CN1958605A

CN1958605A - Spg3a基因突变、其编码产物及其应用

Info

Publication number: CN1958605A
Application number: CN 200510110066
Authority: CN
Inventors: 王一鸣; 陈素琴; 李荀华; 周雁; 拉布; 宋纯; 陈赟; 郭辉; 黄霜; 黄玮俊
Original assignee: National Sun Yat Sen University
Current assignee: Sun Yat Sen University; National Sun Yat Sen University
Priority date: 2005-11-04
Filing date: 2005-11-04
Publication date: 2007-05-09
Anticipated expiration: 2025-11-04
Also published as: CN100478356C

Abstract

本发明公开了SPG3A基因内的两个新突变，这个基因中的突变会导致遗传性痉挛性截瘫。同时还与小鼠、大鼠、河豚和秀丽线虫等脊椎动物中的SPG3A同源基因进行同源性比对。本发明还公开了检测上述SPG3A基因突变的方法和试剂盒以及在分离和生产SPG3A突变基因编码的蛋白质的应用和包含此突变基因的载体和细胞株。

Description

明书 SPG3A基因突变、其编码产物及其应用

技术领域

本发明涉及生物工程和医学领域。更具体地，本发明涉及SPG3A突变基因及其编码产物和检测SPG3A基因突变的方法和试剂盒。

背景技术

遗传性痉挛性截瘫是单个基因的病理性突变而引起的疾病。这是一组遗传异质性很强的疾病，即本病可由不同基因的不同突变引起。因此，找寻及鉴定本病的致病基因及其突变类型不仅是了解、阐明本病发病机理的必须途径，同时也是建立本病的基因诊断和产前/种植前诊断的先决条件。在已了解本病的致病基因及其突变类型之后，我们可以建立起基于这一基因及其突变类型的诊断技术，以期对临床上可疑的患者进行确凿的基因水平的诊断，还可以通过羊水及脐血的检测，判断胎儿是否携带有这一基因的突变，从而预测胎儿出生后是否会患有这一疾病，并将这一信息提供给孕妇及其家人，从而决定继续或终止妊娠。由于基因的突变是本病发生的原因，从长远看，对突变的鉴定使我们有可能使用纠正突变的基因疗法或其它针对这一突变的生物学效应的方法(如蛋白质拮抗剂)去治疗本病。因此，从长远看，本突变的发现有治疗方面的应用前景。

由于对本病的临床诊断现无特殊方法，因而基因水平的诊断不仅明确了突变的具体部位及种类，还具有准确，快速，低消耗的特点。因此，本领域迫切需要开发新的早期诊断、鉴定与遗传性痉挛性截瘫相关的基因突变及其检测方法。

发明内容

本发明的目的是提供与遗传性痉挛性截瘫的发病或发病风险有关的多核苷酸和蛋白。

本发明的另一目标是用这些蛋白和多核苷酸筛选调节这些蛋白或多核苷酸表达或功能的化合物。

本发明进一步的目的是用这些化合物调节或与所述遗传性痉挛性截瘫相关的蛋白及多核苷酸相互作用，以治疗和诊断这种疾病。

本发明的进一步目的是提供检测SPG3A基因突变的方法和试剂盒。

本发明的第一方面，提供了一种SPG3A基因突变蛋白，其特征在于，SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列中第189位组氨酸突变为天冬氨酸，或者SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列中第410位甘氨酸突变为精氨酸。

本发明的第二方面，提供了一种分离的SPG3A突变基因，其特征在于，它编码上述SPG3A基因突变蛋白。

在优选例中，所述的SPG3A突变基因的突变选自：

SEQ ID NO：1所示核苷酸序列第565位C发生突变；

SEQ ID NO：1所示核苷酸序列第1228位G发生突变。

在一实施例中，SEQ ID NO：1所示核苷酸序列第565位由C突变为G；

在另一实施例中，SEQ ID NO：1所示核苷酸序列第1228位由G突变为A。

本发明的第三方面，提供了一种检测SPG3A基因突变的方法，它包括步骤：提取DNA样本；PCR扩增；测序；与正常SPG3A核苷酸序列(SEQ ID NO：1)比较是否存在突变；其特征在于，所述突变选自：

SEQ ID NO：1所示核苷酸序列第565位C发生突变；

SEQ ID NO：1所示核苷酸序列第1228位G发生突变。

在另一实施例中，SEQID NO：1所示核苷酸序列第1228位由G突变为A。

优选的，上述PCR扩增的引物选自：

(1)SEQID NO：3和SEQ ID NO：4；

(2)SEQID NO：5和SEQ ID NO：6。

较佳的，所述DNA样本取自血液(包括脐血)、羊水或组织。

本发明的第四方面，提供了一种载体，所述载体包含上述SPG3A突变基因。

本发明的第五方面，提供了一种遗传工程化的宿主细胞，其特征在于，它是被上述载体转化或转导的宿主细胞。优选的，所述宿主细胞为哺乳动物细胞。

本发明的第六方面，提供了一种检测SPG3A基因突变的试剂盒，其特征在于，它包括特异性扩增SPG3A基因或转录本的引物，所述PCR扩增的引物选自：

(1)SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4；

(2)SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6。

优选的，上述基因突变选自：

SEQ ID NO：1所示核苷酸序列第565位发生C突变；

SEQ ID NO：1所示核苷酸序列第1228位发生G突变。

本发明的第七方面，提供了一种化合物，所述化合物抑制上述SPG3A基因突变蛋白的激活或抑制上述SPG3A突变基因的表达。较佳的，所述化合物是SPG3A突变基因的反义核苷酸。

本发明的第八方面，提供了一种SPG3A基因突变蛋白的用途，所述SPG3A基因突变蛋白用于制备治疗或诊断遗传性痉挛性截瘫的组合物。

本发明的第九方面，提供了一种SPG3A突变基因的用途，所述SPG3突变基因用于制备治疗或诊断遗传性痉挛性截瘫的组合物。

本发明也包括了应用所述蛋白和多核苷酸筛选治疗和/或诊断遗传性痉挛性截瘫的化合物，这些化合物可以作为SPG3A基因表达或功能的激活剂或拮抗剂。这些蛋白和多核苷酸既作为筛选化合物的靶子，同时为合成衍生化合物提供了原料，后者能作为SPG3A基因表达或功能的激活剂或拮抗剂。

特别地，本发明还包括针对SPG3A基因或基因产物的异常表达水平、基因的突变、甚至异常基因或基因产物的检测方法。上述异常出现于具有遗传性痉挛性截瘫或有遗传性痉挛性截瘫发病风险的人的细胞、血液或组织中，或者在患有这种疾病的细胞或动物模型中。

因而，本发明用于通过检测SPG3A基因或基因产物来指导筛选遗传性痉挛性截瘫患者或遗传性痉挛性截瘫的发病风险。对异常表达水平、基因突变或其他的异常现象的检测容许对遗传性痉挛性截瘫患者或遗传性痉挛性截瘫发病的风险进行诊断，还可以作为孕妇产前筛查的手段，必要的时候可以终止妊娠。在实施例中，这项发明指示了检测SPG3A基因的异常水平或基因突变的方法。

因此，本发明还包括对患有遗传性痉挛性截瘫，或有遗传性痉挛性截瘫发病风险的人的治疗方法，本方法用SPG3A基因或基因产物的异常表达水平、突变或其他的异常现象作为治疗的指标或靶子。

本发明也包括了用SPG3A基因或基因产物作为指标或靶子筛选调节表达水平的因子或有效逆转在SPG3A基因或基因产物中的突变或其他异常特征的方法。因此，本发明包括筛选SPG3A基因或基因产物的激活剂和拮抗剂的方法。这些因子可以根据它们对SPG3A基因或基因产物的表达水平或功能的影响用于制备诊断或治疗遗传性痉挛性截瘫的组合物。通过鉴别能调节SPG3A基因或基因产物的表达或功能的因子，就获得了通过调节SPG3A基因或基因产物的表达水平或功能而影响一个人的遗传性痉挛性截瘫发病过程或发病程度的方法。进一步，通过获得这些基因表达调节的因子，就形成了评估对细胞和动物模型的治疗效果的方法。

通过筛选能够相互作用，或者容许对SPG3A基因或基因产物的异常表达或功能进行检测的因子，这样就形成了诊断遗传性痉挛性截瘫的发病或发病风险的方法。

本发明进一步还包括了在SPG3A基因或基因产物基础上得到的组合物，它们对于检测或调节SPG3A基因或基因产物的表达或功能都十分有用。所以，这些组合物对于制备诊断和/或治疗遗传性痉挛性截瘫的组合物十分有用。

本发明也包括了根据模型中的SPG3A基因或基因产物研究遗传性痉挛性截瘫的载体、细胞和动物模型。

本发明的其它方面由于本文的技术的公开，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1：伴有c.565C＞G(p.H189D)突变的蚬二家系系谱图。

图2：伴有c.1228G＞A(p.G410R)突变的西藏家系系谱图。

图3：伴有c.715C＞T(p.R239C)突变的山东家系系谱图。

图4：包含突变点的人类SPG3A cDNA与各物种同源序列比对结果，图中的方框表示c.565C和c.1228G位点。

图5.包含突变点的人类SPG3A基因编码的蛋白质与各物种同源序列比对结果，图中的方框表示p.H189和p.G410位点。

图6A：野生型(A1、A2)与突变型(B1、B2)(p.H189D突变)的atlastin蛋白质结构预测。

cartoons(A1，B1)(比Ribbons选项(用光滑的条带表示a-和β-片段)厚，并且β链有箭头标注)与spacefill(A2，B2)(用范德华半径来显示所表示的原子)模式。突变位点用杆线表示。GB：鸟苷酸结合蛋白域；TM：跨膜螺旋区。突变后的p.G410R没有在图中显示，是由于模型模板的结构从104-436转换到104-378，除去了突变位点。

图6B：野生型(A1、A2)与突变型(B1、B2)(p.G410R突变)的atlastin蛋白质结构预测。

cartoons(A1，B1)与spacefill(A2，B2)模式。突变位点用杆线表示。GB：鸟苷酸结合蛋白域；TM：跨膜螺旋区。

图7：蚬二家系的测序结果

图上部分为患者的正向测序结果，中部为患者的反向测序结果，图下部为正常人的正向测序结果。(箭头所示为突变位点)。

图8：西藏家系的测序结果

图9：山东家系的测序结果

图10：负重状态下蚬二家系和山东家系患者足部前后位和侧位的影像图。

TC的角度变大(前后位图中TC＝34°，侧位图中TC＝55°)，TMT角度偏离(在侧位图中TMT＝162°)。

图11：负重状态下蚬二家系和山东家系患者足部前后位和侧位的影像图。

TC的角度变大(前后位图中TC＝34°，侧位图中TC＝55°)，TMT角度偏离(在侧位图重TMT＝162°)。

具体实施方式

本发明的SPG3A突变蛋白是指SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的第189位氨基酸突变为精氨酸的蛋白或第410位氨基酸突变为天冬氨酸。本发明的SPG3A突变基因编码SPG3A突变蛋白。其核苷酸序列是指SEQIDNO：1的第565位发生突变。较佳的，上述突变为：C→G。或者其突变发生在SEQ ID NO：1的核苷酸序列第1228位。较佳的，上述突变为：G→A。

本发明的人SPG3A核苷酸全长序列(SPG3A突变基因)或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据SPG3A的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆人载体；再转入细胞；然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。

将本发明SPG3A编码序列插入合适的表达载体，再转入宿主细胞，就可以分离出SPG3A突变蛋白。

本发明的核苷酸序列可优选地插入到载体，例如表达载体中。术语“载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒或其他载体。在本发明中适用的载体包括但不限于：表达载体、克隆载体，例如适用于原核(如大肠杆菌等细菌)、低等真核细胞(如酵母)、昆虫细胞、植物细胞、哺乳动物细胞中的载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。在表达载体中，除了含有复制起点外，还可含有标记基因和其他翻译控制元件。

本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含SPG3A突变基因的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等(Sambrook，et al.Molecular Cloning，a Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory.New York，1989)。此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。

上述载体，可以用于转化或转染适当的宿主细胞，以使其能够表达外源蛋白质或功能性核酸。

宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属；鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞；真菌细胞如酵母；植物细胞；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CHO、COS、293细胞、或Bowes黑素瘤细胞的动物细胞等。

用重组DNA转化、转染宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。一些采用的转化、转染方法包括但并不限于：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。

通过常规的重组DNA技术(Science，1984；224：1431)，可生产本发明突变蛋白。一般来说有以下步骤：

(1).用本发明所述多核苷酸，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转染合适的宿主细胞；

(2).在合适的培养基、培养液中培养宿主细胞；

(3).从培养基、培养液或细胞中分离、纯化蛋白质。

SPG3A突变蛋白可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

本发明还包括对本发明SPG3A突变基因或是其片段编码的蛋白具有特异性的多克隆抗体和单克隆抗体，尤其是单克隆抗体。这里，“特异性”是指抗体能结合于人SPG3突变基因产物或片段。较佳地，指那些能与人SPG3A突变基因产物或片段结合但不识别和结合于其它非相关抗原分子的抗体。

此类单克隆抗体可以利用杂交瘤技术来制备。本发明的抗体包括能阻断人SPG3A突变蛋白功能的抗体以及不影响人SPG3A蛋白功能的抗体。本发明的各类抗体可以利用人SPG3A突变基因产物的片段或功能区，通过常规免疫技术获得。这些片段或功能区可以利用重组方法制备或利用蛋白合成仪合成。

本发明包括SPG3A突变蛋白及其抗体、抑制剂、激动剂、拮抗剂等。当在治疗上进行施用(给药)时，可提供不同的效果。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：肌内、静脉内、皮下、或局部给药(包括病灶处)。较佳地是局部给药。

本发明还提供了一种药物组合物，它含有安全有效量的本发明SPG3A突变蛋白的拮抗剂以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。使用药物组合物时，是将安全有效量的SPG3突变蛋白的拮抗剂拮抗剂施用于哺乳动物，其中本安全有效量通常至少约0.1微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约10毫克/千克体重，较佳地本剂量是约0.1微克/千克体重-约100微克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。

本发明还涉及定量和定位检测人SPG3A突变蛋白水平的诊断试验方法。这些试验是本领域所熟知的，且包括FISH测定和放射免疫测定。

一种检测样品中是否存在SPG3A突变蛋白的方法是利用SPG3A蛋白的特异性抗体进行检测，它包括：将样品与SPG3A蛋白特异性抗体接触；观察是否形成抗体复合物，形成了抗体复合物就表示样品中存在SPG3A突变蛋白。

SPG3A蛋白的多聚核苷酸可用于SPG3A蛋白相关疾病的诊断和治疗。在诊断方面，SPG3A蛋白的多聚核苷酸可用于检测SPG3A蛋白的表达与否或在疾病状态下SPG3A蛋白的异常表达。如SPG3A DNA序列可用于对活检标本的杂交以判断SPG3A蛋白的表达异常。杂交技术包括Southern印迹法，Northern印迹法、原位杂交等。这些技术方法都是公开的成熟技术，相关的试剂盒都可从商业途径得到。本发明的多核苷酸的一部分或全部可作为探针固定在微阵列(microarray)或DNA芯片(又称为“基因芯片”)上，用于分析组织中基因的差异表达分析和基因诊断。用SPG3A蛋白特异的引物进行RNA一聚合酶链反应(RT-PCR)体外扩增也可检测SPG3A蛋白的转录产物。

本发明提供了一种检测人SPG3A基因表达是否异常的方法；它包括步骤：(a)确定在人SPG3A基因的SEQ ID NO：1所示序列的第565或1228位的核苷酸；和b)检测在所述位置是否存在碱基C或G的错义突变。

检测SPG3A基因的突变也可用于诊断遗传性痉挛性截瘫。检测可以针对DNA，也可针对基因组DNA。SPG3A蛋白突变的形式包括与正常野生型SPG3A DNA序列相比的点突变、易位、缺失、重组和其它任何异常等。可用已有的技术如Southern印迹法、DNA序列分析，PCR和原位杂交检测突变。另外，突变有可能影响蛋白的表达，因此用Northern印迹法、Western印迹法可间接判断基因有无突变。

发明人经过广泛而深入的研究，对来自21个遗传性痉挛性截瘫的家系(20个汉族家系和1个藏族家系)的84位患者和23个散发病例进行SPG3A基因的突变筛查。Zhao X等在2001年克隆了SPG3A基因(Zhao X，et al.Mutations in a newly identified GTPase genecause autosomal dominant hereditary spastic paraplegia.Nat Genet 29：326-331，2001)。目前全世界已报导了19个SPG3A基因的突变位点，但从未见中国人的报道。发明人通过测序的方法，在3个中国人的家系中共发现3个突变位点，其中2个突变位点为国际上从未报道的新的突变位点，1个突变位点为已知突变(但在中国人群为首次报道)。1个突变位点发生在SPG3A基因的第5外显子c.565C＞G(SEQ ID NO：1中第565位由C变为G)，导致p.H189D氨基酸(SEQ ID NO：2中第189位氨基酸由组氨酸变为天冬氨酸)的改变；发生在SPG3A基因的第12外显子c.1228G＞A(SEQ ID NO：1中第1228位由G变为A)，导致p.G410R氨基酸(SEQ ID NO：2中第410位氨基酸由甘氨酸变为精氨酸)的改变。

由于突变氨基酸位于编码肽链跨膜区的功能基团中，这一改变使得SPG3A基因所编码肽链的功能发生异常，从而引发本病。突变碱基C和G在脊椎动物中的保守性，也证明了这二个碱基在功能上的重要性。在此基础上，发明人完成了本发明。

本发明发现了一个SPG3A基因的2个新突变。这一发现可应用于制备诊断、治疗遗传性痉挛性截瘫的药物，检测SPG3A基因的突变；并进一步证实了SPG3A基因是引起遗传性痉挛性截瘫的疾病基因。发明人还发现疾病的表型和基因型存在着一定相关性。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明，而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1 家系收集

发明人收集了来自21个遗传性痉挛性截瘫的家系(20个汉族家系和1个藏族家系)的84位患者和23个散发病例。黑色图案符号表示患者。方框表示男性，圆圈表示女性。斜条表示个体死亡，黑色箭头指示的患者表示先证者(即家系中第一个得到确诊的患者)。在上述所有家系成员知情同意后，取外周血于EDTA管中备用。用Qiagen公司生产的QIAampDNA Blood Maxi Kits从抗凝外周血中提取DNA，TE溶解，-70℃保存，备用。

实施例2 SPG3A基因突变检测

SPG3A基因其mRNA序列来自Genebank(NM_181598.1)。Genomic DNA序列来自http：//genome.ucsc.edu。

主要步骤：

1.PCR扩增：PCR反应体积为50μl，内含50mmol/L Tris-HCl(pH8.8)，16.6mmol/L(NH4)₂SO₄，0.10mg/mlBSA，3.0mmol/L MgCl₂，200μmol/L dNTPs，引物P1、P2(检测外显子5即蚬二家系突变位点所在的引物)、P3、P4(检测外显子12即西藏家系突变位点所在的引物)各0.2μmol/L，Taq酶2U(MBI公司)，人基因组DNA约0.1～0.7μg。PCR反应条件：94℃3min；94℃45s，60℃1min，72℃1min，35循环；最后72℃延伸10min。引物P1(SEQID NO：3)的序列为：5’-TCCATCTCCAGAGCAGGTGA-3’，P2(SEQ ID NO：4)的序列为：5’-AGGCAGCTAATTGGGCCAA-3’；引物P3(SEQID NO：5)的序列为：5’-TATAGTCATGCCTCGTGGAT-3’；引物P4(SEQ ID NO：6)的序列为：5’-GCTTGTATCTGGGCAGGTCA-3’

2.测序反应方案：

(1)预反应：反应体积共3μl，内含PCR产物5-10ng(约0.5-1.0μl)，虾碱性磷酸酶(SAP)、外切酶I(Exo I)各0.25μl(USB公司)，补超纯水至3μl。反应混合物在PCR仪上反应，37℃温浴15min，然后85℃15min灭活酶。反应完毕后反应混合物直接作为测序反应的模板用。

(2)测序反应：用ABI公司的96孔板，在GeneAmp 9700PCR仪上进行。反应体积共10μl，内含3μl的预反应产物，2μl的5×buffer，1μl的Big-Dye(ABI)，1μl引物(3.2pmol/μl)，3μl的超纯水。反应条件：98℃2min；96℃10s，50℃5s，60℃4min，30循环；最后4℃保存。

(3)测序纯化：直接在96孔板上进行。

a)测序反应完毕后，每个样品加入90μl 75％乙醇，贴上封口铝箔，漩涡混匀；

b)室温避光20min；

c)20℃，3500rpm离心30min(5810R离心机上进行)；

d)倒去上清，倒扣在四层吸水纸上，350rpm离心30s；

e)室温避光20min，以晾干乙醇；

f)样品加10μl超纯水，上ABI3100测序仪进行测序。

3.测序结果分析：用ABI序列分析软件进行分析

发明人对来自21个遗传性痉挛性截瘫的家系(20个汉族家系和1个藏族家系)的84位患者和23个散发病例进行SPG3A基因的突变筛查。结果如下：

新的突变位点一为：发生在SPG3A基因的第5外显子c.565C＞G，导致p.H189D氨基酸的改变。该家系编号蚬二家系，来自广东肇庆蚬二。3代共8人患病。系谱见图1。

临床症状：患者均在年龄6岁以前发病，表型较轻，无须辅助工具行走，病程发展缓慢，部分患者出现扁平足。

新的突变位点二为：发生在SPG3A基因的第12外显子c.1228G＞A，导致p.G410R氨基酸的改变。该家系来自西藏。4代共9人患病。系谱见图2。

临床症状：患者均在年龄15岁以前发病。病程进展快速而病情严重。患者均呈双下肢截瘫，成痉挛状态，肌肉萎缩。足部呈马蹄状内翻，不能行走只能以手撑地移行。

已知突变位点(但在中国人群为首次报道)为：发生在SPG3A基因的第7外显子c.715C＞T，导致p.R239C氨基酸的改变。该家系来自山东。3代共5人患病。引物序列为：上游SEQ ID NO：75’-AGGGGAGAGACTGCCCAGA-3’；下游SEQ ID NO：85’-TGCTCTAAGATTGACTCCAGGGA-3’。

临床症状：患者均在年龄6岁以前发病，表型较轻，无须辅助工具行走，病程发展缓慢，。部分患者出现扁平足。系谱见图3。

以往的报道表明，SPG3A患者脚部的一个常见特征是弓形足。然而我们的2个汉族家系(蚬二家系和山东家系)中，11位患者有9位是扁平足。而家系中的正常人脚部都是未见异常。见图10、11。患者的TC(talocalcaneal angle，距跟骨)的角度均变大，TMT(the talarfirst metatarsal angle，距骨第一跖骨)的角度偏离。以上是根据美国的诊断标准(Lee etal.Clinical Practice Guideline Adult Flatfoot Panel.Diagnosis and treatment ofadult flatfoot.J Foot Ankle 44：78-113，2005)。

发明人又检测了100名与本家系无血缘关系的正常人，第189密码子全为CAC，第239密码子全为CGC，第410密码子全为GGG。

p.H189D(CAC→GAC)、p.R239C(CGC→TGC)及p.G410R(GGG→AGG)改变及分别在我们家系中所有的病人中都存在，与疾病表型呈共分离，但在家系中所有正常人中不存在；

在蚬二家系和山东家系中，其患者携带的致病突变导致SPG3A编码的肽链的N端发生改变。同时我们发现这两个家系所有的患者均有扁平足的症状，而其中的正常家系成员的足弓均无异常表现。患者的病情进展缓慢，症状轻微，所有的患者生活都能自理。

而西藏家系的致病突变导致SPG3A编码的肽链的C端发生改变。患者均无扁平足的症状，但症状严重，所有的患者均已不能行走。SPG3A编码的肽链的C端发生改变，可能导致较严重的症状。

实施例3 跨种属同源性比对

2个新突变发生在进化中高度保守的序列。应用Clustal X1.83软件(Thompson JD，Gibson TJ，Plewniak F，Jeanmougin F，Higgins DG.The CLUSTAL X windows interface：flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools.Nucleic Acids Res.1997；25：4876-4882.)比对人类SPG3A cDNA (NM 181598.1)及SPG3A基因编码的蛋白质(NP_853629.1)与大猩猩、牛、狗、鸡、大鼠、小鼠、河豚、秀丽线虫相应的序列。

与10种物种比对结果显示：SPG3A基因的cDNA序列的c.565C和c.1228G位点，SPG3A基因编码的蛋白的p.H189和p.G410位点高度保守。序列比对结果见图4，5。跨种属同源性比对结果证明，突变所在位点碱基在脊椎动物及非脊椎动物10种物种中全为C和G，所在的密码子全为His(组氨酸)及Gly(甘氨酸)。

实施例4 SPG3蛋白质二级结构预测

方法：用PROSPECT(Version 2.0beta l)(Xu Y，Xu D.Protein threading using PROSPECT：design and evaluation.Proteins.2000；40：343-354.)、Pfam 14.0(Bateman A，Coin L，Durbin R，etal.The Pfam protein fami l ies database.Nucleic Acids Res.2004；32：D138-141)及DAS-TMFillter软件(The upgraded and modifed version of theDAS-prediction method)(Cserzo M，Eisenhaber F，Eisenhaber B，Simon I.TM or not TM：transmembrane protein prediction with low false positive rate using DAS-TMfilter.Bioinformatics.2004；20：136-137.)预测SPG3A基因编码的蛋白质atlastin的结构及功能域。

蛋白质结构预测结果见图6。PG3A基因编码肽链的生物结构学的研究，发现一个鸟苷酸结合蛋白域。该鸟苷酸结合蛋白域与包含三磷酸核苷酸水解酶的P-loop(CATH分类)(CATH isa novel hierarchical classification of protein domain structures，which clust是一种对蛋白质结构域的新的等级分类方法，在4个主要级别上归类蛋白质，即门类C，体系A，拓扑结构T和同源超家族H)同源。H/D残基侧链位于结合口袋(binding pocket)的边缘。因而蚬二家系中p.H189D氨基酸的替换预测会影响鸟苷酸的或三磷酸鸟苷酸酶的激活。而西藏家系p.G410R氨基酸的改变发生在鸟苷酸结合蛋白域(GB，球状区域)与跨膜螺旋区(TM，杆状区域)的联结部位，并且这个被覆盖在分子中间的残基位于α-螺旋的起始点。因而，p.G410R氨基酸的改变很可能通过使一个小而不重要的残基转变成一个大而重要的残基，破坏了α-螺旋，从而引起杆状区域的整体结构的变化，从而引起严重的临床上的症状、体征。

实施例5 SPG3A基因突变检测试剂盒1的制备

制备一试剂盒，它含有：

名称序列序列(5’→3’) 编号浓度

正向引物 TCC ATC TCC AGA GCA GGT GA SEQ ID NO：3 干粉2OD

反向引物 AGG CAG CTA ATT GGG CCA A SEQ ID NO：4 干粉2OD

PCR反应液含Taq酶、dNTP、镁离子、PCR反应缓冲液

PCR产物纯化盒含小量PCR产物纯化的溶液，DNA吸附柱Label1

测序反应液含Big Dye

抽取待检测病人的血液3ml，使用常规方法(或使用特定的试剂盒)从血液中提取DNA。将SPG3A基因突变检测试剂盒1中的PCR引物稀释到0.2μmol/L，以所提取的DNA为模板与所提供的引物进行PCR反应。使用检测试剂盒所提供的PRC产物纯化盒对PCR产物进行纯化。将纯化的产物进行测序反应后直接进行测序。观测测序所得到的序列是否有错义突变，即SEQID NO：1所示核苷酸序列第565位C是否突变。

实施例6 SPG3A基因突变检测试剂盒2的制备

制备一试剂盒，它含有：

名称序列序列(5’→3’) 编号浓度

正向引物 TAT AGT CAT GCC TCG TGG AT SEQ ID NO：5 干粉2OD

反向引物 GCT TGT ATC TGG GCA GGT CA SEQ ID NO：6 干粉2OD

PCR反应液含Taq酶、dNTP、镁离子、PCR反应缓冲液

PCR产物纯化盒含小量PCR产物纯化的溶液，DNA吸附柱Label1

测序反应液含Big Dye

抽取待检测孕妇的羊水15ml，使用常规方法(或使用特定的试剂盒)从羊水中提取DNA。将SPG3A基因突变检测试剂盒中的PCR引物稀释到0.2μmol/L，以所提取的DNA为模板与所提供的引物进行PCR反应。使用检测试剂盒所提供的PCR产物纯化盒对PCR产物进行纯化。将纯化的产物进行测序反应后直接进行测序。观测测序所得到的序列是否有错义突变，即SEQID NO：1所示核苷酸序列第1228位G是否突变。

实施例7 药物组合物的制备

将SPG3A突变蛋白的拮抗剂与普通的药膏材料按特定的比例混合，制成含SPG3A突变蛋白的拮抗剂的药膏。使用时，将药膏施于患处，患处SPG3A突变基因所编码的突变蛋白受到抑制，使病人由于缺乏SPG3A所编码的正常蛋白而引起的遗传性痉挛性截瘫得以减轻，直至最后的消失。或将SPG3A突变基因所编码的突变蛋白制成针剂，使用时对患处进行皮下注射，直接抑制病灶处的SPG3A突变蛋白，使病人的遗传性痉挛性截瘫症状得到改善，从而达到治疗的目的。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110>中山大学

<120>SPG3A基因突变、其编码产物及其应用

<130>051005

<160>8

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>2403

<212>DNA

<213>智人

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(1641)

<223>

<400>1

atg gcc aag aac cgc agg gac aga aac agt tgg ggt gga ttt tcg gaa 48

Met Ala Lys Asn Arg Arg Asp Arg Asn Ser Trp Gly Gly Phe Ser Glu

1 5 10 15

aag aca tat gaa tgg agc tca gaa gag gag gag cca gtg aaa aag gca 96

Lys Thr Tyr Glu Trp Ser Ser Glu Glu Glu Glu Pro Val Lys Lys Ala

20 25 30

gga cca gtc caa gtc ctc att gtc aaa gat gac cat tcc ttt gag tta 144

Gly Pro Val Gln Val Leu Ile Val Lys Asp Asp His Ser Phe Glu Leu

35 40 45

gat gaa act gca tta aat cgg atc ctt ctc tcg gag gct gtc aga gac 192

Asp Glu Thr Ala Leu Asn Arg Ile Leu Leu Ser Glu Ala Val Arg Asp

50 55 60

aag gag gtt gtt gct gta tct gtt gct gga gca ttt aga aaa gga aaa 240

Lys Glu Val Val Ala Val Ser Val Ala Gly Ala Phe Arg Lys Gly Lys

65 70 75 80

tca ttc ctg atg gac ttc atg ttg aga tac atg tac aac cag gaa tca 288

Ser Phe Leu Met Asp Phe Met Leu Arg Tyr Met Tyr Asn Gln Glu Ser

85 90 95

gtt gat tgg gtt gga gac tac aat gaa cca ttg act ggt ttt tca tgg 336

Val Asp Trp Val Gly Asp Tyr Asn Glu Pro Leu Thr Gly Phe Ser Trp

100 105 110

aga ggt gga tct gag cga gag acc aca gga att cag ata tgg agt gaa 384

Arg Gly Gly Ser Glu Arg Glu Thr Thr Gly Ile Gln Ile Trp Ser Glu

115 120 125

atc ttc ctt atc aat aaa cct gat ggt aaa aag gtt gca gtg tta ttg 432

Ile Phe Leu Ile Asn Lys Pro Asp Gly Lys Lys Val Ala Val Leu Leu

130 135 140

atg gat act cag gga acc ttt gat agt cag tca act ttg aga gat tca 480

Met Asp Thr Gln Gly Thr Phe Asp Ser Gln Ser Thr Leu Arg Asp Ser

145 150 155 160

gcc aca gta ttt gcc ctt agc aca atg atc agc tca ata cag gta tat 528

Ala Thr Val Phe Ala Leu Ser Thr Met Ile Ser Ser Ile Gln Val Tyr

165 170 175

aac tta tcc caa aat gtc cag gag gat gat ctt cag cac ctc cag ctt 576

Asn Leu Ser Gln Asn Val Gln Glu Asp Asp Leu Gln His Leu Gln Leu

180 185 190

ttc act gag tat ggc aga ctg gca atg gag gaa aca ttc ctg aag cca 624

Phe Thr Glu Tyr Gly Arg Leu Ala Met Glu Glu Thr Phe Leu Lys Pro

195 200 205

ttt cag agt ctg ata ttt ctt gtt cga gac tgg agt ttc cca tac gaa 672

Phe Gln Ser Leu Ile Phe Leu Val Arg Asp Trp Ser Phe Pro Tyr Glu

210 215 220

ttt tca tat gga gcc gat ggt ggt gcc aaa ttc ttg gaa aaa cgc ctc 720

Phe Ser Tyr Gly Ala Asp Gly Gly Ala Lys Phe Leu Glu Lys Arg Leu

225 230 235 240

aag gtc tca ggg aac cag cat gaa gaa cta cag aac gtc aga aaa cac 768

Lys Val Ser Gly Asn Gln His Glu Glu Leu Gln Asn Val Arg Lys His

245 250 255

atc cat tcc tgt ttc acc aac att tcc tgt ttt ctg cta cct cat cct 816

Ile His Ser Cys Phe Thr Asn Ile Ser Cys Phe Leu Leu Pro His Pro

260 265 270

ggc tta aaa gta gct acc aat cca aac ttt gat gga aaa ttg aaa gaa 864

Gly Leu Lys Val Ala Thr Asn Pro Asn Phe Asp Gly Lys Leu Lys Glu

275 280 285

ata gat gat gaa ttc atc aaa aac ttg aaa ata ctg att cct tgg cta 912

Ile Asp Asp Glu Phe Ile Lys Asn Leu Lys Ile Leu Ile Pro Trp Leu

290 295 300

ctt agt ccc gag agc cta gat att aaa gag atc aat ggg aat aaa atc 960

Leu Ser Pro Glu Ser Leu Asp Ile Lys Glu Ile Asn Gly Asn Lys Ile

305 310 315 320

acc tgc cgg ggt ctg gtg gag tac ttc aag gct tat ata aag atc tat 1008

Thr Cys Arg Gly Leu Val Glu Tyr Phe Lys Ala Tyr Ile Lys Ile Tyr

325 330 335

caa ggt gaa gaa tta cca cat ccc aaa tcc atg tta cag gcc aca gca 1056

Gln Gly Glu Glu Leu Pro His Pro Lys Ser Met Leu Gln Ala Thr Ala

340 345 350

gaa gct aac aat tta gca gcc gtg gca act gcc aag gac aca tac aac 1104

Glu Ala Asn Asn Leu Ala Ala Val Ala Thr Ala Lys Asp Thr Tyr Asn

355 360 365

aaa aaa atg gaa gag att tgt ggt ggt gac aaa cca ttt ctg gcc cca 1152

Lys Lys Met Glu Glu Ile Cys Gly Gly Asp Lys Pro Phe Leu Ala Pro

370 375 380

aat gac ttg cag acc aaa cac ctg caa ctt aag gaa gaa tct gtg aag 1200

Asn Asp Leu Gln Thr Lys His Leu Gln Leu Lys Glu Glu Ser Val Lys

385 390 395 400

cta ttc cga ggg gtg aag aag atg ggt ggg gaa gaa ttt agc cgg cgt 1248

Leu Phe Arg Gly Val Lys Lys Met Gly Gly Glu Glu Phe Ser Arg Arg

405 410 415

tac ctg cag cag ttg gag agt gaa ata gat gaa ctt tac atc caa tat 1296

Tyr Leu Gln Gln Leu Glu Ser Glu Ile Asp Glu Leu Tyr Ile Gln Tyr

420 425 430

atc aag cac aat gat agc aaa aat atc ttc cat gca gct cgt acc cca 1344

Ile Lys His Asn Asp Ser Lys Asn Ile Phe His Ala Ala Arg Thr Pro

435 440 445

gcc aca ctg ttt gta gtc atc ttt atc aca tat gtg att gct ggt gtg 1392

Ala Thr Leu Phe Val Val Ile Phe Ile Thr Tyr Val Ile Ala Gly Val

450 455 460

act gga ttc att ggt ttg gac atc ata gct agc cta tgc aat atg ata 1440

Thr Gly Phe Ile Gly Leu Asp Ile Ile Ala Ser Leu Cys Asn Met Ile

465 470 475 480

atg gga ctg acc ctt atc acc ctg tgc act tgg gca tat atc cgg tac 1488

Met Gly Leu Thr Leu Ile Thr Leu Cys Thr Trp Ala Tyr Ile Arg Tyr

485 490 495

tct gga gaa tac cga gag ctg gga gct gta ata gac cag gtg gct gca 1536

Ser Gly Glu Tyr Arg Glu Leu Gly Ala Val Ile Asp Gln Val Ala Ala

500 505 510

gct ctg tgg gac cag gga aga ggc ttt gta caa gct tta cag tgc agc 1584

Ala Leu Trp Asp Gln Gly Arg Gly Phe Val Gln Ala Leu Gln Cys Ser

515 520 525

agc aac cca cag aca tct gta tca tca agc ttt ccc tac acc aaa gtc 1632

Ser Asn Pro Gln Thr Ser Val Ser Ser Ser Phe Pro Tyr Thr Lys Val

530 535 540

gga atc tac tgaacaatca gaaaagaaaa aaatgtaatg caaattttaa 1681

Gly Ile Tyr

545

gaaatacagg tgcatgacca attgtcaatt aaatattcag ttttatgtct ccatgcaaac 1741

attcaaagtg cttccatcag aacggagtaa aatactaaac acctctgaag actgcaaact 1801

ggattagttc ttttacttca gtgtttaata agcagatgta tgtatgcatg gttatactat 1861

tttgttaaca tgtacaattt cctgattttt cttcaaaaat gctgttataa agtatttgtc 1921

tatttatgat aacagtacac gtgttctgct tgaatttact aaattctact actgggttat 1981

aattaaatca tgtgatattc cacgtttgga tatgctcatt taatttctac agaaaaaatt 2041

ttaaattatt tcacattagc catttgttaa aacacagcat cataactcag caggctggat 2101

ttaatctgta tcatcttata tatatcacaa tcttattttt aagcacattt tagagttcct 2161

tagttgcttt atcaaaaacc agatattgct tttacatggt ttaatagaat ataaacctct 2221

tgataaaaaa tgcacaaaaa atcactttgt atatgtgagt ttcactgcat tgtatatttt 2281

ttcatttggt acacaaagaa tgtattcttc ataggtttat tcttttaata tgtgaactat 2241

tattaaagtt tactctggtt cctaagatta aaaacaaatg cttactgaat ttgaaaaaaa 2401

aa 2403

<210>2

<211>547

<212>PRT

<213>智人

<400>2

Met Ala Lys Asn Arg Arg Asp Arg Asn Ser Trp Gly Gly Phe Ser Glu

1 5 10 15

Lys Thr Tyr Glu Trp Ser Ser Glu Glu Glu Glu Pro Val Lys Lys Ala

20 25 30

Gly Pro Val Gln Val Leu Ile Val Lys Asp Asp His Ser Phe Glu Leu

35 40 45

Asp Glu Thr Ala Leu Asn Arg Ile Leu Leu Ser Glu Ala Val Arg Asp

50 55 60

Lys Glu Val Val Ala Val Ser Val Ala Gly Ala Phe Arg Lys Gly Lys

65 70 75 80

Ser Phe Leu Met Asp Phe Met Leu Arg Tyr Met Tyr Asn Gln Glu Ser

85 90 95

Val Asp Trp Val Gly Asp Tyr Asn Glu Pro Leu Thr Gly Phe Ser Trp

100 105 110

Arg Gly Gly Ser Glu Arg Glu Thr Thr Gly Ile Gln Ile Trp Ser Glu

115 120 125

Ile Phe Leu Ile Asn Lys Pro Asp Gly Lys Lys Val Ala Val Leu Leu

130 135 140

Met Asp Thr Gln Gly Thr Phe Asp Ser Gln Ser Thr Leu Arg Asp Ser

145 150 155 160

Ala Thr Val Phe Ala Leu Ser Thr Met Ile Ser Ser Ile Gln Val Tyr

165 170 175

Asn Leu Ser Gln Asn Val Gln Glu Asp Asp Leu Gln His Leu Gln Leu

180 185 190

Phe Thr Glu Tyr Gly Arg Leu Ala Met Glu Glu Thr Phe Leu Lys Pro

195 200 205

Phe Gln Ser Leu Ile Phe Leu Val Arg Asp Trp Ser Phe Pro Tyr Glu

210 215 220

Phe Ser Tyr Gly Ala Asp Gly Gly Ala Lys Phe Leu Glu Lys Arg Leu

225 230 235 240

Lys Val Ser Gly Asn Gln His Glu Glu Leu Gln Asn Val Arg Lys His

245 250 255

Ile His Ser Cys Phe Thr Asn Ile Ser Cys Phe Leu Leu Pro His Pro

260 265 270

Gly Leu Lys Val Ala Thr Asn Pro Asn Phe Asp Gly Lys Leu Lys Glu

275 280 285

Ile Asp Asp Glu Phe Ile Lys Asn Leu Lys Ile Leu Ile Pro Trp Leu

290 295 300

Leu Ser Pro Glu Ser Leu Asp Ile Lys Glu Ile Asn Gly Asn Lys Ile

305 310 315 320

Thr Cys Arg Gly Leu Val Glu Tyr Phe Lys Ala Tyr Ile Lys Ile Tyr

325 330 335

Gln Gly Glu Glu Leu Pro His Pro Lys Ser Met Leu Gln Ala Thr Ala

340 345 350

Glu Ala Asn Asn Leu Ala Ala Val Ala Thr Ala Lys Asp Thr Tyr Asn

355 360 365

Lys Lys Met Glu Glu Ile Cys Gly Gly Asp Lys Pro Phe Leu Ala Pro

370 375 380

Asn Asp Leu Gln Thr Lys His Leu Gln Leu Lys Glu Glu Ser Val Lys

385 390 395 400

Leu Phe Arg Gly Val Lys Lys Met Gly Gly Glu Glu Phe Ser Arg Arg

405 410 415

Tyr Leu Gln Gln Leu Glu Ser Glu Ile Asp Glu Leu Tyr Ile Gln Tyr

420 425 430

Ile Lys His Asn Asp Ser Lys Asn Ile Phe His Ala Ala Arg Thr Pro

435 440 445

Ala Thr Leu Phe Val Val Ile Phe Ile Thr Tyr Val Ile Ala Gly Val

450 455 460

Thr Gly Phe Ile Gly Leu Asp Ile Ile Ala Ser Leu Cys Asn Met Ile

465 470 475 480

Met Gly Leu Thr Leu Ile Thr Leu Cys Thr Trp Ala Tyr Ile Arg Tyr

485 490 495

Ser Gly Glu Tyr Arg Glu Leu Gly Ala Val Ile Asp Gln Val Ala Ala

500 505 510

Ala Leu Trp Asp Gln Gly Arg Gly Phe Val Gln Ala Leu Gln Cys Ser

515 520 525

Ser Asn Pro Gln Thr Ser Val Ser Ser Ser Phe Pro Tyr Thr Lys Val

530 535 540

Gly Ile Tyr

545

<210>3

<211>20

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(20)

<223>引物P1

<400>3

tccatctcca gagcaggtga 20

<210>4

<211>19

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(19)

<223>引物P2

<400>4

aggcagctaa ttgggccaa 19

<210>5

<211>20

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(20)

<223>引物P3

<400>5

tatagtcatg cctcgtggat 20

<210>6

<211>20

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(20)

<223>引物P4

<400>6

gcttgtatct gggcaggtca 20

<210>7

<211>20

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(20)

<223>引物P5

<400>7

gcttgtatct gggcaggtca 20

<210>8

<211>20

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(20)

<223>引物P6

<400>8

gcttgtatct gggcaggtca 20

Claims

1.一种SPG3A基因突变蛋白，其特征在于，SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列中第189位组氨酸突变为天冬氨酸，或者SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列中第410位甘氨酸突变为精氨酸。

2.一种分离的SPG3A突变基因，其特征在于，它编码权利要求1所述的突变蛋白。

3.如权利要求2所述的SPG3A突变基因，其特征在于，所述突变选自：

SEQ ID NO：1所示核苷酸序列第565位由C突变为G；

SEQ ID NO：1所示核苷酸序列第1228位由G突变为A。

4.一种检测SPG3A基因突变的方法，它包括步骤：提取DNA样本；PCR扩增；测序；与正常SPG3A核苷酸序列(SEQ ID NO：1)比较是否存在突变；其特征在于，所述突变选自：

SEQ ID NO：1所示核苷酸序列第565位C发生突变；

SEQ ID NO：1所示核苷酸序列第1228位G发生突变。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增的引物选自：

(1)SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4；

(2)SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6。

6.如权利要求4或5所述的方法，其特征在于，所述DNA样本取自血液、羊水或组织。

7.一种载体，其特征在于，包含权利要求2或3所述的SPG3A突变基因。

8.一种遗传工程化的宿主细胞，其特征在于，它是被权利要求7所述的载体转化或转导的宿主细胞。

9.一种检测SPG3A基因突变的试剂盒，其特征在于，它包括特异性扩增SPG3A基因或转录本的引物，所述PCR扩增的引物选自：

(1)SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4；

(2)SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6。

10.如权利要求9所述的试剂盒，所述基因突变选自：

SEQ ID NO：1所示核苷酸序列第565位C发生突变；

SEQ ID NO：1所示核苷酸序列第1228位G发生突变。