FR2823763A1 - Nouveaux polynucleotides et polypeptides de l'interferon alpha 6 - Google Patents
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Abstract
Polynucléotide isolé comprenant :a) une séquence nucléotidique ayant au moins 80 % d'identité avec la séquence ID SEQ Ndegre 1 ou sa séquence codante, étant entendu que cette séquence nucléotidique comporte au moins l'un des polymorphismes de type SNP suivants :- t637c,- a669g,- a775g,- g918a; oub) une séquence nucléotidique complémentaire à une séquence nucléotidique sous a).
Description
un polypoptide selon l'une des revendications 14 à 18.
La présente invention concerne de nouveaux polynucléotides comportant des polymorphismes de type SNP dans la séquence nucléotidique du gène IFNa-6 ainsi que de nouveaux polypeptides codés par ces
polynucléotides et leurs utilisations thérapeutiques.
ART ANTERIEUR
Le gène interféron alpha 6 (IFNa-6) est décrit dans les publications suivantes: - "The evolution of the type I intefferon gene family in mammals"; Hughues
Al.; J. Mol. Evol.;1995 Nov; 41(5): 539-48.
- "Structural relationship of human intefferon alpha genes and
pseudogenes"; Henco K. et al.; J. mol. Biol.; 1985 Sep 20; 185(2):227-60.
PMID: 4057246.
Ce gène est accessible sous le numéro d'accès X02958 dans la
base de données GenBank.
Les interférons alpha humains (I FNa) sont con nus pour leurs effets antiprolifératifs cellulaires et leurs implications dans les réponses anti
virales et anti-parasitaires.
Les IFNa sont aussi connus pour inhiber l'expression de plusieurs autres cytokines au niveau des cellules hématoporétiques souches, ainsi que
pour inhiber la prolifération cellulaire de certaines tumeurs.
Les IFNa sont également connus pour réduire l'expression des récepteurs de l'EGF dans les carcinomes rénaux, pour inhiber l'expression de certains gènes mitochondriaux, pour inhiber la prolifération des fibroblastes, des monocytes et des Iymphocytes B. notamment in vitro et pour bloquer la synthèse des anticorps par les Iymphocytes B. Les iFNa sont également connus pour induire l'expression d'antigènes spécifiques de tumeurs à la surface de cellules tumorales et également pour induire la transcription des gènes placés sous le contrôle de régions promotrices de type ISRE (InterFeron-Stimulated Response Element) en
agissant sur les facteurs de transcription spécifiques de ces ISRE.
11 a été observé par ailleurs une immunisation dirigée contre les INF chez des patients atteints de certaines formes de pathologies auto
immunes ou d'infections virales généralisées ainsi que dans certains cancers.
Il est connu que les IFNoc sont impliqués dans différents dérèglements eVou maladies humaines, tels que les différents cancers comme, par exemple, les carcinomes, les mélanomes, les Iymphomes, les myélomes, les tumeurs cancéreuses ou non, les leucémies et les cancers du foie, du cou, de la tête et des reins, les maladies cardiovasculaires, les maladies métaboliques telles que celles qui ne sont pas liées au système immunitaire comme, par exemple, I'obésité, les maladies infectieuses en particulier les infections virales comme les hépatites B et C et le SIDA, les pneumonies, les colites uicératives, les maladies du système nerveux central comme, par exemple, la maladie d'Alzheimer, la schizophrénie et la dépression, le rejet de greffe de tissus ou d'organes, la cicatrisation de blessures, I'anémie en particulier chez les patients dialysés, les allergies, I'astUme, les scléroses multiples, I'ostéoporose, le psoriasis, I'arthrite rhumatode, la maladie de Crohn, les maladies et les désordres auto-immuns, les désordres gastro-intestinaux ou
encore les désordres liés aux traitements par chimiothérapie.
Les IFNa sont particulièrement utilisés pour le traitement des hépatites chroniques B et C, des leucémies telles que la leucémie à tricholeucocytes et la leucémie myélode chronique, des myélomes multiples, des Iymphomes folliculaires, de tumeurs carcinodes, de mélanomes malins, de carcinomes rénaux métastesés ainsi que des tumeurs qui apparaissent à la suite d'un déficit immunitaire, tel que le sarcome de Kaposi dans le cas du SIDA. 11 est également connu que les IFNoc sont aussi efficaces contre les tumeurs cancéreuses ou non. Les IFN sont reconnus par la FDA (Food and Drug Administration) pour ie traitement des verrues génitales ou vénériennes. Toutefois, les IFNa présentent de nombreux effets secondaires lorsqu'ils sont employés dans des compositions pharmaceutiques, tels que des réactions d'hypersensibilité aiguë (urticaire, broncho-constriction, choc anaphylactique, etc.), des arythmies cardiaques, des hypotensions artérielles, des crises d'épilepsie, des troubles des fonctions thyrodiennes ou des
syndromes pseuJo-grippaux (fièvres, sueurs, myalgies).
La demanderesse a trouvé de nouveaux polypeptides et nouveaux polynucléotides analogues à l'lFNa-6, pouvant avoir une fonctionnalité
différente de l'lFNa-6 naturel.
Ces nouveaux polypeptides et polynucléotides peuvent notamment être utilisés pour traiter ou prévenir les dérèglements ou maladies mentionnés précédemment et éviter tout ou partie des inconvénients qui leurs
sont liés.
L'INVENTION
L'invention a pour premier objet de nouveaux polynucléotides qui diffèrent de la séquence nucléotidique du gène sauvage de référence de l'lFNa 6, en ce qu'ils comportent un ou plusieurs polymorphismes de type SNP (Single
Nucleotide Polymorphism) fonctionnels.
La séquence nucléotidique ID SEQ N 1 du gène IFNa-6 humain sauvage de référence est composée de 1544 nucléotides et comporte une séquence codante de 570 nucléotides, du nucléotide 492 (codon start) au
nucléotide 1061 (codon stop).
La demanderesse a ainsi identifié quatre polymorphismes de type SNP fonctionnel dans la séquence nucléotidique du gène sauvage de référence
de l'lFNa-6.
Ces quatre polymorphismes sont présentés ci-dessous: -1) Le nucléotide thymine (t) en position 637 de la séquence nucléotidique iD SEQ N 1 du gène sauvage de référence IFNa-6 est muté en
cytosine (c).
Ce polymorphisme de type SNP est appelé ci-après t637c.
2) Le nucléotide adénine (a) en position 669 de la séquence nucléotidique ID SEQ N 1 du gène sauvage de référence IFNa-6 est muté en
guanine (g).
Ce polymorphisme de type SNP est appelé ci-après a669g.
3) Le nucléotide adénine (a) en position 775 de la séquence nucléotidique ID SEQ N 1 du gène sauvage de référence IFNa-6 est muté en
guanine (g).
Ce polymorphisme de type SNP est appelé ci-après a775g.
4) Le nucléotide guanine (g) en position 918 de la séquence nucléotidique ID SEQ N 1 du gène sauvage de référence IFNa-6 est muté en
adénine (a).
Ce polymorphisme de type SNP est appelé ci-après g918a.
Ces polymorphismes de type SNP fonctionnel (au sens de ia présente invention) ont été chacun identifiés par la demanderesse sur la base du procédé de détermination décrit dans sa demande de brevet FR 00 22894, intitulée "Procédé de détermination d'un ou plusieurs polymorphisme(s) fonctionnel(s) dans la séquence nucléotidique d'un gène candidat fonctionnel présélectionné et ses applications" et déposée le 6 décembre 2000, citée ici à
titre de référence.
Le procédé décrit dans cette demande de brevet permet I'identification d'un (ou plusieurs) polymorphisme(s) de type SNP fonctionnel(s) préexistant(s) dans au moins un individu constitutif d'une population aléatoire d'individus. Dans le cadre de la présente invention, un fragment de la séquence nucléotidique du gène IFNa-6, comprenant la séquence codante, a été isolé chez des individus dans une population d'individus choisis de manière aléatoire. -Un séquençage de ces fragments a ensuite été réalisé sur certains de ces échantilions présentant un profil hétéroduplex (différent de la séquence nucléotidique du gène sauvage de référence de l'lFNa-6) après analyse par DHPLC ("Denaturing- High Performance Liquid Chromatography"; Chromatographie liquide haute performance en condition dénaturante). On a alors comparé le fragment ainsi séquencé à la séquence nucléotidique du fragment du gène IFNa-6 sauvage de référence et identifier
les polymorphismes de type SNP conformes à l'invention.
Ainsi ces polymorphismes de type SNP fonctionnels sont naturels et chacun d'entre eux est présent chez certains individus de la population mondiale. Le gène IFNoc-6 sauvage de référence code pour une protéine immature de 189 acides aminés, correspondant à la séquence d'acides aminés ID SEQ N 2, qui sera convertit en protéine mature de 166 acides aminés, par
clivage du peptide signal qui comprend les 23 premiers acides aminés.
Chacun des polymorphismes de type SNP de l'invention t637c, a669g, a775g, g918a, entranent des modifications de la protéine codée par la séquence nucléotidique du gène IFNa-6 au niveau de la séquence d'acides aminés. Ces modifications dans la séquence d'acides aminés sont les suivantes: 1) Le polymorphisme de type SNP t637c entrane une mutation de l'acide aminé leucine (L) en position 49 dans la protéine immature du gène IFNa-6, correspondant à la séquence d'acides aminés ID SEQ N 2, en proline
(P) et en position 26 de la protéine mature.
Dans la description de la présente invention, on appellera
indifféremment L26P et L49P la mutation codée par le polymorphisme de type SNP de l'invention selon que l'on se réfère respectivement à la protéine mature
ou à la protéine immature.
2) Le polymorphisme de type SNP a669g entrane une mutation de l'acide aminé arginine (R) en position 60 dans la protéine immature du gène IFNoc6, correspondant à la séquence d'acides aminés ID SEQ N 2, en glycine
(G) et en position 37 de la protéine mature.
Dans la description de la présente invention, on appellera
indifféremment R37G et R60G la mutation codée par le polymorphisme de type SNP de l'invention selon que l'on se réfère respectivement à la protéine mature
ou à la protéine immature.
3) Le polymorphisme de type SNP a775g entrane une mutation de l'acide aminé acide aspartique (D) en position 95 dans la protéine immature du gène IFN-6, correspondant à la séquence d'acides aminés ID SEQ N 2, en
glycine (G) et en position 72 de la protéine mature.
Dans la description de la présente invention, on appellera
indifféremment D72G et D95G la mutation codée par le polymorphisme de type SNP de l'invention selon que l'on se réfère respectivement à la protéine mature
ou à la protéine immature.
4) Le polymorphisme de type SNP g918a entrane une mutation de l'acide aminé valine (V) en position 143 dans la protéine immature du gène IFNoc6, correspondant à la séquence d'acides aminés ID SEQ N 2, en
méthionine (M) et en position 120 de la protéine mature.
Dans la description de la présente invention, on appellera
indifféremment V120M et V143M la mutation codée par le polymorphisme de type SNP de l'invention selon que l'on se réfère respectivement à la protéine
mature ou à la protéine immature.
Les polymorphismes de type SNP de l'invention entranent des modifications de la conformation spatiale des polypeptides conformes à I'invention par rapport au polypeptide codé par la séquence nucléotidique du
gène sauvage de référence IFNcc-6.
Ces modifications peuvent être observées par modélisation moléculaire bioinformatique, selon des méthodes bien connues de l'homme du métier mettant en _uvre, par exemple, les outils de modélisation de novo (par exemple, SEQFOLD/MSI), d'homologie (par exemple, MODELER/M S I), de minimisationdes champs de force (par exemple, DISCOVER, DELPHI/MSI)
eVou de dynamique moléculaire (par exemple, CFF/MSI).
Des exem pies d e tel les modél isations sont don nés ci-a p rès d ans
la pa rtie expéri m e nta le.
1) La modélisation blo-informatique permet d'observer que la mutation L26P sur la protéine mutée mature entrane une déformation locale de la boucle "AB". Ceffe déformation est cependant limitée par le pont disulfure Cys29-Cys139 qui participe à la rigidification de la boucle "AB" devant l'hélice E. On observe également la disparition d'un pont hydrogène que formait le résidu Leu26 avec les résidus Cys29 et Leu30 et l'apparition d'un
nouveau pont hydrogène entre le résidu Glu142 et le résidu Ser25.
Ainsi, la protéine mutée possède une conformation tridimensionnelle différente de la protéine codée par le gène sauvage de l'lFNa
6 naturel.
Par ailleurs, le résidu Leu26 est connu pour être impliqué dans la
liaison de l'interféron alpha 2 (IFNa-2) avec son récepteur.
La structure de l'lFNa-2 étant proche de celle de l'lFNa-6, il est très probable que ce même résidu Leu26 dans l'lFNa-6 naturel soit impliqué
dans la liaison avec son récepteur.
Par conséquent, l'aide aminé proline en position 26 entrane une
modification de la fonctionnalité de l'lFNa-6 naturel.
La modélisation bio-informatique permet ainsi de prévoir que la présence de l'acide aminé proline en position 26 entrane une modification significative de la structure et de la fonction de l'lFNa-6 naturel, notamment au
niveau de la liaison l'lFNa-6 à son récepteur.
2) La modélisation blo-informatique permet d'observer que la mutation R37G sur la protéine mutée mature entrane la modification locale de la boucle AB et la perte de liaisons hydrogène entre le résidu Asp35 et le résidu
Arg37 ainsi qu'entre le résidu acide de Glu147 et le résidu Phe36.
Cette modification a pour effet de déplacer vers l'extérieur les résidus Phe36 et Phe38 de la structure tridimensionnelle de la protéine mutée IFNa-6 R37G alors qu'ils étaient partiellement enfouis dans structure de la
protéine IFNa-6 naturel.
Ainsi, la protéine mutée possède une conformation tridimensionnelle différente de la protéine codée par le gène sauvage de l'lFNa
6 naturel.
La modélisation bio-informatique permet ainsi de prévoir que la présence de l'acide aminé glycine en position 37 entrane une modification
significative de la structure et de la fonction de l'lFNa-6 naturel.
3) La modélisation bio-informatique permet d'observer que la mutation D72G sur la protéine matée mature entrane un dépliement de la courte hélice (K78-A53) située juste après l'hélice B. La boucle, contenant le résidu Tyr136 en face du résidu Asp95,
est dépliée dans la protéine IFNa-6 mutée (D72G).
La modélisation bio-informatique permet ainsi de prévoir que ia présence de l'acide aminé glycine en position 72 entrane une modification significative de la structure et de la fonction de i'lFNa-6 naturel, notamment au
niveau de la liaison l'lFNa-6 à son récepteur.
4) La modélisation blo-informatique permet d'observer que la mutation V120M sur la protéine mutée mature entrane une déformation de
l'hélice D depuis la moitié jusqu'au trois quart de sa terminaison.
- O n observe éga le me nt u ne déformation de l' hé lice B à la ha uteu r
du résidu méthionine 120.
La modélisation bio-informatique permet ainsi de prévoir que la présence de l'acide aminé méthionine en position 120 entrane une modification
significative de la structure et de la fonction de l'lFNa-6 naturel.
Un génotypage des polynucléotides conformes à l'invention peut également être effectué de façon à déterminer la fréquence allélique de ces polynucléotides dans une population. Un exemple de génotypage est donné, ci
après, dans la partie expérimentale.
La détermination de la fonctionnalité des polypeptides de
l'invention peut également être effectuée par un test de ieur activité biologique.
Par exemple, on peut mesurer l'effet anti-prolifératif sur la lignée cellulaire de Daudi en présence de polypeptides conformes à l'invention en comparaison avec la protéine IFNoc-6 naturel. L'invention a aussi pour objet l'utiiisation polynucléotides et de polypeptides conformes à l'invention ainsi que de molécules thérapeutiques obtenues eVou identifiées à partir de ces polynucléotides et polypeptide, notamment pour la prévention et le traitement de certains dérèglements eVou
maladies humaines.
La Figure 1 représente la modélisation de la protéine codée conforme à l'invention comportant le polymorphisme de type SNP L49P et de la
protéine IFNoc-6 naturel.
La Figure 2 représente la modélisation de la partie inférieure de
chacune des protéines représentées sur la Figure 1.
Le ruban noir des Figures 1 et 2 représente la structure de la
protéine IFNa-6 naturel.
Le ruban blanc des Figures 1 et 2 représente la structure de la
protéine IFNoc-6 mutée (L49P).
La Figure 3 représente la modélisation de la protéine codée conforme à l'invention comportant le polymorphisme de type SNP a669g et de
la protéine iFNa-6 naturel.
La Figure 4 représente la modélisation de la partie droite de
chacune des protéines représentées sur la Figure 3.
Le ruban noir des Figures 3 et 4 représente la structure de la
protéine IFNor-6 naturel.
Le ruban blanc des Figures 3 et 4 représente la structure de la
protéine IFNcc-6 mutée (R37G).
La Figure 5 représente la modélisation de la protéine codée conforme à 1'invention comportant le polymorphisme de type SNP D95G et de la
protéine IFNcc-6 naturel.
La Figure 6 représente la modélisation de la partie inférieure de
chacune des protéines représentées sur la Figure 5.
Le ruban noir des Figures 5 et 6 représente la structure de la
protéine IFNa-6 naturel.
Le ruban blanc des Figures 5 et 6 représente la structure de la
protéine IFNa-6 mutée (D95G).
La Figure 7 représente la modélisation de la protéine codée conforme à l'invention comportant le polymorphisme de type SNP V143M et de
la protéine IFNa-6 naturel.
La Figure 8 représente la modélisation de la partie droite de
chacune des protéines représentées sur la Figure 7.
Le ruban noir des Figures 7 et 8 représente la structure de la
protéine IFNa-6 naturel.
Le ruhan blanc des Figures 7 et 8 représente la structure de la
protéine IFNa-6 mutée (V120M).
La Figure 9 représente le résultat du génotypage du
polymorphisme de type SNP t637c dans une population d'individus.
Sur cette figure, les abscisses représentent la valeur mp du filtre Tamra (ddGTP) et les ordonnées représentent la valeur mp du filtre R-110 (ddATP) .
En haut à droite, le groupe hétérozygote AG contient 1 individu.
En bas à droite, le groupe homozypote M contient 237 individus.
En bas à gauche, le groupe d'individ us contient 7 ind ivid us blancs
et 1 individu non génotypé.
La Figure 10 représente le résultat du génotypage du
polymorphisme de type SNP a669g dans une population d'individus.
Sur cette figure, les abscisses représentent la valeur mp du filtre Tamra (ddCTP) et les ordonnées représentent la valeur mp du filtre R-110 (ddTTP) .
En haut à droite, le groupe hétérozygote TC contient 2 individus.
"En haut à gauche, le groupe homozygote TT contient 237 individus.
En bas à gauche, le groupe d'individus contient 7 blancs.
La Figure 11 représente le résultat du génotypage du poiymorphisme de type SNP a775g dans une population d'individus. Sur cette figure, les abscisses représentent la valeur mp du filtre Tamra (ddATP) et les ordonnées représentent la valeur mp du filtre R-110 (ddGTP).
En haut à droite, le groupe hétérozygote AG contient 3 individus.
En bas à droite, le groupe homozygote M contient 236 individus.
En bas à gauche, le groupe d'individus contient 7 blancs.
La Figure 12 représente le résultat du génotypage du
polymorphisme de type SNP g918a dans une population d'individus.
Sur cette figure, les abscisses représentent la valeur mp du filtre Tamra (ddCTP) et les ordonnées représentent la valeur mp du filtre R-110 (ddTTP) .
En haut à droite, le groupe hétérozygote CT contient 2 individus.
En bas à droite, le groupe homozygote CC contient 234 individus.
En bas à gauche, le groupe d'individus contient 7 blancs et 3
individus non génotypés.
DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION
Définitions On entend par "séquence nucléotidique du gène sauvage de
référence", la séquence nucléotidique ID SEQ N 1 du gène IFNx-6 humain.
Cette séquence est accessible dans la GenBank sous le numéro
d'accès X02958.
On entend par " IFNoc-6 naturel" le polypeptide codé par la séquence nucléotidique du gène sauvage de référence. La protéine immature
de l'lFNoc-6 naturel correspond à la séquence peptidique ID SEQ N 2.
-On entend par "polynucléotide", un polyribonucléotide ou un
polydésoxyribonucléotide qui peut être un ADN ou un ARN modifié ou non.
Le terme polynucléotide inclut, par exemple, un ADN simple brin ou double brin, un ADN composé d'un mélange d'une ou plusieurs région(s) simple brin et d'une ou plusieurs région(s) double brins, un ARN simple brin ou double brin et un ARN composé d'un mélange d'une ou plusieurs région(s) simple brin et d'une ou plusieurs région(s) double brins. Le terme polynucléotide peut aussi comprendre un ARN eVou un ADN comprenant une ou plusieurs régions triple brins. On entend également par polynucléotide les ADNs et ARNs contenant une ou plusieurs bases modifiées de façon à avoir un squelette modifié pour la stabilité ou pour d'autres raisons. On entend par base modifise,
par exemple, les bases inhabituelles telles que l'inosine.
On entend par "polypeptide", un peptide, un oligopoptide, un oligomère ou une protéine comprenant au moins deux acides aminés joints l'un à l'autre par une liaison peptidique normale ou modifiée, comme dans le cas
des peptides isostères, par exemple.
Un polypeptide peut être composé d'autres acides aminés que les acides aminés codés par les gènes humains. Un polypeptide peut également être composé d'acides aminés modifiés par des processus naturels, tel que le processus de maturation post-traductionnel ou par des procédés chimiques, qui sont bien connus de l'homme du métier. De telles modifications sont bien détaillées dans la littérature. Ces modifications peuvent appara'^tre n'importe o dans le polypeptide. dans le squelette peptidique, dans la chane
d'acides aminés ou encore aux extrémités carboxy- ou amino-terminales.
Un polypeptide peut être ramifié suite à une ubiquitination ou être cyclique avec ou sans ramification. Ce type de modifications peut être le résultat de processus de post-translation naturel ou synthétique, qui sont bien
connus de l'homme du métier.
On entend, par exemple, par modifications d'un polypeptide, I'acétylation, I'acylation, I'ADP-ribosylation, I'amidation, la fixation covalente de flavine, la fixation covalente d'un hème, la fixation covalente d'un nucléotide ou d'un dérivé nucléotidique, la fixation covalente d'un lipide ou d'un dérivé lipidique, la fixation covalente d'un phosphatidylinositol, la réticulation covalente ou non-covalente, la cyciisation, la formation de pont disulfure, la déméthylation, la formation de cystéine, la formation de pyroglutamate, la formylation, la gamma-carboxylation, la glycosylation, la formation d'ancre au GPl, l'hydroxylation, l'iodisation, la méthylation, la myristoylation, l'oxydation, le processus protéolytique, la phosphorylation, la prénylation, la racémisation, la sénéloylation, la sulfatation, l'addition d'acides aminés telle que l'arginylation ou l'ubiquitination. De telles modifications sont bien détaillées dans la littérature: PROTEINS-STRUCTURE AND MOLECULAR PROPERTIES, 2nd Ed., T. E. Creighton, New York, 1993, POST-TRANSLATIONAL COVALENT MODIFICATION OF PROTEINS, B. C. JoUnson, Ed., Academic Press, New York, 1983, Selfter et al. "Analysis for protein modifications and nonprotein cofactors", Meth. Enzymol. (1990) 182:626-646 et Rattan et al. "Protein Synthesis: Post-translational Modifications and Aging", Ann NY Acad Sci
(1992) 663:48-62.
On entend par"polynucléotide isolé" ou "polypeptide isolé" un polynucléotide ou un polypeptide tel que défini précédemment qui est isolé du
corps humain ou autrement produit par un procédé technique.
On entend par "identité", la mesure d'identité d'une séquence
nucléotidique ou polypeptidique.
L'identité est un terme bien connu de l'homme du métier et de la littérature. Voir COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY, Lesk, A.M., Ed., Oxford University Press, New York, 1998; BIOCOMPUTING INFORMATICS AND GENOME PROJECT, Smith, D.W., Ed., Academic Press, New York,
1993; COMPUTER ANALYSIS OF SEQUENCE DATA, PART I, Griffin, A.M.
and Griffin H.G., Ed, Humana Press, New Jersey, 1994; et SEQUENCE
ANALYSIS IN MOLECULAR BIOLOGY, von Heijne, G., Academic Press, 1987.
Les méthodes communément employées pour déterminer I'identité et la similarité entre deux séquences sont également bien décrites dans la littérature. Voir GUIDE TO HUGE COMPUTER, Martin J. Bishop, Ed, Academic Press, San Diego, 1994, et Carillo H. and Lipton D., Siam J Applied
Math (1988) 48:1073.
Un polynucléotide ayant, par exemple, une identité d'au moins % avec la séquence nucléotidique ID SEQ N 1 est un polynucléotide qui comporte au plus 5 points de mutation sur 100 nucléotides, par rapport à ladite sequence. Ces points de mutation peuvent être une (ou plusieurs)
substitution(s), addition(s) et/ou délétion(s) d'un (ou plusieurs) nucléotide(s).
De même, un polypeptide ayant, par exemple, une identité d'au moins 95 % avec la séquence d'acides aminés ID SEQ N 2 est un polypeptide qui comporte au plus 5 points de mutation sur 100 acides aminés, par rapport à
ladite séquence.
Ces points de mutation peuvent être une (ou plusieurs) substitution(s), addition(s) eVou délétion(s) d'un (ou plusieurs) acide(s)
1 5 aminé(s).
Les polynucléotides et les polypeptides conformes à l'invention qui ne sont pas totalement identique avec respectivement la séquence nucléotidique ID SEQ N 1 ou la séquence d'acides aminés ID SEQ N 2, étant entendu que ces séquences comportent au moins l'un des polymorphismes de type SNP de l'invention, sont considérés comme des variants de ces sequences. Habituellement un polynucléotide conforme à l'invention possède la même, ou pratiquement la même activité biologique que la séquence nucléotidique ID SEQ N 1 comportant au moins l'un des polymorphismes de
type SNP de l'invention.
De même, habituellement un polypeptide conforme à l'invention possède la même, ou pratiquement la même activité blologique que la séquence d'acides aminés ID SEQ N 2 comportant au moins l'un des
polymorphismes de type SNP de l'invention.
Un variant, selon l'invention, peut être obtenu, par exemple, par
mutagenèse dirigée ou par synthèse directe.
On entend par "polymorphisme de type SNP", toute variation naturelle d'une base dans une séquence nucléotidique. Par extension, ce terme
s'applique à une mutation dans une séquence d'acides aminés.
On entend par "polymorphisme de type SNP fonctionnei", un polymorphisme de type SNP compris dans une séquence nucléotidique ou une
séquence d'acides aminés ayant une fonctionnalité.
On entend par "fonctionnalité", I'activité blologique d'un
polypeptide ou d'un polynucléotide.
La fonctionnalité d'un polypeptide ou d'un polynucléotide conforme à l'invention peut consister en une conservation, une augmentation, une diminution ou une suppression de l'activité blologique du polypoptide codé par la séquence nucléotidique du gène sauvage de référence ou de cette dernière
séquence nucléotidique.
La fonctionnalité d'un polypeptide ou d'un polynucléotide conforme àl'invention peut également consister en un changement de la nature de l'activité blologique du polypoptide codé par la séquence nucléctidique du gène
sauvage de référence ou de cette dernière séquence nucléotidique.
L'activité biologique peut, notamment, être liée à l'affinité ou à l'absence d'affinité d'un polypeptide conforme à l'invention vis-à-vis d'un
récepteur.
Polyn ucléotide La présente invention a pour premier objet un polynucléotide isolé comprenant: a) une séquence nucléotidique ayant au moins 80 % d'identité, préférentiellement au moins 90 % d'identité, plus préférentiellement au moins 95 % d'identité et encore plus préférentiellement au moins 99 % d'identité avec la séquence ID SEQ N 1 ou sa séquence codante (du nucléotide 492 au nucléotide 1061), étant entendu que cette séquence nucléotidique comporte au moins l'un des polymorphismes de type SNP suivants: - t637c, - a669g, - a775g, - g918a; ou b) une séquence nucléotidique complémentaire à une séquence nucléotidique
sous a).
Il est entendu, au sens de la présente invention, que la numérotation correspondant au positionnement des polymorphismes de type SNP t637c, a669g, a775g et g918a est relative à la numérotation de la
séquence nucléotidique ID SEQ N 1.
La présente invention concerne également un p.olynucléotide isolé comprenant: a) la séquence nucléotidique ID SEQ N 1 ou sa séquence codante, étant entendu que chacune de ces séquences comporte au moins l'un des polymorphismes de type SNP suivants: - t637c, - a669g, - a775g, g918a; ou b) une séquence nucléotidique complémentaire à une séquence nucléotidique
sous a).
Préférentiellement, le polynucléotide de l'invention consiste en la séquence ID SEQ N 1 ou sa séquence codante, étant entendu que chacune de ces séquences comporte au moins l'un des polymorphismes de type SNP suivants: - t637c, - a669g, a775g,
- g918a.
Selon l'invention, le polynucléotide défini précédemment comporte préférentiellement un seul polymorphisme de type SNP choisi dans le groupe constitué par: - t637c, - a669g, - a775g, et - g918a. La présente invention a aussi pour objet un polynucléotide isolé codant pour un polypeptide comprenant: a) la séquence d'acides aminés ID SEQ N 2, ou b) la séquence d'acides aminés comprenant les acides aminés compris entre 24 et 189 de la séquence d'acides aminés ID SEQ N 2, étant entendu que chacune des séquences d'acides aminés sous a) et b) comporte au moins l'un des polymorphismes de type SNP suivants:
- L49P,
- R60G,
- D95G,
- V143M.
Il est entendu, au sens de la présente invention, que la numérotation correspondant au positionnement des polymorphismes de type SNP L49P, R60G, D95G, et V143M est relative à la numérotation de la séquence d'acides aminés ID
SEQ N 2.
Selon un objet préféré de l'invention, le polypoptide défini précédemment comporte un seul polymorphisme de type SNP choisi parmi:
- L49P,
- R60G,
- D95G, et
*- V143M.
Préférentiellement un polynucléotide conforme à l'invention est
composé d'une molécule d'ADN ou d'ARN.
Un polynucléotide conforme à l'invention peut être obtenu par les
méthodes standards de synthèse d'ADN ou d'ARN.
Ce polynucléotide peut également être obtenu par mutagenèse dirigée à partir de la séquence nucléotidique du gène IFN-6 en modifiant l'un au moins des nucléotides t, a, a et g par respectivement les nucléotides c, g, g et a en position 637, 669, 775 et 918 sur la séquence nucléotidique ID SEQ N 1. Les procédés de mutagenèse dirigée qui peuvent ainsi étre mis en _uvre sont bien connus de l'homme du métier. On peut notamment évoquer la
publication de TA Kunkel en 1985 dans "Proc. Natl. Acad. Sci. USA" 82:488.
Un polynucléotide isolé peut également comprendre, par exemple, des séquences nucléotidiques codant pour des séquences d'acides aminés pre-, pro- ou pre-pro-protéine ou des séquences d'acides aminés marqueurs,
comme l'hexa-histidine peptide.
Un polynucléotide de l'invention peut également être associé à des séquences nucléotidiques codant pour d'autres protéines ou fragments de
protéines en vue d'obtenir des protéines de fusion ou à des fins de purification.
Un polynucléotide conforme à l'invention peut également comprendre des séquences nucléotidiques comme les séquences 5' eVou 3' non-codantes, telles que, par exemple, des séquences transcrites ou non, des séquences traduites ou non, des séquences signal d'épissage, des séquences polyadénylées, des séquences de liaison avec des ribosomes ou encore des
séquences qui stabilisent l'ARNm.
On définit comme séquence nucléotidique complémentaire à la séquence nucléotidique un polynucléotide qui peut être hybridé avec cette
séquence nucléotidique, dans des conditions stringentes.
On entend généralement, mais pas nocessairement, par "conditions stringentes d'hybridation" les conditions chimiques qui permettent une hybridation lorsque les séquences nucléotidiques ont une identité d'au moins 80 %, de préférence supérieure ou égale à 90 %, encore plus préférentie l lement supérieu re o u ég ale à 95 % et tout pa rticu l ièrement
supérieure ou égale à 97 %.
Les conditions stringentes peuvent être obtenues selon les méthodes bien connues de l'homme du métier et, par exemple, par une incubation des polynucléotides, à 42 C, dans une solution comprenant 50 % de formamide, 5xSSC (150 Mm de NaCI, 15 mM de trisodium citrate), 50 Mm de sodium phosphate (pH = 7,6), 5x Solution Denhardt, 10 % de dextran sulfete et g d'ADN de sperme de saumon dénaturé, suivi d'un lavage des filtres à 0,1x SSC, à 65 C. Dans le cadre de l'invention, lorsque les conditions stringentes d'hybridation permettent une hybridation des séquences nucléotidiques ayant une identité égale à 100 %, on considère que la séquence nucléotidique est strictement complémentaire à la séquence nucléotidique sous a), telle que
décrite plus haut.
Il est bien entendu au sens de la présente invention que la séquence nucléotidique complémentaire d'une séquence nucléotidique comportant l'un au moins des polymorphismes de type SNP conforme à
l'invention en anti-sens.
Ainsi, par exemple, si la séquence nucléotidique comporte le polymorphisme de type SNP t637c, sa séquence nucléotidique complémentaire
comporte toujours le nucléotide g en position 637.
Identification, hybridation et/ou amplification d'un polynucléotide comportant le polymorphisme de type SNP La présente invention a aussi pour objet l'utilisation de tout ou partie d'un polynucléotide défini précédemment, pour identifier, hybrider eVou amplifier tout ou partie d'un polynucléotide consistant en la séquence nucléotidique ID SEQ N 1 ou sa séquence codante (du nucléotide 492 au nucléotide 1061), étant entendu que chacune de ce séquences comporte au moins l'un des polymorphismes de type SNP suivants: - t637c, - a669g, - a775g,
- g918a.
Génotypane et détermination de la fréquence du polvmorphisme de tyne SNP La présente invention a également pour objet l'utilisation de tout ou partie d'un polynucléotide conforme à l'invention comme outil de génotypage. La présente invention a aussi pour objet un procédé de détermination de la fréquence du polymorphisme de type SNP d'un polynucléotide conforme à l'invention dans lequel on procède à un génotypage
chez un individu ou dans une population d'individus.
Au sens de l'invention, on définit le génotypage comme un procédé de détermination du génotype d'un individu ou d'une population d'individus. On entend par "population d'individus", un groupe d'individus déterminés de façon aléatoire ou non. Ces individus peuvent être des humains,
des animaux, des micro-organismes ou des plantes.
Les individus peuvent étre choisis selon leur ethnie ou selon leur phénotype, notamment ceux qui sont atteints par les dérèglements eVou maladies suivantes: les différents cancers comme, par exemple, les carcinomes, les mélanomes, les Iymphomes, les myélomes, les tumeurs cancéreuses ou non, les leucémies et les cancers du foie, du cou, de la tête et des reins, les maladies cardiovasculaires, les maladies métaboliques telles que celles qui ne sont pas lices au système immunitaire comme, par exemple, I'obésité, les maladies infectieuses comme les hépatites B et C et le SIDA, les pneumonies, les colites uicératives, les maladies du système nerveux central comme, par exemple, la maladie d'Alzheimer, la schizophrénie et la dépression, le rejet de greffe de tissus ou d'organes, la cicatrisation de blessures, I'anémie chez les patients dialysés, les allergies, I'asthme, les scléroses multiples, I'ostéoporose, le psoriasis, I'arthrite rhumatorde, la maladie de Crohn, les maladies et les désordres auto-immuns, les verrues génitales ou vénériennes, les désordres gastro-intestinaux ou encore les désordres liés aux traitements
par chimiothérapie.
Le polymorphisme de type SNP fonctionnel conforme à l'invention
est préférentiellement génotypé dans une population d'individus.
11 existe de multiples technologies de pouvant être mises en oeuvre pour génotyper des polymorphismes de type SNP génotypage (voir notamment Kwok Pharmacogenomics, 2000, vol 1, pp 95-100. "High throughput genotyping assay approaches"). Ces technologies sont basées sur l'un des quatre principes suivants: hybridation d'oligonucléotides spécifiques d'allèles, élongation d'un oligonucléotide par des didésoxynucléotides en présence ou non de désoxynucléotides, ligation d'oligonucléotides spécifiques d'allèles ou clivage d'oligonucléotides spécifiques d'allèles. Chacune de ces technologies peut être couplé à un système de détection tel que la mesure de la
fluorescence directe ou polarisée, ou la spectrométrie de masse.
Le génotypage peut notamment être effectué par un miniséquençage avec des ddNTPs chauds (2 ddNTPs différents marqués par des fluorophores différents) et froids (2 ddNTPs non marqués), en liaison avec un lecteur de fluorescence polarisé. Le protocole de miniséquençage avec lecture de fluorescence polarisée (Technologie FP-TDI ou Fluorescence Polarization Template-direct Dye-Terminator Incorporation) est bien connu de
l'homme du métier.
Il peut être réalisé sur un produit obtenu après amplification par réaction de polymérisation en chane (PCR) de l'ADN de chaque individu. Ce prod uit PC R est choisi pour couvrir la région génique d u polyn ucléotide contenant le polymorphisme de type SNP étudié. Après la dernière étape dans le thermocycleur de la PCR, la plaque est alors placée sur un lecteur de fluorescence polarisée pour la lecture des bases marquces en utilisant les filtres d'excitation et d'émission spécifique des fluorophores. Les valeurs
d'intensité des bases marquées sont reportées sur un graphe.
Les amorces respectivement sens et antisens pour l'amplification PCR, dans le cas du polymorphisme de type SNP de l'invention, peuvent facilement être choisis par l'homme du métier selon la position des
polymorphismes de type SNP conforme à l'invention.
Par exemple, les séquences nucléotidiques sens et antisens pour
l'amplification PCR peuvent être respectivement ID SEQ N 3 et ID SEQ N 4.
Ces séquences nucléotidiques permettent d'amplifier un fragment d'une longueur de 659 nucléotides, du nucléotide 444 au nucléotide 1102 dans
la séquence nucléotidique ID SEQ N 1.
Une analyse statistique de la fréquence de chaque allèle (fréquence allélique) codé par le gène comportant le SNP dans la population d'individus est alors effectuée, ce qui permet de déterminer l'importance de leur impact et leur répartition dans les différents sous-groupes et notamment, le cas
échéant, les diverses ethnies qui constituent cette population d'individus.
Les données de génotypage sont analysées pour estimer les fréquences de distributions des différents allèles observés dans les populations étudiées. Les calcuis de fréquences alléliques peuvent être réalisés à l'aide de logiciels tels SAS-suite (SAS) ou SPLUS (MathSoft). La comparaison des distributions alléliques du polymorphisme de type SNP de l'invention au travers des différentes ethnies de la population d'individus peut être réalisée au moyen
des logiciels ARLEQUIN et SAS-suiteO.
La présente invention a également pour objet l'utilisation d'un polynucléotide conforme à l'invention pour la recherche d'une variation dans la
séquence nucléotidique du gène IFNa-6 chez un individu.
Vecteur d'expression et cellule hôte La présente invention a aussi pour objet un vecteur recombinant
comprenant au moins un polynucléotide conforme à l'invention.
De nombreux systèmes d'expression peuvent être utilisés, comme, par exemple, les chromosomes, les épisomes, les virus dérivés. Plus particulièrement, les vecteurs recombinants utilisés peuvent être dérivés de plasmides bactériens, de transposons, d'épisome de levure, d'éléments d'insertion, d'éléments chromosomiques de levures, de virus tels que les baculovirus, les papillonna virus comme SV40, les vaccinia virus, les
adénovirus, les fox pox virus, les pseudorabies virus, les rétrovirus.
Ces vecteurs recombinants peuvent également être des dérivés de cosm ides ou de phagem ides. La séq uence nucléotidiq ue peut être insérée dans le vecteur recombinant d'expression par les méthodes bien connues de l'homme du métier, telles que, par exemple, celles qui sont décrites dans
MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL (supra) Sambrook et al..
Le vecteur recombinant peut comprendre des séquences nucléotidiques de contrôle de la régulation de l'expression du polynucléotide ainsi que des séquences nucléotidiques permettant l'expression et la transcription d'un polynucléotide de l'invention et la traduction d'un polypeptide de l'invention, ces séquences étant choisies en fonction des cellules hôtes
mises en _uvre.
Ainsi, par exemple, un signal de sécrétion approprié peut être intégré dans le vecteur recombinant pour que le polypeptide, codé par le polynucléotide de l'invention, soit dirigé vers la lumière du réticulum endoplasmique, vers l'espace périplasmique, sur la membrane ou vers
l'environnement extracellulaire.
La présente invention a aussi pour objet une cellule hôte
comprenant un vecteur recombinant conforme à l'invention.
L'introduction du vecteur recombinant dans une cellule hôte peut être effectuée selon les méthodes bien connues de l'homme du métier telles que celles décrites dans BASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, Davis et al., 1986 et MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989, telles que la transfection par calcium phosphate, le transfection par DEAE dextran, la transvection, la microinjection, la transfection par lipides cationiques,
I'électroporation, la transduction ou l'infection.
Les cellules hôtes peuvent être, par exemple, des cellules bactériennes telles que les cellules de streptocoque, de staphylocoque, d'E. coli ou de Bacillus subtilis, des cellules de champignons telles que les cellules de levure et les cellules d'Aspergillus, de Streptomyces, des cellules d'insectes telles que les cellules de Drosophilia S2 et de Spodoptera Sf9, des cellules animales, telles que les cellules CHO, COS, HeLa, C127, BHK, HEK 293 et des
cellules humaines du sujet à traiter ou encore des cellules végétales.
Les cellules hôtes peuvent être utilisées, par exemple, pour exprimer un polypeptide de l'invention ou en tant que produit actif dans des
compositions pharmaceutiques, comme on le verra ci-après.
Polypeptide La présente invention a aussi pour objet un polypeptide isolé comprenant une séquence d'acides aminés ayant au moins 80 % d'identité, préférentiellement au moins 90 % d'identité, plus préférentiellement au moins % d'identité et encore plus préférentiellement au moins 99 % d'identité avec: a) la séquence d'acides aminés ID SEQ N 2 ou b) la séquence d'acides aminés comportant ies acides aminés compris entre 24 et 189 de la séquence d'acides aminés ID SEQ N 2, étant entendu que chacune des séquences d'acides aminés sous a) et b) comporte au moins l'un des polymorphismes de type SNP suivants:
- L49P,
- R60G,
- D95G,
- V143M.
Le polypeptide de l'invention peut également comprendre: a) la séquence d'acides aminés ID SEQ N 2, ou b) la séquence d'acides aminés comportant les acides aminés compris entre 24 et189 de la séquence d'acides aminés ID SEQ N 2, étant entendu que chacune des séquences d'acides aminés sous a) et b) comporte au moins l'un des polymorphismes de type SNP suivants:
- L49P,
- R60G,
- D95G,
- V143M.
Le polypeptide de l'invention peut tout particulièrement consister en: a) la séquence d'acides aminés ID SEQ N 2, ou b) la séquence d'acides aminés comportant les acides aminés compris entre 24 et 189 de la séquence d'acides aminés ID SEQ N 2, étant entendu que chacune des séquences d'acides aminés sous a) et b) comporte au moins l'un des polymorphismes de type SNP suivants:
- L49P,
- R60G,
- D95G,
- V143M.
Préférentiellement, un polypeptide conforme à l'invention comporte un seul polymorphisme de type SNP choisi dans le groupe constitué 1 5 par:
- L49P,
- R60G,
- D95G, et
- V143M.
La présente invention a également pour objet un procédé de préparation d'un polypeptide ci-dessus décrit, dans lequel une cellule hôte définie précédemment est cultivée et ledit polypeptide est isolé du milieu de culture. Le polypeptide peut être purifié à partir des cellules hôtes, selon les méthodes bien connues de l'homme du métier telles que la précipitation à l'aide d'agents chaotropiques comme les sels, en particulier le sulfete d'ammonium, I'éthanol l'acétone ou l'acide trichloroacétique, I'extraction à l'acide; la chromatographie échangeuse d'ions; la chromatographie par phosphocellulose; la chromatographie par interaction hydrophobe; la chromatographie d'affinité; la chromatographie hydroxylapatite ou les
chromatographies d'exclusion.
On entend par"milieu de culture", le milieu dans lequel on purifie le polypeptide de l'invention. Ce milieu peut être constitué par le milieu extracellulaire et/ou le Iysat cellulaire. Des techniques biens connues de l'homme du métier permettent également à ce dernier de redonner la conformation active au polypeptide, si la conformation dud it polypeptide a été
altérée lors de l'isolation ou de la purification.
Anticorps La présente invention a aussi pour objet un procédé d'obtention
d'un anticorps immunospécifique.
On entend par "anticorps", les anticorps monoclonaux, polyclonaux, chimériques, simple chane, humanisés ainsi que les fragments Fab, incluant les produits d'un Fab ou d'une banque d'expression d'immunoglobulines. Un anticorps immunospécifique peut être obtenu par immunisation
d'un animal avec un polypeptide conforme à l'invention.
L'invention concerne aussi un anticorps immunospécifique pour un
polypeptide conforme à l'invention, tel que défini précédemment.
Un polypoptide selon l'invention, un de ses fragments, un analogue, un de ses variants ou une cellule exprimant ce polypoptide peuvent
aussi être utilisés pour produire des anticorps immunospécifiques.
Le terme "immunospécifique'i signifie que l'anticorps possède une meilleure affinité pour le polypeptide de l'invention que pour d'autres
polypaplides connus de l'art antérieur.
Les anticorps immunospécifiques peuvent être obtenus par administration d'un polypeptide de l'invention, d'un de ses fragments, d'un analogue ou d'un fragment épitopique ou d'une cellule exprimant ce polynucléotide chez un mammifère, de préférence non humain, selon les
méthodes bien connues de l'homme du métier.
Pour la préparation d'anticorps monoclonaux, on peut utiliser des méthodes usuelles de production d'anticorps, à partir de lignées cellulaires, telles que la technique des hybridomes (Kohier et al., Nature (1975) 256:495 497), la technique des triomes, la technique des hybridomes de cellules B humaines (Kozbor et al., Immunology Today (1983) 4:72) et la technique des hybridomes EBV (Cole et al., MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, pp. 77-96, Alan R. Liss, 1985). Les techniques de production d'anticorps simple-chane telles que
décrites, par exemple, dans US N 4,946, 778 peuvent être également utilisées.
Des animaux transgéniques comme les souris, par exemple,
peuvent être également utilisés pour produire des anticorps humanisés.
Agents interagissant avec le polypeptide de l'invention La présente invention a également pour objet un procédé d'identification d'un agent activateur ou inhibiteur d'un polypeptide conforme à l'invention, comprenant: a) la mise en présence de cellules hôtes, telles que définies ci-dessus avec un agent à tester, et
b) la détermination de l'effet activateur, ou inhibiteur, généré par l'agent à tester.
Un polypeptide conforme à l'invention peut ainsi être employé pour un procédé de criblage de composés qui rentrent en interaction avec celui ci. Ces composés peuvent être des agents activateurs (agonistes) ou inhibiteurs (antagonistes) de l'activité intrinsèque d'un polypeptide selon l'invention. Ces composés peuvent également être des ligands ou des substrats d'un polypeptide de l'invention. Voir Coligan et al., Current Protocols in
Immunology 1 (2), Chapter 5 (1991).
En général, pour mettre en place un tel procédé, il est d'abord souhaitable de produire des cellules hôtes appropriées qui expriment un polypeptide conforme à l'invention. De telles cellules peuvent être, par exemple, des cellules de mammifères, de levures, d'insectes comme Drosophilia ou de
bactéries comme E. coli.
Ces cellules ou des extraits de membrane de ces cellules, sont
alors mises en présence des composés à tester.
On peut ainsi observer la capacité de liaison des composés à tester avec le polypeptide de l'invention, mais également l'inhibition ou I'activation de la réponse fonctionnelle. L'étape b) du procédé ci-dessus peut être mise en _uvre en utilisant un agent à tester marqué directement ou indirectement. Elle peut aussi comprendre un test de compétition, en utilisant un agent marqué ou non et un
agent compétiteur marqué.
On peut également déterminer si un agent à tester conduit à la génération d'un signal d'activation ou d'inhibition sur des cellules exprimant le polypeptide de l'invention, en utilisant des moyens de détection appropriés,
suivant le signal à détecter.
De tels agents activateurs ou inhibiteurs peuvent être des polynucléotides, et dans certains cas des oligonucléotides ou des polypoptides,
comme des protéines ou des anticorps, par exemple.
La présente invention a aussi pour objet une méthode pour l'identification d'un agent activé ou inhibé par un polypeptide conforme à l'invention, comprenant: a) la mise en présence de cellules hôtes obtenues comme décrit ci-dessus avec un agent à tester, et b) la déterm ination de l'effet activateur ou in hib ite ur, généré par led it polypeptide
sur l'agent à tester.
Un agent activé ou inhibé par le polypeptide de l'invention est un agent qui répond, respectivement, par une activation ou une inhibition en présence de ce polypeptide. Les agents activés ou inhibés, directement ou indirectement, par ie polypeptide de l'invention peuvent consister-en des polypoptides comme, par exemple, des récepteurs membranaires ou nucléaires, des kinases et plus préférentiellement des tyrosines kinases, des
facteurs de transcription ou des polynucléctides.
Détection de maladies La présente invention a aussi pour objet un procédé de détection de l'expression eVou de l'activité d'un polypeptide conforme à l'invention, comprenant: a) la détection de la présence ou de l'absence d'un polynucléotide selon l'invention dans le génome du sujet, eVou b) la détection de la présence, de l'absence eVou d'une concentration
prédéterminée d'un polypeptide selon l'invention chez un sujet.
La détection d'un polynucléotide et d'un polypeptide de l'invention peut ainsi permettre de savoir si un sujet est atteint ou risque d'être atteint ou, au contraire, présente une résistance partielle au développement d'une maladie, d'une indisposition ou d'un dérèglement tels que définis précédemment, relatifs à l'expression eVou l'activité d'un polypeptide de l'invention. La concentration "normale" d'un polypeptide peut être prédéterminée par l'homme du métier par des tests ou des essais conventionnels qui lui permettront d'identifier le seuil au-dessus ou en dessous duquel appara^t la sensibilité ou, au contraire, la résistance à la maladie,
I'indisposition ou le dérèglement évoqué ci-dessus.
Le polynucléotide à tester peut être obtenu à partir d'échantillons biologiques du sujet à étudier, tels que des cellules, du sang, de l'urine, de la salive, ou à partir d'une biopsie ou d'une autopsie du sujet à étudier. L'ADN génomique peut être utilisé directement pour la détection ou après à une amplification par PCR, par exemple. L'ARN ou l'ADNc peuvent également être
utilisés de façon similaire.
Il est ensuite possible de comparer la séquence nucléotidique d'un polynucléotide conforme à l'invention avec la séquence nucléotidique détectée
dans le génome du sujet.
La comparaison des séquences nucléotidiques peut être effectuée par séquençage par des méthodes d'hybridation de l'ADN, par différence de mobilité des fragments d'ADN sur gel d'électrophorèse avec ou sans agents dénaturants ou par différence de températures de fusion. Voir Myers et al. , Science (1985) 230:1242. De telles modifications dans la structure de la séquence nucléotidique en un point précis peuvent également être révélées par des essais de protection aux nucléases, telles que l'ARNase et la nucléase S1 ou encore par des agents chimiques de clivage. Voir Cotton et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA (1985) 85:4397-4401. Des sondes oligonucléotidiques comprenant un fragment d'un polynucléotide de l'invention peuvent également
être utilisées pour conduire le criblage.
De nombreuses méthodes bien connues de l'homme du métier peuvent être utilisées pour déterminer l'expression d'un polynucléotide de l'invention et pour identifier la variabilité génétique de ce polynucléotide. Voir
Chee et al., Science (1996), Vol 274, pp 610-613.
La présente invention a également pour objet l'utilisation d'un polynucléotide conforme à l'invention pour effectuer un diagnostic génétique d'une maladie ou d'une résistance à une maladie liée à la présence, chez un ou plusieurs individus de la population humaine, de l'allèle mutant codé par le
polymorphisme de type SNP fonctionnel conforme à l'invention.
Ces maladies peuvent être des dérèglements eVou des maladies humaines, tels que les différents cancers comme, par exemple, les carcinomes, les mélanomes, les Iymphomes, les myélomes, ies tumeurs cancéreuses ou non, les leucémies et les cancers du foie, du cou, de la tête et des reins, les maladies cardiovasculaires, les maladies métaboliques telles que celles qui ne sont pas liées au système immunitaire comme, par exemple, I'obésité, les maladies infectieuses en particulier virales comme leshépatites B et C et le SIDA, les pneumonies, les colites ulcératives, les maladies du systéme nerveux central comme, par exemple, la maladie d'Alzheimer, la schizophrénie et la dépression, le rejet de greffe de tissus ou d'organes, la cicatrisation de blessures, I'anémie en particulier chez les patients dialysés, les allergies, I'asthme, les scléroses multiples, I'ostéoporose, le psoriasis, I'arthrite rhumatode, la maladie de Crohn, les maladies et les désordres auto-immuns, les verrues génitales ou vénériennes, les désordres gastro-intestinaux ou
encore les désordres liés aux traitements par chimiothérapie.
Préférentiellement, ces maladies peuvent être des hopatites chroniques B et C, des leucémies telles que la leucémie à tricholeucocytes et la leucémie myélode chronique, des myclomes multiples, des Iymphomes folliculaires, des tumeurs carcinodes, des mélanomes malins, des carcinomes rénaux métastasés, la maladie d'Alzheimer, la maladie de Parkinson ainsi que des tumeurs qui apparaissent à la suite d'un déficit immunitaire, tel que le
sarcome de Kaposi dans le cas du SIDA.
De même, la présence, I'absence eVou la concentration de polypoptide selon l'invention peuvent aider au diagnostic d'une maladie, une indisposition ou un dérèglement ou, au contraire, la résistance à une maladie, une indisposition ou un dérèglement chez un sujet en prélevant un échantillon
dérivé de ce sujet.
L'augmentation ou la diminution de l'expression du polypeptide peut être mesurée en quantifiant le niveau d'ARN codant pour ce polypeptide, suivant les méthodes bien connues de l'homme du métier, par exemple, par PCR, RT-PCR, protection à l'ARNase, Northern blot, et autres méthodes d'hybridation. 11 est également possible de déterminer la concentration en polypeptides de l'invention présents dans un échantillon blologique du sujet par des méthodes bien connues, par exemple, par radioimmunoessai, tests de
liaisons compétitives, Western blot et tests ELISA.
Médicaments et traitements des maladies La présente invention a aussi pour objet un médicament
renfermant, à titre de principe actif, un polypeptide conforme à l'invention.
L'invention concerne encore l'utilisation d'un polypeptide conforme à l'invention, pour la fabrication d'un médicament destinée à la prévention ou au traitement de différents dérèglements eVou maladies humaines, tels que les différents cancers comme, par exemple, les carcinomes, les mélanomes, les Iymphomes, les myélomes, les tumeurs cancéreuses ou non, les leucémies et les cancers du foie, du cou, de la tête et des reins, les maladies cardiovasculaires, les maladies métaboliques telles que celles qui ne sont pas liées au système immunitaire comme, par exemple, I'obésité, les maladies infectieuses en particulier virales comme les hépatites B et C et le SIDA, les pneumonies, les colites uicératives, les maladies du système nerveux central comme, par exemple, la maladie d'Alzheimer, la schizophrénie et la dépression, le rejet de greffe de tissus ou d'organes, la cicatrisation de blessures, I'anémie en particulier chez les patients dialysés, les allergies, I'asthme, les scléroses multiples, I'ostéoporose, le psoriasis, I'artUrite rhumatode, la maladie de Crohn, les maladies et les désordres auto-immuns, les verrues génitales ou vénériennes, les désordres gastro-intestinaux ou encore les désordres liés aux
traitements par chimiothérapie.
Préférentiellement, un polypeptide conforme à l'invention peut être utilisé pour la fabrication d'un médicament destinée à la prévention ou au traitement de différents dérèglements eVou maladies humaines, tels que les hopatites chroniques B et C, les leucémies telles que la leucémie à tricholeucocytes et la leucémie myclode chronique, les myclomes multiples, les Iymphomes folliculaires, les tumeurs carcinodes, les mélanomes malins, les carcinomes rénaux métastesés, la maladie d'Alzheimer, ia maladie de Parkinson ainsi que les tumeurs qui apparaissent à la suite d'un déficit
immunitaire, tel que le sarcome de Kaposi dans le cas du SIDA.
Certains des composés permettant d'obtenir le polypeptide confornie à l'invention ainsi que les composés obtenus ou identifiés par ou à partir de ce polypeptide peuvent également être utilisés pour le traitement
thérapeutique du corps humain, c'est-à-dire à titre de médicament.
C'est pourquoi la présente invention a aussi pour objet un médicament contenant, à titre de principe actif un polynucléotide conforme à l'invention, un vecteur recombinant défini précédemment, une cellule hôte définie précédemment, un anticorps défini précédemment et/ou un agent
activateur etiou inhibiteur d'un polypeptide conforme à l'invention.
L'invention concerne encore l'utilisation d'un polynucléotide conforme à l'invention, d'un vecteur recombinant défini précédemment, d'une cellule hôte définie précédemment, d'un anticorps défini précédemment eVou un agent activateur eVou inhibiteur d'un polypeptide conforme à l'invention, pour la fabrication d'un médicament destinée à la prévention ou au traitement de différents dérèglements eVou maladies humaines, tels que les différents cancers comme, par exemple, les carcinomes, les mélanomes, les Iymphomes, les myélomes, les tumeurs cancéreuses ou non, les leucémies et les cancers du foie, du cou, de la tête et des reins, les maladies cardiovasculaires, les maladies métaboliques telles que celles qui ne sont pas liées au système immunitaire comme, par exemple, I'obésité, les maladies infectieuses en particulier virales comme les hopatites B et C et le SIDA, les pneumonies, les colites uicératives, les maladies du système nerveux central comme, par exemple, la maladie d'Alzheimer, la schizophrénie et la dépression, le rejet de greffe de tissus ou d'organes, la cicatrisation de blessures, I'anémie en particulier chez les patients dialysés, les allergies, I'asthme, les scléroses multiples, I'ostéoporose, le psoriasis, I'arthrite rhumatode, la maladie de Crohn, les maladies et les désordres auto-immuns, les verrues génitales ou vénériennes, les désordres gastro-intestinaux ou encore les désordres liés aux
traitements par chimiothérapie.
Préférentiellement, un polynucléotide conforme à l'invention, un vecteur recombinant défini précédemment, une cellule hôte définie précédemment, un anticorps défini précédemment et/ou un agent activateur eVou intibiteur d'un polypeptide conforme à l'invention peuvent être utilisés pour la fabrication d'un médicament destinée à la prévention ou au traitement de différents dérèglements eVou maladies humaines, tels que les hopatites chroniques B et C, les leucémies telles que la leucémie à tricholeucocytes et la leucémie myclode chronique, les myélomes multipies, les Iymphomes folliculaires, les tumeurs carcinodes, les mélanomes malins, les carcinomes rénaux métestesés, la maladie d'Alzheimer, la maladie de Parkinson ainsi que les tumeurs qui apparaissent à la suite d'un déficit immunitaire, tel que le
sarcome de Kaposi dans le cas du SIDA.
Le dosage d'un poiypeptide et des autres composés de l'invention, utiles en tant que principe actif, dépend du choix du composé, du mode d'administration, de la nature de la formulation, de la nature du sujet et du
jugement du médecin.
Lorsqu'il est utilisé comme principe actif, un polypeptide conforme à l'invention est généralement administré à des doses comprises entre 1 et
g/kg du sujet.
L'invention a aussi pour objet une composition pharmaceutique qui renferment au moins un composé précité, tel qu'un polypoptide conforme à l'invention, un polynucléotide conforme à l'invention, un vecteur recombinant défini précédemment, une cellule hôte définie précédemment, un anticorps défini précédemment et/ou un agent activateur eVou inLibiteur d'un polypeptide conforme à l'invention, à titre de principe actif, ainsi qu'un excipient
pharmaceutiquement acceptabie.
Dans ces compositions pharmaceutiques, le principe actif est
avantageusement présent à des doses physiologiquement efficaces.
Ces compositions pharmaceutiques peuvent être, par exemple, solides ou liquides et se présenter sous les formes pharmaceutiques couramment utilisoes en médecine humaine, comme par exemple les comprimés simples ou dragélfiés, les gélules, les granulés, les caramels, les suppositoires et de préférence les préparations injectables et les poudres pour injectables. Ces formes pharmaceutiques peuvent être préparées selon les
méthodes usuelles.
Le ou les principes actifs peuvent y être incorporés à des excipients habituellement employés dans ces compositions pharmaceutiques, tels que le talc, la gomme arabique, le lactose, I'amidon, le dextrose, le glycérol, I'éthanol, le stéarate de magnésium, le beurre de cacao, les véhicules aqueux ou non, les corps gras d'origine animale ou végétale, les dérivés paraffiniques, les glycols, les divers agents mouillants, dispersants ou émuisifiants, les conservateurs. Le ou les principes actifs conforme à l'invention peuvent être employés seul ou en combinaison avec d'autres composés, tels que des composés thérapeutiques tels que d'autres IFNsx, voire d'autres cytokines
com me l' inte rleu ki ne, pa r exemp ie.
Les différentes formulations des compositions pharmaceutiques
sont adaptées suivant le mode d'administration.
Les compositions pharmaceutiques peuvent être administrées par
les différentes voies d'administration connues de l'homme du métier.
L'invention a également pour objet une composition de diagnostic qui renferment au moins un composé précité, tel qu'un polypeptide conforme à l'invention, un polynucléotide conforme à l'invention, un vecteur recombinant défini précédemment, une cellule hôte définie précédemment, un anticorps défini précédemment eVou un agent activateur eVou inUibiteur d'un polypeptide conforme à l'invention, à titre de principe actif, ainsi qu'un excipient approprié
pharmaceutiquement acceptable.
Les excipients appropriés utilisés dans la composition de
diagnostic sont généralement des tampons et des conservateurs.
La présente invention a également pour objet l'utilisation: a) d'une quantité thérapeutiquement effficace d'un agent activateur défini précédemment eVou b) d'une quantité thérapeutiquement efficace d'un polypeptide selon l'invention, eVo c) d'un polynucléotide selon l'invention, eVou d) d'une cellule hôte du sujet à traiter, définie précédemment, pour préparer un médicament destiné à augmenter l'expression ou l'activité
chez un sujet, d'un polypeptide conforme à l'invention.
Ainsi, pour traiter un sujet qui a besoin d'une augmentation de I'expression ou de l'activité d'un polypeptide de l'invention, plusieurs méthodes
sont possibles.
Il est possible d'administrer au sujet une quantité thérapeutiquement efficace d'un polypeptide de l'invention eVou d'un agent activateur et/ou activé tels que définis précédemment, éventuellement en
combinaison, avec un excipient pharmaceutiquement acceptable.
11 est également possible d'augmenter ia production endogène d'un polypeptide de l'invention par administration au sujet d'un polynucléotide selon l'invention. Par exemple, ce polynucléotide peut être inséré dans un vecteur rétroviral d'expression. Un tel vecteur peut être isolé à partir de cellules ayant été infectées par un vecteur de plasmide rétroviral contenant de l'ARN codant pour le polypeptide de l'invention, de telle façon pour que les cellules transduites produisent des particules virales infectieuses contenant le gène d'intérêt. Voir Gene Therapy and other Molecular Genetic-based Therapeutic Approaches, Chapter 20, in Human Molecular Genetics, Strachan and Read,
BIOS Scientifics PublisUers Ltd (1996).
11 est également possible d'administrer au sujet des cellules hôtes lui appartenant, ces cellules hôtes ayant été prélevées et modifiées, au préalable, de façon à exprimer le polypeptide de l'invention, comme décrit précédemment. La présente invention concerne également l'utilisation a) d'une quantité thérapeutiquement effficace d'un agent inhibiteur défini précédemment, eVou b) d'une quantité thérapeutiquement efficace d'un anticorps immunospécifique défini précédemment, eVou c) d'un polynucléotide permettant d'inhiber l'expression d'un polynucléotide conforme à l'invention, pour préparer un médicament destiné à diminuer l'expression ou l'activité, chez
un sujet, d'un polypeptide conforme à l'invention.
Ainsi, il est possible d'administrer au sujet une quantité thérapeutiquement efficace d'un agent inhibiteur et/ou d'un anticorps tels que définis précédemment, éventuellement en combinaison, avec un excipient
pharmaceutiquement acceptable.
Il est également possible de diminuer la production endogène d'un polypeptide de l'invention par administration au sujet d'un polynucléotide complémentaire conforme à l'invention permettant d'inhiber l'expression d'un
polynucléotide de l'invention.
PARTIE EXPERIMENTALE
Exemple 1: Modélisation d'une protéine codée Par un polynucléotide de séquence nucléotidique comportant un polymorphisme de type SNP t637c, a669g, a775g ou g918a et de la protéine codée par la séquence nucléotidique du qène sauvage de référence Dans une première étape la structure tridimensionnelle de IFN-6 a été construite à partir de celle de IFNcc-2 dont la structure est disponible dans la base de donnces PDB (code 11TF) et ce en utilisant le logiciel Modeler (MSI,
San Diego, CA).
Le fragment polypoptidique mature a ensuite été modifié de façon
à reproduire la mutation L49P, R60G, D95G ou V143M.
Un millier d'étapes de minimisations moléculaires ont été conduites sur ce fragment muté en utilisant les programmes AMBER et
DISCOVER (MSI: Molecular Simulations Inc.).
Deux suites de calcuis de dynamiques moléculaires ont ensuite
été effectuées avec le même programme et les mémes champs de forces.
Dans chaque cas, 50000 étapes ont été calculées à 300 K,
terminées par 300 étapes d'équilibration.
Le résultat de cette modélisation est visualisé sur les Figures 1, 2, 3,4, 5,6,7et8.
Exemple 2: Génotypage des polymorphismes de type SNP t637c, a669.
a775g ou g918a dans une population d'individus Le génotypage des polymorphismes de type SNP est basé sur le principe du miniséquençage dont le produit est détecté par une lecture de fluorescence polarisée. La technique consiste en un miniséquençage fluorescent (Technologie FP-TDI ou Fluorescence Polarization Template-direct
Dye-terminator I ncorporation j.
Le miniséquençage consiste à allonger un oligonucléotide amorce, placé juste en amont du site du polymorphisme de type SNP, par des didéoxynucléotides fluoromarqués à l'aide d'une enzyme polymérase. Le produit résultant de cet allongement est directement analysé par une lecture de
fluorescence polarisée.
Le génotypage requiert 5 étapes: 1) Amplification par PCR 2) Purification du produit de PCR par digestion enzymatique 3) Elongation de l'oligonucléotide amorce 4) Lecture ) Interprétation de la lecture Les étapes de génotypage 1 et 2 sont réalisées de manière identique pour chacun des polymorphismes de type SNP t637c, a669g, a775g
et g918a.
Les étapes 3, 4 et 5 sont spécifiques à chacun de ces polymorphismes. 1) L'amplification PCR de la séquence nucléotidique du gène IFNor-6 est effectuée à partir de d'ADN génomique provenant de 239 individus
d'origine ethniques diverses.
Ces ADNs génomiques ont été fournis par l'lnstitut Coriell aux
Etats-Unis.
Les 239 individus se répartissent comme suit:
POPULATION DESCRIPTION NOMBRE D'INDIVIDUS
Afro Américain 50 2 Amérindien du Sud Ouest Sud Américain (Andes) 10 4 Caribéen 10 Caucasien 50 Chinois 10 7 Grec 8 Ibérien 10 9 Italien 10 Japonais 10 11 Mexicain 10 12 Moyen-Orient 20 13 Individus du Pacifique 14 I ndo-Pakistanais 9 Sud Américain 10 16 Asie du Sud 10 L'ADN génomique issu de chacun des individus constitue un échantillon. L'amplification PCR est réalisée à partir des amorces suivantes: IDSEQN 3etlDSEQN 4. Ces séquences nucléotidiques permettent d'amplifier un fragment d'une longueur de 659 nucléotides, du nucléotide 444 au nucléotide 1102 dans la séquence nucléotidique ID SEQ N 1 Les amplifiats PCR serviront de matrice pour la réaction de
miniséquençage.
Le volume résctionnel total mis en _uvre pour l'amplification PCR
est de 5,ul par échantillon.
Ce volume résctionnel est composé par les réactifs indiqués dans
le tableau suivant.
Fournisseur Référence Réactif Conc. Vol. par Conc.
ntale tube (,ul) fnale Life Technologie Livré avec Taq Tampon (X) 10 0, 5 1 Life Technologie Livré avec Taq MgSO4 (mM) 50 0,2 2 AP Biotech 272035-03 dNTPs (mM) 10 0,1 0,2 Sur demande Amorce F (,uM) 10 0,1 0,2
ID SEQ N 4
Surdemande Amorce R (gM) 10 0,1 0,2
ID SEQ N 5
Life Technologie 11304-029 Taq platinium 5U/,ul 0,02 0,1 U/ réaction H2O Qsp 5 111 1,98 ADN 2,5 ng/,ul 2 5 ngl (échantillon) réaction Volume total 5,ul Ces réactifs sont distribués dans une plaque PCR noire à 384 puits fournie par ABGene (ref:TF-0384-k). La plaque est scellée, centrifugée puis placée dans un thermocycleur pour plaque 384 (Tetrad de MJ Reseorch) et subit l'incubation suivante: Cycles de PCR: 1 min à 94 C, suivi de 36 cycles
composés de 3 étapes (15 sec. à 94 C, 30 sec. à 56 C, 1 min. à 68 C).
2) L'amplifiat PCR est ensuite purifié à l'aide de deux enzymes: la phosphatase alcaline de crevette (ou Shrimp Alkaline Phosphatase SAP) et l'exonucléase I (Exo I). La première de ces enzymes permet la déphosphorylation des dNTPs non incorporés au cours de l'amplification PCR, tandis que la seconde élimine les résidus simple brin d'ADN, en particulier les
amorces non utilisées au cours de la PCR.
Cette digestion se fait par addition dans chaque puits de la plaque
PCR d'un mélange réactionnel de 5,ul par échantillon.
Ce mélange réactionnel est composé des réactifs suivants:
Foumisseur Référence Réactif Conc. Vol. par Conc.
initiale tube ( p1) finale AP Biotech E70092X SAP 1 Ulul O,5 réscton AP Biotech 070073Z Exo I 10 U/,ul 0,1 réalC/tjon AP Biotech Fourni Tampon 10 0,5 1 avec SAP SAP (X) H2O Qsp 5,ul 3,9 PCR 5,ul (amplifiat) Vol total 10,ul Une fois remplie, la plaque est scellée, centrifugée puis placée dans un thermocycleur pour plaque 384 puits (Tetrad de MJ Research) et subit I'incubation suivante: Digestion SAP-EXO: 45 min à 37 C, 15 min à 80 C. 3) L'étape d 'élongation ou de m in iséq ue nçage est ens u ite réalisée sur ce produit de PCR digéré, par addition d'un mélange résctionnel de pL par échantillon préparé. Le miniséquençage 3) et les étapes de lecture 4) et d'interprétation de lecture 5) sont spécifiques à chaque polymorphisme de type
*SNP t637c, a669g, a775g et g918a.
Toutes ces étapes sont décrites ci-après pour chacun de ces polymorphismes. 3.1) Polymorphisme de type SNP t637c Liétape d'élongation ou de miniséquençage est réalisoe comme indiqué dans le tableau suivant:
Fou misseu r lTef rence Réactif Co nc Vo l par Con c.
Propre Tampon Elongation 5 1 1 préparation (X) Llfe Amorce Miniseq Technologies Sur demande À ou B 10 0,5 1 AP Biotech 27-2051 ddNTPs (,uM) 2,5 025 0,125 (61,71,81)-01 2 non marques de chaque de chaque NEN Nel 47215 ddNTPs ( uM) 2,5 0,25 0,125 et Nel 492/5 Tamra ét R110 de chaque de chaque AP Biotech E79000Z Thermo-sequenase 3,2 Ul pl 0,125 ré0a4tiUo/n H20 Qsp 5 IJ1 3,125 PCR digérée 10 pl Vol totai 15 pl Le tampon élongation: Le tampon élongation 5X est composé de Tris-HCI pH 9 à 250 mM, de
KCI à 250 mM, de NaCI à 25 mM, de MgCI2 à 10 mM et de glycérol à 40 %.
2 ddNTPs: Pour les ddNTPs, un mélange des 4 bases est réalisé en fonction du polymorphisme étudié. Seulement les 2 bases d'intérêts A/G) composant le polymorphisme de type SNP fonctionnel portent un marquage, soit en Tamra, soit en R110. Le mélange de ddNTPs est composé de: - 2,5 M de ddCTP non marqué, - 2,5 M de ddTTP non marqué, 1 0 - 2,5,uM de ddATP (1, 875,uM de ddATP non marqué et 0,6251JM de ddATP marqué au Tamra),
- 2,51JM de ddGTP (1,875 M de ddGTP non marqué et 0,625,uM de ddGTP marqué au R110).
Une fois remplie, la plaque est scellée, centrifugée puis placée dans unthermocycleur pour plaque 384 puits (Tetrad de MJ Research) et subit I'incubation suivante: Cycles d'élongation: 1 min. à 93 C, suivi de 35 cycies
composés de 2 étapes (10 sec. à 93 C, 30 sec. à 55 C).
Après la dernière étape dans le thermocycleur, la plaque est directement placoe sur un lecteur de fluorescence polarisée de type Analyst HT de LJL Biosystems Inc.. La plaque est lue à l'aide du logiciel Criterion Host en utilisant deux méthodes. La première permet de lire la base marquée en Tamra en utilisant les filtres d'excitation et d'émission spécifiques de ce fluorophore (excitation 550-10 nm, émission 580-10 nm) et la seconde permet de lire la base marquce en R110 en utilisant les filtres d'excitation et
d'émission spécifiques de ce fluorophore (excitation 490-10 nm, émission 520-
nm). Dans les deux cas, un miroir double dichroque (R110/Tamra) est utilisé et les autres paramètres de lecture sont: Z-height: 1,5 mm Attenuator: out
Temps d'intégration: 100,000,usec.
Raw data units: counts/sec Switch polarization: by well Plate settling time: O msec PMT setup: Smart Read (+), sensitivity 2 Dynamic polarizer: emission Static polarizer: S Un fichier résultat est alors obtenu contenant les valeurs calculées de mP (millipolarization) pour le filtre Tamra et celle pour le filtre R110. Ces valeurs de mP sont calculées à partir des valeurs d'intensité obtenues sur le plan parallèle(/l) et sur le plan perpendiculaire (l) d'après la formule suivante:
mP =1000(/1- gl)l(ll + gl).
Dans ce calcul, la valeur l est pondérée d'un facteur g. Celui-ci est un paramètre machine qui doit étre déterminé préalablement expérimentalement. 4.1) et 5.1) Interprétation de la lecture et détermination des
génotypes.
Les valeurs de mP sont reportées sur un graphe à l'aide du logiciel Excel de Microsoft Inc., eVou du logiciel Allele Caller développé par
LJL Biosystems Inc..
En abscisse est indiquée la valeur de mP de la base marquée au
Tamra, en ordonnée est indiquée la valeur de mP de la base marquée au R110.
Une forte valeur de mP indique que la base marquée avec ce fluorophore est incorporée et, inversement, une faible valeur de mP révèle l'absence
d'incorporation de cette base.
On obtient jusqu'à trois groupes homogènes de séquences
nucléotidiques ayant des génotypes différents, comme indiqué dans la Figure 9.
L'utilisation du logiciel Allele Caller permet, une fois le repérage des différents groupes réalisé, d'extraire directement le génotype défini pour
chaque individu sous forme d'un tableau.
Les séquences des deux amorces de miniséquençage nécessaires pour le génotypage ont été déterminces de façon à être placées en amont du site du polymorphisme de type SNP. Le produit de PCR qui comporte le polymorphisme de type SNP étant un produit d'AD-N double brin, le génotypage peut donc se faire soit sur le brin sens soit sur le brin antisens. Les amorces sélectionnées sont fabriquées par Life Technologies Inc. Les amorces du miniséquençage sont les suivantes: 1 5 Amorce sens: (A): acaaatgaggagaatctctc Amorce antisens: (B): tgtccttcagacaggagaaa Le miniséquençage du polymorphisme de type SNP t637c a d'abord été validé sur 16 échantillons, puis génotypé sur l'ensemble de la
population d'individus composée de 239 individus et 7 blancs.
Conditions de miniséquençage testées: Condition N 1: Amorce sens + ddCTPR110 + ddTTP-Tamra Condition N 2: Amorce sens + ddTTP-R110 + ddCTP-Tamra Condition N 3: Amorce antisens + ddGTP-R110 + ddATP-Tamra Condition N 4: Amorce antisens + ddATP-R110 + ddGTP-Tamra Ces 4 conditions ont été testées et la condition N 3 a été retenue
pour le génotypage.
Résultats du miniséquençage pour le polymorphisme de type SNP t637c Après la réalisation complète du processus de génotypage, la détermination des génotypes des individus de la population d'individus pour la SNP fonctionnel étudié ici a été réalisée à l'aide du graphe représenté sur la Figure 9. Ce génotype est en théorie soit homozygote M, soit hétérozygote AG, soit homozygote GG chez les individus testés. En réalité et comme montré ci-dessous, le génotype homozygote GG n'est pas détecté dans la population
d'individ us.
Les résultats des contrôles, de la répartition des génotypes déterminés dans la population d'individus et le calcul des différentes fréquences alléliques pour ce polymorphisme de type SNP fonctionnel sont présentés dans les tableaux suivants: Nom bre d'i nd ividus Nom bre de b lanc Pou rcentage de testés génotypés testés validés réussite
239 238 7 7 99,6
o o o o o o o o o o o o o o o o <: o o ô ô oo ô ô o o o ô o ô ô o o o _ _ Z u C) o o OD O O 0 O C r o o h o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o Ci o o o o o o o o o o o o o __ _ _ _ Z o o o o o o o o o o o o o o o ô o ô ô ô ô ô ô ô o ô ô o - oO ô o ô o _ _ _ __ _ _ Z o o o o o o o o o o o o o o o o o -ô L i L iL ô oo- ô ô o ô ô o ô ô ô ô ô ô ô ô o o i r 0 co i co c cY) 0 z z o 0 0 0 0 0 o 0 0 0 o 0
E J8 =:1
Dans le tableau ci-dessus, - N représente le nombre d'individus, - % représente le pourcentage d'individus dans la sous-population spécifique, - la fréquence allélique représente le pourcentage de l'allèle muté dans la sous population spécifique,
- 95 % IC représente l'intervalle minimal et maximal de confiance à 95 %.
Il faut préciser que l'allèle a lu en antisens correspond à l'allèle t lu en sens, soit à la présence d'un L en position 49 de la séquence de la protéine immature IFNoc-6 et donc que l'allèle g lu en antisens correspond à l'allèle c lu en sens correspondant à un P pour cette position dans la séquence de la
protéine correspondante.
En examinant ces résultats par population, on constate que le seul individu hétérozypote AG est issu de la sous-population caucasienne de la
population d'individus.
3.2) Polymorphisme de type SNP a669g L'étape d'élongation ou de miniséquençage est ensuite réalisée comme indiqué dans le tableau suivant:
Fourn ssour RefÉrence Réactif in a e Vo! par Conc.
Propre Tampon Elongation 5 1 1 préparation (X) Amorce Miniseq L'fe Surdemande ( M) 10 0,5 1 Technologes C ou D AP Biotech 27- 2051 ddNTPs (,uM) 2,5 025 0,125 (61,71,81)-01 2 non marques de chaque de chaque Nel 4.7215 ddNTPs ( 2,5 0,125 NEN et Nel 492/5 Tamra ét R110 de chaque 0,25 de chaque AP Biotech E79000Z Thermo-sequenase 3,2 U/ pl 0, 125 réaction H20 Qsp 5 p1 3,125 PCR digérée 10 IJI Vol total 15 pl Le tampon élongation: Le tampon élongation 5X est composé de Tris-HCI pH 9 à 250 mM, de
KCI à 250 mM, de NaCI à 25 mM, de MgCI2 à 10 mM et de glycérol à 40 %.
2 ddNTPs. Pour les ddNTPs, un mélange des 4 bases est réalisé en fonction du polymorphisme étudié. Seulement les 2 bases d'intérêts (T/C) composant le polymorphisme de type SNP fonctionnel portent un marquage, soit en Tamra, soit en R110. Le mélange de ddNTPs est composé de: - 2,5,uM de ddATP non marqué, - 2,5 M de ddGTP non marqué, 1 0 - 2,5,uM de ddCTP (1,875,uM de ddCTP non marqué et 0,625 IIM de ddCTP marqué au Tamra),
2,5 IJM de ddTTP (1,875 M de ddTTP non marqué et 0,625 M de ddTTP marqué au R110).
Une fois remplie, la plaque est scellée, centrifugée puis placée dans unthermocycleur pour plaque 384 puits (Tetrad de MJ Research) et subit I'incubation suivante: Cycles d'élongation: 1 min. à 93 C, suivi de 35 cycles
composés de 2 étapes (10 sec. à 93 C, 30 sec. à 55 C).
Après la dernière étape dans le thermocycleur, la plaque est directement placce sur un lecteur de fluorescence polarisoe de type Analyst HT de LJL Biosystems Inc.. La plaque est lue à l'aide du logiciel Criterion Host en utilisant deux méthodes. La première permet de lire la base marquée en Tamra en utilisant les filtres d'excitation et d'émission spécifiques de ce fluorophore (excitation 550-10 nm, émission 580-10 nm) et la seconde permet de lire la base marquée en R110 en utilisant les filtres d'excitation et d'émission spécifiques de ce fluorophore (excitation 49010 nm, émission 520 nm). Dans les deux cas, un miroir double dichroque (R110/Tamra) est utilisé et les autres paramètres de lecture sont: Zheight: 1,5 mm Attenuator: out
Tempsd'intégration: 100,000,usec.
Raw data units: counts/sec Switch polarization: by well Plate settling time: O msec PMT setup: Smart Read (+), sensitivity 2 Dynamic polarizer: emission Static polarizer: S Un fichier résultat est alors obtenu contenant les valeurs calculées de mP pour le filtre Tamra et celle pour le filtre R110. Ces valeurs de mP sont calculées à partir des valeurs d'intensité obtenues sur le plan parallèle(//) et sur le plan perpendiculaire (l) d'après la formule suivante:
mP =1000(//- gl)l(ll + gl).
Dans ce calcul, la valeur l est pondérce d'un facteur g. Celui-ci est un paramètre machine qui doit être déterminé préalablement expérimentalement. 4.2) et5.2) Interprétation de la lecture et détermination des
génotypes.
Les valeurs de mP sont reportées sur un graphe à l'aide du logiciel Excel de Microsoft Inc., eVou du logiciel Allele Caller développé par
LJL Biosystems Inc..
En abscisse est indiquée la valeur de mP de la base marquée au
Tamra, en ordonnce est indiquce la valeur de mP de la base marquée au R110.
Une forte valeur de mP indique que la base marquée avec ce fluorophore est incorporce et, inversement, une faible valeur de mP révèle l'absence
d'incorporation de cette base.
On obtient jusqu'à trois groupes homogènes de séquences nucléotidiques ayant des génotypes différents, comme indiqué dans la Figure 10. L' utilisation d u log iciel Allele Ca ller permet, u ne fois le repé rage des différents groupes réalisé, d'extraire directement le génotype défini pour
chaque individu sous forme d'un tableau.
Les séquences des deux amorces de miniséquençage nécessaires pour le génotypage ont été déterminées suivant la position du polymorphisme de type SNP. Les amorces sélectionnées sont fabriquces par Life Technologies Inc. Les amorces du miniséquençage sont les suivantes: Amorce sens: (C): tgaaggacagacatgacttc Amorce antisens: (D): aaactcctcctggggaaatc Le miniséquençage du polymorphisme de type SNP a669g a d'abord été validé sur 16 échantillons, puis génotypé sur l'ensemble de la
population d'individus composée de 239 individus et 7 blancs.
Conditions de miniséquençage testées: Condition N 1: Amorce sens + ddGTPR110 + ddATP-Tamra Condition N 2: Amorce sens + ddATP-R110 + ddGTP-Tamra Condition N 3: Amorce antisens + ddCTP-R110 + ddTTP-Tamra Condition N 4: Amorce antisens + ddTTP-R110 + ddCTP-Tamra Ces 4 conditions ont été testées et la condition N 4 a été retenue
pour le génotypage.
Résultats du miniséquençage pour le polymorphisme de type SNP a669g Après la réa l isatio n comp lète d u process us de génotypage, la détermination des génotypes des individus de la population d'individus pour la SNP fonctionnel étudié ici a été réalisée à l'aide du graphe représenté sur la Figure 10. Ce génotype est en théorie soit homozygote TT, soit hétérozygote TC, soit homozygote CC chez les individus testés. En réalité et comme montré ci-dessous, le génotype homozypote CC n'est pas détecté dans la population d'individus. Les résultats des contrôles, de la répartition des génotypes déterminés dans la population d'individus et le calcul des différentes fréquences alléliques pour ce polymorphisme de type SNP fonctionnel sont présentés dans les tableaux suivants: Nom bre d'individus Nom bre de blanc Pourcentage de testés | génotypés testés | validés réussite
239 239 100
o o o o o o o o o o o o o o o o o' o ô o o CO- o o o ô ô o o ô o o o
ô _ _ _ _. _ =- _
Z o u: 0 0 o 03 0 o o o o) h o o o o o o o o o o o o o o o o CO o o o o o o o o o o o o o o o o o
_ _ __ _ _ _
Z o o o o C o o o o o o o o o o o C o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o
_ _ __ _ _ _ _
Z o o o o o o o o o o o o-' o o o o o o o ô ô o o o ô ô ô o o ô ô o ô ô o o CT) C CA C =) C C CJ Ci)) N 1 O _ 0 i ç- 0 oo r 0
_ Z O 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 (D 0 0 N
Z. _ ô.,. i. F Dans le tableau ci-dessus, - N représente le nombre d'individus, - % représente le pourcentage d'individus dans la souspopulation spécifique, - la fréquence allélique représente le pourcentage de l'allèle muté dans la sous population spécifique,
- 95 % IC représente l'intervalle minimal et maximal de conhance à 95 %.
Il faut préciser que l'allèle t lu en antisens correspond à l'allèle a lu en sens, soit à la présence d'un R en position 60 de la séquence de la protéine de l'lFNa6 et donc que l'allèle c lu en antisens correspond à l'allèle g lu en sens correspondant à un G pour cette position dans la séquence de la protéine correspondante. En examinant ces résultats par population, on constate que les deux individus hétérozygotes TC sont issus de la sous-population caucasienne
de la population d'individus.
3.3) Polymorphisme de type SNP a775g L'étape d'élongation ou de miniséquençage est ensuite réalisée comme indiqué dans le tableau suivant:
Fourn isseur Référence Réactif Conc. Vol. par Conc.
1 initiale (111) finale Propre Tampon Elongation 5 1 1 préparation (X) f Amorce Miniseq Technologies Sur demande É ou F l 0,5 1 AP Biotech 27- 2051 ddNTPs ( M) 2, 025 0,125 (61,71,81)-01 2 non marques de chaque de chaque NEN Nel 472/5 ddNTPs ( I1M) 2,5 0,25 0,125 et Nel 492/5 Tamra et R110 de chaque de chaque AP Biotech E79000Z Thermo-sequenase 3,2 U/ pl 0, 125 réaction H20 Qsp 5,u1 3,125 PCR digérée 10,ul Vol total 15 pl Le tampon élongation: Le tampon élongation 5X est composé de Tris-HCI pH 9 à 250 mM, de
KCI à 250 mM, de NaCI à 25 mM, de MgCI2 à 10 mM et de glycérol à 40 %.
2 ddNTPs: Pour les ddNTPs, un mélange des 4 bases est réalisé en fonction du polymorphisme étudié. Seulement les 2 bases d'intérêts A/G) composant le polymorphisme de type SNP fonctionnel portent un marquage, soit en Tamra, soit en R110. Le mélange de ddNTPs est composé de: - 2,51JM de ddCTP non marqué, - 2,5 llM de ddTTP non marqué, 1 0 - 2,51JM de ddATP (1, 875 M de ddATP non marqué et 0,6251JM de ddATP marqué au Tamra),
- 2,5,uM de ddGTP (1,875 M de ddGTP non marqué et 0,625 M de ddGTP marqué au R110).
Une fois remplie, la plaque est scellée, centrifugée puis placoe dans unthermocycleur pour plaque 384 puits (Tetrad de MJ Research) et subit I'incubation suivante: Cycles d'élongation: 1 min. à 93 C, suivi de 35 cycles
composés de 2 étapes (10 sec. à 93 C, 30 sec. à 55 C).
Après la dernière étape dans le thermocycleur, la plaque est directement placée sur un lecteur de fluorescence polarisée de type Analyst HT de LJL Biosystems Inc.. La plaque est lue à l'aide du logiciel Criterion Host en utilisant deux méthodes. La première permet de lire la base marquée en Tamra en utilisant les filtres d'excitation et d'émission spécifiques de ce fluorophore (excitation 550-10 nm, émission 580-10 nm) et la seconde permet de lire la base marquée en R110 en utilisant les filtres d'excitation et d'émission spécifiques de ce fluorophore (excitation 49010 nm, émission 520 nm). Dans les deux cas, un miroir double dichroque (R110/Tamra) est utilisé et les autres paramètres de lecture sont: Zheight: 1,5 mm Attenuator: out
Temps d'intégration: 100,000,usec.
Raw data units: counts/sec Switch polarization: by well Plate settling time: O msec PMT setup: Smart Read (+), sensitivity 2 Dynamic polarizer: emission Static polarizer: S Un fichier résultat est alors obtenu contenant les valeurs calculées de mP pour le filtre Tamra et celle pour le filtre R110. Ces valeurs de mP sont calculées à partir des valeurs d'intensité obtenues sur le plan parallèle(//) et sur le plan perpendiculaire (l) d'après la formule suivante:
mP =1000(/1- gl)l(ll + gl).
Dans ce calcul, la valeur l est pondérée d'un facteur g. Celui-ci est un paramètre machine qui doit être déterminé préalablement expérimentalement. 4.3) et 5.3) Interprétation de la lecture et détermination des
génotypes.
Les valeurs de mP sont reportées sur un graphe à l'aide du logiciel Excel de Microsoft Inc., et/ou du logiciel Allele Caller@) développé par
LJL Biosystems Inc..
En abscisse est indiquée la valeur de mP de la base marquée au
Tamra, en ordonnée est indiquée la valeur de mP de la base marquée au R110.
Une forte valeur de mP indique que la base marquée avec ce fluorophore est incorporée et, inversement, une faible valeur de mP révèle l'absence
d'incorporation de cette base.
On obtient jusqu'à trois groupes homogènes de séquences nucléotidiques ayant des génotypes différents, comme indiqué dans la Figure 11. L'utilisation du logiciel Ailele Caller permet, une fois le repérage des différents groupes réalisé, d'extraire directement le génotype défini pour
chaque individu sous forme d'un tableau.
Les séquences des deux amorces de miniséquençage nécessaires pour le génotypage ont été déterminées suivant la position du polymorphisme de type SNP. Les amorces sélectionnées sont fabriquées par Life Technologies Inc. Les amorces du miniséquençage sont les suivantes: Amorce sens: (E): caatctcttcagcacaasgg Amorce antisens: (F): catcccaagcaacagatgag Le miniséquençage du polymorphisme de type SNP A775G a d'abord été validé sur 16 échantillons, puis génotypé sur l'ensemble de la
population d'individ us composée de 239 ind ivid us et 7 blancs.
Conditions de miniséquençage testées: Condition N 1: Amorce sens + ddGTPR110 + ddATP-Tamra Condition N 2: Amorce sens + ddATP-R110 + ddGTP-Tamra Condition N 3: Amorce antisens + ddCTP-R110 + ddTTP-Tamra Condition N 4: Amorce antisens + ddTTP-R110 + ddCTP-Tamra Ces 4 conditions ont été testées et la condition N 1 a été retenue
pour le génotypage.
Résultats du miniséquençage pour le polymorphisme de type SNP a775g Ap rès la réalisatio n co mp lète d u process us de gé n otypage, la détermination des génotypes des individus de la population d'individus pour la SNP fonctionnel étudié ici a été réalisée à l'aide du graphe représenté sur la Figure 11. Ce génotype est en théo rie so it homozygote M, soit hété rozygote AG, soit homozygote GG chez les individus testés. En réalité et comme montré ci-dessous, le génotype homozygote GG n'est pas détecté dans la population d'individus. Les résultats des contrôles, de la répartition des génotypes déterminés dans la population d'individus et le calcul des différentes fréquences alléliques pour ce polymorphisme de type SNP fonctionnel sont présentés dans les tableaux suivants: Nom bre d'individus Nom bre de blanc l Pourcentage de | testés génotypés testés I validés | réussite
239 239 7 1 7 1 100
_ o o o o ô o o o, o o o o Oo o Oo o, i Z U) o) U) o ", o o o o co o ô ô ô ô Oo ô o ô Oo ô ô ô o ô Oo _ __ Z C o o o o o o o o o o o o o o CO o o o o o o o o o o o o o o o o o o^ o o o o o o o o o o o o. o o o o __ _ Z o o o o o o o o o o o o o o o o o P o ô ô ô o ô ô o ô ô ô ô ô ô Oo Oo ô
N N _ _ N _ _ O
Z- O _ O O O O oo O O O O C O) O O O) o 3 Dans le tableau ci-dessus, - N représente le nombre d'individus, - % représente le pou rce ntage d 'i nd ivid us dans la sous-popu lation spécifique, - la fréquence allélique représente le pourcentage de l'allèle muté dans la sous population spécifique,
- 95 % IC représente l'intervalle minimal et maximal de confiance à 95 %.
En examinant ces résultats par population, on constate que les 3 individus hétérozygotes AG sont issus des sous-populations afro- américaine et
ibérienne de la population d'individus.
3.4) Polymorphisme de type SNP g91 8a L'étape d'élongation ou de miniséquençage est ensuite réalisée comme indiqué dans le tableau suivant:
Fournisseur Rétérence Réactif Conc. Vol. par Conc.
initiale ( lul) fnale Propre Tampon Elongation 5 1 1 préparation (X) Amorce Miniseq Life Sur demande (,uM) 10 0,5 1 Technologes G ou H AP Biotech 27-2051 ddNTPs (,uM) 2,5 025 0,125 (61,71,81)-01 2 non marqués de chaque de chaque NEN Nel 472/5 2 marqués 2,5 0,25 0,125 et Nel 492/5 Tamra et R110 de chaque de chaque AP Biotech E79000Z Thermo- sequenase 3,2 U/ ul 0,125 réacton H20 Qsp 5 IJ1 3,125 PCR digérée 10 ul Vol total 15 pl Le tampon élongation: Le tampon élongation 5X est composé de Tris-HCI pH 9 à 250 mM, de
KCI à 250 mM, de NaCI à 25 mM, de MgCI2 à 10 mM et de glycérol à 40 %.
2 ddNTPs: Pour les ddNTPs, un mélange des 4 bases est réalisé en fonction du polymorphisme étudié. Seulement les 2 bases d'intérêts C/T) composant le polymorphisme de type SNP fonctionnel portent un marquage, soit en Tamra, soit en R110. Le mélange de ddNTPs est composé de: - 2,5,uM de ddATP non marqué, - 2,5 M de ddGTP non marqué, - 2,5,uM de ddCTP (1,875, uM de ddCTP non marqué et 0,625 M de ddCTP marqué au Tamra), - 2,5,uM de ddTTP (1,875,uM de ddl1P non marqué et 0,625 M de ddTTP marqué au R110). Une fois remplie, la plaque est scellée, centrifugée puis placée dans un thermocycleur pour plaque 384 puits (Tetrad de MJ Reseorch) et subit itincubation suivante: Cycles d'élongation: 1 min. à 93 C, suivi de 35 cycles
composés de 2 étapes (10 sec. à 93 C, 30 sec. à 55 C).
Après la dernière étape dans le thermocycleur, la plaque est directement placée sur un lecteur de fluorescence polarisée de type AnalystO HT de LJL Biosystems Inc.. La plaque est lue à l'aide du logiciel Criterion Host en utilisant deux méthodes. La première permet de lire la base marquée en Tamra en utilisant les filtres d'excitation et d'émission spécifiques de ce fluorophore (excitation 550-10 nm, émission 580-10 nm) et la seconde permet de lire la base marquée en R110 en utilisant les filtres d'excitation et d'émission spécifiques de ce fluorophore (excitation 490-10 nm, émission 520 nm). Dans les deux cas, un miroir double dichroque (R110/Tamra) est utilisé et les autres paramètres de lecture sont: Z-height: 1,5 mm Attenuator: out
Temps d'intégration: 100,000,usec.
Raw data units: counts/sec Switch polarization: by well Plate settling time: O msec PMT setup: Smart Read (), sensitivity 2 Dynamic polarizer: emission Static polarizer: S Un fichier résultat est alors obtenu contenant les valeurs calculées de mP pour le filtre Tamra et celle pour le filtre R110. Ces valeurs de mP sont calculées à partir des valeurs d'intensité obtenues sur le plan parallèle(l/) et sur le plan perpendiculaire (l) d'après la formule suivante:
mP =1000(// - gl)l(ll + gl).
Dans ce calcul, la valeur l est pondérée d'un facteur g. Celui-ci est un paramètre machine qui doit être déterminé préalablement expérimentalement. 4.4) et 5.4) Interprétation de la lecture et détermination des génotypes. Les valeurs de mP sont reportées sur un graphe à l'aide du logiciel Excel de Microsoft inc., eVou du logiciel Allele Caller développé par LJL Biosystems Inc En abscisse est indiquée la valeur de mP de la base marquée au
Tamra, en ordonnée est indiquce la valeur de mP de la base marquée au R110.
Une forte valeur de mP indique que la base marquce avec ce fluorophore est incorporce et, inversement, une faible valeur de mP révèle l'absence
d'incorporation de cette base.
On obtient jusqu'à trois groupes homogènes de séquences nucléotidiques ayant des génotypes différents, comme indiqué dans la Figure 12. L'utilisation du logiciel Allele Caller permet, une fois le repérage des différents groupes réalisé, d'extraire directement le génotype défini pour
chaque individu sous forme d'un tableau.
Les séquences des deux amorces de miniséquençage nécessaires pour le génotypage ont été déterminées suivant la position du polymorphisme de type SNP. Les amorces sélectionnées sont fabriquées par Life Technologies Inc. Les amorces du miniséquençage sont les suivantes: Amorce sens: (G): algaggoctccatcctggct Amorce antisens: (H): tcmggeagtattttctca Le miniséquençage du polymorphisme de type SNP G91 8A a d'abord été validé sur 16 échantillons, puis génotypé sur l'ensemble de la
population d'individus composée de 239 individus et 7 blancs.
Conditions de miniséquençage testées: Condition N 1: Condition N 1: Amorce sens + ddGTP-R110 + ddATP-Tamra Condition N 2: Amorce sens + ddATP-R110 + ddGTP-Tamra Condition N 3: Amorce antisens + ddCTP-R110 + ddTTP-Tamra Condition N 4: Amorce antisens + ddTTP-R110 + ddCTP-Tamra Ces 4 conditions ont été testées et la condition N 4 a été retenue
pour le génotypage.
Résultats du miniséquençage pour le polymorphisme de type SNP g918a Après la réalisation complète du processus de génotypage, la détermination des génotypes des individus de la population d'individus pour la SNP fonctionnel étudié ici a été réalisée à l'aide du graphe représenté sur la Figure 12 Ce génotype est en théorie soit homozygote CC, soit hétérozygote CT soit homozygote TT chez les individus testés. En réalité et comme montré ci-dessous, le génotype homozygote TT n'est pas détecté dans la population d'individus. Les résultats des contrôles, de la répartition des génotypes déterminés dans la population d'individus et le calcul des différentes fréquences alléliques pour ce polymorphisme de type SNP fonctionnel sont présentés dans les tableaux suivants: Nombre d'individus Nombre de blanc Pourcentage de | testés I génotypés I testés I validés réussite!
239 1 236 7 1 7 1 98,8 1
_ o o o o o o U) o o o o o o o o o O o 0 0 0 0 0 0 0 0 0 o 0 0 0 o _ _ é) Z O 0 0 0 0 1 O) 0 0 (7) o) (0 O) 0 0 N Q o' O- O- O- 00- O- O- O- oO 00O- O 00- O- O- 00- È
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Z O O O O O O O O O O O O O O C
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O> O- O- O- O O- O- O O O- O- O- O -0 O O- O O
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o O O O O O O O O O O O U) O O O
IJÀ O- O- O- O- O- O O- O O O- O O- O O
o O) 1 1 0) -1 c) C1 1 1 (1 t O) 00 -1 -1 O - O O t CO-) O Z U) O O m0 O CO O O O O C=M O O Dans le tableau ci-dessus, - N représente le nombre d'individus, - % représente le pou rcentage d 'i nd ivid us dans la so uspopu lation spécifiq ue, - la fréq uence al léliq ue rep résente le pourcentage de l'allèle muté dans la sous population spécifique,
- 95 % IC représente l'intervalle minimal et maximal de confiance à 95 %.
Il faut préciser que l'allèle c lu en antisens correspond à l'allèle g lu en sens, soit à la présence d'un V en position 143 de la séquence de la protéine immature IFNa-6 et donc que l'allèle t lu en antisens correspond à I'allèle a lu en sens correspondant à un M pour cette position dans la séquence
de la protéine correspondante.
En examinant ces résultats par population, on constate que les 2 individus hétérozygotes CT sont issus des sous-populations grecque et
provenant du Moyen -Orient de la population d'individus.
Claims (33)
1. Polynucléotide isolé comprenant: a) une séquence nucléotidique ayant au moins 80 % d'identité avec la séquence ID SEQ N 1 ou sa séquence codante, étant entendu que cette séquence nucléotidique comporte au moins l'un des polymorphismes de type SNP suivants: - t637c, - a669g, - a775g, - g918a; ou b) une séquence nucléotidique complémentaire à une séquence nucléotidique
sous a).
2. Polynucléotide isolé comprenant: a) la séquence nucléotidique ID SEQ N 1 ou sa séquence codante, étant entendu que chacune de ces séquences comporte au moins l'un des polymorphismes de type SNP suivants: - t637c, a669g, - a775g, - g918a; ou b) une séquence nucléotidique complémentaire à une séquence nucléotidique
sous a).
3. Polynucléotide selon l'une quelconque des revendications 1 à 2,
caractérisé en ce qu'il consiste en la séquence ID SEQ N 1 ou sa séquence codante, étant entendu que chacune des séquences comporte au moins l'un des polymorphismes de type SNP suivants: - t637c, - a669g, - a775g,
- g918a.
4. Polynucléotide selon l'une quelconque des revendications 1 à 3,
caractérisé en ce que la séquence nucléotidique a) comporte un seul polymorphisme de type SNP choisi dans le groupe constitué par: - t637c, a669g, - a775g, et
- g918a.
5. Polynucléotide isolé, caractérisé en ce qu'il code pour un polypeptide comprenant: a) la séquence d'acides aminés ID SEQ N 2, ou b) la séquence d'acides aminés comprenant les acides aminés compris entre 24 et189 de la séquence d'acides aminés ID SEQ N 2, étant entendu que chacune des séquences d'acides aminés sous a) et b) comporte au moins l'un des polymorphismes de type SNP suivants:
- L49P,
- R60G,
- D95G,
- V143M.
6. Polynucléotide selon la revendication 5, caractérisé en ce qu'il code pour un polypeptide comportant un seul polymorphisme de type SNP choisi dans le groupe constitué par:
- L49P,
- R60G,
- D95G, et
- V143M.
7. Polynucléotide selon l'une quelconque des revendications 1 à 6,
caractérisé en ce qu'il est composé d'une molécule d'ADN ou d'ARN.
8. Utilisation de tout ou partie d'un polynucléotide selon l'une
quelconque des revendications 1 à 7, pour identifier, hybrider eVou amplifier
tout ou partie d'un polynucléotide consistant en la séquence ID SEQ N 1 ou sa séquence codante, étant entendu que chacune de ces séquences comporte au moins l'un des polymorphismes de type SNP suivants: - t637c, a669g, - a775g,
- g91 8a.
9. Utilisation de tout ou partie d'un polynucléotide selon l'une
quelconque des revendications 1 à 7, comme outil de génotypage.
10. Procédé de détermination de la fréquence du polymorphisme
de type SNP d'un polynucléotide selon l'une quelconque des revendications 1 à
7, dans lequel on procède à un génotypage chez un individu ou dans une
population d'individus.
1 1. Procédé de détermination selon la revendication 10, dans
lequel le génotypage est effectué par miniséquençage.
12. Procédé de détermination selon la revendication 11, dans lequel le miniséquençage est réalisé avec les amorces sens et antisens correspondant respectivement aux séquences nucléotidique ID SEQ N 3 et ID
SEQ N 4.
13. Utilisation d'un polynucléotide selon l'une quelconque des
revendications 1 à 6, pour la recherche d'une variation de séquence dans la
séquence nucléotidique du gène IFNoc-6 chez un individu.
14. Vecteur recombinant comprenant un polynucléotide selon
l'une quelconque des revendications 1 à 7.
15. Cellule hôte comprenant un vecteur recombinant selon la
revendication 14.
16. Procédé de préparation d'un polypeptide, caractérisé en ce qu'une cellule hôte selon la revendication 15 est cultivée et ledit polypeptide est
isolé du milieu de culture.
17. Polypeptide isolé comprenant une séquence d'acides aminés ayant au moins 80 % d'identité avec: a) la séquence d'acides aminés ID SEQ N 2 ou b) la séquence d'acides aminés comportant les acides aminés compris entre 24 et 189 de la séquence d'acides aminés ID SEQ N 2, étant entendu que chacune des séquences d'acides aminés sous a) et b) comporte au moins l'un des polymorphismes de type SNP suivants:
- L49P,
- R60G,
- D95G,
- V143M.
18. Polypeptide selon la revendication 17, caractérisé en ce qu'il comprend: a) la séquence d'acides aminés ID SEQ N 2, ou b) la séquence d'acides aminés comportant les acides aminés compris entre 24 et 189 de la séquence d'acides aminés ID SEQ N 2, étant entendu que chacune des séquences d'acides aminés sous a) et b) comporte au moins l'un des polymorphismes de type SNP suivants:
- L49P,
- R60G,
- D95G,
- V143M.
19. Polypeptide selon l'une quelconque des revendications 17 à
18, caractérisé en ce qu'il consiste en: a) la séquence d'acides aminés ID SEQ N 2, ou b) la séquence d'acides aminés comportant les acides aminés compris entre 24 et 189 de la séquence d'acides aminés ID SEQ N 2, étant entendu que chacune des séquences d'acides aminés sous a) et b) comporte au moins l'un des polymorphismes de type SNP suivants:
- L49P,
- R60G,
- D95G,
- V143M.
20. Polypeptide selon l'une quelconque des revendications 17 à 19,
caractérisé en ce que chacune des séquences d'acides aminés sous a) et b) comporte un seul polymorphisme de type SNP choisi dans le groupe constitué par:
- L49P,
- R60G,
- D95G, et
- V143M.
21. Procédé d'obtention d'un anticorps immunospécifique, caractérisé en ce qu'il est obtenu par immunisation d'un animal avec un
polypeptide selon l'une quelconque des revendications 17 à 20.
22. Anticorps immunospécifique pour un polypeptide selon l'une
quelconque des revendications 17 à 20.
23. Procédé d'identification d'un agent activateur ou inhibiteur d'un
polypeptide selon l'une quelconque des revendications 17 à 20, comprenant:
a) la mise en présence de cellules hôtes selon la revendication 15 avec un agent à tester, et
b) la détermination de l'effet activateur ou inhibiteur généré par l'agent à tester.
24. Méthode pour l'identification d'un agent activé ou inhibé par un
polypeptide selon l'une quelconque des revendications 17 à 20, comprenant:
a) la mise en présence de cellules hôtes selon la revendication 15 avec un agent à tester, et b) la détermination de l'effet activateur ou inhibiteur généré par un polypeptide
sur l'agent à tester.
25. Procédé de détection de l'expression eVou de l'activité d'un
polypeptide selon l'une quelconque des revendications 17 à 20, comprenant:
a) la détection de la présence ou de l'absence d'un polynucléotide selon l'une
quelconque des revendications 1 à 7 dans le génome du sujet, eVou
b) la détection de la présence, de l'absence eVou d'une concentration
prédéterminée d'un polypeptide selon l'une quelconque des revendications 17
à 20, dans un échantillon biologique du sujet.
26. Médicament comprenant à titre de principe actif au moins un
polypeptide selon l'une quelconque des revendications 17 à 20.
27. Utilisation d'un polypeptide selon l'une quelconque des
revendications 17 à 20, pour la préparation d'un médicament destiné à la
prévention ou le traitement de l'une des maladies choisies dans le groupe constitué par les différents cancers comme les carcinomes, les mélanomes, les Iymphomes, les myélomes, les tumeurs cancéreuses ou non, les leucémies et les cancers du foie, du cou, de la tête et des reins, les maladies cardiovasculaires, les maladies métaboliques telles que celles qui ne sont pas liées au système immunitaire comme l'obésité, les maladies infectieuses en particulier virales comme les hépatites B et C et le SIDA, les pneumonies, les colites uicératives, les maladies du système nerveux central comme la maladie d'Alzheimer, la schizophrénie et la dépression, le rejet de greffe de tissus ou d'organes, la cicatrisation de blessures, I'anémie en particulier chez les patients dialysés, les allergies, I'asthme, les scléroses multiples, I'ostéoporose, le psoriasis, I'arthrite rhumatode, la maladie de Crohn, les maladies et les désordres auto-immuns, les verrues génitales ou vénériennes, les désordres gastro-intestinaux ou encore les désordres liés aux traitements par chimiothérapie. 28. Utilisation d'un polypeptide selon la revendication 27, pour la préparation d'un médicament destiné à la prévention ou le traitement de l'une des maladies choisies dans le groupe constitué par les hépatites chroniques B et C, les leucémies telles que la leucémie à tricholeucocytes et la leucémie myélode chronique, les myélomes multiples, des Iymphomes folliculaires, les tumeurs carcinodes, les mélanomes malins, les carcinomes rénaux métestasés, la maladie d'Alzheimer, la maladie de Parkinson ainsi que les tumeurs qui apparaissent à la suite d'un déficit immunitaire, tel que le sarcome
de Kaposi dans le cas du SIDA.
29. Médicament comprenant à titre de principe actif au moins un
polynucléotide selon l'une quelconque des revendications 17 à 20, un vecteur
recombinant selon la revendication 14, une cellule hôte selon la revendication
eVou un anticorps selon la revendication 22.
30. Utilisation d'un polynucléotide selon l'une quelconque des
revendications 1 à 7, d'un vecteur recombinant selon la revendication 14, d'une
cellule hôte selon la revendication 15 eVou un anticorps selon la revendication 22, pour la préparation d'un médicament destiné à la prévention ou le traitement de l'une des maladies choisies dans le groupe constitué par les différents cancers comme les carcinomes, les mélanomes, les Iymphomes, les myélomes, les tumeurs cancéreuses ou non, les leucémies et les cancers du foie, du cou, de la tête et des reins, les maladies cardiovasculaires, les maladies métaboliques telles que celles qui ne sont pas liées au système immunitaire comme l'obésité, les maladies infectieuses en particulier virales comme les hépatites B et C et le SIDA, les pneumonies, les colites ulcératives, les maladies du système nerveux central comme la maladie d'Alzheimer, la schizophrénie et la dépression, le rejet de greffe de tissus ou d'organes, la cicatrisation de blessures, I'anémie en particulier chez les patients dialysés, les allergies, I'asthme, les scléroses multiples, I'ostéoporose, le psoriasis, I'arthrite rhumatode, la maladie de Crohn, les maladies et les désordres auto-immuns, les verrues génitales ou vénériennes, les désordres gastro-intestinaux ou
encore les désordres liés aux traitements par chimiothérapie.
31. Utilisation d'un polynucléotide selon l'une quelconque des
revendications 1 à 7, d'un vecteur recombinant selon la revendication 14, d'une
cellule hôte selon la revendication 15 et/ou un anticorps selon la revendication 22, pour la préparation d'un médicament destiné à la prévention ou le traitement de l'une des maladies choisies dans le groupe constitué par les hépatites chroniques B et C, les leucémies telles que la leucémie à tricholeucocytes et la leucémie myélode chronique, les myélomes multiples, des Iymphomes folliculaires, les tumeurs carcinodes, les mélanomes malins, les carcinomes rénaux métastasés, la maladie d'Alzheimer, la maladie de Parkinson ainsi que les tumeurs qui apparaissent à la suite d'un déficit
immunitaire, tel que le sarcome de Kaposi dans le cas du SIDA.
32. Composition pharmaceutique renfermant à titre de principe
actif au moins un polypeptide selon l'une quelconque des revendications 17 à
, un polynucléotide selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, un
vecteur recombinant selon la revendication 14, une cellule hôte selon la revendication 15 et/ou un anticorps selon la revendication 22, ainsi qu'un
excipient pharmaceutiquement acceptable.
33. Composition de diagnostic renfermant à titre de principe actif
au moins un polypeptide selon l'une quelconque des revendications 17 à 20, un
polynucléotide selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, un vecteur
recombinant selon la revendication 14, une cellule hôte selon la revendication et/ou un anticorps selon la revendication 22, ainsi qu'un excipient approprié
pharmaceutiquement acceptable.
34. Utilisation: a) d'une quantité thérapeutiquement efficace d'un polypeptide selon l'une
quelconque des revendications 17 à 20, eVou
b) d'un polynucléotide selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, eVou
c) d'une cellule hôte selon la revendication 15, cette cellule provenant du sujet à traiter, pour préparer un médicament destiné à augmenter l'expression ou l'activité
chez un sujet, d'un polypeptide selon l'une quelconque des revendications 17 à
20. 35. Utilisation: a) d'une quantité thérapeutiquement efficace d'un anticorps selon la revendication 21, eVou b) d'un polynucléotide permettant d'inhiber l'expression d'un polynucléotide selon
l'une quelconque des revendications 1 à 7,
pour préparer un médicament destiné à diminuer l'expression ou l'activité chez un sujet d'un polypaptide selon l'une quelconque des
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- 2002-04-17 WO PCT/EP2002/004953 patent/WO2002083733A2/fr not_active Application Discontinuation
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