CN1800390A - 一类与口腔鳞癌发生发展相关基因 - Google Patents

Abstract

本发明关于在口腔鳞状细胞癌体外多因素、多阶段、多步骤癌变模型的基础上，筛选到与肿瘤发生发展相关基因。相关基因具有如SEQID：1、SEQID：2、SEQID：3、SEQID：4、SEQID：5、SEQID：6、SEQID：7、SEQID：8、SEQID：9、SEQID：10所示的核苷酸序列。本发明验证差异基因在细胞癌变过程中的表达情况，动态地研究口腔鳞癌癌变发生、发展进程中恶变相关基因表达情况，为进一步预防和治疗鳞癌提供候选基因。

Description

一类与口腔鳞癌发生发展相关基因

技术领域

本发明关于一类基因，特别关于一类与口腔鳞癌发生发展相关基因。

背景技术

口腔鳞癌占全身恶性肿瘤的4％，由于口腔位于呼吸道与消化道的重要位置，病变结果严重影响患者的生活和生存质量。目前研究肿瘤发生发展机制的常用方法之一是检测临床标本中的一些分子标记物的表达情况，从而推测这些分子标记物和肿瘤的相关性。方法二是以已经建立的肿瘤细胞系为研究对象。通过检测临床标本中的分子标记物表达情况的方法可以在一定程度上阐述某些因子和肿瘤发生发展的关系，但它受标本的限制，不能动态地观察细胞恶变过程，不能系统研究肿瘤的发生机制；目前已经建立的肿瘤细胞系在一定程度上为肿瘤发生机制的研究提供了实验平台，但也不能在纵向研究肿瘤的发生发展机制。上述技术一次性只能研究个别基因与肿瘤的相关性，而基因芯片技术可以满足高通量检测的要求，更加全面地研究肿瘤发生、发展机制相关基因。

发明内容

本发明的目的在于：提供一类与口腔鳞癌发生发展相关基因。

本发明的目的是通过以下技术方法来实现的：通过基因芯片技术筛选口腔鳞癌体外癌变模型各细胞系间的差异表达基因，进一步验证差异基因在细胞癌变过程中的表达情况，动态地研究口腔鳞癌癌变发生、发展进程中恶变相关基因表达情况，为进一步预防和治疗鳞癌提供候选基因。

首先通过转染HPV 16 E6/E7永生化口腔上皮细胞系，采用化学致癌剂苯丙芘或复合促癌剂佛波酯诱导永生化细胞恶变；这样在生物因素(人乳头状瘤病毒)，化学致癌因素(苯丙芘)，促癌因素(佛波酯)以及血清等方面体现了癌变过程中多因素作用的过程；细胞在从正常粘膜上皮细胞到永生化，然后逐步表现出恶性细胞特性，最终恶变的过程。这一过程很好地验证了肿瘤多因素、多阶段、多步骤发生学说。该模型在一定程度上反映了体内口腔黏膜上皮细胞的癌变过程。(上述部分已经申请专利见本申请人申请的中国发明专利“一种口腔粘膜上皮细胞癌变模型”其专利申请号200510028310.5)进一步通过Affymetrix PLUS 2.0(USA)寡核苷酸芯片检测永生化上皮细胞HIOEC、HIOEC-B(a)P(56G)和HIOEC-B(a)P(96G)细胞基因表达谱，采用GeneSpring 7.01软件分析芯片结果，得到上述各细胞系间的差异表达基因谱。筛选差异倍数在2倍以上的基因，选取可能与肿瘤发生、发展关系密切的候选基因。采用RT-PCR和实时定量PCR验证差异表达基因。在口腔鳞状细胞癌体外多因素、多阶段、多步骤癌变模型的基础上，筛选到与肿瘤发生发展相关基因。相关基因具有如SEQID：1、SEQID：2、SEQID：3、SEQID：4、SEQID：5、SEQID：6、SEQID：7、SEQID：8、SEQID：9、SEQID：10所示的核苷酸序列。

本发明所公开一类与口腔鳞癌发生发展相关基因，其优点表现在：

(1)首先我们建立的口腔黏膜上皮细胞体外癌变模型可以动态地反映肿瘤发生发展过程；

(2)Affymetrix寡核苷酸基因芯片包含人类全基因组信息，具有高通量和高准确性的优点；

(3)芯片检测结果通过Genespring软件分析以及综合生物信息学分析可以筛选到与肿瘤发生发展相关候选基因。

附图说明

图1显示永生化上皮细胞在化学致癌剂诱导早期细胞形态学。

图2显示永生化上皮细胞在化学致癌剂和促癌剂诱导早期细胞形态学。

图3显示永生化上皮细胞在化学致癌剂作用后细胞形态学。

图4显示永生化上皮细胞在化学致癌剂和促癌剂作用后细胞形态学。

图5显示HIOEC-B(a)P细胞软琼脂集落形成能力。

图6显示HIOEC-B(a)P-TPA细胞软琼脂集落形成能力。

图7显示显微镜放大200倍观察第55代HIOEC-B(a)P细胞在裸小鼠皮下的成瘤性。

图8显示显微镜放大400倍观察第55代HIOEC-B(a)P细胞在裸小鼠皮下的成瘤性。

图9显示显微镜放大200倍观察第69代HIOEC-B(a)P细胞在裸小鼠皮下的成瘤性。

图10显示显微镜放大400倍观察第69代HIOEC-B(a)P细胞在裸小鼠皮下的成瘤性。

图11显示显微镜放大200倍观察第96代HIOEC-B(a)P细胞在裸小鼠皮下的成瘤性。

图12显示显微镜放大400倍观察第96代HIOEC-B(a)P细胞在裸小鼠皮下的成瘤性。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步描述。

实施例1

I、在已经建立的HPV 16 E6/E7永生化口腔上皮细胞系的基础上，采用化学致癌剂苯丙芘(benzo(a)pyrene，B(a)P)诱导培养，B(a)P的浓度为0.1-1.2μg/ml，体外递增浓度、间歇诱导培养6个月；诱导细胞第18代克隆培养，第21代改用含10％胎牛血清的DMEM培养液培养；体外连续传代培养1年，建立恶性细胞系HIOEC-B(a)P(见图1)。

II、通过软琼脂集落形成和裸小鼠皮下成瘤性鉴定诱导细胞的恶性表型。不同培养时期的细胞接种裸小鼠皮下形成不同恶性程度的肿瘤。(见图2，图3)

III、分别培养永生化上皮细胞HIOEC、HIOEC-B(a)P(56G)和HIOEC-B(a)P(96G)细胞，待细胞生长至80％铺满培养瓶(25cm²)底时，弃去培养液，每瓶细胞分别加入2ml TRIzol reagent(Invitrogen，USA)，充分吹打后将液体吸入1.5ml离心管中，-80℃保存备用。每种细胞分别收集4份，其中3份用于芯片检测重复实验3次，1份备做验证芯片结果。

IV.总RNA的提取和纯化

1.样品置冰上融化后，用加样枪反复吸吹，使样品充分裂解，移入1.5ml离心管中，室温静置3～5分钟。

2.在离心管中每1mlTRIzol起始量加200ul氯仿，振荡混匀。

3.将离心管在4℃，12000rcf，离心15分钟。

4.用移液器小心吸出上层水相，加入另一离心管中，每ml TRIzol起始量加入500ul异丙醇。

5.-20℃，沉淀过夜。

6.4℃，12000rcf，离心10分钟。

7.小心移出上清。

8.沉淀中加入1mL 75％乙醇，4℃，12000rcf，离心10分钟。

9.重复用75％乙醇洗涤一次RNA沉淀。

10.去上清，稍微晾干，RNA略显透明，加入适当体积(30ul)的RNase-free的水，充分溶解。

V.定量和检测总RNA

a)紫外定量和检测

1)用紫外分光光度计检测RNA的产量，在260nm处的吸光度，1OD＝40ug/ml。

2)根据在260nm和280nm处的吸光值，检测RNA的纯度，纯RNA的OD260/OD280比值应接近2.0(比值最好在1.9～2.1之间)。

b)变性胶电泳质检

1)配制1.2％的电泳胶

10×MOPS Gel Buffer                       10ml

Agrose                                    1.2g

RNase-Free Water                                 90ml

加热溶解Agrose，稍微冷却，加入37％甲醛           1.8ml

EB(10mg/ml)                                      1ul

摇匀后倒胶，待胶冷凝后，置于电泳槽中，浸于1×MOPS Gel Buffer中平衡10分钟，待用。

2)样品变性

5×Loading Buffer      2ul

RNA样品                1ug

Rnase-Free water       调节至10ul

在65℃，变性5分钟，立即置于冰上冷却。

3)电泳

将处理好的RNA样品，稍微离心，70V恒压电泳1小时。在凝胶成像仪上观察结果。

VI.纯化总RNA

RNeasy Mini Kit

1.将总RNA的体积用RNase-free的水调整到100ul，(因QIAGEN纯化柱的最大上样量为100ugRNA，所以一般取RNA不大于100ug)。

2.加入350ul RLT工作液(1ml RLT中加10ul 2-ME，混匀而成)，充分混匀。

3.加入250ul无水乙醇，充分混匀(不要离心)。

4.将混好的700ul样品加到QIAGEN纯化柱中，＞8000rpm，离心15秒。

5.弃滤液，加入500ul RPE工作液(一份RPE加入4份无水乙醇混匀而成)，＞8000rpm，离心15秒。

6.弃滤液，加入500ul RPE工作液(一份RPE加入4份无水乙醇混匀而成)，＞8000rpm，离心2分钟。

7.将纯化柱放入一个新的收集管，最大转速，离心1分钟。

8.将纯化柱换入一个EP管中，在纯化柱膜中间25ul RNase-free的水，室温放置1分钟，最大转速，离心1分钟。

9.将EP管中的样品移入一个新的EP管中。

VII.纯化总RNA的定量和检测(同V)

a紫外定量和检测：总RNA的浓度和OD260/OD280。

b变性胶电泳质检：

VIII.cDNA的合成和纯化

1.1^stcDNA的合成(Affymetrix one-cycle cDNA Synthesis Kit)

a)总RNA                   5～16ug(8ug，不足取10ul)

b)RNase-free water                       补至10ul

T7-(dT)24Primer(50uM)                    2ul

混匀，70℃温浴10分钟，置于冰上至少2分钟，离心片刻；

c)5×1st Strand Buffer                   4ul

DTT(0.1M)                                2ul

dNTP(10mM)                               1ul

混匀，42℃，温浴2分钟；

d)SuperScript II RT(200U/ul)             2uL(8～16ug起始)

                                         1uL(5～8ug起始)

e)混匀，42℃，温浴1小时。

2.2^ndcDNA的合成(Affymetrix one-cycle cDNA Synthesis Kit)

a)将1st cDNA合成产物置于冰上，加入下列试剂：

Component                                Volume

RNase-Free water                         91ul

5×2nd Strand Buffer                     30ul

dNTP(10mM)                               3ul

E.coli DNA Ligase(10U/ul)                1ul

E.coli DNA Polymerase(10U/ul)            4ul

E.coli RNase H(10U/ul)                   1ul

Total Volume                             130ul

混匀，16℃，反应2小时；

b)加入2ul T4DNAPolymerase，混匀，16℃，5分钟；

c)加入10ul EDTA(0.5M)，混匀，终止反应。

 -20℃保存或进行下步纯化。

3.纯化cDNA(Affymetrix GeneChip Sample Cleanup Module)

a)将600ul cDNA Binding Buffer加入cDNA合成产物中，振荡混匀3秒。

b)将500ul液体移入cDNA Cleanup Spin Column管中，不要振荡，＞＝10000rpm，室温离心1分钟，弃滤液。

c)将剩余液体移入cDNA Cleanup Spin Column管中，不要振荡，＞＝10000rpm，室温离心1分钟，弃滤液。

d)换一个新收集管，加入750ul cDNA Wash Buffer，最大转速离心1Min，弃滤液。

e)打开盖子，最大转速离心5Min，弃滤液。

f)将柱子转移至1.5mL的收集管中，加14ul的cDNA Elution Buffer。

室温静置1分钟，最大转速离心1分钟。

IX.cRNA的合成和纯化

1.IVT合成cRNA(GeneChip IVT Labeling Kit)

Reagent                                    Volume

Template cDNA                              12ul

RNase-Free water                           8ul

10×IVT Labeling Buffer                    4ul

IVT Labeling NTP Mix                       12ul

IVT Labeling Enzyme Mix                    4ul

Total Volume                               40ul

混匀，稍离心，37℃温浴16小时。

合成产物可保存在-20℃或直接进行下一步纯化。

2.纯化cRNA(Genechip Sample Cleanup Module)

1)加入60ul RNase Free水，振荡混匀3’。

2)加入350ulIVT cRNA binding Buffer，振荡混匀3’。

3)加入250ul无水乙醇，用加样枪混匀。

4)将以上混合液加入cRNA Cleanup Spin Colum，＞＝10000rpm，离心15’，弃滤液。

5)将柱子移至1.5mL的收集管，加入500ul的IVT cRNA WashBuffer，＞＝10000rpm，离心15’，弃滤液。

6)加入500ul 80％乙醇，＞＝10000rpm，离心15’，弃滤液。

7)换一个收集管，打开盖子，＞＝10000rpm，离心5min，弃滤液。

8)将柱子转移至1.5mL的收集管，加入11ul的Rnase Free水，＞＝10000rpm 1min。

9)加入10ul的Rnase Free水，＞＝10000rpm 1min。

cRNA的定量和检测

a.用紫外分光光度计测量cRNA的浓度和OD260/OD280：

b.变性胶检测cRNA：

取2ug cRNA在1.2％的变性胶上电泳，纯化的cRNA应该呈弥散状长条带。

X.cRNA片段化、配制杂交液

1.片段化cRNA

a.校正cRNA浓度

根据公式：

[cRNA]：cRNA的测量浓度；

V：cRNA的洗脱体积；

M：合成cRNA时所用总RNA的量；

R：cRNA的回收得率；

[校正cRNA]：cRNA校正后的浓度。

b.配制片段化反应体系

根据校正cRNA的浓度片段化(40ul)：

cRNA                                    15ug

5×Fragmentation Buffer                 6ul

RNase-Free Water                  补充至30ul

c.片段化

混匀，94℃温浴35分钟，之后置于冰上。

d.片段化cRNA的质检：变性胶电泳质检，片段化cRNA约为35～200bp。

2.配制杂交液

根据芯片类型按下表配制适当量的杂交液：见表1

表1

配方	300ul	终浓度
			1  片段化cRNA(0.5mg/ml)	30ul	0.05ug/ul
2  Oligo B2对照(3nM)	5ul	50pM
			3  20×Hybridizition control	15ul	1×
4  鱼精DNA(9.3mg/ml)	3.3ul	0.1mg/ml
			5  乙酰化BSA(20mg/ml)	7.5ul	0.5mg/ml
6  2×杂交Buffer	150ul	1×
			7  DMSO	30ul
8  RNase-Free Water	59.2ul

XI.芯片杂交

先进行测试芯片的杂交、洗染和分析，根据测试芯片的结果再杂交表达谱芯片。

1和2同时进行，直到第3步：

1.预杂交芯片

1)取出芯片，平衡至室温；

2)加入1×杂交Buffer；

3)45℃，60rpm，预杂交10分钟。

2.杂交液的准备

1)杂交液混匀，离心片刻；

2)99℃，温浴5分钟；

3)将杂交液转至45℃，温浴5分钟；

4)离心机最大转速离心5分钟。

3.杂交芯片

1)吸出芯片中的1×杂交Buffer；

2)将杂交液加入到芯片中；

3)45℃，60rpm，杂交16小时；

4)杂交结束后，吸出芯片中的杂交液，加入洗液A，进行后面的洗染过程。

XII.洗脱芯片

在洗脱工作站上按照芯片类型，运行洗脱程序。

XII.扫描芯片

扫描仪上扫描芯片。

XIV.数据分析结果见表2

1.应用Genespring 7.01软件进行数据分析。

2.Normalization方法：将芯片所有探针组的Signal从小到大排序，去掉最大的2％和最小的2％后，将剩下探针组的平均信号值调整到500。

表2  一类与口腔鳞癌发生发展相关基因表达差异结果

编号	.SEQ	差异倍数
									B vs H	A vs H	D vs H	C vs H	基因描述
1	SEQID：1	39.37	45.68	34.31	25.15	inhibitor of DNA binding 1，dominantnegative helix-loop-helix proteinDNA结合蛋白抑制基因1，
							2	SEQID：2	125	141.3	54.59	61.56	insulin-like growth factor bindingprotein 3胰岛素样生长因子结合蛋白3
3	SEQID：3	0.0853	0.0297	0.547	1.255	interferon induced transmembraneprotein 1干扰素诱导的穿膜蛋白1
							4	SEQID：4	1.754	2.297	3.247	4.318	jun D proto-oncogenejun D原癌基因
5	SEQID：5	0.0376	0.0403	0.0459	0.0367	lectin，galactoside-binding，soluble，7
							6	SEQID：6	3.779	3.099	2.107	2.646	met proto-oncogenemet原癌基因
7	SEQID：7	3.783	3.191	2.263	2.096	mitogen-activated protein kinase 1丝裂酶素激活蛋白激酶1
							8	SEQID：8	2.083	2.365	0.643	0.487	mitogen-activated protein kinasekinase 1丝裂酶素激活蛋白激酶激酶1
9	SEQID：9	3.116	2.708	9.261	9.997	myristoylated alanine-rich proteinkinase C substrate十四烷基富丙胺酸蛋白激酶C的底物
							10	SEQID：10	2.952	1.8	7.134	2.212	N-myc downstream regulated gene 1N-myc下游调节基因1

H＝HIOEC细胞

A＝HIOEC-B(a)P细胞96G(成瘤)

B＝HIOEC-B(a)P细胞56G(不成瘤)

C＝HIOEC-B(a)P-TPA细胞75G(软琼脂克隆)

D＝HIOEC-B(a)P-TPA细胞47G(软琼脂无克隆)

<110>上海交通大学医学院附属第九人民医院

<120>一类与口腔鳞癌发生发展相关基因

<130>/

<160>10

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>993

<212>DNA

<213>智人(Homo sapiens)

<400>1

attccacgtt cttaactgtt ccattttccg tatctgcttc gggcttccac ctcatttttt   60

tcgctttgcc cattctgttt cagccagtcg ccaagaatca tgaaagtcgc cagtggcagc  120

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ttaaacaaataatttagatggtgaaaaaaa aaa                                 993

<210>2

<211>2638

<212>DNA

<213>智人(Homo sapiens)

<400>2

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agccccaaat atagtaagat ctatactaga taatcctaga tgaaatgtta gagatgctat   2220

atgatacaac tgtggccatg actgaggaaa ggagctcacg cccagagact gggctgctct   2280

cccggaggcc aaacccaaga aggtctggca aagtcaggct cagggagact ctgccctgct   2340

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gacattctgc ctacctatta gcttttcttt atttttttaa ctttttgggg ggaaaagtat   2460

ttttgagaag tttgtcttgc aatgtattta taaatagtaa ataaagtttt taccattaaa   2520

aaaatatctt tccctttgtt attgaccatc tctgggcttt gtatcactaa ttattttatt   2580

ttattatata ataattattt tattataata aaatcctgaa aggggaaaat aaaaaaaa     2638

<210>3

<211>853

<212>DNA

<213>智人(Homo sapiens)

<400>3

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caccctgcca taagtaattt gatcctcaag aagttaaacc acacctcatt ggtccctggc    120

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<210>4

<211>1891

<212>DNA

<213>智人(Homo sapiens)

<400>4

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<210>5

<211>498

<212>DNA

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<400>5

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<210>6

<211>6641

<212>DNA

<213>智人(Homo sapiens)

<400>6

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tatgaagtat cagcttccca acttcaccgc ggaaacaccc atccagaatg tcattctaca    360

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ccgtgaagat cccattgtct atgaaattca tccaaccaaa tcttttatta gtggtgggag   2460

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<210>7

<211>5916

<212>DNA

<213>智人(Homo sapiens)

<400>7

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gtccgagtgg ctgtcggctc ttcagctctc ccgctcggcg tcttccttcc tcctcccggt    120

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ttatgatagg gaaggctact acctagggca ctttaagtca gtgacagccc cttatttgca   1800

cttcaccttt tgaccataac tgtttcccca gagcaggagc ttgtggaaat accttggctg   1860

atgttgcagc ctgcagcaag tgcttccgtc tccggaatcc ttggggagca cttgtccacg   1920

tcttttctca tatcatggta gtcactaaca tatataaggt atgtgctatt ggcccagctt   1980

ttagaaaatg cagtcatttt tctaaataaa aaggaagtac tgcacccagc agtgtcactc   2040

tgtagttact gtggtcactt gtaccatata gaggtgtaac acttgtcaag aagcgttatg   2100

tgcagtactt aatgtttgta agacttacaa aaaaagattt aaagtggcag cttcactcga   2160

catttggtga gagaagtaca aaggttgcag tgctgagctg tgggcggttt ctggggatgt   2220

cccagggtgg aactccacat gctggtgcat atacgccctt gagctacttc aaatgtgggt   2280

gtttcagtaa ccacgttcca tgcctgagga tttagcagag aggaacactg cgtctttaaa   2340

tgagaaagta tacaattctt tttccttcta cagcatgtca gcatctcaag ttcatttttc   2400

aacctacagt ataacaattt gtaataaagc ctccaggagc tcatgacgtg aagcactgtt   2460

ctgtcctcaa gtactcaaat atttctgata ctgctgagtc agactgtcag aaaaagctag   2520

cactaactcg tgtttggagc tctatccata ttttactgat ctctttaagt atttgttcct   2580

gccactgtgt actgtggagt tgactcggtg ttctgtccca gtgcggtgcc tcctcttgac   2640

ttccccactg ctctctgtgg tgagaaattt gccttgttca ataattactg taccctcgca   2700

tgactgttac agctttctgt gcagagatga ctgtccaagt gccacatgcc tacgattgaa   2760

atgaaaactc tattgttacc tctgagttgt gttccacgga aaatgctatc cagcagatca   2820

tttaggaaaa ataattctat ttttagcttt tcatttctca gctgtccttt tttcttgttt   2880

gatttttgac agcaatggag aatgggttat ataaagactg cctgctaata tgaacagaaa   2940

tgcatttgta attcatgaaa ataaatgtac atcttctatc ttcacattca tgttaagatt   3000

cagtgttgct ttcctctgga tcagcgtgtc tgaatggaca gtcaggttca ggttgtgctg   3060

aacacagaaa tgctcacagg cctcactttg ccgcccaggc actggcccag cacttggatt   3120

tacataagat gagttagaaa ggtacttctg tagggtcctt tttacctctg ctcggcagag   3180

aatcgatgct gtcatgttcc tttattcaca atcttaggtc tcaaatattc tgtcaaaccc   3240

taacaaagaa gccccgacat ctcaggttgg attccctggt tctctctaaa gagggcctgc   3300

ccttgtgccc cagaggtgct gctgggcaca gccaagagtt gggaagggcc gccccacagt   3360

acgcagtcct caccacccag cccagggtgc tcacgctcac cactcctgtg gctgaggaag   3420

gatagctggc tcatcctcgg aaaacagacc cacatctcta ttcttgccct gaaatacgcg   3480

cttttcactt gcgtgctcag agctgccgtc tgaaggtcca cacagcattg acgggacaca   3540

gaaatgtgac tgttaccgga taacactgat tagtcagttt tcatttataa aaaagcattg   3600

acagttttat tactcttgtt tctttttaaa tggaaagtta ctattataag gttaatttgg   3660

agtcctcttc taaatagaaa accatatcct tggctactaa catctggaga ctgtgagctc   3720

cttcccattc cccttcctgg tactgtggag tcagattggc atgaaaccac taacttcatt   3780

ctagaatcat tgtagccata agttgtgtgc tttttattaa tcatgccaaa cataatgtaa   3840

ctgggcagag aatggtccta accaaggtac ctatgaaaag cgctagctat catgtgtagt   3900

agatgcatca ttttggctct tcttacattt gtaaaaatgt acagattagg tcatcttaat   3960

tcatattagt gacacggaac agcacctcca ctatttgtat gttcaaataa gctttcagac   4020

taatagcttt tttggtgtct aaaatgtaag caaaaaattc ctgctgaaac attccagtcc   4080

tttcatttag tataaaagaa atactgaaca agccagtggg atggaattga aagaactaat   4140

catgaggact ctgtcctgac acaggtcctc aaagctagca gagatacgca gacattgtgg   4200

catctgggta gaagaatact gtattgtgtg tgcagtgcac agtgtgtggt gtgtgcacac   4260

tcattccttc tgctcttggg cacaggcagt gggtgtagag gtaaccagta gctttgagaa   4320

gctacatgta gctcaccagt ggttttctct aaggaatcac aaaagtaaac tacccaacca   4380

catgccacgt aatatttcag ccattcagag gaaactgttt tctctttatt tgcttatatg   4440

ttaatatggt ttttaaattg gtaactttta tatagtatgg taacagtatg ttaatacaca   4500

catacatacg cacacatgct ttgggtcctt ccataatact tttatatttg taaatcaatg   4560

ttttggagca atcccaagtt taagggaaat atttttgtaa atgtaatggt tttgaaaatc   4620

tgagcaatcc ttttgcttat acatttttaa agcatttgtg ctttaaaatt gttatgctgg   4680

tgtttgaaac atgatactcc tgtggtgcag atgagaagct ataacagtga atatgtggtt   4740

tctcttacgt catccacctt gacatgatgg gtcagaaaca aatggaaatc cagagcaagt   4800

cctccagggt tgcaccaggt ttacctaaag cttgttgcct tttcttgtgc tgtttatgcg   4860

tgtagagcac tcaagaaagt tctgaaactg ctttgtatct gctttgtact gttggtgcct   4920

tcttggtatt gtaccccaaa attctgcata gattatttag tataatggta agttaaaaaa   4980

tgttaaagga agattttatt aagaatctga atgtttattc attatattgt tacaatttaa   5040

cattaacatt tatttgtggt atttgtgatt tggttaatct gtataaaaat tgtaagtaga   5100

aaggtttata tttcatctta attcttttga tgttgtaaac gtacttttta aaagatggat   5160

tatttgaatg tttatggcac ctgacttgta aaaaaaaaaa actacaaaaa aatccttaga   5220

atcattaaat tgtgtccctg tattaccaaa ataacacagc accgtgcatg tatagtttaa   5280

ttgcagtttc atctgtgaaa acgtgaaatt gtctagtcct tcgttatgtt ccccagatgt   5340

cttccagatt tgctctgcat gtggtaactt gtgttagggc tgtgagctgt tcctcgagtt   5400

gaatggggat gtcagtgctc ctagggttct ccaggtggtt cttcagacct tcacctgtgg   5460

gggggggggt aggcggtgcc cacgcccatc tcctcatcct cctgaacttc tgcaacccca   5520

ctgctgggca gacatcctgg gcaacccctt ttttcagagc aagaagtcat aaagatagga   5580

tttcttggac atttggttct tatcaatatt gggcattatg taatgactta tttacaaaac   5640

aaagatactg gaaaatgttt tggatgtggt gttatggaaa gagcacaggc cttggaccca   5700

tccagctggg ttcagaacta ccccctgctt ataactgcgg ctggctgtgg gccagtcatt   5760

ctgcgtctct gctttcttcc tctgcttcag actgtcagct gtaaagtgga agcaatatta   5820

cttgccttgt atatggtaaa gattataaaa atacatttca actgttcagc atagtacttc   5880

aaagcaagtactcagtaaatagcaagtctt tttaaa                               5916

<210>8

<211>2222

<212>DNA

<213>智人(Homo sapiens)

<400>8

attcggcacg agggaggaag cgagaggtgc tgccctcccc ccggagttgg aagcgcgtta     60

cccgggtcca aaatgcccaa gaagaagccg acgcccatcc agctgaaccc ggcccccgac    120

ggctctgcag ttaacgggac cagctctgcg gagaccaact tggaggcctt gcagaagaag    180

ctggaggagc tagagcttga tgagcagcag cgaaagcgcc ttgaggcctt tcttacccag    240

aagcagaagg tgggagaact gaaggatgac gactttgaga agatcagtga gctgggggct    300

ggcaatggcg gtgtggtgtt caaggtctcc cacaagcctt ctggcctggt catggccaga    360

aagctaattc atctggagat caaacccgca atccggaacc agatcataag ggagctgcag    420

gttctgcatg agtgcaactc tccgtacatc gtgggcttct atggtgcgtt ctacagcgat    480

ggcgagatca gtatctgcat ggagcacatg gatggaggtt ctctggatca agtcctgaag    540

aaagctggaa gaattcctga acaaatttta ggaaaagtta gcattgctgt aataaaaggc    600

ctgacatatc tgagggagaa gcacaagatc atgcacagag atgtcaagcc ctccaacatc    660

ctagtcaact cccgtgggga gatcaagctc tgtgactttg gggtcagcgg gcagctcatc    720

gactccatgg ccaactcctt cgtgggcaca aggtcctaca tgtcgccaga aagactccag    780

gggactcatt actctgtgca gtcagacatc tggagcatgg gactgtctct ggtagagatg    840

gcggttggga ggtatcccat ccctcctcca gatgccaagg agctggagct gatgtttggg    900

tgccaggtgg aaggagatgc ggctgagacc ccacccaggc caaggacccc cgggaggccc    960

cttagctcat acggaatgga cagccgacct cccatggcaa tttttgagtt gttggattac   1020

atagtcaacg agcctcctcc aaaactgccc agtggagtgt tcagtctgga atttcaagat   1080

tttgtgaata aatgcttaat aaaaaacccc gcagagagag cagatttgaa gcaactcatg   1140

gttcatgctt ttatcaagag atctgatgct gaggaagtgg attttgcagg ttggctctgc   1200

tccaccatcg gccttaacca gcccagcaca ccaacccatg ctgctggcgt ctaagtgttt   1260

gggaagcaac aaagagcgag tcccctgccc ggtggtttgc catgtcgctt ttgggcctcc   1320

ttcccatgcc tgtctctgtt cagatgtgca tttcacctgt gacaaaggat gaagaacaca   1380

gcatgtgcca agattctact cttgtcattt ttaatattac tgtctttatt cttattacta   1440

ttattgttcc cctaagtgga ttggctttgt gcttggggct atttgtgtgt atgctgatga   1500

tcaaaacctg tgccaggctg aattacagtg aaatttttgg tgaatgtggg tagtcattct   1560

tacaattgca ctgctgttcc tgctccatga ctggctgtct gcctgtattt tcggactttg   1620

acatttgaca tttggtggac tttatcttgc tgggcatact ttctctctag gagggagcct   1680

tgtgagatcc ttcacaggca gtgcatgtga agcatgcttt gctgctatga aaatgagcat   1740

cagagagtgt acatcatgtt attttattat tattatttgc ttttcatgta gaactcagca   1800

gttgacatcc aaatctagcc agagcccttc actgccatga tagctggggc ttcaccagtc   1860

tgtctactgt ggtgatctgt agacttctgg ttgtatttct atatttattt tcagtatact   1920

gtgtgggata cttagtggta tgtctcttta agttttgatt aatgtttctt aaatggaatt   1980

atttgaatgt cacaaattga tcaagatatt aaaatgtcgg atttatcttt ccccatatcc   2040

aagtaccaat gctgttgtaa acaacgtgta tagtgcctaa aattgtatga aaatcctttt   2100

aaccatttta acctagatgt ttaacaaatc taatctctta ttctaataaa tatactatga   2160

aataaaaaaa aaaggagaaa gctaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa   2220

aa                                                                  2222

<210>9

<211>2589

<212>DNA

<213>智人(Homo sapiens)

<400>9

caaccaggga gatttctcca ttttcctctt gtctacagtg cggctacaaa tctgggattt     60

ttttattact tctttttttt tcgaactaca cttgggctcc tttttttgtg ctcgactttt    120

ccaccctttt tccctccctc ctgtgctgct gctttttgat ctcttcgact aaaatttttt    180

tatccggagt gtatttaatc ggttctgttc tgtcctctcc accaccccca cccccctccc    240

tccggtgtgt gtgccgctgc cgctgttgcc gccgccgctg ctgctgctgc tcgccccgtc    300

gttacaccaa cccgaggctc tttgtttccc ctcttggatc tgttgagttt ctttgttgaa    360

gaagccagca tgggtgccca gttctccaag accgcagcga agggagaagc cgccgcggag    420

aggcctgggg aggcggctgt ggcctcgtcg ccttccaaag cgaacggaca ggagaatggc    480

cacgtgaagg taaacggcga cgcttcgccc gcggccgccg agtcgggcgc caaggaggag    540

ctgcaggcca acggcagcgc cccggccgcc gacaaggagg agcccgcggc cgccgggagc    600

ggggcggcgt cgccctcctc ggccgagaaa ggtgagccgg ccgccgccgc tgcccccgag    660

gccggggcca gcccggtaga gaaggaggcc cccgcggaag gcgaggctgc cgagcccggc    720

tcggccacgg ccgcggaggg agaggccgcg tcggccgcct cctcgacttc ttcgcccaag    780

gccgaggacg gggccacgcc ctcgcccagc aacgagaccc cgaaaaaaaa aaagaagcgc    840

ttttccttca agaagtcttt caagctgagc ggcttctcct tcaagaagaa caagaaggag    900

gctggagaag gcggtgaggc tgaggcgccc gctgccgaag gcggcaagga cgaggccgcc    960

gggggcgcag ctgcggccgc cgccgaggcg ggcgcggcct ccggggagca ggcagcggcg   1020

ccgggcgagg aggcggcagc gggcgaggag ggggcggcgg gtggcgaccc gcaggaggcc   1080

aagccccagg aggccgctgt cgcgccagag aagccgcccg ccagcgacga gaccaaggcc   1140

gccgaggagc ccagcaaggt ggaggagaaa aaggccgagg aggccggggc cagcgccgcc   1200

gcctgcgagg ccccctccgc cgccgggccc ggcgcgcccc cggagcagga ggcagccccc   1260

gcggaggagc ccgcggccgc cgcagcctcg tcagcctgcg cagccccctc acaggaggcc   1320

cagcccgagt gcagtccaga agccccccca gcggaggcgg cagagtaaaa gagcaagctt   1380

ttgtgagata atcgaagaac ttttctcccc cgtttgtttg ttggagtggt gccaggtact   1440

gttttggaga acttgtctac aaccagggat tgattttaaa gatgtctttt tttattttac   1500

ttttttttaa gcaccaaatt ttgttgtttt tttttttctc ccctccccac agatcccatc   1560

tcaaatcatt ctgttaacca ccattccaac aggtcgagga gagcttaaac accttcttcc   1620

tctgccttgt ttctctttta ttttttattt tttcgcatca gtattaatgt ttttgcatac   1680

tttgcatctt tattcaaaag tgtaaacttt ctttgtcaat ctatggacat gcccatatat   1740

gaaggagatg ggtgggtcaa aaagggatat caaatgaagt gataggggtc acaatgggga   1800

aattgaagtg gtgcataaca ttgccaaaat agtgtgccac tagaaatggt gtaaaggctg   1860

tctttttttt tttttttaaa gaaaagttat taccatgtat tttgtgaggc aggtttacaa   1920

cactacaagt cttgagttaa gaaggaaaga ggaaaaaaga aaaaacacca atacccagat   1980

ttaaaaaaaa aaaaacgatc atagtcttag gagttcattt aaaccatagg aacttttcac   2040

ttatctcatg ttagctgtac cagtcagtga ttaagtagaa ctacaagttg tataggcttt   2100

attgtttatt gctggtttat gaccttaata aagtgtaatt atgtattacc agcagggtgt   2160

ttttaactgt gactattgta taaaaacaaa tcttgatatc cagaagcaca tgaagtttgc   2220

aactttccac cctgcccatt tttgtaaaac tgcagtcatc ttggaccttt taaaacacaa   2280

attttaaact caaccaagct gtgataagtg gaatggttac tgtttatact gtggtatgtt   2340

tttgattaca gcagataatg ctttcttttc cagtcgtctt tgagaataaa ggaaaaaaaa   2400

tcttcagatg caatggtttt gtgtagcatc ttgtctatca tgttttgtaa atactggaga   2460

agctttgacc aatttgactt agagatggaa tgtaactttg cttacaaaaa ttgctattaa   2520

actcctgctt aaggtgttct aattttctgt gagcacacta aaagcgaaaa ataaatgtga   2580

ataaaatgt                                                           2589

<210>10

<211>3074

<212>DNA

<213>智人(Homo sapiens)

<400>10

aacaaacctc gcctggctcc cagctggtgc tgaagctcgt cagttcacca tccgccctcg     60

gcttccgcgg ggcgctgggc cgccagcctc ggcaccgtcc tttcctttct ccctcgcgtt    120

aggcaggtga cagcagggac atgtctcggg agatgcagga tgtagacctc gctgaggtga    180

agcctttggt ggagaaaggg gagaccatca ccggcctcct gcaagagttt gatgtccagg    240

agcaggacat cgagacttta catggctctg ttcacgtcac gctgtgtggg actcccaagg    300

gaaaccggcc tgtcatcctc acctaccatg acatcggcat gaaccacaaa acctgctaca    360

accccctctt caactacgag gacatgcagg agatcaccca gcactttgcc gtctgccacg    420

tggacgcccc tggccagcag gacggcgcag cctccttccc cgcagggtac atgtacccct    480

ccatggatca gctggctgaa atgcttcctg gagtccttca acagtttggg ctgaaaagca    540

ttattggcat gggaacagga gcaggcgcct acatcctaac tcgatttgct ctaaacaacc    600

ctgagatggt ggagggcctt gtccttatca acgtgaaccc ttgtgcggaa ggctggatgg    660

actgggccgc ctccaagatc tcaggatgga cccaagctct gccggacatg gtggtgtccc    720

acctttttgg gaaggaagaa atgcagagta acgtggaagt ggtccacacc taccgccagc    780

acattgtgaa tgacatgaac cccggcaacc tgcacctgtt catcaatgcc tacaacagcc    840

ggcgcgacct ggagattgag cgaccaatgc cgggaaccca cacagtcacc ctgcagtgcc    900

ctgctctgtt ggtggttggg gacagctcgc ctgcagtgga tgccgtggtg gagtgcaact    960

caaaattgga cccaacaaag accactctcc tcaagatggc ggactgtggc ggcctcccgc   1020

agatctccca gccggccaag ctcgctgagg ccttcaagta cttcgtgcag ggcatgggat   1080

acatgccctc ggctagcatg acccgcctga tgcggtcccg cacagcctct ggttccagcg   1140

tcacttctct ggatggcacc cgcagccgct cccacaccag cgagggcacc cgaagccgct   1200

cccacaccag cgagggcacc cgcagccgct cgcacaccag cgagggggcc cacctggaca   1260

tcacccccaa ctcgggtgct gctgggaaca gcgccgggcc caagtccatg gaggtctcct   1320

gctaggcggc ctgcccagct gccgcccccg gactctgatc tctgtagtgg ccccctcctc   1380

cccggcccct tttcgccccc tgcctgccat actgcgccta actcggtatt aatccaaagc   1440

ttattttgta agagtgagct ctggtggaga caaatgaggt ctattacgtg ggtgccctct   1500

ccaaaggcgg ggtggcggtg gaccaaagga aggaagcaag catctccgca tcgcatcctc   1560

ttccattaac cagtggccgg ttgccactct cctcccctcc ctcagagaca ccaaactgcc   1620

aaaaacaaga cgcgtagcag cacacacttc acaaagccaa gcctaggccg ccctgagcat   1680

cctggttcaa acgggtgcct ggtcagaagg ccagccgccc acttcccgtt tcctctttaa   1740

ctgaggagaa gctgatccag tttccggaaa caaaatcctt ttctcatttg gggagggggg   1800

taatagtgac atgcaggcac ctcttttaaa caggcaaaac aggaaggggg aaaaggtggg   1860

attcatgtcg aggctagagg catttggaac aacaaatcta cgtagttaac ttgaagaaac   1920

cgatttttaa agttggtgca tctagaaagc tttgaatgca gaagcaaaca agcttgattt   1980

ttctagcatc ctcttaatgt gcagcaaaag caggcgacaa aatctcctgg ctttacagac   2040

aaaaatattt cagcaaacgt tgggcatcat ggtttttgaa ggctttagtt ctgctttctg   2100

cctctcctcc acagccccaa cctcccaccc ctgatacatg agccagtgat tattcttgtt   2160

cagggagaag atcatttaga tttgttttgc attccttaga atggagggca acattccaca   2220

gctgccctgg ctgtgatgag tgtccttgca ggggccggag taggagcact ggggtggggg   2280

tggaattggg gttactcgat gtaagggatt ccttgttgtt gtgttgagat ccagtgcagt   2340

tgtgatttct gtggatccca gcttggttcc aggaattttg tgtgattggc ttaaatccag   2400

ttttcaatct tcgacagctg ggctggaacg tgaactcagt agctgaacct gtctgacccg   2460

gtcacgttct tggatcctca gaactctttg ctcttgtcgg ggtgggggtg ggaactcacg   2520

tggggagcgg tggctgagaa aatgtaagga ttctggaata catattccat gggactttcc   2580

ttccctctcc tgcttcctct tttcctgctc cctaaccttt cgccgaatgg ggcagcacca   2640

ctgacgtttc tgggcggcca gtgcggctgc caggttcctg tactactgcc ttgtactttt   2700

cattttggct caccgtggat tttctcatag gaagtttggt cagagtgaat tgaatattgt   2760

aagtcagcca ctgggacccg aggatttctg ggaccccgca gttgggagga ggaagtagtc   2820

cagccttcca ggtggcgtga gaggcaatga ctcgttacct gccgcccatc accttggagg   2880

ccttccctgg ccttgagtag aaaagtcggg gatcggggca agagaggctg agtacggatg   2940

ggaaactatt gtgcacaagt ctttccagag gagtttctta atgagatatt tgtatttatt   3000

tccagaccaa taaatttgta actttgcagc ggaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa   3060

aaaaaaaaaa aaaa                                                     3074

Claims (10)

1、一类与口腔鳞癌发生发展相关基因，其特征在于它具有如SEQ ID：1所示的核苷酸序列。

2、一类与口腔鳞癌发生发展相关基因，其特征在于它具有如SEQ ID：2所示的核苷酸序列。

3、一类与口腔鳞癌发生发展相关基因，其特征在于它具有如SEQ ID：3所示的核苷酸序列。

4、一类与口腔鳞癌发生发展相关基因，其特征在于它具有如SEQ ID：4所示的核苷酸序列。

5、一类与口腔鳞癌发生发展相关基因，其特征在于它具有如SEQ ID：5所示的核苷酸序列。

6、一类与口腔鳞癌发生发展相关基因，其特征在于它具有如SEQ ID：6所示的核苷酸序列。

7、一类与口腔鳞癌发生发展相关基因，其特征在于它具有如SEQ ID：7所示的核苷酸序列。

8、一类与口腔鳞癌发生发展相关基因，其特征在于它具有如SEQ ID：8所示的核苷酸序列。

9、一类与口腔鳞癌发生发展相关基因，其特征在于它具有如SEQ ID：9所示的核苷酸序列。

10、一类与口腔鳞癌发生发展相关基因，其特征在于它具有如SEQ ID：10所示的核苷酸序列。

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