CN1890387A - 用于乳腺癌的诊断/预后的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于乳腺癌的诊断/预后的方法，其包括下列步骤：A)从生物学样品中提取核物质，B)使用至少一对扩增引物获得核物质的至少一个靶序列的扩增子C)使用至少一种检测探针检测所述扩增子的存在。其特征在于，在步骤B)中，所述引物对包含至少一个含有选自SEQID No.1至SEQ ID No.24的核苷酸序列的至少10个核苷酸残基的扩增引物，和/或在步骤C)中，所述检测探针包含选自SEQ ID No.1至SEQ ID No.20的核苷酸序列的至少10个核苷酸残基。本发明也涉及可用于该方法的扩增引物和杂交探针以及用于乳腺癌的诊断/预后的试剂盒。

Description

用于乳腺癌的诊断/预后的方法
本发明涉及用于乳腺癌的诊断/预后的方法。本发明也涉及用于该方法的扩增引物和杂交探针，以及用于乳腺癌的诊断/预后的试剂盒。
乳腺癌是种普遍发生的疾病：11个妇女中有1个在其一生中会发生乳腺癌。然而，因为存在各种类型乳腺癌和不同的乳腺癌预后，因此受其影响的妇女不会都采用相同的治疗：为了获得最大的治愈可能性，医生给每个患者提供适合于其状况的疗法。
因此，作为乳腺癌的系统性疗法的激素疗法被用于激素依赖性乳腺癌，即在其细胞表面表达激素受体的肿瘤的情况下使用。手术后，可单独地使用激素治法或与辅助化学治法交替地使用。在疾病的复发中，可开出单独的、或与化学疗法组合的或与化学疗法交替使用的激素疗法。
化学疗法本身是种系统性癌症疗法，因为通过血液循环运载的药物能够在身体中各处起作用。化学疗法在治疗法中占有重要的位置，特别是最近十年左右，随着新的分子的出现更是如此。药物最普遍通过静脉内、皮下或肌内输注来施用。
因此，治疗可以倾向或不倾向激素疗法，其依赖于激素分泌细胞表面的激素受体的表达。
特别是我们可提到雌激素受体ESR1和ESR2以及孕酮受体(PGR)，其是预测乳腺癌中对激素疗法的反应的最著名的参数。因此，ESR1的含量用作预后指标，和用于预测患者对使用抗雌激素例如Tamoxifen(Osborne C等人，Breast Cancer Res treat 51：227-238，1998；Goldhirsch等人，J Clin Oncol 19：3817-3827，2001)的疗法的反应。PGR受体的存在也用于监控激素疗法和用作预后标记(Horwitz等人，Recent Prog Horm Res 41：249-316，1995)。我们也会提到HER2受体，据说其在大约1/4的侵袭性乳腺癌中过量表达(Slamon等人，Science，1987，235：177-182)。
为了给患者提供合适的疗法，因此有必要了解编码激素受体，例如ESR1、ESR2、HER2和PGR的基因的表达。通常在原发性肿瘤中和通常使用免疫组织化学法来研究该表达。在不确定的情况下，通过原位杂交法(FISH)检查基因的扩增是种参考方法，特别是在HER2的情况下。近些年来，已可能检测小肿瘤，使得能够进行乳腺癌的早期诊断，但从少量肿瘤组织中对该癌症进行预后仍然困难，少量肿量组织使前述激素受体的蛋白定量变得十分困难。因此分子生物学技术成为激素受体定量的必不可少的技术，因为其需要更少量的肿瘤组织(Fuqua等人，Natl Cancer Inst 82：859-861，1997；Fasco等人，Anal Biochem，245：167-178，1997；Poola等人，Anal Biochem，258：209-215，1998)。
本发明提出了用于乳腺癌的诊断/预后的新方法。该方法特别地使用了能够用作扩增引物或用作杂交探针的新的核苷酸序列。特别是本发明的方法可能确定最适合用于治疗患有乳腺癌的患者的疗法。
因此，本发明涉及用于乳腺癌的诊断/预后的方法，其包括下列阶段：
A-从生物样品中提取核物质(nuclear material)，
B-使用至少一对扩增引物获得核物质中的至少一个靶序列的扩增子，
C-使用至少一种检测探针检测所述扩增子的存在，其特征在于，在B阶段，所述引物对包含至少一个这样的扩增引物，该扩增引物含有选自SEQ ID No.1至SEQ ID No.24的核苷酸序列的至少10个核苷酸残基，和/或在C阶段，所述检测探针包含选自SEQID No.1至SEQ ID No.20的核苷酸序列的至少10个核苷酸残基。
令人吃惊的是，本发明者由此发现在乳腺癌的诊断/预后的方法中，包含选自SEQ ID No.1至SEQ ID No.20的核苷酸序列的至少10个核苷酸残基的核苷酸序列非常适合用作扩增靶序列例如编码ESR1、ESR2、PGR或HER2的基因的扩增引物。本发明者也发现将包含选自SEQ ID No.1至SEQ ID No.20的核苷酸序列的至少10个核苷酸残基的核苷酸序列用作杂交探针非常适合用于对靶序列(例如编码ESR1、ESR2、PGR或HER2的基因)的特异性杂交。
在本发明的含义中， 生物学样品是指任何可含有如此后定义的核物质的样品。该生物学样品可采自患者和可以特别是获自患者的组织、血液、血清、唾液或循环细胞的样品。优选地，该生物学样品采自肿瘤。以任何本领域技术人员已知的方式获得该生物学样品。
在本发明的含义中， 核物质b包含核酸序列例如脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)的序列。根据本发明的优选的实施方案，所述核物质包含脱氧核糖核酸的序列。根据本发明的优选的实施方案，从采自患者的生物学样品中提取所述核物质。
核苷酸序列(或核酸序列或核苷酸片段或寡核苷酸、或多核苷酸)是指通过磷酯键连接起来的核苷酸残基的链，其特征在于能够和另一核酸序列杂交的天然核酸的信息序列，其中所述链可含有不同结构的单体和可从天然核酸分子和/或通过基因重组和/或通过化学合成获得。
核苷酸残基是指单体的衍生物，其可以是核酸的天然核苷酸，其组成成分是糖、磷酸基团和含氮碱基，在DNA中所述糖为脱氧-2-核糖，在RNA中所述糖为核糖；依赖于其是否是DNA或RNA物质，所述含氮碱基选自腺嘌呤、鸟嘌呤、尿嘧啶、胞嘧啶或胸腺嘧啶；或可选择地所述单体是在所述三个组成成分中的至少一个上经修饰的核苷酸；作为例子，修饰可以发生在碱基水平上，经修饰的碱基例如为肌苷、甲基-5-脱氧胞苷、脱氧尿苷、二甲氨基-5-脱氧尿苷、二氨基-2，6-嘌呤、溴-5-脱氧腺苷或任何能够杂交的其他经修饰的碱基，或者修饰可以发生在糖的水平上，例如至少一个脱氧核糖被聚酰胺取代(P.E.Nielsen等人，Science，254，1497-1500(1991))，或者修饰可发生在磷酸基团的水平上，例如其被酯特别是选自二磷酸酯、烷基和芳基膦酸酯和硫代磷酸酯取代。该核物质包含至少一个靶序列。至于 靶序列，我们是指这样的序列，即其中核苷酸残基的链特异于靶基因，例如优选地是编码ESR1、ESR2、PGR或HER2的基因。根据本发明的优选的实施方案，所述靶序列包含于选自ESR1、ESR2、PGR或HER2的编码基因的基因中。此后，我们将使用术语靶序列，无论其是单链的还是双链的。
在步骤A中，通过本领域技术人员已知的实验方案 从生物学样品 中提取核物质。作为示例，可通过裂解存在于生物学样品的细胞的步骤进行核酸的提取，以使细胞的蛋白和/或脂包膜(如干扰随后反应的细胞碎片)中包含的核酸释放出来。作为例子，可能使用如专利申请WO00/05338中描述的使用磁力和机械力组合的裂解、WO99/53304中的使用电裂解和WO99/15321中使用机械裂解的裂解方法。
本领域技术人员能够使用其他熟知的裂解方法例如热或渗透休克(thermal or osmotic shock)、或通过离液剂例如胍盐的化学裂解(US 5,234,809)。该裂解步骤之后也可进行纯化步骤，使核酸和在裂解步骤中盐析的其他细胞成分之间产生分离。该步骤通常使核酸被浓缩，并可适于DNA或RNA的纯化。作为例子，可能使用任选地通过吸附或共价结合(cf.专利US 4,672,040和US 5,750,338)包被了寡核苷酸的磁粒，从而在洗涤步骤中将附着在这些磁粒上的核酸纯化出来。如果想要进一步扩增所述核酸，用于纯化核酸的该步骤是特别有吸引力的。在专利申请WO97/45202和WO99/35500中描述了这些磁粒的特别有吸引力的实施方案。核酸纯化的方法的另一个有吸引力的例子是使用二氧化硅，其以柱子形式存在、或以惰性颗粒(Boom R.等人，J.Clin.Microbiol.，1990，No.28(3)，p.495-503)或磁粒(Merck：MagPrepSilica，Promega：MagneSilTM Paramagneticparticles)形式存在。广泛使用的其他方法基于柱子中的或以顺磁性颗粒(Whatman：DEAE-Magarose)形式存在的离子交换树脂(LevisonPR等人，J.Chromatography，1998，p.337-344)。另一个非常合适本发明但并不专用于本发明的方法是金属氧化物支持物上吸附法(company Xtrana：Xtra-BindTM matrix)。
如果我们希望从生物样品中专一地提取DNA，特别地可用酚、氯仿和乙醇除去蛋白并用100％乙醇沉淀DNA来进行提取。然后可通过离心沉淀DNA、洗涤DNA和重悬浮DNA。
在步骤B中，使用至少一对扩增引物以获得核物质中的至少一个靶序列的扩增子。
在本发明的含义中， 扩增引物是指包含10至100个核苷酸残基，优选地15至25个核苷酸残基的核酸序列。该扩增引物包含选自SEQ IDNo.1至20的序列的至少10个、优选地15个和更优选地20个核苷酸残基。在本发明的含义中，包含下面序列的至少10个、优选地15个和甚至更优选地20个核苷酸残基的引物，并具有和本发明的扩增引物功能(即用于扩增完整的或部分的编码ESR1、ESR2、PGR或HER2的基因)相同的引物，被认为是本发明的扩增引物的等同物：
●与SEQ ID No.1至SEQ ID No.20同源的序列，即
○与SEQ ID No.1至SEQ ID No.20互补或充分互补的序列
○显示足以与SEQ ID No.1至SEQ ID No.20或与SEQ IDNo.1至SEQ ID No.20的互补序列杂交的同源性的序列，
●包含来自SEQ ID No.1至SEQ ID No.20的序列(或如前面定义的，与SEQ ID No.1至SEQ ID No.20同源的序列)的序列，
在所述序列中尿嘧啶碱基替代了胸腺嘧啶碱基。
扩增引物对使得可以起始酶促聚合作用，特别是例如酶促扩增反应。
酶促扩增反应是指通过至少一种酶的作用产生核酸序列的多拷贝(或扩增子)的过程。在本发明的含义中， 扩增子是指在酶促扩增反应中获得的靶序列的拷贝。这些扩增反应对本领域技术人员来说是熟悉的，特别地我们可提到在专利US-A-4,683,195、US-A-4,683,202和US-A-4,800,159中描述的PCR(聚合酶链式反应)；在例如专利申请EP-A-0 201 184中公开的LCR(连接酶链式反应)；在专利申请WO-A-90/01069中公开的RCR(修复链式反应)；专利申请WO-A-90/06995中的3SR法(自动维持序列扩增)；专利申请WO-A-91/02818中的NASBA(基于核酸序列的扩增)，或专利US-A-5,399,491中的TMA(转录介导的扩增)。一般地，这些酶促扩增反应通常使用包含下列步骤的连续循环：
○靶序列的变性(如果靶序列是双链的)，以获得两个互补性靶链，
○这些在前面的变性步骤中获得的靶链中的每一条链与至少一个扩增引物的杂交，
○在聚合酶和核苷三磷酸(核糖核苷三磷酸和/或脱氧核糖核苷三磷酸，依赖于所用的技术)存在的情况下，在扩增引物的基础上，形成和与之杂交的链互补的链，
重复进行确定次数的该循环以获得足以使其被检测到的份量的靶序列。
杂交是指这样的过程，即在其中，在合适的条件下，两个核酸序列特别是例如扩增引物和靶序列或杂交探针和靶序列，通过稳定和特异的氢键连接起来形成双链。在互补性碱基腺嘌呤(A)和胸腺嘧啶(T)(或尿嘧啶(U))(称作A-T键)之间或在互补性碱基鸟嘌呤(G)和胞嘧啶(C)(称作G-C键)之间形成这些氢键。两个核酸序列的杂交可以是完全的(此时称其为互补序列)，即在该杂交中获得的双链只包含A-T键和C-G键。该杂交也可以是部分的(此时称其为充分互补的序列)，即获得的双链包含允许双链形成的A-T键和C-G键，同时还包括未和互补性碱基结合的碱基。两个互补序列或充分互补的序列之间的杂交依赖于使用的工作条件，特别是严紧性。严紧性的确定与两个核酸序列之间的碱基组成以及这两个核酸序列之间的错配程度紧密相关。严紧性也可以是反应参数例如存在于杂交溶液中的离子种类的浓度和类型、变性剂的性质和浓度和/或杂交温度的函数。所有这些因素都是熟知的并且可由本领域技术人员确定合适的条件。
更准确地，NASBA是基于三种酶(逆转录酶AMV、RNA酶-H和RNA聚合酶T7)的组合作用的核酸等温扩增技术。和对于靶序列特异性的扩增引物结合，其在90分钟内扩增超过10亿倍的RNA靶序列。扩增反应在41℃发生并以单链RNA分子为终产物。NASBA需要这样的引物对，即其中至少有一个引物包含允许通过噬菌体T7聚合酶启动转录的启动子。这样的引物优选地选自SEQ ID No.21至24。根据本发明的特定实施方案，所述引物对包含至少一个这样的扩增引物，即其含有允许通过噬菌体T7聚合酶启动转录的启动子。
根据本发明的特定实施方案，所述用于步骤B的引物对选自下列的引物对：
□包含核苷酸序列SEQ ID No.1的至少10个、优选地15个和更优选地20个核苷酸残基的第一扩增引物和包含核苷酸序列SEQ IDNo.2的至少10个、优选地15个和更优选地20个核苷酸残基的第二扩增引物；例如，当第一引物以SEQ ID No.1作为其序列，第二引物以SEQ ID No.2作为其序列时，获得对编码ESR1的基因特异性的、具有202个碱基对大小的扩增子，该扩增子对应于编码ESR1的参照基因的序列(Genbank X03635)上的序列1427-1629。
□包含核苷酸序列SEQ ID No.3的至少10个、优选地15个和更优选地20个核苷酸残基的第一扩增引物和包含核苷酸序列SEQ IDNo.4的至少10个、优选地15个和更优选地20个核苷酸残基的第二扩增引物；例如，当第一引物以SEQ ID No.3作为其序列，第二引物以SEQ ID No.4作为其序列时，于是获得对编码PGR的基因特异性的、具有184个碱基对大小的扩增子，该扩增子对应于编码PGR的参照序列(Genbank NM_000926)上的序列2761-2945。
□包含核苷酸序列SEQ ID No.5的至少10个、优选地15个和更优选地20个核苷酸残基的第一扩增引物和包含核苷酸序列SEQ IDNo.6的至少10个、优选地15个和更优选地20个核苷酸残基的第二扩增引物；例如，当第一引物以SEQ ID No.5作为其序列，第二引物以SEQ ID No.6作为其序列时，获得对编码ESR2的基因特异性的、具有210个碱基对大小的扩增子，该扩增子对应于编码ESR2的参照序列(Genbank MN_001437)上的序列1640-1850。
□包含核苷酸序列SEQ ID No.7的至少10个、优选地15个和更优选地20个核苷酸残基的第一扩增引物和包含核苷酸序列SEQ ID No.8的至少10个、优选地15个和更优选地20个核苷酸残基的第二扩增引物；例如，当第一引物以SEQ ID No.7作为其序列，第二引物以SEQ ID No.8作为其序列时，于是获得对编码HER2的基因特异性的、具有185个碱基对大小的扩增子，该扩增子对应于编码HER2的参照序列(Genbank NM_00448)上的序列2567-2752。
□包含核苷酸序列SEQ ID No.13的至少10个、优选地15个和更优选地20个核苷酸残基的第一扩增引物和包含核苷酸序列SEQ IDNo.14的至少10个、优选地15个和更优选地20个核苷酸残基的第二扩增引物；例如，当第一引物以SEQ ID No.13作为其序列，第二引物以SEQ ID No.14作为其序列时，此时获得对编码ESR1的基因特异性的、具有858个碱基大小的扩增子，该扩增子对应于编码ESR1的参照序列(Genbank X03635)上的序列808-1666。
□包含核苷酸序列SEQ ID No.15的至少10个、优选地15个和更优选地20个核苷酸残基的第一扩增引物和包含核苷酸序列SEQ IDNo.16的至少10个、优选地15个和更优选地20个核苷酸残基的第二扩增引物；例如，当第一引物以SEQ ID No.15作为其序列，第二引物以SEQ ID No.16作为其序列时，此时获得对编码PGR的基因特异性的、具有658个碱基对大小的扩增子，该扩增子对应于编码PGR的参照序列(Genbank NM_000926)上的序列2319-2977。
□包含核苷酸序列SEQ ID No.17的至少10个、优选地15个和更优选地20个核苷酸残基的第一扩增引物和包含核苷酸序列SEQ IDNo.18的至少10个、优选地15个和更优选地20个核苷酸残基的第二扩增引物；例如，当第一引物以SEQ ID No.17作为其序列，第二引物以SEQ ID No.18作为其序列时，此时获得对编码ESR2的基因特异性的、具有702个碱基对大小的扩增子，该扩增子对应于编码ESR2的参照序列(Genbank MN_001437)上的序列1246-1948。
□包含核苷酸序列SEQ ID No.19的至少10个、优选地15个和更优选地20个核苷酸残基的第一扩增引物和包含核苷酸序列SEQ IDNo.20的至少10个、优选地15个和更优选地20个核苷酸残基的第二扩增引物；例如，当第一引物以SEQ ID No.19作为其序列，第二引物以SEQ ID No.20作为其序列时，此时获得对编码HER2的基因特异性的、具有928个碱基对大小的扩增子，该扩增子对应于编码HER2的参照序列(Genbank NM_004448)上的序列2123-3051。
根据本发明的特定实施方案，所述用于步骤B的引物对，包括含有允许通过噬菌体T7聚合酶启动转录的启动子的第一引物，并选自下列的引物对：
□第一扩增引物SEQ ID No.21和包含核苷酸序列SEQ ID No.2的至少10个、优选地15个和更优选地20个核苷酸残基的第二扩增引物；
□第一扩增引物SEQ ID No.22和包含核苷酸序列SEQ ID No.4的至少10个、优选地15个和更优选地20个核苷酸残基的第二扩增引物；
□第一扩增引物SEQ ID No.23和包含核苷酸序列SEQ ID No.6的至少10个、优选地15个和更优选地20个核苷酸残基的第二扩增引物；
□第一扩增引物SEQ ID No.24和包含核苷酸序列SEQ ID No.8的至少10个、优选地15个和更优选地20个核苷酸残基的第二扩增引物。
考虑到可在扩增反应的各步骤中观察到的酶促效率的可变性，可通过同时确定所谓的管家基因的表达(在不同患者群体中，其表达相似)来标准化靶基因的表达。通过保持靶基因的表达对管家基因的表达的比例，可校正不同实验间的任何可变性。本领域技术人员可特别地参考下列出版物：Bustin SA Journal of molecular endocrinology，2002，29：23-39；Giulietti A Methods，2001，25：386-401。根据本发明的特定实施方案，为获得对于管家基因特异性的扩增子，在步骤B中，另外使用至少一对扩增引物。至于 管家基因，我们是指无论在怎样的生理学状况下，在给定的组织中，其表达稳定的基因。根据本发明的优选的实施方案，所述管家基因是编码亲环蛋白B的PPIB基因。根据本发明的优选的实施方案，所述用于获得对于管家基因特异性的扩增子的扩增引物包含选自SEQ ID No.25至29的序列的至少10个、优选地15个和更优选地20个核苷酸残基。
根据本发明的特定实施方案，所述用于获得对于管家基因特异性的扩增子的扩增引物对选下列引物对：
□包含核苷酸序列SEQ ID No.27的至少10个、优选地15个和更优选地20个核苷酸残基的第一扩增引物和包含核苷酸序列SEQ IDNo.28的至少10个、优选地15个和更优选地20个核苷酸残基的第二扩增引物；例如，当第一引物以SEQ ID No.27作为其序列，第二引物以SEQ ID No.28作为其序列时，获得对PPIB基因特异性的、具有239个碱基对大小的扩增子，该扩增子对应于PPIB参照序列(GenbankM60857)上的序列231-470；
□包含核苷酸序列SEQ ID No.25的至少10个、优选地15个和更优选地20个核苷酸残基的第一扩增引物和包含核苷酸序列SEQ IDNo.26的至少10个、优选地15个和更优选地20个核苷酸残基的第二扩增引物；例如，当第一引物以SEQ ID No.25作为其序列，第二引物以SEQ ID No.26作为其序列时，获得对PPIB基因特异性的、具有639个碱基对大小的扩增子，该扩增子对应于PPIB参照序列(GenbankM60857)上的序列11-650。
根据本发明的特定实施方案，所述用于获得对于管家基因特异性的扩增子的扩增引物对包括含有允许通过噬菌体T7聚合酶启动转录的启动子的第一扩增引物。所述第一扩增引物优选地是SEQ ID No.30，所述第二扩增引物优选地包含核苷酸序列SEQ ID No.28的至少10个、优选地15个和更优选地20个核苷酸残基。
在步骤C中，使用至少一种检测探针检测所述扩增子的存在。可通过本领域技术人员已知的涉及核酸检测的所有实验方案进行该检测步骤。
在本发明的意思中，杂交探针是指10至100个核苷酸残基，特别是15至35个核苷酸残基的核酸序列，所述核酸序列在特定的条件下具有和靶核酸序列形成杂交复合物的杂交特异性。杂交探针可包括使其能够被检测的标记物。因此称其为检测探针。 检测是指通过物理方法直接检测，或通过使用标记物检测的方法间接检测。存在许多用于核酸检测的检测方法。[参见例如Kricka等人，ClinicalChemistry，1999，No.45(4)，p.453-458或Keller G.H.等人，DNAProbes，第2版，Stockton Press，1993，sections 5 and 6，p.173-249]。 标记物是指能够产生可被检测的信号的示踪物。这些示踪物的非限制性名录包括产生可通过例如比色、荧光或发光检测的信号的酶，例如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β半乳糖苷酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶；发色团例如荧光、发光或显色化合物；可通过电子显微镜或通过其与电有关的性质例如导电性、通过电流测定法或电压测定法、或通过阻抗的测量来检测的具有电子密度的基团；可通过光学方法例如衍射、表面等离子共振、接触角的变化或通过物理方法例如原子力光谱学、隧道效应等来检测的基团；放射性分子例如32P、35S或125I。
在本发明的含义中，杂交探针可以是 所谓的检测探针。在该情况下，用前面所定义的标记物标记所谓的检测探针。由于该标记物的存在，因此可能检测到给定的检测探针和对于给定的物种特异性的靶序列之间的杂交反应的存在。
特别地检测探针可以是如Tyagi & Kramer(Nature biotech，1996，14：303-308)描述的“分子信标(molecular beacon)”检测探针。这些“分子信标”在杂交时产生荧光。其具有茎-环结构并且包含荧光团和“淬灭”基团。特异性的环序列和其互补序列靶核酸的固定导致茎的解旋并在合适的波长激发下发射荧光信号。
杂交探针也可以是 所谓的捕获探针。在该情况下，通过任何合适的方法，即例如通过共价键合或通过吸附，直接或间接地将或可将所谓的捕获探针固定在固体支持物上。然后检测给定的捕获探针和靶序列之间的杂交反应。
为检测杂交反应，可能直接地(特别是通过将标记整合入靶序列内)使用经标记的靶序列，或间接地(特别是通过使用如前面定义的检测探针)使用靶序列。特别地，在杂交步骤之前，可能进行靶序列的标记和/或切割步骤，例如通过在酶促扩增反应中使用经标记的脱氧核糖核苷三磷酸来进行。特别是可通过咪唑和氯化锰的作用进行切割。也可以在扩增步骤后标记靶序列，例如根据资料WO 91/19812中所描述的三明治杂交技术，通过和检测探针进行杂交来标记。另一个特别优选的标记核酸的方法描述于申请FR2 780 059。
作为固体支持物，可能使用合成材料或天然材料，任选地经化学修饰的材料，特别是多糖例如基于纤维素的材料，例如纸、纤维素衍生物例如乙酸纤维素和硝酸纤维素或葡聚糖、多聚体、共聚物(特别是基于苯乙烯型的单体的)、天然纤维例如棉花和合成的纤维例如尼龙；矿物例如硅石、石英、玻璃、陶瓷；胶乳；磁粒；金属衍生物、凝胶等。固体支持物可以微量滴定板、如申请WO 94/12670中描述的膜或颗粒的形式存在。
根据本发明的优选的实施方案，检测探针包含荧光团和淬灭基团。根据本发明的更优选的实施方案，杂交探针在其5’末端包含荧光团FAM(6-羧基-荧光素)或ROX(6-羧基-X-罗丹明)和在其3’末端包含淬灭基团(Dabsyl)。在下文中，这种杂交探针称为“分子信标”。
根据本发明优选的实施方案，同时进行步骤B和C。该优选的实施方案可用于“实时NASBA”，所述“实时NASBA”在单个步骤中组合了NASBA扩增技术和使用“分子信标”的实时检测技术。在试管中进行NASBA反应，产生了这样的单链RNA，即其同时可与特异性的“分子信标”杂交，产生荧光信号。通过在荧光读出器中连续测定信号来实时测量新RNA分子的形成。与通过RT-PCR的扩增相反，NASBA中的扩增可在样品中存在DNA的情况下进行。因此，不必在RNA的提取过程中验证DNA实际上被完全除去。
如下面的例子所示，当我们希望检测ESR1靶基因(参照序列NCBI目录号：X03635)时，下列序列优选地用于步骤b)：
□第一引物SEQ ID No.1或21，
□第二引物SEQ ID No.2
和步骤C)
□包含SEQ ID No.9的检测探针。
如下面的例子所示，当我们希望检测编码PGR的靶基因(参照序列NCBI目录号：NM_000926)，下列序列优选地用于步骤b)：
□第一引物SEQ ID No.3或22，
□第二引物SEQ ID No.4
和步骤C)
□包含SEQ ID No.10的检测探针。
如下面的例子所示，当我们希望检测编码ESR2的靶基因(参照序列NCBI目录号：MN_001437)，下列序列优选地用于步骤b)：
□第一引物SEQ ID No.5或23，
□第二引物SEQ ID No.6
和步骤C)
□包含SEQ ID No.11的检测探针。
如下面的例子所示，当我们希望检测编码HER2的靶基因(参照序列NCBI目录号：NM_00448)，下列序列优选地用于步骤b)：
□第一引物SEQ ID No.7或24，
□第二引物SEQ ID No.8
和步骤C)
□包含SEQ ID No.12的检测探针。
如下面的例子所示，当我们希望检测PPIB管家基因(参照序列NCBI目录号：M60857)，下列序列优选地用于步骤b)：
□第一引物SEQ ID No.27或30，
□第二引物SEQ ID No.28
和步骤C)
□包含SEQ ID No.29的检测探针。
当在步骤B中使用获得对于管家基因特异性的扩增子的扩增引物对时，可以与前面描述的方式相似的方法，特别是可通过使用检测探针来检测所述对于管家基因特异性的扩增子。根据本发明的优选的实施方案，管家基因是编码亲环蛋白B的PPIB基因并且检测探针包含选自SEQ ID No.27至29的核苷酸序列的至少10个、优选地15个和更优选地20个核苷酸残基。优选地，该检测探针包含荧光团和淬灭基团。
本发明也涉及这样的扩增引物，即其包含选自SEQ ID No.1至SEQ ID No.20的至少10个，优选地15个，和更优选地20个核苷酸残基。
根据本发明的优选的实施方案，扩增引物包含这样的启动子，即其允许通过噬菌体T7的聚合酶起始转录。特别地该引物可以是SEQ IDNo.21至24中的任一个，并优选地用于NASBA扩增反应中。
本发明也涉及选自下列引物对的引物对：
□包含核苷酸序列SEQ ID No.1的至少10个、优选地15个和更优选地20个核苷酸残基的第一扩增引物和包含核苷酸序列SEQ ID No.2的至少10个、优选地15个和更优选地20个核苷酸残基的第二扩增引物；例如，当第一引物以SEQ ID No.1作为其序列，第二引物以SEQID No.2作为其序列时，获得对编码ESR1的基因特异性的、具有202个碱基对大小的扩增子，该扩增子对应于编码ESR1的参照序列(Genbank X03635)上的序列1427-1629。
□包含核苷酸序列SEQ ID No.3的至少10个、优选地15个和更优选地20个核苷酸残基的第一扩增引物和包含核苷酸序列SEQ ID No.4的至少10个、优选地15个和更优选地20个核苷酸残基的第二扩增引物；例如，当第一引物以SEQ ID No.3作为其序列，第二引物以SEQID No.4作为其序列时，获得对编码PGR的基因特异性的、具有184个碱基对大小的扩增子，该扩增子对应于编码PGR的参照序列(Genbank NM_000926)上的序列2761-2945。
□包含核苷酸序列SEQ ID No.5的至少10个、优选地15个和更优选地20个核苷酸残基的第一扩增引物和包含核苷酸序列SEQ ID No.6的至少10个、优选地15个和更优选地20个核苷酸残基的第二扩增引物；例如，当第一引物以SEQ ID No.5作为其序列，第二引物以SEQID No.6作为其序列时，获得对编码ESR2的基因特异性的、具有210个碱基对大小的扩增子，该扩增子对应于编码ESR2的参照序列(Genbank MN_001437)上的序列1640-1850。
□包含核苷酸序列SEQ ID No.7的至少10个、优选地15个和更优选地20个核苷酸残基的第一扩增引物和包含核苷酸序列SEQ ID No.8的至少10个、优选地15个和更优选地20个核苷酸残基的第二扩增引物；例如，当第一引物以SEQ ID No.7作为其序列，第二引物以SEQID No.8作为其序列时，获得对编码HER2的基因特异性的、具有185个碱基对大小的扩增子，该扩增子对应于编码HER2的参照序列(Genbank MN_004448)上的序列2567-2752。
□包含核苷酸序列SEQ ID No.13的至少10个、优选地15个和更优选地20个核苷酸残基的第一扩增引物和包含核苷酸序列SEQ IDNo.14的至少10个、优选地15个和更优选地20个核苷酸残基的第二扩增引物；例如，当第一引物以SEQ ID No.13作为其序列，第二引物以SEQ ID No.14作为其序列时，获得对编码ESR1的基因特异性的、具有858个碱基对大小的扩增子，该扩增子对应于编码ESR1的参照序列(Genbank X03635)上的序列808-1666。
□包含核苷酸序列SEQ ID No.15的至少10个、优选地15个和更优选地20个核苷酸残基的第一扩增引物和包含核苷酸序列SEQ IDNo.16的至少10个、优选地15个和更优选地20个核苷酸残基的第二扩增引物；例如，当第一引物以SEQ ID No.15作为其序列，第二引物以SEQ ID No.16作为其序列时，于是获得对编码PGR的基因特异性的、具有658个碱基对大小的扩增子，该扩增子对应于编码PGR的参照序列(Genbank NM_000926)上的序列2319-2977。
□包含核苷酸序列SEQ ID No.17的至少10个、优选地15个和更优选地20个核苷酸残基的第一扩增引物和包含核苷酸序列SEQ IDNo.18的至少10个、优选地15个和更优选地20个核苷酸残基的第二扩增引物；例如，当第一引物以SEQ ID No.17作为其序列，第二引物以SEQ ID No.18作为其序列时，于是获得对编码ESR2的基因特异性的、具有702个碱基对大小的扩增子，该扩增子对应于编码ESR2的参照序列(Genbank MN_001437)上的序列1246-1948。
□包含核苷酸序列SEQ ID No.19的至少10个、优选地15个和更优选地20个核苷酸残基的第一扩增引物和包含核苷酸序列SEQ IDNo.20的至少10个、优选地15个和更优选地20个核苷酸残基的第二扩增引物；例如，当第一引物以SEQ ID No.19作为其序列，第二引物以SEQ ID No.20作为其序列时，于是获得对编码HER2的基因特异性的、具有928个碱基对大小的扩增子，该扩增子对应于编码HER2的参照序列(Genbank MN_004448)上的序列2123-3051。
根据本发明的优选的实施方案，所述第一引物包含这样的启动子，即其允许通过噬菌体T7的聚合酶起始转录。特别是该引物可以是SEQ ID 21至24中的任一个。当第一引物包含允许噬菌体T7聚合酶启动转录的启动子时，该第一引物优选地存在于选自下列的引物对的引物对中：
□第一扩增引物SEQ ID No.21和包含核苷酸序列SEQ ID No.2的至少10个、优选地15个，更优选地20个核苷酸残基的第二扩增引物；
□第一扩增引物SEQ ID No.22和包含核苷酸序列SEQ ID No.4的至少10个、优选地15个，更优选地20个核苷酸残基的第二扩增引物；
□第一扩增引物SEQ ID No.23和包含核苷酸序列SEQ ID No.6的至少10个、优选地15个，更优选地20个核苷酸残基的第二扩增引物；
□第一扩增引物SEQ ID No.24和包含核苷酸序列SEQ ID No.8的至少10个、优选地15个，更优选地20个核苷酸残基的第二扩增引物；
本发明也涉及前面定义的至少一个扩增引物和/或前面定义的至少一对引物在NASBA扩增反应中的用途。
本发明也涉及用于获得对于管家基因特异性的扩增子的扩增引物。该扩增引物优选地包含选自SEQ ID No.25至29的序列的至少10个，优选地15个和更优选地20个核苷酸残基。
本发明也涉及用于获得对于管家基因特异性的扩增子的扩增引物对，所述引物对选自下列引物对：
□包含核苷酸序列SEQ ID No.27的至少10个、优选地15个和更优选地20个核苷酸残基的第一扩增引物和包含核苷酸序列SEQ IDNo.28的至少10个、优选地15个和更优选地20个核苷酸残基的第二扩增引物；例如，当第一引物以SEQ ID No.27作为其序列，第二引物以SEQ ID No.28作为其序列时，获得对PPIB基因特异性的、具有239个碱基对大小的扩增子，该扩增子对应于PPIB参照序列(GenbankM60857)上的序列231-470。
□包含核苷酸序列SEQ ID No.25的至少10个、优选地15个和更优选地20个核苷酸残基的第一扩增引物和包含核苷酸序列SEQ IDNo.26的至少10个、优选地15个和更优选地20个核苷酸残基的第二扩增引物；例如，当第一引物以SEQ ID No.25作为其序列，第二引物以SEQ ID No.26作为其序列时，获得对PPIB基因特异性的、具有639个碱基对大小的扩增子，该扩增子对应于PPIB参照序列(GenbankM60857)上的序列11-650。
根据本发明的特定实施方案，所述用于获得对于管家基因特异性的扩增子的扩增引物对包含这样的第一引物，即其包含允许通过噬菌体T7聚合酶启动转录的启动子。所述第一扩增引物优选地是SEQ ID No.30，所述第二扩增引物优选地包含核苷酸序列SEQ ID No.28的至少10个、优选地15个和更优选地20个核苷酸残基。本发明也涉及这样的检测探针，即其包含选自SEQ ID No.1至SEQ ID No.20的核苷酸序列的至少10个、优选地15个和更优选地20个核苷酸残基。
优选地，该检测探针包含荧光团和淬灭基团。
本发明也涉及用于检测对于管家基因特异性的扩增子的杂交探针。优选地，该检测探针包含选自SEQ ID No.27至29的核苷酸序列的至少10个、优选地15个和更优选地20个核苷酸残基。优选地，该检测探针包含荧光团和淬灭基团。
本发明也涉及使用至少一个如前面所定义的引物和/或至少一对如前面所定义的引物对和/或至少一个如前面所定义的检测探针诊断/预后乳腺癌。
本发明最后涉及用于乳腺癌的诊断/预后的试剂盒，其包含至少一个如前面所定义的引物和/或至少一对如前面所定义的引物对和/或至少一个如前面所定义的检测探针。
如下面的实施例中所示的，当我们希望检测编码ESR1的靶基因时，试剂盒还包含
□第一引物SEQ ID No.1或21
□第二引物SEQ ID No.2
□包含SEQ ID No.9的检测探针。
如下面的实施例中所示的，当我们希望检测编码PGR的靶基因时，试剂盒优选地包含
□第一引物SEQ ID No.3或22
□第二引物SEQ ID No.4
□包含SEQ ID No.10的检测探针。
如下面的实施例中所示的，当我们希望检测编码ESR2的靶基因(参照序列NCBI目录号：MN_001437)时，试剂盒优选地包含
□第一引物SEQ ID No.5或23
□第二引物SEQ ID No.6
□包含SEQ ID No.11的检测探针。
如下面的实施例中所示的，当我们希望检测编码HER2的靶基因(参照序列NCBI目录号：NM_00448)时，试剂盒优选地包含
□第一引物SEQ ID No.7或24
□第二引物SEQ ID No.8
□包含SEQ ID No.12的检测探针。
如下面的实施例中所示的，和根据本发明的特定实施方案，试剂盒还包含
□第一引物SEQ ID No.27或30
□第二引物SEQ ID No.28
□包含SEQ ID No.29的检测探针。
下面的图是以举例说明的方式给出并且绝不是限制性的。其将有助于理解本发明。
图1显示实施例1-3a中描述的对基因ESR1(图1a)、PGR(图1b)、ESR2(图1c)、HER2(图1d)和PPIB(图1e)获得的标准曲线。各基因的各标准曲线(基于质粒中对于所述基因特异性的参照序列在体外转录成RNA而获得的)表示出现扩增指数期所需的时间(也称为TTP：阳性，阈值时间)，其为在NASBA扩增起始时存在的RNA的拷贝数的函数(在扩增起始时RNA拷贝的初始数目越大，出现指数期所需的时间越短)。
下列的实施例是以举例说明的方式给出的并且绝不是限制性的。其有助于理解本发明。
实施例1-编码ESR1、PGR、ESR2和HER2的mRNAs的扩增和实时检测
1/获得和制备样品
使用肿瘤细胞的三个品系进行该实施例，之前通过IHC法或放射性配体法(或LBA)确定了所述肿瘤细胞的激素受体的表达，使用的三个系是：MCF-7(表达受体ESR1和PGR)、T47D(不表达ESR1受体但表达PGR受体)以及BT-549(既不表达ESR1受体也不表达PGR受体)。从美国典型培养物保藏中心(ATCC，Manassas，USA)获得这些品系。将这些细胞在37℃下、含有5％CO2的气体环境中培养在含有胎牛血清(10％)、L-谷氨酸(2mM)、非必需氨基酸(1％)和链霉素(10μg/ml)的DMEM培养基(MCF-7)或RPMI 1640(T47D和BT-549)中。
也使用来自患有乳腺癌的患者(n＝102)的肿瘤进行该实施例，之前已根据本领域技术人员已知的常规方法通过放射性配体法(LBA)确定了所述肿瘤的激素受体ER和PR(也称作ESR1和PGR)的表达。LBA技术告诉我们功能性受体ER和PR在细胞的细胞质中的存在。之前已按照本领域技术人员已知的常规方法，通过定量PCR法(为我们提供关于HER2基因扩增的信息)和ELISA法(提供关于由HER2基因编码的膜蛋白的表达的信息)确定了HER2的表达。
2/总RNAs的提取
根据试剂盒提供商(Invitrogen，Canada)的推荐使用Trizol试剂从细胞系中提取总RNAs。在260和280nm确定RNA的质量和数量并在琼脂糖凝胶上进行证实。然后将RNAs在-70℃下冻存待用。
也以相似的方法从来自患有乳腺癌的患者的肿瘤中提取总RNAs。
3)NASBA扩增
NASBA扩增反应基于禽类成髓细胞瘤病毒(AMV-RT)的逆转录酶、大肠杆菌(E.coli)的RNA酶H和噬菌体T7的RNA聚合酶的同时活性(Compton J，1991，Nature，350：91-92)。如前面所述，使用NuclisensEasyQ读出器(bioMérieux BV，the Netherlands)和“分子信标”检测探针进行扩增子的实时检测。NASBA中的定量基于标准曲线的使用，所述标准曲线是始于质粒中的对于靶基因特异性的参照序列在体外转录成RNA而获得的。该标准曲线表示出现扩增的指数期所需的时间，其为在NASBA扩增起始时存在的RNA的拷贝数的函数(扩增起始时RNA的起始拷贝数越大，出现指数期所需的时间越短)。
a)基因ESR1、PGR、ESR2、HER2和PPIB管家基因的扩增-获取标准典线
编码ESR1的靶基因的标准曲线
对于编码ESR1的靶基因(参照序列NCBI目录号：X03635)，使用分别位于参照序列的位点808-832和1646-166的第一引物SEQ IDNo.135′TACAGGCCAA ATTCAGATAA TCGAC 3′和第二引物SEQ ID No.14 5′GGAACCGAGAT GATGTAGCCA 3′，以通过PCR产生(第一循环的变性(95℃；1分钟)；然后35个包括下列步骤的循环：变性：94℃；1分钟；杂交：60℃；1分钟；延伸：72℃；2分钟，以及最后的循环，其包括变性步骤：72℃；7分钟)858个碱基对大小的、对编码ESR1的基因特异性的扩增子(其被称为“ESR1扩增子”)。
然后将如上所述获得的ESR1扩增子克隆为质粒pGEM-T(Promega，Madison，USA)。
通过测序(Biofidal，Vaulx en Velin，France)验证这些ESR1扩增子的序列以确保其确实对应于待扩增的靶基因的序列。获得的扩增子对于ESR1基因确实是特异性的。
然后使用RNA聚合酶(T7或SP6(Megascriptkit，Ambion，Austin，USA)，依赖于扩增子方向)在体外将扩增子转录成RNA。在用DNA酶除去质粒后，使用RneasyMini试剂盒(Qiagen，Hilden，Germany)对RNAs进行纯化和定量(RNA6000Nano，AgilentTechnologies，Walbronn，Germany)。
将上面获得的RNAs稀释成各种浓度(母液：0.2×1011拷贝/μl，以0.2×1011拷贝/μl至0.2×102拷贝/μl进行级联稀释)。在特异性引物ESR1 SEQ ID No.1和ESR1 No.2以及“分子信标”SEQ ID No.9存在的情况下，使用Nuclisens basic试剂盒(bioMérieux BV，theNetherlands)通过NASBA扩增级联稀释的这些稀释物：
□0.2μM的第一ESR1引物SEQ ID No.15′CTCCACCATGCCCTCTACACA3′，在其5′末端，其包含(并以小写字母显示)含有T7聚合酶启动子的序列，即其全长序列是SEQ ID No.21：5′aattctaata cgactcactatagggagaag gCTCCACCAT GCCCTCTACA CA 3′的第一引物，
□0.2μM的第二ESR1引物SEQ ID No.2 5′ACATGATCAACTGGGCGAAGA3′，
□0.1μM的“分子信标”，其包含在5’端标记有荧光团FAM(6-羧基荧光素)和在3’标记有“淬灭基团”(Dabsyl)的SEQ ID No.9 5′GATCCTGATGATTGGTCTCG 3′(完整序列：5′FAM-cgatcgGATC CTGATGATTGGTCTCGcgat cg-Dabsyl 3′)。
随着扩增进行，信号按产生的扩增子的量成比例增强。作为时间函数的荧光曲线使得可能确定扩增的指数期出现的时间(也称为TTP：阳性，阈值时间)。在NASBA扩增中，标准曲线ESR1使最初存在于溶液中的转录物的数目成为检测到的TTP的函数。使用标准曲线，计算靶基因拷贝的绝对数目。最后，在管家基因(在本情况下是PPIB基因)的基础上规范化该值。该标准曲线ESR1显示于图1a。
编码PGR的靶基因的标准曲线
根据和对于ESR1的原理相同的原理构建编码PGR的靶基因的曲线，除了使用的对PGR特异性的扩增引物和“分子信标”。
因此，对于编码PGR的靶基因(参照序列NCBI目录号：NM_000926)，使用分别位于参照序列的位点2319-2340和2955-2977的第一引物SEQ ID No.15 5′TGACAAGTCTTAATCAACTAGG 3′和第二引物SEQ ID No.16 5′TCACTTTTTAT GAAAGAGAAGGG 3′。通过测序(Biofidal，Vaulx en Velin，France)验证这些PGR扩增子的序列以确保其确实对应于待扩增的靶基因的序列。获得的扩增子对于PGR基因确实是特异性的。
然后使用RNA聚合酶(T7或SP6(Megascript试剂盒，Ambion，Austin，USA)，依赖于扩增子方向)在体外将扩增子转录成RNA。在用DNA酶除去质粒后，使用RneasyMini试剂盒(Qiagen，Hilden，Germany)对RNAs进行纯化和定量(RNA6000Nano，AgilentTechnologies，Walbronn，Germany)。
将上面获得的RNAs稀释成各种浓度(母液：0.2×1011拷贝/μl，以0.2×1011拷贝/μl至0.2×102拷贝/μl进行级联稀释)。在下列物质存在的情况下，使用Nuclisens basic试剂盒(bioMérieux BV，theNetherlands)通过NASBA扩增这些经级联稀释的稀释物：
□0.1μM的第一PGR引物SEQ ID No.3 5′TCCCTGCCAATATCTTGGGTA3′，在其5′末端，其包含(并以小写字母显示)含有T7聚合酶启动子的序列，即第一引物的完整序列是SEQ ID No.22：5′aattctaatacgactcacta tagggagaag gTCCCTGCCA ATATCTTGGG TA 3′，
□0.1μM的第二PGR引物SEQ ID No.4 5′AGTTGTGTCGAGCTCACAGC3′，
□使用0.1μM的“分子信标”，其包含在其5’端标记有荧光团FAM(6-羧基荧光素)和在其3’标记有“淬灭基团”(Dabsyl)的SEQ IDNo.10 5′CGGGCACTGAGTGTTGAATT 3′(完整序列：5′FAM-cgatcgCGGG CACTGAGTGT TGAATTcgat cg-Dabsyl 3′)。
标准曲线PGR显示于图1B。
编码ESR2的靶基因的标准曲线
根据和对于ESR1的原理相同的原理构建编码ESR2的靶基因的曲线，除了使用的对于ESR2是特异性的扩增引物和“分子信标”。
因此，对于编码ESR2的靶基因(参照序列NCBI目录号：MN_001437)，使用分别位于参照序列的位点1246-1263和1928-1948的第一引物SEQ ID No.17 5′GCCGCCCCAT GTGCTGAT 3′和第二引物SEQ ID No.18 5′GGACCCCGTGA TGGAGGACTT 3′。通过测序(Biofdal，Vaulx en Velin，France)验证这些ESR2扩增子的序列以确保其确实对应于待扩增的靶基因的序列。获得的扩增子对于ESR2基因确实是特异性的。
然后使用RNA聚合酶(T7或SP6(Megascript试剂盒，Ambion，Austin，USA)，依赖于扩增子方向)在体外将扩增子转录成RNA。在用DNA酶除去质粒后，使用RneasyMini试剂盒(Qiagen，Hilden，Germany)对RNAs进行纯化和定量(RNA6000Nano，AgilentTechnologies，Walbronn，Germany)。
将上面获得的RNAs稀释成各种浓度(母液：0.2×1011拷贝/μl，以0.2×1011拷贝/μl至0.2×102拷贝/μl进行级联稀释)。在下列物质存在的情况下，使用Nuclisens basic试剂盒(bioMérieux BV，theNetherlands)通过NASBA扩增这些经级联稀释的稀释物：
□0.2μM的第一ESR2引物SEQ ID No.5 5′TGAGCAGATGTTCCATGCCCT3′，在其5′末端包含(并以小写字母显示)含有T7聚合酶启动子的序列，即第一引物的完整序列是SEQ ID No.23：5′aattctaatacgactcacta tagggagaag gTGAGCAGAT GTTCCATGCC CT 3′，
□0.2μM的第二ESR2引物SEQ ID No.6 5′TCCAGTATGT ACCCTCTGGT3′，
□0.1μM的“分子信标”，包含在其5’端标记有荧光团FAM(6-羧基荧光素)和在其3’标记有“淬灭基团”(Dabsyl)的SEQ ID No.115′GATGCTTTGGTTTGGGTGAT 3′。
标准曲线ESR2显示于图1C。
编码HER2的靶基因的标准曲线
根据和对于ESR1的原理相同的原理构建编码HER2的靶基因的曲线，除了使用的扩增引物和“分子信标”对于HER2是特异性的。
因此，对于编码HER2的靶基因(参照序列NCBI目录号：NM_00448)，使用分别位于参照序列的位点2123-2147和3027-3051的第一引物SEQ ID No.19 5′TGGTTGGCAT TCTGCTGGTC GTGGT 3′和第二引物SEQ ID No.20 5′TGGCCGACAT TCAGAGTCAA TCATC 3′。通过测序(Biofidal，Vaulx en Velin，France)验证这些HER2扩增子的序列以确保其确实对应于待扩增的靶基因的序列。获得的扩增子对于HER2基因确实是特异性的。
然后使用RNA聚合酶(T7或SP6(Megascript试剂盒，Ambion，Austin，USA)，依赖于扩增子方向)在体外将扩增子转录成RNA。在用DNA酶除去质粒后，使用RneasyMini试剂盒(Qiagen，Hilden，Germany)对RNAs进行纯化和定量(RNA6000Nano，AgilentTechnologies，Walbronn，Germany)。
将上面获得的RNAs稀释成各种浓度(母液：0.2×1011拷贝/μl，以0.2×1011拷贝/μl至0.2×102拷贝/μl进行级联稀释)。在下列物质存在的情况下，使用Nuclisens basic试剂盒(bioMérieux BV，theNetherlands)通过NASBA扩增这些经级联稀释的稀释物：
□0.2μM的第一HER2引物SEQ ID No.7 5′GAGCCAGCCC GAAGTCTGTA3′，在其5′末端包含(并以小写字母显示)T7聚合酶启动子，即第一引物的完整序列是SEQ ID No.24：5′aattctaata cgactcactatagggagaag g GAGCCAGC CCGAAGTCTG TA 3′，
□0.2μM的第二HER2引物SEQ ID No.8 5′TCTTAGACCA TGTCCGGGAAA 3′，
□0.1μM的使用的“分子信标”，包含在其5’端标记有荧光团FAM(6-羧基荧光素)和在其3’末端标记有“淬灭基团”(Dabsyl)的SEQ IDNo.12 5′GGAGGATGTG CGGCTCGTAC 3′。
标准曲线HER2显示于图1D。
PPIB靶基因的标准曲线
根据和对于ESR1的原理相同的原理构建编码PPIB靶基因的曲线，除了使用的扩增引物和“分子信标”对于PPIB是特异性的。
因此，对于PPIB管家基因(参照序列NCBI目录号：M60857)，使用分别位于参照序列的位点11-30和631-650的第一引物SEQ ID No.25 5′ACATGAAGGT GCTCCTTGCC 3′和第二引物SEQ ID No.26 5′GTCCCTGTGC CCTACTCCTT 3′。通过测序(Biofidal，Vaulx en Velin，France)验证这些PPIB扩增子的序列以确保其确实对应于待扩增的靶基因的序列。获得的扩增子对于PPIB基因确实是特异性的。
然后使用RNA聚合酶(T7或SP6(Megascript试剂盒，Ambion，Austin，USA)，依赖于扩增子方向)在体外将扩增子转录成RNA。在用DNA酶除去质粒后，使用RneasyMini试剂盒(Qiagen，Hilden，Germany)对RNAs进行纯化和定量(RNA6000Nano，AgilentTechnologies，Walbronn，Germany)。
将上面获得的RNAs稀释成各种浓度(母液：0.2×1011拷贝/μl，以0.2×1011拷贝/μl至0.2×102拷贝/μl进行级联稀释)。在下列物质存在的情况下，使用Nuclisens basic试剂盒(bioMérieux BV，theNetherlands)通过NASBA扩增这些经级联稀释的稀释物：
□0.2μM的第一PPIB引物SEQ ID No.27 5′CAGGCTGTCTTGACTGTCGT GA 3′，在其5′末端包含(并以小写字母显示)含有T7聚合酶启动子的序列，即第一引物的完整序列是SEQ ID No.30：5′aattctaata cgactcacta tagggagaag gCAGGCTGTC TTGACTGTCG TGA 3′，
□0.2μM的第二PPIB引物SEQ ID No.28 5′AGGAGAGAAAGGATTTGGCT 3′，
□0.1μM的“分子信标”，其包含在其5’端标记有荧光团ROX(6-羧基-X-罗丹明)和在其3’标记有“淬灭基团”(Dabsyl)的SEQ IDNo.29 5′GATCCAGGGCGGAGACTTCA 3′(完整序列：5′ROX-cgatcgGATC CAGGGCGGAG ACTTCAcgat cg-Dabsyl 3′)。
标准曲线PPIB显示于图1E。
b)NASBA扩增反应
b1)ESR1和PPIB基因的双重扩增
使用Nuclisens basic试剂盒(bioMérieux BV，theNetherlands)进行该扩增反应。为进行该反应，将5ng从不同细胞系中提取的总RNA加入10μl NASBA缓冲液(在20μl的反应介质中的终浓度：40mM Tris HCl pH8.5、12mM MgCl2、70mM KCl、5mM二硫苏糖醇、15％v/v DMSO、1mM各dNTP、2mM各NTP)。
将0.1μM包含
□SEQ ID No.9 5′GATCCTGATGATTGGTCTCG 3′，在5’端标记有荧光团FAM(6-羧基荧光素)和在其3’标记有“淬灭基团”(Dabsyl)，(完整序列：5′FAM-cgatcgGATC CTGATGATTG GTCTCGcgatcg-Dabsyl 3′，用于检测ESR1基因的RNAs)，
□SEQ ID No.29 5′GATCCAGGGCGGAGACTTCA 3′，在5’端标记有荧光团FOX(6-羧基-X-罗丹明)和在3’标记有“淬灭基团”(Dabsyl)，(完整序列：5′ROX-cgatcgGATC CAGGGCGGAGACTTCAcgat cg-Dabsyl 3′，用于检测PPIB基因的RNAs)，的“分子信标”加入该介质。
也将下列引物加入至该介质：
□0.2μM的第一ESR1引物SEQ ID No.1 5′CTCCACCATG CCCTCTACACA 3′，在其5′末端包含(并以小写字母显示)含有T7聚合酶启动子的序列，即其完整序列是SEQ ID No.21：5′aattctaata cgactcactatagggagaag gCTCCACCAT GCCCTCTACA CA 3′的第一引物，
□0.2μM的第二ESR1引物SEQ ID No.2 5′ACATGATCAA CTGGGCGAAGA 3′，
□0.2μM的第一PPIB引物SEQ ID No.27 5′CAGGCTGTCTTGACTGTCGTGA 3′，在其5′末端包含(并以小写字母显示)含有T7聚合酶启动子的序列，即其完整序列是SEQ ID No.30：5′aattctaatacgactcacta tagggagaag gCAGGCTGTC TTGACTGTCG TGA 3′的第一引物，
□0.2μM的第二PPIB引物SEQ ID No.28 5′AGGAGAGAAAGGATTTGGCT 3′。
在41℃下温育2分钟之前，在65℃下预温育2分钟。加入5μl体积的酶混合物(0.08U的RNA酶H、32U的RNA聚合酶T7、6.4U的AMV-RT)，并在41℃下温育90分钟。
对经转录的RNAs进行实时定量(NucliSens EasyQ，bioMérieux)，NASBA反应产生这样的扩增子，即特异性的“分子信标”可与其同时杂交，产生荧光信号。通过在荧光读出器(NucliSens EasyQ分析仪)上连续监控信号来实时测量新的RNA分子的形成。由Nuclisens TTP软件(bioMérieux BV，the Netherlands)提供分析和结果的自动报告。使用前面所定义的标准曲线(经转录的RNA的稀释度：108至102拷贝)对各靶ESR1基因和PPIB管家基因的表达进行定量，以推断每个样品的mRNA拷贝数。靶基因表达的量表示为mRNA拷贝数/5ng总RNA。
表1显示使用5ng来源于细胞系MCF-7、T47D和BT-549的总RNA定量的ESR1基因的表达。
    mRNA的拷贝数ESR1     mRNA的拷贝数PPIB     ESR1/PPIB
    MCF-7     2.24×104     7.43×105     3.01×10-2
    T47D     3.24×104     2.34×106     1.38×10-2
    BT549     NC     4.43×106     NC
表1-ESR1基因在MCF-7，T47D，BT-549细胞中的表达(NC：不能被计算)
ESR1基因的表达表示为靶基因的mRNA拷贝数与管家基因的mRNA拷贝数的比例。因此，ESR1的mRNAs在MCF-7细胞中表达而其未在BT-549细胞中被检测到，与这些细胞的激素受体的表达一致。注意虽然ESR1的mRNAs在T47D细胞中表达，但只有PGR受体表达，暗示着ESR1基因的转录后调控。
表2显示使用50ng获自IHC+肿瘤(即表达肿瘤细胞的核激素受体)或来自IHC-肿瘤(即不表达核激素受体)的总RNA定量的ESR1基因的表达(3-7个肿瘤的平均值)
ESR1 mRNA的平均拷贝数 PPIB mRNA的平均拷贝数   ESR1/PPIB
  IHC+肿瘤     2.64×105     4.71×106   5.61×10-2
  IHC-肿瘤     9.62×103     9.39×106   1.02×10-3
表2-ESR1基因在IHC+和IHC-肿瘤中的表达
ESR1的表达表示为靶基因的mRNA的拷贝数与管家基因的mRNA拷贝数的比例。在IHC+肿瘤中观察到ESR1基因的过量表达。
基于前面构建的ESR1和PPIB标准曲线，确定双重扩增的ESR1和PPIB基因的检测极限和定量极限。对于ESR1和PPIB，观察到定量极限为100个mRNA拷贝。对于ESR1和PPIB，检测极限是100个mRNA拷贝。
通过在对于PGR特异性的“分子信标”存在的情况下扩增ESR1和通过在特异性针对ESR1的“分子信标”存在的情况下扩增PGR来检测ESR1/PPIB双体的特异性。没有检测到信号。类似地，当以从BT-549(ESR1和PGR呈阴性的细胞系)中获得的总RNAs起始进行NASBA时，没有观测到信号。
使用另外的扩增技术(定量RT-PCR)确认所有这些结果。此外，使针对ESR1基因的通过NASBA技术在信使RNA水平上获得的结果和通过LBA法(配体结合测定法)(ESR：r＝0.77，p＜0.0001；Spearman相关性统计检验(Spearman statistical test of correlation))在蛋白质水平上获得的结果产生关联。这些结果显示ESR1的mRNAs的表达与细胞质中功能性受体的存在关联，肯定了在mRNA水平上观测该基因的表达的有利方面。
这些结果表明NASBA中的ESR1/PPIB双体允许在非常少量的总RNA的基础上，和，更广义地在非常少量肿瘤细胞的基础上对ESR1基因的表达进行定量，并且其完全适合用于研究乳腺癌的诊断/预后和患者对特定治疗的反应。
b2)PGR和PPIB基因的双重扩增
使用Nuclisens basic试剂盒(bioMérieux BV，theNetherlands)进行该扩增反应。为进行该反应，将5ng从不同细胞系中提取的总RNA加入至10μl NASBA缓冲液(在20μl的反应介质中的终浓度：40mM Tris HCl pH8.5、12mM MgCl2、70mM KCl、5mM二硫苏糖醇、15％v/v DMSO、1mM各dNTP、2mM NTP)。
将0.1μM包含
□SEQ ID No.10 5′CGGGCACTGAGTGTTGAATT 3′，在其5’末端标记有荧光团FAM(6-羧基荧光素)和在其3’末端标记有“淬灭基团”(Dabsyl)(完整序列：5′FAM-cgatcgCGGG CACTGAGTGTTGAATTcg at cg-Dabsyl 3′)，用于在PGR/亲环蛋白B双重扩增中检测编码PGR的RNAs。
□SEQ ID No.29 5′GATCCAGGGCGGAGACTTCA 3′，在5’端标记有荧光团ROX(6-羧基-X-罗丹明)和在其3’标记有“淬灭基团”(Dabsyl)，(完整序列：5′ROX-cgatcgGATC CAGGGCGGAGACTTCAcgat cg-Dabsyl 3′，用于检测编码PPIB基因的RNAs)，的“分子信标”加入至该介质。
也将下列引物加入该介质：
□0.1μM的第一PGR引物SEQ ID No.3 5′TCCCTGCCAA TATCTTGGGTA 3′，在其5′末端包含(并以小写字母显示)含有T7聚合酶启动子的序列，即其完整序列是SEQ ID No.22：5′aattctaata cgactcactatagggagaag gTCCCTGCCA ATATCTTGGG TA 3′的第一引物，
□0.1μM的第二PGR引物SEQ ID No.4 5′AGTTGTGTCG AGCTCACAGC3′，
□0.2μM的第一PPIB引物SEQ ID No.27 5′CAGGCTGTCTTGACTGTCGTGA 3′，在其5′末端包含(并以小写字母显示)含有T7聚合酶启动子的序列，即其完整序列是SEQ ID No.30：5′aattctaatacgactcacta tagggagaag gCAGGCTGTC TTGACTGTCG TGA 3′的第一引物，
□0.2μM的第PPIB引物SEQ ID No.28 5′AGGAGAGAAAGGATTTGGCT 3′。
在41℃下温育2分钟之前，在65℃下先预温育2分钟。加入5μl体积的酶混合物(0.08U的RNA酶H、32U的RNA聚合酶T7、6.4U的AMV-RT)，并在41℃下温育90分钟。
根据和对于ESR1的原理相似的原理对经转录的RNAs进行实时定量。使用如前面所定义的标准曲线(经转录的RNA的稀释度：108至102拷贝)对各靶PGR基因和PPIB管家基因的表达进行定量，以推断每个样品的mRNA拷贝数。靶基因表达的量表示为mRNA拷贝数/5ng总RNA。
表3显示使用5ng来源于细胞系MCF-7、T47D和BT-549的总RNA定量的PGR基因的表达。
    mRNA的拷贝数PGR     mRNA的拷贝数PPIB     PGR/PPIB
    MCF-7     4.35×102     2.54×106     1.71×10-4
    T47D     3.92×104     8.32×105     4.71×10-2
    BT549     NC     9.73×106     NC
表3-PGR基因在MCF-7，T47D，BT-549细胞中的表达
PGR基因的表达表示为靶基因的mRNA拷贝数与管家基因的mRNA拷贝数的比例。因此，PGR的mRNAs在MCF-7和T47D细胞中表达但其在BT-549细胞中未被检测到，与这些细胞的激素受体的表达一致。
表4显示使用50ng获自IHC+肿瘤(即在肿瘤细胞的表面表达激素受体)或来自IHC-肿瘤(即不在其表面表达激素受体)的总RNA定量的PGR基因的表达(3-7个肿瘤的平均值)
PGR mRNA的平均拷贝数 PPIB mRNA的平均拷贝数     PGR/PPIB
 IHC+肿瘤     2.78×103     9.23×107     3.01×10-4
 IHC-肿瘤     2.98×103     1.91×106     1.56×10-4
表4-PGR基因在IHC+和IHC-肿瘤中的表达
PGR基因的表达表示为靶基因的mRNA的拷贝数与管家基因的mRNA拷贝数的比例。在IHC+肿瘤中观察到PGR基因的过量表达。
基于前面构建的PGR和PPIB标准曲线，确定双重扩增的PGR和PPIB基因的检测极限和定量极限。对于PGR和PPIB，分别观察到定量极限为100和1000个mRNA拷贝。对于PGR和PPIB，检测极限是100个mRNA拷贝。
通过在对于ESR1特异性的“分子信标”存在的情况下扩增PGR来检测PGR/PPIB双体的特异性。没有检测到信号。类似地，当以从BT-549(PGR呈阴性的细胞系)中获得的总RNAs起始进行NASBA时，没有观测到信号。
使用另外的扩增技术(定量RT-PCR)来确认所有这些结果。此外，使针对PGR基因的通过NASBA技术在信使RNA水平上获得的结果和通过LBA法(配体结合测定法)(PGR：r＝0.87，p＜0.0001，n＝102；Spearman相关性统计检验(Spearman statistical test ofcorrelation))在蛋白质水平上获得的结果关联。这些结果显示PGR的mRNAs的表达与细胞质中功能性受体的存在关联，肯定了在mRNA水平上研究该基因表达的有利方面。
这些结果表明NASBA中的PGR/PPIB双体允许在非常少量的总RNA的基础上，和，更广义地在非常少量肿瘤细胞的基础上对PGR基因的表达进行定量，并且其完全适合用于研究乳腺癌的诊断/预后和患者对特定治疗的反应。
b3)ESR2和PPIB基因的双重扩增
使用Nuclisens basic试剂盒(bioMérieux BV，theNetherlands)进行该扩增反应。为进行该反应，将5ng从不同细胞系中提取的总RNA加入至10μl NASBA缓冲液(在20μl的反应介质中的终浓度：40mM Tris HCl pH8.5、12mM MgCl2、70mM KCl、5mM二硫苏糖醇、15％v/v DMSO、各dNTP 1mM、各NTP 2mM)。
将0.1μM包含
□SEQ ID No.11 5′GATGCTTTGGTTTGGGTGAT 3′，在其5’末端标记有荧光团FAM(6-羧基荧光素)和在其3’末端标记有“淬灭基团”(Dabsyl)。
□SEQ ID No.29 5′GATCCAGGGCGGAGACTTCA 3′，在5’端标记有荧光团ROX(6-羧基-X-罗丹明)和在其3’标记有“淬灭基团”(Dabsyl)，(完整序列：5′ROX-cgatcgGATC CAGGGCGGAGACTTCAcgat cg-Dabsyl 3′，用于检测编码亲环蛋白B的PPIB基因的RNAs)，的“分子信标”加入该介质。
也将下列引物加入该介质：
□0.2μM的第一ESR2引物SEQ ID No.5 5′TGAGCAGATG TTCCATGCCCT 3′，在其5′末端包含(并以小写字母显示)T7聚合酶启动子，即其完整序列是SEQ ID No.23：5′aattctaata cgactcactatagggagaag gTGAGCAGAT GTTCCATGCC CT 3′的第一引物，
□0.2μM的第二ESR2引物SEQ ID No.6 5′TCCAGTATGT ACCCTCTGGT3′，
□0.2μM的第一PPIB引物SEQ ID No.27 5′CAGGCTGTCTTGACTGTCGTGA 3′，在其5′末端包含(并以小写字母显示)T7聚合酶启动子，即其完整序列是SEQ ID No.30：5′aattctaata cgactcactatagggagaag gCAGGCTGTC TTGACTGTCG TGA 3′的第一引物，0.2μM的第二PPIB引物SEQ ID No.28 5′AGGAGAGAAA GGATTTGGCT 3′。
在41℃下温育2分钟之前，在65℃下先预温育2分钟。加入5μl体积的酶混合物(0.08U的RNA酶H、32U的RNA聚合酶T7、6.4U的AMV-RT)，并在41℃下温育90分钟。
对经转录的RNAs进行实时定量(NucliSens EasyQ，bioMérieux)，NASBA反应产生这样的扩增子，即特异性的“分子信标”可与其同时杂交，产生荧光信号。通过在荧光读出器(NucliSens EasyQ分析仪)上连续监控信号来实时测量新的RNA分子的形成。由Nuclisens TTP软件(bioMérieux BV，the Netherlands)提供分析和结果的自动报告。使用前面所定义的标准曲线(经转录的RNA的稀释度：108至102拷贝)对各靶ESR2基因和PPIB管家基因的表达进行定量，使得可能推断每个样品的mRNA拷贝数。
基于前面构建的ESR2和PPIB标准曲线，确定各基因的检测极限和定量极限。对于ESR2和PPIB，分别观察到定量极限为1000和10000个mRNA拷贝。对于ESR2和PPIB，检测极限是1000个mRNA拷贝。
通过在对于HER2特异性的“分子信标”存在的情况下扩增ESR2，和通过在对于ESR2特异性的“分子信标”存在的情况下扩增HER2来检测ESR2/PPIB双体的特异性。没有检测到信号。
这些结果表明NASBA中的ESR2/PPIB双体允许在非常少量的总RNA的基础上特异性和灵敏性地扩增ESR2基因，使得该双体完全适合用于研究乳腺癌的诊断/预后和患者对特定治疗的反应。
b4)HER2和PPIB基因的双重扩增
使用Nuclisens basic试剂盒(bioMérieux BV，theNetherlands)进行该扩增反应。为进行该反应，将5ng从不同细胞系中提取的总RNA加入至10μl NASBA缓冲液(在20μl的反应介质中的终浓度：40mM Tris HCl pH8.5、12mM MgCl2、70mM KCl、5mM二硫苏糖醇、15％v/v DMSO、各dNTP 1mM、各NTP 2mM)。
将0.1μM包含
□SEQ ID No.12 5′GGAGGATGTG CGGCTCGTAC 3′，在其5’末端标记有荧光团FAM(6-羧基荧光素)和在其3’末端标记有“淬灭基团”(Dabsyl)，用于在HER2/PPIB双重扩增中检测编码HER2的RNA，
□SEQ ID No.29 5′GATCCAGGGCGGAGACTTCA 3′，在5’端标记有荧光团ROX(6-羧基-X-罗丹明)和在其3’标记有“淬灭基团”(Dabsyl)，(完整序列：5′ROX-cgatcgGATC CAGGGCGGAGACTTCAcgat cg-Dabsyl 3′，用于检测编码亲环蛋白B的PPIB基因的RNAs)，的“分子信标”加入至该介质。
也将下列引物加入该介质：
□0.2μM的第一HER2引物SEQ ID No.7 5′GAGCCAGCCC GAAGTCTGTA3′，在其5′末端包含(并以小写字母显示)T7聚合酶启动子，即其完整序列是SEQ ID No.24：5′aattctaata cgactcacta tagggagaagg GAGCCAGC CCGAAGTCTG TA 3′的第一引物，
□0.2μM的第二HER2引物SEQ ID No.8 5′TCTTAGACCA TGTCCGGGAAA 3′，
□0.2μM的第一亲环蛋白B引物SEQ ID No.27 5′CAGGCTGTCTTGACTGTCGTGA 3′，在其5′末端包含(并以小写字母显示)T7聚合酶启动子，即其完整序列是SEQ ID No.30：5′aattctaata cgactcactatagggagaag gCAGGCTGTC TTGACTGTCG TGA 3′的第一引物，0.2μM的第二亲环蛋白B引物SEQ ID No.28 5′AGGAGAGAAA GGATTTGGCT 3′。
在41℃下温育2分钟之前，在65℃下先预温育2分钟。加入5μl体积的酶混合物(0.08U的RNA酶H、32U的RNA聚合酶T7、6.4U的AMV-RT)，并在41℃下温育90分钟。
对经转录的RNAs进行实时定量(NucliSens EasyQ，bioMérieux)，NASBA反应产生这样的扩增子，即特异性的“分子信标”可与其同时杂交，产生荧光信号。通过在荧光读出器(NucliSens EasyQ分析仪)上连续监控信号来实时测量新的RNA分子的形成。由Nuclisens TTP软件(bioMérieux BV，the Netherlands)提供分析和结果的自动报告。使用前面所定义的标准曲线(经转录的RNA的稀释度：108至102拷贝)对各靶HER2基因和PPIB管家基因的表达进行定量，这使得可能推断出每个样品的mRNA拷贝数。
基于前面构建的HER2和PPIB标准曲线，确定各基因的检测极限和定量极限。对于HER2和PPIB，分别观察到定量极限为1000和10000个mRNA拷贝。对于HER2和PPIB，检测极限是100个mRNA拷贝。
通过在对于HER2特异性的“分子信标”存在的情况下扩增ESR2，和通过在特异性针对ESR2的“分子信标”存在的情况下扩增HER2来检测HER2/PPIB双体的特异性。没有检测到信号。
这些针对HER2基因通过NASBA技术在信使RNA水平上获得的结果和在定量PCR(r＝0.54，p＜0.0001，n＝97，Spearman相关性统计学检验)中和在ELISA(r＝0.50，p＜0.0001，n＝93；Spearman相关性统计学检验)中获得的结果相关联。这些结果显示HER2的mRNA的表达与基因的扩增以及HER2膜受体的过量表达相关联，肯定了在mRNA水平上研究该基因表达的有利方面。
这些结果表明NASBA中的HER2/PPIB双体允许在非常少量的总RNA的基础上特异性和灵敏性地扩增HER2基因，使得该双体完全适合用于研究乳腺癌的诊断/预后和患者对特定治疗的反应。
序列表
<110>bioMérieux SA
<120>用于乳腺癌的诊断/预后的方法
<130>未知
<160>30
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>21
<212>DNA
<213>智人
<400>1
ctccaccatg ccctctacac a                                              21
<210>2
<211>21
<212>DNA
<213>智人
<400>2
acatgatcaa ctgggcgaag a                                              21
<210>3
<211>21
<212>DNA
<213>智人
<400>3
tccctgccaa tatcttgggt a                                              21
<210>4
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Claims (18)

1.用于乳腺癌的诊断/预后的方法，其包括下列步骤：
A-从生物学样品中提取核物质，
B-使用至少一对扩增引物获取核物质中的至少一个靶序列的扩增子，
C-使用至少一种检测探针检测所述扩增子的存在，
其特征在于，在步骤B中，所述引物对包含至少一个扩增引物，该扩增引物含有选自SEQ ID No.1至SEQ ID No.20的核苷酸序列的至少10个核苷酸残基，和/或在步骤C中，所述检测探针包含选自SEQ ID No.1至SEQ ID No.20的核苷酸序列的至少10个核苷酸残基。
2.权利要求1中所述的用于乳腺癌的诊断/预后的方法，基特征在于，在步骤B中，所述引物对选自下列引物对：
□包含核苷酸序列SEQ ID No.1的至少10个核苷酸残基的第一扩增引物和包含核苷酸序列SEQ ID No.2的至少10个核苷酸残基的第二扩增引物；
□包含核苷酸序列SEQ ID No.3的至少10个核苷酸残基的第一扩增引物和包含核苷酸序列SEQ ID No.4的至少10个核苷酸残基的第二扩增引物；
□包含核苷酸序列SEQ ID No.5的至少10个核苷酸残基的第一扩增引物和包含核苷酸序列SEQ ID No.6的至少10个核苷酸残基的第二扩增引物；
□包含核苷酸序列SEQ ID No.7的至少10个核苷酸残基的第一扩增引物和包含核苷酸序列SEQ ID No.8的至少10个核苷酸残基的第二扩增引物；
□包含核苷酸序列SEQ ID No.13的至少10个核苷酸残基的第一扩增引物和包含核苷酸序列SEQ ID No.14的至少10个核苷酸残基的第二扩增引物；
□包含核苷酸序列SEQ ID No.15的至少10个核苷酸残基的第一扩增引物和包含核苷酸序列SEQ ID No.16的至少10个核苷酸残基的第二扩增引物；
□包含核苷酸序列SEQ ID No.17的至少10个核苷酸残基的第一扩增引物和包含核苷酸序列SEQ ID No.18的至少10个核苷酸残基的第二扩增引物；
□包含核苷酸序列SEQ ID No.19的至少10个核苷酸残基的第一扩增引物和包含核苷酸序列SEQ ID No.20的至少10个核苷酸残基的第二扩增引物。
3.权利要求1或2中所述的用于乳腺癌的诊断/预后的方法，其中所述引物对包含至少一个扩增引物，所述扩增引物包含允许通过噬菌体T7聚合酶启动转录的启动子。
4.权利要求1至3任一项中所述的用于乳腺癌的诊断/预后的方法，其中，在步骤C中，检测探针包含荧光团和淬灭基团。
5.权利要求1至4中任一项所述的方法，其中靶序列包含在选自ESR1、ESR2、PGR、HER2的基因之中。
6.权利要求1至5中任一项所述的方法，其中同时进行步骤B和C。
7.权利要求1至6中任一项所述的方法，其特征在于，在步骤B中，还使用至少一对扩增引物以获得对于管家基因特异性的扩增子。
8.权利要求7中所述的方法，其特征在于用于获得对于管家基因特异性的扩增子的扩增引物包含选自SEQ ID No.25至29的序列的至少10个核苷酸残基。
9.权利要求7中所述的方法，其特征在于用于获得对于管家基因特异性的扩增子的所述扩增引物对选自下列引物对：
□包含核苷酸序列SEQ ID No.27的至少10个核苷酸残基的第一扩增引物和包含核苷酸序列SEQ ID No.28的至少10个核苷酸残基的第二扩增引物；
□包含核苷酸序列SEQ ID No.25的至少10个核苷酸残基的第一扩增引物和包含核苷酸序列SEQ ID No.26的至少10个核苷酸残基的第二扩增引物。
10.包含选自SEQ ID No.1至SEQ ID No.20；25至29的核苷酸序列的至少10个核苷酸残基的扩增引物。
11.权利要求10中所述的扩增引物，其包含允许通过噬菌体T7的聚合酶起始转录的启动子。
12.选自下列引物对的扩增引物对：
□包含核苷酸序列SEQ ID No.1的至少10个核苷酸残基的第一扩增引物和包含核苷酸序列SEQ ID No.2的至少10个核苷酸残基的第二扩增引物；
□包含核苷酸序列SEQ ID No.3的至少10个核苷酸残基的第一扩增引物和包含核苷酸序列SEQ ID No.4的至少10个核苷酸残基的第二扩增引物；
□包含核苷酸序列SEQ ID No.5的至少10个核苷酸残基的第一扩增引物和包含核苷酸序列SEQ ID No.6的至少10个核苷酸残基的第二扩增引物；
□包含核苷酸序列SEQ ID No.7的至少10个核苷酸残基的第一扩增引物和包含核苷酸序列SEQ ID No.8的至少10个核苷酸残基的第二扩增引物；
□包含核苷酸序列SEQ ID No.13的至少10个核苷酸残基的第一扩增引物和包含核苷酸序列SEQ ID No.14的至少10个核苷酸残基的第二扩增引物；
□包含核苷酸序列SEQ ID No.15的至少10个核苷酸残基的第一扩增引物和包含核苷酸序列SEQ ID No.16的至少10个核苷酸残基的第二扩增引物；
□包含核苷酸序列SEQ ID No.17的至少10个核苷酸残基的第一扩增引物和包含核苷酸序列SEQ ID No.18的至少10个核苷酸残基的第二扩增引物；
□包含核苷酸序列SEQ ID No.19的至少10个核苷酸残基的第一扩增引物和包含核苷酸序列SEQ ID No.20的至少10个核苷酸残基的第二扩增引物。
13.权利要求12中所述的引物对，其中所述第一引物包含允许通过噬菌体T7的聚合酶启动转录的启动子。
14.权利要求10或11中所述的至少一个扩增引物和/或权利要求12或13中所述的引物对在NASBA扩增反应中的用途。
15.包含选自SEQ ID No.1至SEQ ID No.20的核苷酸序列的至少10个核苷酸残基的检测探针。
16.权利要求15中所述的检测探针，其包含荧光团和淬灭基团。
17.权利要求10或11中所述的至少一个引物和/或权利要求12或13中所述的至少一对引物和/或权利要求15或16中所述的至少一种检测探针在乳腺癌的诊断/预后中的用途。
18.用于乳腺癌的诊断/预后的试剂盒，其包含权利要求10或11中所述的至少一个引物和/或权利要求12或13中所述的至少一对引物和/或权利要求15或16中所述的至少一种检测探针。
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