CN1813064A

CN1813064A - 检测sars冠状病毒的方法

Info

Publication number: CN1813064A
Application number: CNA2004800182095A
Authority: CN
Inventors: 峰川晴美; 渡边惠子; 糀谷伸一
Original assignee: Eiken Chemical Co Ltd
Current assignee: Eiken Chemical Co Ltd
Priority date: 2003-06-27
Filing date: 2004-06-15
Publication date: 2006-08-02
Anticipated expiration: 2024-06-15
Also published as: US20090092962A1; JP4603979B2; WO2005001097A1; US20090117537A1; CN1813064B; EP1642978A1; EP1642978A4; US7595163B2; JPWO2005001097A1; US20070099178A1; US7399588B2; HK1092179A1; US7595381B2

Abstract

本发明提供：(问题)为诊断严重急性呼吸综合征(SARS)提供高灵敏度且快速检测SARS致病病毒冠状病毒的方法。(解决方法)能够与根据SARS冠状病毒RNA聚合酶碱基序列设计的任意碱基序列杂交的寡核苷酸引物；使用这样的引物的核酸扩增法；通过检测核酸扩增来诊断SARS冠状病毒感染的方法；和严重急性呼吸综合征的诊断试剂盒。

Description

检测SARS冠状病毒的方法

技术领域

本发明涉及检测严重急性呼吸综合征(severe acute respiratorysyndrome，SARS)冠状病毒的方法，且更具体地涉及利用高灵敏度的基因检测方法诊断SARS的方法。

背景技术

严重急性呼吸综合征(下文中缩写为“SARS”)是2002年11月始发于中国广东的一种传染病，并且已经在香港、台湾和加拿大等国家和地区导致了严重的传染。根据世界卫生组织(WHO)的推断，受SARS感染的患者的死亡率平均为15％，而且对于年龄为65岁及以上的患者的死亡率为50％或更高。SARS冠状病毒，即SARS的致病病毒，是一种单链RNA病毒(参见，例如，非专利文献1)。已知该病毒除感染人外也感染动物。

SARS的主要临床症状是发烧38℃或更高以及出现比如咳嗽和呼吸困难这样的呼吸问题。在一些病例中还观察到比如头痛、恶寒战栗、无食欲、全身感觉不适、腹泻或意识模糊这样的症状。然而，这些症状与其它呼吸疾病，比如流感，几乎相同。因此，仅仅依据其症状难以将SARS与其它疾病相区分。

已知免疫方法是一种临床测试方法。在这样的测试中，要检查的是血液、血清、尿液或唾液中抗病毒抗原的抗体的存在。酶联免疫吸附测定(ELISA)和免疫荧光测定(IFA)是已知的用于检测抗SARS冠状病毒抗体的技术。然而，利用这些技术，在疾病早期阶段无法检测到抗体。就ELISA来说，直到疾病发展后第20天才能检测到抗体。就IFA来说，直到疾病发展后第10天才能检测到抗体(参见，例如，非专利文献2)。

同样，通过PCR扩增病毒基因来检测抗体的方法也是已知的。然而由于该技术需要花费1小时或更长时间用于扩增和检测，且其检测灵敏度低，所以这项技术也有问题。因此，人们期待一种快速且具有高灵敏度的SARS冠状病毒检测方法(参见，例如，非专利文献3和4)。

本发明人发现，前述问题可以用LAMP法解决，该法与比如免疫测定或PCR这样的常规技术相比能够在更短的时间段内以更高的灵敏度和特异性检测SARS冠状病毒。至此，本发明人实现了本发明目的。

[非专利文献1]

The World Health Organization Update 49-SARS case fatality ratio，incubation period，2003年5月7日，Case fatality ratio(检索日期：2003年6月24日)，URL：http：//www.who.int/csr/sars/archive/2003_05_07a/en/)

[非专利文献2]

SARS：a method of diagnostic assay(4月29日，Revision 4-1)，检索日期：2003年6月24日，URL：http：//idsc.nih.go.jp/others/urgent/update41-No1.html，the InfectiousDisease Surveillance Center(IDSC)，the National Institute ofInfectious Diseases

[非专利文献3]

Drosten C.，等人，New Eng，J，Med.，2003，第348卷，第1967-1976页

[非专利文献4]

“Detection of SARS coronavirus gene via RT-PCR(更新日期：2003年5月16日)，检索日期：2003年6月24日，URL：http：//idsc.nih.go.jp/others/urgent/update56-b.html，the Laboratory ofInfluenza Virus，Department of Virology Iii，the Infectious DiseaseSurveillance Center(IDSC)，the National Institute of InfectiousDiseases

发明概述

本发明的一个目的是为早期诊断SARS以高灵敏度检测病毒，即SARS冠状病毒。

为实现上述发明目的，本发明人已经做了集中的研究。结果他们发现，通过制备能够与SARS冠状病毒-特异性核苷酸序列选择性杂交的寡核苷酸引物并用LAMP法扩增SARS冠状病毒-特异性核苷酸序列，可以高灵敏度地检测SARS冠状病毒。由此本发明得以完成。

更具体地说，本发明包括以下要素。

(1)根据选自如SEQ ID NO：1所示的SARS冠状病毒RNA聚合酶核苷酸序列第41至256位核苷酸的任意核苷酸序列或与之互补的核苷酸序列设计的寡核苷酸引物。

(2)根据(1)的寡核苷酸引物，其含有选自如SEQ ID NO：2至13所示选自SARS冠状病毒RNA聚合酶的核苷酸序列的核苷酸序列或与之互补的核苷酸序列的至少15个连续核苷酸。

(3)根据(1)或(2)的寡核苷酸引物，其由选自以下核苷酸序列(a)至(d)的核苷酸序列组成，前提是核苷酸序列区F3c、F2c和F1c选自SARS冠状病毒靶核酸的3′-末端，而核苷酸序列区R3、R2和R1选自SARS冠状病毒靶核酸的5′-末端，且将与之互补的核苷酸序列分别确定为F3、F2和F1和R3c、R2c和R1c：

(a)分别在3′-末端和5′-末端具有靶核酸F2区和F1c区的核苷酸序列；

(b)具有靶核酸F3区的核苷酸序列；

(c)分别在3′-末端和5′-末端具有靶核酸R2区和R1c区的核苷酸序列；和

(d)具有靶核酸R3区的核苷酸序列。

(4)根据(1)至(3)中任一项的寡核苷酸引物，其能够扩增SARS冠状病毒-特异性核苷酸序列、且自5′-末端向3′-末端由选自以下(e)至(h)的核苷酸序列组成：

(e)5′-(与SEQ ID NO：2所示核苷酸序列互补的核苷酸序列)-(含有0至50个核苷酸的任意核苷酸序列)-(SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列)-3′；

(f)5′-(SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列)-(含有0至50个核苷酸的任意核苷酸序列)-(与SEQ ID NO：6所示核苷酸序列互补的核苷酸序列)-3′；

(g)5′-(与SEQ ID NO：8所示核苷酸序列互补的核苷酸序列)-(含有0至50个核苷酸的任意核苷酸序列)-(SEQ ID NO：9所示的核苷酸序列)-3′；和

(h)5′-(SEQ ID NO：11所示的核苷酸序列)-(含有0至50个核苷酸的任意核苷酸序列)-(与SEQ ID NO：12所示的核苷酸序列互补的核苷酸序列)-3′。

(5)检测SARS冠状病毒的方法，包括利用根据(1)至(4)之中任一项的寡核苷酸引物扩增SARS冠状病毒靶核酸区。

(6)根据(5)的方法，其中用LAMP法扩增SARS冠状病毒靶核酸区。

(7)一种诊断严重急性呼吸综合征(SARS)的方法，包括通过利用根据(1)至(4)之中任一项的寡核苷酸引物检测SARS冠状病毒靶核酸区扩增来诊断SARS冠状病毒感染。

(8)一种用于诊断严重急性呼吸综合征(SARS)的试剂盒，其含有根据(1)至(4)之中任一项的寡核苷酸引物。

发明效果

根据本发明，制备了能够与SARS冠状病毒-特异性核苷酸序列选择性杂交的寡核苷酸引物，并用LAMP法扩增SARS冠状病毒-特异性核苷酸序列。这样，可以以高灵敏度并快速检测SARS冠状病毒。

以下详细描述本发明。

本发明的优选实施方案

本发明中所使用的样品是获自疑似患有SARS的人或其它动物的样品。其例子包括痰、支气管肺泡灌洗液、鼻溢、鼻吸出物、鼻洗剂、鼻海绵、咽海绵、嘴洗涤物、唾液、血液、血清、血浆、脊髓液、尿液、粪便及组织。此外，包括例如用于感染实验等的细胞、及其培养液、或从获自生物的样品或培养细胞分离的病毒的样品也可用作样品。这样的样品可以经过比如分离、提取、浓缩或纯化这样的预处理。

可以用一种称作环介导的等温扩增(LAMP)法(WO 00/28082)的新核酸扩增技术来扩增核酸。该LAMP法是由Notomi等人开发的，它不需要对于PCR来说必不可少的温度控制。该法中，使模板核苷酸的3′末端退火，从那里开始合成互补链，而且其中与之组合使用了一种与由上述合成而形成的环退火的引物。这使得核酸扩增可以在等温条件下完成。在LAMP法中，引物3′末端总是与一个衍生自样品的区域退火，且由此，一种核查核苷酸序列互补键合的机制不断重复的起作用。结果，实现了高灵敏度和特异性的核酸扩增。

在LAMP反应中，使用了至少4种类型的寡核苷酸引物，这些引物总共识别模板核酸的核苷酸序列中的6个区域，即，自3′末端的F3c、F2c和F1c区核苷酸序列和自5′末端的R3、R2和R1区核苷酸序列。将这些引物称为内部引物F和R和外部引物F和R。F1c、F2c和F3c的互补序列分别称作F1、F2和F3，而R1、R2和R3的互补序列分别称作R1c、R2c和R3c。内部引物是一种识别靶核苷酸序列上“给定核苷酸序列区域”的寡核苷酸。其在其3′末端带有合成起点核苷酸序列，并在其5′末端带有与由该引物引发的核酸合成产物任意区域互补的核苷酸序列。在本发明中，将含有“选自F2的核苷酸序列”和“选自F1c的核苷酸序列”的引物称作“内部引物F”(下文中简称为“IPF”)，而将含有“选自R2的核苷酸序列”和“选自R1c的核苷酸序列”的引物称作“内部引物R”(下文中简称为“IPR”)。相反，外部引物是识别“位于‘给定核苷酸序列区域’3′末端一侧上的任意核苷酸序列区域”的寡核苷酸、和用作靶核苷酸序列上的合成起点的核苷酸序列。在本发明中，将含有“选自F3的核苷酸序列”的引物称作“外部引物F”(下文中简称为“OPF”)，而将含有“选自R3的核苷酸序列”的引物称作“外部引物R”(下文中简称为“OPR”)。各引物中的“F”指与靶核苷酸序列有义链互补结合、且作为合成起点起作用的引物，“R”指与靶核苷酸序列反义链互补结合、且作为合成起点起作用的引物。用作引物的寡核苷酸的长度为至少10个核苷酸，且优选至少15个核苷酸。其是可化学合成的或天然存在的。各引物可以是单个寡核苷酸或多个寡核苷酸的混合物。

在LAMP法中，除内部和外部引物外，还可以使用另一引物，即，环引物。环引物具有与哑铃结构5′末端侧上的环结构单链区中的核苷酸序列互补的核苷酸序列。使用这样的引物可以增加核酸合成起点的数目、缩短反应时间、以及提高检测灵敏度(WO 02/24902)。环引物核苷酸序列可以选自靶基因或其互补链的核苷酸序列。在另一种替代方式中，它可以是另一种核苷酸序列，只要它与上述哑铃结构5′末端侧上的环结构单链区中的核苷酸序列互补即可。可以使用单一类型或两种或更多类型的环引物。

SARS冠状病毒是一种RNA病毒。当在LAMP法中使用RNA模板时，将逆转录酶添加到使用DNA模板类型的反应的反应液中，使用如此制备的反应液，可以进行与使用DNA模板的反应类似的核酸扩增(RT-LAMP法)。

本发明人已经详尽地研究了能够快速扩增SARS冠状病毒-特异性核苷酸序列的LAMP法引物及其组合的核苷酸序列。结果，本发明人选择了以下基于如SEQ ID NO：1所示来自SARS冠状病毒RNA聚合酶核苷酸序列的核苷酸序列的引物组A和B(DrostenC.，等人，New Eng，J，Med.，2003，第348卷，第1967-1976页)。

(引物组A)

IPF-A：5′-TACATCAAAGCCAATCCACGCAATATGTTTATCACCCGCGAAGA-3′(SEQ ID NO：14)

OPF-A：5′-ACCAAGTCAATGGTTACCCT-3′(SEQ ID NO：4)

IPR-A：5′-GCTGTCATGCAACTAGAGATGCTACAGCTACTAAGTTAACACCTG-3′(SEQ ID NO：15)

OPR-A：5′-GTGTCAACATAACCAGTCGG-3′(SEQ ID NO：16)

LPF-A：5′-ACGAACGTGACGAATAGCT-3′(SEQ ID NO：20)

LPR-A：5′-GTACTAACCTACCTCTCCAGC-3′(SEQ ID NO：21)

(引物组B)

IPF-B：5′-TGCATGACAGCCCTCGAAGAAGCTATTCGTCAC-3′(SEQ ID NO：17)

OPF-B：5′-CTAATATGTTTATCACCCGC-3′(SEQ ID NO：10)

IPR-B：5′-GCTGTGGGTACTAACCTACCTGTCAACATAACCAGTCGG-3′(SEQ IDNO：18)

OPR-B：5′-CTCTGGTGAATTCTGTGTT-3′(SEQ ID NO：19)

LPF-B：5′-AAAGCCAATCCACGC-3′(SEQ ID NO：22)

LPR-B：5′-CCAGCTAGGATTTTCTACAGG-3′(SEQ ID NO：23)

无特定限制，可以使用任何具有链置换活性的模板-依赖性核酸合成酶进行核酸合成。这样的酶的例子包括Bst DNA聚合酶(大片段)、Bca(exo-)DNA聚合酶和大肠杆菌(E.coli)DNA聚合酶I的克列诺(Klenow)片段。优选Bst DNA聚合酶(大片段)。

无特定限制，可以使用任何具有利用RNA模板合成DNA的活性的酶作为RT-LAMP法的逆转录酶。这样的酶的例子包括逆转录酶，比如AMV、克隆的AMV、MMLV、SuperscriptII、ReverTraAce和Thermoscript。优选比如AMV或克隆的AMV这样的逆转录酶。如果使用比如Bca DNA聚合酶这样的具有逆转录酶和DNA聚合酶活性的酶，则可以使用单一的一种酶来完成RT-LAMP。

任何用于核酸合成的酶或逆转录酶均可从病毒或细菌中纯化，或者可以通过基因重组制备。在另一种替代方式中，可以对这样的酶做比如片段化或氨基酸取代这样的修饰。

LAMP反应后，可以通过常规技术检测核酸扩增产物。例如，通过使用特异性识别所扩增的核苷酸序列的标记寡核苷酸，或者通过使用基于荧光嵌入剂的方法(JP专利公开(Kokai)No 2001-242169A)或通过在反应结束后将反应液进行琼脂糖凝胶电泳，可以容易地检测这样的产物。LAMP扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后，被检测为多条不同核苷酸长度的梯。在LAMP法中，大量底物都在核酸合成中消耗，焦磷酸作为一种副产物在与同样存在于反应液中的镁反应后被转化为焦磷酸镁，且反应液逐渐变得浑浊直到这种浊度可以用肉眼观察到的程度。因此，随着时间的消逝，通过利用可以在反应完成后或反应过程中光学观察浊度水平的测量装置观察这种浊度，例如，利用通常的分光光度计测定400nm处的吸收变化，可以检测核酸扩增(WO01/83817)。

根据本发明检测用引物进行的核酸扩增所需的各种试剂都可以预先包装为试剂盒。更具体地说，该试剂盒根据需要含有作为本发明的引物或环引物所必需的各种类型的寡核苷酸、作为核酸合成底物的4种类型的dNTP、用于核酸合成的DNA聚合酶、具有逆转录酶活性的酶、提供适宜酶反应条件的缓冲液或盐、用于稳定酶或模板的保护剂、和检测反应产物所必需的试剂。

实施例

以下参照下列实施例更详细地对本发明进行描述，尽管本发明不受其限制。

实施例1：检测灵敏度的证实

LAMP检测灵敏度与PCR检测灵敏度的比较。

1.准备样品和试剂

1)样品

将如SEQ ID NO：1所示选自SARS冠状病毒RNA聚合酶序列的RNA溶于酵母RNA溶液(50ng/μl，Ambion)中，从其制备每μl包含10至10⁴拷贝RNA的稀释液以及包含2.5、5和10拷贝的稀释液，并将这些稀释物称作样品溶液。将前述酵母RNA溶液称作含有0拷贝的样品溶液。

2)用于PCR的试剂的组成及浓度

根据非专利文献4中所述的方法进行PCR，其中使用了扩增RNA聚合酶195-bp片段的、各自独立由如SEQ ID NO：24和25所示的核苷酸序列组成的两种类型的引物作为检测SARS冠状病毒的引物。cDNA合成反应液的组成

·4μL 5×第一链缓冲液(Invitrogen)

·1μL 10mM dNTPs

·2μL 0.1M DTT

·1μL随机引物(50ng/μl，TAKARA)

·1μL RNA酶抑制剂(40U/μl，Invitrogen)

·1μL SuperScriptII(200U/μl，Invitrogen)

·5μL蒸馏水

·5μL样品溶液

PCR溶液的组成

·5μL 10×Ex Taq缓冲液(不含Mg)(TAKARA)

·4μL 25mM MgCl₂

·4μL 2.5mM dNTPs

·1μL各10pmol/μL引物

·0.5μL Ex Taq(5U/μL，TAKARA)

·33.5μL蒸馏水

·1μL cDNA合成溶液

3)用于LAMP法的试剂的组成及浓度

对于使用引物组A的LAMP扩增，将25μl终反应液中的试剂浓度调节至以下水平。

反应液的组成

·20mM Tris-HCl(pH8.8)

·10mM KCl

·8mM MgSO₄

·1.4mM dNTPs

·10mM(NH₄)₂SO₄

·0.8M甜菜碱(Sigma)

·0.1％Tween 20

·1.6μM IPF和IPR

·0.2μM OPF和OPR

·0.8μM LPF和LPR

·0.625U AMV逆转录酶(Invitrogen)

·8U Bst DNA聚合酶(New England Biolabs)

·0.25μg/mL EtBr(Nippon Gene Co.，Ltd.)

对于使用引物组B的反应，用2U克隆的AMV逆转录酶(Invitrogen)代替0.625U AMV逆转录酶。

2.经核酸扩增的反应

1)经PCR的反应

将包含0或10至10³拷贝靶序列的样品溶液(5μl)添加至上述cDNA合成溶液中，并使所得混合物于42℃下进行50分钟的cDNA合成、之后在70℃下进行15分钟的cDNA合成。将所合成的cDNA溶液(1μl)添加至前述PCR溶液中以使其最终量达50μl，并用PTC-200热循环仪(MJ Research)使反应液在0.2-ml专用管中进行PCR。重复如下循环四十次：95℃变性30秒、56℃退火30秒和72℃下聚合酶延伸30秒。完成PCR所需的时间约为1小时。反应完成后，用5μl反应液进行2％琼脂糖凝胶电泳。

2)经LAMP的反应

将包含0或10至10³拷贝靶序列的样品溶液(1μl)添加至用引物组A进行LAMP的试剂中至其最终量为25μl，以及于63℃使反应液在0.2-ml专用管中进行LAMP 60分钟。反应完成后，用5μl反应液进行2％琼脂糖凝胶电泳。

3.通过电泳检测各核酸扩增产物的灵敏度的比较结果

图1显示经电泳观察PCR检测灵敏度的结果，而图2显示经电泳观察用引物组A进行的LAMP检测灵敏度的结果。结果，在PCR和LAMP中都观察到了扩增产物。对于PCR，在包含10²拷贝的稀释液中清楚的观察到了195-bp的特异性条带；然而，对于包含10拷贝的稀释液，所观察到的扩增产物是不清楚的条带。相反，对于LAMP，在包含10拷贝的稀释液中观察到了呈梯状条带的特异性扩增产物。

实施例2：实时LAMP检测所需时间的确定

用一种实时荧光测量装置(PRISM 7700，Applied Biosystems)，使用25μl实施例1中LAMP法所用的组合物，并将反应温度固定在63℃，测定了用引物组A进行的LAMP检测所需的时间。结果示于图3。

结果，在60分钟后在包含0拷贝的样品中未观察到荧光增强。相反，在包含10拷贝或更多的样品中在20分钟内观察到了荧光增强。这表明，在20分钟内检测到了10拷贝。

利用实时浊度测量装置(LA-200，Teramecs Co.，Ltd.)通过实时比浊法测定了用引物组B进行的LAMP检测所需的时间。用实施例1中制备的LAMP组合物(25μl)，并将反应温度固定在63℃来进行LAMP反应。结果示于图4。

结果，在60分钟后在包含0拷贝的样品中未观察到浊度升高。相反，在包含2.5拷贝或更多的样品中在35分钟内观察到了荧光升高。这表明，在35分钟内检测到了2.5拷贝。

附图简述

图1显示经电泳观察到的PCR检测灵敏度(泳道1和7：标记物；泳道2：试剂空白道；泳道3：0拷贝；泳道4：10拷贝；泳道5：10²拷贝；和泳道6：10³拷贝)。

图2显示经电泳观察道的用引物组A进行的LAMP检测的灵敏度(泳道1：0拷贝；泳道2：10拷贝；泳道3：10²拷贝；泳道4：10³拷贝；泳道5：10⁴拷贝；和泳道6：标记物)。

图3显示用引物组A完成的实时荧光测定的检测时间。

图4显示用引物组B完成的实时比浊法的检测时间。

序列表

<110>Eiken Kagaku Kabushiki Kaisha

<120>检测SARS冠状病毒的方法

<130>PH-2447-PCT

<140>

<141>

<150>JP 2003-184123

<151>2003-06-27

<150>JP 2003-384572

<151>2003-11-14

<160>

<210>1

<211>300

<212>RNA

<213>SARS冠状病毒

<220>

<223>发明人：Minegawa，Harumi；Watanabe，Keiko；Kasuya，Shinichi

<400>1

uaccguagac ucaucucuau gauggguuuc aaaaugaauu accaagucaa ugguuacccu 60

aauauguuua ucacccgcga agaagcuauu cgucacguuc gugcguggau uggcuuugau 120

guagagggcu gucaugcaac uagagaugcu guggguacua accuaccucu ccagcuagga 180

uuuucuacag guguuaacuu aguagcugua ccgacugguu auguugacac ugaaaauaac 240

acagaauuca ccagaguuaa ugcaaaaccu ccaccaggug accaguuuaa acaucuuaua 300

<210>2

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：引物

<400>2

tgcgtggatt ggctttgatg ta 22

<210>3

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

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<223>人工序列描述：引物

<400>3

atatgtttat cacccgcgaa ga 22

<210>4

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<212>DNA

<213>人工序列

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<223>人工序列描述：引物

<400>4

accaagtcaa tggttaccct 20

<210>5

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

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<223>人工序列描述：引物

<400>5

gctgtcatgc aactagagat gct 23

<210>6

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：引物

<400>6

caggtgttaa cttagtagct gt 22

<210>7

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

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<223>人工序列描述：引物

<400>7

ccgactggtt atgttgacac 20

<210>8

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

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<223>人工序列描述：引物

<400>8

gagggctgtc atgca 15

<210>9

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

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<223>人工序列描述：引物

<400>9

gaagaagcta ttcgtcac 18

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<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

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<223>人工序列描述：引物

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ctaatatgtt tatcacccgc 20

<210>11

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

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<223>人工序列描述：引物

<400>11

gctgtgggta ctaacctacc t 21

<210>12

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

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<223>人工序列描述：引物

<400>12

ccgactggtt atgttgac 18

<210>13

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

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<223>人工序列描述：引物

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aacacagaat tcaccagag 19

<210>14

<211>44

<212>DNA

<213>人工序列

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<223>人工序列描述：引物

<400>14

tacatcaaag ccaatccacg caatatgttt atcacccgcg aaga 44

<210>15

<211>45

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：引物

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gctgtcatgc aactagagat gctacagcta ctaagttaac acctg 45

<210>16

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

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<223>人工序列描述：引物

<400>16

gtgtcaacat aaccagtcgg 20

<210>17

<211>38

<212>DNA

<213>人工序列

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<223>人工序列描述：引物

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tgcatgacag ccctcgaaga agctattcgt cac 33

<210>18

<211>39

<212>DNA

<213>人工序列：

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<223>人工序列描述：引物

<400>18

gctgtgggta ctaacctacc tgtcaacata accagtcgg 39

<210>19

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：引物

<400>19

ctctggtgaa ttctgtgtt 19

<210>20

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：引物

<400>20

acgaacgtga cgaatagct 19

<210>21

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：引物

<400>21

gtactaacct acctctccag c 21

<210>22

<211>17

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：引物

<400>22

aaagccaatc cacgc 15

<210>23

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：引物

<400>23

ccagctagga ttttctacag g 21

<210>24

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：引物

<400>24

atgaattacc aagtcaatgg ttac 24

<210>25

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：引物

<400>25

cataaccagt cggtacagct ac 22

Claims

1.根据选自如SEQ ID NO：1所示的SARS冠状病毒RNA聚合酶核苷酸序列第41至256位核苷酸的任意核苷酸序列或与之互补的核苷酸序列设计的寡核苷酸引物。

2.根据权利要求1的寡核苷酸引物，其含有选自如SEQ ID NO：2至13所示选自SARS冠状病毒RNA聚合酶的核苷酸序列的核苷酸序列或与之互补的核苷酸序列的至少15个连续核苷酸。

3.根据权利要求1或2的寡核苷酸引物，其由选自以下核苷酸序列(a)至(d)的核苷酸序列组成，前提是核苷酸序列区F3c、F2c和F1c选自SARS冠状病毒靶核酸的3′-末端，而核苷酸序列区R3、R2和R1选自SARS冠状病毒靶核酸的5′-末端，且将与之互补的核苷酸序列分别确定为F3、F2和F1和R3c、R2c和R1c：

(b)具有靶核酸F3区的核苷酸序列；

(d)具有靶核酸R3区的核苷酸序列。

4.根据权利要求1至3中任一项的寡核苷酸引物，其能够扩增SARS冠状病毒-特异性核苷酸序列、且自5′-末端向3′-末端由选自以下(e)至(h)的核苷酸序列组成：

5.检测SARS冠状病毒的方法，包括利用根据权利要求1至4之中任一项的寡核苷酸引物扩增SARS冠状病毒靶核酸区。

6.根据权利要求5的方法，其中用LAMP法扩增SARS冠状病毒靶核酸区。

7.一种诊断严重急性呼吸综合征(SARS)的方法，包括通过利用根据权利要求1至4之中任一项的寡核苷酸引物检测SARS冠状病毒靶核酸区扩增来诊断SARS冠状病毒感染。

8.一种用于诊断严重急性呼吸综合征(SARS)的试剂盒，其含有根据权利要求1至4之中任一项的寡核苷酸引物。