异性核酸序列，已有开发了大量技术。这些技术在检测和定量食品、环境样品、种畜和其他类型物质中微生物方面有着广阔的用途，在这些场合下需要监测某种推定微生物是否存在。其他应用包括用于法医学、分子病理学、人类学、考古学和生物学等方面。

实现这类任务的一种常见做法是核酸杂交。该方法基于两条核酸链在合适条件下形成双链结构的能力，其中这两条核酸链含有互补或基本互补的序列从而能够特异性地结合。为了检测和/或定量特定的核酸序列(称为“靶序列”)，需制备标记的寡核苷酸(“探针”)，该探针含有与靶序列互补的序列。为了灵敏地检测和/或定量微量的遗传物质，已经开发了许多更成熟的技术，它们通常涉及在测试样品中扩增靶核酸(DNA或RNA)并随后进行检测，其中包括聚合酶链反应(PCR)、连接酶链反应(LCR)、链取代扩增(SDA)、转录介导扩增(transcription mediatedamplication，TMA)和自动维持合成反应(3SR)。

尽管所有这些技术都是检测和鉴别样品中微量靶核酸的有利工具，但是它们有各种不同的问题，这些问题限制了它们在临床实验室环境下用于常规操作时的应用性。最困难的问题之一是，在每种测试中扩增靶核酸以便随后进行检测和定量分析的条件是不同的。换言之，没有利于测试标准化的统一条件。

此外，对于目前的基于靶序列扩增的核酸检测和/或定量方法而言，准确地检测和/或定量具有不同基因型或突变(如导致抗药性的突变)的病原体一直是众所周知的挑战。

分支DNA(bDNA)法是一种新兴的信号扩增技术，它可提供高重复性和准确度。然而，该方法本身的灵敏度有限，且难以为常规实验室所广泛采用。

因此，本领域迫切需要开发易用、灵敏、准确的检测和/或定量样品中病原体和基因表达的分析技术。

发明内容

本发明的目的就是提供一种可用于检测和/或定量样品中病原体和基因表达的易用、灵敏、准确的分析技术。本发明的新技术可以克服现有技术中的许多局限。

在本发明的第一方面，提供了一种核酸检测方法，它包括步骤：

(1)在含有报告分子的核酸扩增反应体系中，用人工序列模板引物集待测样品进行核酸扩增反应，其中所述引物集包括特异性结合于被检测核酸序列并引发目的核酸扩增反应的引物对，且至少一个引物是人工序列模板引物，该人工序列模板引物包括：

(a)特异结合区，该特异结合区位于人工序列模板引物3′端，用于与被检测核酸序列特异性结合；

(b)公用区，该公用区位于人工序列模板引物的5′端并且具有报告分子结合区和公用引物区，报告分子可特异性结合于该报告分子结合区或该报告分子结合区的互补链，且所述的报告分子在下列两种情况下的状态不同，从而产生可检测的信号：(i)结合于报告分子结合区或该报告分子结合区的互补链，和(ii)报告分子被切断或被取代；

(2)检测报告分子所产生的可检测信号。

在一优选例中，所述报告分子的数量大于或等于人工序列模板引物的数量。

在另一优选例中，使用两种或两种以上不同的人工序列模板引物集，这些人工序列模板引物集分别特异性地结合于不同被检测体的靶序列、同一被检测体的不同靶序列、同一被检测体的相同靶序列的不同区域、或其组合，并且这些人工序列模板引物集的报告分子结合区分别与相同或不同的报告分子发生特异性结合。

在本发明的第二方面，提供了一种人工序列模板引物集，所述引物集包括特异性结合于被检测序列并引发目的核酸扩增反应的寡核苷酸引物对，其中至少一个引物是人工序列模板引物，该人工序列模板引物包括：

(b)公用区，该公用区位于人工序列模板引物的5′端并且具有报告分子结合区和公用引物区，报告分子可特异性结合于该报告分子结合区或该报告分子结合区的互补链，且所述的报告分子在下列两种情况下的状态不同，从而产生可检测的信号：(i)结合于报告分子结合区或该报告分子结合区的互补链，和(ii)报告分子被切断或被取代。

在一优选例中，人工序列模板引物还在特异结合区和报告分子结合区之间存在间隔区，和/或在公用引物区和报告分子结合区之间存在间隔区，所述的间隔区为1-20bp，较佳地为5-10bp。

在另一优选例中，所述的人工序列模板引物集还包括用于增加被检测核酸模板数量的扩增模板引物。

在另一优选例中，所述人工序列模板引物的公用引物区的长度为0bp。

在本发明的第三方面，提供了一种核酸检测试剂盒，它含有本发明所述的人工序列模板引物集。

附图说明

图1显示了本发明的人工序列模板引物的两种结构示意图。

图2显示了本发明人工序列模板引物集的各种组合形式。

图3显示了本发明人工序列模板检测中信号产生几种示意图。

图4是本发明一种核酸检测方法的示意图，其中使用的人工序列模板引物集含有一个人工序列模板引物，其报告分子结合与人工序列模板的报告分子结合区。

图5是本发明一种核酸检测方法的示意图，其中使用的人工序列模板引物集含有一个人工序列模板引物、一个常规引物、一个公用引物和一个扩增模板引物，其报告分子结合与人工序列模板的报告分子结合区。

具体实施方式

如本文所用，下列词语/术语具有下列含义，除非另外说明。

“核酸”：核糖核酸(RNA)、脱氧核糖核酸(DNA)、RNA或DNA的多核苷酸类似物、RNA或DNA的寡核苷酸类似物。

“模板”：能够被核酸聚合酶扩增的核酸分子的全长或部分序列。模板可以是RNA或DNA、或其类似物，并且可以是单链、双链或部分双链的。

“人工序列模板(AT)引物”：人工序列模板引物是合成的寡核苷酸序列。参见图1A，人工序列模板引物的3′端有特异结合区，该特异结合区互补于靶序列并作为引物在扩增反应中延伸。此外，人工序列模板引物还含有公用区，该公用区位于人工序列模板引物的5′端并且具有报告分子结合区(或其互补序列)和公用引物区。报告分子可特异性结合于该报告分子结合区或该报告分子结合区的互补链。人工序列模板引物可以用本领域技术人员已知的各种方法合成。

一种特殊形式的人工序列模板引物的公用引物区的长度为0bp，如图1B所示。

如本文所用，“报告分子结合区”指与人工序列模板引物上报告分子发生结合的区域。当然，报告分子可以直接结合于人工序列模板引物上的该报告分子结合区，也可结合于该结合区的互补链(为方便起见，人工序列模板引物上的与报告分子序列一样的区域仍被称为“报告分子结合区”)。

此外，一种优选的人工序列模板引物还在特异结合区和报告分子结合区之间存在间隔区，和/或在公用引物区和报告分子结合区之间存在间隔区，所述的间隔区为1-20bp(较佳地为3-10bp，更佳地为5-10bp)。添加间隔区的主要目的是：(1)调节人工序列模板引物的Tm，使人工序列模板引物集中各引物的Tm接近或相同；(2)防止某些二级结构(如发夹结构、二聚体等)的形成；和/或(3)防止空间位阻。然而应理解，并不是所有情况下都需要间隔区，有时并不需要间隔区。取决于待检测的序列，本领域的技术人员能够确定人工序列模板引物是否需要间隔区，以及间隔区的长短和组成。

“报告分子”是一种用于产生可检测信号的分子。所述的报告分子在下列两种情况下的状态不同，从而产生可检测的信号：(i)结合于报告分子结合区或其互补序列区域，和(ii)报告分子被切断或被取代。合适的报告分子例子是基于荧光共振能量转移(FRET)原理的探针和含稀土元素的寡核苷酸链。

荧光共振能量转移(FRET)：是利用不同荧光物质激发光波长、发射光波长间的相互作用，对某些特定波长光进行检测的一种信号检测原理。基于此原理产生信号的探针被称为荧光共振能量转移型探针。特别合适的荧光共振能量转移型探针包括(但并不限于)：Taqman探针、分子信标(molecular beacon)(图3D)、FRET双探针(图2J)和肽核酸(peptide nucleic acid)信号探针(简称为PNA信号探针)。

“Taqman探针”是一种在其5′端带有报告基团并且在3′端带有猝灭基团的寡核苷酸，所述的猝灭基团会抑制报告基团产生可检测的信号(例如荧光)。Taqman探针设计是现有技术，并且可以从公开途径获得有关信息(Heid CA，Stevens J，Livak KJ，Williams PM；Real Time Quantitaive PCR，Genome Res.1996 Oct.；6(10)：986-94)。

图3显示了本发明人工序列模板检测中信号产生几种示意图。图3A和图3B为Taqman探针因切割而产生可检测信号，图3C为FRET双探针因酶切或取代而产生可检测信号。图3D为分子信标因杂交而产生可检测信号。

“人工序列模板”指在本发明的PCR过程中，扩增出的掺入了人工序列模板引物的核酸序列，或其反义核酸序列。这些人工序列模板既具有对应于靶序列的核苷酸序列，又具有对应于人工序列模板引物公用区(包括报告分子结合区、公用引物区和间隔区)的核苷酸序列。在随后的PCR扩增循环中，这些人工序列模板作为模板起作用。

本发明所公开的方法原则上归为信号扩增法。其关键是使用了合适的含人工序列的核酸序列作为信号扩增的模板(在此称为“人工序列模板”)，因此相应的方法被称为“人工序列模板扩增的核酸分析”(AT分析)。AT分析可灵敏、准确和标准化地检测和/或定量靶核酸分子。

在本发明中，对于待测样品没有限制，只要其中含有遗传物质即可。代表性的待测样品包括(但并不限于)：DNA样品、RNA样品、和从RNA经逆转录得到的cDNA样品，以及其他形式的修饰过的多聚核苷酸。

在本发明的人工序列模板引物中，对所述的特异结合区的长度没有特别限制，通常其长度为6-35bp，较佳地为15-25bp。对于所述公用区的也没有特别限制，通常其长度为8-100bp，较佳地为20-60bp，更佳地约为30-50bp。

人工序列模板引物中含有的核苷酸通常选自A、T、C、G。然而，在所述的人工序列模板引物中含有其他一些核苷酸以产生特殊的检测效果，如增加特异性、掺入荧光分子、或增加与模板的结合等。合适的例子但不限于选自下组的核苷酸：isoG、isoC、2′-O-甲基-G、2′-O-甲基-C、及其组合。

在本发明的反应体系中，报告分子与人工序列模板引物的数量关系没有特别限制。然而，较佳地，所述报告分子的数量应大于或等于人工序列模板引物的数量，通常报告分子与人工序列模板引物之比大于1∶1-10∶1，更佳地为1.5∶1-5∶1。这样，在反应体系中，人工序列模板引物便基本上都处于与报告分子结合的状态。

当报告分子是Taqman探针时，Taqman探针与人工序列模板引物报告分子结合区的Tm，宜高于人工序列模板引物特异结合区与模板的Tm。通常，高出2-15℃，较佳地高出5-12℃。

此外，在本发明的人工序列模板引物集中还可包括一个或多个“扩增模板引物”。如本文所用，“扩增模板引物”指用于增加被检测核酸序列(模板)数量的引物。扩增模板引物结合于待检测序列的上游或下游，在扩增反应中可有效地提高模板的数量，从而提供检测的灵敏度。应理解，“扩增模板引物”是常规引物，只是其作用是提高待检测模板的数量而已。

在本发明中，如图2所示，人工序列模板引物集有多种组合形式，其中包括(但并不限于)：

(1)下游为人工序列模板引物，上游为常规引物，报告分子与人工序列模板引物结合(图2A)，或上下游引物位置互换(图2B)；

(2)图2A的引物集与一条扩增模板引物形成的组合(图2C)，图2B的引物集与一条扩增模板引物形成的组合(图2D)。即上下游为常规引物对，中间为一条人工序列模板引物，报告分子与人工序列模板引物结合。

(3)两条人工序列模板引物与两条扩增模板引物构成的组合(图2E)。即上下游为常规引物对，中间为一对方向相对的人工序列模板引物，报告分子与人工序列模板引物结合；

(4)上下游为常规引物对，中间两条人工序列模板引物方向相反，报告分子与人工序列模板引物结合(图2F)；

(5)下游为人工序列模板引物，上游为常规引物，报告分子与人工序列模板引物的互补序列结合(图2G)，或上下游引物位置互换(未示出)；

(6)图2G的引物集与一条扩增模板引物形成的组合(图2H)，即上下游为常规引物对，中间为一条人工序列模板引物，报告分子与人工序列模板引物互补序列结合，或人工序列模板引物方向变换；

(7)上游为常规引物，下游为人工序列模板引物，报告分子分别标记在人工序列模板引物及报告分子上(图2I)，或人工序列模板引物方向变换(未示出)；或者图2I的引物集与一条扩增模板引物形成的组合(图2J)；

(8)图2E+图2G的组合，即上下游为常规引物对，中间为一对反向相对的人工序列模板引物，报告分子与人工序列模板引物互补序列结合(未示出)

(9)图2F+图2G的组合，即上下游为常规引物对，中间两条人工序列模板引物方向相反，报告分子与人工序列模板引物互补序列结合(未示出)；

(10)图2E+图2I的组合，即上下游为常规引物对，中间为一对相反相对的人工序列模板引物，报告分子分别标记在人工序列模板引物及报告分子上(未示出)；

(11)图2F+图2I的组合，即上下游为常规引物对，中间为两条方向相反的人工序列模板引物，报告分子分别标记在人工序列模板引物及报告分子上(未示出)。

在本发明方法中，在同一被检测核酸序列上可同时放置一个或多个人工序列模板引物集。这样可以同时检测被检测核酸序列上的不同位置。

在本发明中，对于与人工序列模板引物结合的报告分子而言，不同的人工序列模板引物可结合相同的报告分子，也可结合不同的报告分子(例如带有发不同荧光的报告基团和相应猝灭基团的报告分子，序列相同或不同的报告分子)。

对于人工序列模板引物集扩增出的人工序列模板的长度没有特别限制。按人工序列模板引物集的两个引物的特异结合区的3′端在模板上相距的距离表示，通常为1bp-10kb，较佳地为1-2kb，更佳地为1-500b，最佳地为1-100bp。尤其是是当间距小于100bp时，可设计针对例如病原体高保守区的引物集，从而降低假阴性率。此外，间距越短，越可发挥人工序列模板的共性。

下面结合附图进一步说明本发明。

扩增模式(一)、使用含人工序列模板引物和常规引物的引物集(图2A所示的组合)进行核酸扩增分析

现参见图4。在该例子中，使用一个人工序列模板引物集，该引物集包括一个人工序列模板引物1和一个常规引物2。此外，反应体系中还包括公用引物3和报告分子4构成。在该例子中，待检测的样品是RNA或DNA。

步骤1：将引物集和待测样品置于反应体系中。

步骤2：在合适的条件下，发生退火(或杂交)，即人工序列模板引物1的3′端的特异结合区结合于靶RNA或DNA序列。

步骤3：在逆向转录酶(对于RNA靶序列)或DNA聚合酶(对于DNA靶序列)，人工序列模板引物的3′端向靶序列5′端延伸，形成RNA/DNA或DNA/DNA双链。

步骤4：形成的双链核酸在合适的条件下变性，形成单链靶序列和新合成的DNA序列(即人工序列模板)。或者用RNase水解RNA链，形成新合成的DNA序列(即人工序列模板)。

必要时，在合适的条件下重复上述步骤3-4。

步骤5：常规引物2结合于新合成的DNA序列的互补区域。

步骤6：在DNA聚合酶存在下，常规引物2的3′端向人工序列模板序列5′端延伸，双链DNA(该双链中新合成的DNA序列也是人工序列模板)。当常规引物2的3′端延伸到结合于报告分子结合区的报告分子处时，会发生以下3种情况：

(1)延伸停止；

(2)继续延伸，将报告分子从人工序列模板上取代下来；

(3)继续延伸，并切断或破坏报告分子。

在第一和第二种情况下，报告分子仍是完整的，因此不会产生可检测信号。而在第三种情况下，由于报告分子(如Taqman探针)5′端上的猝灭基团被DNA聚合酶(如Taq聚合酶)的5′核酸酶活性所水解，因此在Taqman探针3′端处的报告基团就不再被猝灭，从而导致产生可检测信号(如荧光信号)。

步骤7：在下一循环中，在变性后的退火时，会发生三种情况：

7a：人工序列模板引物1结合于含常规引物2序列的新合成的DNA序列。

7b：公用引物3结合于含常规引物2序列的新合成的DNA序列。

7c：常规引物2结合含人工序列引物1序列的人工序列模板(类似于步骤5，未示出)。

步骤8：分三种情况：

8a：人工序列模板引物1向含常规引物2序列的DNA链的5′端延伸，形成DNA双链。在下一轮循环中，这些DNA双链就是新的人工序列模板。

8b：公用引物3向含常规引物2序列的DNA链的5′端延伸，形成DNA双链。在下一轮循环中，这些DNA双链就是新的人工序列模板。

8c：与步骤6中相同，当常规引物2的3′端延伸到结合于报告分子结合区的报告分子处时，会发生以下3种情况：

(1)延伸停止；

(2)继续延伸，将报告分子从人工序列模板上取代下来；

(3)继续延伸，并切断或破坏报告分子。

步骤9：重复步骤7和8。

在经过若干循环后，与PCR原理相同，因报告分子被切断而产生的可检测信号也是成指数级(或近似于指数关系)增加的。在可检测信号是荧光的情况下，这些信号可用实时荧光阅读仪，如Roche′s LightCycler，或者ABI GeneAmp 5700或GeneAmp 7700等进行实时测定；也可使用静态荧光阅读仪，在核酸扩增反应结束后进行荧光测定。

扩增模式(二)、使用图2C所示的人工序列模板引物集进行核酸扩增分析

现参见图5。在该例子中，使用一条人工序列模板引物1，常规引物2和扩增模板引物5组成一个引物集。反应体系中还包括公用引物3及报告分子4。在该例子中，待检测的样品是DNA或RNA。

步骤1：将引物集和待测样品置于反应体系中。

步骤2：在合适的条件下，发生退火(或杂交)，此时发生两种情况：

2a：人工序列模板引物1的3′端的特异结合区结合于靶RNA或DNA序列。

2b：扩增模板引物5与靶RNA或DNA序列结合。

步骤3：

3a：对应于上述第一种情况，在逆向转录酶(对于RNA靶序列)或DNA聚合酶(对于DNA靶序列)作用下，人工序列模板引物1的3′端向靶序列5′端延伸，形成RNA/DNA或DNA/DNA双链。

3b：对应于上述第二种情况，在逆向转录酶(对于RNA靶序列)或DNA聚合酶(对于DNA靶序列)作用下，扩增模板引物5的3′端向靶序列5′端延伸，形成RNA/DNA或DNA/DNA双链。

步骤4：形成的双链核酸在合适的条件下变性，形成单链靶序列和新合成的DNA序列(即人工序列模板)。或者用RNase水解RNA链，形成新合成的DNA序列(在第一种情况下，形成人工序列模板；在第二种情况下，提供与常规引物2结合的靶分子核酸序列)。

必要时，在合适的条件下重复步骤2，3和4(任选的)。

步骤5：在下一循环中，在变性后的退火时，会发生四种情况：

5a：常规引物2结合于新合成的含人工序列模板引物1的DNA链。

5b：常规引物2结合于新合成的含扩增模板引物5的DNA链。

5c：人工序列模板引物1的3′端的特异结合区结合于靶RNA或DNA序列(同步骤2a，未示出)。

5d：扩增模板引物5与靶RNA或DNA序列结合(同步骤2b，未示出)。

步骤6：

6a：对应于5a，在DNA聚合酶存在下，常规引物2的3′端向人工序列模板序列5′端延伸，双链DNA(该双链中新合成的DNA序列也是人工序列模板)。当人工序列模板引物2的3′端延伸到结合于报告分子结合区的报告分子处时，会发生以下3种情况：

(1)延伸停止；

(2)继续延伸，将报告分子从人工序列模板上取代下来；

(3)继续延伸，并切断或破坏报告分子。

6b：对应于5b，在DNA聚合酶存在下，常规引物2的3′端向含扩增模板引物5序列的新生链5′端延伸，形成DNA双链。在下一轮循环中，这些DNA双链就是新的人工序列模板。

6c和6d：对应于5c和5d，分别形成新的人工序列模板(同步骤3a和3b未示出)。

步骤7：在下一循环中，在变性后的退火时，会发生四种情况：

7a：常规引物2结合于新合成的含人工序列模板引物1的DNA链(同5a，未示出)。

7b：常规引物2结合于新合成的含扩增模板引物5的DNA链(同5b，未示出)。

7c：人工序列模板引物1的3′端的特异结合区结合于靶RNA或DNA序列(类似于同步骤2a)。

7d：扩增模板引物5与靶RNA或DNA序列结合(同步骤2b，未示出)；

7e：公用引物3结合于含常规引物2序列的新合成的DNA序列。

步骤8：在下一次延伸过程中，可能会发生以下几种情况：

8a：在DNA聚合酶存在下，常规引物2的3′端向人工序列模板序列5′端延伸，双链DNA(该双链中新合成的DNA序列也是人工序列模板)。当人工序列模板引物2的3′端延伸到结合于报告分子结合区的报告分子处时，会发生以下3种情况：

(1)延伸停止；

(2)继续延伸，将报告分子从人工序列模板上取代下来；

(3)继续延伸，并切断或破坏报告分子。

8b：同6b，在DNA聚合酶存在下，常规引物2的3′端向含扩增模板引物5序列的新生链5′端延伸，形成DNA双链。在下一轮循环中，这些DNA双链就是新的人工序列模板。

8c：同6c，形成新的人工序列模板(类似于步骤3a)。

8d：同6d，形成新的人工序列模板(类似于3b)。

8e：公用引物3向含常规引物2序列的DNA链的5′端延伸，形成DNA双链。在下一轮循环中，这些DNA双链就是新的人工序列模板。

步骤9：重复步骤7和8。

在本发明方法中，报告分子也可与人工序列模板上报告分子结合区的互补链结合(图2G和图2H)，或者使用两个人工序列模板及两个常规引物(图2E和2F的组合)，其核酸扩增过程与扩增模式(一)和(二)基本相同，

在本发明中，另一种产生信号的方式是使用FRET双探针，即报告信号基团分别标记在人工序列模板及报告分子上。参见图3C和3C′。此时，人工序列模板引物集包括：一个标记有FRET基团如FAM荧光素的人工序列模板引物1，和一对常规引物2。在反应体系中，还包括用另一FRET基团如标记Dabcyl的报告分子4(寡核苷酸)。

步骤1-5，与扩增模式(一)步骤1-5类似。

在步骤6中：在第一种情况下，在DNA聚合酶存在下，常规引物2的3′端向人工序列模板序列5′端延伸，双链DNA(该双链中新合成的DNA序列也是人工序列模板)。当人工序列模板引物2的3′端延伸到结合于报告分子结合区的报告分子处时，会发生以下3种情况：

(1)延伸停止；

(2)继续延伸，将报告分子从人工序列模板上取代下来；

(3)继续延伸，并切断或破坏报告分子。

在第一情况下，报告分子结合在人工序列模板引物，与其上标记的Dabcyl淬灭人工序列模板引物上的FAM分子，因此不会产生可检测信号。在第二种情况下，虽然报告分子是完整的，但由于新生链取代了报告分子，使报告分子与人工序列模板引物间的相互淬灭被破坏，从而产生可检测信号(见图3C′)。在第三种情况下，报告分子的猝灭基团被DNA聚合酶(如Taq聚合酶)的5′核酸酶活性所水解，因此人工序列模板引物上的报告分子如FAM就不再被猝灭，从而导致产生可检测信号(如荧光信号)(图3C)。

在第二种情况下，在DNA聚合酶存在下，常规引物2的3′端向含扩增模板引物5序列的新生链5′端延伸，形成人工序列模板。

步骤7-9与上述扩增模式(一)中步骤7-9类似。

在经过若干循环后，与PCR原理相同，因报告分子被切断或取代而产生的可检测信号也是成指数级(或近似于指数关系)增加的。在可检测信号是荧光的情况下，这些信号可用实时荧光阅读仪，如Roche′s LightCycler，或者ABI GeneAmp5700或GeneAmp 7700等进行实时测定；也可使用静态荧光阅读仪，在核酸扩增反应结束后进行荧光测定。

本发明具有明显优于现有技术的优点，其主要优点包括：

(1)易于复合式检测

掺入该人工序列模板区可在新合成的DNA序列中引入不属于靶序列的一段序列。而新合成的DNA序列可作为进一步DNA扩增的模板。与不同靶序列的数目无关，新合成的DNA序列是大部分是相同的-人工序列模板区序列，这使得各不同的靶序列被转变成具有共同特性的序列。因此，可以在相同或基本相同的条件下对该DNA序列继续处理或操作，易于实现例如多管同一条件、或一管多种靶序列等复合式检测。

(2)更高的分析灵敏度

通过使用含两个人工序列模板引物的引物集，或者对单个靶序列的不同位点设计多个人工序列模板引物集，可以产生现有技术中单探针模式更高水平的信噪比。

此外，使用扩增模板引物还可进一步提高检测灵敏度。

(3)高准确性

本发明的人工序列模板引物和人工序列模板核酸检测方法，可减少由下列因素导致的假阴性概率：

(a)在靶序列的探针(或引物)结合位点处的二级结构，这些二级结构可能会有效地影响探针(或引物)的结合；

(b)在靶序列的探针(或引物)结合位点处序列的改变，这些变化可以是由于不同的亚型或突变引起的。例如在HCV中，由于使用了各种药物，会导致HCV发生突变或变异。如用常规核酸检测方法，常会导致假阴性。而在各种生物(包括病原体)的遗传物质中找出高保守的短区域(如100bp或更短)是很方便的。利用本发明，可以设计针对这些短的、高保守区域(如40-50bp)的人工序列模板引物集，从而减少假阴性。根据，本发明人用多对人工序列模板引物集HCV突变株的检测，发现假阴性率减少50％。

(c)在样品加工或处理过程中长片段靶序列的断裂，而这种断裂发生在长片段的扩增的中间区域，会导致互补DNA序列复制的停止。

(4)简化或消除多重检测

在需要检测多种病原体时，目前常需要对某种病原体进行单独的检测。这是因为不同检测反应的最佳反应条件各不相同，因此，在同一反应管中进行核酸扩增反应时，各扩增反应的效率难以接近一致，从而难以在同一反应管内同时检测多种病原体。

使用本发明的技术，因为人工序列模板的大部分是相同的，即人工序列模板区，因此便于在使检测各病原体的PCR的反应条件标准化，从而在一管中实现对多种病原体的检测。这使得本发明技术特别适用于献血样品检验等场合。

(5)降低使用荧光标记技术的多倍分析成本

在现有技术中，对于多个待测的靶核酸序列，需要相同数目的荧光标记探针。与此相反，在本发明中，对于检测多个靶序列仅需一种公用报告探针，因此可大大降低成本。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

实施例1

人工序列模板引物核酸扩增检测HCV病毒(RNA病毒)

在该实施例中，设计了包括一个人工序列模板引物和一个常规引物的人工序列模板引物集，反应过程部分如图4所示。

在PCR方案是：从RNA逆转录成DNA：RT(50℃，20分钟，95℃，5分钟)；PCR：50℃，2分钟，94℃5分钟；94℃20秒；和61℃40秒，共40个循环。

人工序列模板引物为：

5-AAGGAACAGG CGGCGACGAA TCAACGACAG AACGCAACCC AACGCTACTC-3′(SEQ IDNO：1)

常规引物：

5′-GTGCCCCCGC AAGACT-3′(SEQ ID NO：2)

使用的Taqman探针序列是：

5′-TCGTCGCCGC CTGTTCCTTA-3′(SEQ ID NO：3)

其中使用的报告基团是6-羧基荧光素(6-carboxyfluorescein，6-FAM)(位于5′端的)，猝灭基团是6-羧基-四甲基罗丹明(6-carboxy-tetramethyl-rhodamine，TAMRA)(位于3′端的)。

检测时使用的检测仪器为ABI GeneAmp 5700，激发光源为卤素灯，波长为488nm。

用上述引物及相应的Taqman探针在ABI5700基因扩增仪进行扩增。结果，加入不同稀释度阳性样品在不同循环(Ct)出现荧光信号，而阴性样品及其他非特异对照样品(含有其他病原体的样品)在扩增反应结束时(Ct＞40)时均未出现荧光信号。

实施例2

人工序列模板扩增检测HBV病毒(DNA病毒)

在PCR方案是：PCR：50℃，2分钟，94℃5分钟；94℃20秒；和61℃40秒，共40个循环。

人工序列模板引物分别为：

5-AAGGAACAGG CGGCGACGAA TCAACGACAG AACCAGCGAT AGCCA GGACA-3′(SEQ IDNO：4)

常规引物：

5′-CCTCCAATCA CTCACCAACC-3′(SEQ ID NO：5)

使用的Taqman探针序列是：

5′-TCGTCGCCGC CTGTTCCTTA-3′(SEQ ID NO：3)

实施例3

人工序列模板扩增检测HCV病毒(RNA病毒)

在该实施例中，设计了包括一个人工序列模板引物、一个常规引物和一个公用引物的人工序列模板引物集，反应过程如图4所示。

人工序列模板引物为：

5-TCATCCACAT CCCACCTCAT CAGGAACAGG CGGCGACGAA TCAACGACAGAACGCAACCC AACGCTACTC-3′(SEQ ID NO：6)

常规引物：

5′-GTGCCCCCGC AAGACT-3′(SEQ ID NO：2)

使用的公用引物序列是：

5′-TCATCCACAT CCCACCTCAT-3′(SEQ ID NO：7)

使用的Taqman探针序列是：

5′-TCGTCGCCGC CTGTTCCTTA-3′(SEQ ID NO：3)

实施例4

人工序列模板扩增检测HCV病毒(RNA病毒)

在该实施例中，设计了包括一个人工序列模板引物、一对常规引物和一个公用引物的人工序列模板引物集，反应过程如图5所示。

人工序列模板引物为：

常规引物1：

5′-GTGCCCCCGC AAGACT-3′(SEQ ID NO：2)

常规引物2：

5′-TGAGTGTCGTACAGC CTCCAGG-3′(SEQ ID NO：8)

使用的公用引物序列是：

5′-TCATCCACAT CCCACCTCAT-3′(SEQ ID NO：7)

使用的Taqman探针序列是：

5′-TCGTCGCCGC CTGTTCCTTA-3′(SEQ ID NO：3)

实施例5

人工序列模板扩增检测HCV病毒(RNA病毒)和HBV病毒(DNA病毒)

在该实施例中，设计了包括两个人工序列模板引物、两对常规引物和一个公用引物的人工序列模板引物集，反应过程如图5所示。

HCV病毒人工序列模板引物为：

HBV病毒人工序列模板引物为：

5′-TCATCCACAT CCCACCTCAT CAGGAACAGG CGGCGACGAA TCATCCAGTCTATGTTTCCC TCTTGTTGCT-3′(SEQ ID NO：9)

HCV病毒常规引物1：

5′-GTGCCCCCGC AAGACT-3′(SEQ ID NO：2)

HCV病毒常规引物2：

5′-TGAGTGTCGTACAGC CTCCAGG-3′(SEQ ID NO：8)

HBV病毒常规引物1：

5′-CCTCCAATCA CTCACCAACC-3′(SEQ ID NO：5)

HBV病毒常规引物2：

5′-AGTTTCCGTC CGAAGGTTT-3′(SEQ ID NO：10)

使用的公用引物序列是：

5′-TCATCCACAT CCCACCTCAT-3′(SEQ ID NO：7)

使用的Taqman探针序列是：

5′-TCGTCGCCGC CTGTTCCTTA-3′(SEQ ID NO：3)

用上述引物及相应的Taqman探针在ABI5700基因扩增仪进行扩增。结果，加入不同稀释度HCV和(或)HBV阳性样品在不同循环(Ct)出现荧光信号，同时含有HBV和HCV阳性样品不影响检测灵敏度，其Ct值主要由高浓度病毒决定。而阴性样品及其他非特异对照样品(含有其他病原体的样品)在扩增反应结束时(Ct＞40)时均未出现荧光信号。

实施例6

人工序列模板扩增检测HCV病毒(RNA病毒)

在该实施例中，设计了包括一个荧光素标记的人工序列模板引物和一对常规引物的人工序列模板引物集，反应过程部分如图8所示。

人工序列模板引物序列为：

5′-AAGGAACAGG CGGCGACGAA TCAACGACAG AACGCAACCC AACGCTACTC-3′(SEQ IDNO：11)

其中使用的报告基团是6-羧基荧光素(6-carboxyfluorescein，6-FAM)(位于5′端的)

常规引物：

5′-GTGCCCCCGC AAGACT-3′(SEQ ID NO：2)

扩增模板引物：

5′-TGAGTGTCGTACAGC CTCCAGG-3′(SEQ ID NO：8)

使用的报告探针序列是：

5′-TCGTCGCCGC CTGTTCCTTA-3′(SEQ ID NO：3)

其中使用的猝灭基团是Dabcyl(即四(4-甲基氨基苯基偶氮)-苯甲酸(位于3′端的)。

用上述引物及相应的Taqman探针在ABI5700基因扩增仪进行扩增。结果，如果仅使用常规引物1和人工序列模板引物进行扩增，与同时加入常规引物和扩增模板引物的人工序列模板引物集相比，其检测灵敏度可相差10～100倍。加入不同稀释度阳性样品在不同循环(Ct)出现荧光信号，而阴性样品及其他非特异对照样品(含有其他病原体的样品)在扩增反应结束时(Ct＞40)时均未出现荧光信号。

此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110>曹，卫

<120>人工序列模板引物集及用途

<130>014338

<160>11

<170>PatentIn version 3.0

<210>1

<211>50

<212>DNA

<213>合成的引物

<400>1

aaggaacagg cggcgacgaa tcaacgacag aacgcaaccc aacgctactc 50

<210>2

<211>16

<212>DNA

<213>合成的引物

<400>2

gtgcccccgc aagact 16

<210>3

<211>20

<212>DNA

<213>合成的引物

<400>3

tcgtcgccgc ctgttcctta 20

<210>4

<211>50

<212>DNA

<213>合成的引物

<400>4

aaggaacagg cggcgacgaa tcaacgacag aaccagcgat agccaggaca 50

<210>5

<211>20

<212>DNA

<213>合成的引物

<400>5

cctccaatca ctcaccaacc 20

<210>6

<211>70

<212>DNA

<213>合成的引物

<400>6

tcatccacat cccacctcat caggaacagg cggcgacgaa tcaacgacag aacgcaaccc 60

aacgctactc 70

<210>7

<211>20

<212>DNA

<213>合成的引物

<400>7

tcatccacat cccacctcat 20

<210>8

<211>22

<212>DNA

<213>合成的引物

<400>8

tgagtgtcgt acagcctcca gg 22

<210>9

<211>70

<212>DNA

<213>合成的引物

<400>9

tcatccacat cccacctcat caggaacagg cggcgacgaa tcatccagtc tatgtttccc 60

tcttgttgct 70

<210>10

<211>19

<212>DNA

<213>合成的引物

<400>10

agtttccgtc cgaaggttt 19

<210>11

<211>50

<212>DNA

<213>合成的引物

<400>11

aaggaacagg cggcgacgaa tcaacgacag aacgcaaccc aacgctactc 50

Claims

1.一种人工序列模板引物集，其特征在于，所述引物集包括：

特异性结合于被检测核酸序列并引发目的核酸扩增反应的寡核苷酸引物对，其中至少一个引物是人工序列模板引物，该人工序列模板引物包括：

2.如权利要求1所述的人工序列模板引物集，其特征在于，所述的报告分子包括荧光共振能量转移型信号探针和含稀土元素的寡核苷酸链。

3.如权利要求1所述的人工序列模板引物集，其特征在于，所述的特异结合区长度为6-35bp，所述公用区的长度为8-100bp。

4.如权利要求2中任一所述的人工序列模板引物集，其特征在于，所述的特异结合区长度为15-25bp，所述公用区的长度为20-50bp，且所述的荧光共振能量转移型信号探针选自下组：Taqman探针、FRET双探针、分子信标和PNA信号探针，且在特异结合区和报告分子结合区之间存在间隔区，和/或在公用引物区和报告分子结合区之间存在间隔区，所述的间隔区为1-20bp。

5.如权利要求1所述的人工序列模板引物集，其特征在于，在所述的人工序列模板引物中含有选自下组的核苷酸：isoG、isoC、2′-O-甲基-G、2′-O-甲基-C、及其组合。

6.如权利要求1所述的人工序列模板引物集，其特征在于，还包括用于增加被检测核酸模板数量的扩增模板引物。

7.一种检测试剂盒，其特征在于，它含有权利要求1所述的人工序列模板引物集。

8.一种检测核酸检测方法，其特征在于，它包括步骤：

(1)在含有报告分子的核酸扩增反应体系中，用人工序列模板引物集与待测样品进行核酸扩增反应，其中所述引物集包括特异性结合于被检测核酸序列并引发目的核酸扩增反应的引物对，且至少一个引物是人工序列模板引物，该人工序列模板引物包括：

(2)检测报告分子所产生的可检测信号。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述的待测样品选自下组：DNA样品、RNA样品、和从RNA经逆转录得到的cDNA样品。

10.如权利要求8所述的方法，其特征在于，使用两种或两种以上不同的人工序列模板引物集，这些人工序列模板引物集分别特异性地结合于不同被检测体的靶序列、同一被检测体的不同靶序列、同一被检测体的相同靶序列的不同区域、或其组合，并且这些人工序列模板引物集的报告分子结合区分别与相同或不同的报告分子发生特异性结合。