CN1930290A

CN1930290A - 检测由乙型肝炎病毒引起的癌发生的方法

Info

Publication number: CN1930290A
Application number: CNA2005800072032A
Authority: CN
Inventors: 井上逸朗; 西乡健一
Original assignee: Otsuka Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Otsuka Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2004-03-05
Filing date: 2005-03-01
Publication date: 2007-03-14
Also published as: EP1726646A4; US20080160510A1; CA2557761A1; JPWO2005085436A1; EP1726646A1; WO2005085436A1

Abstract

一种从怀疑是瘤性的人样品分离的肝组织中，检测HBV－DNA掺入MLL4基因的方法，其指示组织的瘤性。在典型情况下，可以使用对MLL4基因的含内含子3的区域特异性的引物和另一个对HBV的X基因区域特异性的引物通过PCR检测这种掺入。

Description

检测由乙型肝炎病毒引起的癌发生的方法

技术领域

本发明涉及检测HBV-DNA整合入MLL4基因的方法和试剂盒，其指示来自疾病组织例如慢性肝炎或肝硬化的组织，是癌性的；或者涉及检测其融合产物的方法和试剂盒。本发明进一步涉及检测染色体19长臂上的MLL4基因的内含子3与染色体17短臂之间的染色体易位，其指示组织是癌性的。

背景技术

人乙型肝炎病毒(HBV)，其属于嗜肝DNA病毒家族，表现非常受限的宿主范围并显示对肝实质细胞强烈的向性。急性HBV感染在一些情况导致严重的疾病，约0.5％的爆发性肝炎患者死亡。另一方面，慢性感染引起中度到重度的肝疾病，比如，例如，慢性肝炎、肝硬化和肝细胞癌(Beasley，R.P.，et al.，Lancet，2，1129-1133(1981)；Block，T.M.，et al.，Oncogene，22，5093-5107(2003))。约25％具有慢性HBV感染的患者最终发展成不能治疗的肝癌。

HBV经常整合入人宿主基因组中，推测由此引起的插入突变在肿瘤发生中起重要作用。因而，鉴定病毒整合位点能提供鉴定癌症相关基因的有效工具(Gozuacik，D.，et al.，Oncogene，20，6233-6240(2001)；Brechot，C.，Semin.Cancer Biol.，10，211-231(2000))。以下事实支持这个观点。

例如，在旱獭动物模型中，HBV相关的旱獭肝炎病毒(WHV)以至少80％的频率整合到能引起旱獭肝中癌发生的N-myc家族癌基因内或其邻近区域(Hsu，T.，etal.，Cell，55，627-635(1988)；Fourel，G.，et al.，Nature，347，294-298(1990))。在人中，已经在慢性肝炎组织中发现，HBV-DNA随机整合入宿主基因组中(Takada，S.，etal.，J.Virol.，64，822-828(1990))。此外，通过Southern印迹分析已经证实，在约90％HBs抗原阳性患者的肝细胞癌(HCC)组织中有HBV-DNA克隆或寡克隆性整合(Brechot，C.，Semin.Cancer Biol.，10，211-231(2000))。

肝细胞癌是世界上最常见的癌之一。大多数情况下，肝细胞癌是由慢性感染人乙型肝炎病毒或人丙型肝炎病毒(HCV)引起的。肿瘤相关病毒引起癌发生的经典机制是通过将病毒基因组整合入细胞基因组中，由此诱导能潜在诱发转化的细胞基因活化。

例如，HBV基因组整合入视黄酸受体β基因和细胞周期蛋白A2基因已经被证明引起癌发生(Dejean，A.，et al.，Nature，322，70-72(1986)；Wang，J.，et al.，Nature，343，555-557(1990))。已经有报道肌质网/内质网钙ATP酶(SERCA)也是HBV整合的靶标，HBx/SERCA1嵌合蛋白质融合产物可能与经细胞凋亡的癌发生相关(Chami，M.，ct al.，Oncogene，19，2877-2886(2000)；Minami，M.，et al.)。然而，HBV在这些位点的整合引起的癌发生还没有在其它肝细胞癌患者的样品中重现。

也有几个报道表明HBV-DNA优先整合入肝细胞癌组织中人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因的启动子区域中，导致肝细胞癌中人端粒酶逆转录酶的顺式活化(Ferber，M.J.，et al.，Oncogene，22，3813-3820(2003)；Paterlini-Brcchot，P.，et al，Oncogene，22，3911-3916(2003))。此外，已经报道肿瘤抑制基因和癌基因与经hTERT的癌发生抑制相关(Lin，S.Y.，and Elledge，S.J.，Cell，113，881-889(2003))。基于这些报道，能够得出结论，HBV-DNA整合入hTERT基因或其启动子中对癌发生可能具有直接的作用。

混合谱系白血病4(MLL4)基因(ATCC登记号：AD000671)被报道作为MLL基因的第二个人同源基因(Ruault，M.，et al.，Gene，284，73-81(2002))。MLL4基因早先被称作MLL2，在文章中被标记为MLL2。该MLL4基因是TRX/MLL基因家族的成员(FitzGerald，K.T.，and Diaz，M.O.，Genomics，59，187-192(1999))。MLL4基因定位于染色体19q13.1，已经报道对于实体瘤中的该基因在此频繁发生基因组重排或扩增(Mitelman，F.，et al.，Nat.Genet.，15，417-474(1997)；Curtis，L.J.，et al.，Genomics，53，42-55(1998)；Ferbus，D.，et al.，Int.J.Cancer；80，369-372(1999))。该基因在成年人组织中广泛表达。HBV相关肝细胞癌中染色体19q13.1处的基因扩增已经通过比较基因组杂交法(CGH)被观察到(Marchio，a.，et al.，GenesChromosom.Cancer，18，59-65(1997))。染色体19q13.1在实体瘤中高频基因组重排也已经被报道(Curtis，L.J.，et al.，Genomics，53，42-55(1998)；Ferbus，D.，et al.，Int.J.Cancer，80，369-372(1999)；Urashima，T.，et al.，J.Hepatol.，26，771-778(1997))。

已知MLL基因是与人白血病相关的染色体易位的常见靶标(der Poel，S.Z.，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，88，10735-10739(1991))；Rowley，J.D.，Annual Rev.Genet.，96，496-519(1998)；Huntsman，D.G.，et al.，Oncogene，18，7975-7984(1999))。由于MLL和MLL4之间存在高保守性区域，对MLL4基因的类似可能性也可能是事实，但是还没有报道含MLL4基因的染色体区域参与白血病中的易位。

虽然认为HBV-DNA与人肝细胞中的癌发生有关，但是很少有关于HBV-DNA整合入人染色体的肝癌诱导位点的信息，由于这个原因，不能以高概率检测HBV起始的肝癌。基于此，需要鉴定HBV起始的人肝癌中的染色体中HBV-DNA的整合位点。

发明内容

本发明的一个目的是提供方法和试剂盒，使用它们，能有效检测，例如，肝癌，这是通过鉴定怀疑是癌性的肝组织中HBV-DNA整合入MLL4基因的位点和染色体17和19之间的易位，由此指示组织是癌性的。

为了实现这个目的，本发明人寻求鉴定新靶标基因，用于优先的和预示癌症的HBV-DNA整合。此外，本发明人为了建立方法进行了广泛研究，通过检测整合入特定基因或通过检测由此可以产生的融合产物，所述方法将检测患者提供的样品是与该特定基因功能异常相连的肝癌或者在未来有可能称为肝癌。以下知识是作为这些研究的结果而获得的。

(1)从HBs抗原阳性的10位肝细胞癌患者的肝肿瘤组织中提取DNA，然后于使用HBV-DNA特异性引物对此DNA进行接头连接/抑制PCR(Siebert，P.D.，et al.，Nucleic Acids Res.，23，1087-1088(1995))。接头连接/抑制PCR是一种能够扩增与引物相应的特异性碱基序列以及该特异性碱基序列插入的旁侧位点的方法。这种方法能从肿瘤组织提取的DNA中鉴定HBV-DNA的整合位点。

作为结果，在10个肝细胞癌样品中，7个样品检测到HBV-DNA的整合，这些样品中有4个证实HBV-DNA整合入MLL4基因的内含子3中。

这些观察结果支持可以通过检测HBV-DNA整合入MLL4基因的内含子3中来检测由HBV感染引起的肝癌的构思。

(2)在已证实HBV-DNA整合入MLL4基因内含子3的4个样品的DNA中，存在有HBV启动子区和去C端的HBV X蛋白编码区。这提示可能存在MLL4和HBV X基因(HBx)间的融合转录产物。根据RT-PCR的实际结果，产生了这样的融合转录产物，其中由于HBx-DNA插入而导致阅读框位移并因此在MLL4基因中产生一个早熟终止密码子；也产生了这样的融合转录产物，其中没有阅读框位移并且MLL4基因中没有引入早熟终止密码子。

这些观察结果支持能通过检测HBx-DNA/MLL4基因融合转录产物而检测由HBV感染引起的肝癌的想法。

(3)从已经证实HBx-DNA整合入MLL4内含子3的4个样品的肝肿瘤组织和邻近的非肿瘤组织中制备总蛋白质，使用抗HBx单克隆抗体检测免疫沉淀产物并进行Western印迹。这导致在肿瘤组织中观察到检测到带或免疫沉淀产物，但是在非肿瘤组织中没有。

这些观察支持能通过使用抗HBx单克隆抗体或抗MLL4内含子3和HBV X个体区域的融合蛋白的单克隆抗体使用Western印迹或免疫沉淀反应来检测由HBV感染引起的肝癌的想法。

(4)在26个抗HBc抗体阳性的肝细胞癌组织样品中，包括10个HBs抗原阳性的样品，使用对应MLL4内含子3(染色体19长臂)的引物和对应染色体17短臂的引物进行PCR。在22个样品中检测到MLL4内含子3(染色体19长臂)和染色体17短臂间的染色体易位。

这个观察支持能通过使用PCR检测MLL4内含子3(染色体19长臂)和染色体17短臂间的染色体易位以高概率检测由HBV感染引起的肝癌的想法。

(5)前面的结果强烈提示MLL4内含子3是与癌发生连锁的HBV整合的优先靶标。此外，该区域的染色体重排也可能与肝中癌发生病因学关联。

基于上述发现完成了本发明，本发明提供下述的检测方法和检测试剂盒。

1.用于检测从人对象分离和怀疑是癌性的肝组织中HBV-DNA整合入MLL4基因的方法，HBV-DNA的这种整合指示组织的癌性。

2.根据项1的方法，用于检测HBV-DNA整合入MLL4基因，这是通过

对肝组织的DNA进行聚合酶链式反应(PCR)；和

通过确定扩增DNA的碱基序列确认HBV-DNA整合入MLL4基因。

3.根据项2的方法，其中含HBV-DNAX基因的区域整合入MLL4基因内含子3被确认。

4.根据项1的方法，用于检测HBV-DNA整合入MLL4基因内含子3。

5.根据项4的方法，用于检测HBV-DNA整合入MLL4基因内含子3的从5’末端起碱基编号17515-17818区域中。

6.根据项1、4或5的方法，其中HBV-DNA是含HBV X基因的区域。

7.用于检测从人对象分离和怀疑是癌性的肝组织中HBV-DNA整合入MLL4基因的方法，HBV-DNA的这种整合指示组织的癌性，这是通过包含以下步骤的操作：

(1)从肝组织中提取DNA；

(2)以(1)中获得的DNA作为模板，使用对含MLL4基因内含子3区域特异性的第一引物和对HBV X基因区域特异性的第一引物，进行PCR；和

(3)任选再进行一次PCR，其中以(2)中扩增的DNA作为模板，使用对含MLL4基因内含子3区域特异性的第二引物和对HBV X基因区域特异性的第二引物。

8.根据项1、4、5和6任一项的方法，其中通过检测MLL4基因/HBV融合转录产物来检测HBV-DNA整合入MLL4基因。

9.根据项8的方法，用于检测MLL4基因/HBV X区域融合转录产物。

10.根据项1、4、5和6任一项的方法，其中通过检测MLL4/HBV融合蛋白来检测HBV-DNA整合入MLL4基因。

11.根据项10的方法，包括检测MLL4/HBV X区域融合蛋白。

12.根据项10或11的方法，其使用与MLL4/HBV X区域融合蛋白特异性结合的抗体或抗体片段。

13.用于检测在从人对象分离和怀疑是癌性的肝组织中MLL4基因的t(17；19)(P11.2；q13.1)染色体易位的方法，该易位指示组织的癌性。

14.根据项13的方法，用于通过检测包括染色体17和染色体19之间连接点的碱基序列来检测MLL4基因的t(17；19)(p11.2；q13.1)染色体易位。

15.根据项14的方法，用于通过包括以下步骤的操作来检测含染色体17和染色体19之间连接点的碱基序列：

(1)从肝组织中提取DNA；

(2)以获得的DNA作为模板，使用对含染色体17的p11.2的区域特异性的第一引物和对含染色体19的q13.1处MLL4基因内含子3的区域特异性的第一引物，进行PCR；和

(3)以扩增的DNA作为模板，使用对含染色体17的p11.2的区域特异性的第二引物和含对染色体19的q13.1处MLL4基因内含子3的区域特异性的第二引物，进行PCR。

16.检测HBV-DNA整合入MLL4基因的试剂盒。

17.检测HBV-DNA整合入MLL4基因内含子3的试剂盒。

18.检测HBV X区域整合入MLL4基因内含子3的试剂盒。

19.根据项18的试剂盒，包括对含MLL4基因内含子3的区域特异性的引物或探针和对HBV X区域特异性的引物或探针。

20.检测MLL4基因/HBV X区域融合转录产物的试剂盒。

21.检测MLL4基因/HBV X区域融合蛋白的试剂盒。

22.根据项21的试剂盒，包括与MLL4/HBV X区域融合蛋白特异性结合的抗体或抗体片段。

23.检测MLL4基因的t(17；19)(p11.2；q13.1)染色体易位的试剂盒。

24.根据项23的试剂盒，包括对含MLL4基因内含子3的区域特异性的引物或探针和对含染色体17的p11.2的区域特异性的引物和探针。

25.根据项7的方法，使用SEQ ID NO.12所示的引物作为对含MLL4基因内含子3的区域特异性的引物和使用SEQ ID NO.4所示的引物作为对HBV X基因区域特异性的引物。

26.根据项7的方法，使用SEQ ID NO.8所示的引物作为对含MLL4基因内含子3的区域特异性的第一引物和使用SEQ ID NO.14所示的引物作为对HBV X基因区域特异性的第一引物，和任选地使用SEQ ID NO.9所示的引物作为对含MLL4基因内含子3区域特异性的第二引物和使用SEQ ID NO.14所示的引物作为对HBV X基因区域特异性的第二引物。

27.根据项15的方法，使用SEQ ID NO.20引物作为对含染色体17的p11.2区域特异性的第一引物，SEQ ID NO.8引物作为对含染色体19的q13.1处MLL4基因内含子3区域特异性的第一引物，SEQ ID NO.21引物作为对含染色体17的p11.2区域特异性的第二引物，和SEQ ID NO.9引物作为对含染色体19的q13.1处MLL4基因内含子3区域特异性的第二引物。

关于上述DNA，根据本发明的方法和试剂盒能够通过PCR检测从怀疑是肝癌的人、尤其是具有HBV感染和/或慢性肝炎或肝硬化的人收集的肝组织中HBV-DNA整合入MLL4基因，并由此能够基于其指示来检测肝细胞组织中存在/缺少癌性变化。

此外，根据本发明的方法和试剂盒能够检测在前述DNA中由HBV-DNA整合入MLL4基因产生的融合产物，更特别的是能够检测含HBV X基因区域的DNA整合入MLL4基因产生的融合产物、融合转录产物或融合蛋白质，由此可以对肿瘤发生进行遗传诊断。而且，这些融合产物可以用于研究肝病如慢性肝炎和肝硬化患者中癌发生和基因整合之间的关联性。

根据本发明的方法和试剂盒也能够检测MLL4基因的t(17；19)(p11.2；q13.1)染色体易位，其又可以对肿瘤发生进行遗传诊断。此外，根据本发明的方法和试剂盒能够用于研究细胞转化特别是肝细胞转化和遗传重排相关联基因的功能之间的关系。

基于前述，根据本发明的方法和试剂盒能够提供信息和方法，用于阐明肝组织中癌发生的发作机制和特别是用来阐明肝细胞癌的发作机制，和用于理解、诊断和预防有关多种疾病的组织中癌发生，例如这样的人，其患有慢性肝炎或肝硬化、酒精性肝病、基于代谢疾病如Wilson’s病和血色素沉着病的肝病、基于接触化学物质如黄曲霉毒素的肝病、或自身免疫性肝炎。

附图说明

图1显示用来检测HBV整合位点的特异性PCR和接头连接/抑制PCR的结果。

图1a显示接头连接/抑制PCR方案。

图1b显示通过接头连接/抑制PCR筛选HBV/细胞DNA连接点的结果。

图1c显示用特异性引物经PCR证实HBV-DNA整合入MLL4基因。

图2显示HBV整合位点旁侧的序列。

图3显示4个整合HBV的基因组分析结果。

图4显示HBx-MLL4融合转录产物的RT-PCR分析结果。

图5显示在来自肝细胞癌患者的样品中HBx融合蛋白的免疫检测结果。

图6显示在MLL4内含子3的基因座处的相互易位。

具体实施方式

以下对本发明进行详细说明。

基于以下发现的事实已经实现本发明：表现慢性肝炎或肝硬化史的肝细胞癌病例中癌性组织的指征与HBV-DNA整合入MLL4基因的特定区域、尤其是与HBV的X基因区域整合入MLL4基因相关联；表现慢性肝炎或肝硬化史的肝细胞癌病例中癌性组织的指征与染色体17和位于染色体19上的MLL4基因间的易位相关；并且，基于这些事实，例如，发生肝细胞癌的风险可以通过检测MLL4基因中特定位置处的DNA整合或基因易位而确定(预示性诊断)。

在本说明书中使用的氨基酸、肽、碱基序列、核酸等的缩写遵守IUPAC-IUB规则(IUPAC-IUB Communication on Biological Nomenclature，Eur.J.Biochem.，138：9(1984))，“Guidelines for Preparing Descriptions Containing Base Sequences ofAmino Acid Sequences”(edited by the Japan Patent Office)和相关领域惯用的符号。

(I)检测HBV-DNA整合入MLL4基因的方法

根据本发明的第一种检测方法是，检测从人对象分离和怀疑是癌性的肝组织中HBV-DNA整合入MLL4基因的方法，这种整合预示组织的癌性。

目标人群

根据本发明的第一检验方法的目标人群没有特别限制，此第一检验方法可以应用于正常的健康个体和患有疾病如肝病的人。在前述中间，非常适合将这样的人作为第一检验方法的目标，他们患有慢性肝炎、肝硬化、酒精性肝病、基于代谢疾病如Wilson’s病和血色素沉着病的肝病、基于接触化学物质如黄曲霉毒素的肝病，或自身免疫性肝炎，这些疾病容易发展成肝细胞癌。根据本发明的检验方法也能用于确认患有肝癌的人中由HBV感染引起的肝癌。

MLL4基因

在此说明书中给出的人MLL4基因的基因组序列与人类基因组中心(HumanGenome Center)由J.E.Lamerdin等人报告的GenBank登记号AD000671的具有总碱基长度46,251bp的基因的基因组序列一致。SEQ ID NO.1显示具有总碱基长度46,251bp的人MLL4基因(AD000671)外显子3至外显子4的碱基序列，其给出为从碱基15295至碱基17983的区域。

从MLL4的基因组序列推断出的基因包含37个外显子(FitzGerald，K.T.，andDiaz，M.O.，Genomics，59，187-192(1999))，内含子存在其间。此外，从MLL4的基因组序列推断出的基因遗传作图定位于染色体19长臂的13.1(19q13.1)，已经报道其在实体瘤中经常重排和扩增，并且其是与MLL基因非常相似的人TRX/MLL基因家族的人类成员，其自身与许多染色体易位和白血病有关。

含MLL4内含子3/外显子4区域的序列被显示在图2b、3c、4b和6中，染色体19上MLL4基因的DNA序列和染色体17之间的相互易位作为插入DNA序列显示在图6中。

HBV-DNA

在此说明书给出的人乙型肝炎病毒(HBV)的基因组序列与Jichi Medical School的Okamoto等人报告的GenBank登记号AB033550的碱基序列一致，其总碱基长度为3,215bp。

此外，在本发明中，X基因区域，其被证实是整合入MLL4基因的HBV-DNA区域，其是GenBank登记号AB033550下碱基编号1374-1838指定的碱基长度465bp的区域(SEQ ID NO.2)。这个基因区域编码一种氨基酸序列长155的蛋白质。HBV的环状基因组以线性形式显示在图3a中。

HBV-DNA整合入MLL4基因

对于在本发明实施例中检测到HBV-DNA整合的4个样品(HCC002(1051-1762)，HCC131(1824-1826)，HCC143(2974-1794)，HCC146(未鉴定-1807))，整合入染色体DNA的HBV基因组显示在图3b中。对于已经证实HBV整合的这4个样品，仅在HCC131中全长HBV整合，而在所有4个样品中X基因启动子区和除C末端部分以外的X基因编码区被整合。

因此，HBV-DNA任何部分整合入MLL4基因可以根据本发明的方法检测，但是其中通过检测整合入MLL4基因的HBV X基因的启动子区或编码区，可以甚至更高的概率检验肝组织的癌性，如肝癌。

正如图3c所示，在所有4个样品中HBV-DNA整合入MLL4基因的位置在内含子3内。更具体地，从MLL4基因的5’端计数，在样品HCC146中HBV-DNA整合在第17515位，在HCC002中整合在第17543位，在HCC131中整合在第17753位和在HCC143中整合在第17818位。

因此，根据本发明的方法，通过检测HBV-DNA整合入MLL4基因内含子3，可以高概率检查肝细胞癌。在此范围内，通过检测HBV-DNA整合入MLL4基因从5’端起17515-17818处的区域可以甚至更高概率检查肝组织的癌性，如肝癌。

DNA制备

对于从人对象中提取DNA，从作为检验对象的人中已经分离并怀疑是癌性的肝组织制备DNA。

对于本发明的目的，“基因”不但表示双链DNA，也表示个体的单链DNA，被称为有义链和反义链，包括双链DNA；对于长度没有任何限制。因此，在缺少其它具体说明时，对于本发明目的的基因(DNA)包括包含人基因组DNA的双链DNA，包括cDNA的单链DNA(有义链)，具有与有义链互补序列的单链DNA(反义链)，和前述的片段。本发明所称的基因(DNA)包括调节区、编码区、外显子和内含子。RNA和DNA是多核苷酸的实例。DNA包括cDNA、基因组DNA和合成DNA，而具有特定氨基酸序列的多肽包括其片段、衍生物、同源物和变体。

根据本发明检验方法使用的基因，基于本发明公开的基因的具体实例中的序列信息，可以通过一般性基因工程方法容易地生产或获得(参见，例如，MolecularCloning，2nd Ed.，Cold Spring Harbor Lab.Press(1989)；“Genetic Research MethodsI，II，III”，Experimental Protocols in Biochemistry Series，edited by The JapaneseBiochemical Society(1986))。

从表达该基因的合适来源获得的基因是一个具体实例，在本发明中合适的来源包括患有以下疾病的个体：慢性肝炎、肝硬化、酒精性肝病、基于代谢疾病如Wilson’s病和血色素沉着病的肝病、基于接触化学物质如黄曲霉毒素的肝病、或自身免疫性肝炎，这些疾病容易发展成肝细胞癌。优选从患有慢性肝炎患者、肝硬化患者或肝细胞癌患者的个体的人组织制备分离的DNA。

从上述来源材料的样品，优选是源自人患者的基因组DNA或DNA。可以经任何常用的方法从这些来源材料分离RNA、分离和纯化mRNA、获得cDNA及其克隆等。

从分离的DNA或基因表达产物筛选基因的方法也没有特殊的限制，例如，可以通过用对该基因特异性的合适探针或抗体选择期望克隆来回收目标基因(例如，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，78，6613(1981)；Science，222，778(1983))。

在这方面的具体实例是免疫筛选法，其使用对cDNA产生的蛋白质有特异性的抗体来选择相应的cDNA克隆；使用选择性结合靶DNA序列的探针的噬斑杂交法；菌落杂交；和前述方法的组合。

除了前述方法，可以通过接头-连接/抑制PCR从来源材料中提取HBV-DNA已经整合入MLL4的DNA。也就是，从来源材料提取基因组DNA后，用产生钝末端的限制性内切酶消化基因组DNA；然后将接头序列连接至基因组DNA片段；随后加入HBV序列特异性引物和接头特异性引物并可以在初次(primary)PCR反应中扩增靶基因组DNA片段(Siebert，P.D.，et al.，Nucleic Acids Res.，23，1087-1088(1995))。可以使用Clontech Laboratories，Inc.的Genomewalker试剂盒获得基因组DNA。

可以通过基因扩增方法扩增所提取的基因。这种扩增可以使根据本发明的检测方法进行检测更容易和更准确。

基因扩增方法的一种非常合适的实例是经PCR扩增DNA/RNA(Science，230，1350(1985))。尤其是在难以从组织或从文库获得全长cDNA的情况下，使用RACE(rapid amplication of cDNA ends，Experimental Medicine，12(6)，35(1994))尤其是5’-RACE(M.A.Frohman，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，8，8998(1988))是非常合适的。

例如由PCR扩增的基因片段的分离和纯化可以按通常的方法实施，例如，凝胶电泳或柱方法。例如，可以通过质谱法确认扩增产物。由这些方法扩增的基因，根据所扩增材料的性质，用于根据本发明检测HBV-DNA是否整合入MLL4基因、或测定整合的融合产物的DNA序列、或分析其mRNA。

经PCR检测整合

使用特异性检测包含整合入MLL4基因内含子3的HBV X基因的特异性序列的引物组进行PCR是，能检测HBV X基因整合入MLL4基因内含子3的方法的一个实例。

基于MLL4基因或HBV-DNA基因的数据化学合成的DNA一般可用作筛选引物，但是已经获得的融合或键合的基因或其片段也能够有利地用作筛选引物。此外，基于基因序列数据设计的基因特异性正向和反向引物可以用作筛选引物。

用这种引物组进行PCR的典型实例是，使用特异性针对含MLL4基因内含子3区域的引物和特异性针对HBV X基因的引物进行PCR。

当不能获得可检测水平的扩增产物时，可以使用前述PCR扩增产物作为模板，对含MLL4基因内含子3区域特异性的引物和对HBV X基因特异性的引物，进行二次PCR，这可以提高检测的灵敏度。

特别地，包括以下步骤的方法是用于从人对象分离和怀疑是癌性的组织中检测HBV-DNA整合入MLL4基因的一个典型方法实例，这种整合预示组织的癌性：

(1)从肝组织中提取DNA；

(3)任选地再进行一次PCR，其中以(2)中扩增的DNA作为模板，使用对含MLL4基因内含子3区域特异性的第二引物和对HBV X基因区域特异性的第二引物。

可以基于MLL4基因和HBV-DNA的碱基序列根据通常的方法适当地设计对这些区域特异性的引物(正向和反向)序列。引物长度没有特殊的限制，但是通常至少10个核苷酸和优选约10到约50个核苷酸，更优选约10到约35个核苷酸，甚至更优选约15到约35个核苷酸。

在特定术语中，MLL4的引物可以是能识别MLL4内含子3的约10到约35个核苷酸和优选约15到约30个核苷酸的部分序列的引物，并因此能够启动DNA合成。对于HBV-DNA，引物可以是能识别插入到MLL4内含子3区域的HBV X基因序列的约10到约35个核苷酸和优选约15到约30个核苷酸的部分序列的引物，并因此能够启动DNA合成。

这些引物能够根据通常的方法合成。例如，它们能够根据化学合成方法如氨基磷酸酯法或磷酸三酯法合成，另外它们能够用商品自动寡核苷酸合成仪合成，如Pharmacia公司的LKB Gene Assembler Plus。双链片段也可以从化学合成的单链产物获得，通过合成互补链并使两条链在合适条件下退火或通过用DNA聚合酶和合适的引物序列加入互补链的方法。

引物对的具体实例如下。例如，以下组合可用于分别检测HBV X基因整合入含MLL4基因内含子3的区域的前和后连接点(junction)。

为了检测HBV X基因整合入含MLL4基因内含子3的区域的一个连接点，初次PCR反应的正向引物实例可以是SEQ ID NO.8显示的671F1，反向引物实例可以是SEQ ID NO.14显示的MD26；然而二次PCR反应的正向引物实例可以是SEQ IDNO.9显示的671F2，反向引物实例可以是SEQ ID NO.14显示的MD26。这种二次反应在任选基础上进行。

为了检测HBV X基因整合入含MLL4基因内含子3的区域的的其它连接点，初次PCR反应的正向引物实例可以是SEQ ID NO.4显示的MD26c，而反向引物实例可以是SEQ ID NO.12显示的671R3。SEQ ID NO.10显示的671R1或SEQ ID NO.11显示的671R2也可以代替SEQ ID NO.12显示的671R3用作反向引物。

例如，以下组合可分别用于检测HBV X基因反向整合入含MLL4基因内含子3的区域的前和后连接点。

为了检测HBV X基因反向整合入含MLL4基因内含子3的区域的前和后连接点，初次PCR反应的正向引物实例可以是SEQ ID NO.8显示的671F1，反向引物实例可以是SEQ ID NO.4显示的MD26c。此外，二次PCR反应的正向引物实例可以是SEQ ID NO.9显示的671F2，反向引物实例可以是SEQ ID NO.4显示的MD26c。这种二次反应在任选基础上进行。

为了检测HBV X基因反向整合入含MLL4基因内含子3的区域的其它连接点，初次PCR反应的正向引物实例可以是SEQ ID NO.14显示的MD26，而反向引物实例可以是SEQ ID NO.12显示的671R3。SEQ ID NO.10显示的671R1或SEQ ID NO.11显示的671R2也可以代替671R3用作反向引物。

在HBV X基因整合入含MLL4基因内含子3的区域情况下，为了检测连接点，优选的引物对组合实例例如可以是SEQ ID NO.4显示的MD26c作为正向引物和SEQ ID NO.12显示的671R3作为反向引物的组合。在HBV X基因反向整合入含MLL4基因内含子3的区域情况下，为了检测连接点，一个优选实例是SEQ ID NO.8显示的671F1作为正向引物和SEQ ID NO.4显示的MD26c作为反向引物。

PCR扩增产物的检测和鉴定

例如，可以通过琼脂糖凝胶电泳检测根据前述PCR扩增的DNA，由此使得可以检测HBV X基因整合入MLL4基因内含子3。

此外，也可以通过从琼脂糖凝胶切下的带中提取该扩增产物并测定它的碱基序列来确认HBV-DNA整合入MLL4基因。

DNA碱基序列测定可以根据通常的方法实施，例如，双脱氧法(Proc.Natl.Acad.Sci.，USA.，74，5463(1977))或Maxam-Gilbert法(Methods in Enzymology，65，499(1980))。例如，碱基序列也能够使用商品测序试剂盒方便地测定。

融合转录产物的检测

也可以通过检测MLL4基因/HBV X基因融合转录产物来检测HBV-DNA整合入MLL4基因。可以检测以全部或部分MLL4与全部或部分HBV X基因的融合转录产物形式存在的MLL4基因/HBV X基因融合转录产物。

可以根据通常的方法进行这种检测，例如，通过使用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR，E.S.Kawasaki，et a1.，Amplification of RNA.In： PCR Protocol，a Guide to Methods and Applications.Academic Press，Inc.，San Diego，21-27(1991))、Northern印迹分析( Molecular Cloning，Cold Spring Harbor Lab.(1989))、原位RT-PCR(Nucl.Acids Res.，21，3159-3166(1993))、原位杂交、Southern印迹(Sambrook，J.，et al.，Molecular Cloning，a Laboratory Manual.Cold Spring Harbor Laboratory Press：New York.(1989))、荧光原位杂交(FISH，Takahashi E.，et al.，Hum.Genet.，86，1416(1990))、比较基因组杂交(CGH，Kallioneimi，A.，et al.，Science，258，818-821(1992))、核型谱分析(SKY，Rowley，J.D.，et al.，Blood，93，2038-2042(1999))和使用酵母人工克隆(YAC)载体作为探针的方法(Lengauer，C.，et al.，Cancer Res.，52，2509-2596(1992))；NASBA方法(nuclei acid sequence-based amplification，Nature，350，91-92(1991))；和其它许多方法在细胞水平测量。经RT-PCR检测是非常合适的方法。

经RT-PCR检测MLL4基因/HBV X基因融合转录物可以使用这种引物组，其中包括对含MLL4基因的区域特异性的引物和对HBV X基因特异性的引物。

RT-PCR引物的长度与前述PCR中的相同。对含MLL4基因的区域特异性的引物和对HBV X基因特异性的引物也与前述PCR中的相同。

RT-PCR的优选引物组的具体实例是，包括作为正向引物的SEQ ID NO.4显示的MD26c和作为反向引物的SEQ ID NO.15显示的E5-1的引物组，和包括作为正向引物的SEQ ID NO.13显示的MD24和作为反向引物的SEQ ID NO.16显示的E5-2或SEQ ID NO.17显示的E6-2的引物组。

可以用琼脂糖凝胶电泳检测由RT-PCR产生的扩增产物，由此使得可以确定HBV X基因整合入MLL4基因。MLL4基因/HBV X基因融合转录产物的产生也能够通过测定该融合产物的碱基序列而确认。

作为预示组织癌性的一个实例，在DNA水平或转录产物水平确认HBV-DNA整合入MLL4，产生一个表明肝癌存在的阳性结果。

融合蛋白质的检测

也可以通过检测MLL4/HBV融合蛋白和优选MLL4/HBV X区融合蛋白来检测HBV整合入MLL4基因。MLL4/HBV X区融合蛋白可以是全部或部分MLL4和全部或部分HBV X区域之间的融合蛋白。

可以应用使用与MLL4/HBV X区融合蛋白特异性结合的抗体的免疫测试方法进行这种检测。该抗体也包括抗体片段。

生产抗体的方法对本领域的技术人员是众所周知的，本发明也能使用这些众所周知的方法(参见，例如，“Methods in Immunobiochemical Research”，ExperimentalProtocols in Biochemistry Serials，edited by The Japanses Biochemical Society(1986))。

能够没有限制的使用所属研究领域中已知的方法作为所考虑的免疫测试方法，例如可以是Western印迹、免疫组织分析和ELISA分析。

在经ELISA检测融合蛋白的方法的一个具体实例中，裂解推测含MLL4/HBV融合蛋白的靶细胞并提取总蛋白质；随后和抗融合蛋白或HBV X蛋白的单克隆抗体一起孵育；此后用免疫沉淀法进行免疫沉淀；然后与过氧化物酶标记的马抗小鼠IgG抗体一起孵育。依此进程，可以显示出因抗体结合产生的信号。这种抗原结合信号能够通过使用ECL Western印迹检测系统(Amersham Biosciences)在电泳凝胶上检测。

作为经Western印迹检测MLL4/HBV融合蛋白的一个实例，在本发明实施例中检测各种大小(kDa)的MLL4/HBV融合蛋白显示在图5中。

作为预示组织癌性的实例，用所考虑方法检测融合蛋白并由此检测到HBV整合，产生一个表明肝癌存在的阳性结果。

(II)检测MLL4基因处易位的方法

本发明第二检测方法是检测关于从人对象分离并怀疑是癌性的肝组织中MLL4基因的t(17；19)(p11.2；q13.1)染色体易位的方法，这种易位预示组织的癌性。

适合作为此第二检测方法的目标人群和从人样品中制备DNA的方法与第一方法中相同。

染色体17

染色体17上染色体位置17q11.2处的基因组序列根据Whitehead Institute的B.Birren等人报告的GenBank登记号AC087294的总碱基长度177,017bp的克隆的基因组序列。包含染色体17碱基24481-25200区域的碱基序列被显示在SEQ ID NO.3中。

经PCR检测易位

检测MLL4基因的t(17；19)(p11.2；q13.1)染色体易位方法的一个特别合适的实例包括使用对含染色体17的p11.2区域特异性的引物和对含MLL4基因的区域特异性的引物进行PCR，其中MLL4基因存在于染色体19长臂的q13.1处，随后检测扩增产物。对含MLL4基因的区域特异性的引物优选是对含MLL4基因内含子3的区域特异性的引物。

由于易位检测的低灵敏度，可以期望将初次PCR产物进行二次PCR，其中使用一组引物，其包括对含染色体17的p11.2的区域特异性的引物和对含存在于染色体19长臂上MLL4基因内含子3的区域特异性的引物。用于二次PCR的引物一般可以设计成使得可以扩增初次PCR所扩增区域内的区域。

合适的引物实例是设计成与对MLL4基因区域具有特异性的DNA相应的核苷酸区段，该区域位于染色体17和染色体19上MLL4基因之间的边界区附近，具有至少10个和优选约15到约30个连续碱基。另外引物的合适实例是设计成与对染色体17区域具有特异性DNA相应的核苷酸区段，该区域位于染色体17和染色体19上MLL4基因之间的边界区附近，具有至少10个和优选约15到约30个连续碱基。

正如本发明的第一检测方法，这里的“特异性”表示识别指定区域从而启动DNA合成的能力。

更具体的是，为了检测从染色体19向染色体17的易位，用于初次PCR的正向引物的实例可以是SEQ ID NO.8表示的引物671F1，其是MLL4基因特异性引物，而反向引物的实例可以是SEQ ID NO.20表示的引物17-1，其是17q特异性引物。为了检测从染色体17向染色体19的易位，用于二次PCR反应的正向引物的实例可以是SEQ ID NO.9表示的引物671F2，其是MLL4基因特异性引物，而反向引物的实例可以是SEQ ID NO.21表示的引物17-2，其是17q特异性引物。

此外，用于初次PCR反应的正向引物的实例可以是SEQ ID NO.10表示的引物671R1，其是MLL4基因特异性引物，而反向引物的实例可以是SEQ ID NO.18表示的引物17R1，其是17q特异性引物。为了检测从染色体17向染色体19的易位，用于二次PCR反应的正向引物的实例可以是据SEQ ID NO.11表示的引物671R2，其是MLL4基因特异性引物，而反向引物的实例可以是SEQ ID NO.19表示的引物17R2，其是17q特异性引物。

作为预示组织癌性的实例，根据本发明方法检测到上述的易位，产生表示肝癌存在的阳性结果。

如前述的根据本发明的检测方法能检测染色体17和位于染色体19上的MLL4基因之间的易位，并且通过对从人对象分离并怀疑是癌性的肝组织中组织癌发生(例如肝细胞癌)的理解，其中所述人对象患有例如，慢性肝炎或肝硬化，从而可以提供可用于阐明肝细胞癌发生机制以及理解、诊断和预防组织中癌发生的信息和方法。

(III)检测试剂盒

根据本发明的第一种检测试剂盒是用于检测HBV-DNA尤其是HBV的X基因整合入MLL4基因尤其是其内含子3的试剂盒。

为了在DNA水平检测这种整合，可特别提供包括对含MLL4基因内含子3的区域特异性的引物和对HBV X基因特异性的引物的试剂盒。这些引物如前所述。

存在于该试剂盒中的引物组的优选实例是这种引物组，其包含能识别由SEQ IDNO.10、11或12显示的全部或部分碱基序列并由此能够启动DNA合成的DNA片段，和能识别由SEQ ID NO.4显示的全部或部分碱基序列并由此能够启动DNA合成的DNA片段。另一优选实例是这种引物组，其包含能识别由SEQ ID NO.14显示的全部或部分碱基序列并由此能够启动DNA合成的DNA片段，和能识别由SEQ ID NO.8或9显示的全部或部分碱基序列并由此能够启动DNA合成的DNA片段。

检测试剂盒可含有PCR所需的其它组分。这些其它组分的实例为标记剂、TaqDNA聚合酶、脱氧核苷三磷酸和用于DNA扩增的第二引物。标记剂例如可以是化学修饰剂如放射性同位素或荧光(fluor)，并可以预先自身与DNA片段偶联。根据本发明的检测试剂盒也可以含有，例如，反应稀释溶液、参考抗体、缓冲液、清洗剂以及有助于测量的反应终止溶液。

也可以使用检测MLL4基因/HBV X基因融合转录产物的试剂盒来检测HBV-DNA整合入MLL4基因。在一个典型实例中，经RT-PCR检测融合转录产物的试剂盒例如可以是包括上述用于在DNA水平检测整合的引物或探针组的试剂盒。

适用于该RT-PCR的引物组例如可以是包括能识别由SEQ ID NO.4显示的碱基序列或其互补碱基序列并由此能启动DNA合成的引物，和能识别由SEQ ID NO.15显示的碱基序列或其互补碱基序列并由此能启动DNA合成的引物。

如上所述，也可以通过检测MLL4/HBV X区融合蛋白来检测HBV-DNA整合入MLL4基因。在此情况下的检测试剂盒可以包括特异性识别MLL4/HBV X区融合蛋白或HBV X区的抗体或抗体片段。这种抗体与前述的相同。此试剂盒也可以含有与所用方法相应的基本组分，这些方法例如，Western印迹、免疫组织学测试或ELISA。

根据本发明的第二种检测试剂盒是用于检测MLL4基因的t(17；19)(p11.2；q13.1)染色体易位的试剂盒。例如，该试剂盒提供有对MLL4基因内含子3的区域特异性的引物和对含染色体17的p11.2的区域特异性的引物。这些引物与前述相同。

合适的引物组的实例是用于初次PCR反应的这种引物组，其包括能识别SEQ IDNO.8显示的全部或部分碱基序列或其互补碱基序列并由此能启动DNA合成的引物，和能识别SEQ ID NO.20显示的全部或部分碱基序列或其互补碱基序列并由此能启动DNA合成的引物。此外，期望该试剂盒也含有用于二次PCR反应的引物组，其中用于二次PCR反应的引物组的实例可以是用于检测从染色体17向染色体19易位的引物组，包括能识别由SEQ ID NO.9显示的全部或部分碱基序列或其互补碱基序列并由此能启动DNA合成的引物，和能识别由SEQ ID NO.21显示的全部或部分碱基序列或其互补碱基序列并由此能启动DNA合成的引物。该试剂盒也可包含PCR所需的其它组分和/或有助于测量的试剂。

实施例

通过以下提供的实施例更加详细的描述本发明，但本发明并不局限于这些实施例。

实施例1

(a)组织学和血清学检查肝细胞样品

以下试验用从1987-2003年期间在千叶大学医院第二外科住院的26名日本患者体内切除的肝肿瘤组织(肝细胞癌或HCC)进行。这些患者没有接受术前治疗。

对提供样品的患者进行临床、组织学及血清学检查。在组织学检查中，对肿瘤大小，肿瘤细胞的分化程度(三期)和肝病类型(CPH：慢性持久性肝炎；CAH：慢性肝炎急性发作；LC：肝硬化)进行调查。在血清学检查中，使用Dinabot Co.Ltd.的酶免疫测定(EIA)试剂盒进行乙型肝炎表面抗原(HBsAg)检测，并使用放射免疫测定(RIA)试剂盒进行抗乙型肝炎表面抗原的抗体(抗HBs抗体)和抗乙型肝炎核心抗原的抗体(抗HBc抗体)检测，RIA试剂盒也来自Dinabot Co.Ltd.。也使用HCV重组抗原c25、c33c和NS5作为靶抗原和来自Ortho Diagnostic Systems的重组免疫印迹测试来检测抗丙型肝炎的抗体(抗HCV抗体)。

结果显示在下面的表1中。在表1中，HbsAg表示乙型肝炎表面抗原；抗-HBs表示抗乙型肝炎表面抗原的抗体；抗-HBc表示抗乙型肝炎核心抗原的抗体；抗-HCV表示抗丙型肝炎的抗体(c25、c33c和NS5)；“中度”表示中度分化的HCC；“差”表示低分化的HCC；“好”表示充分分化的HCC；CPH表示慢性持久性肝炎；CAH表示慢性肝炎急性发作；LC表示肝硬化。通过使用HBx特异性引物MD24和MD26经单次PCR对HBV-DNA进行检测。

在试验中使用这些样品符合赫尔辛基宣言(1975)的伦理学规则，并且也经过千叶大学医学院伦理委员会的批准。

表1

病例号	年龄	性别	血清学研究				HBV-DNA检测1)	肿瘤大小(cm)	组织学观察	周围肝组织学
			血清学研究								HBsAg	抗-HBs	抗-HBc	抗-HCV
			HCC131HCC146HCC002HCC003HCC9907HCC155H20H54H120HCC143H49H62H70H72H78H89H76H57H71H85H86H87HCC128HCC147HCC127HCC001	4845585650526629416366625362666171666055656273685768	MMMMMMFFMMMMMMMFMMMMMMMMMM	++++++++++----------------					HBsAg	抗-HBs	抗-HBc	抗-HCV	----------+++++++---------	++++++++++++++++++++++++++	---------+++++++-+++++++--	阳性阳性阳性阳性阳性阳性阳性阳性阳性阳性阳性阳性阳性阳性阳性阳性阳性阳性阳性阳性阳性阳性阴性阴性阳性阴性	133105.52.34.7142.24,23.42.562.5243.5111.82.261242.557	中差，中中中中中中差中中中中中差好中中差差中中好中中中中	CHLCCHLCLCLCCPHCPHLCCPHCAHLCLCCAHpreLCLCCPHCAHLCLCCAHCPHLCCPHCPHCH

通过接头连接/抑制PCR扩增HBV整合位点

<PCR>

根据先前报导的方法(Urashima，T.，et al.，J.Hepatol.，26，771-778(1997))，从样品中提取DNA。以下试验首先对取自血清学检查呈HBsAg阳性的患者的10个样品中进行。通过接头连接/抑制PCR扩增这些样品的DNA中HBV整合入人类基因组位点(HBV/细胞DNA连接点)旁侧的序列(Siebert，P.D.，et al.，Nuclcic Acids Res.，23，1087-1088(1995))，其中使用Clontech Laboratories，Inc的Genomewalker试剂盒。

参考图1a，接头连接/抑制PCR方案描述于下。用Dral、PvuII、EcoRV或ScaI限制性内切酶(Life Technologies，Inc.)消化2.5μg基因组DNA，并将接头序列连接到由此产生的DNA片段两端的钝端(连接反应)。准备50μL反应溶液，该溶液含有按此方法处理的基因组片段、0.2mM dNTPs、10pmol具有SEQ ID NO.4的HBV引物(MD26c)、1X缓冲液(天然Taq缓冲液，Invitrogen)、4％甘油、1单位Taq酶(天然Taq酶，Invitrogen)和0.04单位Vent DNA聚合酶(New England Biolabs)，并在PCR反应前将该溶液在80℃加热3分钟。然后向所得溶液中加入2.5mM MgCl₂和10pmol具有SEQ ID NO.6的接头特异性引物(AP-1)，随后在94℃反应1分钟。

然后开始PCR反应，但是为了提高特异性，使用先前报导的递减PCR(Chami，M.，et al.，Oncogene，2000；19：2877-2866)。

进行最初的20个循环的反应，其中第一个循环为94℃持续30秒、65℃持续30秒、和70℃持续3分钟，并且退火温度为每2个循环下降1℃。然后反应条件保持恒定在第20个循环(94℃持续30秒，55℃持续30秒，70℃持续3分钟)，并再进行另外20个循环反应。最后一个循环之后继续在70℃反应7分钟，产生初次PCR扩增产物。

用QIAGEN Co.，Ltd.的QIAquick PCR纯化试剂盒纯化扩增产物，并用其1/50作为模板，使用同样的操作进行二次PCR(巢式PCR)，但是将10pmol HBV引物变成由SEQ ID NO.5显示的MX2和将接头特异性引物变成由SEQ ID NO.7显示的AP-2。

由前述操作获得的最终扩增产物进行1.2％琼脂糖凝胶电泳。结果显示于图1b和1c中。

每张图显示了二次PCR扩增后接头连接/抑制PCR的典型琼脂糖凝胶图。图1b中泳道1-5的PCR产物是从PvuII消化的接头连接DNA文库中获得。泳道1-6分别表示HCC9907、HCC002、HCC003、HCC143、HCC146和阴性PCR对照(无DNA)。泳道M含有1kb DNA大小的标志物(Life Technologies，Inc.)。

使用HBV-DNA整合入MLL4基因的特异性引物的PCR构象显示于图1c中。该图显示了使用HBx特异性引物(MD26c：SEQ ID NO.4)和MLL4特异性引物(19R1：SEQID NO.10(671R1)的常规PCR的典型琼脂糖凝胶电泳结果。

泳道1-5分别表示HCC131、HCC143、HCC146、HCC002和阴性PCR对照(无DNA)。泳道M含有1kb DNA大小的标志物(Life Technologies，Inc.)。

<测定扩增DNA的碱基序列>

切除每一分离带并研究其碱基序列。

使用通常广泛使用的来自Applied Biosystems的BigDye Terminator CycleSequencing试剂盒进行测序反应，并用ABI PRIZM 3700 DNA分析仪分析。结果显示于表2中。

表2

病例号	染色体	基因组序列登记号	基因	t(17；19)(p11.2；q13.1)
病例号	染色体	基因组序列登记号	基因	t(17；19)(p11.2；q13.1)	HCC131	19q13.1	AD000671	MLL4	阳性
HCC146	19q13.17p14-15	AD000671AC005090	MLL4	阳性	HCC131	19q13.1	AD000671	MLL4	阳性
HCC146	19q13.17p14-15	AD000671AC005090	MLL4	阳性	HCC002	19q13.1	AD000671	MLL4	阳性
HCC003	5p13	AY007685	hTERT	阳性	HCC002	19q13.1	AD000671	MLL4	阳性
HCC003	5p13	AY007685	hTERT	阳性	HCC9907	9q13-21.3	AL133578		阴性
HCC155				阳性	HCC9907	9q13-21.3	AL133578		阴性
HCC155				阳性	H20				阳性
H54	18p11.3	AP000845	NMPp84^a)	阳性	H20				阳性
H54	18p11.3	AP000845	NMPp84^a)	阳性	H120
HCC143	19q13.1	AD000671	MLL4	阳性	H120
HCC143	19q13.1	AD000671	MLL4	阳性	H49				阳性
H62				阴性	H49				阳性
H62				阴性	H70				阳性
H72				阳性	H70				阳性
H72				阳性	H78				阳性
H89				阳性	H78				阳性
H89				阳性	H76				阳性
H57				阴性	H76				阳性
H57				阴性	H71				阳性
H85				阳性	H71				阳性
H85				阳性	H86				阴性
H87				阳性	H86				阴性
H87				阳性	HCC128				阳性
HCC147				阳性	HCC128				阳性
HCC147				阳性	HCC127				阳性
HCC001				阳性	HCC127				阳性

a)H87该整合已经用HBV-Alu PCR报道于Oncogene，

20，62HCC12833-6240(2001)

b)″阳性″：t(17；HCC14719)(p11.2；q13.1)阳性

″阴性″：t(17；19)(p11.2； HCC127q13.1)阴性

正如表2显示，在10个样品的7个样品中(HCC131、HCC143、HCC146、HCC002、HCC003、HCC9907、H54)，总共检测到8个HBV/细胞DNA连接点。在这8个连接点中，4个(HCC131、HCC143、HCC146、HCC002)存在于19q13.1上混合谱系白血病4(MLL4)的内含子3中。其余的分别存在于5q13上的hTERT(人端粒酶逆转录酶)的启动子区，9q13-21.3上的编码假想蛋白的区域和7p14-15上的表达序列标签(EST)区域。两个小组已经报导了HBV整合入hTERT区域(Ferber；M.J.，et al.，Oncogene，22，3813-3820(2003)；Paterlini-Brechot，P.，et al.，Oncogene，22，3911-3916(2003))，而且这些报告得到本文报告结果的支持

(c)使用MLL4基因特异性引物经PCR扩增HBV整合位点

基于上述结果，使用HBV特异性引物MD26c(SEQ ID NO.4)与MLL4特异性引物671R1(SEQ ID NO.10)、671R2(SEQ ID NO.11)或671R3(SEQ ID NO.12)的组合，通过对已经观察到HBV/MLL4连接点的4种基因组DNA进行常规PCR，证实了HBV-DNA整合入MLL4基因。通过使用SEQ ID NO.14显示的与MD26c互补的HBV特异性引物MD26、和MLL4特异性引物671F1(SEQ ID NO.8)或671F2(SEQ ID NO.9)的组合经PCR证实另外的MLL4/HBV连接点。

试验操作的细节描述如下。准备50μL反应溶液，该溶液含有100ng基因组DNA、0.2mM dNTPs、10pmol各种引物、1X GCI缓冲液(Takara)、和1单位LATaq DNA聚合酶(Takara)。分析MLL4/HBV连接点的反应使用引物671F1和MD26，并由35个反应循环组成，每个反应循环为94℃加热1分钟、然后98℃持续10秒、68℃持续1-4分钟。最后进行延伸反应72℃持续10分钟。上述步骤构成了初次PCR。

然后按以前相同的条件进行二次PCR，其中使用引物671F2和MD26。分析HBV/MLL4连接点的反应使用引物MD26c和671R3，并由30个反应循环组成，每个反应循环为94℃加热1分钟，然后94℃持续30秒，50℃持续30秒，和72℃持续45秒，随后延伸反应72℃持续5分钟。

结果显示于图2和3中。图2显示按上述PCR扩增的DNA中HBV整合位点的旁侧序列。

表1中HCC131、HCC143、HCC146和HCC002的MLL4基因中HBV/细胞DNA连接点序列显示于图2a中。在序列1)-4)中，斜线左边的序列表示整合的HBV-DNA序列，而右边以黑体显示的序列是MLL4基因序列的旁侧。显示以上序列1)-4)的数字指示HBV/细胞DNA连接点位置的数字指示HBV核苷酸数(GenBank登记号AB033550，HBV基因型C，亚型adr)。

MLL4基因(GenBank登记号AD000671)内含子3的序列和HBV-DNA整合位点的旁侧序列显示于图2b中。

HBV基因组整合入HCC002、HCC131、HCC143和HCC146这4个样品的DNA中的分析结果显示于图3中。HBV基因组(GenBank登记号AB033550)基因结构图显示于图3a中，其中开放阅读框(ORF)和转录方向由粗箭头表示，其上的数字表示开放阅读框(ORF)位置。DR1和DR2是11个碱基对的直接重复。

HBV基因组整合入HCC002、HCC131、HCC143和HCC146这4个样品的DNA中的图显示于图3b中，其中实心点和箭头指示整合的HBV-DNA序列的5’端和3’端。整合入HCC146中的HBV-DNA序列的5’端不能确定。

整合位点处MLL4基因内含子3(对应于GenBank登记号AD000671的核苷酸17316-17869)和HBV-DNA的图显示于图3c，其包括用于此分析的MLL4特异性引物的方向和位置的图。

正如在图2和3中所显示的，在这4个基因组DNA中，已经证明HBV整合入MLL4内含子3中存在的Alu重复序列或其相邻序列中。

一般来说，HBV整合区域经常出现在含11碱基对重复序列的DR1和DR2附近，在本文所研究的4个实例中全部在DR1附近。只在HCC131中证实了全长HBV整合，而在其它3例中观察到部分整合(图3)。如HCC131中表现基因型C的HBV感染在日本更普遍。

另外，通过PCR，在所有HCC样品中都证实了HCV-DNA的存在(表1)，该PCR组合使用SEQ ID NO.13显示的HBx特异性引物MD24和SEQ ID NO.14显示的HBx特异性引物MD26。

实施例2

用RT-PCR检测HBx/MLL4融合转录产物

除C-末端以外的HBx蛋白编码区和HBx(HBV-DNA的X基因)启动子区存在于已证实MLL4/HBV-DNA整合的所有4个病例中。以此为基础，预测在这4个样品中存在HBx/MLL4融合转录产物。从HCC131、HCC143、HCC146和HCC002中提取总RNA并研究经RT-PCR所获得的转录产物。

试验操作的细节描述于下。

根据使用说明书使用Trizol(Invitrogen)提取RNA。提取的RNA通过1.2％琼脂糖凝胶电泳确认。RT-PCR方法如下，根据使用说明书使用Superscript One-StepRT-PCR系统(Invitrogen)；设计在MLL4的外显子5或6上的基因特异性引物(E5-1：SEQ ID NO.15；E5-2：SEQ ID NO.16；E6-1：SEQ ID NO.17)被用作逆转录引物。500ng个体RNA、0.8μM各种引物(具有SEQ ID NO.4的MD26c被用作共同正向引物)、2单位酶混合物(含SuperScript II RT和Platinum Taq DNA聚合酶)和1X缓冲液(含0.2mM dNTPs和1.2mM MgSO4)在冰上混合准备反应溶液。该反应溶液在50℃反应30分钟，并用旋转振荡仪在94℃彻底搅拌2分钟。随后的PCR反应由30个反应循环组成：94℃/15秒，55℃/30秒和70℃/1分钟。PCR产物在1.2％琼脂糖凝胶上进行电泳，切下每条所得带并进行序列分析。

对HBx-MLL4融合转录本的RT-PCR分析结果显示于图4中。

正如在图4a中所显示的，通过使用MD26c/MLL外显子5引物进行PCR，可从每个肝细胞癌组织中获得各种融合转录本。对图4a中单个带中的RT-PCR产物进行碱基序列分析。来自4个肝细胞癌组织(HCC131、HCC002、HCC143和HCC146)的融合转录产物的图显示于图4b中。在图4a中单个带处垂直显示的圆圈内数字与图4b中表示该融合转录产物的垂直显示的圆圈内数字相对应。

作为结果，在所有的肝细胞癌中检测到从MLL4的外显子4向前的读码框正确的融合转录产物和含有早熟终止密码子的读码框外的融合转录产物(图4b)。

在HCC131中检测到两种融合转录产物(一种是阅读框内融合转录产物，其包括内含子3序列和从外显子4向前的序列，和一种包括内含子3和内含子4的融合转录产物，其在外显子6内具有早熟终止密码子)，并在HCC002中检测到三种融合转录产物(一种是阅读框内融合转录产物，其中内含子3被剪接掉；一种其中内含子3相似被剪接掉的融合转录产物，但它是阅读框外的并在外显子4内具有早熟终止密码子；以及一种融合转录产物，其包括内含子3并且其在内含子3内具有早熟终止密码子)。在HCC146中检测到具有类似于HCC002模式的三种融合转录产物。在HCC143中总共检测到4种阅读框外融合转录产物，其中2种终止密码子存在于内含子3中，另2种终止密码子存在于外显子4中。在HCC143中也检测到一种包括内含子3的阅读框内融合转录产物；剪接发生在该融合产物的CC-GT位点，而不符合GT-AG规则。

实施例3

经免疫印迹分析检测HBx/MLL4融合蛋白质

为了证实这些融合转录产物真实翻译成蛋白质，通过免疫试验操作用HCC131、HCC143和HCC002的肝肿瘤细胞及其邻近细胞进行比较。

试验操作细节如下。制备总蛋白质：将100-200mg细胞用缓冲液裂解，该缓冲液含有0.1％SDS、0.5％脱氧胆酸、1％NP-40、150mM NaCl、50mM Tris-HCl(pH8.0)、1mM APMSF和其它蛋白酶抑制剂(完全蛋白酶抑制剂片，Roche)，随之在4℃以12,500rpm离心30分钟。任选地，500μg所获总蛋白与抗HBx(乙型肝炎病毒X蛋白)单克隆抗体(Advanced Immuno Chemical，Inc.)一起孵育，并按标准方法进行免疫沉淀。

按前述操作制备的总蛋白质和免疫沉淀产物，对其进行SDS-PAGE电泳，并将其转移到PVDF膜上(Hybond-P，Amersham Biosciences)。该膜在室温与含3％脱脂乳的TBS-T(Tris盐缓冲液和0.1％吐温20)预孵育1小时，以阻止非特异性抗体结合，然后在4℃与抗HBx单克隆抗体一起孵育8小时。随后用TBS-T清洗4次，然后与偶联过氧化物酶的马抗小鼠IgG一起孵育。使用ECL Western印迹检测系统(Amersham Biosciences)显示由抗体结合所产生的信号并分析该信号。

结果显示于图5中。对来自HCC002，HCC131和HCC143的肿瘤组织(T)和附近非肿瘤组织(N)使用抗HBx抗体进行Western印迹分析显示于图5a，而图5b显示由于用抗HBx抗体进行免疫检测而形成的免疫沉淀产物。

根据对总蛋白质直接Western印迹的结果，在HCC143和HCC002的肿瘤细胞中，选择性检测出一种17kDa蛋白质。这对应因存在未成熟终止密码子而产生的短HBx/MLL4融合蛋白质(图5a)。尽管在HCC131中并没检测出融合蛋白质，但是在用抗HBx抗体抗免疫沉淀产物的Western印迹中检测到一种160kDa蛋白质，其对应阅读框内HBx/MLL4融合蛋白质(图5b)。

实施例4

通过递减PCR扩增染色体易位区域

对HBs抗原阴性而抗HBc阳性的对象，研究HBV整合入MLL4内含子3(见表1)。用HBV引物MD26c(SEQ ID NO.4)和MLL4特异性引物19R1(SEQ ID NO.10(671R1))进行初次PCR，然后用HBV引物MD26c(SEQ ID NO.4)和MLL4特异性引物19R2(SEQ ID NO.11(671R2))进行第二次PCR，随后根据实施例1的方法进行序列分析。作为结果，在这些肝细胞癌(HCC)样品中，未检测到HBV整合入MLL4内含子3。

然而相反的是，检测到在MLL4和17p11.2区域之间的嵌合序列。因为在用HBV特异性引物和MLL4特异性引物的试验中该易位偶尔表达，所以设计对17p特异性的引物17R1(SEQ ID NO.18)和17R2(SEQ ID NO.19)来代替HBV特异性引物。使用这些引物，通过前述递减PCR对来自肝细胞癌患者的26个样品确认染色体17和19之间的易位。

为了检测染色体17/染色体19边界，引物19R1和17R1被用于初次PCR中，引物19R2和17R2被用于二次PCR中。为了检测染色体19/染色体17边界，使用引物671F1(SEQ ID NO.8)和17-1(SEQ ID NO.20)进行初次PCR，使用引物671F2(SEQ ID NO.9)和17-2(SEQ ID NO.21)进行二次PCR。

结果证实在来自肝细胞癌患者的26个样品中有22个发生了易位(参见表2)。

表示MLL4内含子3的基因座中相互易位的序列图显示于图6中。染色体19q13.1(左，GenBank登记号AD000671)和染色体17p11.2(右，GenBank登记号AC087294)的重排显示于图6中。灰色框内的序列表示Alu重复序列。位于Alu重复序列之中和与之邻近的HBV整合位点以箭头表示，对每一染色体向下指的粗箭头显示由Alu重复序列产生重组后新合成的染色体(从黑到黑，从白到白)。

显示于图6中的序列分析结果，证明易位产物中的一段约240bp并形成染色体边界的区域，含有Alu重复序列并且在所述染色体之间约85％同源。

虽然认为由Alu序列介导的同源重组可能促进易位，然而在HCC003中也检测到了相同的易位，其中HBV被整合入hTERT的启动子区而不是MLL4的内含子3区。因此，也可能是肝癌自身的癌发生引起了基因组的不稳定性。另外，在分析该易位中，在初次PCR阶段经常获得不确定结果，使得期望进行二次PCR。

此外，一段CA重复序列在染色体17上与Alu序列邻近，例如，这对单个鉴定将是有效的。

序列表

<110>大塚制药株式会社

<120>检测由乙型肝炎病毒引起的癌发生的方法

<130>P05-11

<150>JP2004-063046

<151>2004-03-05

<160>21

<170>Patentln version 3.1

<210>1

<211>2689

<212>DNA

<213>人

<400>1

gtcgagcgcc ccgaggtcgg ggtcgcaagc ataagacgac cccccttcct cctcctcgcc 60

tagcagatgt ggctcctacc cccccaaaga cccctgcccg gaaacggggt gaggaaggca 120

cagaacggat ggtgcaggca ctgactgaac ttctccggcg ggcccaggca ccccaagcac 180

cccggagccg ggcatgtgag ccctccaccc cccggcggtc tcggggacgg cccccaggac 240

ggccagcagg cccctgcagg aggaagcagc aagcagtagt ggtggcagaa gcagctgtga 300

caatccccaa acctgagccc ccacctcctg tggttccagt gaaacatcag actggcagct 360

ggaaatgcaa ggaggggccc ggtccaggac ctgggacccc caggcgtgga ggacagtcaa 420

gccgtggagg ccgtggaggc aggggccgcg gccgaggtgg tgggctcccc tttgtgatca 480

agtttgtttc aagggccaaa aaagtaaaga tgggacaatt gtccttggga ctcgaatcag 540

gtcaaggtca aggtcaacat gaggaaagtt ggcaggatgt cccccaaaga agagttggat 600

ctggacaggg agggagccct tgctggaaaa agcaggaaca gaagctggat gacgaggaag 660

aagagaagaa agaagaagaa gaaaaagaca aggagggaga agagaaggaa gaaagagctg 720

tagctgagga gatgatgcca gctgcggaaa aggaagaggc aaagctgcca ccaccgcctc 780

tgactcctcc agccccttca cctcctccac ccctcccacc cccttcgaca tctcctccac 840

ccccactctg ccctccacca ccacccccag tgtccccacc acctctacca tcccctccac 900

cgcctcctgc ccaagaggag caggaggaat cccctcctcc tgtggtccca gctacgtgct 960

ccaggaagag gggccggcct cccctgactc ccagccagcg ggcggagcgg gaagctgctc 1020

gggcagggcc agagggcacc tctcctccca ctccaacccc cagcaccgcc acgggaggcc 1080

ctccggaaga cagtcccacc gtggccccca aaagcaccac cttcctgaag aatatccggc 1140

agtttattat gcctgtggtg agtgcccgct cctcccgtgt catcaagaca ccccggcgat 1200

ttatggatga agaccccccc aaacccccaa aggtggaggt ctcacctgtc ctgcgacctc 1260

ccattaccac ctccccacct gttccccagg agccagcacc agtcccctct ccaccacgtg 1320

ccccaactcc tccatctacc ccagttccac tccctgagaa gagacggtcc atcctaaggg 1380

aacccacatt tcgctggacc tcactgaccc gggagctgcc ccctcctccc ccagcccctc 1440

cacctccccc ggccccctcc ccaccccctg ctcctgccac ctcctcccgg aggcccctac 1500

tccttcgggc ccctcagttt accccaagcg aagcccacct gaagatctac gaatcggtgc 1560

ttactcctcc tcctcttggg gctcctgaag cccctgagcc agagcctcct cctgccgatg 1620

actctccagc tgagcctgag cctcgggcag tgggccgcac caaccacctc agcctgcctc 1680

gattcgcccc tgtggtcacc actcctgtta aggccgaggt gtcccctcac ggggctccag 1740

ctctgagcaa cgggccacag acacaggctc agctactgca gcccctgcag gccttgcaaa 1800

cccagctcct gccccaggca ctaccgccac cacagccaca gctgcagcca ccgccgtcac 1860

cacagcagat gcctcccctg gaaaaagccc ggattgcggg cgtgggttcc ttgccgctgt 1920

ctggggtaga ggagaagatg ttcagcctcc tcaagagagc caaagtgcag ctattcaaga 1980

tcgatcagca gcagcagcag aaggtggcag cttccatgcc ggtgagtgtg gtccctgggc 2040

ccagcggcac acccagccat ccagcctcca ttctttgcaa ccccctaacc ttccgcctcc 2100

ttggacactt tccagcattg cggggaaccc tcagaacctg cctttctgtg atcccccacc 2160

ttcctttgtt cctccccaga cctggccctt ctctgtgcta gttccctgtc cctatcttcc 2220

tttttttttt ttttttattt ttgagaccga gtctcacttt gtccaggctg gagtgcagtg 2280

gcgtgatctc ggctcactgc agcctttgcc tcccgggttc aagagattct cctgcctcag 2340

tctctcgagt agctgggact acaggtgccc atcaccacgc ctggctaatt tttgtatttt 2400

tagtagagac agggtttcac cacattggct aggctggtct tgaactcctg acctcgtgat 2460

ctgcccgtct cggcctccca aagtgctggg attacaggca tcagccacca cacccagctc 2520

cctgtcccta tctttcctca ctgtccagcc cctgaccctg tttattccct gccagctgag 2580

ccctggaggg cagatggagg aggtggccgg ggctgtcaag cagatctccg acagaggccc 2640

tgtccggtct gaagatgagt cggtggaagc taagagagag cggccctca 2689

<210>2

<211>465

<212>DNA

<213>人乙型肝炎病毒

<400>2

atggctgctc gggtgtgctg ccaactggat ccttcgcggg acgtcctttg tctacgtccc 60

gtcggcgctg aatcccgcgg acgacccgtc tcggggccgt ttggggctct atcgtcccct 120

tcttcatctg ccgttccggc cgaccacggg gcgcacctct ctttacgcgg tctccccgtc 180

tgtgccttct catctgccgg accgtgtgca cttcgcttca cctctgcacg tcgcatggag 240

accaccgtga acgcccacca ggtcttgccc aaggtcttac ataagaggac tcttggactc 300

tcatcaatgt caacgaccga ccttgaggca tacttcaaag actgtttgtt taaggactgg 360

gaggagttgg gggaggagat taggttaaag gtctttgtac taggaggctg taggcataaa 420

ttggtctgtt caccagcacc atgcaacttt ttcacctctg cctaa 465

<210>3

<211>720

<212>DNA

<213>人

<400>3

tgacccaata ctgccaatgg ggtgcgagcg gcgcgaggaa gtggatgaac ccacacccgg 60

cagggcagaa aagggataga actcagtccg ccgtcgccac cgtgaaccac tgactgctac 120

aggagcgaat aatcgtctac cttgtttaaa ccatcattaa cttgggtttt ggtgtttgtt 180

tgtttgtttg tgtgtttttc gagacggagt cttgctgggt cgcccaggct ggagtgcagt 240

ggcgcgatct gggctcactg caacctccgc ctccgggttc aagcagttct ccctgcctca 300

gcctcccgag tagctgggat tacaggcgcc ggccaccacg cttggctaat ttttgcattt 360

tttagtagag acggggtttc gtcatgttgg ccaggctggt ctcgaactcc tgacctcaag 420

tgatccgctc acctcagcct cccaaagtgc tgggattaca ggcatgaaac actgcgcccg 480

gccggttttg ttttttaata agtaaccgag cctgcattct aaccaataaa ctcattctat 540

taaaacacgc ctgtggtgcc cagggccagc aggttgtctc atgtcaggtt ctcccagaag 600

ccgagcctga gagcaggatt caggtgcaaa tgtttcccta gggagtttct tccagctgaa 660

accagcgagg gagccaggga aaaagaagga gaagacaagc aagggtttct tcaatttcca 720

<210>4

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>扩增HBV-X的引物序列

<400>4

tgccatggag accaccgtga ac 22

<210>5

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>扩增HBV-X的引物序列

<400>5

tgcccaaggt cttacataag agga 24

<210>6

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>扩增接头的引物序列

<400>6

ccatcctaat acgactcact atagggc 27

<210>7

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>扩增接头的引物序列

<400>7

actcactata gggctcgagc ggc 23

<210>8

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>扩增MLL4的引物序列

<400>8

actttccagc attgcgggga accctcaga 29

<210>9

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>扩增MLL4的引物序列

<400>9

tgttcctccc cagacctggc ccttctctgt 30

<210>10

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>扩增MLL4的引物序列

<400>10

gctctctctt agcttccacc gact 24

<210>11

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>扩增MLL4的引物序列

<400>11

agggcctctg tcggagatct gct 23

<210>12

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>扩增MLL4的引物序列

<400>12

ctggcaggga ataaacaggg tca 23

<210>13

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>扩增HBV-X的引物序列

<400>13

tcgcaactgg atccttcgcg ggacgtcctt 30

<210>14

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>扩增HBV-X的引物序列

<400>14

gcgaagcttg ttcacggtgg tctccatg 28

<210>15

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>扩增MLL4的引物序列

<400>15

atgcggggac cttgcacagg ggactcggga 30

<210>16

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>扩增MLL4的引物序列

<400>16

ctgacccagg gccacagcag catgacggca 30

<210>17

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>扩增MLL4的引物序列

<400>17

cgggacactc tcagtctcgg acgccgatga 30

<210>18

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>扩增染色体17的引物序列

<400>18

agtttgtgct ccctccctgc aga 23

<210>19

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>扩增染色体17的引物序列

<400>19

agcggcgcga ggaagtggat ga 22

<210>20

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>扩增染色体17的引物序列

<400>20

gaaaagccta gccccttgcc ttaaggcagg 30

<210>21

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>扩增染色体17的引物序列

<400>21

agctcccttg ggctcaggcc acggcaggga 30

Claims

1.用于检测从人对象分离和怀疑是癌性的肝组织中HBV-DNA整合入MLL4基因的方法，所述HBV-DNA整合指示组织的癌性。

2.根据权利要求1的方法，用于检测HBV-DNA整合入MLL4基因，这是通过

对来自所述肝组织的DNA进行聚合酶链式反应(PCR)；和

通过确定所扩增DNA的碱基序列确认HBV-DNA整合入MLL4基因。

3.根据权利要求2的方法，其中含HBV-DNA X基因的区域整合入MLL4基因内含子3被确认。

4.根据权利要求1的方法，用于检测HBV-DNA整合入MLL4基因内含子3。

5.根据权利要求4的方法，用于检测HBV-DNA整合入MLL4基因内含子3的从5’末端起碱基编号17515-17818的区域中。

6.根据权利要求1、4或5的方法，其中HBV-DNA是含HBV的X基因的区域。

7.用于检测从人对象分离和怀疑是癌性的肝组织中HBV-DNA整合入MLL4基因的方法，所述HBV-DNA整合指示组织的癌性，该方法包括以下步骤：

(1)从肝组织中提取DNA；

(2)以(1)中获得的DNA作为模板，使用对含MLL4基因内含子3区域特异性的第一引物和对HBV的X基因区域特异性的第一引物，进行PCR；和

(3)任选再进行一次PCR，其中以(2)中扩增的DNA作为模板，使用对含MLL4基因内含子3区域特异性的第二引物和对HBV的X基因区域特异性的第二引物。

8.根据权利要求1、4、5和6任一项的方法，其中通过检测MLL4基因/HBV融合转录产物来检测HBV-DNA整合入MLL4基因。

9.根据权利要求8的方法，用于检测MLL4基因/HBV X区域融合转录产物。

10.根据权利要求1、4、5和6任一项的方法，其中通过检测MLL4/HBV融合蛋白来检测HBV-DNA整合入MLL4基因。

11.根据权利要求10的方法，包括检测MLL4/HBV X区域融合蛋白。

12.根据权利要求10或11的方法，其使用与MLL4/HBV X区域融合蛋白特异性结合的抗体或抗体片段。

13.用于检测在从人对象分离和怀疑是癌性的肝组织中MLL4基因的t(17；19)(p11.2；q13.1)染色体易位的方法，所述易位指示组织的癌性。

14.根据权利要求13的方法，用于通过检测包括染色体17和染色体19之间连接点的碱基序列来检测MLL4基因的t(17；19)(p11.2；q13.1)染色体易位。

15.根据权利要求14的方法，用于通过包括以下步骤的操作来检测含染色体17和染色体19之间连接点的碱基序列：

(1)从肝组织中提取DNA；

16.检测HBV-DNA整合入MLL4基因的试剂盒。

17.检测HBV-DNA整合入MLL4基因内含子3的试剂盒。

18.检测HBV的X区域整合入MLL4基因内含子3的试剂盒。

19.根据权利要求18的试剂盒，包括对含MLL4基因内含子3的区域特异性的引物或探针和对HBV的X区域特异性的引物或探针。

20.检测MLL4基因/HBV X区域融合转录产物的试剂盒。

21.检测MLL4基因/HBV X区域融合蛋白的试剂盒。

22.根据权利要求21的试剂盒，包括与MLL4/HBV X区域融合蛋白特异性结合的抗体或抗体片段。

23.检测MLL4基因的t(17；19)(p11.2；q13.1)染色体易位的试剂盒。

24.根据权利要求23的试剂盒，包括对含MLL4基因内含子3的区域特异性的引物或探针和对含染色体17的p11.2的区域特异性的引物和探针。