CN1531600A - IFNα-21基因的新的多核苷酸和多肽 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及来源于IFNα－21基因核苷酸序列的包含新的SNP的新的多核苷酸、以及来源于天然野生型IFNα－21蛋白质的包含由至少一个本发明的SNP所致至少一个突变的新的多肽、及其治疗用途。

Description

IFNα-21基因的新的多核苷酸和多肽
相关申请
本发明要求对2001年3月30日提交的、名为《Nouveauxpolynucléotides comportant des polymorphismes de type SNPfonctionnels dans la séquence nucléique du gène IFNalpha21ainsi que de nouveaux polypeptides codés par cespolynucléotides et leurs utilisations thérapeutiques.》的法国专利申请0104404的优先权。
发明背景
发明领域
本发明涉及来源于IFNα-21基因核苷酸序列的包含新的SNP的新的多核苷酸、以及来源于天然野生型IFNα-21蛋白质的包含该SNP所致突变的新的多肽、及其治疗用途。
相关技术
干扰素α21基因，以下简称IFNα-21，如下列文献所述：
-Goeddel，D.V.，Leung，D.W；″The structure of eightdistinct cloned human leukocyte interferon cDNAs″；Nature 290(5801)，20-26(1981)。
-Olopade OI.，Bohlander SK.；″Mapping of the shortestregion of overlap of deletions of the short arm of chromosome9 associated with human neoplasia″；Genomics 14(2)，437-443(1992)。
该基因的核苷酸序列可得自GenBank数据库的HTG部分，登录号为AC009445。
IFNα-21信使RNA序列如NCBI数据库登录号NM_002175所述。
IFNα-21基因的结构和功能同源性接近于人干扰素α(IFNα)，特别是IFNα-2。
已知IFNα具有抗细胞增殖作用，并与抗病毒和抗寄生虫反应有关。
已知IFNα还抑制其它几种细胞因子在造血干细胞水平的表达，并抑制某些肿瘤的细胞增殖。
已知IFNα还降低肾癌EGF受体的表达，抑制某些线粒体基因的表达，抑制成纤维细胞、单核细胞和B淋巴细胞的增殖，特别是在体外，并阻断B淋巴细胞的抗体合成。
已知IFNα还诱导肿瘤细胞表面上的肿瘤特异性抗原的表达，并通过作用于ISRE(干扰素刺激反应元件)的特定转录因子，诱导位于ISRE型启动子区控制下的基因。
已知IFNα与各种病症和/或人类疾病有关，例如各种癌症，如恶性肿瘤、黑色素瘤、淋巴瘤、白血病和肝癌、颈癌、头癌和肾癌，心血管疾病，与免疫系统无关的代谢疾病，例如肥胖症，传染病，例如乙型肝炎、丙型肝炎和AIDS，肺炎，溃疡性结肠炎，中枢神经系统疾病，例如阿尔茨海默氏病、精神分裂症和抑郁症，组织或器官移植的排斥，创伤愈合，透析患者的贫血，变态反应，哮喘，多发性硬化，骨质疏松症，银屑病，类风湿性关节炎，克罗恩氏病(Crohn’sdisease)，自身免疫疾病和病症、胃肠疾病乃至与化学治疗有关的疾病。
IFNα特别用于治疗某些白血病、转移性肾癌以及伴随免疫缺陷出现的肿瘤，例如爱滋病情况下的Kaposi肉瘤。IFNα还有效对抗其它类型肿瘤和某些病毒感染。FDA(食品和药品管理局)确认IFNα也可用于治疗生殖器疣或性病。
更具体而言，利用原位杂交将IFNα-21定位于帕金森氏病或阿尔茨海默氏病患者的脑中。
与其它细胞相比，小神经胶质(microglial)细胞大量表达IFNα-21。
阿尔茨海默氏病患者的顶叶神经元显示存在IFNα-21，提示IFNα-21可能与其病理有关(例如参见Kawaguchi N，Yamada T，Yoshiyama Y.No To Shinkei.1997 Jan.；49(1)：69-73)。
然而，IFNα特别是IFNα-21用于药物组合物时具有很多副作用，例如急性超敏反应(荨麻疹、支气管收缩、过敏性休克等)、心率不齐、低血压、癫痫发作、甲状腺功能问题、流感样综合症(发热、出汗、肌痛)等。
此外，用IFNα治疗的患者可以产生中和该分子的抗体，从而降低其效率。
本发明人发现IFNα-21基因的新的多肽和新的多核苷酸类似物，其能够具有不同于天然野生型IFNα-21蛋白质的功能性。
这些新的多肽和多核苷酸可以特别用于治疗或预防前述病症或疾病，并避免其所具有的全部或部分缺点。
发明简述
本发明的首要目的在于新的多核苷酸，其因包含一个或几个SNP(单核苷酸多态性)而不同于参考的野生型IFNα-21基因核苷酸序列。
参考的野生型人IFNα-21基因的核苷酸序列SEQ ID NO.1由2001个核苷酸组成，包含核苷酸670(起始密码子)-1239(终止密码子)的570个核苷酸的编码序列。
申请人已经鉴定了参考的野生型IFNα-21基因核苷酸序列中的8个SNP。这8个SNP如下：c794g、c973a、g1011c、t1049a、t1155a、a1204g、t1265c、t1277c。
应当理解，在本发明意义上，定位上文定义的SNP的相应编号是相对于核苷酸序列SEQ ID NO.1的编号而言。
字母a、t、c和g分别对应于含氮碱基腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶和鸟嘌呤。
第一个字母对应于野生型核苷酸，而最后一个字母对应于突变的核苷酸。
因此，例如SNP c794g对应于参考的野生型IFNα-21基因核苷酸序列SEQ ID NO.1中的794位核苷酸胞嘧啶(c)突变为核苷酸鸟嘌呤(g)。
本申请人利用申请人于2000年12月6日提交的名为″Process forthe determination of one or several functional polymorphism(s)in the nucleotide sequence of a preselected functionalcandidate gene and its applications″的专利申请FR 00 22894(此处引用以供参考)中所述测定方法，鉴定出了这些SNP。
该专利申请中所述方法可以从随机个体群体中的至少一个个体中鉴定一个(或几个)已存在的SNP。
在本发明范围内，在随机选取的个体群体中的不同个体中分离例如包含编码序列的IFNα-21基因核苷酸序列片段。
在DHPLC分析(″变性高效液相层析″)之后，对某些具有异质双链性质(即性质不同于参考的野生型IFNα-21基因序列)的样品进行这些片段的测序。
这样测序的片段然后与参考的野生型IFNα-21基因片段的核苷酸序列作比较，并鉴定本发明的SNP。
因此，该SNP是天然的，其中每一个均存在于世界群体的某些个体中。
参考的野生型IFNα-21基因编码对应于氨基酸序列SEQ ID NO.2的189个氨基酸的未成熟蛋白质，通过断裂包括前23个氨基酸的信号肽而转变为166个氨基酸的成熟蛋白质。
本发明的每个编码SNP，即：c794g、c973a、g1011c、t1049a、t1155a、a1204g，引起IFNα-21基因核苷酸序列编码的蛋白质在氨基酸序列水平的改变。
这些氨基酸序列的改变如下：
SNP c794g引起对应于氨基酸序列SEQ ID NO.2的IFNα-21基因的未成熟蛋白质42位氨基酸丙氨酸(A)突变为甘氨酸(G)，其位于成熟蛋白质的19位。在本发明的说明书中，根据是否涉及成熟蛋白质抑或未成熟蛋白质，而分别将该SNP编码的突变称为A19G或A42G。
SNP c973a引起对应于氨基酸序列SEQ ID NO.2的IFNα-21基因的未成熟蛋白质102位氨基酸谷氨酰胺(Q)突变为赖氨酸(K)，其位于成熟蛋白质的79位。在本发明的说明书中，根据是否涉及成熟蛋白质抑或未成熟蛋白质，而分别将该SNP编码的突变称为Q79K或Q102K。
SNP g1011c引起对应于氨基酸序列SEQ ID NO.2的IFNα-21基因的未成熟蛋白质114位氨基酸谷氨酰胺(Q)突变为组氨酸(H)，其位于成熟蛋白质的91位。在本发明的说明书中，根据是否涉及成熟蛋白质抑或未成熟蛋白质，而分别将该SNP编码的突变称为Q91H或Q114H。
SNP t1049a引起对应于氨基酸序列SEQ ID NO.2的IFNα-21基因的未成熟蛋白质127位氨基酸缬氨酸(V)突变为天冬氨酸(D)，其位于成熟蛋白质的104位。在本发明的说明书中，根据是否涉及成熟蛋白质抑或未成熟蛋白质，而分别将该SNP编码的突变称为V104D或V127D。
SNP t1155a引起对应于氨基酸序列SEQ ID NO.2的IFNα-21基因的未成熟蛋白质162位氨基酸半胱氨酸(C)突变为终止密码子(终止)，其位于成熟蛋白质的139位。在本发明的说明书中，根据是否涉及成熟蛋白质抑或未成熟蛋白质，而分别将该SNP编码的突变称为C139stop或C162stop。
SNP a1204g引起对应于氨基酸序列SEQ ID NO.2的IFNα-21基因的未成熟蛋白质179位氨基酸赖氨酸(K)突变为谷氨酸(E)，其位于成熟蛋白质的156位。在本发明的说明书中，根据是否涉及成熟蛋白质抑或未成熟蛋白质，而分别将该SNP编码的突变称为K156E或K179E。
SNP c794g、c973a、g1011c、t1049a、t1155a、a1204g引起符合本发明的多肽较之野生型参考IFNα-21基因核苷酸序列编码的多肽，其空间构象改变。
按照本领域技术人员熟知的方法，通过计算机分子模建(modeling)，例如利用de novo(例如SEQFOLD/MSI)、同源性(例如MODELER/MSI)、最小化势场(force field)(例如DISCOVER、DELPHI/MSI)和/或分子动力学(例如CFF/MSI)模建工具，可以观察到这些改变。
下文实验部分给出了上述模式的实例。
计算机分子模建表明，成熟突变蛋白质的Q79K突变包括因氢键破坏而使野生型IFNα-21蛋白质螺旋C的N端移位(displacement)，如图1A和1B所示。
实际上，在Q79K突变型IFNα-21蛋白质中，野生型IFNα-21蛋白的Q79残基侧链氧原子、E83残基的酸性基团以及螺旋C间的氢键消失。
因此，Q79K突变蛋白质具有不同于天然野生型IFNα-21蛋白质的三维构象，其结构和功能显著变化。
计算机分子模建表明，成熟突变蛋白质的Q91H突变包括螺旋C在突变位置的移位，如图2A和2B所示。出现几个氢键和盐桥，特别位于H91和D76氨基酸的侧链之间，使螺旋更具刚性。
因此，Q91H突变蛋白质具有不同于天然野生型IFNα-21蛋白质的三维构象，结构和功能显著变化。
计算机分子模建表明，成熟突变蛋白质的V104D突变包括螺旋C和D之间的环状结构在突变位置的改变，如图3A和3B所示。在突变结构中出现几个氢键(一方面为Q102和G105，另一方面为Q52、E107和T109)，使螺旋C和D之间的环更具刚性。此外，还观察到螺旋BN端略微移位。
这些空间改变影响到与IFNα-21结合其受体有关的残基。
因此，V104D突变蛋白质具有不同于天然野生型IFNα-21蛋白质的三维构象，结构和功能显著变化。
计算机分子模建表明，成熟突变蛋白质的C139stop突变引起蛋白质翻译过早停止，导致通常与野生型IFNα-21蛋白质螺旋E有关的多肽片段消失，如图4所示。
螺旋E对于IFNα-21与其受体结合必不可少。缺少螺旋E导致突变蛋白质错误折叠，并引起蛋白质三维构象变化，其中蛋白质的疏水核心接触外部亲水性介质。因此，该突变蛋白质必须改变其三维构象，使其疏水核心为亲水性残基所覆盖，以免接触外部亲水性介质。
因此，C139stop突变蛋白质具有不同于天然野生型IFNα-21蛋白质的三维构象，结构和功能显著变化。
计算机分子模建表明，成熟突变蛋白质的K156E突变包括螺旋EC端的伸展以及C末端环状的改变，如图5A和5B所示。
该突变增强了氢键网络，并在E156和R161残基之间形成盐桥。这些改变使IFNα-21蛋白质结构在此区域更为刚性。已知蛋白质该区域与其抗病毒活性有关。因此，可预测K156E突变型IFNα-21蛋白质的抗病毒活性被显著破坏，并预测156位谷氨酸导致成熟IFNα-21的结构和功能改变。
本发明的其它SNP，即：t1265c、t1277c，并不包含IFNα-21基因核苷酸序列编码的蛋白质在氨基酸序列SEQ ID NO.2水平的改变。SNP t1265c、t1277c是非编码SNP。
本发明的多核苷酸可以按此方式进行基因分型，以便确定这些多核苷酸在群体中的等位基因频率。下文实验部分给出了基因分型的实施例。
通过测定生物活性，可以同样进行本发明多肽的功能性测定。
在此方面，例如可测定本发明的多肽与天然野生型IFNα-21蛋白质相比，对Daudi细胞系的抗增殖作用(Pielher等人J.Biol.Chem.；275卷，51期，40425-40433，12月22，2000；″New structural andFunctional Aspects of the type I Interferon-Receptorinteraction revealed by comprehensible mutational analysis ofthe binding interface″)。
本发明目的还在于本发明的多核苷酸和多肽、以及从这些多核苷酸和多肽开始而获得和/或鉴定的治疗性分子的用途，特别是用于预防和治疗某些人类病症和/或疾病。
附图简述
图1A和1B表示包含SNP c973a(Q79K)的本发明编码蛋白质以及天然野生型IFNα-21蛋白质的模型。图1B表示图1A所示每种蛋白质下部模型的特写(close up)。
在图1A和1B中，黑色条带代表天然野生型IFNα-21蛋白质的结构，而白色条带代表Q79K突变型IFNα-21蛋白质的结构。
图2A和2B表示包含SNP g1011c(Q91H)的本发明编码蛋白质以及天然野生型IFNα-21蛋白质的模型。图2B表示图2A所示每种蛋白质左部模型的特写。
在图2A和2B中，黑色条带代表天然野生型IFNα-21蛋白质的结构，而白色条带代表Q91H突变型IFNα-21蛋白质的结构。
图3A和3B表示包含SNP t1049a(V104D)的本发明编码蛋白质以及天然野生型IFNα-21蛋白质的模型。图3B表示图3A所示每种蛋白质上部模型的特写。
在图3A和3B中，黑色条带代表天然野生型IFNα-21蛋白质的结构，而白色条带代表V104D突变型IFNα-21蛋白质的结构。
图4表示包含SNP t1155a(C139stop)的本发明编码蛋白质(图4B)以及天然野生型IFNα-21蛋白质(图4A)的模型。图4C表示图4A和4B的两个蛋白质的叠加。在图4中，黑色条带代表天然野生型IFNα-21的蛋白质的结构，而白色条带代表C139stop突变型IFNα-21蛋白质的结构。
图5A和5B表示包含SNP a1204g(K156E)的本发明编码蛋白质以及天然野生型IFNα-21蛋白质的模型。
图5B表示图5A所示每种蛋白质上部模型的特写。在图5中，黑色条带代表天然野生型IFNα-21蛋白质的结构，而白色条带代表K156E突变型IFNα-21蛋白质的结构。
图6表示预先经VSV病毒感染以及A42G、Q114H/V127D、或K179E突变型IFNα-21蛋白质处理的小鼠，与利用野生型IFNα-2处理、或未经处理的小鼠相比的存活率。
在此图中，横坐标对应存活时间(天)，纵坐标对应VSV感染小鼠的相对存活率。黑色三角形、十字形、黑色菱形分别代表经A42G突变型IFNα-21、Q114H/V127D突变型IFNα-21以及K179E突变型IFNα-21处理的VSV感染小鼠的数据。  黑色正方形代表经野生型IFNα-2处理的VSV感染小鼠的数据，空三角形代表未经处理的VSV感染小鼠的数据。
发明详述
定义
″参考野生型基因的核苷酸序列″应理解为人IFNα-21基因的核苷酸序列SEQ ID NO.1。
该序列可得自GenBank登录号AC009445，IFNα-21信使RNA序列如NCBI数据库登录号NM_002175所述。此外，人IFNα-21基因描述于Goeddel，D.V.，Leung，D.W″The structure of eight distinctcloned human leukocyte interferon cDNAs″；Nature 290(5801)，20-26(1981)，以及Olopade OI.，Bohlander SK.″Mapping of theshortest region of overlap of deletions of the short arm ofchromosome 9 associated with human neoplasia″；Genomics 14(2)，437-443(1992)。
″天然野生型IFNα-21蛋白质″应理解为由参考的野生型IFNα-21基因的核苷酸序列编码的成熟蛋白质。天然野生型非成熟IFNα-21蛋白质对应于SEQ ID NO.2所示肽序列。
″多核苷酸″应理解为多核糖核苷酸或多脱氧核糖核苷酸，可以是修饰或未修饰的DNA或RNA。
术语多核苷酸包括，例如单链或双链DNA、由一个或几个单链区以及一个或几个双链区的混合物组成的DNA、单链或双链RNA以及由一个或几个单链区以及一个或几个双链区的混合物组成的RNA。术语多核苷酸还可以包括包含一个或几个三链区的RNA和/或DNA。多核苷酸同样可理解为因稳定性或其它原因包含一个或几个碱基修饰的而修饰骨架的DNA和RNA。修饰碱基可理解为，例如诸如次黄苷等稀有碱基。
″多肽″应理解为包含通过正常或修饰的肽键(例如，诸如在同型空间配位肽的情况下)彼此互联的至少两个氨基酸的肽、寡肽、寡聚体或蛋白质。
多肽可以由除遗传密码定义的20个氨基酸以外的氨基酸组成。多肽同样可以由利用本领域技术人员熟知的天然过程(诸如翻译后成熟过程)或化学过程修饰的氨基酸组成。文献中充分详述了这些修饰。这些修饰可以出现在多肽的任何位置：肽骨架、氨基酸链乃至羧基或氨基末端。
多肽可以是泛素化之后的分支状，或者有或无分支的环状。这类修饰可以是本领域技术人员熟知的天然或合成的翻译后过程的结果。
例如，多肽修饰可理解为包括乙酰化、酰基化、ADP-核糖基化、酰胺化、黄素的共价固定、血红素的共价固定、核苷酸或核苷酸衍生物的共价固定、脂质或脂质衍生物的共价固定、磷脂酰肌醇的共价固定、共价或非共价交联、环化、二硫键形成、脱甲基化、半胱氨酸形成、焦谷氨酸形成、甲酰化、γ-羧基化、糖基化、GPI锚形成、羟基化、碘化、甲基化、十四酰化、氧化、蛋白水解过程、磷酸化、异戊二烯化、外消旋化、seneloylation、硫酸酯化(sulfatation)、氨基酸加成，诸如精氨酸化或泛素化。文献中充分详述了这些修饰：PROTEINS-STRUCTURE AND MOLECULAR PROPERTIES，第二版，T.E.Creighton，New York，1993，POST-TRANSLATIONAL COVALENTMODIFICATION OF PROTEINS，B.C.Johnson，Ed.，Academic Press，New York，1983，Seifter等人″Analysis for proteinmodifications and nonprotein cofactors″，Meth.Enzymol.(1990)182：626-646，以及Rattan等人″Protein Synthesis：Post-translational Modifications and Aging″，Ann NY Acad Sci(1992)663：48-62。
″分离的多核苷酸″或″分离的多肽″应理解为从人体中分离或利用技术方法产生的、分别如前文定义的多核苷酸或多肽。
″同一性″应理解为测定核苷酸或多肽序列的同一性。
同一性是本领域技术人员熟知的术语，在文献中有详述。参见COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY，Lesk，A.M.，Ed.，OxfordUniversity Press，New York，1998；BIOCOMPUTING INFORMATICS ANDGENOME PROJECT，Smith，D.W.，Ed.，Academic Press，New York，1993；COMPUTER ANALYSIS OF SEQUENCE DATA，PART I，Griffin，A.M.andGriffin H.G.，Ed，Humana Press，New Jersey，1994；以及SEQUENCEANALYSIS IN MOLECULAR BIOLOGY，von Heinje，G.，Academic Press，1987。
文献中同样详述了一般用于确定两个序列间同一性和相似性的方法。参见GUIDE TO HUGE COMPUTER，Martin J.Bishop，Ed，AcademicPress，San Diego，1994，以及Carillo H.和Lipton D.，Siam JApplied Math(1988)48：1073。
例如，与核苷酸序列SEQ ID NO.1具有至少95％同一性的多核苷酸是与该序列相比，每100个核苷酸中包含至多5个突变点的多核苷酸。
这些突变点可以是一个(或几个)核苷酸的一个(或几个)替换、添加和/或缺失。
同样，例如与氨基酸序列SEQ ID NO.2具有至少95％同一性的多肽是与该序列相比，每100个氨基酸中包含至多5个突变点的多肽。
这些突变点可以是一个(或几个)氨基酸的一个(或几个)替换、添加和/或缺失。
本发明的多核苷酸和多肽并不完全分别等同于核苷酸序列SEQ IDNO.1或氨基酸序列SEQ ID NO.2，应理解这些序列包含至少一个本发明的SNP，而被认为是这些序列的变体。
本发明的多核苷酸通常与包含至少一个本发明的SNP的核苷酸序列SEQ ID NO.1具有相同或几乎相同的生物活性。
同样，本发明的多肽通常与包含至少一个本发明的编码SNP的氨基酸序列SEQ ID NO.2具有相同或几乎相同的生物活性。
例如，通过定点诱变或直接合成，可以获得本发明的变体。
″SNP″可理解为核苷酸序列中碱基的任何天然变异。核苷酸序列的SNP可以是编码、沉默或非编码型。
编码SNP是包括在核苷酸序列的编码序列内、涉及该核苷酸序列所编码氨基酸序列中的氨基酸改变的一种多态性。在这种情况下，术语SNP经外延同样适用于氨基酸序列的突变。
沉默SNP是包括在核苷酸序列的编码序列内、不涉及该核苷酸序列所编码的氨基酸序列中的氨基酸改变的一种多态性。
非编码SNP是包括在核苷酸序列的非编码序列中的一种多态性。该多态性特别发现于内含子、拼接区、转录启动子或增强子位点序列中。
″功能性SNP″可理解为如前文定义的、包括在核苷酸序列或氨基酸序列中的具有功能性的SNP。
″功能性″可理解为多肽或多核苷酸的生物活性。
本发明的多肽或多核苷酸的功能性可以是保留、增加、降低或抑制野生型参考基因的核苷酸序列编码的多肽或后者核苷酸序列的生物活性。
本发明的多肽或多核苷酸的功能性同样可以是野生型参考基因的核苷酸序列编码的多肽或后者核苷酸序列的生物活性的本质改变。
生物活性可以特别涉及本发明的多肽与受体有或没有亲和力。
多核苷酸
本发明的首要目的在于分离的多核苷酸，其包含：
a)与序列SEQ ID NO.1或其编码序列(核苷酸670-1239)具有至少80％同一性、优选至少90％同一性、更优选至少95％同一性以及更加优选至少99％同一性的核苷酸序列，应当理解该核苷酸序列包含至少一个以下编码SNP c794g、c973a、g1011c、t1049a、t1155a、a1204g或
b)与a)中核苷酸序列互补的核苷酸序列。
应当理解，在本发明意义上，编号对应于该SNP在核苷酸序列SEQID NO.1中的定位。
本发明同样涉及分离的多核苷酸，其包含：
a)核苷酸序列SEQ ID NO.1或其编码序列，应当理解这些序列中每一个均包含至少一个以下编码SNP：c794g、c973a、g1011c、t1049a、t1155a、a1204g，或
b)与a)中核苷酸序列互补的核苷酸序列。
优选地，本发明的多核苷酸由序列SEQ ID NO.1或其编码序列组成，应当理解这些序列中每一个均包含至少一个以下编码SNP：c794g、c973a、g1011c、t1049a、t1155a、a1204g。
根据本发明，前面定义的多核苷酸包含选自c794g、c973a、g1011c、t1049a、t1155a和a1204g的单一编码SNP。
如上定义的多核苷酸同样可以包括至少一个下列非编码SNP：t1265c、t1277c。
本发明的目的同样在于分离的多核苷酸，其包含以下或由以下组成：
a)核苷酸序列SEQ ID NO.1或其编码序列，应当理解这些序列中每一个均包含至少一个以下非编码SNP：t1265c、t1277c，或
b)与a)中核苷酸序列互补的核苷酸序列。
本发明还涉及分离的多核苷酸，其由部分的：
a)核苷酸序列SEQ ID NO.1或其编码序列，应当理解这些序列中每一个均包含至少一个下列编码SNP：c794g、c973a、g1011c、t1049a、t1155a、a1204g、t1265c、t1277c，或
b)与a)中核苷酸序列互补的核苷酸序列组成。
该分离的多核苷酸由至少10个核苷酸组成。
优选地，如上定义的分离的多核苷酸由10-40个核苷酸组成。
本发明的目的还在于分离的多核苷酸，其编码的多肽包含：
a)氨基酸序列SEQ ID NO.2，或
b)包含氨基酸序列SEQ ID NO.2中24-189位之间所含氨基酸的氨基酸序列，
应当理解a)和b)中的每个氨基酸序列均包含至少一个下列编码SNP：A42G、Q102K、Q114H、V127D、C162stop、K179E。
应当理解，在本发明意义上，定位A42G、Q102K、Q114H、V127D、C162stop、K179E SNP的相应编号是相对于氨基酸序列SEQ IDNO.2的编号而言。
根据本发明的优选目的，前面定义的多肽包含单个如上定义的编码SNP。
优选的，本发明多核苷酸由DNA或RNA分子组成。
本发明多核苷酸可以利用标准DNA或RNA合成方法获得。
利用定点诱变从IFNα-21基因的核苷酸序列开始，通过核苷酸序列SEQ ID NO.1中每个SNP的突变核苷酸修饰野生型核苷酸，同样可以获得本发明的多核苷酸。
例如，利用定点诱变从IFNα-21基因的核苷酸序列开始，将核苷酸序列SEQ ID NO.1中794位核苷酸胞嘧啶(c)修饰为核苷酸鸟嘌呤(g)，可以获得包含SNP c794g的本发明多核苷酸。
可以这样应用的定点诱变方法为本领域技术人员熟知。特别提到的是文献TA Kunkel，1985″Proc.Natl.Acad.Sci.USA″82：488。
分离的多核苷酸同样可以包括，例如编码前(Pre-)、原(Pro-)或前原(Pre-Pro-)蛋白质氨基酸序列或诸如六组氨酸肽等标志氨基酸序列的核苷酸序列。
本发明的多核苷酸同样可以连接编码其它蛋白质或蛋白质片段的核苷酸序列，以获得融合蛋白质或其它纯化产物。
本发明的多核苷酸同样可以包括诸如5’和/或3’非编码序列的核苷酸序列，例如转录或非转录序列、翻译或非翻译序列、拼接信号序列、多腺苷酸化序列、核糖体结合序列乃至稳定mRNA的序列。
与核苷酸或多核苷酸序列互补的核苷酸序列可定义为可以在严格条件下与该核苷酸序列杂交的核苷酸序列。
″严格杂交条件″一般但不一定理解为可使具有至少80％、优选大于或等于90％、更优选大于或等于95％、最优选大于或等于97％的同一性的核苷酸序列杂交的化学条件。
可以按照本领域技术人员熟知的方法获得严格条件，例如将多核苷酸在包含50％甲酰胺、5×SSC(150mM NaCl、15mM柠檬酸钠)、50mM磷酸钠(pH＝7.6)、5×Denhardt液、10％硫酸葡聚糖和20μg变性鲑精DNA的溶液中，于42℃温育，然后于0.1×SSC、65℃洗涤滤膜。
在本发明范围内，如果该严格条件可使具有100％同一性的核苷酸序列杂交，则认为该核苷酸序列与如a)中所述核苷酸序列严格互补。
在本发明的涵义中可以理解，与一个核苷酸序列互补的核苷酸序列包含至少一个本发明的反义SNP。
因此，举例来说，如果该核苷酸序列包含SNP c794g，则其互补核苷酸序列在相当于794的位置包含胞嘧啶(c)核苷酸。
包含SNP的多核苷酸的鉴定、杂交和/或扩增
本发明的目的还在于以下全部或部分的用途：
a)与核苷酸序列SEQ ID NO.1具有80-100％同一性(优选至少90％同一性、更优选95％同一性、特别优选100％同一性)的多核苷酸，和/或
b)包含至少一个SNP的本发明多核苷酸
以鉴定、杂交和/或扩增与核苷酸序列SEQ ID NO.1或必要时其编码序列(核苷酸670-1239)具有80-100％同一性(优选至少90％同一性、更优选95％同一性、特别优选100％同一性)的多核苷酸的全部或部分，
应当理解，这些序列中每个均包含至少一个下列SNP：c794g、c973a、g1011c、t1049a、t1155a、a1204g、t1265c、t1277c。
基因分型并测定SNP频率
本发明的目的同样在于以下全部或部分的用途：
a)与核苷酸序列SEQ ID NO.1具有80-100％同一性(优选至少90％同一性、更优选95％同一性、特别优选100％同一性)的多核苷酸，和/或
b)包含至少一个SNP的本发明多核苷酸
用于与核苷酸序列SEQ ID NO.1或必要时其编码序列(核苷酸670-1239)具有80-100％同一性(优选至少90％同一性、更优选95％同一性、特别优选100％同一性)的多核苷酸的全部或部分的基因分型，
应当理解，这些序列中每个均包含至少一个下列SNP：c794g、c973a、g1011c、t1049a、t1155a、a1204g、t1265c、t1277c。
根据本发明，可以对个体或个体的群体进行基因分型。
在本发明的涵义中，基因分型可定义为用于测定个体或个体群基因型的方法。基因型由存在于一个或多个特定座位的等位基因构成。
″个体群″可理解为以随机或非随机方式选择的一群个体。这些个体可以是人类、动物、微生物或植物。
个体群一般包含至少10个成员，优选100-300个成员。
可以根据种族或表现型选择个体，特别是受以下疾病和/或疾病影响的个体：恶性肿瘤、黑色素瘤、淋巴瘤、白血病和肝癌、颈癌、头癌和肾癌、心血管疾病、诸如与免疫系统无关的代谢疾病，例如肥胖症，传染病，特别是病毒性感染，如乙型肝炎、丙型肝炎和AIDS，肺炎、溃疡性结肠炎、中枢神经系统疾病，例如阿尔茨海默氏病、精神分裂症和抑郁症，组织或器官移植排斥、创伤愈合、透析患者的贫血、变态反应、哮喘、多发性硬化、骨质疏松症、银屑病、类风湿性关节炎、克罗恩氏病、自身免疫疾病和异常、胃肠疾病乃至与化学治疗有关的疾病。
优选对个体群进行本发明功能性SNP的基因分型。
现有许多可以用来进行SNP基因分型的技术(特别参见KwokPharmacogenomics，2000，卷1，95-100页，″High-throughputgenotyping assay approaches″)。这些技术基于以下四原理之一：等位基因特异性寡核苷酸杂交、任选在脱氧核苷酸存在下通过双脱氧核苷酸的寡核苷酸延伸、等位基因特异性寡核苷酸的连接或等位基因特异性寡核苷酸的断裂。其中每个技术都可与检测系统相连，例如直接或偏振荧光测定、或质谱分析。
利用热ddNTP(由不同荧光团标记的两种不同的ddNTP)和冷ddNTP(两种不同的非标记的ddNTP)的微型测序，结合偏振荧光扫描仪，可以特别进行基因分型。本领域技术人员熟知利用读取偏振荧光的微型测序方法(FP-TDI技术或荧光偏振模板-直接染料-终止物参入)。
它可以对聚合酶链式反应(PCR)扩增每一个体DNA后获得的产物进行。选择包括含所研究SNP的多核苷酸基因区域的PCR产物。在PCR热循环仪的最后步骤之后，将平板置于偏振荧光扫描仪，利用荧光团特异性激发和发射滤器读取标记碱基。以图表报告标记碱基的强度值。
就本发明SNP的PCR扩增而言，本领域技术人员很容易根据本发明SNP的位置，分别选择有义和反义引物。
例如，用于PCR扩增引物的有义和反义核苷酸序列可以分别为：
SEQ ID NO.3：有义引物：GGTTCAAGGTTACCCATCTC
SEQ ID NO.4：反义引物：TTTGAAATGGCAGAAGTCAT
该核苷酸序列可以扩增具有核苷酸序列SEQ ID NO.1中620-1315位核苷酸的696个核苷酸长度的片段。
然后对个体群中由包含SNP的基因编码的每个等位基因的频率(等位频率)进行统计分析，可确定其影响的重要性及其在不同亚群、特别是必要时在构成该个体群的不同种群中的分布。
分析基因型数据，估计在所研究群体中观察到的不同等位基因的分布频率。可借助于软件，例如SAS-suite(SAS)或SPLUS(MathSoft)，计算等位频率。利用软件ARLEQUIN和SAS-suite，可以比较本发明SNP在个体群中不同种群的等位分布。
本发明SNP作为遗传标志
鉴于SNP改变的基因功能性序列(例如启动子、拼接位点、编码区)很可能与疾病易感性或抗性直接有关，所有SNP(不论功能性与否)均可能提供用于鉴定与疾病状态有关的一个或几个基因的重要标志，从而可能与该疾病状态间接相关(参见Cargill等人(1999).NatureGenetics 22：231-238；Riley等人(2000).Pharmacogenomics1：39-47；Roberts L.(2000).Science 287：1898-1899)。
因此，本发明还涉及包含在IFNα-21基因的多核苷酸的至少一个下列SNP的数据库：c794g、c973a、g1011c、t1049a、t1155a、a1204g、t1265c、t1277c。
应当理解，所述SNP根据核苷酸序列SEQ ID NO.1编号。
可分析该数据库，确定以下两者之间的统计学相关性：
(i)IFNα-21基因多核苷酸中的至少一个下列SNP：c794g、c973a、g1011c、t1049a、t1155a、a1204g、t1265c、t1277c，以及
(ii)疾病或疾病抗性。
本发明还涉及IFNα-21基因多核苷酸中的至少一个下列SNP的用途：c794g、c973a、g1011c、t1049a、t1155a、a1204g、t1265c、t1277c，用于开发疾病或疾病抗性的诊断/预后试剂盒。
如上定义的本发明SNP可直接或间接与疾病或疾病抗性有关。
优选地，这些疾病可能是上文定义的疾病。
表达载体和宿主细胞
本发明目的还在于包含至少一种本发明多核苷酸的重组载体。
可以使用多种表达系统，包括而不限于染色体、附加体和衍生病毒。更特别而言，所用重组载体可来自于细菌质粒、转座子、酵母附加体、插入元件、酵母染色体元件、诸如杆状病毒等病毒、诸如SV40等乳头状瘤病毒、痘苗病毒、腺病毒、福克斯痘病毒(fox pox viruses)、假狂犬病毒、逆转录病毒。
这些重组载体同样可以是粘粒或噬菌粒衍生物。可以利用本领域技术人员熟知的方法，例如MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，Sambrook等人，第四版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.(2001)中所述方法，将核苷酸序列插入重组表达载体。
该重组载体可以包括控制多核苷酸表达调节的核苷酸序列、以及可表达和转录本发明多核苷酸、翻译本发明多肽的核苷酸序列，根据所用宿主细胞选择这些序列。
因此，例如可以将合适的分泌信号引入重组载体，以便将本发明多核苷酸编码的多肽导向内质网腔、周质间隙、膜或细胞外环境。
本发明目的还在于包含本发明重组载体的宿主细胞。
可按照本领域技术人员公知的方法，例如BASIC METHODS INMOLECULAR BIOLOGY，Davis等人，第二版，McGraw-HillProfessional Publishing，1995和MOLECULAR CLONING：ALABORATORY MANUAL(同上)中所述方法，例如磷酸钙转染、DEAE葡聚糖转染、转染、显微注射、阳离子脂质转染、电穿孔、转导或感染，将重组载体引入宿主细胞。
例如，宿主细胞可以是细菌细胞诸如链球菌、葡萄球菌、大肠杆菌(E.coli)或枯草杆菌(Bacillus subtilis)细胞，真菌细胞诸如酵母细胞和曲霉菌属、链霉菌属细胞，昆虫细胞诸如果蝇S2和Spodoptera Sf9细胞，动物细胞诸如CHO、COS、HeLa、C127、BHK、HEK 293细胞，以及所治疗受试者的人类细胞乃至植物细胞。
例如，可用来表达本发明多肽或作为药物组合物中活性产物的宿主细胞参见下文。
多肽
本发明目的还在于分离的多肽，其包含与以下序列具有至少80％同一性、优选至少90％同一性、更优选至少95％同一性、更加优选至少99％同一性的氨基酸序列：
a)氨基酸序列SEQ ID NO.2，或
b)包含氨基酸序列SEQ ID NO.2中24-189位之间所含氨基酸的氨基酸序列，
应当理解，a)和b)中的每个氨基酸序列均包含至少一个下列编码SNP：A42G、Q102K、Q114H、V127D、C162stop、K179E。
本发明的多肽同样可以包含：
a)氨基酸序列SEQ ID NO.2，或
b)包含氨基酸序列SEQ ID NO.2中24-189位之间所含氨基酸的氨基酸序列，
应当理解，a)和b)中的每个氨基酸序列均包含至少一个下列编码SNP：A42G、Q102K、Q114H、V127D、C162stop、K179E。
本发明的多肽可以更特别由以下序列组成：
a)氨基酸序列SEQ ID NO.2，或
b)包含氨基酸序列SEQ ID NO.2中24-189位之间所含氨基酸的氨基酸序列，
应当理解，a)和b)中的每个氨基酸序列均包含至少一个下列编码SNP：A42G、Q102K、Q114H、V127D、C162stop、K179E。
优选地，本发明的多肽包含选自A42G、Q102K、Q114H、V127D、C162stop和K179E的单个编码SNP。
本发明的目的同样在于制备上述多肽的方法，其中在培养基中培养前面定义的宿主细胞，并从培养基中分离该多肽。
按照本领域技术人员熟知的方法，例如利用诸如盐、特别是硫酸铵、乙醇、丙酮或三氯乙酸等离液剂沉淀；酸提取；离子交换层析；磷酸纤维素层析；疏水作用层析；亲合层析；羟基磷灰石层析或排阻层析，可以从宿主细胞的培养基中纯化所述多肽。
″培养基″可理解为从中分离或纯化本发明多肽的培养基。该培养基可以由细胞外培养基和/或细胞裂解物组成。如果该多肽的构象在分离或纯化期间改变，同样可以利用本领域技术人员熟知的方法恢复该多肽的活性构象。
抗体
本发明的目的还在于获得免疫特异性抗体的方法。
″抗体″可理解为包括单克隆、多克隆、嵌合、单链、人源化抗体以及Fab片段，包括Fab或免疫球蛋白表达文库产物。
利用本发明的多肽免疫动物，可以获得免疫特异性抗体。
本发明还涉及前面定义的本发明多肽的免疫特异性抗体。
本发明的多肽、其片段之一、类似物、其变体之一或表达该多肽的细胞，也可以用来产生免疫特异性抗体。
术语″免疫特异性″是指该抗体对于本发明的多肽比对于现有技术已知的其它多肽具有更好的亲合力。
按照本领域技术人员熟知的方法，将本发明的多肽、其片段之一、类似物或表位片段、或表达该多核苷酸的细胞给予哺乳动物、优选非人哺乳动物，可以获得免疫特异性抗体。
为制备单克隆抗体，可以从细胞系开始，使用抗体制备的典型方法，例如杂交瘤技术(Kohler等人，Nature(1975)256：495-497)，三源杂交瘤(trioma)技术，人B细胞杂交瘤技术(Kozbor等人，Immunology Today(1983)4：72)以及EBV杂交瘤技术(Cole等人，″The EBV-hybridoma technique and its application to human lungcancer，″Monoclonal Ant ibodies and Cancer Therapy(27卷，UCLASymposia on Molecular and Cellular Biology，New Series)(R.A.Reisfeld和S.Sell编著)，77-96页，Alan R.Liss，Inc.N.Y.，1985，pp.77-96)。
同样可以使用单链抗体制备技术，例如美国专利4,946,778所述。
诸如小鼠等转基因动物同样可以用来制备人源化抗体。
与本发明多肽相互作用的试剂
本发明的目的同样在于鉴定活化或抑制本发明多肽的试剂的方法，其包含：
a)制备包含本发明的含有至少一个SNP的多核苷酸的重组载体，
b)制备包含a)中重组载体的宿主细胞，
c)将b)中宿主细胞接触待测试剂，以及
d)确定待测试剂产生的活化或抑制作用。
本发明的多肽还可以用于筛选与其相互作用的化合物的方法。
这些化合物可以是本发明多肽固有活性的活化剂(激动剂)或抑制剂(拮抗剂)。这些化合物同样可以是本发明多肽的配基或底物。参见Coligan等人，Current Protocols in Immunology 1(2)，Chapter 5(1991)。
一般而言，为实施上述方法，最理想的是制备表达本发明多肽的合适的宿主细胞。上述细胞可以是，例如哺乳动物、酵母、昆虫(例如果蝇)或细菌(例如大肠杆菌)的细胞。
然后将这些细胞或这些细胞的膜提取物置于待测化合物的存在下。
然后观察该待测化合物与本发明多肽的结合力以及对功能性反应的抑制或活化作用。
使用直接或间接标记的待测试剂，可以进行上述方法的步骤d)。还可以包括一个使用标记或非标记的试剂以及标记的竞争剂的竞争试验。
同样可以利用根据待检信号而适当选择的检测方法，确定待检试剂是否对表达本发明多肽的细胞产生活化或抑制信号。
上述活化或抑制剂可以是多核苷酸、在某些情况下是寡核苷酸或多肽，例如蛋白质或抗体。
本发明的目的还在于鉴定受本发明多肽活化或抑制的试剂的方法，其包含：
a)制备包含本发明的含有至少一个SNP的多核苷酸的重组载体，
b)制备包含a)中重组载体的宿主细胞，
c)将b)中宿主细胞置于待测试剂的存在下，以及
d)确定该多肽对待测试剂产生的活化或抑制作用。
受本发明多肽活化或抑制的试剂是在该多肽存在下，分别对活化或抑制反应的试剂。受本发明多肽直接或间接活化或抑制的试剂可以由多肽例如膜或核受体、激酶并更优选酪氨酸激酶、转录因子或多核苷酸组成。
疾病检测
本发明目的还在于分析受试者中本发明多核苷酸和/或本发明多肽的生物学特性的方法，其包含以下至少一项：
a)确定受试者基因组中存在或缺少本发明的多核苷酸；
b)确定受试者中本发明的多核苷酸的表达水平；
c)确定在受试者中存在或缺少本发明的多肽；
d)确定在受试者中本发明多肽的浓度；和/或
e)确定受试者中本发明多肽的功能性。
可分析受试者或受试者样品中这些生物学特性。
这些生物学特性可进行遗传诊断和确定受试者是否患有与存在本发明多核苷酸和/或本发明多肽有关的疾病、不适或病症，或具有患有疾病、不适或病症的危险，或反之具有对疾病、不适或病症形成的部分抗性。
这些疾病可以是病症和/或人类疾病，例如癌症和肿瘤、传染病、性病、免疫相关疾病和/或自身免疫疾病和病症、心血管疾病、代谢疾病、中枢神经系统疾病、以及与化学治疗有关的疾病。
所述癌症和肿瘤包括，包含转移的肾癌、黑色素瘤的恶性肿瘤、包含滤泡性淋巴瘤和皮肤T细胞淋巴瘤的淋巴瘤、包含毛样细胞白血病、慢性淋巴细胞性白血病和慢性骨髓性白血病的白血病、肝癌、颈癌、头癌和肾癌、多发性骨髓瘤、类癌瘤以及包含AIDS情况下的Kaposi肉瘤在内的伴随免疫缺陷出现的肿瘤。
所述传染病包括病毒性传染，包含慢性乙型和丙型肝炎以及HIV/AIDS，感染性肺炎以及性病，例如生殖器疣。
所述免疫和自身免疫相关疾病可能包括组织或器官移植排斥、变态反应、哮喘、银屑病、类风湿性关节炎、多发性硬化、克罗恩氏病以及溃疡性结肠炎。
所述代谢疾病可能包括上述非免疫相关性疾病，例如肥胖症。
所述中枢神经系统疾病可能包括阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、精神分裂症和抑郁症。
所述疾病和病症还可能包括创伤愈合、透析患者的贫血以及骨质疏松症。
该方法还可遗传诊断受试者中与存在本发明SNP编码的突变等位基因有关的疾病或疾病抗性。
优选在步骤a)中检测包含前面定义的至少一个编码SNP的多核苷酸的存在与否。
可以从所研究受试者的生物样品(例如细胞、血液、尿、唾液)、或其活检或尸检样品开始，检测该多核苷酸。例如，可使用基因组DNA直接或于PCR扩增后进行检测。同样可按类似方式使用RNA或cDNA。
然后可将本发明多核苷酸的核苷酸序列与受试者基因组中检测到的核苷酸序列作比较。
可以通过测序、DNA杂交方法、DNA片段在有或无变性剂的电泳凝胶中的迁移率差异、或解链温度差异，进行核苷酸序列的比较。参见Myers等人，Science(1985)230：1242。利用核酸酶保护试验(例如RNase和S1核酸酶)或化学裂解剂，同样可以揭示核苷酸序列精确位点的上述结构改变。参见Cotton等人，Proc.Nat.Acad.Sci.USA(1985)85：4397-4401。同样可以利用包含本发明多核苷酸片段的寡核苷酸探针进行筛选。
许多为本领域技术人员所熟知的方法可用于确定本发明多核苷酸的表达，并鉴定这些多核苷酸的遗传变异性(参见Chee等人，Science(1996)，Vol 274，pp 610-613)。
在步骤b)中，按照本领域技术人员熟知的方法，例如PCR、RT-PCR、RNase保护、Northern印迹及其它杂交方法，定量该多核苷酸编码的RNA(及编码多肽)的水平，可测定该多核苷酸的表达水平。
在步骤c)和d)中，利用公知的方法，例如放射免疫测定、竞争性结合试验、Western印迹和ELISA试验，可以测定本发明多肽在受试者或来自受试者样品中的存在与否及其浓度。
步骤d)之后，测定的本发明多肽的浓度可与通常在受试者中发现的天然野生型蛋白质的浓度相比。
本领域技术人员借助于现有技术文献或诸如前述常规试验或测定，可以确定对以上所致疾病、不适或病症表现出敏感性或反之抗性的高低阈值。
在步骤e)中，利用本领域技术人员熟知的方法，例如上述体外试验，或使用表达本发明多肽的宿主细胞，可以测定本发明多肽的功能性。
治疗性化合物及疾病治疗
本发明的目的还在于包含本发明多肽作为活性剂的治疗性化合物。
本发明还涉及本发明多肽的用途，用于制备意在预防或治疗各种人类病症和/或疾病的治疗性化合物。这些疾病可以是病症和/或人类疾病，例如癌症和肿瘤、传染病、性病、免疫相关疾病和/或自身免疫疾病和异常、心血管疾病、代谢疾病、中枢神经系统疾病、以及与化学治疗有关的病症。
所述癌症和肿瘤包括，包含转移的肾癌、黑色素瘤的恶性肿瘤、包含滤泡性淋巴瘤和皮肤T细胞淋巴瘤的淋巴瘤、包含毛样细胞白血病、慢性淋巴细胞性白血病和慢性骨髓性白血病的白血病、肝癌、颈癌、头癌和肾癌、多发性骨髓瘤、类癌瘤以及包含AIDS情况下的Kaposi肉瘤的伴随免疫缺陷出现的肿瘤。
所述传染病包括病毒性传染，包含慢性乙型和丙型肝炎以及HIV/AIDS，感染性肺炎以及性病，例如生殖器疣。
所述免疫和自身免疫相关疾病可能包括组织或器官移植排斥、变态反应、哮喘、银屑病、类风湿性关节炎、多发性硬化、克罗恩氏病以及溃疡性结肠炎。
所述代谢疾病可能包括上述非免疫相关性疾病，例如肥胖症。
所述中枢神经系统疾病可能包括阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、精神分裂症和抑郁症。
所述疾病和病症还可能包括创伤愈合、透析患者的贫血以及骨质疏松症。
优选地，本发明的多肽还可以用于制备意在预防或治疗各种人类病症和/或疾病的治疗性化合物，例如某些病毒性感染，如乙型和丙型慢性肝炎，白血病例如毛样细胞白血病和慢性骨髓性白血病，多发性骨髓瘤、滤泡性淋巴瘤、类癌瘤、恶性黑色素瘤、转移性肾癌、阿尔茨海默氏病、帕金森氏病以及伴随免疫缺陷出现的肿瘤，例如在AIDS情况下的Kaposi肉瘤、以及生殖器疣或性病。
可以获得本发明多肽的某些化合物以及通过或由该多肽获得或鉴定的化合物同样可以作为治疗性化合物，用于治疗人体。
正因为如此，本发明的目的还在于包含含有至少一个前面定义的编码SNP的本发明多核苷酸、前面定义的重组载体、前面定义的宿主细胞、和/或前面定义的抗体作为活性剂的药物。
本发明还涉及包含至少一个前面定义的编码SNP的本发明多核苷酸、前面定义的重组载体、前面定义的宿主细胞、和/或前面定义的抗体的用途，用于制备意在预防或治疗各种人类病症和/或疾病的药物。这些疾病可以是病症和/或人类疾病，例如癌症和肿瘤、传染病、性病、免疫相关疾病和/或自身免疫疾病和病症、心血管疾病、代谢疾病、中枢神经系统疾病、以及与化学治疗有关的疾病。
所述癌症和肿瘤包括，包含转移的肾癌、黑色素瘤的恶性肿瘤、包含滤泡性淋巴瘤和皮肤T细胞淋巴瘤的淋巴瘤、包含毛样细胞白血病、慢性淋巴细胞性白血病和慢性骨髓性白血病在内的白血病、肝癌、颈癌、头癌和肾癌、多发性骨髓瘤、类癌瘤以及包含AIDS情况下的Kaposi肉瘤的伴随免疫缺陷出现的肿瘤。
所述传染病包括病毒性传染，包含慢性乙型和丙型肝炎以及HIV/AIDS，感染性肺炎以及性病，例如生殖器疣。
所述免疫和自身免疫相关疾病可能包括组织或器官移植排斥、变态反应、哮喘、银屑病、类风湿性关节炎、多发性硬化、克罗恩氏病以及溃疡性结肠炎。
所述代谢疾病可能包括上述非免疫相关性疾病，例如肥胖症。
所述中枢神经系统疾病可能包括阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、精神分裂症和抑郁症。
所述疾病和病症还可能包括创伤愈合、透析患者的贫血以及骨质疏松症。
优选地，本发明涉及包含至少一个前面定义的SNP的本发明多核苷酸、前面定义的重组载体、前面定义的宿主细胞、和/或前面定义的抗体的用途，用于制备意在预防或治疗各种人类病症和/或疾病的药物，例如某些病毒性感染，如乙型和丙型慢性肝炎，白血病例如毛样细胞白血病和慢性骨髓性白血病，多发性骨髓瘤、滤泡性淋巴瘤、类癌瘤、恶性黑色素瘤、转移性肾癌、阿尔茨海默氏病、帕金森氏病以及伴随免疫缺陷出现的肿瘤，例如在AIDS情况下的Kaposi肉瘤，以及生殖器疣或性病。
本发明用作活性剂的多肽和其它化合物的剂量取决于所选择的化合物、治疗适应症、给药方式、制剂性质、受试者性质及医生的判断。
用作活性剂时，一般按1-100μg/kg受试者的剂量给予本发明的多肽。
本发明的目的还在于药物组合物，其包含至少一种上述化合物，例如本发明的多肽、包含至少一个前面定义的SNP的本发明多核苷酸、前面定义的重组载体、前面定义的宿主细胞、和/或前面定义的抗体作为活性剂，以及药物可接受的赋形剂。
该活性剂有利地以生理有效剂量存在于这些药物组合物中。
例如，这些药物组合物可以是固体或液体，并以目前用于人类医学的药物形式存在，例如简单或包衣片剂、软胶囊(gelcap)、颗粒剂、焦糖剂、栓剂、优选可注射制剂和可注射用粉末。可以按照常用方法制备这些药物形式。
活性剂可以掺入通常用于药物组合物的赋形剂，例如滑石粉、阿拉伯胶、乳糖、淀粉、葡萄糖、甘油、乙醇、硬脂酸镁、可可脂、含水或无水载体、动物或植物来源的脂质、石蜡衍生物、乙二醇、各种湿润剂、分散剂或乳化剂、防腐剂。
本发明的活性剂可以单独使用或与其它化合物联用，例如治疗性化合物，诸如白细胞介素或干扰素等其它细胞因子。
根据给药方式，调整该药物组合物的不同剂型。
可以通过本领域技术人员已知的不同给药途径，给予该药物组合物。
本发明的目的同样在于诊断性组合物，其包含至少一种上述化合物(例如本发明的多肽、本发明多核苷酸的全部或部分、前面定义的重组载体、前面定义的宿主细胞、和/或前面定义的抗体)作为活性剂，以及合适的药物可接受的赋形剂。
该诊断性组合物可包含，例如一般用于诊断性组合物的合适的赋形剂，诸如缓冲液和防腐剂。
本发明的目的同样在于下列的用途：
a)治疗有效量的本发明多肽，和/或
b)本发明的多核苷酸，和/或
c)前面定义的来自所需治疗受试者的宿主细胞，
以制备意在增加本发明多肽在受试者中表达或活性的治疗性化合物。
因此，为治疗需要增加本发明多肽表达或活性的受试者，可能有几种方法。
可给予受试者治疗有效量的本发明多肽，连同药物可接受的赋形剂。
还可通过给予受试者本发明的多核苷酸，增加本发明多肽的内源性生成。例如，可以将该多核苷酸插入逆转录病毒表达载体。利用包含编码本发明多肽的RNA的逆转录病毒质粒载体感染细胞，以使转导细胞产生包含目的基因的感染性病毒颗粒，可以从该细胞开始分离上述载体。参见Human Molecular Genetics，Strachan和Read，第20章，Gene Therapy and other Molecular Genetic-based TherapeuticApproaches，BIOS Scientifics Publishers Ltd(1996)。
根据本发明，优选使用如上定义的包含至少一个编码SNP的多核苷酸。
同样可给予受试者属于自身的宿主细胞，预先取出这些宿主细胞，并如前所述进行修饰，使其表达本发明多肽。
本发明同样涉及：
a)治疗有效量的前面定义的免疫特异性抗体，和/或
b)可抑制本发明多核苷酸表达的多核苷酸的用途，
以便制备意在降低本发明多肽在受试者中表达或活性的治疗性化合物。
因此，可给予受试者治疗有效量的诸如前面定义的抑制剂和/或抗体，可能联用，连同药物可接受的赋形剂。
通过给予受试者可抑制本发明多核苷酸表达的本发明的互补多核苷酸，同样有可能降低本发明多肽的内源性生成。
优选使用如上定义的包含至少一个编码SNP的互补多核苷酸。
本发明还涉及IFNα-21蛋白质在制备药物中的用途，用于预防或治疗具有IFNα-21变体所致病症或疾病的患者，该变体与该患者基因组存在与核苷酸序列SEQ ID NO.1具有至少95％同一性(优选97％同一性、更优选99％同一性、特别优选100％同一性)的核苷酸序列有关，只要该核苷酸序列包含下列SNP之一：c794g、c973a、g1011c、t1049a、t1155a、a1204g、t1265c、t1277c。
优选地，该药物用于预防或治疗选自下列之一的疾病：癌症和肿瘤、传染病、性病、免疫相关疾病和/或自身免疫疾病和病症、心血管疾病、代谢疾病、中枢神经系统疾病以及与化学治疗有关的疾病。
所述癌症和肿瘤包括，包含转移的肾癌、黑色素瘤的恶性肿瘤、包含滤泡性淋巴瘤和皮肤T细胞淋巴瘤的淋巴瘤、包含毛样细胞白血病、慢性淋巴细胞性白血病和慢性骨髓性白血病的白血病、肝癌、颈癌、头癌和肾癌、多发性骨髓瘤、类癌瘤以及包含AIDS情况下的Kaposi肉瘤的伴随免疫缺陷出现的肿瘤。
所述传染病包括病毒性传染，包含慢性乙型和丙型肝炎以及HIV/AIDS，感染性肺炎以及性病，例如生殖器疣。
所述免疫和自身免疫相关疾病可能包括组织或器官移植排斥、变态反应、哮喘、银屑病、类风湿性关节炎、多发性硬化、克罗恩氏病以及溃疡性结肠炎。
所述代谢疾病可能包括上述非免疫相关性疾病，例如肥胖症。
所述中枢神经系统疾病可能包括阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、精神分裂症和抑郁症。
所述疾病和病症还可能包括创伤愈合、透析患者的贫血以及骨质疏松症。
包含本发明SNP的IFNα-21多肽的类似(mimetic)化合物
本发明还涉及具有与下列多肽基本类似的生物活性的新化合物：
a)氨基酸序列SEQ ID NO.2，或
b)包含氨基酸序列SEQ ID NO.2中24-189位之间所含氨基酸的氨基酸序列；
只要a)和b)中所述氨基酸序列包含SNP K179E。
例如，如实验部分所述，通过测定刺激树突状细胞成熟的能力、CD4+或CD8+T淋巴细胞释放细胞因子、单核细胞释放细胞因子、体外或体内抗病毒活性、对Daudi Burkitt细胞系的细胞抗增殖活性、对TF-1细胞系的细胞抗增殖活性，可评价所述生物活性。
如实验部分所述，K179E突变型IFNα-21在下列方面不同于野生型IFNα-2：
*K179E突变型IFNα-21具有较强的刺激树突状细胞成熟的能力；
*K179E突变型IFNα-21具有较强的刺激CD4+或CD8+T淋巴细胞释放IFN-γ的能力；
*K179E突变型IFNα-21在感染VSV的细胞培养物中具有低于野生型IFNα-2的抗病毒活性。
如实验部分所述，K179E突变型IFNα-21对Daudi Burkitt细胞系具有略微低于天然野生型IFNα-21的细胞抗增殖活性。
同样如实验部分所述，K179E突变型IFNα-21对TF-1细胞系具有类似于野生型IFNα-2的细胞抗增殖活性，在EMCV小鼠模型中具有类似于野生型IFNα-2的抗病毒活性。
如上定义的本发明的新化合物可能具有基本上类似于K179E突变型IFNα-21的生物活性。
根据所研究的生物活性类型，所述化合物可能还具有低于或高于K179E突变型IFNα-21的生物活性。
所述化合物可能是生物化学化合物，例如多肽或肽，或有机化学化合物，例如合成肽类似物。
本发明还涉及包含K179E SNP的本发明多肽在鉴定如上定义的化合物中的用途。
本发明还涉及鉴定本发明化合物的方法，其包含以下步骤：
a)确定待测化合物的生物活性，例如树突状细胞成熟、CD4+或CD8+T淋巴细胞释放细胞因子、单核细胞释放细胞因子、体外或体内抗病毒活性、对Daudi Burkitt细胞系的细胞抗增殖活性；
b)比较：
i)步骤a)测定的待测化合物的活性，与
ii)氨基酸序列SEQ ID NO.2的多肽的活性，或包含氨基酸序列SEQ ID NO.2中24-189位之间所含氨基酸的氨基酸序列的活性；只要该氨基酸序列包含K179E SNP；以及
c)根据步骤b)中进行的比较，确定该待测化合物是否具有比氨基酸序列SEQ ID NO.2的多肽、或与包含氨基酸序列SEQ ID NO.2中24-189位所含氨基酸的氨基酸序列基本类似、或低、或高的活性；只要该氨基酸序列包含K179E SNP。
优选该待测化合物可能预先鉴定自合成肽组合文库、高通量筛选、或由计算机辅助药物设计而设计，以具有与氨基酸序列SEQ ID NO.2的多肽、或包含氨基酸序列SEQ ID NO.2中24-189位所含氨基酸的氨基酸序列相同的三维结构；只要该氨基酸序列包含K179E SNP。
本发明还涉及具有与下列多肽基本类似的生物活性的新化合物：
a)氨基酸序列SEQ ID NO.2，或
b)包含氨基酸序列SEQ ID NO.2中24-189位之间所含氨基酸的氨基酸序列；
只要a)和b)中所述氨基酸序列包含SNP Q114H和V127D。
例如，如实验部分所述，通过测定刺激树突状细胞成熟的能力、CD4+或CD8+T淋巴细胞释放细胞因子、单核细胞释放细胞因子、体外或体内抗病毒活性、对Daudi Burkitt细胞系的细胞抗增殖活性、对TF-1细胞系的细胞抗增殖活性，可评价所述生物活性。
如实验部分所述，包含SNP Q114H和V127D两者的IFNα-21(所述双突变下文记作″Q114H/V127D″)在下列方面不同于野生型IFNα-2：
*Q114H/V127D突变型IFNα-21具有较高的刺激CD4+或CD8+T淋巴细胞释放IFN-γ的能力；
*Q114H/V127D突变型IFNα-21在感染VSV的细胞培养物中具有较低的抗病毒活性
如实验部分所述，Q114H/V127D突变型IFNα-21对Daudi Burkitt细胞系具有低于天然野生型IFNα-21的细胞抗增殖活性。
同样如实验部分所述，Q114H/V127D突变型IFNα-21在EMCV小鼠模型中具有类似于野生型IFNα-2的抗病毒活性、类似于野生型IFNα-2的刺激单核细胞释放IL-10、IL-12和TNF-α的能力、以及类似于野生型IFNα-2的对TF-1细胞系的细胞抗增殖活性。
如上定义的本发明新化合物可能具有基本类似于Q114H/V127D突变型IFNα-21的生物活性。
根据所研究的生物活性类型，所述化合物可能还具有低于或高于Q114H/V127D突变型IFNα-21的生物活性。
所述化合物可能是生物化学化合物，例如多肽或肽，或有机化学化合物，例如合成肽类似物。
本发明还涉及包含Q114H/V127D SNP的本发明多肽在鉴定如上定义的化合物中的用途。
本发明还涉及鉴定本发明化合物的方法，其包含以下步骤：
a)确定生物活性，例如树突状细胞成熟、CD4+或CD8+T淋巴细胞释放细胞因子、单核细胞释放细胞因子、体外或体内抗病毒活性、对Daudi Burkitt细胞系的细胞抗增殖活性；
b)比较：
i)步骤a)测定的待测化合物的活性，与
ii)氨基酸序列SEQ ID NO.2的多肽的活性，或包含氨基酸序列SEQ ID NO.2中24-189位之间所含氨基酸的氨基酸序列的活性；
只要该氨基酸序列包含Q114H/V127D SNP；以及
c)根据步骤b)中进行的比较，确定该待测化合物是否具有与氨基酸序列SEQ ID NO.2的多肽、或包含氨基酸序列SEQ ID NO.2中24-189位所含氨基酸的氨基酸序列基本类似、或更低、或更高的活性；只要该氨基酸序列包含Q114H/V127D SNP。
优选该待测化合物可能预先鉴定自合成肽组合文库、高通量筛选、或由计算机辅助药物设计而设计，以具有与氨基酸序列SEQ ID NO.2的多肽、或包含氨基酸序列SEQ ID NO.2中24-189位所含氨基酸的氨基酸序列相同的三维结构；只要该氨基酸序列包含Q114H/V127DSNP。
鉴定和设计化合物的方法为本领域技术人员所熟知。
例如，关于这些方法的文献可能有：
-Silverman R.B.(1992).″Organic Chemistry of Drug Designand Drug Action″.Academic Press，1st edition(January 15，1992).
-Anderson S和Chiplin J.(2002).″Structural genomics；shaping the future of drug design″Drug Discov.Today.7(2)：105-107.
-Selick HE，Beresford AP，Tarbit MH.(2002).″The emergingimportance of predictive ADME simulation in drug discovery″.Drug Discov.Today.7(2)：109-116.
-Burbidge R，Trotter M，Buxton B，Holden S.(2001).″Drugdesign by machine learning：support vector machines forpharmaceutical data analysis″.Comput.Chem.26(1)：5-14.
-Kauvar L.M.(1996).″Peptide mimetic drugs：a comment onprogress and prospects″14(6)：709.
本发明的药物可用于制备意在预防或治疗选自下列疾病之一的药物：癌症和肿瘤、传染病、性病、免疫相关疾病和/或自身免疫疾病和病症、心血管疾病、代谢疾病、中枢神经系统疾病以及与化学治疗有关的疾病。
所述癌症和肿瘤包括，包含转移的肾癌、黑色素瘤的恶性肿瘤、包含滤泡性淋巴瘤和皮肤T细胞淋巴瘤的淋巴瘤、包含毛样细胞白血病、慢性淋巴细胞性白血病和慢性骨髓性白血病的白血病、肝癌、颈癌、头癌和肾癌、多发性骨髓瘤、类癌瘤以及包含AIDS情况下的Kaposi肉瘤在内的伴随免疫缺陷出现的肿瘤。
所述传染病包括病毒性传染，包含慢性乙型和丙型肝炎以及HIV/AIDS，感染性肺炎以及性病，例如生殖器疣。
所述免疫和自身免疫相关疾病可能包括组织或器官移植排斥、变态反应、哮喘、银屑病、类风湿性关节炎、多发性硬化、克罗恩氏病以及溃疡性结肠炎。
所述代谢疾病可能包括上述非免疫相关性疾病，例如肥胖症。
所述中枢神经系统疾病可能包括阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、精神分裂症和抑郁症。
所述疾病和病症还可能包括创伤愈合、透析患者的贫血以及骨质疏松症。
本发明的化合物可能用于制备意在预防或治疗选自下列疾病的药物：某些病毒性感染，如乙型和丙型慢性肝炎，白血病例如毛样细胞白血病和慢性骨髓性白血病，多发性骨髓瘤、滤泡性淋巴瘤、类癌瘤、恶性黑色素瘤、转移性肾癌、阿尔茨海默氏病、帕金森氏病以及伴随免疫缺陷出现的肿瘤，例如在AIDS情况下的Kaposi肉瘤，以及生殖器疣或性病。
实验部分
实施例1：包含SNP c794g、c973a、g1011c、t1049a、t1155a、 a1204g的核苷酸序列的多核苷酸编码的蛋白质以及野生型参考基因 的核苷酸序列编码的蛋白质的模建。
第一步，从得自PDB数据库(编码1ITF)的IFNα-2结构开始，利用软件Modeler(MSI，San Diego，CA)，构建IFNα-21的三维结构。
然后修饰该成熟多肽的片段，以便复制突变A19G、Q79K、Q91H、V104D、C139stop和K156E。
利用程序AMBER和DISCOVER(MSI：Molecular SimulationsInc.)，对该突变片段进行1000次分子最小化步骤。
然后利用相同程序和相同势场，进行两次分子动态计算运行。
在所有情况下，于300°K计算50,000步，由300个平衡步终止。
模建结果由图1、2、3、4和5所示。
实施例2：个体群中SNP c794g、c973a、g1011c、t1049a、t1155a、 a1204g的基因分型
SNP的基因分型是根据微型测序原理，其中通过读取偏振荧光进行产物检测。该技术由荧光微型测序(FP-TDI技术或荧光偏振模板直接染料终止物掺入)组成。
对群体中每一个体基因组DNA的PCR扩增产物进行微型测序。选择PCR产物，使其包括含待基因分型的SNP的基因区域。去除未使用的PCR引物以及未掺入的dNTP，然后进行微型测序。
微型测序包含利用聚合酶和荧光标记的双脱氧核苷酸，延长位于SNP位点紧上游的寡核苷酸引物。通过读取偏振荧光，直接分析该延伸过程产生的产物。
所有这些步骤及读取，均在同一PCR平板上进行。
因此，基因分型需要5个步骤：
1)PCR扩增
2)利用酶促消化纯化PCR产物
3)寡核苷酸引物延伸
4)读取
5)解读
每一SNP c794g、c973a、g1011c、t1049a、t1155a、a1204g均在相同条件下进行基因分型步骤1和2。步骤3、4和5针对其中每一多态性是特异的。
1)从来自不同种族来源的268位个体的基因组DNA开始，进行IFNα-21基因核苷酸序列的PCR扩增。
美国Coriell Institute提供了这些基因组DNA。
该268位个体分布如下：
系统发生的群体                              特定种族的群体        总计   ％
非裔美国人美洲印第安人加勒比人欧洲高加索人墨西哥人东北亚人非欧洲高加索人东南亚人南美人 非裔美国人            50   100.0小计  50   18.7南美安迪斯人          10   66.7西南美国印地安人      5    33.3小计  15   5.6加勒比人              10   100.0小计  10   3.7北美高加索人          79   79.8伊比利亚人            10   10.1意大利人              10   10.1小计  99   36.9墨西哥人              10   100.0小计  10   3.7中国人                10   50.0日本人                10   50.0小计  20   7.5希腊人                8    21.6印度-巴基斯坦人       9    24.3中东人                20   54.1小计  37   13.8太平洋岛民            7    41.2南亚人                10   58.8小计  17   6.3南美人                10   100.0小计  10   3.7
                                  总计  268  100
来自其中每一个体的基因组DNA构成一个样品。
所有SNP的PCR扩增均开始于下列引物：
SEQ ID NO.5：有义引物：GGTTCAAGGTTACCCATCTC
SEQ ID NO.6：反义引物：TTTGAAATGGCAGAAGTCAT
这些核苷酸序列可以扩增具有核苷酸序列SEQ ID NO.1中620-1315位核苷酸的696个核苷酸长度的片段。
每个SNP均以PCR产物作为微型测序的模板。
每个样品PCR反应的总反应体积为5μl。
该反应体积由下表所示试剂组成：
供应商 参考 反应物 初浓度   体积/管(μl) 终浓度
 LifeTechnology 连同Taq附送 缓冲液(X) 10 0.5 1
 LifeTechnology 连同Taq附送 MgSO4(mM) 50 0.2 2
 AP Biotech     27-2035-03     dNTPs(mM)     10     0.1     0.2
    函索    有义引物(μM)     10     0.1     0.2
    函索    反义引物(μM)     10     0.1     0.2
 LifeTechnology 11304-029 Taq platinum 5U/μl 0.02 0.1U/反应
    H20     Qsp 5μl     1.98
    DNA(样品)     2.5ng/μl     2     5ng/反应
    总体积     5μl
这些试剂分布于ABGene提供的具有384孔的黑色PCR平板中(ref：TF-0384-k)。将该平板密封、离心，然后置于用于384孔平板的热循环仪(MJ Research的Tetrad)，进行下列温育：PCR循环：94℃1分钟，继之以3个步骤的36个循环(94℃ 15秒、56℃ 30秒、68℃1分钟)。
2)然后利用两种酶：虾碱性磷酸酶(SAP)和核酸外切酶I(Exo I)纯化PCR扩增产物。其中第一种酶使PCR扩增期间未掺入的dNTP去磷酸化，第二种酶去除单链DNA残基，特别是PCR期间未使用的引物。
在PCR平板的每个孔中，每种样品加入5μl反应混合物，进行消化。该反应混合物由以下试剂组成：
供应商     参考资料     反应物   初浓度   体积/管(μl)   终浓度
AP Biotech     E70092X     SAP   1U/μl     0.5   0.5/反应
AP Biotech 070073Z Exo I 10U/μl 0.1 1/反应
AP Biotech 连同SAP提供 缓冲液SAP(X) 10 0.5 1
    H2O   Qsp 5μl     3.9
    PCR产物     5μl
    总体积     10μl
加样后，将平板密封、离心，然后置于用于384孔平板的热循环仪(MJ Research的Tetrad)，进行下列温育：SAP-EXO消化：37℃ 45分钟、80℃ 15分钟。
加入每个制备的样品5μl反应混合物，对消化的PCR产物进行延伸或微型测序步骤。
微型测序步骤3)、读取步骤4)以及解读步骤5)针对每一SNPc794g、c973a、g1011c、t1049a、t1155a、a1204g是特异的。
下文描述了所有这些步骤，详述了其中每个多态性所使用的特定条件。
3)微型测序
根据对应于位于本发明SNP位点上游的核苷酸序列，确定基因分型所需的两个微型测序引物的序列。包含该SNP的PCR产物是双链DNA产物，因此可以对有义链或反义链进行基因分型。所选引物由LifeTechnologies Inc制备。
下表显示针对每一SNP已经测试的微型测序的引物序列以及用于基因分型的最佳条件：
 SNP                      待测引物 基因分型的最适条件
 c794g  SEQ ID NO.7：正义 gagggccttgatactcctggSEQ ID NO.8：反义    gagagattcttcccatttgt 反义引物    +ddGTP-R110+ddCTP-Tamra
 c973a  SEQ ID NO.9：正义 actcatctgctacttgggaaSEQ ID NO.10：反义    aaatttttctaggaggctct 反义引物    +dGTP-R110+ddTTP-Tamra
 g1011c  SEQ ID NO.11：正义 ttttccactgaacttaaccaSEQ ID NO.12：反义    gcttccaggtcattcagctg 反义引物    +ddGTP-R110+ddCTP-Tamra
 t1049a  SEQ ID NO.13：正义 agcctgcgtgatacaggaggSEQ ID NO.14：反义    ggggagtctcttccacccca 反义引物    +ddATP-R110+ddTTP-Tamra
 t1155a  SEQ ID NO.15：正义 gagaagaaatacagcccttgSEQ ID NO.16：反义    gctctgacaacctcccaggc 反义引物    +ddATP-R110+ddTTP-Tamra
 a1204g  SEQ ID NO.17：正义 tgagatccttctctttatcaSEQ ID NO.18：反义    taatctttcttgaaaaattt 正义引物  +ddGTP-R110+ddATP-Tamra
首先利用16个样品验证SNP的微型测序，然后对由268位个体和10个对照组成的一组个体群进行基因分型。
然后如下表所示，进行延伸或微型测序步骤：
供应商 参考资料 反应物 初浓度    体积/管(μl) 终浓度
  自己制备   延伸缓冲液1(X)   5     1     1
  LifeTechnologies 函索   微型测序引物(μM)A或B 10 0.5 1
AP Biotech   27-2051(61，71，81)-01   ddNTPs2(μM)2个未标记 各2.5 0.25 各0.125
NEN   Nel 472/5和Nel492/5   ddNTPs2(μM)2个标记Tamra和R110 各2.5 0.25 各0.125
AP Biotech E79000Z 热测序酶 3.2U/μl 0.125     0.4U/反应
  H2O   Qsp 5μl     3.125
  消化的PCR产物     10
  总体积     15
15X延伸缓冲液由250mM Tris-HCl pH9、250mM KCl、25mMNaCl、10mM MgCl2和40％甘油组成。
2对于ddNTP，根据研究的多态性使用4种碱基的混合物。只有构成功能性SNP的2种目的碱基(野生型核苷酸/突变的核苷酸)标记Tamra或R110。例如：
对于SNP c973a，ddNTP的混合物由以下组成：
-2.5μM未标记ddCTP，
-2.5μM未标记ddATP，
-2.5μM ddTTP(1.875μM未标记ddTTP以及0.625μM Tamra标记的ddTTP)，
-2.5μM ddGTP(1.875μM未标记ddGTP以及0.625μM R110标记的ddGTP)。
加样后，将平板密封、离心，然后置于用于384孔平板的热循环仪(MJ Research的Tetrad)，进行下列温育：延伸循环：93℃ 1分钟、继之以35个由2个步骤组成的循环(93℃ 10秒、55℃ 30秒)。
在热循环仪最后步骤之后，将平板直接置于LJL Biosystems Inc的AnalystHT型偏振荧光阅读仪。利用Criterion Host软件，通过两种方法读取平板。第一种方法可利用Tamra特异性的发射和激发滤器(激发550-10nm、发射580-10nm)读取该荧光团标记的碱基，第二种方法可利用R110特异性的发射和激发滤器(激发490-10nm、发射520-10nm)读取该荧光团标记的碱基。两种情况均使用二色性的双反射镜(dichroic double mirror)(R110/Tamra)，其它的阅读参数为：
Z-高度：1.5mm
衰减器：关断
积分时间：100,000微妙
原始数据单位：计数/秒
偏振转换：按孔
平板稳定时间：0毫秒
PMT设置：精确读取(+)、灵敏度2
动态起偏镜：发射
静态起偏镜：S
从而获得包含Tamra滤器和R110滤器的mP(毫偏振度)计算值的文件结果。从平行面(//)和垂直面(⊥)所得强度值开始，按照下列公式，计算这些mP值：
                mP＝1000(//-g⊥)/(//+g⊥).
在该运算中，值⊥利用因子g权重。这是必须由预实验确定的机器参数。
步骤4)和5)解读并确定基因型。
利用Microsoft Inc.Excel软件、和/或LJL Biosystems Inc开发的Allele Caller软件，图解报告mP值。
横坐标表示Tamra标记碱基的mP值，纵座标表示R110标记碱基的mP值。强mP值表示掺入了该荧光团标记的碱基，反之，弱mP值表明该碱基未掺入。
可获得多达三个同源组的具有不同基因型的核苷酸序列。
一旦对不同组进行了鉴定，便可以使用Allele Caller软件，以表格形式直接获取所确定的每一个体的基因型。
SNP c794g、c973a、g1011c、t1049a、t1155a、a1204g的微型测 序结果
完成基因分型步骤以后，针对此处所研究的SNP，使用上述图形确定个体群中个体的基因型。
对于SNP c794g，理论上所测试个体的基因型为纯合子CC、或杂合子CG、或纯合子GG。实际上，如下所示，在个体群中未检测到纯合子基因型GG。
对于SNP c973a，理论上所测试个体的基因型为纯合子CC、或杂合子CA、或纯合子AA。实际上，如下所示，在个体群中未检测到纯合子基因型AA。
对于SNP g1011c，理论上所测试个体的基因型为纯合子GG、或杂合子GC、或纯合子CC。实际上，如下所示，在个体群中未检测到纯合子基因型CC。
对于SNP t1049a，理论上所测试个体的基因型为纯合子TT、或杂合子TA、或纯合子AA。实际上，如下所示，在个体群中未检测到纯合子基因型AA。
对于SNP t1155a，理论上所测试个体的基因型为纯合子TT、或杂合子TA、或纯合子AA。实际上，如下所示，在个体群中未检测到纯合子基因型AA。
对于SNP a1204g，理论上所测试个体的基因型为纯合子AA、或杂合子AG、或纯合子GG。实际上，如下所示，在个体群中未检测到纯合子基因型GG。
所测基因型在个体群中的分布以及计算所研究的6个SNP的不同等位频率的结果如下表所示：
系统发生的群体       总计                       c794g(A42G)
f     (95％ Cl)                CC  ％  CG ％  GG  ％                     总计
非裔美国人美洲印第安人加勒比人欧洲高加索人墨西哥人非欧洲高加索人东北亚人南美人东南亚人     501510991037201017 5,0   (0.7，9.3)2,9   (0，8.6)  45 90,0 5 1015 10010 10099 10010 10037 10020 10010 10016 94,1 1 5,9   501510991037201017
总计     268 1,1   (0.2， 2.0) 262 97,8 6 2,2   268
系统发生的群体       总计                     c973a(Q102K)
  f      (95％ Cl)               CC ％   CA  ％   AA  ％                  总计
非裔美国人美洲印第安人加勒比人欧洲高加索人墨西哥人非欧洲高加索人东北亚人南美人东南亚人     501510991037201017 1,5    (0，3.2)1,4    (0，4.0)   49 10015 10010 10096 97,0 3  3,09  10036 97.3 1  2,720 10010 10017 100   49151099937201017
总计     268   0,8    (0，1.5)  262 98,5 4  1,5   266
系统发生的群体       总计                     g1011c(Q114H)
f      (95％ Cl)               GG  ％   GC  ％  CC ％                    总计
非裔美国人美洲印第安人加勒比人欧洲高加索人墨西哥人非欧洲高加索人东北亚人南美人东南亚人     501510991037201017 0,5    (0，1.6) 49  10015  10010  10092  98,9 1  1,110  10037  10020  10010  10017  100   491510931037201017
总计     268 0,2    (0，0.6) 260 99,6 1  0,4   261
系统发生的群体     总计                    t1049a(V127D)
f      (95％ Cl)             TT  ％   TA  ％  AA  ％                    总计
非裔美国人美洲印第安人加勒比人欧洲高加索人墨西哥人非欧洲高加索人东北亚人南美人东南亚人   501510991037201017 1,0    (0，3.0) 48  98,0 1  2,014  10010  10098  10010  10037  10020  10010  10017  100  491410981037201017
总计   268 0,2    (0，0.6) 264 99,6 1  0,4  265
系统发生的群体       总计                    t1155a(C162Stop)
f      (95％ Cl)             TT   ％  TA   ％  AA ％                    总计
非裔美国人美洲印第安人加勒比人欧洲高加索人墨西哥人非欧洲高加索人东北亚人南美人东南亚人     501510991037201017 1,0    (0，3.0)3,6    (1.0，6.2) 48  98,0 1  2,015  1009   10091  92,9 7  7,110  10037  10020  10010  10017  100   49159981037201017
总计     268 1,5    (0.5，2.5) 257 97,0 8  3,0   264
系统发生的群体       总计                      a1204g(K179E)
f      (95％ Cl)              AA  ％   AG   ％    GG  ％                 总计
非裔美国人美洲印第安人加勒比人欧洲高加索人墨西哥人非欧洲高加索人东北亚人南美人东南亚人     501510991037201017 3,6    (0，10.4)1,0    (0，2.4)10,0   (0，23.1)2,7    (0，6.4)17,5   (5.7，29.3)5,0    (0，14.6) 50  10013  92,9 1  7,110  10097  98,0 2  2,08   80,0 2  20,035  94,6 2  5,413  65,0 7  35,09   90,0 1  10,017  100   501410991037201017
总计     268 2,8    (1.4，4.2) 252 94,4 15 5,6   267
在上表中
-N代表个体数目。
-％代表特定亚群中个体的百分比。
-等位频率代表特定亚群中突变等位基因的百分比。
-95％IC代表最小和最大的95％置信度区间。
必须说明，例如对于SNP c973a，反义读取的等位基因g对应于有义读取的等位基因c，并涉及未成熟IFNα-21蛋白质序列102位存在的谷氨酰胺(Q)，因而反义读取的等位基因t对应于有义读取的等位基因a，对应于相应蛋白质序列该位置的赖氨酸(K)。
通过按系统发生的群体以及按SNP考查这些结果，可以看出：
-对于SNP c794g，6个CG杂合子个体来自非裔美洲人和东南亚人亚群。
-对于SNP c973a，4个CA杂合子个体来自欧洲人和非欧裔高加索人亚群。
-对于SNP g1011c，唯一的GC杂合子个体来自欧裔高加索人亚群。
-对于SNP t1049a，唯一的TA杂合子个体来自非裔美洲人亚群。
-对于SNP t1155a，8个TA杂合子个体来自非裔美洲人和欧裔高加索人亚群。
-对于SNP a1204g，15个AG杂合子个体来自美洲印第安人、欧洲人和非欧裔高加索人、墨西哥人、东北亚人和南美人亚群。
实施例3.在酵母中表达天然野生型IFNα-21以及A42G、Q102K、 Q114H/V127D、K179E突变型IFNα-21
a)在真核生物表达载体pPicZα-topo中克隆天然野生型IFNα-21 和突变型IFNα-21
利用来自相应SNP杂合子个体的基因组DNA为模板，PCR扩增编码天然野生型IFNα-21成熟部分以及A42G、Q102K、Q114H/V127D、K179E突变型IFNα-21的核苷酸序列。
可以进行该扩增的PCR引物为：
SEQ ID NO.19：有义引物：TGTGATCTGCCTCAGACCCAC
SEQ ID NO.20：反义引物：TCATTCCTTCCTCCTTAATCTTTCTTG
将PCR产物插入真核生物表达载体pPicZα-TOPO，位于可甲醇诱导的杂合启动子AOX1控制下(TOPOTM-cloning；Invitrogen Corp.)。
该载体可使真核蛋白质在巴斯德毕赤氏酵母(Pichia pastoris)中异源表达。
在核对载体编码重组蛋白质区域的核苷酸序列之后，利用Pme1限制酶将载体线性化，并利用该重组表达载体转化巴斯德毕赤氏酵母菌株(Invitrogen)。
b)天然野生型IFNα-21和突变型IFNα-21蛋白质在巴斯德毕赤氏 酵母中的异源表达及纯化
将包含编码天然野生型IFNα-21或编码A42G、Q102K、Q114H/V127D或K179E突变型IFNα-21的克隆的两个50ml BMGY培养基(2％蛋白胨、1％酵母抽提物、1.34％YNB、1％甘油、100mM磷酸钾、0.4mg/L生物素pH6.0)的饱和前培养物在30℃、200转/分(rpm)振荡培养24-48小时。
当培养物达到饱和细胞密度时(相当于波长600nm下所测光密度12)，用来按5OD/mL接种到250ml BMMY培养基(2％蛋白胨、1％酵母抽提物、1.34％YNB、0.5％甲醇、100mM磷酸钾、0.4mg/L生物素pH6.0)。
然后利用终浓度1％的甲醇，将培养瓶于180转/分振荡下30℃诱导蛋白质表达24小时。
由于在编码序列上游存在″α因子″信号肽序列，酵母将蛋白质分泌于培养基中。α因子在加工过程中自然断裂。
将悬浮液离心，从所获上清开始，利用HPLC纯化蛋白质。
在开始前步骤，超滤(Labscale，截留5000Da，Millipore)后透析可使酵母上清在50mM Tris-Cl pH9.0、25mM NaCl的缓冲液中浓缩10倍。
第一个层析步骤可利用于蓝色琼脂糖凝胶柱(Amersham Pharmacia)的亲和回收蛋白质。一方面通过SDS PAGE型电泳，另一方面通过针对IFNα-21蛋白质的特异性抗体的免疫检测，证实在收集组分中存在该蛋白质。在此步骤，目的蛋白质的纯度高于75％。
在第二个纯化步骤中，凝胶过滤可使对应于IFNα-21蛋白质的收集组分利用50mM Tris pH9.0、25mM NaCl更换缓冲液。
最后的纯化步骤包括利用离子交换层析柱分离蛋白质。
将包含重组蛋白质的组分注入预先用Tris 50mM pH9、NaCl 25mM缓冲液平衡的阴离子交换柱(ResourceQ 6.0mL，Pharmacia)。通过0,025-1M NaCl梯度的Tris(50mM pH9)缓冲液的移动，进行蛋白质洗脱。
利用SDS/PAGE凝胶估计目的蛋白质的纯度，利用光密度法(Quantity one，Biorad)和BCA分析(bicinchoninic酸和硫酸铜，Sigma)测定蛋白质浓度。
按照该方案获得纯化的天然野生型IFNα-21以及A42G、Q102K、Q114H/V127D或K179E突变型IFNα-21蛋白质，最后按比例放大，生产大量蛋白质，用于下述功能测试。
实施例4.评价天然野生型IFNα-21以及A42G、Q114H/V127D或 K179E突变型IFNα-21的免疫调节活性
IFN I型(IFNα和IFNβ)能够调节免疫系统的某些功能。已经证明它们可增强树突状细胞(DC)成熟：增强MHC I类(HLA-ABC)和II类(HLA-DR)分子的表达，增强与T淋巴细胞共刺激有关的分子、CD80、CD86和CD83分子的表达，增强T淋巴细胞的刺激功能。
a)A42G、Q114H/V127D或K179E突变型IFNα-21对树突状细胞成熟的作用
首先研究A42G、Q114H/V127D或K179E突变型IFNα-21对树突状细胞成熟的免疫调节活性，并与选作商品化内含子A(Intron A)产物代表的野生型IFNα-2作比较。
为此，首先从利用GM-CSF和IL-4细胞因子培养的成人外周血单核细胞中生成树突状细胞。利用CD 14+细胞纯化试剂盒纯化以后，将这些树突状细胞置于100ng/ml野生型IFNα-2或A42G、Q114H/V127D或K179E突变型IFNα-21存在下，通过FACS分析确定其表现型，目的在于寻找MHC I类和II类分子以及CD40、CD80、CD86、CD83和CD1a标志的表达。这些树突状细胞的成熟状态也与未经IFNα处理所获树突状细胞相比，后者提供了未刺激树突状细胞的对照。
每个标志以及3次实验条件下测定的荧光强度平均值，按任意单位表示，如下表所示：
    HLAABC    HLA DR     CD40     CD80     CD86     CD83     CD1a
无刺激     64     133     24     25     14     15     26
野生型IFNα-2     87     281     331     76     45     15     155
A42G突变型IFNα-21     76     127     117     37     5     8     209
Q114H/V127D突变型IFNα-21 68 122 163 46 8 8 191
K179E突变型IFNα-21     181     322     491     87     44     14     127
该测试结果表明，K179E突变型IFNα-21蛋白质具有较高的刺激树突状细胞成熟的能力，该刺激效应高于野生型IFNα-2。
b)Q114H/V127D或K179E突变型IFNα-21对T淋巴细胞释放细胞因子的作用
将T淋巴细胞置于相应突变型IFNα-21蛋白质以及有或没有强抗原(SEB)的存在下，以模拟抗侵袭免疫应答，通过测定T淋巴细胞释放细胞因子，同样研究Q114H/V127D或K179E突变型IFNα-21的免疫调节活性。同样在用作对照并选作内含子A商品化产物代表的野生型IFNα-2存在下进行该测试。
为此，从健康供体分离外周血单核细胞(PBMC)，在包含抗CD3和抗CD28抗体或SEB的合适培养基中刺激16小时。每个培养物中加入4μg/mL野生型IFNα-2或Q114H/V127D、或K179E突变型IFNα-21。刺激之后，T淋巴细胞利用抗CD3、抗CD4和抗CD69抗体或抗CD3、抗CD8和抗CD69抗体细胞外标记，利用针对Th1型细胞因子(IFN-γ)或Th2型细胞因子(IL-10)的特异性抗体进行细胞内标记。利用FACScalibur和CellQuest软件分析荧光细胞。
所得结果表明，突变型IFNα-21蛋白质和野生型IFNα-2不刺激IL-10和IFN-γ的释放，因而在缺少SEB时并不活化T淋巴细胞。相反，突变型IFNα-21蛋白质和野生型IFNα-2刺激SEB活化的T淋巴细胞释放细胞因子(IL-10和IFN-γ)，如下表所示。该表显示T淋巴细胞在SEB存在下释放细胞因子，表示为CD4+CD69+细胞或CD8+CD69+细胞分别对于CD4+T淋巴细胞和CD8+T淋巴细胞的百分比，以及CD69+细胞占总细胞的百分比。
  T淋巴细胞     IFNγ     IL-10  CD69+细胞/总细胞
  CD4+CD69+   阴性对照     11.9     7.5     1.26
  野生型IFNα-2     19.6     24.68     2.7
  Q114H/V127DIFNα-21 38.9 14.6 4.67
  K179E IFNα-21     29.5     15.1     3.84
  CD8+CD69+   阴性对照     8.73     0.65     4.69
  野生型IFNα-2     16.37     4.26     10.02
  Q114H/V127DIFNα-21 32.24 4.91 14.98
  K179E IFNα-21     28.28     3.8     13.48
这些结果清楚表明，Q114H/V127D突变型IFNα-21和K179E突变型IFNα-21强烈刺激经SEB抗原预先活化的CD4+和CD8+T淋巴细胞释放细胞因子(IFNγ和IL-10)。在该测试中，T淋巴细胞产生的干扰素γ在Q114H/V127D突变型IFNα-21或K179E突变型IFNα-21存在下高于野生型IFNα-2存在条件下。
c)Q114H/V127D或K179E突变型IFNα-21对单核细胞释放细胞因子的作用
最后，通过在有或无细菌性毒剂(LPS)存在下测定单核细胞释放的细胞因子，研究Q114H/V127D或K179E突变型IFNα-21的免疫调节活性。同样在用作对照并选作内含子A商品化产物代表的野生型IFNα-2存在下进行该测试。
为此，从健康供体分离人外周血单核细胞(PBMC)，分析其表现型，以确定CD64+CD4dim细胞的相对量(CD64和CD4dim是血液单核细胞的标志)。过夜培养之后，将这些PBMC在单独的培养基(未刺激的细胞)或LPS存在下(刺激的细胞)培养。在每个培养物中加入4μg/mL野生型IFNα-2或突变型IFNα-21。培养后，利用抗CD64和抗CD4dim细胞外标记细胞，并利用针对Th1型细胞因子(TNF-α)、IL-12和IL-10的特异性抗体细胞内标记细胞。
利用FACScalibur和CellQuest软件分析荧光细胞。
所得结果表明，在缺少LPS时，突变型IFNα-21蛋白质和野生型IFNα-2不刺激细胞因子(IL-10、IL-12和TNF-α)的释放。相反，存在LPS时，Q114H/V127D和K179E突变型IFNα-21蛋白质以及野生型IFNα-2刺激单核细胞释放细胞因子(IL-10、IL-12和TNF-α)，如下表所示。该表显示单核细胞在存在LPS时释放的细胞因子，表示为CD64+CD4dim细胞的百分比以及CD4dim CD64+细胞占总细胞的百分比。
IL-10 IL-12 TNF-α CD4dim CD64+细胞/总细胞
无刺激     16.21     8.52     13.88     3.1
野生型IFNα-2     49.34     34.48     50.87     2.71
Q114H/V127DIFNα-21 50.63 31.81 56.5 2.31
K179E IFNα-21     60.14     36.42     60.16     4.43
实施例5.评价A42G、Q102K、Q114H/V127D和K179E突变型 IFNα-21的体外抗增殖活性
a)对Daudi Burkitt细胞系人淋巴母细胞的增殖
对A42G、Q102K、Q114H/V127D和K179E突变型IFNα-21蛋白质以及野生型IFNα-21蛋白质进行这些测试。将预先在RPMI 1640培养基中(补充有10％胎牛血清和2mM L-谷氨酰胺)培养的细胞(人DaudiBurkitt淋巴瘤细胞系，下文称为″Daudi细胞″)按细胞密度4.104细胞/孔接种于96孔板。
将每孔中的Daudi细胞与浓度递增的突变型或野生型IFNα-21蛋白质接触。每个待鉴定的IFNα-21按终浓度为0.003pM-600nM进行测试。
然后将Daudi细胞在37℃、5％CO2下培养66小时，其后在培养物中加入Uptiblue试剂(Uptima)。再温育4小时以后，测定590nm处发射的荧光(激发560nm)，定量细胞增殖速率。
突变型或野生型IFNα-21的抗增殖活性是根据IC50的测定，其对应于抑制50％细胞生长的IFNα-21浓度。
每个实验条件进行至少3次实验，一式三份，可以测定每个IFNα-21的平均IC50值。可以比较对应于突变型与野生型蛋白质IC50值的比值。结果汇总于下表(标准差如括号内所示)：
  野生型IFNα-21   A42GIFNα-21     Q102KIFNα-21   Q114H/V127DIFNα-21   K179EIFNα-21
IC50(pM)   1.02   2.55     1.05   13.92   3.73
比值野生型/突变型 - 2.15(0.78)     1.30(0.24) 13.10(3.06) 3.72(0.83)
该测试表明，A42G、Q114H/V127D和K179E突变型IFNα-21蛋白质对Daudi细胞的细胞抗增殖活性低于野生型IFNα-21。特别而言，Q114H/V127D IFNα-21与野生型IFNα-21相比，对Daudi细胞的细胞抗增殖活性低约10-16倍。
b)对TF-1红白血病细胞系
还评价了A42G、Q114H/V127D和K179E突变型IFNα-21对红白血病细胞系的作用。同样在用作对照并选作内含子A商品化产物代表的野生型IFNα-2存在下进行该测试。
为此，将TF-1细胞与浓度递增的突变型IFNα-21或野生型IFNα-2(0.001-1000ng/ml)接触，测定细胞增殖。
结果可以表示为IC30，即对应于抑制30％细胞增殖的IFNα浓度，汇总于下表：
野生型IFNα-2     A42GIFNα-21   Q114H/V127DIFNα-21     K179EIFNα-21
IC30(ng/mL)     0.66     2.33   1.97     1.62
这些数据表明，这3个突变型IFNα-21对TF-1细胞具有弱的抗增殖作用，该作用类似于野生型IFNα-2，提示A42G、Q114H/V127D和K179E突变型IFNα-21的血液学毒性并不高于野生型IFNα-2。
实施例6.评价A42G、Q114H/V127D和K179E突变型IFNα-21的 抗病毒活性
IFN在抗病毒防护中具有重要作用。IFN的抗病毒活性部分应归于IFN诱导的酶系统，例如：
-2’5’寡腺苷酸合成酶，催化腺苷寡聚物合成。这些寡聚物可活化RNase L，一种一旦活化便可破坏病毒RNA的内切核糖核酸酶。
-抑制病毒转录本合成和/或成熟的Mx蛋白质(GTP酶)。该活性主要作用于流感病毒。
-由双链RNA活化的PKR蛋白质(或p68激酶)。活化的PKR可抑制蛋白质合成。
也可通过其它机制诱导IFN的抗病毒活性，例如对于逆转录病毒而言，抑制病毒颗粒进入细胞、复制、结合、颗粒排出以及病毒颗粒的传染力。
最后，IFN通过调节免疫系统的某些功能、特别是促进细胞介导的应答(包括增加MHC I类和II类分子、增加IL-12和IFN-γ生成、增加CTL活性等)，而发挥间接的抗病毒活性，
利用细胞培养物体外以及小鼠模型体内评价了A42G、Q114H/V127D和K179E突变型IFNα-21的抗病毒活性。两个测试均利用用作对照并选作内含子A商品化产物代表的野生型IFNα-2平行进行。
a)细胞培养物体外抗病毒活性
该测定利用水泡性口膜炎病毒(VSV)可以评价A42G、Q114H/V127D和K179E突变型IFNα-21以及野生型IFNα-2在细胞培养物中的抗病毒活性。
为此，在浓度递减的突变型IFNα-21和野生型IFNα-2存在下培养WISH人上皮细胞24小时。然后利用水泡性口膜炎病毒(VSV)感染细胞24-48小时，测定细胞溶解作用。
通过比较IC50值，即对应于抑制50％VSV诱导的细胞溶解作用的IFN浓度，确定所测各种IFNα的抗病毒作用。
同样实验进行两次，测定的IC50平均值如下表所示：
野生型IFNα-2     A42GIFNα-21     Q114H/V127DIFNα-21     K179EIFNα-21
IC50(ng/mL)     4     14     22     25
因此，在VSV感染的细胞培养物中，A42G、Q114H/V127D和K179E突变型IFNα-21具有低于野生型IFNα-2的抗病毒活性。
b)小鼠模型体内抗病毒活性
在EMCV(脑心肌炎病毒)小鼠模型中进行体内测试。
人IFN在小鼠中显示剂量依赖性抗病毒活性，一般比相同数量的小鼠IFN低100-1,000倍(Meister等人(1986).J.Gen.Virol.67，1633-1644)。
利用脑心肌炎病毒(EMCV)腹膜内注射小鼠，引起以有关中枢神经系统和脑炎为特征的快速进行性致命疾病(Finter NB(1973).FrontBiol.2：295-360)。已经证明，小鼠和人干扰素-α均有效保护小鼠抵抗致命的EMCV感染(Tovey和Maury(1999).J.IFN Cytokine Res.19：145-155)。
利用100xLD50 EMCV腹膜内(ip)感染20只6周龄的Swiss小鼠组，然后1小时后利用2μg A42G、Q114H/V127D、K179E突变型IFNα-21或野生型IFNα-2制剂处理，以后每日一次，进行3天。对照组动物只利用赋形剂处理。每日跟踪动物存活率，进行21天。
结果如图6所示，表明A42G、Q114H/V127D或K179E突变型IFNα-21处理小鼠的相对存活率相比未处理小鼠高很多，但是仍类似于野生型IFNα-2处理小鼠所观察的结果。
所有这些结果表明，A42G、Q114H/V127D和K179E突变型IFNα-21具有独特的生物学特性。
                       序列表
<110>Escary，Jean-Louis
<120>IFNα-21基因的新多核苷酸和多肽
<130>021349/0012
<150>FR 0104404
<151>2001-03-30
<160>20
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>2001
<212>DNA
<213>人类(Homo sapiens)
<400>1
attttgtcat ataaagcaaa attcaaagct tcatatatat actatgagaa aaattttaaa    60
aaattattga ttcatatttt tagcagtttt gaatgattaa ctatgtaatt atattcatat    120
tattaatgtg tatttatata gatttttatt ttgcatatgt aatttcataa aacaaaattt    180
acatgaacaa attacattaa aagttattcc acaaatatac ttatcaaatt aagttaaatg    240
tcaatagctt ttaaacttag attttagttt aacatttctg tcattcttta ctttgaataa    300
aaagagcaaa ctttatagtt tttatctgtg aagtagagat atacatatta tacataaata    360
gataagccaa atctgtgtta ctaaaatttc atgaagattt caattagaaa aaaataccat    420
aaaatgtttt gagtgcaggg gaaaaatagg caatgatgaa aaaaaatgaa aaacatctgt    480
aaacacatgt agagagtgca taaagaaagc aaaaacagag atagaaagta aaactagggc    540
atttagaaaa tggaaattag tatgttcact atttaagacc tacgcacaga gcaaagtctt    600
cagaaaacct agaggccaag gttcaaggtt acccatctca agtagcctag caatattggc    660
aacatcccaa tggccctgtc cttttcttta ctgatggccg tgctggtgct cagctacaaa    720
tccatctgtt ctctgggctg tgatctgcct cagacccaca gcctgggtaa taggagggcc    780
ttgatactcc tggcacaaat gggaagaatc tctcctttct cctgcctgaa ggacagacat    840
gactttggat tcccccagga ggagtttgat ggcaaccagt tccagaaggc tcaagccatc    900
tctgtcctcc atgagatgat ccagcagacc ttcaatctct tcagcacaaa ggactcatct    960
gctacttggg aacagagcct cctagaaaaa ttttccactg aacttaacca gcagctgaat    1020
gacctggaag cctgcgtgat acaggaggtt ggggtggaag agactcccct gatgaatgtg    1080
gactccatcc tggctgtgaa gaaatacttc caaagaatca ctctttatct gacagagaag    1140
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gatctgtatt gactaataca ccagtccaca cttctatgac ttctgccatt tcaaagactc    1320
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tctaattatc tatctattga aatatttatt tatttattag atttaaatta tttttgtcca    1500
tgtaatatta tgtgtacttt tacattgtgt tatatcaaaa tatgtgattt atatttagtc    1560
aatatattat ttcttttaat taaattttac tattaaaact tcttatatta tttgtttatt    1620
ctttaataaa gaaataccaa gcccaaatgt gcaatctcat taaagaatgg atggtacaat    1680
tcatttaccc atcatcattg tatccaaatt gtaagtaaaa attgactttc tctaagcgag    1740
gttttatatt gcccttagga tatccaggtg aacataacaa ataccgtttt cgctttcttg    1800
tatcttttat ttttgtaagg aaaataataa ctatactttc taatacctgt tacattaaat    1860
gctatagtga gaagaaataa aaacaaatga aattcagtaa aactgaagca aggcatatca    1920
aaattttttt taaaaaagta gtagatatcc tctatagcag acaagtagac atctaagtgc    1980
aagtgtccat tggtaacctg a                                              2001
<210>2
<211>189
<212>PRT
<213>人类
<400>2
Met Ala Leu Ser Phe Ser Leu Leu Met Ala Val Leu Val Leu Ser Tyr
1               5                   10                  15
Lys Ser Ile Cys Ser Leu Gly Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu
            20                  25                  30
Gly Asn Arg Arg Ala Leu Ile Leu Leu Ala Gln Met Gly Arg Ile Ser
        35                  40                  45
Pro Phe Ser Cys Leu Lys Asp Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu
    50                  55                  60
Glu Phe Asp Gly Asn Gln Phe Gln Lys Ala Gln Ala Ile Ser Val Leu
65                  70                  75                  80
His Glu Met Ile Gln Gln Thr Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser
                85                  90                  95
Ser Ala Thr Trp Glu Gln Ser Leu Leu Glu Lys Phe Ser Thr Glu Leu
            100                 105                 110
Asn Gln Gln Leu Asn Asp Met Glu Ala Cys Val Ile Gln Glu Val Gly
        115                 120                 125
Val Glu Glu Thr Pro Leu Met Asn Val Asp Ser Ile Leu Ala Val Lys
    130                 135                 140
Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser
145                 150                 155                 160
Pro Cys Ala Trp Glu Val Val Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser
                165                 170                 175
Leu Ser Lys Ile Phe Gln Glu Arg Leu Arg Arg Lys Glu
            180                 185
<210>3
<211>20
<212>DNA
<213>人类
<400>3
ggttcaaggt tacccatctc                                            20
<210>4
<211>20
<212>DNA
<213>人类
<400>4
ggttcaaggt tacccatctc                                            20
<210>5
<211>20
<212>DNA
<213>人类
<400>5
ggttcaaggt tacccatctc                                            20
<210>6
<211>20
<212>DNA
<213>人类
<400>6
tttgaaatgg cagaagtcat                                           20
<210>7
<211>20
<212>DNA
<213>人类
<400>7
gagggccttg atactcctgg                                           20
<210>8
<211>20
<212>DNA
<213>人类
<400>8
gagagattct tcccatttgt                                           20
<210>9
<211>20
<212>DNA
<213>人类
<400>9
actcatctgc tacttgggaa                                           20
<210>10
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<212>DNA
<213>人类
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<213>人类
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gcttccaggt cattcagctg                                           20
<210>13
<211>20
<212>DNA
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Claims (46)

1.分离的多核苷酸，其包含全部或部分的：
a)核苷酸序列SEQ ID NO.1，只要所述核苷酸序列包含至少一个选自c794g、c973a、g1011c、t1049a、t1155a、a1204g和t1265c的SNP；或
b)与a)中核苷酸序列互补的核苷酸序列。
2.权利要求1的分离的多核苷酸，其包含SEQ ID NO.1的670-1239位核苷酸，只要该序列包含至少一个选自c794g、c973a、g1011c、t1049a、t1155a和a1204g的编码SNP。
3.权利要求1的分离的多核苷酸，其中所述的多核苷酸由至少10个核苷酸组成。
4.分离的多核苷酸，其编码包含氨基酸序列SEQ ID NO.2的全部或部分、并具有至少一个选自A42G、Q102K、Q114H、V127D、C162stop和K179E的编码SNP的多肽。
5.分离的多核苷酸，其编码包含氨基酸序列SEQ ID NO.2的全部或部分、并具有两个编码SNP Q114H和V127D的多肽。
6.分离的多核苷酸，其编码包含氨基酸序列SEQ ID NO.2的全部或部分、并具有编码SNP K179E的多肽。
7.鉴定或扩增与核苷酸序列SEQ ID NO.1具有80-100％同一性的多核苷酸的全部或部分的方法，其包含该多核苷酸在合适的杂交条件下与权利要求1的多核苷酸杂交。
8.与核苷酸序列SEQ ID NO.1具有80-100％同一性的多核苷酸的全部或部分的基因分型方法，其包含以下步骤：扩增受试者或受试者群体基因组DNA的目的区域，并确定位于核苷酸序列SEQ ID NO.1中选自794、973、1011、1049、1155、1204和1265的至少一个位点的等位基因。
9.权利要求8的方法，其中通过微型测序进行基因分型。
10.包含权利要求1的多核苷酸的重组载体。
11.包含权利要求10的重组载体的宿主细胞。
12.分离多肽的方法，其包含在培养基中培养权利要求11的宿主细胞，并从培养基中分离所述多肽。
13.由权利要求1的分离的多核苷酸编码的多肽。
14.分离的多肽，其包含氨基酸序列SEQ ID NO.2的全部或部分、并具有至少一个选自A42G、Q102K、Q114H、V127D、C162stop和K179E的编码SNP。
15.权利要求13的多肽，其包含氨基酸序列SEQ ID NO.2的氨基酸24-189、并具有至少一个选自A42G、Q102K、Q114H、V127D、C162stop和K179E的编码SNP。
16.权利要求13的多肽，其包含氨基酸序列SEQ ID NO.2中24-189位氨基酸、并具有两个编码SNP Q114H和V127D。
17.权利要求13的多肽，其包含氨基酸序列SEQ ID NO.2中24-189位氨基酸、并具有编码SNP K179E。
18.获得免疫特异性抗体的方法，其包含利用权利要求13的多肽免疫动物，并从该动物收集所述抗体。
19.权利要求18的方法所产生的免疫特异性抗体。
20.在一种或多种待测化合物中鉴定可活化或抑制分离多肽活性的试剂的方法，该分离的多肽包含氨基酸序列SEQ ID NO.2的全部或部分、并具有至少一个选自A42G、Q102K、Q114H、V127D、C162stop和K179E的编码SNP，所述方法包含：
a)提供包含权利要求10的重组载体的宿主细胞；
b)所述宿主细胞与待测化合物接触，
c)确定对所述多肽活性的活化或抑制作用，从而鉴定所述的活化剂或抑制剂。
21.在一种或多种待测化合物中鉴定其活性受分离多肽增强或抑制的试剂的方法，该分离的多肽包含氨基酸序列SEQ ID NO.2的全部或部分、并具有至少一个选自A42G、Q102K、Q114H、V127D、C162stop和K179E的编码SNP，所述方法包含：
a)提供包含权利要求10的重组载体的宿主细胞；
b)所述宿主细胞与待测化合物接触，
c)确定对该试剂活性的增强或抑制作用，从而鉴定所述被增强或被抑制的试剂。
22.分析受试者生物学特征的方法，其包含进行至少一个下列步骤：
a)确定在受试者基因组中存在或缺少权利要求1的多核苷酸；
b)确定在受试者中权利要求1的多核苷酸的表达水平；
c)确定在受试者中存在或缺少权利要求13的多肽；
d)确定在受试者中权利要求13的多肽的浓度；或
e)确定在受试者中权利要求13的多肽的功能性。
23.包含一种或多种化合物的治疗剂，所述化合物选自包含核苷酸序列SEQ ID NO.1的全部或部分的分离的多核苷酸，只要该核苷酸序列包含至少一个选自c794g、c973a、g1011c、t1049a、t1155a、a1204g和t1265c的SNP，或者与所述核苷酸序列互补的核苷酸序列；包含所述多核苷酸的重组载体；包含所述重组载体的宿主细胞；包含氨基酸序列SEQID NO.2的全部或部分、并具有至少一个选自A42G、Q102K、Q114H、V127D、C162stop和K179E的编码SNP的分离的多肽；特异性针对所述多肽的抗体。
24.用于预防或治疗个体疾病的方法，所述疾病选自癌症和肿瘤、传染病、免疫相关疾病和/或自身免疫相关疾病、心血管疾病、代谢疾病、中枢神经系统疾病以及化学治疗相关疾病，其包含给予个体治疗有效量的权利要求23的治疗剂，外加药物可接受的赋形剂。
25.权利要求24的方法，其中所述癌症和肿瘤包含转移的肾癌、黑色素瘤、包含滤泡性淋巴瘤和皮肤T细胞淋巴瘤的淋巴瘤、包含毛样细胞白血病、慢性淋巴细胞性白血病和慢性骨髓性白血病的白血病、肝癌、颈癌、头癌和肾癌、多发性骨髓瘤、类癌瘤以及伴随免疫缺陷出现的肿瘤，包含AIDS情况下的Kaposi肉瘤。
26.权利要求24的方法，其中所述代谢疾病包含非免疫相关性疾病，例如肥胖症。
27.权利要求24的方法，其中所述传染病包含病毒性传染，包括慢性乙型和丙型肝炎以及HIV/AIDS，感染性肺炎以及性病，例如生殖器疣。
28.权利要求24的方法，其中所述中枢神经系统疾病包含阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、精神分裂症以及抑郁症。
29.权利要求24的方法，其中所述免疫和自身免疫相关疾病包含组织或器官移植排斥、变态反应、哮喘、银屑病、类风湿性关节炎、多发性硬化、克罗恩氏病以及溃疡性结肠炎。
30.预防或治疗个体疾病的方法，所述疾病选自创伤愈合、透析患者的贫血和/或骨质疏松症，包含给予该个体治疗有效量的权利要求23的治疗剂，外加药物可接受的赋形剂。
31.增加或降低受试者中权利要求13的多肽活性的方法，其包含给予治疗有效量的一种或多种：包含核苷酸序列SEQ ID NO.1的全部或部分的分离的多核苷酸，只要该核苷酸序列包含至少一个选自c794g、c973a、g1011c、t1049a、t1155a、a1204g和t1265c的SNP，或与该核苷酸序列互补的核苷酸序列；包含该多核苷酸的重组载体；包含该重组载体的宿主细胞，其中该宿主细胞可得自待治疗的受试者；包含氨基酸序列SEQ ID NO.2的全部或部分、并具有至少一个选自A42G、Q102K、Q114H、V127D、C162stop和K179E的编码SNP的分离的多肽；特异性针对该多肽的抗体；以及药物可接受的赋形剂。
32.预防或治疗个体与其基因组中存在权利要求1的多核苷酸有关的病症或疾病的方法，其包含给予治疗有效量的一种或多种：包含核苷酸序列SEQ ID NO.1的全部或部分、并具有至少一个选自c794g、c973a、g1011c、t1049a、t1155a、a1204g和t1265c的SNP的分离的多核苷酸，或与该核苷酸序列互补的核苷酸序列；包含一种该多核苷酸的重组载体；包含该重组载体的宿主细胞；包含氨基酸序列SEQ ID NO.2的全部或部分、并具有至少一个选自A42G、Q102K、Q114H、V127D、C162stop和K179E的编码SNP的分离的多肽；特异性针对一种该多肽的抗体；以及药物可接受的赋形剂。
33.确定至少一个选自IFNα-21基因中c794g、c973a、g1011c、t1049a、t1155a、a1204g和t1265c的SNP与疾病或疾病抗性之间统计学相关性的方法，其包含：
a)对一组个体进行基因分型；
b)确定该疾病或疾病抗性在该组个体中的分布；
c)将基因型数据与该疾病或疾病抗性的分布作比较；以及
d)对上述比较进行统计学相关性分析。
34.诊断或确定疾病或疾病抗性预后的方法，其包含检测IFNα-21基因中至少一个选自c794g、c973a、g1011c、t1049a、t1155a、a1204g和t1265c的SNP。
35.在一种或多种待测化合物中鉴定与Q114H/V127D突变型IFNα-21基因产物具有基本类似的生物活性的化合物的方法，该方法包含以下步骤：
a)确定所述化合物的生物活性，例如树突状细胞成熟、CD4+或CD8+T淋巴细胞释放细胞因子、单核细胞释放细胞因子、体外或体内抗病毒活性、对Daudi Burkitt细胞系的细胞抗增殖活性、对TF-1细胞系的细胞抗增殖活性；
b)将由步骤a)确定的该化合物活性与Q114H/V127D突变型IFNα-21基因产物活性作比较。
c)根据步骤b)进行的比较确定该化合物是否具有与Q114H/V127D突变型IFNα-21基因产物基本类似的活性。
36.权利要求35的方法，其中所述待测化合物鉴定自合成肽组合文库、高通量筛选、或通过计算机辅助药物设计而设计，以具有与SEQ ID NO.2的多肽、或包含氨基酸序列SEQ ID NO.2的24-189位所含氨基酸的氨基酸序列相同的三维结构，只要该氨基酸序列包含Q114H和V127D SNP。
37.利用权利要求35的方法鉴定的化合物。
38.从一种或多种待测化合物中鉴定与K179E突变型IFNα-21基因产物具有基本类似的生物活性的化合物的方法，该方法包含以下步骤：
a)确定所述化合物的生物活性，例如树突状细胞成熟、CD4+或CD8+T淋巴细胞释放细胞因子、单核细胞释放细胞因子、体外或体内抗病毒活性、对Daudi Burkitt细胞系的细胞抗增殖活性、对TF-1细胞系的细胞抗增殖活性；
b)将由步骤a)确定的该化合物活性与K179E突变型IFNα-21基因产物活性作比较。
c)根据步骤b)进行的比较，确定该化合物是否具有与K179E突变型IFNα-21基因产物基本类似的活性。
39.权利要求38的方法，其中所述待测化合物鉴定自合成肽组合文库、高通量筛选、或通过计算机辅助药物设计而设计，以具有与SEQ ID NO.2的多肽、或包含氨基酸序列SEQ ID NO.2的24-189位所含氨基酸的氨基酸序列相同的三维结构，只要该氨基酸序列包含K179E SNP。
40.利用权利要求38的方法鉴定的化合物。
41.用于预防或治疗个体疾病的方法，所述疾病选自癌症和肿瘤、传染病、免疫相关疾病和/或自身免疫相关疾病、心血管疾病、代谢疾病、中枢神经系统疾病以及化学治疗相关疾病，其包含给予该个体治疗有效量的权利要求37或40的试剂，外加药物可接受的赋形剂。
42.权利要求41的方法，其中所述癌症和肿瘤包含转移的肾癌、黑色素瘤、包含滤泡性淋巴瘤和皮肤T细胞淋巴瘤的淋巴瘤、包含毛样细胞白血病、慢性淋巴细胞性白血病和慢性骨髓性白血病的白血病、肝癌、颈癌、头癌和肾癌、多发性骨髓瘤、类癌瘤以及伴随免疫缺陷出现的肿瘤，包含AIDS情况下的Kaposi肉瘤。
43.权利要求41的方法，其中所述传染病包含病毒性传染，包括慢性乙型和丙型肝炎以及HIV/AIDS，感染性肺炎以及性病，例如生殖器疣。
44.权利要求41的方法，其中所述免疫和自身免疫相关疾病包含组织或器官移植排斥、变态反应、哮喘、银屑病、类风湿性关节炎、多发性硬化、克罗恩氏病以及溃疡性结肠炎。
45.权利要求41的方法，其中所述中枢神经系统疾病包含阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、精神分裂症以及抑郁症。
46.权利要求41的方法，其中所述代谢疾病包含非免疫相关性疾病，例如肥胖症。
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