FR2821625A1 - Nouveaux polynucleotides comportant un polymorphisme de type snp fonctionnel dans la sequence nucleotidique du gene ifn-alpha-2 ainsi que de nouveaux polypeptides codes par ces polynucleotides et leurs utilisations therapeutiques - Google Patents

Abstract

Polynucléotide isolé comprenant :a) une séquence nucléotidique ayant au moins 80 % d'identité avec la séquence nucléotidique ID SEQ Ndegre 1 et ayant la même, ou pratiquement la même fonctionnalité que la séquence nucléotidique ID SEQ Ndegre 1, b) une séquence nucléotidique ayant au moins 80 % d'identité avec la séquence nucléotidique codante de la séquence nucléotidique ID SEQ Ndegre 1 et ayant la même, ou pratiquement la même fonctionnalité que la séquence nucléotidique ID SEQ Ndegre 1, ouc) une séquence nucléotidique complémentaire à la séquence nucléotidique sous a) ou sous b).

Description

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La présente invention concerne de nouveaux polynucléotides comportant un polymorphisme de type SNP fonctionnel dans la séquence nucléotidique du gène IFNa-2 ainsi que de nouveaux polypeptides codés par ces polynucléotides et leurs utilisations thérapeutiques.

ART ANTERIEUR
Le gène interféron alpha-2 humain (IFNa-2) est décrit dans les publications : - Olopade 01., Bohlander Sk. "Mapping of the shortest region of overlap of deletions of the short arm of chromosome 9 associated with human neoplasia." Genomics. 1992 Oct;14(2):437-43 PMID: 1385305 ; - Ezekowitz Ra., Mulliken Jb., "Interferon alfa-2a therapy for life-threatening hemangiomas of infancy" N. Engl. J. Med. 1992 May 28;326(22):1456-63.

PMID: 1489383 ; - Dithmar S., Rusciano D., "Neoadjuvant interferon alfa-2b treatment in a murine model for metastatic ocular melanoma: a preliminary study" Arch.

Ophthalmol. 2000 Aug;118(8):1085-9. PMID : 10922203 ; - et notamment sous le numéro d'accès J00207, V11834 dans la base de données GenBank.

Les IFNa sont connus pour leurs effets anti-prolifératifs cellulaires et leurs implications dans les réponses anti-virales et anti-parasitaires.

Les IFNa sont aussi connus pour inhiber l'expression de plusieurs autres cytokines au niveau des cellules hématopoïétiques souches, ainsi que pour inhiber la prolifération cellulaire de certaines tumeurs.

Les IFNa sont également connus pour réduire l'expression des récepteurs à l'EGF dans les carcinomes rénaux, pour inhiber l'expression de certains gènes mitochondriaux, pour inhiber la prolifération des fibroblastes, des monocytes et des lymphocytes B, notamment in-vitro et pour bloquer la

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synthèse des anticorps, par les lymphocytes B.

Les IFNa sont également connus pour induire l'expression d'antigènes spécifiques de tumeurs à la surface de cellules tumorales et également pour induire les gènes placés sous le contrôle de régions promotrices de type ISRE (Interferon-stimulated response element) en agissant sur les facteurs de transcription spécifiques de ces ISRE.

Il est connu que les IFNa sont impliqués dans différents dérèglements et/ou maladies humaines, tels que les différents cancers comme, par exemple, les carcinomes, les mélanomes, les lymphomes, les leucémies et , les cancers du foie, du cou, de la tête et des reins, les maladies cardiovasculaires, les maladies métaboliques telles que celles qui ne sont pas liées au système immunitaire comme, par exemple, l'obésité, les maladies infectieuses comme les hépatites B et C et le SIDA, les pneumonies, les colites ulcératives, les maladies du système nerveux central comme, par exemple, la maladie d'Alzheimer, la schizophrénie et la dépression, le rejet de greffe de tissus ou d'organes, la cicatrisation de blessures, l'anémie chez les patients dialysés, les allergies, l'asthme, les scléroses multiples, l'ostéoporose, le psoriasis, l'arthrite rhumatoïde, la maladie de Crohn, les maladies et les désordres auto-immuns, les désordres gastro-intestinaux ou encore les désordres liés aux traitements par chimiothérapie.

Les IFNa sont particulièrement utilisés pour le traitement de certaines leucémies, de carcinomes rénaux métastasés ainsi que des tumeurs qui apparaissent à la suite d'un déficit immunitaire, tel que le sarcome de
Kaposi dans le cas du SIDA. Les IFNa sont aussi efficaces contre d'autres types de tumeurs et contre certaines infections virales. Les IFN[alpha] sont aussi reconnus par la Food and Drug Administration (FDA) pour le traitement des verrues génitales ou vénériennes.

Toutefois, les IFNa, et particulièrement les IFNa-2, présentent de nombreux effets secondaires lorsqu'ils sont employés dans des compositions pharmaceutiques, tels que des réactions d'hypersensibilité aiguë (urticaire, broncho-constriction, choc anaphylactique, etc. ), des arythmies cardiaques, des

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hypotensions artérielles, des crises d'épilepsie, des troubles des fonctions thyroïdiennes, des syndromes pseudo-grippaux (fièvres, sueurs, myalgies), etc.

De plus, les patients traités par les IFNa peuvent développer des anticorps neutralisant ces molécules diminuant ainsi leurs efficacités.

La demanderesse a trouvé de nouveaux polypeptides et nouveaux polynucléotides analogues à l'IFNa-2, présentant une activité anti-proliférative cellulaire significativement inhibée par rapport à l'IFNa-2 naturel, pouvant être utilisés pour traiter ou prévenir les dérèglements ou maladies mentionnés précédemment et d'éviter tout ou partie des inconvénients mentionnés ci- , dessus.

L'INVENTION
L'invention a pour principal objet de nouveaux polynucléotides qui diffèrent de la séquence nucléotidique du gène sauvage de référence de IFN[alpha]-
2, en ce qu'ils comportent un polymorphisme de type SNP (Single Nucleotide
Polymorphism) fonctionnel.

Ainsi, le nucléotide guanine (g) en position 1023 est modifié en adénine (a) par rapport à la séquence nucléotidique du gène sauvage de référence IFNa-2, comme il est mentionné dans la séquence nucléotidique ID SEQ N 1. Le polymorphisme de type SNP est donc appelé g1023a du gène IFNa-2.

Ce polymorphisme de type SNP a été identifié par la demanderesse au moyen du procédé de détermination décrit dans la demande de brevet FR 00 22894, intitulé "Procédé de détermination d'un ou plusieurs polymorphisme(s) fonctionnel(s) dans la séquence nucléotidique d'un gène "candidat" fonctionnel présélectionné et ses applications" et déposée le 6 décembre 2000, cité ici à titre de référence.

La séquence nucléotidique ID SEQ N 3 correspond à un fragment de 20 nucléotides qui se situe dans la séquence nucléotidique ID SEQ
N 1 de la position 1011 à la position 1030. Ainsi, la séquence nucléotidique ID SEQ N 3 inclut le polymorphisme de type SNP de l'invention.

L'IFNa-2 humain sauvage code pour une protéine immature de

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188 acides aminés qui sera convertit en protéine mature de 165 acides aminés, par section du peptide signal qui comprend les 23 premiers acides aminés. La séquence nucléotidique codante de la protéine immature commence au nucléotide 511 (codon start) et finit au nucléotide 1077 (codon stop), dans la séquence nucléotidique du gène IFNa-2 humain sauvage qui comporte 1733 nucléotides.

Le polymorphisme de type SNP de l'invention entraîne une modification de méthionine (M) en position 171 dans la protéine immature codée par la séquence nucléotidique du gène IFNa-2 en isoleucine (1), et en , position 148 de la protéine mature.

Le polypeptide comportant la mutation M1711 du gène IFN[alpha]-2 correspond à la séquence d'acides aminés ID SEQ N 2 (protéine immature de
188 acides aminés). La séquence d'acides aminés de la protéine mature du gène de l'IFNa-2 comporte 165 acides aminés et correspond à la séquence d'acides aminés comprise entre l'acide aminé 24 et 188 de la séquence d'acides aminés ID SEQ N 2 (protéine immature).

Dans la description de la présente invention, on appellera indifféremment M1481 et M1711 la mutation codée par le polymorphisme de type
SNP de l'invention selon que l'on se réfère respectivement à la protéine mature ou à la protéine immature.

Le polymorphisme de type SNP de l'invention entraîne une modification de la conformation spatiale d'un polypeptide conforme à l'invention par rapport au polypeptide codé par la séquence nucléotidique du gène sauvage de référence. Une telle modification peut être observée par modélisation moléculaire bio-informatique, selon des méthodes bien connues de l'homme du métier mettant en #uvre, par exemple, les outils de modélisation de-novo (par exemple, SEQFOLD/MSI), d'homologie (par exemple, MODELER/MSI), de minimisation des champs de force (par exemple,
DISCOVER, DELPHI/MSI) et/ou de dynamique moléculaire (par exemple,
CFF/MSI).

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Un exemple d'une telle modélisation est donnée ci-après dans la partie expérimentale. Ces outils ont ainsi permis une modélisation d'un polypeptide de l'invention.

La modélisation bio-informatique permet d'observer que la mutation M1481 sur la protéine mutée mature entraîne une modification des chaînes latérales proches du point de mutation, sur les hélices A et E de l'IFNa- 2 naturel. La chaîne latérale mutée 1148 s'engage dans un pont salin avec la chaîne latérale de E141, ce qui entraîne quelques modifications dans la conformation spatiale de la protéine mutée mature.

Alors que dans l'IFNa-2 naturel la chaîne latérale de R144 est orientée vers l'intérieur de la molécule dans sa conformation tridimensionnelle, cette chaîne latérale est orientée vers l'extérieur sur la protéine mutée mature.

De même, les chaines latérales R22 et E141 sont déplacées dans la protéine mutée mature.

Un génotypage d'un polynucléotide conforme à l'invention peut également être effectué de façon à déterminer la fréquence allélique de ce polynucléotide dans une population. Un exemple de génotypage est donné, ciaprès, dans la partie expérimentale.

La détermination de la fonctionnalité d'un polypeptide de l'invention peut également être effectuée par un test de mesure de l'effet antiprolifératif sur la lignée cellulaire de Daudi en présence d'un polypeptide conforme à l'invention et d'un polypeptide codé par le gène sauvage de référence de l'IFNa-2 humain.

L'invention a aussi pour objet la mise en évidence et l'utilisation de molécules thérapeutiques obtenues à partir de l'information dérivant d'un polynucléotide et d'un polypeptide conforme à l'invention, notamment pour la prévention et le traitement des différents dérèglements et/ou maladies humaines, tels que les différents cancers comme, par exemple, les carcinomes, les mélanomes, les lymphomes, les leucémies et les cancers du foie, du cou, de la tête et des reins, les maladies cardiovasculaires, les maladies métaboliques telles que celles qui ne sont pas liées au système immunitaire comme, par exemple, l'obésité, les maladies infectieuses comme les hépatites

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B et C et le SIDA, les pneumonies, les colites ulcératives, les maladies du système nerveux central comme, par exemple, la maladie d'Alzheimer, la schizophrénie et la dépression, le rejet de greffe de tissus ou d'organes, la cicatrisation de blessures, l'anémie chez les patients dialysés, les allergies, l'asthme, les scléroses multiples, l'ostéoporose, le psoriasis, l'arthrite rhumatoïde, la maladie de Crohn, les maladies et les désordres auto-immuns, les désordres gastro-intestinaux ou encore les désordres liés aux traitements par chimiothérapie.

La Figure 1 représente la modélisation de la protéine codée par le polynucléotide de séquence nucléotidique ID SEQ N 1 et de la protéine codée par la séquence nucléotidique du gène sauvage de référence.

La Figure 2 représente le résultat du génotypage du polymorphisme de type SNP conforme à l'invention dans une population d'individus.

Sur cette figure, les abscisses représentent la valeur mp du filtre
Tamra (ddGTP)et les ordonnées représentent la valeur mp du filtre R-110 (ddATP).

En haut à droite, le groupe hétérozygote AG contient 1 individu.

En bas à droite, le groupe homozygote GG contient 237 individus.

En bas à gauche, le groupe d'individus contient 7 individus blancs et 1 individu non génotype.

La Figure 3 représente le résultat du test de mesure de l'effet anti- prolifératif sur la lignée cellulaire de Daudi en présence d'un polypeptide conforme à l'invention et d'un polypeptide codé par le gène sauvage de référence de l'IFNa-2 humain.

Sur cette Figure, les abscisses correspondent au logarithme de la concentration protéique en picomolaires (pM) et les ordonnées correspondent au pourcentage de prolifération cellulaire.

L'effet anti-prolifératif de l'IFNa-2 sauvage est représenté par des triangles et l'effet anti-prolifératif de l'IFNa-2 muté est représenté par des ronds.

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DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION Définitions
On entend par "séquence nucléotidique du gène sauvage de référence", la séquence nucléotidique du gène IFNa-2 humain mentionnée dans la GenBank sous le numéro d'accès J00207, V11834 et mentionnée notamment dans la publication Olopade Ol., Bohlander Sk. "Mapping of the shortest region of overlap of deletions of the short arm of chromosome 9 associated with human neoplasia." Genomics. 1992 Oct;14(2):437-43 PMID: 1385305.

On entend par "IFNa-2 naturel" le polypeptide codé par la séquence nucléotidique du gène sauvage de référence.

On entend par "polynucléotide", un polyribonucléotide ou un polydésoxyribonucléotide qui peut être un ADN ou un ARN modifié ou non.

Le terme polynucléotide inclut, par exemple, un ADN simple brin ou double brin, un ADN composé d'un mélange d'une ou plusieurs région (s) simple brin et d'une ou plusieurs région (s) brins, un ARN simple brin ou double brin et un ARN composé d'un mélange d'une ou plusieurs région(s) simple brin et d'une ou plusieurs région (s) brins. Le terme polynucléotide peut aussi comprendre un ARN et/ou un ADN comprenant une ou plusieurs régions triple brins. On entend également par polynucléotide les ADNs et ARNs contenant une ou plusieurs bases modifiées de façon à avoir un squelette modifié pour la stabilité ou pour d'autres raisons. On entend par base modifiée, par exemple, les bases inhabituelles telles que l'inosine.

On entend par "polypeptide", un peptide, un oligopeptide, un oligomère ou une protéine comprenant au moins deux acides aminés joints l'un à l'autre par une liaison peptidique normale ou modifiée, comme dans le cas des peptides isostères, par exemple.

Un polypeptide peut être composé d'autres acides aminés que les 20 acides aminés codés par les gènes humains. Un polypeptide peut également être composé d'acides aminés modifiés par des processus naturels, tel que le processus de maturation post-traductionnel ou par des procédés chimiques, qui sont bien connus de l'homme du métier. De telles modifications

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sont bien détaillées dans la littérature. Ces modifications peuvent apparaître n'importe où dans le polypeptide : dans le squelette peptidique, dans la chaîne d'acides aminés ou encore aux extrémités carboxy- ou amino-terminales.

Un polypeptide peut être ramifié suite à une ubiquitination ou être cyclique avec ou sans ramification. Ce type de modifications peut être le résultat de processus de post-translation naturel ou synthétique, qui sont bien connus de l'homme du métier.

On entend, par exemple, par modifications d'un polypeptide, l'acétylation, l'acylation, l'ADP-ribosylation, l'amidation, la fixation covalente de flavine, la fixation covalente d'un hème, la fixation covalente d'un nucléotide ou d'un dérivé nucléotidique, la fixation covalente d'un lipide ou d'un dérivé lipidique, la fixation covalente d'un phosphatidylinositol, la réticulation covalente ou non-covalente, la cyclisation, la formation de pont disulfure, la déméthylation, la formation de cystéine, la formation de pyroglutamate, la formylation, la gamma-carboxylation, la glycosylation, la formation d'ancre au
GPI, l'hydroxylation, l'iodisation, la méthylation, la myristoylation, l'oxydation, le processus protéolytique, la phosphorylation, la prénylation, la racémisation, la sénéloylation, la sulfatation, l'addition d'acides aminés telle que l'arginylation ou l'ubiquitination. De telles modifications sont bien détaillées dans la littérature :
PROTEINS-STRUCTURE AND MOLECULAR PROPERTIES, 2nd Ed., T. E.

Creighton, New York, 1993, POST-TRANSLATIONAL COVALENT
MODIFICATION OF PROTEINS, B. C. Johnson, Ed., Academic Press, New York, 1983, Seifter et al. "Analysis for protein modifications and nonprotein cofactors", Meth. Enzymol. (1990) 182:626-646 et Rattan et al. "Protein
Synthesis : Post-translational Modifications and Aging", Ann NY Acad Sci (1992) 663 :48-62.

On entend par "variant", un polynucléotide ou un polypeptide qui diffère respectivement d'au moins un nucléotide ou d'au moins un acide aminé par rapport à un polynucléotide ou à un polypeptide conforme à l'invention, mais qui garde les mêmes propriétés intrinsèques, c'est à dire la même, ou pratiquement la même fonctionnalité.

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Un changement dans la séquence nucléotidique du variant peut altérer ou non la séquence d'acides aminés du polypeptide qu'il code, par rapport à un polypeptide de l'invention. Un changement de nucléotide dans le polynucléotide variant peut résulter en une substitution d'un acide aminé, une addition, une délétion, une fusion ou une troncation dans le polypeptide variant codé par ledit polynucléotide variant, par rapport à un polypeptide de l'invention.
Un polypeptide variant diffère généralement d'un polypeptide de l'invention par une (ou plusieurs) substitution (s), ou délétion(s) ou plusieurs de ces modifications, pris en combinaison. Un variant non-naturel d'un polynucléotide ou d'un polypeptide peut être obtenu, par exemple, par mutagenèse dirigée ou par synthèse directe.

On entend par "identité", la mesure d'identité d'une séquence nucléotidique ou polypeptidique. L'identité est un terme bien connu de l'homme du métier et de la littérature. Voir COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY,
Lesk, A. M., Ed., Oxford University Press, New York, 1998; BIOCOMPUTING
INFORMA TICS AND GENOME PROJECT, Smith, D. W., Ed., Academic Press, New York, 1993 ; COMPUTERANALYSIS OF SEQUENCE DATA, PART I, Griffin, A. M. and Griffin H.G., Ed, Humana Press, New Jersey, 1994 ; SEQUENCE ANALYSIS IN MOLECULAR BIOLOGY, von Heinje, G., Academic Press, 1987.

Les méthodes communément employées pour déterminer l'identité et la similarité entre deux séquences sont également bien décrites dans la littérature. Voir GUIDE TO HUGE COMPUTER, Martin J. Bishop, Ed, Academic Press, San Diego, 1994, et Carillo H. and Lipton D., Siam J Applied Math (1988) 48 :1073.

Un polynucléotide ayant, par exemple, une identité d'au moins 95 % avec le polynucléotide ID SEQ N 1 est un polynucléotide qui comporte au plus 5 nucléotides modifiés sur 100 nucléotides, par rapport à ladite séquence.

On entend par "polymorphisme de type SNP", toute variation naturelle d'une base dans une séquence nucléotidique.

On entend par "polymorphisme de type SNP fonctionnel", un polymorphisme de type SNP qui a pour conséquence de modifier la

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fonctionnalité d'un polynucléotide ou d'un polypeptide codé par ce polynucléotide.

On entend par "fonctionnalité", l'activité biologique d'un polypeptide ou d'un polynucléotide codant pour ce polypeptide.

La fonctionnalité d'un polypeptide conforme à l'invention ou d'un polynucléotide codant pour ce polypeptide peut consister en une augmentation, une diminution ou une suppression de l'activité biologique, voire un changement de nature de l'activité biologique du polypeptide codé par la séquence nucléotidique du gène sauvage de référence ou de cette séquence.

L'activité biologique peut, notamment, être liée à l'affinité ou à l'absence d'affinité du polypeptide vis-à-vis d'un ligand, tel qu'un récepteur.

On considérera, dans le cadre de la présente invention, qu'un variant possède la même ou pratiquement la même fonctionnalité qu'un polynucléotide ou un polypeptide de l'invention si l'on obtient une inhibition de l'effet anti-prolifératif cellulaire, déterminée selon le test décrit dans l'exemple 3 de la partie expérimentale, supérieure à 90%.

Polynucléotide
La présente invention a pour premier objet un polynucléotide isolé comprenant : a) une séquence nucléotidique ayant au moins 80 % d'identité, préférentiellement au moins 90 % d'identité, encore plus préférentiellement au moins 95 % d'identité, avec la séquence nucléotidique ID SEQ N 1 et ayant la même, ou pratiquement la même fonctionnalité que la séquence nucléotidique ID SEQ N 1, b) une séquence nucléotidique ayant au moins 80 % d'identité, préférentiellement au moins 90 % d'identité, encore plus préférentiellement au moins 95 % d'identité, avec la séquence nucléotidique codante de la séquence nucléotidique ID SEQ N 1 (du nucléotide 511 au nucléotide 1077) et ayant la même, ou pratiquement la même fonctionnalité que la séquence nucléotidique ID SEQ N 1, ou c) une séquence nucléotidique complémentaire à une séquence nucléotidique

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décrite sous a) ou sous b).

La présente invention concerne également un polynucléotide isolé comprenant : a) une séquence nucléotidique ayant au moins 80 % d'identité, préférentiellement au moins 90 % d'identité, encore plus préférentiellement au moins 95 % d'identité avec la séquence nucléotidique ID SEQ N 1 et comportant la séquence nucléotidique ID SEQ N 3, b) une séquence nucléotidique ayant au moins 80 % d'identité, préférentiellement au moins 90 % d'identité, encore plus préférentiellement au moins 95 % d'identité avec la séquence nucléotidique codante de la séquence nucléotidique ID SEQ N 1 (du nucléotide 511 au nucléotide 1077) et comportant la séquence nucléotidique ID SEQ N 3, ou c) la séquence nucléotidique complémentaire à la séquence nucléotidique décrite sous a) ou sous b).

Ainsi, une séquence nucléotidique selon l'invention peut comprendre les 20 nucléotides de la séquence ID SEQ N 3 , celle ci étant un fragment de la dite séquence ID SEQ N 1(du nucléotide 1011 au nucléotide 1030). Préférentiellement, une séquence nucléotidique selon l'invention peut comprendre 10 nucléotides de la séquence ID SEQ N 3 (du nucléotide 1018 au nucléotide 1027 de la séquence ID SEQ N 1) et encore plus préférentiellement 5 nucléotides de la séquence ID SEQ N 3 (du nucléotide 1021 au nucléotide 1025 de la séquence ID SEQ N 1).

Le polynucléotide isolé conforme à l'invention comprend, plus particulièrement : a) la séquence nucléotidique ID SEQ N 1, b) la séquence nucléotidique codante de la séquence nucléotidique ID SEQ
N 1, telle que définie ci-dessus, ou c) la séquence nucléotidique complémentaire à la séquence nucléotidique sous a) ou sous b).

Le polynucléotide isolé conforme à l'invention consiste, tout particulièrement, en la séquence nucléotidique ID SEQ N 1 ou sa séquence codante (du nucléotide 511 au nucléotide 1077).

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La présente invention concerne aussi un polynucléotide isolé codant pour un polypeptide comprenant : a) la séquence d'acides aminés ID SEQ N 2, ou b) la séquence d'acides aminés comportant les acides aminés compris entre
24 et 188 de la séquence d'acides aminés ID SEQ N 2.

Préférentiellement le polynucléotide conforme à l'invention comprend une molécule d'ADN ou d'ARN.

Le polynucléotide de l'invention peut être obtenu par les méthodes standards de synthèse d'ADN ou d'ARN. Ce polynucléotide peut également être , obtenu par mutagénèse dirigée à partir de la séquence nucléotidique du gène
IFNa-2 en modifiant le nucléotide g par le nucléotide a en position 1023. Les procédés de mutagenèse dirigée qui peuvent ainsi être mis en #uvre sont bien connus de l'homme du métier. On peut notamment évoquer la publication de
TA Kunkel en 1985 dans "Proc. Natl. Acad. Sci. USA" 82:488.

Le polynucléotide isolé peut également comprendre, par exemple, des séquences nucléotidiques codant pour des séquences d'acides aminés pre-, pro- ou pre-pro-protéine ou des séquences d'acides aminés marqueurs, comme l'hexa-histidine peptide.

Le polynucléotide de l'invention peut également contenir des séquences nucléotidiques codant pour d'autres protéines ou fragments de protéines en vue d'obtenir des protéines de fusion ou à des fins de purification.

Le polynucléotide conforme à l'invention peut également comprendre des séquences nucléotidiques comme les séquences 5' et/ou 3' non-codantes, telles que, par exemple, des séquences transcrites, des séquences non-translatées, des séquences signal d'épissage, des séquences polyadénylées, des séquences de liaison avec des ribosomes ou encore des séquences qui stabilisent l'ARNm.

On définit comme séquence nucléotidique complémentaire à la séquence nucléotidique un polynucléotide qui peut être hybridé avec cette séquence nucléotidique, dans des conditions stringentes.

On entend généralement, mais pas nécessairement, par "conditions stringentes d'hybridation" les conditions chimiques qui permettent

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une hybridation lorsque les séquences nucléotidiques ont une identité d'au moins 80 %, de préférence supérieure ou égale à 90 %, encore plus préférentiellement supérieure ou égale à 95 % et tout particulièrement supérieure ou égale à 97 %.

Ces conditions peuvent être obtenues selon les méthodes bien connues de l'homme du métier et, par exemple, par une incubation des polynucléotides, à 42 C, dans une solution comprenant 50 % de formamide, 5xSSC (150 Mm de NaCI, 15 mM de trisodium citrate), 50 Mm de sodium phosphate (pH = 7,6), 5x Solution Denhardt, 10 % de dextran sulfate et 20 g d'ADN de sperme de saumon dénaturé, suivi d'un lavage des filtres à 0,1 x SSC, à 65 C.

Identification, hybridation et/ou amplification d'un polynucléotide. comportant le polymorphisme de type SNP
La présente invention a aussi pour objet l'utilisation de tout ou partie d'un polynucléotide défini précédemment, pour identifier, hybrider et/ou amplifier tout ou partie d'un polynucléotide comportant le polymorphisme de type SNP g1023a du gène IFNa-2.

Ainsi, par exemple, tout ou partie d'un polynucléotide conforme à l'invention, qui est identique ou suffisamment identique, à la séquence nucléotidique ID SEQ N 1 ou à sa séquence codante (du nucléotide 511 au nucléotide 1077), à la séquence nucléotidique ID SEQ N 3, ou à un de ses fragments comprenant le polymorphisme de type SNP conforme à l'invention, peut être utilisé comme sonde d'hybridation pour isoler l'ADNc ou l'ADN génomique de la séquence ID SEQ N 1, de sa séquence codante (du nucléotide 511au nucléotide 1077) ou de la séquence ID SEQ N 3.

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Génotypage et détermination de la fréquence du polymorphisme de type
SNP
La présente invention a également pour objet l'utilisation de tout ou partie d'un polynucléotide conforme à l'invention comme outil de génotypage.

La présente invention a aussi pour objet un procédé de détermination de la fréquence du polymorphisme de type SNP d'un polynucléotide conforme à l'invention dans lequel on procède à un génotypage chez un individu ou dans une population d'individus.

Au sens de l'invention, on définit le génotypage comme un procédé de détermination du génotype d'un individu ou d'une population d'individus.

On entend par "population d'individus", un groupe d'individus déterminés de façon aléatoire ou non. Ces individus peuvent être des humains, des animaux ou des plantes.

Les individus peuvent être choisis selon leur ethnie ou selon leur phénotype, notamment ceux qui sont atteints par les dérèglements et/ou maladies suivantes : les différents cancers comme, par exemple, les carcinomes, les mélanomes, les lymphomes, les leucémies et les cancers du foie, du cou, de la tête et des reins, les maladies cardiovasculaires, les maladies métaboliques telles que celles qui ne sont pas liées au système immunitaire comme, par exemple, l'obésité, les maladies infectieuses comme les hépatites B et C et le SIDA, les pneumonies, les colites ulcératives, les maladies du système nerveux central comme, par exemple, la maladie d'Alzheimer, la schizophrénie et la dépression, le rejet de greffe de tissus ou d'organes, la cicatrisation de blessures, l'anémie chez les patients dialysés, les allergies, l'asthme, les scléroses multiples, l'ostéoporose, le psoriasis, l'arthrite rhumatoïde, la maladie de Crohn, les maladies et les désordres auto-immuns, les désordres gastro-intestinaux ou encore les désordres liés aux traitements par chimiothérapie.

Le polymorphisme de type SNP fonctionnel conforme à l'invention est préférentiellement génotype dans une population d'individus.

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Le génotypage peut être effectué par un miniséquençage avec des ddNTPs chauds (2 ddNTPs différents marqués par des fluorophores différents) et froids (2 ddNTPs non marqués), en liaison avec un lecteur de fluorescence polarisé. Le protocole de miniséquençage avec lecture de fluorescence polarisée (Technologie FP-TDI ou Fluorescence Polarization Template-direct Dye-Terminator Incorporation) est bien connu de l'homme du métier.

Il peut être réalisé sur un produit obtenu après amplification par réaction de polymérisation en chaîne (PCR) de l'ADN de chaque individu. Ce produit PCR est choisi pour couvrir la région génique du polynucléotide contenant le polymorphisme de type SNP étudié. Après la dernière étape dans le thermocycleur de la PCR, la plaque est alors placée sur un lecteur de fluorescence polarisée pour la lecture des bases marquées en utilisant les filtres d'excitation et d'émission spécifique des fluorophores. Les valeurs d'intensité des bases marquées sont reportées sur un graphe.

Les amorces respectivement sens et antisens pour l'amplification PCR, dans le cas du polymorphisme de type SNP de l'invention, peuvent comprendre par exemple les séquences nucléotidiques ID SEQ N 4 et ID SEQ N 5.

Ces séquences nucléotidiques permettent d'amplifier un fragment d'une longueur de 655 nucléotides, du nucléotide 470 au nucléotide 1124 dans la séquence nucléotidique ID SEQ N 1.

Une analyse statistique de la fréquence de chaque allèle (fréquence allélique) codé par le gène comportant le SNP dans la population d'individus est alors effectuée, ce qui permet de déterminer l'importance de leur impact et leur répartition dans les différents sous-groupes et notamment, le cas échéant, les diverses ethnies qui constituent cette population d'individus.

Les données de génotypage sont analysées pour estimer les fréquences de distributions des différents allèles observés dans les populations étudiées. Les calculs de fréquences alléliques peuvent être réalisés à l'aide de logiciels tels SAS-suite@ (SAS) ou SPLUS (MathSoft). La comparaison des distributions alléliques du polymorphisme de type SNP de l'invention au travers

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des différentes ethnies de la population d'individus peut être réalisée au moyen des logiciels ARLEQUIN@ et SAS-suite@.

La présente invention a également pour objet l'utilisation d'un polynucléotide conforme à l'invention pour la recherche d'une variation dans la séquence nucléotidique du gène IFNa-2 chez un individu.

Vecteur d'expression et cellule hôte
La présente invention a aussi pour objet un vecteur recombinant comprenant au moins un polynucléotide conforme à l'invention.

De nombreux systèmes d'expression peuvent être utilisés, comme, par exemple, les chromosomes, les épisomes, les virus dérivés. Plus particulièrement, les vecteurs recombinants utilisés peuvent être dérivés de plasmides bactériens, de transposons, d'épisome de levure, d'éléments d'insertion, d'éléments chromosomiques de levures, de virus tels que les baculovirus, les papillonna virus comme SV40, les vaccinia virus, les adénovirus, les fox pox virus, les pseudorabies virus, les rétrovirus.

Ces vecteurs recombinants peuvent également être des dérivés de cosmides ou de phagemides. La séquence nucléotidique peut être insérée dans le vecteur recombinant d'expression par les méthodes bien connues de l'homme du métier, telles que, par exemple, celles qui sont décrites dans MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL (supra) Sambrook et al..

Le vecteur recombinant peut comprendre des séquences nucléotidiques de contrôle de la régulation de l'expression du polynucléotide ainsi que des séquences nucléotidiques permettant l'expression et la transcription d'un polynucléotide de l'invention et la traduction d'un polypeptide de l'invention, ces séquences étant choisies en fonction des cellules hôtes mises en #uvre.

Ainsi, par exemple, un signal de sécrétion approprié peut être intégré dans le vecteur recombinant pour que le polypeptide, codé par le polynucléotide de l'invention, soit dirigé vers la lumière du réticulum endoplasmique, vers l'espace périplasmique, sur la membrane ou vers l'environnement extracellulaire.

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La présente invention a aussi pour objet une cellule hôte comprenant un vecteur recombinant conforme à l'invention.

L'introduction du vecteur recombinant dans une cellule hôte peut être effectuée selon les méthodes bien connues de l'homme du métier telles que celles décrites dans BASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, Davis et al., 1986 et MOLECULAR CLONING : A LABORATORY MANUAL, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989, telles que la transfection par calcium phosphate, le transfection par DEAE dextran, la transvection, la microinjection, la transfection par lipides cationiques, l'électroporation, la transduction ou l'infection.

Les cellules hôtes peuvent être, par exemple, des cellules bactériennes telles que les cellules de streptocoque, de staphylocoque, d'E. coli ou de Bacillus subtilis, des cellules de champignons telles que les cellules de levure et les cellules d'Aspergillus, de Streptomyces, des cellules d'insectes telles que les cellules de Drosophilia S2 et de Spodoptera Sf9, des cellules animales, telles que les cellules CHO, COS, HeLa, C127, BHK, HEK 293 et des cellules humaines du sujet à traiter ou encore des cellules végétales.

Les cellules hôtes peuvent être utilisées, par exemple, pour exprimer un polypeptide de l'invention ou en tant que produit actif dans des compositions pharmaceutiques, comme on le verra ci-après.

Polypeptide
La présente invention a aussi pour objet un polypeptide comprenant : a) une séquence d'acides aminés ayant au moins 80 % d'identité, préférentiellement au moins 90 % d'identité, encore plus préférentiellement au moins 95 % d'identité avec la séquence d'acides aminés ID SEQ N 2 et ayant la même, ou pratiquement la même fonctionnalité que la séquence d'acides aminés ID SEQ N 2, ou b) une séquence d'acides aminés ayant au moins 80 % d'identité, préférentiellement au moins 90 % d'identité, encore plus préférentiellement au moins 95 % d'identité avec la séquence d'acides aminés comportant les

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acides aminés compris entre 24 et 188 de la séquence d'acides aminés ID SEQ N 2 et ayant la même, ou pratiquement la même fonctionnalité que la séquence d'acides aminés ID SEQ N 2.

Ainsi, un polypeptide conforme à l'invention peut comprendre des variants de la séquence d'acides aminés ID SEQ N 2 ou de la séquence d'acides aminés comportant les acides aminés compris entre 24 et 188 de la séquence d'acides aminés ID SEQ N 2. Néanmoins, par définition, ces variants doivent conférer la même, ou pratiquement la même fonctionnalité que la séquence d'acides aminés ID SEQ N 2.

Le polypeptide de l'invention peut également comprendre la séquence d'acides aminés ID SEQ N 2 ou la séquence d'acides aminés comportant les acides aminés compris entre 24 et 188 de la séquence d'acides aminés ID SEQ N 2.

Le polypeptide de l'invention peut tout particulièrement consister en la séquence d'acides aminés ID SEQ N 2 ou la séquence d'acides aminés comportant les acides aminés compris entre 24 et 188 de la séquence d'acides aminés ID SEQ N 2.

La présente invention a également pour objet un procédé de préparation d'un polypeptide ci-dessus décrit, dans lequel une cellule hôte définie précédemment est cultivée et ledit polypeptide est isolé du milieu de culture.

Le polypeptide peut être purifié à partir des cellules hôtes, selon les méthodes bien connues de l'homme du métier telles que la précipitation à l'aide d'agents chaotropiques comme les sels, en particulier le sulfate d'ammonium, l'éthanol, l'acétone ou l'acide trichloroacétique, l'extraction à l'acide; la chromatographie échangeuse d'ions; la chromatographie par phosphocellulose; la chromatographie par interaction hydrophobe; la chromatographie d'affinité; la chromatographie hydroxylapatite ou les chromatographies d'exclusion.

On entend par "milieu de culture", le milieu dans lequel on purifie le polypeptide de l'invention. Ce milieu peut être constitué par le milieu extracellulaire et/ou le lysat cellulaire. Des techniques biens connues de

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l'homme du métier permettent également à ce dernier de redonner la conformation active au polypeptide, si la conformation dudit polypeptide a été altérée lors de l'isolation ou de la purification.

Anticorps
La présente invention a aussi pour objet un procédé d'obtention d'un anticorps immunospécifique.

On entend par "anticorps", les anticorps monoclonaux, polyclonaux, chimériques, simple chaîne, humanisés ainsi que les fragments Fab, incluant les produits d'un Fab ou d'une banque d'expression d'immunoglobulines.

Un anticorps immunospécifique peut être obtenu par immunisation d'un animal avec un polypeptide conforme à l'invention.

L'invention concerne aussi un anticorps immunospécifique pour un polypeptide conforme à l'invention, tel que défini précédemment.

Un polypeptide selon l'invention, un de ses fragments, un analogue, un de ses variants ou une cellule exprimant ce polypeptide peuvent aussi être utilisés pour produire des anticorps immunospécifiques.

Le terme "immunospécifique" signifie que l'anticorps possède une meilleure affinité pour le polypeptide de l'invention que pour d'autres polypeptides connus de l'art antérieur.

Les anticorps immunospécifiques peuvent être obtenus par administration d'un polypeptide de l'invention, d'un de ses fragments, d'un analogue ou d'un fragment épitopique ou d'une cellule exprimant ce polynucléotide chez un mammifère, de préférence non humain, selon les méthodes bien connues de l'homme du métier.

Pour la préparation d'anticorps monoclonaux, on peut utiliser des méthodes usuelles de production d'anticorps, à partir de lignées cellulaires, telles que la technique des hybridomes (Kohler et al., Nature (1975) 256 :495- 497), la technique des triomes, la technique des hybridomes de cellules B humaines (Kozbor et al., Immunology Today (1983) 4 : 72) et la technique des

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hybridomes EBV (Cole et al., MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER
THERAPY, pp. 77-96, Alan R. Liss, 1985).

Les techniques de production d'anticorps simple-chaîne telles que décrites, par exemple, dans US N 4,946,778 peuvent être également utilisées.

Des animaux transgéniques comme les souris, par exemple, peuvent être également utilisés pour produire des anticorps humanisés.

Agents interagissant avec le polypeptide de l'invention
La présente invention a également pour objet un procédé d'identification d'un agent activateur ou inhibiteur d'un polypeptide conforme à l'invention, comprenant : a) la mise en présence de cellules hôtes, telles que définies ci-dessus avec un agent à tester, et b) la détermination de l'effet activateur, ou inhibiteur, généré par l'agent à tester.

Un polypeptide conforme à l'invention peut ainsi être employé pour un procédé de criblage de composés qui rentrent en interaction avec celui- ci.

Ces composés peuvent être des agents activateurs (agonistes) ou inhibiteurs (antagonistes) de l'activité intrinsèque d'un polypeptide selon l'invention. Ces composés peuvent également être des ligands ou des substrats d'un polypeptide de l'invention. Voir Coligan et al., Current Protocols in
Immunology 1 (2), Chapter 5 (1991).

En général, pour mettre en place un tel procédé, il est d'abord souhaitable de produire des cellules hôtes appropriées qui expriment un polypeptide conforme à l'invention. De telles cellules peuvent être, par exemple, des cellules de mammifères, de levures, d'insectes comme Drosophilia ou de bactéries comme E. coli.

Ces cellules ou des extraits de membrane de ces cellules, sont alors mises en présence des composés à tester.

On peut ainsi observer la capacité de liaison des composés à tester avec le polypeptide de l'invention, mais également l'inhibition ou l'activation de la réponse fonctionnelle.

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L'étape b) du procédé ci-dessus peut être mise en #uvre en utilisant un agent à tester marqué directement ou indirectement. Elle peut aussi comprendre un test de compétition, en utilisant un agent marqué ou non et un agent compétiteur marqué.

On peut également déterminer si un agent à tester conduit à la génération d'un signal d'activation ou d'inhibition sur des cellules exprimant le polypeptide de l'invention, en utilisant des moyens de détection appropriés, suivant le signal à détecter.

De tels agents activateurs ou inhibiteurs peuvent être des polynucléotides, et dans certains cas des oligonucléotides ou des polypeptides, comme des protéines ou des anticorps, par exemple.

La présente invention a aussi pour objet une méthode pour l'identification d'un agent activé ou inhibé par un polypeptide conforme à l'invention, comprenant : a) la mise en présence de cellules hôtes obtenues comme décrit ci-dessus avec un agent à tester, et b) la détermination de l'effet activateur ou inhibiteur, généré par ledit polypeptide sur l'agent à tester.

Un agent activé ou inhibé par le polypeptide de l'invention est un agent qui répond, respectivement, par une activation ou une inhibition en présence de ce polypeptide. Les agents activés ou inhibés, directement ou indirectement, par le polypeptide de l'invention peuvent consister en des polypeptides comme, par exemple, des récepteurs membranaires ou nucléaires, des kinases et plus préférentiellement des tyrosines kinases, des facteurs de transcription ou des polynucléotides.

Détection de maladies
La présente invention a également pour objet l'utilisation d'un polynucléotide conforme à l'invention pour donner des moyens pour effectuer un diagnostic génétique d'une maladie ou d'une résistance à une maladie liée à la présence, chez un ou plusieurs individus de la population humaine, de l'allèle

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mutant codé par le polymorphisme de type SNP fonctionnel conforme à l'invention.

La présente invention a aussi pour objet un procédé de détection de l'expression et/ou de l'activité d'un polypeptide conforme à l'invention, comprenant : a) la détection de la présence ou de l'absence d'un polynucléotide selon l'invention dans le génome du sujet, et/ou b) la détection de la présence, de l'absence et/ou d'une concentration prédéterminée d'un polypeptide selon l'invention chez un sujet.

La détection d'un polynucléotide et d'un polypeptide de l'invention peut ainsi permettre de savoir si un sujet est atteint ou risque d'être atteint ou, au contraire, présente une résistance partielle au développement d'une maladie, d'une indisposition ou d'un dérèglement tels que définis précédemment, relatifs à l'expression et/ou l'activité d'un polypeptide de l'invention.

La concentration "normale" d'un polypeptide peut être prédéterminée par l'homme du métier par des tests ou des essais conventionnels qui lui permettront d'identifier le seuil au-dessus ou en dessous duquel apparaît la sensibilité ou, au contraire, la résistance à la maladie, l'indisposition ou le dérèglement évoqué ci-dessus.

Le polynucléotide à tester peut être obtenu à partir d'échantillons biologiques du sujet à étudier, tels que des cellules, du sang, de l'urine, de la salive, ou à partir d'une biopsie ou d'une autopsie du sujet à étudier. L'ADN génomique peut être utilisé directement pour la détection ou après à une amplification par PCR, par exemple. L'ARN ou l'ADNc peuvent également être utilisés de façon similaire.

Il est ensuite possible de comparer la séquence nucléotidique d'un polynucléotide conforme à l'invention avec la séquence nucléotidique détectée dans le génome du sujet.

La comparaison des séquences nucléotidiques peut être effectuée par séquençage par des méthodes d'hybridation de l'ADN, par différence de mobilité des fragments d'ADN sur gel d'électrophorèse avec ou sans agents

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dénaturants ou par différence de températures de fusion. Voir Myers et al., Science (1985) 230:1242. De telles modifications dans la structure de la séquence nucléotidique en un point précis peuvent également être révélées par des essais de protection aux nucléases, telles que l'ARNase et la nucléase S1 ou encore par des agents chimiques de clivage. Voir Cotton et al., Proc. Nat.

Acad. Sci. USA (1985) 85:4397-4401. Des sondes oligonucléotidiques comprenant un fragment d'un polynucléotide de l'invention peuvent également être utilisées pour conduire le criblage.

De nombreuses méthodes bien connues de l'homme du métier peuvent être utilisées pour déterminer l'expression d'un polynucléotide de l'invention et pour identifier la variabilité génétique de ce polynucléotide. Voir Chee et al., Science (1996), Vol 274, pp 610-613.

La présente invention a également pour objet l'utilisation d'un polynucléotide conforme à l'invention pour effectuer un diagnostic génétique d'une maladie ou d'une résistance à une maladie liée à la présence, chez un ou plusieurs individus de la population humaine, de l'allèle mutant codé par le polymorphisme de type SNP fonctionnel conforme à l'invention.

Ces maladies peuvent être des dérèglements et/ou des maladies humaines, tels que les différents cancers comme, par exemple, les carcinomes, les mélanomes, les lymphomes, les leucémies et les cancers du foie, du cou, de la tête et des reins, les maladies cardiovasculaires, les maladies métaboliques telles que celles qui ne sont pas liées au système immunitaire comme, par exemple, l'obésité, les maladies infectieuses comme les hépatites B et C et le SIDA, les pneumonies, les colites ulcératives, les maladies du système nerveux central comme, par exemple, la maladie d'Alzheimer, la schizophrénie et la dépression, le rejet de greffe de tissus ou d'organes, la cicatrisation de blessures, l'anémie chez les patients dialysés, les allergies, l'asthme, les scléroses multiples, l'ostéoporose, le psoriasis, l'arthrite rhumatoïde, la maladie de Crohn, les maladies et les désordres auto-immuns, les désordres gastro-intestinaux ou encore les désordres liés aux traitements par chimiothérapie.

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De même, la présence, l'absence et/ou la concentration de polypeptide selon l'invention peuvent aider au diagnostic d'une maladie, une indisposition ou un dérèglement ou, au contraire, la résistance à une maladie, une indisposition ou un dérèglement chez un sujet en prélevant un échantillon dérivé de ce sujet.

L'augmentation ou la diminution de l'expression du polypeptide peut être mesurée en quantifiant le niveau d'ARN codant pour ce polypeptide, suivant les méthodes bien connues de l'homme du métier, par exemple, par
PCR, RT-PCR, protection à l'ARNase, Northern blot, et autres méthodes d'hybridation.

Il est également possible de déterminer la concentration en polypeptides de l'invention présents dans un échantillon biologique du sujet par des méthodes bien connues, par exemple, par radioimmunoessai, tests de liaisons compétitives, Western blot et tests ELISA.

Médicaments et traitements des maladies
Les polypeptides de l'invention possèdent de très intéressantes propriétés pharmacologiques. Ils sont notamment capables de se fixer sur le récepteur de l'IFNa-2 humain.

Ces propriétés justifient l'utilisation d'un polypeptide conforme à l'invention pour le traitement thérapeutique du corps humain, c'est-à-dire à titre de médicament.

C'est pourquoi la présente invention a pour objet un médicament renfermant, à titre de principe actif, un polypeptide conforme à l'invention et en particulier un polypeptide comprenant la séquence ID SEQ N 2, et plus particulièrement encore, le polypeptide de séquence ID SEQ N 2.

L'invention concerne encore l'utilisation d'un polypeptide conforme à l'invention, pour la fabrication d'un médicament destinée à la prévention ou au traitement de différents dérèglements et/ou maladies humaines, tels que les différents cancers comme, par exemple, les carcinomes, les mélanomes, les lymphomes, les leucémies et les cancers du foie, du cou, de la tête et des reins, les maladies cardiovasculaires, les maladies métaboliques telles que celles qui

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ne sont pas liées au système immunitaire comme, par exemple, l'obésité, les maladies infectieuses comme les hépatites B et C et le SIDA, les pneumonies, les colites ulcératives, les maladies du système nerveux central comme, par exemple, la maladie d'Alzheimer, la schizophrénie et la dépression, le rejet de greffe de tissus ou d'organes, la cicatrisation de blessures, l'anémie chez les patients dialysés, les allergies, l'asthme, les scléroses multiples, l'ostéoporose, le psoriasis, l'arthrite rhumatoïde, la maladie de Crohn, les maladies et les désordres auto-immuns, les désordres gastro-intestinaux ou encore les désordres liés aux traitements par chimiothérapie.

Certains des composés permettant d'obtenir le polypeptide conforme à l'invention ainsi que les composés obtenus ou identifiés par ou à partir de ce polypeptide peuvent également être utilisés pour le traitement thérapeutique du corps humain, c'est-à-dire à titre de médicament.

C'est pourquoi la présente invention a aussi pour objet un médicament contenant, à titre de principe actif un polynucléotide conforme à l'invention, un vecteur recombinant défini précédemment, une cellule hôte définie précédemment, un anticorps défini précédemment et/ou un agent activateur et/ou inhibiteur d'un polypeptide conforme à l'invention.

L'invention concerne encore l'utilisation d'un polynucléotide conforme à l'invention, d'un vecteur recombinant défini précédemment, d'une cellule hôte définie précédemment, d'un anticorps défini précédemment et/ou un agent activateur et/ou inhibiteur d'un polypeptide conforme à l'invention, pour la fabrication d'un médicament destinée à la prévention ou au traitement de différents dérèglements et/ou maladies humaines, tels que les différents cancers comme, par exemple, les carcinomes, les mélanomes, les lymphomes, les leucémies et les cancers du foie, du cou, de la tête et des reins, les maladies cardiovasculaires, les maladies métaboliques telles que celles qui ne sont pas liées au système immunitaire comme, par exemple, l'obésité, les maladies infectieuses comme les hépatites B et C et le SIDA, les pneumonies, les colites ulcératives, les maladies du système nerveux central comme, par exemple, la maladie d'Alzheimer, la schizophrénie et la dépression, le rejet de greffe de tissus ou d'organes, la cicatrisation de blessures, l'anémie chez les

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patients dialysés, les allergies, l'asthme, les scléroses multiples, l'ostéoporose, le psoriasis, l'arthrite rhumatoïde, la maladie de Crohn, les maladies et les désordres auto-immuns, les désordres gastro-intestinaux ou encore les désordres liés aux traitements par chimiothérapie.

Le dosage d'un polypeptide et des autres composés de l'invention, utiles en tant que principe actif, dépend du choix du composé, du mode d'administration, de la nature de la formulation, de la nature du sujet et du jugement du médecin.

Lorsqu'il est utilisé comme principe actif, un polypeptide conforme à l'invention est généralement administré à des doses comprises entre 1 et 100 g/kg du sujet.

L'invention a aussi pour objet une composition pharmaceutique qui renferment au moins un composé précité, tel qu'un polypeptide conforme à l'invention, un polynucléotide conforme à l'invention, un vecteur recombinant défini précédemment, une cellule hôte définie précédemment, un anticorps défini précédemment et/ou un agent activateur et/ou inhibiteur d'un polypeptide conforme à l'invention, à titre de principe actif, ainsi qu'un excipient pharmaceutiquement acceptable.

Dans ces compositions pharmaceutiques, le principe actif est avantageusement présent à des doses physiologiquement efficaces.

Ces compositions pharmaceutiques peuvent être, par exemple, solides ou liquides et se présenter sous les formes pharmaceutiques couramment utilisées en médecine humaine, comme par exemple les comprimés simples ou dragéifiés, les gélules, les granulés, les caramels, les suppositoires et de préférence les préparations injectables et les poudres pour injectables. Ces formes pharmaceutiques peuvent être préparées selon les méthodes usuelles.

Le ou les principes actifs peuvent y être incorporés à des excipients habituellement employés dans ces compositions pharmaceutiques, tels que le talc, la gomme arabique, le lactose, l'amidon, le dextrose, le glycérol, l'éthanol, le stéarate de magnésium, le beurre de cacao, les véhicules aqueux ou non, les corps gras d'origine animale ou végétale, les dérivés paraffiniques,

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les glycols, les divers agents mouillants, dispersants ou émulsifiants, les conservateurs.

Le ou les principes actifs conforme à l'invention peuvent être employés seul ou en combinaison avec d'autres composés, tels que des composés thérapeutiques tels que d'autres IFNs a, voire d'autres cytokines comme l'interleukine, par exemple.

Les différentes formulations des compositions pharmaceutiques sont adaptées suivant le mode d'administration.

Les compositions pharmaceutiques peuvent être administrées par les différentes voies d'administration connues de l'homme du métier.

L'invention a également pour objet une composition de diagnostic qui renferment au moins un composé précité, tel qu'un polypeptide conforme à l'invention, un polynucléotide conforme à l'invention, un vecteur recombinant défini précédemment, une cellule hôte définie précédemment, un anticorps défini précédemment et/ou un agent activateur et/ou inhibiteur d'un polypeptide conforme à l'invention, à titre de principe actif, ainsi qu'un excipient approprié pharmaceutiquement acceptable.

Les excipients appropriés utilisés dans la composition de diagnostic sont généralement des tampons et des conservateurs.

La présente invention a également pour objet l'utilisation : a) d'une quantité thérapeutiquement efficace d'un agent activateur défini précédemment et/ou b) d'une quantité thérapeutiquement efficace d'un polypeptide selon l'invention, et/ou c) d'un polynucléotide selon l'invention, et/ou d) d'une cellule hôte du sujet à traiter, définie précédemment, pour préparer un médicament destiné à augmenter l'expression ou l'activité chez un sujet, d'un polypeptide conforme à l'invention.

Ainsi, pour traiter un sujet qui a besoin d'une augmentation de l'expression ou de l'activité d'un polypeptide de l'invention, plusieurs méthodes sont possibles.

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Il est possible d'administrer au sujet une quantité thérapeutiquement efficace d'un polypeptide de l'invention et/ou d'un agent activateur et/ou activé tels que définis précédemment, éventuellement en combinaison, avec un excipient pharmaceutiquement acceptable.

Il est également possible d'augmenter la production endogène d'un polypeptide de l'invention par administration au sujet d'un polynucléotide selon l'invention. Par exemple, ce polynucléotide peut être inséré dans un vecteur rétroviral d'expression. Un tel vecteur peut être isolé à partir de cellules ayant été infectées par un vecteur de plasmide rétroviral contenant de l'ARN codant pour le polypeptide de l'invention, de telle façon pour que les cellules transduites produisent des particules virales infectieuses contenant le gène d'intérêt. Voir Gene Therapy and other Molecular Genetic-based Therapeutic
Approaches, Chapter 20, in Human Molecular Genetics, Strachan and Read,
BIOS Scientifics Publishers Ltd (1996).

Il est également possible d'administrer au sujet des cellules hôtes lui appartenant, ces cellules hôtes ayant été prélevées et modifiées, au préalable, de façon à exprimer le polypeptide de l'invention, comme décrit précédemment.

La présente invention concerne également l'utilisation a) d'une quantité thérapeutiquement efficace d'un agent inhibiteur défini précédemment, et/ou b) d'une quantité thérapeutiquement efficace d'un anticorps immunospécifique défini précédemment, et/ou c) d'un polynucléotide permettant d'inhiber l'expression d'un polynucléotide conforme à l'invention, pour préparer un médicament destiné à diminuer l'expression ou l'activité, chez un sujet, d'un polypeptide conforme à l'invention.

Ainsi, il est possible d'administrer au sujet une quantité thérapeutiquement efficace d'un agent inhibiteur et/ou d'un anticorps tels que définis précédemment, éventuellement en combinaison, avec un excipient pharmaceutiquement acceptable.

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Il est également possible de diminuer la production endogène d'un polypeptide de l'invention par administration au sujet d'un polynucléotide complémentaire conforme à l'invention permettant d'inhiber l'expression d'un polynucléotide de l'invention.

PARTIE EXPERIMENTALE Exemple 1 : Modélisation de la protéine codée par le polynucléotide de séquence nucléotidique ID SEQ N 1 et de la protéine codée par la séquence nucléotidique du gène sauvage de référence
Dans une première étape la structure tridimensionnelle de IFNa-2 a été construite à partir de celle de l'IFNa-2 humain dont la structure est disponible dans la base de données PDB (code 1ITF) et ce en utilisant le logiciel Modeler (MSI, San Diego, CA).

Le fragment polypeptidique mature a ensuite été modifié de façon à reproduire la mutation observée.

Un millier d'étapes de minimisations moléculaires ont été conduites sur cette structure en utilisant les programmes AMBER et DISCOVER (MSI).

Deux suites de calculs de dynamiques moléculaires ont ensuite été effectuées avec le même programme et les mêmes champs de forces.

Dans chaque cas, 50000 étapes ont été calculées à 300 K, terminées par 300 étapes d'équilibration.

Le résultat de cette modélisation est visualisé sur la Figure 1.

Exemple 2: Génotypage du polymorphisme de type SNP conforme à l'invention dans unepopulation d'individus
Le génotypage de SNPs est basé sur le principe du miniséquençage dont le produit est détecté par une lecture de fluorescence polarisée. La technique consiste en un miniséquençage fluorescent (Technologie FP-TDI ou Fluorescence Polarization Template-direct Dyeterminator Incorporation).

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Le miniséquençage consiste à allonger un oligonucléotide amorce, placé juste en amont du site polymorphe, par des didéoxynucléotides fluoromarqués à l'aide d'une enzyme polymérase. Le résultat de cet allongement est directement analysé par une lecture de fluorescence polarisée.

A) Protocole
Le miniséquençage est réalisé sur un produit obtenu après amplification par PCR à partir de l'ADN génomique de chaque individu de la population d'individus d'un fragment de séquence nucléotidique du IFNa-2.

Ce produit PCR est choisi pour couvrir la région génique contenant le polymorphisme de type SNP de l'invention. Ensuite, on élimine les amorces de PCR et les dNTPs non incorporés avant de réaliser le miniséquençage. Toutes ces étapes, ainsi que la lecture, sont réalisées dans la même plaque.

Le génotypage requiert donc 5 étapes :
1) Amplification par PCR
2) Purification du produit de PCR par digestion enzymatique
3) Elongation de l'oligonucléotide amorce
4) Lecture
5) Interprétation de la lecture
1) L'amplification PCR de la séquence nucléotidique du gène
IFNa-2 qui couvre la région génique contenant le polymorphisme de type SNP fonctionnel conforme à l'invention est effectuée pour chaque individu de la population d'individus.

La population d'individus est composée d'ADNs génomiques fournis par l'Institut Coriell aux Etats-Unis.

Les 239 individus se répartissent comme suit :

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<tb>
<tb> POPULATION <SEP> DESCRIPTION <SEP> NOMBRE <SEP> D'INDIVIDUS
<tb> 1 <SEP> Afro <SEP> Américain <SEP> 50
<tb> 2 <SEP> Amérindien <SEP> du <SEP> Sud <SEP> Ouest <SEP> 5
<tb> 3 <SEP> Sud <SEP> Américain <SEP> (Andes) <SEP> 10
<tb> 4 <SEP> Caribéen <SEP> 10
<tb> 5 <SEP> Caucasien <SEP> 50
<tb> 6 <SEP> Chinois <SEP> 10
<tb> 7 <SEP> Grec <SEP> 8 <SEP>
<tb> 8 <SEP> Ibérien <SEP> 10
<tb> 9 <SEP> Italien <SEP> 10
<tb> 10 <SEP> Japonais <SEP> 10
<tb> 11 <SEP> Mexicain <SEP> 10
<tb> 12 <SEP> Moyen-Orient <SEP> 20
<tb> 13 <SEP> Individus <SEP> du <SEP> Pacifique <SEP> 7
<tb> 14 <SEP> Indo-Pakistanais <SEP> 9
<tb> 15 <SEP> Sud <SEP> Américain <SEP> 10
<tb> 16 <SEP> Asie <SEP> du <SEP> Sud <SEP> 10
<tb>

L'amplification PCR est réalisée à partir d'amorces que l'homme du métier peut facilement déterminer à l'aide de la séquence nucléotidique ID SEQ N 1.

Les amorces sont les suivantes : ID SEQ N 4 et ID SEQ N 5
Ces séquences nucléotidiques permettent d'amplifier un fragment d'une longueur de 655 nucléotides, du nucléotide 470 au nucléotide 1124 de la séquence nucléotidique ID SEQ N 1.

Les amplifiats PCR serviront de matrice pour la réaction de miniséquençage.

Le volume réactionnel est de 5 l par échantillon comme décrit dans le tableau suivant :

<Desc/Clms Page number 32>

<tb>
<tb> Fournisseur <SEP> Référence <SEP> Réactif <SEP> Conc. <SEP> Vol. <SEP> par <SEP> Cône.
<tb>

Initiale <SEP> tube <SEP> ( <SEP> NI) <SEP> finale
<tb> Life <SEP> Technologie <SEP> Livré <SEP> avec <SEP> Taq <SEP> Tampon <SEP> (X) <SEP> 10 <SEP> 0,5 <SEP> 1
<tb> Life <SEP> Technologie <SEP> Livré <SEP> avec <SEP> Taq <SEP> MgS04 <SEP> (mM) <SEP> 50 <SEP> 0,2 <SEP> 2
<tb> AP <SEP> Biotech <SEP> 27-2035-03 <SEP> dNTPs <SEP> (mM) <SEP> 10 <SEP> 0,1 <SEP> 0,2 <SEP>
<tb> Sur <SEP> demande <SEP> Amorce <SEP> F <SEP> ( <SEP> pM) <SEP> 10 <SEP> 0,1 <SEP> 0,2
<tb> ID <SEP> SEQ <SEP> N <SEP> 4
<tb> Sur <SEP> demande <SEP> AmorceR <SEP> ( M) <SEP> 10 <SEP> 0,1 <SEP> 0,2
<tb> ID <SEP> SEQ <SEP> N <SEP> 5
<tb> Life <SEP> Technologie <SEP> 11304-029 <SEP> Taq <SEP> platinium <SEP> 5U/ <SEP> l <SEP> 0,02 <SEP> 0,1 <SEP> U/
<tb> réaction
<tb> H20 <SEP> Qsp <SEP> 5 <SEP> l <SEP> 1,98
<tb> ADN <SEP> 2,5 <SEP> ng/ <SEP> l <SEP> 2 <SEP> 5 <SEP> ng/
<tb> réaction
<tb> Volume <SEP> total <SEP> 5 <SEP> l
<tb>

Ces réactifs sont distribués dans une plaque PCR noire à 384 puits fournie par ABGene (ref :TF-0384-k). Une fois remplie, la plaque est scellée, centrifugée puis placée dans un thermocycleur pour plaque 384 (Tetrad de MJ Research) et subit l'incubation suivante : Cycles de PCR : min à 94 C, suivi de 36 cycles composés de 3 étapes (15 sec. à 94 C, 30 sec. à 56 C, 1 min. à 68 C).

2) La PCR est ensuite purifiée à l'aide de deux enzymes que sont la phosphatase alcaline de crevette (ou Shrimp Alkaline Phosphatase SAP) et l'exonucléase I (Exo 1). La première de ces enzymes permet la déphosphorylation des dNTPs non incorporés au cours de la PCR, tandis que la seconde élimine les résidus simple brin d'ADN et donc les amorces non utilisées au cours de la PCR. Cette digestion se fait par addition dans la plaque de PCR d'un mélange réactionnel de 5 l par échantillon préparé comme décrit dans le tableau suivant :

<Desc/Clms Page number 33>

<tb>
<tb> Fournisseur <SEP> Référence <SEP> Réactif <SEP> Conc. <SEP> Vol. <SEP> par <SEP> Conc.
<tb> initiale <SEP> tube <SEP> ( <SEP> l) <SEP> finale
<tb> AP <SEP> Biotech <SEP> E70092X <SEP> SAP <SEP> <SEP> U/ <SEP> l <SEP> 0,5 <SEP> 0,5/
<tb> réaction
<tb> AP <SEP> Biotech <SEP> 070073Z <SEP> Exo <SEP> 10 <SEP> U/ <SEP> l <SEP> 0,1 <SEP> 1/
<tb> réaction
<tb> AP <SEP> Biotech <SEP> Fourni <SEP> Tampon <SEP> 10 <SEP> 0,5 <SEP> 1
<tb> avec <SEP> SAP <SEP> SAP <SEP> (X)
<tb> H20 <SEP> Qsp <SEP> 5 <SEP> pl <SEP> 3,9
<tb> PCR <SEP> 5 <SEP> l
<tb> Vol <SEP> total <SEP> 10 <SEP> l
<tb>

Une fois remplie, la plaque est scellée, centrifugée puis placée dans un thermocycleur pour plaque 384 puits (Tetrad de MJ Research) et subit l'incubation suivante : Digestion SAP-EXO :45 min à 37 C, 15 min à 80 C.

3) L'étape d'élongation ou de miniséquençage est ensuite réalisée sur ce produit de PCR digéré, par addition d'un mélange réactionnel de 5 !-IL par échantillon préparé comme indiqué dans le tableau suivant :

<Desc/Clms Page number 34>

<tb>
<tb> Fournisseur <SEP> Référence <SEP> Réactif <SEP> Initiale <SEP> tube <SEP> Cône.
<tb>

Initiale <SEP> tube <SEP> finale
<tb> Propre <SEP> Tampon <SEP> Elongation' <SEP> 5 <SEP> 1 <SEP> 1
<tb> préparation <SEP> (X)
<tb> Life <SEP> Amorce <SEP> Miniseq <SEP> 0,5
<tb> Technologies <SEP> Sur <SEP> demande <SEP> ( M) <SEP> 10 <SEP> 0,5
<tb> Technologies <SEP> A <SEP> ou <SEP> B <SEP>
<tb> AP <SEP> Biotech <SEP> 27-2051 <SEP> ddNTPs2 <SEP> ( M) <SEP> 2,5 <SEP> 025 <SEP> 0,125
<tb> Biotech <SEP> (61,71,81)-01 <SEP> 2 <SEP> non <SEP> marques <SEP> de <SEP> chaque <SEP> de <SEP> chaque
<tb> @ <SEP> ddNTPs <SEP> ( <SEP> M) <SEP> @
<tb> NEN <SEP> Ne! <SEP> 472/5 <SEP> ddNTPs2 <SEP> ( M) <SEP> 2,5 <SEP> 0,25 <SEP> 0,125
<tb> et <SEP> Ne! <SEP> 492/5 <SEP> 2 <SEP> marqués <SEP> de <SEP> chaque <SEP> de <SEP> chaque
<tb> AP <SEP> Biotech <SEP> E79000Z <SEP> Thermo-sequenase <SEP> 3,2 <SEP> U/ <SEP> l <SEP> 0,125 <SEP> réaction
<tb> H20 <SEP> Qsp <SEP> 5 <SEP> l <SEP> 3,125
<tb> PCR <SEP> digérée <SEP> 10 <SEP> l
<tb> Vol <SEP> total <SEP> 15 <SEP> l
<tb>
1 Le tampon élongation : Le tampon élongation 5X est composé de Tris-HCI pH 9 à 250 mM, de
KCI à 250 mM, de NaCI à 25 mM, de MgCI2 à 10 mM et de glycérol à 40 % 2 ddNTPs :Pour les ddNTPs, un mélange des 4 bases est réalisé en fonction du polymorphisme étudié. Seulement les 2 bases d'intérêts (G/ A) composant le polymorphisme de type SNP fonctionnel portent un marquage, soit en Tamra, soit en R110. Le mélange de ddNTPs est composé de - 2,5 M de ddCTP non marqué, - 2,5 M de ddTTP non marqué, - 2,5 pM de ddGTP (1,825 pM de ddGTP non marqué et 0,625 M de ddGTP marqué au
Tamra), - 2,5 M de ddATP (1,825 M de ddATP non marqué et 0,625 M de ddATP marqué au R110)
Une fois remplie, la plaque est scellée, centrifugée puis placée dans un thermocycleur pour plaque 384 puits (Tetrad de MJ Research) et subit l'incubation suivante : Cycles d'élongation : 1 min. à 93 C, suivi de 35 cycles composés de 2 étapes (10 sec. à 93 C, 30 sec. à 55 C).

Après la dernière étape dans le thermocycleur, la plaque est directement placée sur un lecteur de fluorescence polarisée de type Analyst HT de LJL Biosystems Inc.. La plaque est lue à l'aide du logiciel Criterion Host en utilisant deux méthodes. La première permet de lire la base marquée en Tamra en utilisant les filtres d'excitation et d'émission spécifiques

<Desc/Clms Page number 35>

de ce fluorophore (excitation 550-10 nm, émission 580-10 nm) et la seconde permet de lire la base marquée en R110 en utilisant les filtres d'excitation et d'émission spécifiques de ce fluorophore (excitation 490-10 nm, émission 520- 10 nm). Dans les deux cas, un miroir double dichroïque (R110/Tamra) est utilisé et les autres paramètres de lecture sont : Z-height : 1,5 mm Attenuator : out Temps d'intégration : 100,000 usée.

Raw data units : counts/sec Switch polarization : by well Plate settling time : 0 msec PMT setup : Read (+), sensitivity 2 Dynamic polarizer : emission Static polarizer : S
Un fichier résultat est alors obtenu contenant les valeurs calculées de mP pour le filtre Tamra et celle pour le filtre R110. Ces valeurs de mP sont calculées à partir des valeurs d'intensité obtenues sur le plan parallèle(//) et sur le plan perpendiculaire (#) d'après la formule suivante : mP = 1000(# - g#)/(# + g#).

Dans ce calcul, la valeur sur le filtre # est pondérée d'un facteur g.

Celui-ci est un paramètre machine qui doit être déterminé préalablement expérimentalement.

4) et 5) Interprétation de la lecture et détermination des génotypes.

Les valeurs de mP sont reportées sur un graphe à l'aide du logiciel Excel de Microsoft Inc., et/ou du logiciel Allele Caller développé par LJL Biosystems Inc.

En abscisse est indiquée la valeur de mP de la base marquée au Tamra, en ordonnée est indiquée la valeur de mP de la base marquée au R110. Une forte valeur de mP indique que la base marquée avec ce fluorophore est incorporée et, inversement, une faible valeur de mP révèle l'absence

<Desc/Clms Page number 36>

d'incorporation de cette base.

On obtient jusqu'à trois groupes homogènes de séquences nucléotidiques ayant des génotypes différents, comme indiqué dans la Figure 2.

L'utilisation du logiciel Allele Caller permet, une fois le repérage des différents groupes réalisé, d'extraire directement le génotype défini pour chaque individu sous forme d'un tableau.

Les séquences des deux amorces de miniséquençage nécessaires pour le génotypage ont été déterminées. Ces amorces sont sélectionnées pour correspondre à une vingtaine voire une trentaine de , nucléotides placés juste en amont du site polymorphe. Du fait que le produit de
PCR contenant un SNP est un produit d'ADN double brin, le génotypage peut donc se faire soit sur le brin sens soit sur le brin antisens. Les amorces sélectionnées sont fabriquées par Life Technologies Inc.

Les amorces du miniséquençage sont les suivantes :
Amorce sens : (A) : gttgtcagagcagaaatcat
Amorce antisens : (B) : gttgacaaagaaaaagatct
Le miniséquençage du polymorphisme de type SNP g1023a a d'abord été validé sur 16 échantillons, puis génotype sur l'ensemble de la population d'individus composée de 239 individus et 7 blancs.

Conditions de miniséquençage testées :
Condition N 1 :
Amorce sens + ddGTP-R110 + ddATP-Tamra
Condition N 2 :
Amorce sens + ddATP-R110 + ddGTP-Tamra
Condition N 3 :
Amorce antisens + ddCTP-R110 + ddTTP-Tamra
Condition N 4 :
Amorce antisens + ddTTP-R110 + ddCTP-Tamra
Ces 4 conditions ont été testées et la condition N 2 a été retenue pour le génotypage.

<Desc/Clms Page number 37>

B) Résultats
Après la réalisation complète du processus de génotypage, la détermination des génotypes des individus de la population d'individus pour la SNP fonctionnel étudié ici a été réalisée à l'aide du graphe représenté sur la Figure 2.

Ce génotype est en théorie soit homozygote GG, soit hétérozygote GA, soit homozygote AA chez les individus testés. En réalité et comme montré ci-dessous, le génotype homozygote AA n'est pas détecté dans la population d'individus.

Les résultats des contrôles, de la répartition des génotypes déterminés dans la population d'individus et le calcul des différentes fréquences alléliques pour ce polymorphisme de type SNP fonctionnel sont présentés dans les tableaux suivants :

<tb>
<tb> Nombre <SEP> d'individus <SEP> Nombre <SEP> de <SEP> blanc <SEP> Pourcentage <SEP> de
<tb> testés <SEP> génotypes <SEP> testés <SEP> validés <SEP> réussite
<tb> 239 <SEP> 238 <SEP> 7 <SEP> 7 <SEP> 99,6
<tb>

<Desc/Clms Page number 38>

38

<tb> POPULATION <SEP> Fréquence <SEP> allélique <SEP> Génotype <SEP> AA <SEP> Génotype <SEP> AG <SEP> Génotype <SEP> GG
<tb> N <SEP> % <SEP> % <SEP> 95 <SEP> % <SEP> IC <SEP> N <SEP> % <SEP> N <SEP> % <SEP> N <SEP> %
<tb> Afro <SEP> Américain <SEP> 50 <SEP> 20,9 <SEP> 0 <SEP> - <SEP> - <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 50 <SEP> 100
<tb> Amérindien <SEP> du <SEP> Sud <SEP> Ouest <SEP> 5 <SEP> 2,1 <SEP> 0 <SEP> - <SEP> - <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 5 <SEP> 100 <SEP>
<tb> Sud <SEP> Américain <SEP> (Andes) <SEP> 10 <SEP> 4,2 <SEP> 5,0 <SEP> - <SEP> - <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 9 <SEP> 100
<tb> Caribéen <SEP> 10 <SEP> 4,2 <SEP> 0 <SEP> 0,0 <SEP> 14,6 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 1 <SEP> 10,0 <SEP> 9 <SEP> 90
<tb> Caucasien <SEP> 50 <SEP> 20,9 <SEP> 0 <SEP> - <SEP> - <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 50 <SEP> 100
<tb> Chinois <SEP> 10 <SEP> 4,2 <SEP> 0 <SEP> - <SEP> - <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 10 <SEP> 100
<tb> Grec <SEP> 8 <SEP> 3,3 <SEP> 0 <SEP> - <SEP> - <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 9 <SEP> 100 <SEP>
<tb> Ibérien <SEP> 10 <SEP> 4,2 <SEP> 0 <SEP> - <SEP> - <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 10 <SEP> 100
<tb> Italien <SEP> 10 <SEP> 4,2 <SEP> 0 <SEP> - <SEP> - <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 10 <SEP> 100
<tb> Japonais <SEP> 10 <SEP> 4,2 <SEP> 0 <SEP> - <SEP> - <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 10 <SEP> 100
<tb> Mexicain <SEP> 10 <SEP> 4,2 <SEP> 0 <SEP> - <SEP> - <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 10 <SEP> 100
<tb> Moyen-Orient <SEP> 20 <SEP> 8,4 <SEP> 0 <SEP> - <SEP> - <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 20 <SEP> 100
<tb> Individus <SEP> du <SEP> Pacifique <SEP> 7 <SEP> 2,9 <SEP> 0 <SEP> - <SEP> - <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 7 <SEP> 100 <SEP>
<tb> Indo-Pakistanais <SEP> 9 <SEP> 3,8 <SEP> 0 <SEP> - <SEP> - <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 9 <SEP> 100 <SEP>
<tb> Sud <SEP> Américain <SEP> 10 <SEP> 4, <SEP> 2 <SEP> 0 <SEP> - <SEP> - <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 10 <SEP> 100
<tb> Asie <SEP> du <SEP> Sud <SEP> 10 <SEP> 4,2 <SEP> 0 <SEP> - <SEP> - <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 10 <SEP> 100
<tb> Total <SEP> 239 <SEP> 100 <SEP> % <SEP> 0,210 <SEP> 0,0 <SEP> 0,6 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 1 <SEP> 0,4 <SEP> 238 <SEP> 99,6
<tb>

<Desc/Clms Page number 39>

Dans le tableau ci-dessus,
N représente le nombre d'individus, % représente le pourcentage d'individus dans la sous-population spécifique, la fréquence allélique représente le pourcentage de l'allèle muté dans la sous- population spécifique,
95 % IC représente l'intervalle minimal et maximal de confiance à 95 %.

En examinant ces résultats par population, on constate que le seul individu hétérozygote est issu de la sous-population caribéenne de la population d'individus.

Exemple 3: Etude de la fonction biologique de IFNa-2 mutant M171 # comparée à celle de l'IFNa-2 sauvage 1) Clonage des IFNs a-2 sauvage et muté (M1711) dans le vecteur d'expression procaryote pTrc/His-topo:
La séquence nucléotidique codant pour l'IFNa-2 sauvage ou muté est amplifiée par PCR, comme il est mentionné dans le génotypage de l'exemple 2.

Ces produits PCR sont insérés dans le vecteur d'expression procaryote pTrc/His-Topo sous le contrôle du promoteur hybride Trc inductible par l'IPTG (Iso-Propyl-Thio-Galactoside) par TOPOTM-cloning (Invitrogen Corp. ).

Ce vecteur permet l'expression hétérologue de protéines eucaryotes dans la bactérie grâce à la présence d'une unité mini-cistronique.

La protéine sauvage et la protéine mutée sont produites sous forme de protéines de fusion portant une extension en N-terminal constituée d'une queue 6-histidines et de l'épitope pour un anticorps spécifique.

Il est possible de cliver cette région additionnelle en utilisant l'endoprotéase Entérokinase.

Après vérification de la séquence nucléotidique de la région du vecteur codant pour les protéines recombinantes, la souche d'E.co// Top 10 (Invitrogen) est transformée avec ces vecteurs d'expression recombinants.

<Desc/Clms Page number 40>

2) Expression hétérologue chez E. Coli et purification des protéines de fusion IFNa-2 sauvage et mutée M1711 poly-histidine :
Deux pré-cultures saturantes de 100 ml de milieu LBA (Luria
Bertoni + ampicilline 100 g/ml), contenant respectivement un clone codant pour l'IFNa-2 sauvage et pour l'IFNa-2 M1711, ont été réalisées pendant une nuit à 37 C à une agitation de 200 rpm puis ont été utilisées pour ensemencer au 1/10 900 ml de milieu LBA (pré-incubé la nuit à 37 C).

Lorsque cette seconde culture atteint une densité cellulaire .correspondant à une densité optique D.Osoonm de 0,8, l'expression de la protéine poly-histidine est induite par l'ajout d'IPTG à une concentration finale de 1 mM et est maintenue pendant 5 heures à 30 C avec une agitation de la culture à 200 rpm.

Le culot de bactéries obtenu après centrifugation à 4000 x g,
30 min, 4 C, est resuspendu dans 25 ml de tampon A (Tris 50 mM, pH 8, NaCI
50 mM, imidazole 10 mM, PMSF 0,1 mM pH 8).

Une pré-incubation de 30 min dans la glace en présence de 0,5 mg/ml de lysozyme et de 20 unités de DNAse 1 précède une sonication réalisée en trois étapes avec contrôle de la température de l'échantillon (une étape a délivré 240 Watt par impulsion de 10 sec avec 10 sec d'arrêt et ce pendant 1 min). La suspension cellulaire est ensuite clarifiée par centrifugation à 15000 x g pendant 30 minutes, à 4 C.

Le surnageant de centrifugation est ensuite filtré sur 0,22 micromètre.

Les protéines poly-histidines présentes sont alors purifiées par
HPLC sur résine HiTrapTM Nickel Affinity (Amersham Pharmacia Biotech) préalablement équilibrée en 50 mM Tris, 300 mM NaCI pH 8,0 (Tampon B).

Après avoir lavé abondamment la colonne avec 1 M NaCI dans 50 mM Tris pH
8,0, l'élution des protéines a été induite par un gradient linéaire d'imidazole entre des concentrations de 0,01-0,25 M dans le tampon B.

La présence de la protéine poly-histidine dans les fractions collectées est vérifiée d'une part par électrophorèse de type SDS PAGE et

<Desc/Clms Page number 41>

d'autre part par immuno-détection à l'aide d'un anticorps spécifique dirigé contre l'extrémité N-terminale de la protéine de fusion.

A ce stade, la protéine d'intérêt est pure à hauteur de 80%.

La dernière étape de la purification consiste en une séparation des protéines sur colonne de chromatographie d'échange d'ions.

Les fractions contenant la protéine de fusion sont injectées sur une colonne échangeuse d'anions (MiniQ PE 4,6/50, Pharmacia) préalablement équilibrée en tampon Tris 50 mM pH 8. L'élution des protéines est réalisée par le passage d'un gradient de NaCI entre 0 et 500 mM dans le tampon Tris 50 mM pH 8.

La pureté de la protéine d'intérêt est estimée sur gel SDS/PAGE et les concentrations en protéine ont été mesurées par dosage BCA (acide bicinchoninique et sulfate de cuivre, Sigma).

Les protéines IFNa-2 sauvage et mutée purifiées contenant l'extrémité poly-histidine en N-terminal sont utilisées lors des tests fonctionnels qui consistent en une mesure de l'activité anti-proliférative de ces deux formes de l'IFNa-2 sur la croissance de la lignée cellulaire de type Daudi.

3. Evaluation de la capacité de l'IFNa-2 sauvage et muté M1711 à induire l'anti-prolifération des cellules de lymphoblastes humains de la lignée cellulaire Daudi Burkitt's
Ces tests sont effectués sur deux types d'IFNs a-2 différents à savoir: l'IFNa-2 non muté et l'IFNa-2 M1711. Des cellules (lymphoblastes humains de la lignée cellulaire Daudi Burkitt's) préalablement cultivées dans du milieu RPMI 1640 (supplémenté avec 10% de Sérum de Veau Foetal et 2 mM de L-Glutamine) sont ensemencées en plaque 96 puits à la densité cellulaire de 4 104 cellules/ puits.

Pour chacun des IFNs, des concentrations finales de 0,003 pM à 600 nM sont testées.

Huit cultures et donc mesures différentes sont faites en parallèle pour les deux protéines et ceci pour chaque concentration.

Les cellules Daudi sont ensuite cultivées pendant 66 heures à

<Desc/Clms Page number 42>

37 C sous 5% CO2
Après les 66 heures de croissance, l'effet anti-prolifératif de chaque IFNa-2 est estimé par le nombre de cellules vivantes présentant encore une activité des déshydrogénases mitochondriales. L'activité de ces déshydrogénases peut être détectée en présence de 12 mM de MTT (incubé 4 heures à 37 C), par le suivi de la densité optique à 550 nm correspondant à la formation de cristaux de formazan issus du clivage du sel de tétrazolium MTT.

L'activité d'anti-prolifération de l'IFNa-2 sauvage ou mutée M1711 est basée sur les mesures de l'IC 50, correspondant à la concentration en IFN[alpha]-2 inhibant 50 % la croissance cellulaire.

Les résultats obtenus sont illustrés sur la Figure 3.

Les points de mesure pour chaque concentration de protéine sauvage et mutée (M1711) représentés sur le graphe sont la moyenne pour chaque des quatre mesures prises sur les quatre cultures faites en parallèle pour chacune des protéines et des concentrations.

Ce test permet d'observer que l'activité anti-proliférative cellulaire est fortement inhibée dans le cas de l'IFNa-2 muté M1711 par rapport à l'IFNa-2 sauvage.

Claims (31)

REVENDICATIONS

1. Polynucléotide isolé comprenant : a) une séquence nucléotidique ayant au moins 80 % d'identité avec la séquence nucléotidique ID SEQ N 1 et ayant la même, ou pratiquement la même fonctionnalité que la séquence nucléotidique ID SEQ N 1, b) une séquence nucléotidique ayant au moins 80 % d'identité avec la séquence nucléotidique codante de la séquence nucléotidique ID SEQ N 1 et ayant la même, ou pratiquement la même fonctionnalité que la séquence nucléotidique ID SEQ N 1, ou c) une séquence nucléotidique complémentaire à la séquence nucléotidique sous a) ou sous b).

2. Polynucléotide isolé comprenant : a) une séquence nucléotidique ayant au moins 80 % d'identité avec la séquence nucléotidique ID SEQ N 1 et comportant la séquence nucléotidique ID SEQ

N 3, b) une séquence nucléotidique ayant au moins 80 % d'identité avec la séquence nucléotidique codante de la séquence nucléotidique ID SEQ N 1 et comportant la séquence nucléotidique ID SEQ N 3, ou c) une séquence nucléotidique complémentaire à la séquence nucléotidique sous a) ou sous b).

3. Polynucléotide isolé, comprenant : a) la séquence nucléotidique ID SEQ N 1, b) la séquence nucléotidique codante de la séquence nucléotidique ID SEQ N 1, ou c) la séquence nucléotidique complémentaire à la séquence nucléotidique sous a) ou b).

4. Polynucléotide selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'il consiste en la séquence nucléotidique ID SEQ N 1 ou sa séquence codante.

5. Polynucléotide selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce qu'il code pour un polypeptide comprenant :

<Desc/Clms Page number 44>

24 et 188 de la séquence d'acides aminés ID SEQ N 2.

a) la séquence d'acides aminés ID SEQ N 2, ou b) la séquence d'acides aminés comprenant les acides aminés compris entre

6. Polynucléotide selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce qu'il comprend une molécule d'ADN ou d'ARN.

7 Utilisation de tout ou partie d'un polynucléotide selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, pour identifier, hybrider et/ou amplifier tout ou partie d'un polynucléotide comportant le polymorphisme de type SNP g1023a du gène IFNa-2

8. Utilisation de tout ou partie d'un polynucléotide selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, comme outil de génotypage.

9. Procédé de détermination de la fréquence du polymorphisme de type SNP d'un polynucléotide selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, dans lequel on procède à un génotypage chez un individu ou dans une population d'individus.

10. Procédé de détermination selon la revendication 9, dans lequel le génotypage est effectué par miniséquençage.

11. Procédé de détermination selon la revendication 10, dans lequel le miniséquençage est réalisé avec les amorces sens et antisens correspondant respectivement aux séquences nucléotidique ID SEQ N 4 et ID SEQ N 5.

12. Utilisation d'un polynucléotide selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, pour la recherche d'une variation de séquence dans la séquence nucléotidique du gène IFNa-2 chez un individu.

13. Vecteur recombinant comprenant un polynucléotide selon l'une quelconque des revendications 1 à 6.

14. Cellule hôte comprenant un vecteur recombinant selon la revendication 13.

15. Procédé de préparation d'un polypeptide, caractérisé en ce qu'une cellule hôte selon la revendication 14 est cultivée et ledit polypeptide est isolé du milieu de culture.

16. Polypeptide isolé comprenant :

<Desc/Clms Page number 45>

a) une séquence d'acides aminés ayant au moins 80 % d'identité avec la séquence d'acides aminés ID SEQ N 2 et ayant la même ou pratiquement la même fonctionnalité que la séquence d'acides aminés ID SEQ N 2, ou b) une séquence d'acides aminés ayant au moins 80 % d'identité avec la séquence d'acides aminés comportant les acides aminés compris entre 24 et 188 de la séquence d'acides aminés ID SEQ N 2 et ayant la même ou pratiquement la même fonctionnalité que la séquence d'acides aminés ID SEQ N 2.

17. Polypeptide iselé caractérisé en ce qu'il comprend la séquence d'acides aminés ID SEQ N 2, ou la séquence d'acides aminés comportant les acides aminés compris entre 24 et 188 de la séquence d'acides aminés ID SEQ N 2.

18. Polypeptide selon la revendication 17, caractérisé en ce qu'il consiste en la séquence d'acides aminés ID SEQ N 2 ou la séquence d'acides aminés comportant les acides aminés compris entre 24 et 188 de la séquence d'acides aminés ID SEQ N 2.

19. Procédé d'obtention d'un anticorps immunospécifique, caractérisé en ce qu'il est obtenu par immunisation d'un animal avec un polypeptide selon l'une quelconque des revendications 16 à 18.

20. Anticorps immunospécifique pour un polypeptide selon l'une quelconque des revendications 16 à 18.

21. Procédé d'identification d'un agent activateur ou inhibiteur d'un polypeptide selon l'une quelconque des revendications 16 à 18, comprenant : a) la mise en présence de cellules hôtes selon la revendication 14 avec un agent à tester, et b) la détermination de l'effet activateur ou inhibiteur généré par l'agent à tester.

22. Méthode pour l'identification d'un agent activé ou inhibé par un polypeptide selon l'une quelconque des revendications 16 à 18, comprenant : a) la mise en présence de cellules hôtes selon la revendication 14 avec un agent à tester, et b) la détermination de l'effet activateur ou inhibiteur généré par un polypeptide sur l'agent à tester.

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23. Procédé de détection de l'expression et/ou de l'activité d'un polypeptide selon l'une quelconque des revendications 16 à 18, comprenant : a) la détection de la présence ou de l'absence d'un polynucléotide selon l'une quelconque des revendications 1 à 6 dans le génome du sujet, et/ou b) la détection de la présence, de l'absence et/ou d'une concentration prédéterminée d'un polypeptide selon l'une quelconque des revendications 16 à 18, dans un échantillon biologique du sujet.

24. Médicament comprenant à titre de principe actif au moins un polypeptide selon l'une quelconque des revendications 16 à 18.

25. Utilisation d'un polypeptide selon l'une quelconque des revendications 16 à 18, pour la préparation d'un médicament destiné à la prévention ou le traitement de l'une des maladies choisies dans le groupe constitué par les cancers comme, par exemple, les carcinomes, les mélanomes, les lymphomes, les leucémies et les cancers du foie, du cou, de la tête et des reins, les maladies cardiovasculaires, les maladies métaboliques telles que celles qui ne sont pas liées au système immunitaire comme, par exemple, l'obésité, les maladies infectieuses comme les hépatites B et C et le SIDA, les pneumonies, les colites ulcératives, les maladies du système nerveux central comme, par exemple, la maladie d'Alzheimer, la schizophrénie et la dépression, le rejet de greffe de tissus ou d'organes, la cicatrisation de blessures, l'anémie chez les patients dialysés, les allergies, l'asthme, les scléroses multiples, l'ostéoporose, le psoriasis, l'arthrite rhumatoïde, la maladie de Crohn, les maladies et les désordres auto-immuns, les désordres gastrointestinaux et les désordres liés aux traitements par chimiothérapie.

26. Médicament comprenant à titre de principe actif au moins un polynucléotide selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, un vecteur recombinant selon la revendication 13, une cellule hôte selon la revendication 14 et/ou un anticorps selon la revendication 20.

27. Utilisation d'un polynucléotide selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, d'un vecteur recombinant selon la revendication 13, d'une cellule hôte selon la revendication 14 et/ou d'un anticorps selon la revendication 20, pour la préparation d'un médicament destiné à la prévention ou le

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traitement de l'une des maladies choisies dans le groupe constitué par les cancers comme, par exemple, les carcinomes, les mélanomes, les lymphomes, les leucémies et les cancers du foie, du cou, de la tête et des reins, les maladies cardiovasculaires, les maladies métaboliques telles que celles qui ne sont pas liées au système immunitaire comme, par exemple, l'obésité, les maladies infectieuses comme les hépatites B et C et le SIDA, les pneumonies, les colites ulcératives, les maladies du système nerveux central comme, par exemple, la maladie d'Alzheimer, la schizophrénie et la dépression, le rejet de greffe de tissus ou d'organes, la cicatrisation de blessures, l'anémie chez les patients dialysés, les allergies, l'asthme, les scléroses multiples, l'ostéoporose, le psoriasis, l'arthrite rhumatoïde, la maladie de Crohn, les maladies et les désordres auto-immuns, les désordres gastro-intestinaux et les désordres liés aux traitements par chimiothérapie.

28. Composition pharmaceutique renfermant à titre de principe actif au moins un polypeptide selon l'une quelconque des revendications 16 à 18, un polynucléotide selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, un vecteur recombinant selon la revendication 13, une cellule hôte selon la revendication 14 et/ou un anticorps selon la revendication 20, ainsi qu'un excipient pharmaceutiquement acceptable.

29. Composition de diagnostic renfermant à titre de principe actif au moins un polypeptide selon l'une quelconque des revendications 16 à 18, un polynucléotide selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, un vecteur recombinant selon la revendication 13, une cellule hôte selon la revendication 14 et/ou un anticorps selon la revendication 20, ainsi qu'un excipient approprié pharmaceutiquement acceptable.

30. Utilisation : a) d'une quantité thérapeutiquement efficace d'un polypeptide selon l'une quelconque des revendications 16 à 18, et/ou b) d'un polynucléotide selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, et/ou c) d'une cellule hôte selon la revendication 14, cette cellule provenant du sujet à traiter, pour préparer un médicament destiné à augmenter l'expression ou l'activité d'un

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polypeptide chez un sujet selon l'une quelconque des revendications 16 à 18.

31 Utilisation a) d'une quantité thérapeutiquement efficace d'un anticorps selon la revendication 20, et/ou b) d'un polynucléotide permettant d'inhiber l'expression d'un polynucléotide selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, pour préparer un médicament destiné à diminuer l'expression ou l'activité d'un polypeptide chez un sujet selon l'une quelconque des revendications 16 à 18.