FR2822845A1 - Nouveaux polynucleotides comportant des polymorphismes de type snp fonctionnels dans la sequence nucleotidique du gene ifn-alpha-21 ainsi que de nouveaux polypeptides codes par ces polynucleotides et leurs utilisations therapeutiques - Google Patents

Nouveaux polynucleotides comportant des polymorphismes de type snp fonctionnels dans la sequence nucleotidique du gene ifn-alpha-21 ainsi que de nouveaux polypeptides codes par ces polynucleotides et leurs utilisations therapeutiques Download PDF

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Abstract

Polynucléotide isolé comprenant :a) une séquence nucléotidique ayant au moins 80 % d'identité avec la séquence ID SEQ Ndegre 1 ou sa séquence codante, sous réserve que cette séquence nucléotidique comporte au moins l'un des polymorphismes de type SNP suivants :- c973a,- g1011c, - t1049a, - t1155a,- a1204g; oub) une séquence nucléotidique complémentaire à une séquence nucléotidique sous a).

Description

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La présente invention concerne de nouveaux polynucléotides comportant des polymorphismes de type SNP fonctionnels dans la séquence nucléotidique du gène IFNa-21 ainsi que de nouveaux polypeptides codés par ces polynucléotides et leurs utilisations thérapeutiques.
ART ANTERIEUR
Le gène de l'interféron alpha-21, ci après IFNa-21 est décrit dans les publications : - Goeddel, D. V., Leung, D. W ;"The structure of eight distinct cloned human leukocyte interferon cDNAs" ; Nature 290 (5801), 20-26 (1981), et - Olopade 01., Bohlander SK. ; "Mapping of the shortest région of overlap of deletions of the short arm of chromosome 9 associated with human neoplasia" ; Genomics 14 (2), 437-443 (1992).
La séquence nucléotidique de ce gène est accessible dans la section HTG de la base de donnée GenBank sous le numéro d'accès AC009445.
La séquence de l'ARN messager de l'lFNa-21 est mentionné dans
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la base de données du NCBI, sous le code d'accès NM~002175.
L'IFNa-21 est un gène ayant une homologie structurelle et fonctionnelle proche des interférons alpha humains (I'IFNa), en particulier de l'lFNa-2.
Les IFNa sont connus pour leurs effets anti-prolifératifs cellulaires et leurs implications dans les réponses anti-virales et anti-parasitaires.
Les IFNa sont connus pour inhiber l'expression de plusieurs autres cytokines au niveau des cellules hématopoïétiques souches, ainsi que la prolifération cellulaire de certaines tumeurs cancéreuses ou non.
Les IFNa sont également connus pour réduire l'expression des récepteurs à l'EGF dans les carcinomes rénaux, pour inhiber l'expression de
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certains gènes mitochondriaux, pour inhiber la prolifération des fibroblastes, des monocytes et des lymphocytes B, notamment in vitro et pour bloquer la synthèse des anticorps dans les lymphocytes B.
Les IFNa sont aussi connus pour induire l'expression d'antigènes spécifiques de tumeurs à la surface de cellules tumorales et également pour induire les gènes placés sous le contrôle de régions promotrices de type ISRE (Interferon-Stimulated Response Element) en agissant sur les facteurs de transcription spécifiques de ces ISRE.
Il est connu que les IFNa sont impliqués dans différents dérèglements et/ou maladies humaines, tels que les différents cancers comme, par exemple, les carcinomes, les mélanomes, les lymphomes, les myélomes, les leucémies et les cancers du foie, du cou, de la tête et des reins, les maladies cardiovasculaires, les maladies métaboliques telles que celles qui ne sont pas liées au système immunitaire comme, par exemple, l'obésité, les maladies infectieuses en particulier les infections virales comme les hépatites B et C et le SIDA, les pneumonies, les colites ulcératives, les maladies du système nerveux central comme, par exemple, la schizophrénie et la dépression, le rejet de greffe de tissus ou d'organes, la cicatrisation de blessures, l'anémie en particulier chez les patients dialysés, les allergies, l'asthme, les scléroses multiples, l'ostéoporose, le psoriasis, l'arthrite rhumatoïde, la maladie de Crohn, les maladies et les désordres auto-immuns, les désordres gastro-intestinaux ou encore les désordres liés aux traitements par chimiothérapie.
Les IFNa sont particulièrement utilisés pour le traitement des hépatites chroniques B et C, des leucémies telles que la leucémie à trichloroleucocytes et la leucémie myéloïde chronique, des myélomes multiples, des lymphomes folliculaires, de tumeurs carcinoïdes, de mélanomes malins, de carcinomes rénaux métastasés ainsi que des tumeurs qui apparaissent à la suite d'un déficit immunitaire, tel que le sarcome de Kaposi dans le cas du SIDA.
Il est également connus que les IFNa sont aussi efficaces contre les tumeurs cancéreuses ou non. Les IFNa sont reconnus par la FDA (Food
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and Drug Administration) pour le traitement des verrues génitales ou vénériennes.
Plus particulièrement, l'IFNa-21 a pût être localisé par hybridation in situ dans des cerveaux de patients atteints de la maladie de Parkinson ou de la maladie d'Alzheimer.
Les cellules microgliales expriment en grande quantité l'IFNa-21, par rapport aux autres cellules.
Chez les patients atteints de maladie d'Alzheimer, la présence de l'IFNa-21 a pût être démontrée dans des neurones des lobes pariétaux, suggérant ainsi que l'IFNa-21 pourrait être impliqué dans le développement de cette pathologie (Voir Kawaguchi N, Yamada T, Yoshiyama Y. No To Shinkei.
1997 Jan. ; 49 (1) : 69-73).
Toutefois, FNa-21, comme les IFNa de manière générale, présentent de nombreux effets secondaires lorsqu'ils sont employés dans des compositions pharmaceutiques, tels que des réactions d'hypersensibilité aiguë (urticaire, broncho-constriction, choc anaphylactique, etc. ), des arythmies cardiaques, des hypotensions artérielles, des crises d'épilepsie, des troubles des fonctions thyroïdiennes ou des syndromes pseudo-grippaux (fièvres, sueurs, myalgies).
La demanderesse a trouvé de nouveaux polypeptides et nouveaux polynucléotides analogues à ''IFNa-21, ayant une fonctionnalité différente de dna-21 naturel, pouvant être utilisés notamment pour traiter ou prévenir les dérèglements ou maladies mentionnés précédemment et éviter tout ou partie des inconvénients qui leurs sont liés.
L'INVENTION
L'invention a pour principal objet de nouveaux polynucléotides qui diffèrent de la séquence nucléotidique du gène sauvage de référence de HFNa- 21, en ce qu'ils comportent un ou plusieurs polymorphismes de type SNP (Single Nucleotide Polymorphism) fonctionnels.
La demanderesse a en effet découvert 5 polymorphismes de type SNP fonctionnels dans la séquence nucléotidique du gène sauvage de
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référence de l'IFNa-21, correspondant à la séquence nucléotidique ID SEQ ? 1.
La séquence nucléotidique ID SEQ NO1 comporte 2001 nucléotides.
Ces 5 polymorphismes de type SNP fonctionnels. sont présentés ci-dessous :
1) Le nucléotide cytosine (c) en position 973 de la séquence nucléotidique ID SEQ NO 1 du gène sauvage de référence IFN a-21 est muté en adénine (a).
Ce polymorphisme de type SNP est appelé ci-après c973a.
2) Le nucléotide guanine (g) en position 1011 de la séquence nucléotidique ID SEQ NO 1 du gène sauvage de référence IFN a-21 est muté en cytosine (c).
Ce polymorphisme de type SNP est appelé ci-après g1011c.
3) Le nucléotide thymine (t) en position 1049 de la séquence nucléotidique ID SEQ ? 1 du gène sauvage de référence IFN a-21 est muté en adénine (a).
Ce polymorphisme de type SNP est appelé ci-après t1049a.
4) Le nucléotide thymine (t) en position 1155 de la séquence nucléotidique ID SEQ NO 1 du gène sauvage de référence IFN a-21 est muté en adénine (a).
Ce polymorphisme de type SNP est appelé ci-après t1155a.
5) Le nucléotide adénine (a) en position 1204 de la séquence nucléotidique ID SEQ ? 1 du gène sauvage de référence IFN a-21 est muté en guanine (g).
Ce polymorphisme de type SNP est appelé ci-après a1204g.
Ces polymorphismes de type SNP fonctionnels ont été identifiés par la demanderesse au moyen du procédé de détermination décrit dans sa demande de brevet FR 00 22894, intitulée"Procédé de détermination d'un ou plusieurs polymorphisme (s) fonctionnel (s) dans la séquence nucléotidique d'un gène"candidat"fonctionnel présélectionné et ses applications"et déposée le 6 décembre 2000, citée ici à titre de référence.
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Le procédé décrit dans cette demande de brevet permet l'identification d'un (ou plusieurs) polymorphisme (s) de type SNP fonctionnel (s) préexistant (s) dans au moins un individu constitutif d'une population aléatoire d'individus.
Dans le cadre de la présente invention, un fragment de la séquence nucléotidique du gène IFN a-21, comprenant la séquence codante, a été isolé chez 278 individus, dans la population d'individus choisis de manière aléatoire.
Un séquençage de ces fragments a ensuite été réalisé sur certains de ces échantillons présentant un profil hétéroduplex après analyse par DHPLC (voir brevet FR 00 22894). On a alors comparé le fragment ainsi séquencé à la séquence nucléotidique du fragment du gène IFNa-21 sauvage de référence et identifier tout polymorphisme de type SNP fonctionnel.
Ainsi les polymorphismes de type SNP fonctionnels selon l'invention sont naturels et sont présents chez certains individus de la population mondiale.
Un génotypage des polynucléotides conformes à l'invention a été effectué de façon à déterminer la fréquence allélique de ces polynucléotides dans une population.
Des exemples de tels génotypages sont donnés, ci-après, dans la partie expérimentale.
La séquence nucléotidique ID SEQ NO1 du gène IFNa-21 humain sauvage de référence comporte une séquence codante de 570 nucléotides, du nucléotide 670 (codon start) au nucléotide 1239 (codon stop).
Le gène IFN a-21 humain sauvage de référence code pour une protéine immature de 189 acides aminés, correspondant à la séquence d'acides aminés ID SEQ NO2, qui sera convertit en protéine mature de 166 acides aminés (de l'acide aminé 24 à 189), par clivage du peptide signal qui comprend les 23 premiers acides aminés.
Chacun des polymorphismes de type SNP de l'invention : c973a, g1011c, t1049a, t1155a et a1204g, entraînent des modifications de la protéine codée par la séquence nucléotidique du gène IFNa-21.
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Ces modifications dans la séquence d'acides aminés sont les suivantes :
1) Le polymorphisme de type SNP c973a entraîne une mutation de l'acide aminé glutamin (Q) en position 102 dans la protéine immature du gène IFNa-21, correspondant à la séquence d'acides aminés ID SEQ NO2, en lysine (K) et en position 79 de la protéine mature.
Dans la description de la présente invention, on appellera indifféremment Q79K et Q 1 02K la mutation codée par ce polymorphisme de type SNP de l'invention selon que l'on se réfère respectivement à la protéine mature ou à la protéine immature.
2) Le polymorphisme de type SNP g1011c entraîne une mutation de l'acide aminé glutamin (Q) en position 114 dans la protéine immature du gène IFNa-21, correspondant à la séquence d'acides aminés ID SEQ NO2, en histidine (H) et en position 91 de la protéine mature.
Dans la description de la présente invention, on appellera indifféremment Q91H et Q114H la mutation codée par ce polymorphisme de type SNP de l'invention selon que l'on se réfère respectivement à la protéine mature ou à la protéine immature.
3) Le polymorphisme de type SNP t1049a entraîne une mutation de l'acide aminé valine (V) en position 127 dans la protéine immature du gène IFNa-21, correspondant à la séquence d'acides aminés ID SEQ NO2, en acide aspartique (D) et en position 104 de la protéine mature.
Dans la description de la présente invention, on appellera indifféremment V104D et V127D la mutation codée par ce polymorphisme de type SNP de l'invention selon que l'on se réfère respectivement à la protéine mature ou à la protéine immature.
4) Le polymorphisme de type SNP t1155a entraîne une mutation de l'acide aminé cystéine en position 162 dans la protéine immature du gène IFNa-21, correspondant à la séquence d'acides aminés ID SEQ NO2, en codon stop et en position 139 de la protéine mature.
Dans la description de la présente invention, on appellera indifféremment C139stop et C162stop la mutation codée par ce polymorphisme
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de type SNP de l'invention selon que l'on se réfère respectivement-à la protéine mature ou à la protéine immature.
5) Le polymorphisme de type SNP a1204g entraîne une mutation de l'acide aminé lysine (K) en position 179 dans la protéine immature du gène 1 FNa-21, correspondant à la séquence d'acides aminés D. SEQ N 2, en glutamate (E) et en position 156 de la protéine mature.
Dans la description de la présente invention, on appellera indifféremment K156E et K179E la mutation codée par ce polymorphisme de type SNP de l'invention selon que l'on se réfère respectivement à la protéine mature ou à la protéine immature.
Les polypeptides conformes à l'invention comportant l'un au moins des polymorphismes de type SNP décrit ci-dessus entraînent des modifications de la conformation spatiale ceux par rapport au polypeptide de l'IFNa-21 naturel.
Ces modifications peuvent être observées par modélisation moléculaire bio-informatique, selon des méthodes bien connues de l'homme du métier mettant en oeuvre, par exemple, les outils de modélisation de novo (par exemple, SEQFOLD/MSI), d'homologie (par exemple, MODELER/MSI), de minimisation des champs de force (par exemple, DISCOVER, DELPHI/MSI) et/ou de dynamique moléculaire (par exemple, CFF/MSI).
Des exemples de telles modélisations sont donnés ci-après dans la partie expérimentale.
1) La modélisation bio-informatique permet d'observer que la mutation Q102K sur la protéine mutée mature entraîne un déplacement de l'hélice dite A de l'IFNa-21 naturel due à des perturbations de liaisons hydrogène, comme il est observé sur les Figures 1 et 2.
En effet, les liaisons hydrogènes de l'oxygène de la chaîne latérale de Q102 avec le résidu acide de E106 et avec l'hélice dite C de l'IFNa- 21 naturel disparaissent dans la protéine mutée K102.
Ainsi, la protéine mutée possède une conformation tridimensionnelle très différente de la protéine codée par le gène sauvage de IFNa-21 de référence.
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La modélisation bio-informatique permet ainsi de prévoir que la présence de la lysine en position 102 entraîne une modification significative de la structure et de la fonction de l'IFNa-21.
2) La modélisation bio-informatique permet d'observer que la mutation 0114H sur la protéine mutée mature entraîne un déplacement de l'hélice dite C au niveau du point de mutation, comme il est observé sur les Figures 3 et 4.
Plusieurs liaisons hydrogènes et ponts salins apparaissent, entre autres, entre les chaînes latérales des acides aminés H114 et D99, occasionnant une rigidification de l'hélice.
Ainsi, la protéine mutée possède une conformation tridimensionnelle différente de la protéine codée par le gène sauvage de IFNa-21 de référence.
La modélisation bio-informatique permet ainsi de prévoir que la présence de l'histidine en position 114 entraîne une modification significative de la structure et de la fonction de l'IFNa-21.
3) La modélisation bio-informatique permet d'observer que la mutation V127D sur la protéine mutée mature entraîne des modifications structurales de l'hélice A au niveau du point de mutation, comme il est observé sur les Figures 5 et 6.
Il a été observé que ces modifications spatiales affectent des résidus impliqués dans la liaison de IFNa-21 à son récepteur.
La modélisation bio-informatique permet ainsi de prévoir que la présence de l'acide aspartique en position 127 entraîne une modification significative de la conformation tridimensionnelle et de la fonction de NFNa-21.
4) La modélisation bio-informatique permet d'observer que la mutation C162stop entraîne un arrêt prématuré de la traduction de la protéine avec pour conséquence la disparition d'un fragment polypeptidique qui participe à la dernière hélice, dite hélice E, de l'IFNa-21 naturel, comme il est observé sur la Figure 7.
L'hélice E est primordiale pour l'accrochage de FNa-21 à son récepteur.
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L'absence de cette hélice E dans la protéine mutée-entraîne un mauvais repliement de la protéine mutée et induit ainsi une modification de la conformation tridimensionnelle dans laquelle le coeur hydrophobe de cette protéine se trouve en contact avec le milieu extérieur hydrophile.
La protéine doit ainsi modifier sa conformation tridimensionnelle de façon à couvrir son coeur hydrophobe par des résidus hydrophiles, pour éviter le contact avec milieu extérieur hydrophile.
En conséquence, la protéine mutée possède une conformation tridimensionnelle très différente de la protéine codée par le gène sauvage de IFNa-21 de référence.
La modélisation bio-informatique permet ainsi de prévoir que l'arrêt prématuré de la protéine en position 162 entraîne une modification significative de la structure et de la fonction de l'IFNa-21.
5) La modélisation bio-informatique permet d'observer que la mutation K179E sur la protéine mutée mature entraîne un dépliement de l'hélice E et une modification la forme de la boucle C-terminale, comme il est observé sur les Figures 8 et 9.
Cette mutation s'accompagne d'une augmentation du réseau de liaisons hydrogènes avec la création d'un pont salin entre E179 (E156 dans la protéine mature) et R184 (R161 dans la protéine mature).
Ces modifications entraînent ainsi une rigidification de la structure de l'lFNa-21 dans cette région.
La région protéique affectée par cette mutation est connue pour être impliquée dans son activité anti-virale.
Par conséquent, cette mutation permet de prévoir que l'activité anti-virale de l'lFNa-21 K179E sera fortement perturbée et que l'acide glutamique en position 179 entraîne une modification de la structure et de la fonction de l'lFNa-21.
La détermination de la fonctionnalité des polypeptides de l'invention peut également être effectuée par un test de l'activité biologique en présence de polypeptides conformes à l'invention et d'un polypeptide codé par le gène sauvage de référence de l'IFNa-21, par exemple, par le test d'activité
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anti-proliférative de !' ! FN < x-21 sur la lignée humaine tumorale Daudi du lymphom Burkitt (Journ. Biol. Chem. ; Vol. 275, Issue 51, 40425-40433, December 22,2000 ; "New structural and Functional Aspects of the type 1 Interferon-Receptor interaction revealed by comprehensible mutational analysis of the binding interface" ; Pielher et al..
L'invention a aussi pour objet la mise en évidence et l'utilisation de molécules thérapeutiques obtenues à partir de l'information dérivant de polynucléotides et de polypeptides conformes à l'invention, notamment pour la prévention et le traitement des différents dérèglements et/ou maladies humaines.
La Figure 1 représente d'une part la modélisation de la protéine conforme à l'invention comportant le polymorphisme de type SNP c973a et d'autre part la protéine IFNa-21 naturel.
La Figure 2 représente la modélisation de la partie inférieure de chacune des protéines représentées sur la Figure 1.
Sur ces deux Figures, les zones blanches représentent la structure de la protéine IFNa-21 naturel et les zones noires représentent la structure de la protéine conforme à l'invention comportant le polymorphisme de type SNP c973a.
La Figure 10 représente le résultat du génotypage du polymorphisme de type SNP c973a dans une population d'individus.
Sur cette figure, les abscisses représentent la valeur mp du filtre Tamra (ddTTP) et les ordonnées représentent la valeur mp du filtre R-110 (ddGTP).
En haut à droite, le groupe hétérozygote GT contient 4 individus.
En haut à gauche, le groupe homozygote GG contient 233 individus.
En bas à gauche, le groupe d'individus contient 7 individus blancs et 2 individus non génotypés.
La Figure 3 représente la modélisation de la protéine conforme à l'invention comportant le polymorphisme de type SNP g1011c et de la protéine IFNa-21 naturel.
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La Figure 4 représente la modélisation de la partie gauche de chacune des protéines représentées sur la Figure 3.
Sur ces deux Figures, les zones sombres représentent la structure de la protéine IFNa-21 naturel et les zones claires représentent la structure de la protéine conforme à l'invention comportant le polymorphisme de type SNP g1011c.
La Figure 11 représente le résultat du génotypage du polymorphisme de type SNP g1011 c dans une population d'individus.
Sur cette figure, les abscisses représentent la valeur mp du filtre Tamra (ddCTP) et les ordonnées représentent la valeur mp du filtre R-110 (ddGTP).
En haut au milieu, le groupe hétérozygote CG contient 1 individu.
En bas à droite, le groupe homozygote CC contient 236 individus.
En bas à gauche, le groupe d'individus contient 7 individus blancs et 1 individu non génotypé.
La Figure 5 représente la modélisation de la protéine conforme à l'invention comportant le polymorphisme de type SNP t1049a et de la protéine IFNa-21 naturel.
La Figure 6 représente la modélisation de la partie supérieure de chacune des protéines représentées sur la Figure 5.
Sur ces deux Figures, les zones noires représentent la structure de la protéine IFNa-21 naturel et les zones blanches représentent la structure de la protéine conforme à l'invention comportant le polymorphisme de type SNP t1049a.
La Figure 12 représente le résultat du génotypage du polymorphisme de type SNP t1049a dans une population d'individus.
Sur cette figure, les abscisses représentent la valeur mp du filtre Tamra (ddTTP) et les ordonnées représentent la valeur mp du filtre R-110 (ddATP).
En haut à droite, le groupe hétérozygote AT contient 1 individu.
En haut à gauche, le groupe homozygote AA contient 236 individus.
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En bas à gauche, le groupe d'individus contient 7 individus blancs et 2 individus non génotypé.
La Figure 7 représente la modélisation de la protéine conforme à l'invention comportant le polymorphisme de type SNP t1155a (à droite de la
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Figure) et de la protéine IFNa-21 naturel (à gauche de la Figure). Au centre de la Figure, les deux modélisations moléculaires sont superposées.
Sur cette Figure, les zones claires représentent la structure de la protéine IFNa-21 naturel et les zones sombres représentent la structure de la protéine conforme à l'invention comportant le polymorphisme de type SNP t1155a.
La Figure 13 représente le résultat du génotypage du polymorphisme de type SNP t1155a dans une population d'individus.
Sur cette figure, les abscisses représentent la valeur mp du filtre Tamra (ddTTP) et les ordonnées représentent la valeur mp du filtre R-110 (ddATP).
En haut à droite, le groupe hétérozygote AT contient 1 individu.
En haut à gauche, le groupe homozygote AA contient 235 individus.
En bas à gauche, le groupe d'individus contient 7 individus blancs et 2 individus non génotypés.
La Figure 8 représente la modélisation de la protéine conforme à l'invention comportant le polymorphisme de type SNP a1204g et de la protéine IFNa-21 naturel.
La Figure 9 représente la modélisation de la partie supérieure gauche de chacune des protéines représentées sur la Figure 1.
Sur ces deux Figures, les zones sombres représentent la structure de la protéine IFNa-21 naturel et les zones claires représentent la structure de la protéine conforme à l'invention comportant le polymorphisme de type SNP a1204g.
La Figure 14 représente le résultat du génotypage du polymorphisme de type SNP a1204g dans une population d'individus.
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Sur cette figure, les abscisses représentent la valeur-mp du filtre Tamra (ddATP) et les ordonnées représentent la valeur mp du filtre R-110 (ddGTP).
En haut à droite, le groupe hétérozygote GA contient 13 individus.
En bas à droite, le groupe homozygote AA contient 225 individus.
En bas à gauche, le groupe d'individus contient 7 individus blancs et 1 individu non génotypé.
DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION Définitions
On entend par"séquence nucléotidique du gène sauvage de référence", la séquence nucléotidique ID SEQ NO 1 du gène IFNa-21 humain,
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a représenté ci-après.
Cette séquence nucléotidique est accessible dans une large séquence répertoriée de la section HTG de la base de donnée GenBank sous le numéro d'accès AC009445.
On entend par"IFNa-21 naturel"le polypeptide codé par la séquence nucléotidique du gène sauvage de référence. La protéine immature de l'IFNa-21 naturel correspond à la séquence d'acides aminés ID SEQ ? 2.
On entend par"polynucléotide", un polyribonucléotide ou un polydésoxyribonucléotide qui peut être un ADN ou un ARN modifié ou non.
Le terme polynucléotide inclut, par exemple, un ADN simple brin ou double brin, un ADN composé d'un mélange d'une ou plusieurs région (s) simple brin et d'une ou plusieurs région (s) double brins, un ARN simple brin ou double brin et un ARN composé d'un mélange d'une ou plusieurs région (s) simple brin et d'une ou plusieurs région (s) double brins. Le terme polynucléotide peut aussi comprendre un ARN et/ou un ADN comprenant une ou plusieurs régions triple brins. On entend également par polynucléotide les ADNs et ARNs contenant une ou plusieurs bases modifiées de façon à avoir un squelette modifié pour la stabilité ou pour d'autres raisons. On entend par base modifiée, par exemple, les bases inhabituelles telles que l'inosine.
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On entend par"polypeptide", un peptide, un oligopeptid, un oligomère ou une protéine comprenant au moins deux acides aminés joints l'un à l'autre par une liaison peptidique normale ou modifiée, comme dans le cas des peptides isostères, par exemple.
Un polypeptide peut être composé d'autres acides aminés que les 20 acides aminés codés par les gènes humains. Un polypeptide peut également être composé d'acides aminés modifiés par des processus naturels, tel que le processus de maturation post-traductionnel ou par des procédés chimiques, qui sont bien connus de l'homme du métier. De telles modifications sont bien détaillées dans la littérature. Ces modifications peuvent apparaître n'importe où dans le polypeptide : dans le squelette peptidique, dans la chaîne d'acides aminés ou encore aux extrémités carboxy-ou amino-terminales.
Un polypeptide peut être ramifié suite à une ubiquitination ou être cyclique avec ou sans ramification. Ce type de modifications peut être le résultat de processus de post-translation naturel ou synthétique, qui sont bien connus de l'homme du métier.
On entend, par exemple, par modifications d'un polypeptide, l'acétylation, l'acylation, l'ADP-ribosylation, l'amidation, la fixation covalente de flavine, la fixation covalente d'un hème, la fixation covalente d'un nucléotide ou d'un dérivé nucléotidique, la fixation covalente d'un lipide ou d'un dérivé lipidique, la fixation covalente d'un phosphatidylinositol, la réticulation covalente ou non-covalente, la cyclisation, la formation de pont disulfure, la
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déméthylation, la formation de cystéine, la formation de pyroglutamate, la formylation, la gamma-carboxylation, la glycosylation, la formation d'ancre au GPI, l'hydroxylation, l'iodisation, la méthylation, la myristoylation, l'oxydation, le processus protéolytique, la phosphorylation, la prénylation, la racémisation, la sénéloylation, la sulfatation, l'addition d'acides aminés telle que l'arginylation ou l'ubiquitination. De telles modifications sont bien détaillées dans la littérature : PROTEINS-STRUCTURE AND MOLECULAR PROPERTIES, 2nd Ed., T. E. Creighton, New York, 1993, POST-TRANSLATIONAL COVALENT MODIFICATION OF PROTEINS, B. C. Johnson, Ed., Academic Press, New
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York, 1983, Seifter et al."Analysis for protein modifications and nonprotein
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cofactors", Meth. Enzymol. (1990) 182 : 626-646 et Rattan et. al."Protein Synthesis : Post-translational Modifications and Aging", Ann NY Acad. Sci.
(1992) 663 : 48-62.
On entend par"polynucléotide isolé"ou"polypeptide isolé"un polynucléotide ou un polypeptide tel que défini précédemment qui est isolé du corps humain ou autrement produit par un procédé technique.
On entend par"identité", la mesure d'identité d'une séquence nucléotidique ou polypeptidique. D'une manière générale, les séquences que l'on veut comparer sont alignées de façon à obtenir la plus grande identité entre ces séquences.
L'identité est un terme bien connu de l'homme du métier et de la littérature. Voir COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY, Lesk, A. M., Ed., Oxford University Press, New York, 1998 ; BIOCOMPUTING INFORMATICS AND GENOME PROJECT, Smith, D. W., Ed., Academic Press, New York, 1993 ; COMPUTER ANALYSIS OF SEQUENCE DATA, PART l, Griffin, A. M. and Griffin H. G., Ed, Humana Press, New Jersey, 1994 ; et SEQUENCE ANALYSIS IN MOLECULAR BIOLOGY, von Heinje, G., Academic Press, 1987.
Les méthodes communément employées pour déterminer l'identité et la similarité entre deux séquences sont également bien décrites dans la littérature. Voir GUIDE TO HUGE COMPUTER, Martin J. Bishop, Ed, Academic Press, San Diego, 1994, et Carillo H. and Lipton D., Siam J Applied Math (1988) 48 : 1073.
Un polynucléotide ayant, par exemple, une identité d'au moins 95 % avec la séquence nucléotidique ID SEQ NO 1 est un polynucléotide qui comporte au plus 5 points de mutation sur 100 nucléotides, par rapport à ladite séquence.
Ces points de mutation peuvent être une (ou plusieurs) substitution (s), addition (s) et/ou délétion (s) d'un (ou plusieurs) nucléotide (s).
De même, un polypeptide ayant, par exemple, une identité d'au moins 95 % avec la séquence d'acides aminés ID SEQ No 2 est un polypeptide qui comporte au plus 5 points de mutation sur 100 acides aminés, par rapport à ladite séquence.
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Ces points de mutation peuvent être une (ou plusieurs) substitution (s), addition (s) et/ou délétion (s) d'un (ou plusieurs) acide (s) aminé (s).
Les polynucléotides et les polypeptides conformes à l'invention qui ne sont pas totalement identique avec respectivement la séquence nucléotidique ID SEQ N 1 ou la séquence d'acides aminés ID SEQ NO2, étant entendu que ces séquences comportent le polymorphisme de type SNP de l'invention, sont considérés comme des variants de ces séquences.
Habituellement un polynucléotide conforme à l'invention possède la même, ou pratiquement la même activité biologique, que la séquence nucléotidique ID SEQ NO1 comportant au moins l'un des polymorphismes de type SNP suivants : c973a, g1011c, t1049a, t1155a, a1204g.
De même, habituellement un polypeptide conforme à l'invention possède la même, ou pratiquement la même activité biologique que la séquence d'acides aminés ID SEQ ? 2 comportant au moins l'un des polymorphismes de type SNP suivants : Q102K, Q114H, V127D, C162stop, K179E.
Un variant, selon l'invention, peut être obtenu, par exemple, par mutagenèse dirigée ou par synthèse directe.
On entend par"polymorphisme de type SNP", toute variation naturelle d'une base dans une séquence nucléotidique.
On entend par"polymorphisme de type SNP fonctionnel", un polymorphisme de type SNP qui a pour conséquence de modifier la fonctionnalité d'un polynucléotide ou d'un polypeptide codé par ce polynucléotide.
On entend par"fonctionnalité", l'activité biologique d'un polypeptide ou d'un polynucléotide codant pour ce polypeptide.
La fonctionnalité d'un polypeptide conforme à l'invention ou d'un polynucléotide codant pour ce polypeptide peut consister en une augmentation, une diminution ou une suppression de l'activité biologique, voire un changement de nature total ou partiel de l'activité biologique soit du polypeptide
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codé par la séquence nucléotidique du gène sauvage de référence soit de cette dernière séquence nucléotidique.
L'activité biologique peut, notamment, être liée à l'affinité ou à l'absence d'affinité du polypeptide vis-à-vis d'un ligand, tel qu'un récepteur.
Polynucléotide
La présente invention a pour premier objet un polynucléotide isolé comprenant : a) une séquence nucléotidique ayant au moins 80 % d'identité, préférentiellement au moins 90 % d'identité, plus préférentiellement au moins
95 % d'identité et encore plus préférentiellement au moins 99 % d'identité avec la séquence ID SEQ No 1 ou sa séquence codante (du nucléotide 670 au nucléotide 1239), sous réserve que cette séquence nucléotidique comporte au moins l'un des polymorphismes de type SNP suivants : - c973a, - g1011c, - t1049a, - t1155a, - a1204g ; ou b) une séquence nucléotidique complémentaire à une séquence nucléotidique sous a).
Le polynucléotide conforme à l'invention peut ainsi comporter un ou plusieurs polymorphisme (s) de type SNP fonctionnel (s) défini (s) précédemment, comme par exemple l'association des polymorphismes g 1011 c et t1049a.
La présente invention concerne également un polynucléotide isolé comprenant : a) la séquence nucléotidique ID SEQ NO 1 ou sa séquence codante sous réserve que chacune de ces séquences comporte au moins l'un des polymorphismes de type SNP suivants : - c973a,
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- g1011c, - t1049a, - t1155a, - a1204g ; ou b) une séquence nucléotidique complémentaire à une séquence nucléotidique sous a).
Préférentiellement, le polynucléotide de l'invention consiste en la séquence ID SEQ NO 1 ou sa séquence codante, sous réserve que chacune de ces séquences comporte au moins l'un des polymorphismes de type SNP suivants : c973a, g1011c, t1049a, t1155a, a1204g ; et sa séquence nucléotidique complémentaire.
Selon l'invention, le polynucléotide défini précédemment comporte préférentiellement un seul polymorphisme de type SNP choisi dans le groupe constitué par : - c973a, - g1011c, - t1049a, - t1155a, et - a1204g.
La présente invention a aussi pour objet un polynucléotide codant pour un polypeptide comprenant : a) la séquence d'acides aminés ID SEQ NO 2, ou b) la séquence d'acides aminés comprenant les acides aminés compris entre 24 et 189 de la séquence d'acides aminés ID SEQ ? 2, sous réserve que chacune des séquences d'acides aminés sous a) et b) comporte au moins l'un des polymorphismes de type SNP suivants : - Q102K, - Q114H, - V127D, - C162stop, - K179E.
Selon un objet préféré de l'invention, le polypeptide défini
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précédemment comporte un seul polymorphisme de type SNP tel que défini cidessus.
Préférentiellement le polynucléotide conforme à l'invention comprend une molécule d'ADN ou d'ARN.
Le polynucléotide de l'invention peut être obtenu par les méthodes standards de synthèse d'ADN ou d'ARN.
Ce polynucléotide peut également être obtenu par mutagenèse
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dirigée à partir de la séquence nucléotidique du gène FNa-21 en modifiant l'un au moins des nucléotides c, g, t, t et a par respectivement les nucléotides a, c, a, a et g en position 973, 1011, 1049, 1155 et 1204 sur la séquence ID SEQ No 1.
Les procédés de mutagenèse dirigée qui peuvent ainsi être mis en oeuvre sont bien connus de l'homme du métier. On peut notamment évoquer la publication de TA Kunkel en 1985 dans"Proc. Natal. Acad. Sci. USA"82 : 488.
Le polynucléotide isolé peut également comprendre, par exemple, des séquences nucléotidiques codant pour des séquences d'acides aminés pre-, pro-ou pre-pro-protéine ou des séquences d'acides aminés marqueurs, comme l'hexa-histidine peptide.
Le polynucléotide de l'invention peut également être associé à des séquences nucléotidiques codant pour d'autres protéines ou fragments de protéines en vue d'obtenir des protéines de fusion ou à des fins de purification.
Le polynucléotide conforme à l'invention peut également comprendre des séquences nucléotidiques comme les séquences 5'et/ou 3' non-codantes, telles que, par exemple, des séquences transcrites ou nontranscrites, des séquences non-traduites, des séquences signal d'épissage, des séquences polyadénylées, des séquences de liaison avec des ribosomes ou encore des séquences qui stabilisent l'ARNm.
On définit comme séquence nucléotidique complémentaire à la séquence nucléotidique un polynucléotide qui peut être hybridé avec cette séquence nucléotidique, dans des conditions stringentes.
On entend généralement, mais pas nécessairement, par "conditions stringentes d'hybridation"les conditions chimiques qui permettent
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une hybridation lorsque les séquences nucléotidiques ont une identité d'au moins 80 %, de préférence supérieure ou égale à 90 %, encore plus préférentiellement supérieure ou égale à 95 % et tout particulièrement supérieure ou égale à 99 %.
Dans le cadre de l'invention, lorsque les conditions stringentes d'hybridation permettent une hybridation des séquences nucléotidiques ayant une identité égale à 100 %, on considère que la séquence nucléotidique est strictement complémentaire à la séquence nucléotidique sous a), telle que décrite plus haut.
Les conditions stringentes peuvent être obtenues selon les méthodes bien connues de l'homme du métier et, par exemple, par une incubation des polynucléotides, à 42 C, dans une solution comprenant 50 % de formamide, 5xSSC (150 Mm de NaCI, 15 mM de trisodium citrate), 50 Mm de sodium phosphate (pH = 7,6), 5x Solution Denhardt, 10 % de dextran sulfate et 20 J. ! g d'ADN de sperme de saumon dénaturé, suivi d'un lavage des filtres à 0, 1x SSC, à 650 C.
Il est bien entendu, au sens de la présente invention, que la séquence nucléotidique complémentaire d'une séquence nucléotidique comportant l'un au moins des polymorphismes de type SNP conforme à l'invention doit comporter le même polymorphisme de type SNP en anti-sens.
Ainsi, par exemple, si la séquence nucléotidique comporte le polymorphisme de type SNP a1204g, sa séquence nucléotidique complémentaire comporte toujours le nucléotide c en position 1204.
Identification, hybridation et/ou amplification d'un polynucléotide comportant le polymorphisme de type SNP
La présente invention a aussi pour objet l'utilisation de tout ou partie d'un polynucléotide défini précédemment, pour identifier, hybrider et/ou amplifier tout ou partie d'un polynucléotide consistant en la séquence ID SEQ NO 1 ou sa séquence codante (du nucléotide 670 au nucléotide 1239), sous réserve que chacune de ces séquences comporte au moins l'un des polymorphismes de type SNP suivants :
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- c973a, - g1011c, - t1049a, - t1155a, - a1204g.
Génotypage et détermination de la fréquence du polymorphisme de type SNP
La présente invention a également pour objet l'utilisation de tout ou partie d'un polynucléotide conforme à l'invention comme outil de génotypage.
La présente invention a aussi pour objet un procédé de détermination de la fréquence du polymorphisme de type SNP d'un polynucléotide conforme à l'invention dans lequel on procède à un génotypage chez un individu ou dans une population d'individus.
Au sens de l'invention, on définit le génotypage comme un procédé de détermination du génotype d'un individu ou d'une population d'individus.
Le polymorphisme de type SNP fonctionnel conforme à l'invention est préférentiellement génotypé dans une population d'individus.
On entend par"population d'individus", un groupe d'individus déterminés de façon aléatoire ou non. Ces individus peuvent être des humains, des animaux ou des plantes.
Lorsque ladite population d'individus est déterminée de façon non aléatoire, les individus peuvent être choisis selon leur ethnie ou selon leur phénotype, notamment ceux qui sont atteints par les dérèglements et/ou maladies suivantes : les différents cancers comme, par exemple, les carcinomes, les mélanomes, les lymphomes, les myélomes, les tumeurs cancéreuses ou non, les leucémies et les cancers du foie, du cou, de la tête et des reins, les maladies cardiovasculaires, les maladies métaboliques telles que celles qui ne sont pas liées au système immunitaire comme, par exemple, l'obésité, les maladies infectieuses en particulier les infections virales comme les hépatites B et C et le SIDA, les pneumonies, les colites ulcératives, les maladies du système nerveux central comme, par exemple, la maladie
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d'Alzheimer, la schizophrénie et la dépression, le rejet de greffe de tissus ou d'organes, la cicatrisation de blessures, l'anémie en particulier chez les patients dialysés, les allergies, l'asthme, les scléroses multiples, l'ostéoporose, le psoriasis, l'arthrite rhumatoïde, la maladie de Crohn, les maladies et les désordres auto-immuns, les verrues génitales ou vénériennes, les désordres gastro-intestinaux ou encore les désordres liés aux traitements par chimiothérapie.
Le génotypage peut être effectué par un miniséquençage avec des ddNTPs chauds (2 ddNTPs différents marqués par des fluorophores différents) et froids (2 ddNTPs non marqués), en liaison avec un lecteur de fluorescence polarisé. Le protocole de miniséquençage avec lecture de fluorescence polarisée (Technologie FP-TDI ou Fluorescence Polarization Template-direct Dye-Terminator Incorporation) est bien connu de l'homme du métier.
Il peut être réalisé sur un produit obtenu après amplification par réaction de polymérisation en chaîne (PCR) de l'ADN de chaque individu. Ce produit PCR est choisi pour couvrir la région génique du polynucléotide contenant le polymorphisme de type SNP étudié. Après la dernière étape dans le thermocycleur de la PCR, la plaque est alors placée sur un lecteur de fluorescence polarisée pour la lecture des bases marquées en utilisant les filtres d'excitation et d'émission spécifique des fluorophores. Les valeurs d'intensité des bases marquées sont reportées sur un graphe.
Les amorces respectivement sens et antisens pour l'amplification PCR, dans le cas du polymorphisme de type SNP conforme à l'invention, peuvent comprendre par exemple les séquences nucléotidiques ID SEQ No 3 et ID SEQ N 4.
Ces séquences nucléotidiques permettent d'amplifier un fragment d'une longueur de 696 nucléotides, du nucléotide 620 au nucléotide 1315, du gène de l'lFNoc-21 (ces nucléotides étant numérotés en référence à la séquence
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nucléotidique ID SEQ N 1).
Une analyse statistique de la fréquence de chaque allèle (fréquence allélique) codé par le gène comportant le SNP dans la population
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d'individus est alors effectuée, ce qui permet de déterminer l'importance de leur impact et leur répartition dans les différents sous-groupes et notamment, le cas échéant, les diverses ethnies qui constituent cette population d'individus.
Les données de génotypage sont analysées pour estimer les fréquences de distributions des différents allèles observés dans. les populations étudiées. Les calculs de fréquences alléliques peuvent être réalisés à l'aide de logiciels tels SAS-suite@ (SAS) ou PLUS@ (MathSoft). La comparaison des distributions alléliques du polymorphisme de type SNP de l'invention au travers des différentes ethnies de la population d'individus peut être réalisée au moyen des logiciels ARLEQUIN@ et SAS-suite@.
La présente invention a également pour objet l'utilisation d'un polynucléotide conforme à l'invention pour la recherche d'une variation dans la séquence nucléotidique du gène IFNa-21 chez un individu.
Vecteur d'expression et cellule hôte
La présente invention a aussi pour objet un vecteur recombinant comprenant au moins un polynucléotide conforme à l'invention.
De nombreux systèmes d'expression peuvent être utilisés, comme, par exemple, les chromosomes, les épisomes, les virus dérivés. Plus particulièrement, les vecteurs recombinants utilisés peuvent être dérivés de plasmides bactériens, de transposons, d'épisome de levure, d'éléments d'insertion, d'éléments chromosomiques de levures, de virus tels que les baculovirus, les papillonna virus comme SV40, les vaccinia virus, les adénovirus, les fox pox virus, les pseudorabies virus, les rétrovirus.
Ces vecteurs recombinants peuvent également être des dérivés de cosmides ou de phagemides. La séquence nucléotidique peut être insérée dans le vecteur recombinant d'expression par les méthodes bien connues de l'homme du métier, telles que, par exemple, celles qui sont décrites dans MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL (supra) Sambrook et al..
Le vecteur recombinant peut comprendre des séquences nucléotidiques de contrôle de la régulation de l'expression du polynucléotide ainsi que des séquences nucléotidiques permettant l'expression et la
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transcription d'un polynucléotide de l'invention et la traduction d'un-polypeptide de l'invention, ces séquences étant choisies en fonction des cellules hôtes mises en oeuvre.
Ainsi, par exemple, un signal de sécrétion approprié peut être intégré dans le vecteur recombinant pour que le polypeptide, codé par le polynucléotide de l'invention, soit dirigé vers la lumière du réticulum endoplasmique, vers l'espace périplasmique, sur la membrane ou vers l'environnement extracellulaire.
La présente invention a aussi pour objet une cellule hôte comprenant un vecteur recombinant conforme à l'invention.
L'introduction du vecteur recombinant dans une cellule hôte peut être effectuée selon les méthodes bien connues de l'homme du métier telles que celles décrites dans BASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, Davis et al., 1986 et MOLECULAR CLONING : A LABORATORY MANUAL, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y., 1989, telles que la transfection par calcium phosphate, le transfection par DEAE dextran, la transvection, la microinjection, la transfection par lipides cationiques, l'électroporation, la transduction ou l'infection.
Les cellules hôtes peuvent être, par exemple, des cellules bactériennes telles que les cellules de streptocoque, de staphylocoque, d'E. coli ou de Bacillus subtilis, des cellules de champignons telles que les cellules de levure et les cellules d'Aspergillus, de Streptomyces, des cellules d'insectes telles que les cellules de Drosophilia S2 et de Spodoptera Sf9, des cellules animales, telles que les cellules CHO, COS, HeLa, C127, BHK, HEK 293 et des cellules humaines du sujet à traiter ou encore des cellules végétales.
Les cellules hôtes peuvent être utilisées, par exemple, pour exprimer un polypeptide de l'invention ou en tant que produit actif dans des compositions pharmaceutiques, comme on le verra ci-après.
Polypeptide La présente invention a aussi pour objet un polypeptide isolé comprenant une séquence d'acides aminés ayant au moins 80 % d'identité,
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préférentiellement au moins 90 % d'identité, plus préférentiellement au moins 95 % d'identité et encore plus préférentiellement au moins 99 % d'identité avec : a) la séquence d'acides aminés ID SEQ NO 2, ou avec b) la séquence d'acides aminés comportant les acides aminés compris entre 24 et 189 de la séquence d'acides aminés ID SEQ NO 2, sous réserve que chacune des séquences d'acides aminés sous a) et b) comporte au moins l'un des polymorphismes de type SNP suivants : - Q102K, - Q114H, - V127D, - C162stop, - K179E.
Le polypeptide de l'invention peut également comprendre : a) la séquence d'acides aminés ID SEQ NO 2, ou b) la séquence d'acides aminés comportant les acides aminés compris entre 24 et 189 de la séquence d'acides aminés ID SEQ ? 2, sous réserve que chacune des séquences d'acides aminés sous a) et b) comporte au moins l'un des polymorphismes de type SNP suivants : - Q102K, - Q114H, - V127D, - C162stop, - K179E.
Le polypeptide de l'invention peut tout particulièrement consister en : a) la séquence d'acides aminés ID SEQ N 2, ou b) la séquence d'acides aminés comportant les acides aminés compris entre 24 et 189 de la séquence d'acides aminés ID SEQ No 2, sous réserve que chacune des séquences d'acides aminés sous a) et b) comporte au moins l'un des polymorphismes de type SNP suivants : - Q102K, - Q114H,
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- V127D, - C162stop, - K179E.
Conformément à la présente invention, un polypeptide conforme à l'invention ne peut comporter simultanément les polymorphismes de type SNP C162stop et K179E.
Préférentiellement, un polypeptide conforme à l'invention comporte un seul polymorphisme de type SNP choisi dans le groupe constitué par : - Q102K, - Q114H, - V127D, - C162stop, et - K179E.
La présente invention a également pour objet un procédé de préparation d'un polypeptide ci-dessus décrit, dans lequel une cellule hôte définie précédemment est cultivée et ledit polypeptide est isolé du milieu de culture.
Le polypeptide peut être purifié à partir des cellules hôtes, selon les méthodes bien connues de l'homme du métier telles que la précipitation à l'aide d'agents chaotropiques comme les sels, en particulier le sulfate d'ammonium, l'methanol l'acétone ou l'acide trichloroacétique, l'extraction à l'acide ; la chromatographie échangeuse d'ions ; la chromatographie par phosphocellulose ; la chromatographie par interaction hydrophobe ; la chromatographie d'affinité ; la chromatographie hydroxylapatite ou les chromatographies d'exclusion.
On entend par"milieu de culture", le milieu dans lequel on purifie le polypeptide de l'invention. Ce milieu peut être constitué par le milieu extracellulaire et/ou le lysat cellulaire. Des techniques biens connues de l'homme du métier permettent également à ce dernier de redonner la conformation active au polypeptide, si la conformation dudit polypeptide a été altérée lors de l'isolation ou de la purification.
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Anticorps La présente invention a aussi pour objet un procédé d'obtention d'un anticorps immunospécifique.
On entend par"anticorps", les anticorps monoclonaux, polyclonaux, chimériques, simple chaîne, humanisés ainsi que les fragments Fab, incluant les produits d'un Fab ou d'une banque d'expression d'immunoglobulines.
Un anticorps immunospécifique peut être obtenu par immunisation d'un animal avec un polypeptide conforme à l'invention.
L'invention concerne aussi un anticorps immunospécifique pour un polypeptide conforme à l'invention, tel que défini précédemment.
Un polypeptide selon l'invention, un de ses fragments, un analogue, un de ses variants ou une cellule exprimant ce polypeptide peuvent aussi être utilisés pour produire des anticorps immunospécifiques.
Le terme"immunospécifique"signifie que l'anticorps possède une meilleure affinité pour le polypeptide de l'invention que pour d'autres polypeptides connus de l'art antérieur.
Les anticorps immunospécifiques peuvent être obtenus par administration d'un polypeptide de l'invention, d'un de ses fragments, d'un analogue ou d'un fragment épitopique ou d'une cellule exprimant ce polynucléotide chez un mammifère, de préférence non humain, selon les méthodes bien connues de l'homme du métier.
Pour la préparation d'anticorps monoclonaux, on peut utiliser des méthodes usuelles de production d'anticorps, à partir de lignées cellulaires, telles que la technique des hybridomes (Kohler et al., Nature (1975) 256 : 495- 497), la technique des triomes, la technique des hybridomes de cellules B humaines (Kozbor et al., Immunology Today (1983) 4 : 72) et la technique des hybridomes EBV (Cole et al., MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, pp. 77-96, Alan R. Liss, 1985).
Les techniques de production d'anticorps simple-chaîne telles que décrites, par exemple, dans US No 4,946, 778 peuvent être également utilisées.
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Des animaux transgéniques comme les souris, par exemple, peuvent être également utilisés pour produire des anticorps humanisés.
Agents interagissant avec le polypeptide de l'invention
La présente invention a également pour objet un procédé d'identification d'un agent activateur ou inhibiteur d'un polypeptide conforme à l'invention, comprenant : a) la mise en présence de cellules hôtes, telles que définies ci-dessus avec un agent à tester, et b) la détermination de l'effet activateur, ou inhibiteur, généré par l'agent à tester.
Un polypeptide conforme à l'invention peut ainsi être employé pour un procédé de criblage de composés qui rentrent en interaction avec celuici.
Ces composés peuvent être des agents activateurs (agonistes) ou inhibiteurs (antagonistes) de l'activité intrinsèque d'un polypeptide selon l'invention. Ces composés peuvent également être des ligands ou des substrats d'un polypeptide de l'invention. Voir Coligan et al., Current Protocols in Immunology 1 (2), Chapter 5 (1991).
En général, pour mettre en place un tel procédé, il est d'abord souhaitable de produire des cellules hôtes appropriées qui expriment un polypeptide conforme à l'invention. De telles cellules peuvent être, par exemple, des cellules de mammifères, de levures, d'insectes comme Drosophilia ou de bactéries comme E. coli.
Ces cellules ou des extraits de membrane de ces cellules, sont alors mises en présence des composés à tester.
On peut ainsi observer la capacité de liaison des composés à tester avec le polypeptide de l'invention, mais également l'inhibition ou l'activation de la réponse fonctionnelle.
L'étape b) du procédé ci-dessus peut être mise en oeuvre en utilisant un agent à tester marqué directement ou indirectement. Elle peut aussi comprendre un test de compétition, en utilisant un agent marqué ou non et un agent compétiteur marqué.
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On peut également déterminer si un agent à tester conduit à la génération d'un signal d'activation ou d'inhibition sur des cellules exprimant le polypeptide de l'invention, en utilisant des moyens de détection appropriés, suivant le signal à détecter.
De tels agents activateurs ou inhibiteurs peuvent être des polynucléotides, et dans certains cas des oligonucléotides ou des polypeptides, comme des protéines ou des anticorps, par exemple.
La présente invention a aussi pour objet une méthode pour l'identification d'un agent activé ou inhibé par un polypeptide conforme à l'invention, comprenant : a) la mise en présence de cellules hôtes obtenues comme décrit ci-dessus avec un agent à tester, et b) la détermination de l'effet activateur ou inhibiteur, généré par ledit polypeptide sur l'agent à tester.
Un agent activé ou inhibé par le polypeptide de l'invention est un agent qui répond, respectivement, par une activation ou une inhibition en présence de ce polypeptide. Les agents activés ou inhibés, directement ou indirectement, par le polypeptide de l'invention peuvent consister en des polypeptides comme, par exemple, des récepteurs membranaires ou nucléaires, des kinases et plus préférentiellement des tyrosines kinases, des facteurs de transcription ou des polynucléotides.
Détection de maladies
La présente invention a aussi pour objet un procédé de détection de l'expression et/ou de l'activité d'un polypeptide conforme à l'invention, comprenant : a) la détection de la présence ou de l'absence d'un polynucléotide selon l'invention dans le génome du sujet, et/ou b) la détection de la présence, de l'absence et/ou d'une concentration prédéterminée d'un polypeptide selon l'invention chez un sujet.
La détection d'un polynucléotide et d'un polypeptide de l'invention peut ainsi permettre de savoir si un sujet est atteint ou risque d'être atteint ou,
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au contraire, présente une résistance partielle au développement d'une maladie, d'une indisposition ou d'un dérèglement tels que définis précédemment, relatifs à l'expression et/ou l'activité d'un polypeptide de l'invention.
La concentration"normale"d'un polypeptide peut être prédéterminée par l'homme du métier par des tests ou des essais conventionnels qui lui permettront d'identifier le seuil au-dessus ou en dessous duquel apparaît la sensibilité ou, au contraire, la résistance à la maladie, l'indisposition ou le dérèglement évoqué ci-dessus.
Le polynucléotide à tester peut être obtenu à partir d'échantillons biologiques du sujet à étudier, tels que des cellules, du sang, de l'urine, de la salive, ou à partir d'une biopsie ou d'une autopsie du sujet à étudier. L'ADN génomique peut être utilisé directement pour la détection ou après à une amplification par PCR, par exemple. L'ARN ou l'ADNc peuvent également être utilisés de façon similaire.
Il est ensuite possible de comparer la séquence nucléotidique d'un polynucléotide conforme à l'invention avec la séquence nucléotidique détectée dans le génome du sujet.
La comparaison des séquences nucléotidiques peut être effectuée par séquençage par des méthodes d'hybridation de l'ADN, par différence de mobilité des fragments d'ADN sur gel d'électrophorèse avec ou sans agents dénaturants ou par différence de températures de fusion. Voir Myers et al., Science (1985) 230 : 1242. De telles modifications dans la structure de la séquence nucléotidique en un point précis peuvent également être révélées par des essais de protection aux nucléases, telles que l'ARNase et la nucléase S1 ou encore par des agents chimiques de clivage. Voir Cotton et al., Proc. Nat.
Acad. Sci. USA (1985) 85 : 4397-4401. Des sondes oligonucléotidiques comprenant un fragment d'un polynucléotide de l'invention peuvent également être utilisées pour conduire le criblage.
De nombreuses méthodes bien connues de l'homme du métier peuvent être utilisées pour déterminer l'expression d'un polynucléotide de
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l'invention et pour identifier la variabilité génétique de ce polynucléotide. Voir Chee et al., Science (1996), Vol 274, pp 610-613.
La présente invention a également pour objet l'utilisation d'un polynucléotide conforme à l'invention pour effectuer un diagnostic génétique d'une maladie ou d'une résistance à une maladie liée à la présence, chez un ou plusieurs individus de la population humaine, de l'allèle mutant codé par le polymorphisme de type SNP fonctionnel conforme à l'invention.
Ces maladies peuvent être des dérèglements et/ou des maladies humaines, tels que les différents cancers comme, par exemple, les carcinomes, les mélanomes, les lymphomes, les myélomes, les tumeurs cancéreuses ou non, les leucémies et les cancers du foie, du cou, de la tête et des reins, les maladies cardiovasculaires, les maladies métaboliques telles que celles qui ne sont pas liées au système immunitaire comme, par exemple, l'obésité, les maladies infectieuses en particulier les infections virales comme les hépatites B et C et le SIDA, les pneumonies, les colites ulcératives, les maladies du système nerveux central comme, par exemple, la schizophrénie et la dépression, le rejet de greffe de tissus ou d'organes, la cicatrisation de blessures, l'anémie en particulier chez les patients dialysés, les allergies, l'asthme, les scléroses multiples, l'ostéoporose, le psoriasis, l'arthrite rhumatoïde, la maladie de Crohn, les maladies et les désordres auto-immuns, les verrues génitales ou vénériennes, les désordres gastro-intestinaux ou encore les désordres liés aux traitements par chimiothérapie.
Préférentiellement, ces maladies peuvent être des hépatites chroniques B et C, des leucémies telles que la leucémie à trichloroleucocytes et la leucémie myéloïde chronique, des myélomes multiples, des lymphomes folliculaires, des tumeurs carcinoïdes, des mélanomes malins, des carcinomes rénaux métastasés, la maladie d'Alzheimer, la maladie de Parkinson ainsi que des tumeurs qui apparaissent à la suite d'un déficit immunitaire, tel que le sarcome de Kaposi dans le cas du SIDA.
De même, la présence, l'absence et/ou la concentration de polypeptide selon l'invention peuvent aider au diagnostic d'une maladie, une indisposition ou un dérèglement ou, au contraire, la résistance à une maladie,
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une indisposition ou un dérèglement chez un sujet en prélevant un échantillon dérivé de ce sujet.
L'augmentation ou la diminution de l'expression du polypeptide peut être mesurée en quantifiant le niveau d'ARN codant pour ce polypeptide, suivant les méthodes bien connues de l'homme du métier, par exemple, par PCR, RT-PCR, protection à l'ARNase, Northern blot, et autres méthodes d'hybridation.
Il est également possible de déterminer la concentration en polypeptides de l'invention présents dans un échantillon biologique du sujet par des méthodes bien connues, par exemple, par radioimmunoessai, tests de liaisons compétitives, Western blot et tests ELISA.
Médicaments et traitements des maladies
Les polypeptides de l'invention possèdent de très intéressantes propriétés pharmacologiques puisqu'ils ont une structure tridimensionnelle et une fonctionnalité différente par rapport à)') FNa-21 nature !.
Ces propriétés justifient l'utilisation d'un polypeptide conforme à l'invention pour le traitement thérapeutique du corps humain, c'est-à-dire à titre de médicament.
C'est pourquoi la présente invention a pour objet un médicament renfermant, à titre de principe actif, un polypeptide conforme à l'invention.
L'invention concerne encore l'utilisation d'un polypeptide conforme à l'invention, pour la fabrication d'un médicament destinée à la prévention ou au traitement de différents dérèglements et/ou maladies humaines, tels que les différents cancers comme, par exemple, les carcinomes, les mélanomes, les lymphomes, les myélomes, les tumeurs cancéreuses ou non, les leucémies et les cancers du foie, du cou, de la tête et des reins, les maladies cardiovasculaires, les maladies métaboliques telles que celles qui ne sont pas liées au système immunitaire comme, par exemple, l'obésité, les maladies infectieuses en particulier les infections virales comme les hépatites B et C et le SIDA, les pneumonies, les colites ulcératives, les maladies du système nerveux central comme, par exemple, la schizophrénie et la dépression, le rejet de
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greffe de tissus ou d'organes, la cicatrisation de blessures, l'anémie en particulier chez les patients dialysés, les allergies, l'asthme, les scléroses multiples, l'ostéoporose, le psoriasis, l'arthrite rhumatoïde, la maladie de Crohn, les maladies et les désordres auto-immuns, les verrues génitales ou vénériennes, les désordres gastro-intestinaux ou encore les désordres liés aux traitements par chimiothérapie.
Préférentiellement, le polypeptide conforme à l'invention peut être utilisé pour la fabrication d'un médicament destinée à la prévention ou au traitement de différents dérèglements et/ou maladies humaines, tels que les hépatites chroniques B et C, les leucémies telles que la leucémie à trichloroleucocytes et la leucémie myéloïde chronique, les myélomes multiples, les lymphomes folliculaires, les tumeurs carcinoïdes, les mélanomes malins, les carcinomes rénaux métastasés, la maladie d'Alzheimer, la maladie de Parkinson ainsi que les tumeurs qui apparaissent à la suite d'un déficit immunitaire, tel que le sarcome de Kaposi dans le cas du SIDA.
Certains des composés permettant d'obtenir le polypeptide conforme à l'invention ainsi que les composés obtenus ou identifiés par ou à partir de ce polypeptide peuvent également être utilisés pour le traitement thérapeutique du corps humain, c'est-à-dire à titre de médicament.
C'est pourquoi la présente invention a aussi pour objet un médicament contenant, à titre de principe actif un polynucléotide conforme à l'invention, un vecteur recombinant défini précédemment, une cellule hôte définie précédemment, un anticorps défini précédemment et/ou un agent activateur et/ou inhibiteur d'un polypeptide conforme à l'invention.
L'invention concerne encore l'utilisation d'un polynucléotide conforme à l'invention, d'un vecteur recombinant défini précédemment, d'une cellule hôte définie précédemment, d'un anticorps défini précédemment et/ou un agent activateur et/ou inhibiteur d'un polypeptide conforme à l'invention, pour la fabrication d'un médicament destinée à la prévention ou au traitement de différents dérèglements et/ou maladies humaines, tels que les différents cancers comme, par exemple, les carcinomes, les mélanomes, les lymphomes, les myélomes, les tumeurs cancéreuses ou non, les leucémies et les cancers
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du foie, du cou, de la tête et des reins, les maladies cardiovasculaires, les maladies métaboliques telles que celles qui ne sont pas liées au système immunitaire comme, par exemple, l'obésité, les maladies infectieuses en particulier les infections virales comme les hépatites B et C et le SIDA, les pneumonies, les colites ulcératives, les maladies du système nerveux central comme, par exemple, la schizophrénie et la dépression, le rejet de greffe de tissus ou d'organes, la cicatrisation de blessures, l'anémie en particulier chez les patients dialysés, les allergies, l'asthme, les scléroses multiples, l'ostéoporose, le psoriasis, l'arthrite rhumatoïde, la maladie de Crohn, les maladies et les désordres auto-immuns, les verrues génitales ou vénériennes, les désordres gastro-intestinaux ou encore les désordres liés aux traitements par chimiothérapie.
Préférentiellement, un polynucléotide conforme à l'invention, un vecteur recombinant défini précédemment, une cellule hôte définie précédemment, un anticorps défini précédemment et/ou un agent activateur et/ou inhibiteur d'un polypeptide conforme à l'invention peuvent être utilisés pour la fabrication d'un médicament destinée à la prévention ou au traitement de différents dérèglements et/ou maladies humaines, tels que les hépatites chroniques B et C, les leucémies telles que la leucémie à trichloroleucocytes et la leucémie myéloïde chronique, les myélomes multiples, les lymphomes folliculaires, les tumeurs carcinoïdes, les mélanomes malins, les carcinomes rénaux métastasés, la maladie d'Alzheimer, la maladie de Parkinson ainsi que les tumeurs qui apparaissent à la suite d'un déficit immunitaire, tel que le sarcome de Kaposi dans le cas du SIDA.
Le dosage d'un polypeptide et des autres composés de l'invention, utiles en tant que principe actif, dépend du choix du composé, du mode d'administration, de la nature de la formulation, de la nature du sujet et du jugement du médecin.
* Lorsqu'il est utilisé comme principe actif, un polypeptide conforme à l'invention est généralement administré à des doses comprises entre 1 et 100 g/kg du sujet.
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Figure img00350001
L'invention a aussi pour objet une composition pharmaceutique qui renferment au moins un composé précité, tel qu'un polypeptide conforme à l'invention, un polynucléotide conforme à l'invention, un vecteur recombinant défini précédemment, une cellule hôte définie précédemment, un anticorps défini précédemment et/ou un agent activateur et/ou inhibiteur d'un polypeptide conforme à l'invention, à titre de principe actif, ainsi qu'un excipient pharmaceutiquement acceptable.
Dans ces compositions pharmaceutiques, le principe actif est avantageusement présent à des doses physiologiquement efficaces.
Ces compositions pharmaceutiques peuvent être, par exemple, solides ou liquides et se présenter sous les formes pharmaceutiques couramment utilisées en médecine humaine, comme par exemple les comprimés simples ou dragéifiés, les gélules, les granulés, les caramels, les suppositoires et de préférence les préparations injectables et les poudres pour injectables. Ces formes pharmaceutiques peuvent être préparées selon les méthodes usuelles.
Le ou les principes actifs peuvent y être incorporés à des excipients habituellement employés dans ces compositions pharmaceutiques,
Figure img00350002

tels que le talc, la gomme arabique, le lactose, l'amidon, le dextrose, le glycérol, l'éthanol, le stéarate de magnésium, le beurre de cacao, les véhicules aqueux ou non, les corps gras d'origine animale ou végétale, les dérivés paraffiniques, les glycols, les divers agents mouillants, dispersants ou émulsifiants, les conservateurs.
Le ou les principes actifs conforme à l'invention peuvent être employés seul ou en combinaison avec d'autres composés, tels que des composés thérapeutiques tels que d'autres IFNa, voire d'autres cytokines comme les interleukines, par exemple.
Les différentes formulations des compositions pharmaceutiques sont adaptées suivant le mode d'administration.
Les compositions pharmaceutiques peuvent être administrées par les différentes voies d'administration connues de l'homme du métier.
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Figure img00360001
L'invention a également pour objet une composition de diagnostic qui renferment au moins un composé précité, tel qu'un polypeptide conforme à l'invention, un polynucléotide conforme à l'invention, un vecteur recombinant défini précédemment, une cellule hôte définie précédemment, un anticorps défini précédemment et/ou un agent activateur et/ou inhibiteur d'un polypeptide conforme à l'invention, à titre de principe actif, ainsi qu'un excipient approprié pharmaceutiquement acceptable.
Les excipients appropriés utilisés dans la composition de diagnostic sont généralement des tampons et des conservateurs.
La présente invention a également pour objet l'utilisation : a) d'une quantité thérapeutiquement efficace d'un agent activateur défini précédemment et/ou b) d'une quantité thérapeutiquement efficace d'un polypeptide selon l'invention, et/ou c) d'un polynucléotide selon l'invention, et/ou d) d'une cellule hôte du sujet à traiter, définie précédemment, pour préparer un médicament destiné à augmenter l'expression ou l'activité chez un sujet, d'un polypeptide conforme à l'invention.
Ainsi, pour traiter un sujet qui a besoin d'une augmentation de l'expression ou de l'activité d'un polypeptide de l'invention, plusieurs méthodes sont possibles.
Il est possible d'administrer au sujet une quantité thérapeutiquement efficace d'un polypeptide de l'invention et/ou d'un agent activateur et/ou activé tels que définis précédemment, éventuellement en combinaison, avec un excipient pharmaceutiquement acceptable.
Il est également possible d'augmenter la production endogène d'un polypeptide de l'invention par administration au sujet d'un polynucléotide selon l'invention. Par exemple, ce polynucléotide peut être inséré dans un vecteur rétroviral d'expression. Un tel vecteur peut être isolé à partir de cellules ayant été infectées par un vecteur de plasmide rétroviral contenant de l'ARN codant pour le polypeptide de l'invention, de telle façon pour que les cellules transduites produisent des particules virales infectieuses contenant le gène
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Figure img00370001

d'intérêt. Voir Gene Therapy and other Molecular Genetic-based-Therapeutic Approaches, Chapter 20, in Human Molecular Genetics, Strachan and Read, BIOS Scientifics Publishers Ltd (1996).
Il est également possible d'administrer au sujet des cellules hôtes lui appartenant, ces cellules hôtes ayant été prélevées et modifiées, au préalable, de façon à exprimer le polypeptide de l'invention, comme décrit précédemment.
La présente invention concerne également l'utilisation : a) d'une quantité thérapeutiquement efficace d'un agent inhibiteur défini précédemment, et/ou b) d'une quantité thérapeutiquement efficace d'un anticorps immunospécifique défini précédemment, et/ou c) d'un polynucléotide permettant d'inhiber l'expression d'un polynucléotide conforme à l'invention, pour préparer un médicament destiné à diminuer l'expression ou l'activité, chez un sujet, d'un polypeptide conforme à l'invention.
Ainsi, il est possible d'administrer au sujet une quantité thérapeutiquement efficace d'un agent inhibiteur et/ou d'un anticorps tels que définis précédemment, éventuellement en combinaison, avec un excipient pharmaceutiquement acceptable.
Il est également possible de diminuer la production endogène d'un polypeptide de l'invention par administration au sujet d'un polynucléotide complémentaire conforme à l'invention permettant d'inhiber l'expression d'un polynucléotide de l'invention.
PARTIE EXPERIMENTAL Exemple 1 : Modélisation d'une protéine codée par un polynucléotide de séquence nucléotidique comportant un polymorphisme de type SNP conforme à l'invention et de la protéine codée par la séquence nucléotidique du gène sauvage de référence
Dans une première étape la structure tridimensionnelle de IFNa- 21 a été construite à partir de celle de IFNa-2 dont la structure est disponible
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Figure img00380001

dans la base de données PDB (code HTF) et ce en utilisant le logiciel Modeler (MSI, San Diego, CA).
Le fragment polypeptidique mature a ensuite été modifié de façon à reproduire la mutation Q102K, Q114H, V127D, C162stop ou K179E.
Un millier d'étapes de minimisations moléculaires ont été conduites sur les fragments mutés en utilisant les programmes AMBER et DISCOVER (MSI : Molecular Simulations Inc.).
Deux suites de calculs de dynamiques moléculaires ont ensuite été effectuées avec le même programme et les mêmes champs de forces.
Dans chaque cas, 50000 étapes ont été calculées à 300K, terminées par 300 étapes d'équilibration.
Le résultat de cette modélisation est visualisé sur les Figures 1,2, 3,4, 5,6, 7,8 et 9.
Exemple 2 : Génotypage d'un polymorphisme de type SNP conforme à l'invention dans une population d'individus
Le génotypage de SNPs est basé sur le principe du miniséquençage dont le produit est détecté par une lecture de fluorescence polarisée. La technique consiste en un miniséquençage fluorescent (Technologie FP-TDI ou Fluorescence Polarization Template-direct Dyeterminator Incorporation).
Le miniséquençage consiste à allonger un oligonucléotide amorce, placé juste en amont du site polymorphe, par des didéoxynucléotides fluoromarqués à l'aide d'une enzyme polymérase. Le résultat de cet allongement est directement analysé par une lecture de fluorescence polarisée.
A) Protocole
Le miniséquençage est réalisé sur un produit obtenu après amplification par PCR à partir de l'ADN génomique de chaque individu d'une population d'individus (définie ci-après), d'un fragment de séquence nucléotidique de ! FNa-21.
Ce produit PCR est choisi pour couvrir la région génique
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Figure img00390001

contenant le polymorphisme de type SNP de l'invention. Ensuite, on élimine les amorces de PCR et les dNTPs non incorporés avant de réaliser le miniséquençage. Toutes ces étapes, ainsi que la lecture, sont réalisées dans la même plaque.
Le génotypage requiert donc 5 étapes : 1) Amplification par PCR 2) Purification du produit de PCR par digestion enzymatique 3) Elongation de l'oligonucléotide amorce 4) Lecture 5) Interprétation de la lecture
Les étapes de génotypage 1 et 2 sont les mêmes pour les polymorphismes de type SNP : c973a, g1011c, t1049a, t1155a et a1204g. Les étapes 3,4 et 5 sont spécifiques pour chaque polymorphisme de type SNP de l'invention.
Etape 1)
L'amplification PCR de la séquence nucléotidique du gène IFNa- 21 qui couvre la région génique contenant le polymorphisme de type SNP fonctionnel conforme à l'invention est effectuée pour chaque individu de la population d'individus.
La population d'individus est composée d'ADNs génomiques fournis par l'Institut Coriell aux Etats-Unis.
Les 239 individus choisis aléatoirement se répartissent comme suit :
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Figure img00400001

POPULATION DESCRIPTION NOMBRE D'INDIVIDUS 1 Afro Américain 50 2 Amérindien du Sud Ouest 5 3 Sud Américain (Andes) 10 4 Caribéen 10.
5 Caucasien 50 6 Chinois 10 7 Grec 8 sibérien 10 9 Italien 10 10 Japonais 10 11 Mexicain 10 12 Moyen-Orient 20 13 Individus du Pacifique 7 14 Indo-Pakistanais 9 15 Sud Américain 10 16 Asie du Sud 10
Figure img00400002

L'amplification PCR est réalisée à partir d'amorces que l'homme du métier peut facilement déterminer à l'aide de la séquence nucléotidique ID SEO NO 1.
Les amorces sont les suivantes : ID SEQ No 3 et ID SEQ NO 4.
Ces séquences nucléotidiques permettent d'amplifier un fragment d'une longueur de 696 nucléotides, du nucléotide 620 au nucléotide 1315 dans la séquence nucléotidique ID SEQ No 1 Les amplifias PCR serviront de matrice pour la réaction de miniséquençage.
Le volume réactionnel est de 5 nul par échantillon comme décrit dans le tableau suivant :
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Figure img00410001

Fournisseur Référence Réactif Conc. Vol.-par Conc. initiale tube (pi) finale Life Technologie Livré avec Taq Tampon (X) 10 0, 5 1 Life Technologie Livré avec Taq MgSO4 (mM) 50 0, 2 2 AP Biotech 27-2035-03 dNTPs (mM) 10 0, 1 0, 2 Sur demande Amorce F (pom) 10 0, 1 0, 2 ID SEO NO 4 Sur demande AmorceR (lut) 10 0, 1 0, 2 ID SEQ ? 5 Life Technologie 11304-029 Taq platinium 5u/Pl 0, 02 0, 1 U/ réaction H2O Qsp 5 cl 1, 98 ADN 2, 5 ng/) J 2 5 ng/ réaction Volume total 5 cl
Figure img00410002

Ces réactifs sont distribués dans une plaque PCR noire à 384 puits fournie par ABGene (ref : TF-0384-k). Une fois remplie, la plaque est scellée, centrifugée puis placée dans un thermocycleur pour plaque 384 (Tetrad de MJ Research) et subit l'incubation suivante : Cycles de PCR : 1 min à 94 C, suivi de 36 cycles composés de 3 étapes (15 sec. à 940 C, 30 sec. à 56 C, 1 min. à 68 C) Etape 2) La PCR est ensuite purifiée à l'aide de deux enzymes que sont la phosphatase alcaline de crevette (ou Shrimp Alkaline Phosphatase SAP) et l'exonucléase 1 (Exo 1). La première de ces enzymes permet la déphosphorylation des dNTPs non incorporés au cours de la PCR, tandis que la seconde élimine les résidus simple brin d'ADN et donc les amorces non utilisées au cours de la PCR. Cette digestion se fait par addition dans la plaque de PCR d'un mélange réactionnel de 5 nul par échantillon préparé comme décrit dans le tableau suivant :
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Figure img00420001

Fournisseur Référence Réactif Conc. Vol. par Conc. initiale tube (pi) finale AP Biotech E70092X SAP 1 Ul, ul 0, 5, réaction AP Biotech 070073Z Exo lOU/p ! 0, 1. . réaction AP Biotech Fourni Tampon 10 0, 5 1 avec SAP SAP (X) H20 Qsp 5 Jl 3, 9 PCR 5 Pl Vol total 10 !
Figure img00420002

Une fois remplie, la plaque est scellée, centrifugée puis placée dans un thermocycleur pour plaque 384 puits (Tetrad de MJ Research) et subit l'incubation suivante : Digestion SAP-EXO : 45 min à 37 C, 15min à 80 C.
Etape 3) L'étape d'élongation ou de miniséquençage est ensuite réalisée sur ce produit de PCR digéré, par addition d'un mélange réactionnel de 5 ilL par échantillon préparé.
Le miniséquençage est spécifique à chaque polymorphisme de type SNP : c973a, g1011c, t1049a, t1155a et a1204g.
A) Polymorphisme de type SNP c973a L'étape d'élongation ou de miniséquençage est ensuite réalisée comme indiqué dans le tableau suivant :
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Figure img00430001

Conc. Vol. par Conc.
Fournisseur Référence Réactif Conc Voi par Conc.
(Pl) Propre Tampon Elongation 5 1 1 préparation (X) Amorce Miniseq Life Sur demande (, uM) 10 0, 5 Technologies Aou B A ou B AP Biotech 27-2051 ddNTPs' (uM) 2, 5 025 0, 125 (61, 71, 81)-01 2 non marqués de chaque de chaque n,., ,,-ddNTPs (uM) e r. c NEN Ne) 472/5 2maraués 0. 25 0, 125 2 marqués AP Biotech E79000Z Thermo-sequenase 3, 2 U/ul 0, 125 0, 4 Ut réaction H20 Qsp 5u ! 3, 125 PCR digérée 10 Pl Vol total 15uf 1 1
Figure img00430002

Le tampon élongation : Le tampon élongation 5X est composé de Tris-HCI pH 9 à 250 mM, de KCI à 250 mM, de NaCI à 25 mM, de Mec12 à 10 mM et de glycérol à 40 %.
2 ddNTPs : Pour les ddNTPs, un mélange des 4 bases est réalisé en fonction du polymorphisme étudié. Seulement les 2 bases d'intérêts (G/T) composant le polymorphisme de type SNP fonctionnel portent un marquage, soit en Tamra, soit en R110. Le mélange de ddNTPs est composé de : 2, 5 uM de ddATP non marqué, 2, 5 pom de ddCTP non marqué, 2, 5 uM de ddTTP (1, 825 uM de ddTTP non marqué et 0, 625 uM de ddTTP marqué au Tamra), -2, 5, uM de ddGTP (1, 825 uM de ddGTP non marqué et 0, 625 uM de ddGTP marqué au R110).
Une fois remplie, la plaque est scellée, centrifugée puis placée dans un thermocycleur pour plaque 384 puits (Tetrad de MJ Research) et subit l'incubation suivante : Cycles d'élongation : 1 min. à 930 C, suivi de 35 cycles composés de 2 étapes (10 sec. à 930 C, 30 sec. à 55 C).
Après la dernière étape dans le thermocycleur, la plaque est directement placée sur un lecteur de fluorescence polarisée de type Analyst@ HT de LJL Biosystems Inc.. La plaque est lue à l'aide du logiciel Criterion Host@ en utilisant deux méthodes. La première permet de lire la base marquée en Tamra en utilisant les filtres d'excitation et d'émission spécifiques de ce fluorophore (excitation 550-10 nm, émission 580-10 nm) et la seconde
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Figure img00440001

permet de lire la base marquée en R110 en utilisant les filtres d'excitation et d'émission spécifiques de ce fluorophore (excitation 490-10 nm, émission 520- 10 nm). Dans les deux cas, un miroir double dichroïque (R1O/Tamra) est utilisé et les autres paramètres de lecture sont : Z-height : 1, 5 mm Attenuator : out Temps d'intégration : 100,000 usée.
Raw data units : counts/sec Switch polarization : by weil Plate settling time : 0 msec PMT setup : Smart Read (+), sensitivity 2 Dynamic polarizer : émission Static polarizer : S
Un fichier résultat est alors obtenu contenant les valeurs calculées de mP pour le filtre Tamra et celle pour le filtre RI 10. Ces valeurs de mP sont calculées à partir des valeurs d'intensité obtenues sur le plan parallèle (//) et sur le plan perpendiculaire d'après la formule suivante mP=1000 (//-g)/ (//+g).
Dans ce calcul, la valeur sur le filtre. 1 est pondérée d'un facteur g.
Celui-ci est un paramètre machine qui doit être déterminé préalablement expérimentalement.
Etapes 4) et 5) Interprétation de la lecture et détermination des génotypes.
Les valeurs de mP sont reportées sur un graphe à l'aide du logiciel Excel de Microsoft Inc., et/ou du logiciel Allele Caller@ développé par LJL Biosystems Inc..
En abscisse est indiquée la valeur de mP de la base marquée au Tamra, en ordonnée est indiquée la valeur de mP de la base marquée au R110.
Une forte valeur de mP indique que la base marquée avec ce fluorophore est incorporée et, inversement, une faible valeur de mP révèle l'absence d'incorporation de cette base.
On obtient jusqu'à 3 groupes homogènes de séquences
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Figure img00450001

nucléotidiques ayant des génotypes différents, comme indiqué dans la Figure 10.
L'utilisation du logiciel Allele Caller@ permet, une fois le repérage des différents groupes réalisé, d'extraire directement le génotype défini pour chaque individu sous forme d'un tableau.
Les séquences des deux amorces de miniséquençage nécessaires pour le génotypage ont été déterminées. Ces amorces sont sélectionnées pour correspondre à une vingtaine voire une trentaine de nucléotides placés juste en amont du site polymorphe. Du fait que le produit de PCR contenant un SNP est un produit d'ADN double brin, le génotypage peut donc se faire soit sur le brin sens soit sur le brin antisens. Les amorces sélectionnées sont fabriquées par Life Technologies Inc.
Les amorces du miniséquençage sont les suivantes : Amorce sens : (A) : actcatctgctacttgggaa Amorce antisens : (B) : aaatttttctaggaggctct
Le miniséquençage du polymorphisme de type SNP c973a a d'abord été validé sur 16 échantillons, puis génotypé sur l'ensemble de la population d'individus composée de 239 individus et 7 blancs.
Conditions de miniséquençage testées : Condition NO 1 : Amorce sens + ddCTP-R110 + ddATP-Tamra Condition No 2 : Amorce sens + ddATP-R110 + ddCTP-Tamra Condition No 3 : Amorce antisens + ddGTP-R110 + ddTTP-Tamra Condition No 4 : Amorce antisens + ddTTP-R110 + ddGTP-Tamra
Ces 4 conditions ont été testées et la condition No 3 a été retenue pour le génotypage.
B) Résultats
Après la réalisation complète du processus de génotypage, la
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Figure img00460001

détermination des génotypes des individus de la population d'individus pour le SNP fonctionnel étudié ici a été réalisée à l'aide du graphe représenté sur la Figure 10.
Ce génotype est en théorie soit homozygote GG, soit hétérozygote GT, soit homozygote TT chez les individus testés. En réalité et comme montré ci-dessous, le génotype homozygote TT n'est pas détecté dans la population d'individus.
Les résultats des contrôles, de la répartition des génotypes déterminés dans la population d'individus et le calcul des différentes fréquences alléliques pour ce polymorphisme de type SNP fonctionnel sont présentés dans
Figure img00460002

les tableaux suivants :
Figure img00460003

Nombre d'individus Nombre de blanc Pourcentage de testés génotypes testés validés réussite 239 237 7 7 99, 2
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Figure img00470001

POPULATION Fréquence allélique Génotype TT Génotype TG Génotype GG N % % 95% IC N % N % N % Afro Américain 50 20, 9 0--0 0 0 0 49 100 Amérindien du Sud Ouest 5 2, 1 0--0 0 0 0 5 100 Sud Américain (Andes) 10 4, 2 0--0 0 0 0 10 100 Caribéen 10 4, 2 0--0 0 0 0 10 100 Caucasien 50 20, 9 3, 0 0, 0 6, 3 0 0 3 6, 0 47 94, 0 Chinois 10 4, 2 0--0 0 0 0 10 100 Grec 8 3, 3 6, 3 0, 0 18, 1 0 0 1 12, 5 7 87, 5 Ibérien 10 4, 2 0--00 0 0 10 100 Italien 10 4, 2 0--0 0 0 0 10 100 Japonais 10 4, 2 0--0 0 0 0 10 100 Mexicain 10 4, 2 0--0 0 0 0 9 100 Moyen-Orient 20 8, 4 0--0 0 0 0 20 100 Individus du Pacifique 7 2, 9 0--0 0 0 0 7 100 Indo-Pakistanais 9 3, 8 0--0 0 0 0 9 100 Sud Américain 10 4, 2011000010100 Asie du Sud 10 4, 2 0--0 0 0 0 10 100 Total 239 100 0, 8 0, 0 1, 7 0 0 4 1, 7 233 98 ; 3
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Figure img00480001

Dans le tableau ci-dessus, N représente le nombre d'individus, - % représente le pourcentage d'individus dans la sous-population spécifique, la fréquence allélique représente le pourcentage de l'allèle muté dans la souspopulation spécifique, 95 % IC représente l'intervalle minimal et maximal de confiance à 95 %.
Il faut préciser que l'allèle G lu en antisens correspond à l'allèle C lu en sens, soit à la présence d'un Q en position 102 de la séquence nucléotidique du gène IFNa21 et donc que l'allèle A lu en antisens correspond à l'allèle T lu en sens correspondant à un K pour cette position dans la séquence de la protéine correspondante.
En examinant ces résultats par population, on constate que les 4 individus hétérozygotes GT sont issus des sous-populations grecque et caucasienne de la population d'individus.
B) Polymorphisme de type SNP 9 1011 c L'étape d'élongation ou de miniséquençage est ensuite réalisée comme indiqué dans le tableau suivant :
Figure img00480002

Fournisseur Référence Réactif Cône... c. initiale tube finale Pl) Propre Tampon Elongation préparation (X) ,.e Amorce Miniseq Technologies Sur demande (Pm) Sur demande (M) AP Biotech 27-2051 ddNTPs (pM) 2, 5 025 0, 125 (61, 71, 81)-01 2 non marqués de chaque de chaque NEN Nel 472/5 ) 2, 5 0, 25 0, 125 et Nel 492/5 2 marqués de chaque de chaque Tamra et RI 10 AP Biotech E79000Z Thermo-sequenase 3, 2 U/u) 0, 125 H20 Qsp 5 lul 3, 125 Qggj g H20 Qsp 5 I 3, 125 PCR digérée10 ut Vol total 15 ul
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Figure img00490001

Le tampon élongation : Le tampon élongation 5X est composé de Tris-HCI pH 9 à 250 mM, de KCI à 250 mM, de NaCI à 25 mM, de MgCI2 à 10 mM et de glycérol à 40 %.
2 ddNTPs : Pour les ddNTPs, un mélange des 4 bases est réalisé en fonction du polymorphisme étudié. Seulement les 2 bases d'intérêts (C/G) composant le polymorphisme de type SNP fonctionnel portent un marquage, soit en Tamra, soit en R110 Le mélange de ddNTPs est composé de :
2, 5 uM de ddATP non marqué,
2, 5 uM de ddTTP non marqué,
Figure img00490002

2, 5 uM de ddCTP (1, 825 pM de ddCTP non marqué et 0, 625 uM de ddCTP marqué au Tamra), 2, 5 uM de ddGTP (1, 825 uM de ddGTP non marqué et 0, 625 uM de ddGTP marqué au R110).
Une fois remplie, la plaque est scellée, centrifugée puis placée dans un thermocycleur pour plaque 384 puits (Tetrad de MJ Research) et subit l'incubation suivante : Cycles d'élongation : 1 min. à 93 C, suivi de 35 cycles composés de 2 étapes (10 sec. à 93 C, 30 sec. à 55 C).
Après la dernière étape dans le thermocycleur, la plaque est directement placée sur un lecteur de fluorescence polarisée de type Analyst (D HT de LJL Biosystems Inc.. La plaque est lue à l'aide du logiciel Criterion HostS en utilisant deux méthodes. La première permet de lire la base marquée en Tamra en utilisant les filtres d'excitation et d'émission spécifiques de ce fluorophore (excitation 550-10 nm, émission 580-10 nm) et la seconde permet de lire la base marquée en R110 en utilisant les filtres d'excitation et d'émission spécifiques de ce fluorophore (excitation 490-10 nm, émission 520- 10 nm). Dans les deux cas, un miroir double dichroïque (RHO/Tamra) est utilisé et les autres paramètres de lecture sont : Z-height : 1,5 mm Attenuator : out Temps d'intégration : 100, 000 usée.
Raw data units : counts/sec Switch polarization : by weil Plate settling time : 0 msec PMT setup : Smart Read (+), sensitivity 2 Dynamic polarizer : emission Static polarizer : S
<Desc/Clms Page number 50>
Figure img00500001

Un fichier résultat est alors obtenu contenant les valeurs calculées de mP pour le filtre Tamra et celle pour le filtre R110. Ces valeurs de mP sont calculées à partir des valeurs d'intensité obtenues sur le plan parallèle (//) et sur le plan perpendiculaire Cl) d'après la formule suivante : mP =1000 (//-g)/ (//+ggL).
Dans ce calcul, la valeur sur le filtre est pondérée d'un facteur g.
Celui-ci est un paramètre machine qui doit être déterminé préalablement expérimentalement.
Etapes 4) et 5) Interprétation de la lecture et détermination des génotypes.
Les valeurs de mP sont reportées sur un graphe à l'aide du
Figure img00500002

logiciel Excel de Microsoft Inc., et/ou du logiciel Allele Callers développé par LJL Biosystems Inc..
En abscisse est indiquée la valeur de mP de la base marquée au Tamra, en ordonnée est indiquée la valeur de mP de la base marquée au Roi 10. Une forte valeur de mP indique que la base marquée avec ce fluorophore est incorporée et, inversement, une faible valeur de mP révèle l'absence d'incorporation de cette base.
On obtient jusqu'à 3 groupes homogènes de séquences nucléotidiques ayant des génotypes différents, comme indiqué dans la Figure 11.
L'utilisation du logiciel Allele Caller@ permet, une fois le repérage des différents groupes réalisé, d'extraire directement le génotype défini pour chaque individu sous forme d'un tableau.
Les séquences des deux amorces de miniséquençage nécessaires pour le génotypage ont été déterminées. Ces amorces sont sélectionnées pour correspondre à une vingtaine voire une trentaine de nucléotides placés juste en amont du site polymorphe. Du fait que le produit de PCR contenant un SNP est un produit d'ADN double brin, le génotypage peut donc se faire soit sur le brin sens soit sur le brin antisens. Les amorces sélectionnées sont fabriquées par Life Technologies Inc.
Les amorces du miniséquençage sont les suivantes :
<Desc/Clms Page number 51>
Figure img00510001

Amorce sens : (C) : ttttccactgaacttaacca Amorce antisens : (D) : gcttccaggtcattcagctg
Le miniséquençage du polymorphisme de type SNP g1011c a d'abord été validé sur 16 échantillons, puis génotypé sur l'ensemble de la population d'individus composée de 239 individus et 7 blancs.
Conditions de miniséquençage testées : Condition No 1 : Amorce sens + ddGTP-R110 + ddCTP-Tamra Condition ? 2 : Amorce sens + ddCTP-R110 + ddGTP-Tamra Condition No 3 : Amorce antisens + ddGTP-R110 + ddCTP-Tamra Condition ? 4 : Amorce antisens + ddCTP-R110 + ddGTP-Tamra
Ces 4 conditions ont été testées et la condition N 3 a été retenue pour le génotypage.
B) Résultats
Après la réalisation complète du processus de génotypage, la détermination des génotypes des individus de la population d'individus pour le SNP fonctionnel étudié ici a été réalisée à l'aide du graphe représenté sur la Figure 11.
Ce génotype est en théorie soit homozygote CC, soit hétérozygote CG, soit homozygote GG chez les individus testés. En réalité et comme montré ci-dessous, le génotype homozygote GG n'est pas détecté dans la population d'individus.
Les résultats des contrôles, de la répartition des génotypes déterminés dans la population d'individus et le calcul des différentes fréquences alléliques pour ce polymorphisme de type SNP fonctionnel sont présentés dans les tableaux suivants :
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Figure img00520001

Nombre d'individus Nombre de blanc Pourcentage de testés génotypés Testés validés réussite 239 237 7 7 99, 2
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Figure img00530001

POPULATION Fréquence allélique Génotype GG Génotype GC Génotype CC N % % 95% IC N % N% N % O Afro Américain 50 20, 9 1, 0 0, 0 3, 000 12, 0 49 98, 0 , u e slt Pi on Amérindien du Sud Ouest 5 2, 1 0--0 0 0 0 5 100 Sud Américain (Andes) 10 4, 2 0--0 0 0 0 10 100 Caribéen 10 4, 2 0--0 0 0 0 10 100 Caucasien 50 20, 9 0--0 0 0 0 50 100 Chinois 10 4, 2 0--0 0 0 0 10 100 Grec 301100068100 Ibérien 2011000610100 -- 100 Italien 11000010100 Japonais 10 4, 2 01 0 0 0 10 100 Mexicain 10 4, 2 0110 0 0 10 100 Moyen-Orient 20 8, 4 0--0 0 0 0 20 100 Individus du Pacifique 7 2, 9 0 10 0 0 7 100 Indo-Pakistanais 9 3, 8 0--0 0 0 0 9 100 Sud Américain 2011000610100 Asie du Sud 10 4, 2 0--0 0 0 0 10 100 ---- 236 99, 6 Total (60010423699J3 otal
<Desc/Clms Page number 54>
Figure img00540001

Dans le tableau ci-dessus, N représente le nombre d'individus, - % représente le pourcentage d'individus dans la sous-population spécifique, ta fréquence allélique représente le pourcentage de l'allèle muté dans la souspopulation spécifique, 95 % IC représente l'intervalle minimal et maximal de confiance à 95 %.
Il faut préciser que l'allèle C lu en antisens correspond à l'allèle G lu en sens, soit à la présence d'un Q en position 114 de la séquence nucléotidique du gène IFNa-21 et donc que l'allèle G lu en antisens correspond à l'allèle C lu en sens correspondant à un K pour cette position dans la séquence de la protéine correspondante.
En examinant ces résultats par population, on constate que le seul individu hétérozygote CG est issu de la sous-population afro-américaine de la population d'individus.
C) Polymorphisme de type SNP t1049a L'étape d'élongation ou de miniséquençage est ensuite réalisée comme indiqué dans le tableau suivant :
Figure img00540002

Fournisseur Référence Réacttf Cône.. f :..-,,' initiale tube finale (Pl) Propre Tampon Elongation 1 5 1 1 préparation (X) Life Amorce Miniseq Technologies Sur demande (Pm) Technologies E ou F AP Biotech 27-2051 ddNTPs" (pM) 2, 5 025 0, 125 (61, 71, 81)-01 2 non marqués de chaque de chaque M-70/KddNTPs'' (uM)"cnTn < NEN Nel 472/5 2maraués ' 5 0, 25 0, 125 2 marqués et Nel 492/5 Tamra et R110 de chaque de chaque AP Biotech E79000Z Thermo-sequenase 3, 2 U/ul 0, 125 0, 4 U/ réaction H20 Qsp 51-11 3, 125 PCR digérée10 ut Vol total 15 u)
<Desc/Clms Page number 55>
Figure img00550001

Le tampon élongation : Le tampon élongation 5X est composé de Tris-HCI pH 9 à 250 mM, de KO à 250 mM, de NACI à 25 mM, de MUGI2 à 10 mM et de glycérol à 40 % 2 ddNTPs : Pour les ddNTPs, un mélange des 4 bases est réalisé en fonction du polymorphisme étudié. Seulement les 2 bases d'intérêts (A/T) composant le polymorphisme de type SNP fonctionnel portent un marquage, soit en Tamra, soit en R110 Le mélange de ddNTPs est composé de : 2, 5 uM de ddCTP non marqué, 2, 5 uM de ddGTP non marqué,
2, 5 uM de ddTTP (1,825 M de ddTTP non marqué et 0,625 M de ddTTP marqué au Tamra), 2, 5 JM de ddATP (1, 825 uM de ddATP non marqué et 0,625 M de ddATP marqué au R110).
Une fois remplie, la plaque est scellée, centrifugée puis placée dans un thermocycleur pour plaque 384 puits (Tetrad de MJ Research) et subit l'incubation suivante : Cycles d'élongation : 1 min. à 93 C, suivi de 35 cycles composés de 2 étapes (10 sec. à 93 C, 30 sec. à 550 C).
Après la dernière étape dans le thermocycleur, la plaque est directement placée sur un lecteur de fluorescence polarisée de type Analyst@ HT de LJL Biosystems Inc.. La plaque est lue à l'aide du logiciel Criterion Host (D en utilisant deux méthodes. La première permet de lire la base marquée en Tamra en utilisant les filtres d'excitation et d'émission spécifiques de ce fluorophore (excitation 550-10 nm, émission 580-10 nm) et la seconde permet de lire la base marquée en R110 en utilisant les filtres d'excitation et d'émission spécifiques de ce fluorophore (excitation 490-10 nm, émission 520- 10 nm). Dans les deux cas, un miroir double dichroïque (R110/Tamra) est utilisé et les autres paramètres de lecture sont : Z-height : 1,5 mm Attenuator : out Temps d'intégration : 100,000 usée.
Raw data units : counts/sec Switch polarization : by well Plate settling time : 0 msec PMT setup : Smart Read (+), sensitivity 2 Dynamic polarizer : emission Static polarizer : S
<Desc/Clms Page number 56>
Figure img00560001

Un fichier résultat est alors obtenu contenant les valeurs calculées de mP pour le filtre Tamra et celle pour le filtre Ri 10. Ces valeurs de mP sont calculées à partir des valeurs d'intensité obtenues sur le plan parallèle (/ et sur le plan perpendiculaire (#) d'après la formule suivante : mP =1000 (//-g)/ (//+gJl).
Dans ce calcul, la valeur sur le filtre. 1 est pondérée d'un facteur g.
Celui-ci est un paramètre machine qui doit être déterminé préalablement expérimentalement.
Etapes 4) et 5) Interprétation de la lecture et détermination des génotypes.
Les valeurs de mP sont reportées sur un graphe à l'aide du logiciel Excel de Microsoft Inc., et/ou du logiciel Allele Caller# développé par LJL Biosystems Inc..
En abscisse est indiquée la valeur de mP de la base marquée au Tamra, en ordonnée est indiquée la valeur de mP de la base marquée au Ri 10. Une forte valeur de mP indique que la base marquée avec ce fluorophore est incorporée et, inversement, une faible valeur de mP révèle l'absence d'incorporation de cette base.
On obtient jusqu'à 3 groupes homogènes de séquences nucléotidiques ayant des génotypes différents, comme indiqué dans la Figure 12.
L'utilisation du logiciel Allele Caller@ permet, une fois le repérage des différents groupes réalisé, d'extraire directement le génotype défini pour chaque individu sous forme d'un tableau.
Les séquences des deux amorces de miniséquençage nécessaires pour le génotypage ont été déterminées. Ces amorces sont sélectionnées pour correspondre à une vingtaine voire une trentaine de nucléotides placés juste en amont du site polymorphe. Du fait que le produit de PCR contenant un SNP est un produit d'ADN double brin, le génotypage peut donc se faire soit sur le brin sens soit sur le brin antisens. Les amorces sélectionnées sont fabriquées par Life Technologies Inc.
Les amorces du miniséquençage sont les suivantes :
<Desc/Clms Page number 57>
Figure img00570001

Amorce sens : (E) : agcctgcgtgatacaggagg Amorce antisens : (F) : ggggagtctcttccacccca
Le miniséquençage du polymorphisme de type SNP t1049a a d'abord été validé sur 16 échantillons, puis génotypé sur l'ensemble de la population d'individus composée de 239 individus et 7 blancs.
Conditions de miniséquençage testées : Condition No 1 : Amorce sens + ddATP-R110 + ddTTP-Tamra Condition No 2 : Amorce sens + ddTTP-R110 + ddATP-Tamra Condition ? 3 : Amorce antisens + ddTTP-R110 + ddATP-Tamra Condition ? 4 : Amorce antisens + ddATP-R110 + ddTTP-Tamra
Ces 4 conditions ont été testées et la condition N 4 a été retenue pour le génotypage.
B) Résultats
Après la réalisation complète du processus de génotypage, la détermination des génotypes des individus de la population d'individus pour le SNP fonctionnel étudié ici a été réalisée à l'aide du graphe représenté sur la Figure 12.
Ce génotype est en théorie soit homozygote TT, soit hétérozygote TA, soit homozygote AA chez les individus testés. En réalité et comme montré ci-dessous, le génotype homozygote AA n'est pas détecté dans la population d'individus.
Les résultats des contrôles, de la répartition des génotypes déterminés dans la population d'individus et le calcul des différentes fréquences alléliques pour ce polymorphisme de type SNP fonctionnel sont présentés dans les tableaux suivants :
<Desc/Clms Page number 58>
Figure img00580001

Nombre d'individus Nombre de blanc Pourcentage de testés génotypés Testés validés réussite 239 237 7 7 99, 2 1
<Desc/Clms Page number 59>
Figure img00590001

POPULATION Fréquence allélique Génotype AA Génotype AG Génotype GG N % % 95% IC N % N % N % -- 1 2, 0 48 98, 0 Afro Américain 50 910003000012048980 Amérindien du Sud Ouest 5 2, 1 0, 0 I000 0, 05 100, 0 0 0, 0 0 9 100, 0 Sud Américain (Andes) 10420016000009100, 0 Caribéen 10 4, 2 0, 0-0 0, 0 0 0, 0 10 100, 0 -- 50 100, 0 Caucasien 50 20, 90, 010 ) 00, 050100, 0 Chinois 10 4, 2 0, 0 0 0, 0 0 0, 0 10 100, 0 Grec 8 3, 3 00 0, 0 0 0,o0 8 100, 0 jbérien102001100/) 00010100, 0 Italien (01100000/) 10100, 0 10 4, 2-i-oô, 0Japonais104, 2 0, 0110C) 00, 010 100, 0 0 0, o00 Mexicain 10 4, 20, 0110 ( 06C 0 10100, 0 Moyen-Orient 20 8, 4 0, 0-0 00 0 0 0, 0 20 100, 0 individus du Pacifique 7 2, 9 0, 0--0 0, 0 0 0, 0 7 100, 0 Indo-Pakistanais 9 3, 8 0,6 0 0 0 0 0 0, 09 100, 0 Sud Américain 10 4, 2 0, 0 0 00 0 0, 0 10 100, 0 Asie du Sud 10 4, 2 0, 01000 0, 0 10100, 0 -- 236 99, 6 Total 239 100 0, 20, 00, 600, 0 0, 4 236 99, 6
<Desc/Clms Page number 60>
Figure img00600001

Dans le tableau ci-dessus, N représente le nombre d'individus, - % représente le pourcentage d'individus dans la sous-population spécifique, ta fréquence allélique représente le pourcentage de l'allèle muté dans la souspopulation spécifique, 95 % IC représente l'intervalle minimal et maximal de confiance à 95 %.
Il faut préciser que l'allèle A lu en antisens correspond à l'allèle T lu en sens, soit à la présence d'un V en position 127 de la séquence nucléotidique du gène IFNa-21 et donc que l'allèle T lu en antisens correspond à l'allèle A lu en sens correspondant à un D pour cette position dans la séquence de la protéine correspondante.
En examinant ces résultats par population, on constate que le seul individu hétérozygote AT est issu de la sous-population afro-américaine de la population d'individus.
D) Polymorphisme de type SNP t1155a L'étape d'élongation ou de miniséquençage est ensuite réalisée comme indiqué dans le tableau suivant :
Figure img00600002

Fournisseur Référence Réactif Cône... r.,..,,initiale finale (Pl) Propre Tampon Elongation'1 préparation (X) Life Amorce Miniseq Life Sur demande ('ouM) 10 0, 5 Technologies GouH G ou H AP Biotech 27-2051 dNTPs (pM) 2, 5 025 0, 125 (61, 71, 81)-01 2 non marqués de chaque de chaque i. ddNTPs (uM)"r" < - 2 marqués et Nel 492/5 2 marqués de chaque de chaque TamraetRI10 AP Biotech E79000Z Thermo-sequenase 3, 2 Ul 111 0, 125 0, 4 U/ Thermo-sequenase réaction H20Qsp 5u) 3, 125 PCR digérée10 Vol total 15 ul
<Desc/Clms Page number 61>
Figure img00610001

Le tampon élongation : Le tampon élongation 5X est composé de Tris-HCI pH 9 à 250 mM, de KCI à 250 mM, de NaCI à 25 mM, de MgC12 à 10 mM et de glycérol à 40 %. 2 ddNTPs : Pour les ddNTPs, un mélange des 4 bases est réalisé en fonction du polymorphisme étudié. Seulement les 2 bases d'intérêts (T/A) composant le polymorphisme de type SNP fonctionnel portent un marquage, soit en Tamra, soit en R110. Le mélange de ddNTPs est composé de : 2, 5 uM de ddCTP non marqué,
Figure img00610002

2, 5 uM de ddGTP non marqué,
2, 5 uM de ddTTP (1, 825 uM de ddTTP non marqué et 0, 625 uM de ddTTP marqué au Tamra),
2, 5 M de ddATP (1,825 uM de ddATP non marqué et 0,625 M de ddATP marqué au R110).
Une fois remplie, la plaque est scellée, centrifugée puis placée dans un thermocycleur pour plaque 384 puits (Tetrad de MJ Research) et subit l'incubation suivante : Cycles d'élongation : 1 min. à 93 C, suivi de 35 cycles composés de 2 étapes (10 sec. à 930 C, 30 sec. à 55 C).
Après la dernière étape dans le thermocycleur, la plaque est directement placée sur un lecteur de fluorescence polarisée de type Analyst (D HT de LJL Biosystems Inc.. La plaque est lue à l'aide du logiciel Criterion Host (D en utilisant deux méthodes. La première permet de lire la base marquée en Tamra en utilisant les filtres d'excitation et d'émission spécifiques de ce fluorophore (excitation 550-10 nm, émission 580-10 nm) et la seconde permet de lire la base marquée en R110 en utilisant les filtres d'excitation et d'émission spécifiques de ce fluorophore (excitation 490-10 nm, émission 520- 10 nm). Dans les deux cas, un miroir double dichroïque (R110/Tamra) est utilisé et les autres paramètres de lecture sont : Z-height : 1,5 mm Attenuator : out Temps d'intégration : 100, 000 usée.
Raw data units : counts/sec Switch polarization : by well Plate settling time : 0 msec PMT setup : Smart Read (+), sensitivity 2 Dynamic polarizer : emission Static polarizer : S
<Desc/Clms Page number 62>
Figure img00620001

Un fichier résultat est alors obtenu contenant les valeurs calculées de mP pour le filtre Tamra et celle pour le filtre Ri 10. Ces valeurs de mP sont calculées à partir des valeurs d'intensité obtenues sur le plan parallèle (//) et sur le plan perpendiculaire (l) d'après la formule suivante : mP=1000 (//-gl)/ (//+g).
Dans ce calcul, la valeur sur le filtre 1. est pondérée d'un facteur g.
Celui-ci est un paramètre machine qui doit être déterminé préalablement expérimentalement.
Etapes 4) et 5) Interprétation de la lecture et détermination des génotypes.
Les valeurs de mP sont reportées sur un graphe à l'aide du logiciel Excel de Microsoft Inc., et/ou du logiciel Allele Caller@ développé par LJL Biosystems Inc..
En abscisse est indiquée la valeur de mP de la base marquée au Tamra, en ordonnée est indiquée la valeur de mP de la base marquée au Ri 10.
Une forte valeur de mP indique que la base marquée avec ce fluorophore est incorporée et, inversement, une faible valeur de mP révèle l'absence d'incorporation de cette base.
On obtient jusqu'à 3 groupes homogènes de séquences nucléotidiques ayant des génotypes différents, comme indiqué dans la Figure 13.
L'utilisation du logiciel Allele Caller@ permet, une fois le repérage des différents groupes réalisé, d'extraire directement le génotype défini pour chaque individu sous forme d'un tableau.
Les séquences des deux amorces de miniséquençage nécessaires pour le génotypage ont été déterminées. Ces amorces sont sélectionnées pour correspondre à une vingtaine voire une trentaine de nucléotides placés juste en amont du site polymorphe. Du fait que le produit de PCR contenant un SNP est un produit d'ADN double brin, le génotypage peut donc se faire soit sur le brin sens soit sur le brin antisens. Les amorces sélectionnées sont fabriquées par Life Technologies Inc.
Les amorces du miniséquençage sont les suivantes
<Desc/Clms Page number 63>
Figure img00630001

Amorce sens : (G) : gagaagaaatacagcccttg Amorce antisens : (H) : gctctgacaacctcccaggc
Le miniséquençage du polymorphisme de type SNP t1155a a d'abord été validé sur 16 échantillons, puis génotypé sur l'ensemble de la population d'individus composée de 239 individus et 7 blancs.
Conditions de miniséquençage testées : Condition No 1 : Amorce sens + ddTTP-R110 + ddATP-Tamra Condition No 2 : Amorce sens + ddATP-R110 + ddTTP-Tamra Condition No 3 : Amorce antisens + ddTTP-R110 + ddATP-Tamra Condition No 4 : Amorce antisens + ddATP-R110 + ddTTP-Tamra
Ces 4 conditions ont été testées et la condition No 4 a été retenue pour le génotypage.
B) Résultats
Après la réalisation complète du processus de génotypage, la détermination des génotypes des individus de la population d'individus pour le SNP fonctionnel étudié ici a été réalisée à l'aide du graphe représenté sur la Figure 13.
Ce génotype est en théorie soit homozygote AA, soit hétérozygote AT soit homozygote TT chez les individus testés. En réalité et comme montré ci-dessous, le génotype homozygote TT n'est pas détecté dans la population d'individus.
Les résultats des contrôles, de la répartition des génotypes déterminés dans la population d'individus et le calcul des différentes fréquences alléliques pour ce polymorphisme de type SNP fonctionnel sont présentés dans les tableaux suivants :
<Desc/Clms Page number 64>
Figure img00640001

Nombre d'individus Nombre de blanc Pourcentage de tés testés génotypés Testés validés réussite Tes 239 236 7 7 98, 8 ll 2367-
<Desc/Clms Page number 65>
Figure img00650001

POPULATION Fréquence allélique Génotype TT Génotype TA Génotype AA N % % 95% IC N % N % N % Afro Américain 50 20, 9 1, 0 0, 0 3, 0 0 0 1 2, 0 48 98, 0 Amérindien du Sud Ouest 5 2, 1 0--0 0 0 0 5 100 Sud Américain (Andes) 10 4, 2 0--0 0 0 0 10 100 Caribéen 10 4, 2 0--0 0 0 0 9 100 Caucasien 50 20, 9 0--0 0 0 0 49 100 Chinois 10 4, 2 0--0 0 0 0 10 100 Grec 8 3, 3 0--0 0 0 0 8 100 Ibérien 10 4, 2 0--0 0 0 0 10 100 Italien 10 4, 2 0--0 0 0 0 10 100 Japonais 10 4, 2 0--0 0 0 0 10 100 Mexicain 10 4, 2 0--0 0 0 0 10 100 Moyen-Orient 20 8, 4 0--0 0 0 0 20 100 Individus du Pacifique 7 2, 9 0--0 0 0 0 7 100 Indo-Pakistanais 9 3, 8 0--0 0 0 0 9 100 Sud Américain 10 4, 2 0--00 0 0 10 100 Asie du Sud 10 4, 2 0--0 0 0 0 10 100 Total 239 100 0, 2 0, 0 0, 6 0 0 10, 4 235 99, 6
<Desc/Clms Page number 66>
Figure img00660001

Dans le tableau ci-dessus, N représente le nombre d'individus, % représente le pourcentage d'individus dans la sous-population spécifique, ta fréquence allélique représente le pourcentage de l'allèle muté T dans la sous-population spécifique, 95 % IC représente l'intervalle minimal et maximal de confiance à 95 %.
Il faut préciser que l'allèle A lu en antisens correspond à l'allèle T lu en sens, soit à la présence d'une cystéine en position 162 de la séquence nucléotidique du gène IFNa-21 et donc que l'allèle T lu en antisens correspond à l'allèle A lu en sens correspondant à un codon stop pour cette position dans la séquence de la protéine correspondante.
En examinant ces résultats par population, on constate que le seul individu hétérozygote AT est issu de la sous-population afro-américaine de la population d'individus.
E) Polymorphisme de type SNP a1204g L'étape d'élongation ou de miniséquençage est ensuite réalisée comme indiqué dans le tableau suivant :
Figure img00660002

Fournisseur Référence Réactif Conc. Vol. par Conc. initiale tube finale initiale (J. II) Propre Tampon Elongation' préparation (X) Life Amorce Miniseq Technologies Sur demande (pu) 10 0. 5 1 1 ou J AP Biotech 27-2051 ddNTPsM) 2, 5 025 0, 125 (61, 71, 81)-01 2 non marqués de chaque de chaque 70ddNTPs (uM)"-n') - 2 marqués et Nel 492/5 Tamra et R110 de chaque de chaque Tamra et Rl 10 AP Biotech E79000Z Thermo-sequenase 3, 2 U/m 0, 125 0, 4 U/ réaction H20 Qsp 5 ! JI 3, 125 PCR digérée10 jj) Vol total 15 ut
<Desc/Clms Page number 67>
Figure img00670001

Le tampon élongation : Le tampon élongation 5X est composé de Tris-HCI pH 9 à 250 mM, de KCI à 250 mM, de NaCI à 25 mM, de MgCI2 à 10 mM et de glycérol à 40 %. 2 ddNTPs : Pour les ddNTPs, un mélange des 4 bases est réalisé en fonction du polymorphisme étudié. Seulement les 2 bases d'intérêts (AIG) composant le polymorphisme de type SNP fonctionnel portent un marquage, soit en Tamra, soit en R110. Le mélange de ddNTPs est composé de : 2, 5 uM de ddCTP non marqué,
Figure img00670002

2, 5 uM de ddTTP non marqué, 2, 5 uM de ddATP (1, 825 uM de ddATP non marqué et 0, 625 uM de ddATP marqué au Tamra), -2, 5, uM de ddGTP (1, 825 uM de ddGTP non marqué et 0, 625 uM de ddGTP marqué au R110)
Une fois remplie, la plaque est scellée, centrifugée puis placée dans un thermocycleur pour plaque 384 puits (Tetrad de MJ Research) et subit l'incubation suivante : Cycles d'élongation : 1 min. à 930 C, suivi de 35 cycles composés de 2 étapes (10 sec. à 930 C, 30 sec. à 55 C).
Après la dernière étape dans le thermocycleur, la plaque est directement placée sur un lecteur de fluorescence polarisée de type AnalystS HT de LJL Biosystems Inc.. La plaque est lue à l'aide du logiciel Criterion HostS en utilisant deux méthodes. La première permet de lire la base marquée en Tamra en utilisant les filtres d'excitation et d'émission spécifiques de ce fluorophore (excitation 550-10 nm, émission 580-10 nm) et la seconde permet de lire la base marquée en R110 en utilisant les filtres d'excitation et d'émission spécifiques de ce fluorophore (excitation 490-10 nm, émission 520- 10 nm). Dans les deux cas, un miroir double dichroïque (R110/Tamra) est utilisé et les autres paramètres de lecture sont : Z-height : 1,5 mm Attenuator : out Temps d'intégration : 100, 000 usée.
Raw data units : counts/sec Switch polarization : by well Plate settling time : 0 msec PMT setup : Smart Read (+), sensitivity 2 Dynamic polarizer : emission Static polarizer : S
<Desc/Clms Page number 68>
Figure img00680001

Un fichier résultat est alors obtenu contenant les valeurs calculées de mP pour le filtre Tamra et celle pour le filtre R110. Ces valeurs de mP sont calculées à partir des valeurs d'intensité obtenues sur le plan parallèle (//) et sur le plan perpendiculaire (1) d'après la formule suivante : MP =1 000 (//-g + g
Dans ce calcul, la valeur sur le filtre l est pondérée d'un facteur g.
Celui-ci est un paramètre machine qui doit être déterminé préalablement expérimentalement.
Etapes 4) et 5) Interprétation de la lecture et détermination des génotypes.
Les valeurs de mP sont reportées sur un graphe à l'aide du logiciel Excel de Microsoft zinc., et/ou du logiciel Allele Caller# développé par LJL Biosystems Inc..
En abscisse est indiquée la valeur de mP de la base marquée au Tamra, en ordonnée est indiquée la valeur de mP de la base marquée au Ri 10. Une forte valeur de mP indique que la base marquée avec ce fluorophore est incorporée et, inversement, une faible valeur de mP révèle l'absence d'incorporation de cette base.
On obtient jusqu'à 3 groupes homogènes de séquences nucléotidiques ayant des génotypes différents, comme indiqué dans la Figure 14.
L'utilisation du logiciel Allele Caller permet, une fois le repérage des différents groupes réalisé, d'extraire directement le génotype défini pour chaque individu sous forme d'un tableau.
Les séquences des deux amorces de miniséquençage nécessaires pour le génotypage ont été déterminées. Ces amorces sont sélectionnées pour correspondre à une vingtaine voire une trentaine de nucléotides placés juste en amont du site polymorphe. Du fait que le produit de PCR contenant un SNP est un produit d'ADN double brin, le génotypage peut donc se faire soit sur le brin sens soit sur le brin antisens. Les amorces sélectionnées sont fabriquées par Life Technologies zinc.
Les amorces du miniséquençage sont les suivantes :
<Desc/Clms Page number 69>
Figure img00690001

Amorce sens : (1) : tgagatccttctctttatca Amorce antisens : (J) : taatctttcttgaaaaattt
Le miniséquençage du polymorphisme de type SNP a 1204g a d'abord été validé sur 16 échantillons, puis génotypé sur l'ensemble de la population d'individus composée de 239 individus et 7 blancs.
Conditions de miniséquençage testées : Condition No 1 : Amorce sens + ddATP-R110 + ddGTP-Tamra Condition ? 2 : Amorce sens + ddGTP-R110 + ddATP-Tamra Condition No 3 : Amorce antisens + ddTTP-R110 + ddCTP-Tamra Condition N 4 : Amorce antisens + ddCTP-R110 + ddTTP-Tamra
Ces 4 conditions ont été testées et la condition No 2 a été retenue pour le génotypage.
B) Résultats
Après la réalisation complète du processus de génotypage, la détermination des génotypes des individus de la population d'individus pour le SNP fonctionnel étudié ici a été réalisée à l'aide du graphe représenté sur la Figure 14.
Ce génotype est en théorie soit homozygote sauvage AA, soit hétérozygote AG soit homozygote muté GG chez les individus testés. En réalité et comme montré ci-dessous, le génotype homozygote GG n'est pas détecté dans la population d'individus.
Les résultats des contrôles, de la répartition des génotypes déterminés dans la population d'individus et le calcul des différentes fréquences alléliques pour ce polymorphisme de type SNP fonctionnel sont présentés dans les tableaux suivants :
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Figure img00700001

Nombre d'individus Nombre de blanc Pourcentage de testés génotypes testés validés réussite 2392387794J
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Figure img00710001

POPULATION Fréquence allélique Génotype GG Génotype GA Génotype AA N % % 95% IC N % N % N % Afro Américain 50 20, 9 01I0 00, 0 50 100 Amérindien du Sud Ouest 5 2, 1 10, 0 0, 0 28, 6 0 0 1 20, 0 4 80, 0 Sud Américain (Andes) 10 4, 2 01 0 0 09 100 Caribéen 10 4, 2 0 0 0 0 0 10 100 Caucasien 50 20, 9 0--0 0 0 0 50 100 Chinois 10 4, 2 15, 0 0, 0 30, 6 0 0 3 30, 0 7 70 Grec 8 3, 3 0--0 0 0 0 8 100 tbénen"'fcT'"0I000610100 Italien 10 4, 2 0--0 0 0 0 10 100 Japonais 10 4, 2 20, 0 2, 5 37, 5 0 0 4 40, 0 6 60, 0 Mexicain 10 4, 2 10, 0 0, 0 23, 1 0 0 2 20, 0 8 80, 0 Moyen-Orient 20 8, 4 0--0 0 0 0 20 100 Individus du Pacifique 7 2, 9 1-00 00 7 100 Indo-Pakistanais 9 3, 8 11, 1 0, 0 25, 6 0 0 2 22, 2 7 77, 8 Sud Américain 10 4, 2 5, 0 0, 0 14, 6 0 0 1 10 9 90 Asie du Sud 10 4, 2 0--0 0 0 0 10 100 Total 239100 2J1, 3 4, 20 0, 0 13 5, 5 22594, 5
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Figure img00720001

Dans le tableau ci-dessus, N représente le nombre d'individus, - % représente le pourcentage d'individus dans la sous-population spécifique, ta fréquence allélique représente le pourcentage de l'allèle muté dans la sous- population spécifique, *
95 % IC représente l'intervalle minimal et maximal de confiance à 95 %.
En examinant ces résultats par population, on constate que les individu hétérozygotes mutés AG sont issus de 6 sous-populations : amérindienne du sud-ouest, chinoise, japonaise, mexicaine, indo-pakistanaise et sud-américaine de la population d'individus.

Claims (35)

REVENDICATIONS
1. Polynucléotide isolé comprenant : a) une séquence nucléotidique ayant au moins 80 % d'identité avec la séquence
ID SEQ NO 1 ou sa séquence codante, sous réserve que cette séquence nucléotidique comporte au moins l'un des polymorphismes de type SNP suivants : - c973a, - g1011c, - t1049a, - t1155a, - a1204g ; ou b) une séquence nucléotidique complémentaire à une séquence nucléotidique sous a).
2. Polynucléotide isolé comprenant : a) la séquence nucléotidique ID SEQ NO 1 ou sa séquence codante sous réserve que chacune de ces séquences comporte au moins l'un des polymorphismes de type SNP suivants : - c973a, - g1011c, - t1049a, - t1155a, - a1204g ; ou b) une séquence nucléotidique complémentaire à une séquence nucléotidique sous a).
3. Polynucléotide selon la revendication 2, caractérisé en ce qu'il consiste en la séquence ID SEQ NO 1 ou sa séquence codante, sous réserve que chacune de ces séquences comporte au moins l'un des polymorphismes de type SNP suivants : - c973a, - g1011c, - t1049a,
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- t1155a, - a1204g.
4. Polynucléotide selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que la séquence nucléotidique a) comporte un seul polymorphisme de type SNP choisi dans le groupe constitué par : - c973a, - g1011c, - t1049a, - t1155a, et - a1204g.
5. Polynucléotide selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce qu'il code pour un polypeptide comprenant : a) la séquence d'acides aminés ID SEQ NO 2, ou b) la séquence d'acides aminés comprenant les acides aminés compris entre 24 et 189 de la séquence d'acides aminés ID SEQ NO 2, sous réserve que chacune des séquences d'acides aminés sous a) et b) comporte au moins l'un des polymorphismes de type SNP suivants : - Q102K, - Q114H, - V127D, - C162stop, - K179E.
6. Polynucléotide selon la revendication 5, caractérisé en ce qu'il code pour un polypeptide comportant un seul polymorphisme de type SNP choisi dans le groupe constitué par : - Q102K, - Q114H, - V127D, - C162stop, - K179E.
7. Polynucléotide selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce qu'il comprend une molécule d'ADN ou d'ARN.
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8. Utilisation de tout ou partie d'un polynucléotide selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, pour identifier, hybrider et/ou amplifier tout ou partie d'un polynucléotide consistant en la séquence ID SEQ NO 1 ou sa séquence codante, sous réserve que chacune de ces séquences comporte au moins l'un des polymorphismes de type SNP suivants : - c973a, - g1011c, - t1049a, - t1155a, - a1204g.
9. Utilisation de tout ou partie d'un polynucléotide selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, comme outil de génotypage.
10. Procédé de détermination de la fréquence du polymorphisme de type SNP d'un polynucléotide selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, dans lequel on procède à un génotypage chez un individu ou dans une population d'individus.
11. Procédé de détermination selon la revendication 10, dans lequel le génotypage est effectué par miniséquençage.
12. Procédé de détermination selon la revendication 11, dans lequel le miniséquençage est réalisé avec les amorces sens et antisens correspondant respectivement aux séquences nucléotidique ID SEQ No 3 et ID SEQ No 4.
13. Utilisation d'un polynucléotide selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, pour la recherche d'une variation de séquence dans la séquence nucléotidique du gène IFNa-21 chez un individu.
14. Vecteur recombinant comprenant un polynucléotide selon l'une quelconque des revendications 1 à 7.
15. Cellule hôte comprenant un vecteur recombinant selon la revendication 14.
16. Procédé de préparation d'un polypeptide, caractérisé en ce qu'une cellule hôte selon la revendication 15 est cultivée et ledit polypeptide est isolé du milieu de culture.
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17. Polypeptide isolé comprenant une séquence d'acides aminés ayant au moins 80 % d'identité avec : a) la séquence d'acides aminés ID SEQ No 2, ou avec b) la séquence d'acides aminés comportant les acides aminés compris entre 24 et 189 de la séquence d'acides aminés ID SEQ NO 2, sous réserve que chacune des séquences d'acides aminés sous a) et b) comporte au moins l'un des polymorphismes de type SNP suivants : - Q102K, - Q114H, - V127D, - C162stop, - K179E.
18. Polypeptide selon la revendication 17, caractérisé en ce qu'il comprend : a) la séquence d'acides aminés ID SEQ NO 2, ou b) la séquence d'acides aminés comportant les acides aminés compris entre 24 et 189 de la séquence d'acides aminés ID SEQ NO 2, sous réserve que chacune des séquences d'acides aminés sous a) et b) comporte au moins l'un des polymorphismes de type SNP suivants : - Q102K, - Q114H, - V127D, - C162stop, - K179E.
19. Polypeptide selon l'une quelconque des revendications 17 à 18, caractérisé en ce qu'il consiste en : a) la séquence d'acides aminés ID SEQ NO 2, ou b) la séquence d'acides aminés comportant les acides aminés compris entre 24 et 189 de la séquence d'acides aminés ID SEQ NO 2, sous réserve que chacune des séquences d'acides aminés sous a) et b) comporte au moins l'un des polymorphismes de type SNP suivants : - Q102K,
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- Q114H, - V127D, - 162stop, - K179E.
20. Polypeptide selon l'une quelconque des revendications 17 à 19, caractérisé en ce que chacune des séquences d'acides aminés sous a) et b) comporte un seul polymorphisme de type SNP choisi dans le groupe constitué par : - Q102K, - Q114H, - V127D, - C162stop, et - K179E.
21. Procédé d'obtention d'un anticorps immunospécifique, caractérisé en ce qu'il est obtenu par immunisation d'un animal avec un polypeptide selon l'une quelconque des revendications 17 à 20.
22. Anticorps immunospécifique pour un polypeptide selon l'une quelconque des revendications 17 à 20.
23. Procédé d'identification d'un agent activateur ou inhibiteur d'un polypeptide selon l'une quelconque des revendications 17 à 20, comprenant : a) la mise en présence de cellules hôtes selon la revendication 15 avec un agent à tester, et b) la détermination de l'effet activateur ou inhibiteur généré par l'agent à tester.
24. Méthode pour l'identification d'un agent activé ou inhibé par un polypeptide selon l'une quelconque des revendications 17 à 20, comprenant : a) la mise en présence de cellules hôtes selon la revendication 15 avec un agent à tester, et b) la détermination de l'effet activateur ou inhibiteur généré par un polypeptide sur l'agent à tester.
25. Procédé de détection de l'expression et/ou de l'activité d'un polypeptide selon l'une quelconque des revendications 17 à 20, comprenant : a) la détection de la présence ou de l'absence d'un polynucléotide selon l'une
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quelconque des revendications 1 à 7 dans le génome du sujet, et/ou b) la détection de la présence, de l'absence et/ou d'une concentration prédéterminée d'un polypeptide selon l'une quelconque des revendications 17 à 20, dans un échantillon biologique du sujet.
26. Médicament comprenant à titre de principe actif au moins un polypeptide selon l'une quelconque des revendications 17 à 20.
27. Utilisation d'un polypeptide selon l'une quelconque des revendications 17 à 20, pour la préparation d'un médicament destiné à la prévention ou le traitement de l'une des maladies choisies dans le groupe constitué par les cancers comme, les carcinomes, les mélanomes, les lymphomes, les myélomes, les tumeurs, les leucémies et les cancers du foie, du cou, de la tête et des reins, les maladies cardiovasculaires, les maladies métaboliques telles que celles qui ne sont pas liées au système immunitaire comme, l'obésité, les maladies infectieuses en particulier les infections virales comme les hépatites B et C et le SIDA, les pneumonies, les colites ulcératives, les maladies du système nerveux central comme, la schizophrénie et la dépression, le rejet de greffe de tissus ou d'organes, la cicatrisation de blessures, l'anémie, les allergies, l'asthme, les scléroses multiples, l'ostéoporose, le psoriasis, l'arthrite rhumatoïde, la maladie de Crohn, les maladies et les désordres auto-immuns, les verrues génitales ou vénériennes, les désordres gastro-intestinaux et les désordres liés aux traitements par chimiothérapie.
28. Utilisation d'un polypeptide selon l'une quelconque des revendications 17 à 20, pour la préparation d'un médicament destiné à la prévention ou le traitement de l'une des maladies choisies dans le groupe constitué par les hépatites chroniques B et C, les leucémies telles que la leucémie à trichloroleucocytes et la leucémie myéloïde chronique, les myélomes multiples, des lymphomes folliculaires, les tumeurs carcinoïdes, les mélanomes malins, les carcinomes rénaux métastasés, la maladie d'Alzheimer, la maladie de Parkinson ainsi que les tumeurs qui apparaissent à la suite d'un déficit immunitaire, tel que le sarcome de Kaposi dans le cas du SIDA.
29. Médicament comprenant à titre de principe actif au moins un
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polynucléotide selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, un vecteur recombinant selon la revendication 14, une cellule hôte selon la revendication 15 et/ou un anticorps selon la revendication 22.
30. Utilisation d'un polynucléotide selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, d'un vecteur recombinant selon la revendication 14, d'une cellule hôte selon la revendication 15 et/ou d'un anticorps selon la revendication 22, pour la préparation d'un médicament destiné à la prévention ou le traitement de l'une des maladies choisies dans le groupe constitué par les cancers comme, par exemple, les carcinomes, les mélanomes, les lymphomes, les myélomes, les tumeurs, les leucémies et les cancers du foie, du cou, de la tête et des reins, les maladies cardiovasculaires, les maladies métaboliques telles que celles qui ne sont pas liées au système immunitaire comme, par exemple, l'obésité, les maladies infectieuses en particulier les infections virales comme les hépatites B et C et le SIDA, les pneumonies, les colites ulcératives, les maladies du système nerveux central comme, par exemple, la schizophrénie et la dépression, le rejet de greffe de tissus ou d'organes, la cicatrisation de blessures, l'anémie, les allergies, l'asthme, les scléroses multiples, l'ostéoporose, le psoriasis, l'arthrite rhumatoïde, la maladie de Crohn, les maladies et les désordres auto-immuns, les verrues génitales ou vénériennes, les désordres gastro-intestinaux et les désordres liés aux traitements par chimiothérapie.
31. Utilisation d'un polynucléotide selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, d'un vecteur recombinant selon la revendication 14, d'une cellule hôte selon la revendication 15 et/ou d'un anticorps selon la revendication 22, pour la préparation d'un médicament destiné à la prévention ou le traitement de l'une des maladies choisies dans le groupe constitué par les hépatites chroniques B et C, les leucémies telles que la leucémie à trichloroleucocytes et la leucémie myéloïde chronique, les myélomes multiples, des lymphomes folliculaires, les tumeurs carcinoïdes, les mélanomes malins, les carcinomes rénaux métastasés, la maladie d'Alzheimer, la maladie de Parkinson ainsi que les tumeurs qui apparaissent à la suite d'un déficit immunitaire, tel que le sarcome de Kaposi dans le cas du SIDA.
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32. Composition pharmaceutique renfermant à titre de principe actif au moins un polypeptide selon l'une quelconque des revendications 17 à 20, un polynucléotide selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, un vecteur recombinant selon la revendication 14, une cellule hôte selon la revendication 15 et/ou un anticorps selon la revendication 22, ainsi qu'un excipient pharmaceutiquement acceptable.
33. Composition de diagnostic renfermant à titre de principe actif au moins un polypeptide selon l'une quelconque des revendications 17 à 20, un polynucléotide selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, un vecteur recombinant selon la revendication 14, une cellule hôte selon la revendication 15 et/ou un anticorps selon la revendication 22, ainsi qu'un excipient approprié pharmaceutiquement acceptable.
34. Utilisation : a) d'une quantité thérapeutiquement efficace d'un polypeptide selon l'une quelconque des revendications 17 à 20, et/ou b) d'un polynucléotide selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, et/ou c) d'une cellule hôte selon la revendication 15, cette cellule provenant du sujet à traiter, pour préparer un médicament destiné à augmenter l'expression ou l'activité chez un sujet, d'un polypeptide selon l'une quelconque des revendications 17 à 20.
35. Utilisation : a) d'une quantité thérapeutiquement efficace d'un anticorps selon la revendication 22, et/ou b) d'un polynucléotide permettant d'inhiber l'expression d'un polynucléotide selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, pour préparer un médicament destiné à diminuer l'expression ou l'activité chez un sujet d'un polypeptide selon l'une quelconque des revendications 17 à 20.
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CNA028090551A CN1531600A (zh) 2001-03-30 2002-03-29 IFNα-21基因的新的多核苷酸和多肽
IL15815902A IL158159A0 (en) 2001-03-30 2002-03-29 NEW POLYNUCLEOTIDES AND POLYPEPTIDES OF THE IFNalpha-21 GENE
DK02727557T DK1379695T3 (da) 2001-03-30 2002-03-29 Nye polynukleotider og polypeptider af IFNalfa-21-genet
PT02727557T PT1379695E (pt) 2001-03-30 2002-03-29 Novos polinucleótidos e polipéptidos do gene ifna-21
AT02727557T ATE333520T1 (de) 2001-03-30 2002-03-29 Neuartige polynukleotide und polypeptide des ifnalpha-21 gens
JP2002577873A JP2005503121A (ja) 2001-03-30 2002-03-29 ＩＦＮα−２１遺伝子の新規ポリヌクレオチド及びポリペプチド
EP02727557A EP1379695B1 (fr) 2001-03-30 2002-03-29 Nouveaux polynucleotides et nouveaux polypeptides du gene ifnalpha-21
DE2002613221 DE60213221T2 (de) 2001-03-30 2002-03-29 Neuartige polynukleotide und polypeptide des ifnalpha-21 gens
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AU2002257777A AU2002257777B2 (en) 2001-03-30 2002-03-29 New polynucleotides and polypeptides of the IFN$G(A)-21 gene
CA 2442775 CA2442775A1 (fr) 2001-03-30 2002-03-29 Nouveaux polynucleotides et nouveaux polypeptides du gene ifn alpha-21
ES02727557T ES2268023T3 (es) 2001-03-30 2002-03-29 Nuevos polinucleotidos y polipeptidos del gen ifnalfa-21.
KR10-2003-7012828A KR20030093292A (ko) 2001-03-30 2002-03-29 ＩＦＮα-21 유전자의 신규한 폴리뉴클레오티드 및폴리펩티드
ZA200307578A ZA200307578B (en) 2001-03-30 2003-09-29 New polynucleotides and polypeptides of the IFNalpha-21 gene.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6899770B1 (en) 1999-03-04 2005-05-31 Henkel Corporation Composition and process for treating metal surfaces
EP1351707B9 (fr) * 2001-01-09 2012-01-25 Baylor Research Institute Traitements de maladies auto-immunes chez un sujet et techniques diagnostiques i in vitro /i
US7087726B2 (en) 2001-02-22 2006-08-08 Genentech, Inc. Anti-interferon-α antibodies
FR2822845B1 (fr) * 2001-03-30 2003-12-12 Genodyssee Nouveaux polynucleotides comportant des polymorphismes de type snp fonctionnels dans la sequence nucleotidique du gene ifn-alpha-21 ainsi que de nouveaux polypeptides codes par ces polynucleotides et leurs utilisations therapeutiques
EP1418428A1 (fr) * 2002-11-07 2004-05-12 GenOdyssee Procédé pour fournir des agents thérapeutiques naturels avec un index thérapeutique élevé
KR101363120B1 (ko) * 2005-02-10 2014-02-13 베일러 리서치 인스티튜트 항-인터페론 알파 모노클로날 항체 및 사용 방법
US7888481B2 (en) * 2005-02-10 2011-02-15 Baylor Research Institute Anti-interferon alpha monoclonal antibodies and methods for use
BRPI0912570B8 (pt) * 2008-05-07 2021-05-25 Argos Therapeutics Inc anticorpo anti-ifn-alfa humanizado, ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, composição terapêutica e seus usos
WO2013032883A2 (fr) * 2011-08-26 2013-03-07 Ottawa Heart Institute Research Corporation Procédés de détection et de traitement de maladies cardiovasculaires
CN102584980B (zh) * 2012-02-23 2013-11-20 北京三元基因工程有限公司 干扰素α突变体及其聚乙二醇衍生物
CN102584981B (zh) * 2012-02-23 2013-08-28 北京三元基因工程有限公司 干扰素α突变体及其聚乙二醇衍生物
CN103554246B (zh) * 2012-02-23 2015-04-01 北京三元基因工程有限公司 干扰素α突变体及其聚乙二醇衍生物
CN103467592B (zh) * 2012-02-23 2014-11-19 北京三元基因工程有限公司 干扰素α突变体及其聚乙二醇衍生物
CA3115089A1 (fr) 2018-10-11 2020-04-16 Inhibrx, Inc. Anticorps a domaine unique dll3 et compositions therapeutiques
TW202021986A (zh) 2018-10-11 2020-06-16 美商英伊布里克斯公司 5t4單域抗體及其治療性組合物
CN113166261A (zh) 2018-10-11 2021-07-23 印希比股份有限公司 B7h3单域抗体及其治疗性组合物
JP7453219B2 (ja) 2018-10-11 2024-03-19 インヒブリックス， インコーポレイテッド Ｐｄ－１単一ドメイン抗体およびその治療用組成物

Family Cites Families (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CH657141A5 (de) 1980-07-01 1986-08-15 Hoffmann La Roche Dns-sequenzen, rekombinante expressionsvektoren zur mikrobiellen herstellung von human-leukozyten-interferonen und transformierte mikroorganismen.
US6610830B1 (en) * 1980-07-01 2003-08-26 Hoffman-La Roche Inc. Microbial production of mature human leukocyte interferons
US4801685A (en) * 1981-08-14 1989-01-31 Hoffmann-La Roche Inc. Microbial production of mature human leukocyte interferon K and L
CA1217440A (fr) * 1982-08-18 1987-02-03 Michael A. Innis INTERFERON .alpha. 6L
JPS6156199A (ja) 1984-08-27 1986-03-20 Shionogi & Co Ltd 新規ヒトインタ−フエロンα類
US6299887B1 (en) * 1995-02-24 2001-10-09 Kao Corporation Phosphoric triesters and external compositions containing the same
JP2001526033A (ja) * 1997-12-08 2001-12-18 ジェネンテク・インコーポレイテッド ヒトインターフェロン−イプシロンというｉ型インターフェロン
EP1140144A4 (fr) * 1998-12-31 2002-10-30 Viragen Inc Procedes et composition de melanges naturels extremement purifies d'interferons de type i derives des leucocytes
CN1451045A (zh) * 1999-10-07 2003-10-22 马克西根公司 IFN－α同系物
FR2817559B1 (fr) * 2000-12-06 2003-12-12 Genodyssee Procede de determination d'un ou plusieurs polymorphisme(s) fontionnel(s) dans la sequence nucleique d'un gene "candidat" fonctionnel preselectionne et ses applications
FR2821625B1 (fr) * 2001-03-01 2003-05-16 Genodyssee Nouveaux polynucleotides comportant un polymorphisme de type snp fonctionnel dans la sequence nucleotidique du gene ifn-alpha-2 ainsi que de nouveaux polypeptides codes par ces polynucleotides et leurs utilisations therapeutiques
FR2822845B1 (fr) * 2001-03-30 2003-12-12 Genodyssee Nouveaux polynucleotides comportant des polymorphismes de type snp fonctionnels dans la sequence nucleotidique du gene ifn-alpha-21 ainsi que de nouveaux polypeptides codes par ces polynucleotides et leurs utilisations therapeutiques
FR2823220B1 (fr) * 2001-04-04 2003-12-12 Genodyssee Nouveaux polynucleotides et polypeptides de l'erythropoietine (epo)
FR2823764B1 (fr) * 2001-04-24 2003-12-12 Genodyssee Nouveaux polynucleotides et polypeptides du gene ifn alpha-17
FR2824333B1 (fr) * 2001-05-03 2003-08-08 Genodyssee Nouveaux polynucleotides et polypeptides de l'ifn alpha 5
FR2825102B1 (fr) * 2001-05-23 2003-08-29 Genodyssee Nouveaux polynucleotides et polypeptides de l'interferon alpha 14
FR2825716B1 (fr) * 2001-06-11 2004-09-24 Genodyssee Nouveaux polynucleotides et polypeptides de l'ifn alpha 7
EP1418428A1 (fr) * 2002-11-07 2004-05-12 GenOdyssee Procédé pour fournir des agents thérapeutiques naturels avec un index thérapeutique élevé

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DATABASE EMBL european molecular biology laboratory; 13 August 1987 (1987-08-13), VELAN B ET AL.: "Bovine interferon alpha genes. Structure and expression", XP002187983 *
DONN R P ET AL.: "Cytokine gene polymorphisms and suceptibility to juvenile idiopathic arthritis", ARTHRITIS & RHEUMATISM, vol. 44, no. 4, April 2001 (2001-04-01), pages 802 - 810, XP001058235 *
FINK T ET AL.: "Biological characterization of three novel variants of IFN-alpha13 produced by human placental trophoblast", PLACENTA, vol. 22, September 2001 (2001-09-01), pages 673 - 680, XP001058217 *
SYVANEN A-CH ET AL: "IDENTIFICATION OF INDIVIDUALS BY ANALYSIS OF BIALLELIC DNA MARKERS,USING PCR AND SOLID-PHASE MINISEQUENCING", AMERICAN JOURNAL OF HUMAN GENETICS, UNIVERSITY OF CHICAGO PRESS, CHICAGO,, US, vol. 52, no. 1, 1993, pages 46 - 59, XP002050638, ISSN: 0002-9297 *
YAMADA R ET AL: "IDENTIFICATION OF 142 SINGLE NUCLEOTIDE POLYMORPHISMS IN 41 CANDIDATE GENES FOR RHEUMATOID ARTHRITIS IN THE JAPANESE POPULATION", HUMAN GENETICS, BERLIN, DE, vol. 106, 2000, pages 293 - 297, XP002947356 *

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