KR20030092127A - 피부 치료 - Google Patents

Abstract

본 발명은 개인에게서 채취한 생체외 시료의 게놈에 존재하는 프로필라그린 대립유전자를 동정하는 것을 포함하는, 피부 상태에 대한 개인의 소인을 판정하는 방법을 제공한다. 피부 상태에는 천연 보습 인자 (NMF)를 생산하는 개인의 능력, 피부 건조 및(또는) 세제 유발 홍반에 대한 소인이 포함된다. 전형적으로, 프로필라그린 대립유전자는 코딩된 필라그린 반복부의 수를 파악함으로써 동정한다. 본 발명의 방법은 임상 시험 참여의 목적으로, 또는 개인과 화장품 제제를 짝맞추기 위해 개인들을 분류하는 데 특히 유용하다.

Description

피부 치료 {Skin Treatment}

표피 분화 과정에서, 각질형성세포는 활발하게 증식하는 기저 세포가 유극 세포층 및 과립 세포층을 거쳐 단계적으로 분화하여 최종적으로 피부 표면의 보호 각질층에 특징적인 무핵 비늘을 형성하게 되는 잘 규명된 일련의 형태학적 및 생화학적 변화를 거친다 (Presland 등 (1992)J Biol Chem, 267(33), 23772-23781). 각각의 표피층은 특수한 생화학적 표지의 발현을 특징으로 하는데, 그 중 케라틴 중간체인 필라멘트 단백질인 K5/K14 및 K1/K10이 각각 기저층과 유극층에서 대부분을 차지한다 (Presland 등 (1992)J Biol Chem, 267(33), 23772-23781).

과립형 세포는 프로필라그린의 발현에 의해 특징지어진다. 프로필라그린 유전자는 관련이 있으나 동일하지는 않은 다수의 필라그린 반복부를 포함하는 고분자량의 포스포릴화된 폴리프로테인을 코딩한다. 펩티드 맵핑 및 서열결정 연구 결과필라그린 단위들이 단백질분해 프로세싱 과정에서 제거되는 짧은 링커 펩티드에 의해 분리되어 있다는 것이 밝혀졌다 (Presland 등 (1992)J Biol Chem, 267(33), 23772-23781). 상응하는 설치류의 유전자와 마찬가지로, 사람 프로필라그린 유전자의 코딩 영역은 반복이 있는 부분 내에 인트론을 포함하지 않는다.

포스포릴화된 프로필라그린은 제 기능을 하지 못하며 표피 분화 후기에 F-케라토하이알린 과립으로 축적된다 (Gan 등 (1990)Biochemistry, 29, 9432-9440). 과립형에서 최종적으로 분화된 각화 세포로 옮아가는 과정에서, 프로필라그린은 탈포스포릴화되고 단백질분해에 의해 프로세싱되어 필라그린 단량체를 생산한다. 필라그린은 케라틴 중간체 필라멘트가 각질층에 특징적인 조밀한 거대피브릴로 응집하는 데 관여한다 (Presland 등 (1992)J Biol Chem, 267 (33), 23772-23781). 프로필라그린은 필라그린의 유리 아미노산으로의 분해를 통해 표피 수화를 유지하는 데 일정 역할을 할 수도 있다 (Presland 등 (1992)J Biol Chem, 267(33), 23772-23781). 이 유리 아미노산은 각질층의 천연 보습 인자 (Natural Moisturising Factors) (NMF)의 일부를 구성한다. NMF는 피부의 수화 및 그에 따른 상태를 유지시킨다.

프로필라그린 유전자는 1q21 염색체 상에 표피 분화 복합체 (EDC)라고 알려진 유전자 클러스터의 일부로 위치한다 (Mishke 등 (1996)SID106(5): 989-992). 이들 유전자 중 다수가 각질층의 구조와 기능에 기여하는 것으로 여겨지는 산물을 코딩한다. 프로필라그린 유전자는 엑손 3에 위치하는 필라그린 반복부의 수에 대립유전자 간 차이가 있어 크기 면에서 다형성을 보이는 것으로 보고된 바 있다(Gan 등 (1990) Biochemistry, 29, 9432-9440). 사람 집단에서는 프로필라그린 유전자의 세 가지 길이 변이체가 동정되었는데, 이들은 반복부가 10, 11 또는 12개 있는 다량체를 코딩하는 것이다. 두 개의 프로필라그린 대립유전자 모두가 대략 동등한 수준으로 발현된다는 것, 즉 프로필라그린 유전자로부터의 발현은 이원 대립형(bi-allelic)이라는 것이 밝혀졌다 (Nirunsuksiri 등 (1998)Journal of Investigative Dermatology, 110(6), 854-861).

우성 형질로 유전되는, 비늘이 떨어지는 피부 질환인 심상성 어린선 (IV)을 앓는 개인들에게서 보이는 프로필라그린 유전자의 대립유전자 간 차이를 해당 질환을 앓지 않는, 친족간이거나 연령 및 성별을 맞춘 정상 대조수검자와 비교한 것이 있다 (Nirunsuksiri 등 (1998)Journal of Investigative Dermatology, 110(6), 854-861). 전체 코딩 영역을 에워싼 EcoRV 제한효소 부위를 활용하여 반복부의 크기 및 수의 평가를 행하였다. 필라그린 도메인의 수는 IV 및 대조 수검자들 모두 10에서 12 사이인 것으로 밝혀졌으며, 두 군들 사이에서 대립유전자의 분포에 현저한 차이는 보이지 않았는데 (Nirunsuksiri 등 (1998)Journal of Investigative Dermatology, 110(6), 854-861), 이것은 개인의 프로필라그린 유전자형이 그 개인의 피부 상태에 영향을 미치지 않음을 시사한다. 이 견해는 정상인 최종 분화된 사람 표피는 전구체 유전자로부터 생산된 제 기능을 하는 필라그린의 정확한 양에 결정적으로 의존하지 않는 것으로 보인다는 점에 주목한 문헌[Gan 등 (1990,Biochemistry, 29, 9432-9440)]에 의해 더 뒷받침된다.

이러한 배경기술에 반하여, 놀랍게도 필라그린 반복부의 수와 피부 건조에대한 소인 사이에 상관관계가 있다는 것이 밝혀졌다. 본 발명자는 프로필라그린 유전자형과 피부가 계면활성제 공격을 견디는 능력 (즉, 세제 유발 홍반에 대한 소인) 사이에 관련이 있다는 것을 밝혀내었다. 본 발명자는 또한 필라그린 반복부의 수와 NMF의 생산 사이에 직접적인 상관관계가 있다는 것을 입증하였다. 개인의 NMF 생산 능력 및(또는) 피부 건조, 비듬 및(또는) 세제 유발 홍반과 같은 피부 상태에 대한 소인은 그들의 게놈에 존재하는 프로필라그린 대립유전자를 동정함으로써 판정할 수 있다. 개인들은 임상시험시 그들의 프로필라그린 유전자형을 기초로 분류될 수 있다. 개인은 그들의 프로필라그린 유전자형을 기초로 적합한 화장품과 매치될 수 있다.

본 발명은 대립유전자 동정 방법에 관한 것이다. 더 구체적으로, 본 발명은 개인의 게놈에 존재하는 프로필라그린(profilaggrin) 대립유전자를 동정하는 방법에 관한 것으로, 그 결과는 피부 상태에 대한 개인의 소인을 판정하는 데 이용할 수 있다.

도 1은 PCR 기법을 사용하여 필라그린 반복부의 수를 확인하는, 개인의 게놈에 있는 프로필라그린 대립유전자의 동정법을 보여준다.

도 2는 염색체쌍 당 필라그린 반복부의 수와 각질층 NMF 수준의 관계를 보여준다. 스피어만 상관도: R=0.47; p=0.036; n=20.

도 3은 염색체쌍 당 필라그린 반복부의 수와 각질층 NMF 수준의 관계를 보여주며 두피 상태 이력을 포함한 것이다. 12 반복부 대립유전자가 하나 이상인 경우의％ 비듬 = 67％; 12 반복부 대립유전자가 전혀 없는 경우의％ 비듬 = 17％

도 4는 1％ SLS 패치를 붙인지 48 시간 후의 홍반 점수와 프로필라그린 대립유전자형의 관계를 보여준다. 만-휘트니 순위합 검정: 12 반복부 대립유전자가 없는 패널 참가인과 하나 이상의 12 반복부 대립유전자를 가진 패널 참가자를 비교할 때 패치 24 시간 후의 홍반 점수에 통계적으로 유의한 차이가 있다 (n=43) (a) SLS 패치 회복 - 12 반복부 대립유전자가 없는 개인; (b) SLS 패치 회복 - 12 반복부 대립유전자를 하나 이상 가진 개인.

도 5는 12 반복부 대립유전자가 있거나 없는 패널 참가자 중 피부 건조 자각증상을 빈번히 겪는 사람의 비율을 보여준다. 피셔 정확 검정: 12 반복부 대립유전자의 존재 또는 부재와 피부 건조의 빈도 사이에 통계적으로 유의한 관계 (p=0.0237)가 있다 (n=89).

도 6은 11 반복부 대립유전자가 있거나 없는 패널 참가자 중 가시적인 다리피부 건조를 보인 사람의 비율을 보여준다. 피셔 정확 검정: 11 반복부 대립유전자의 존재 또는 부재와 가시적 피부 건조가 있는 패널 참가자의 비율 사이에 통계적으로 유의한 관계 (p=0.099)가 있다 (n=113).

도 7은 12 반복부 대립유전자가 있거나 없는 패널 참가자 중 1％ SLS 패치 후 4 시간에서 48 시간 사이에 홍반 감소를 보인 사람의 비율을 보여준다. 피셔 정확 검정: 12 반복부 대립유전자의 존재와 패치 후 홍반 감소 사이에 통계적으로 유의한 관계 (p=0.0587)가 있다 (n=131).

발명의 요약

따라서, 본 발명은 개인에게서 채취한 생체외 시료의 게놈에 존재하는 프로필라그린 대립유전자를 동정하는 것을 포함하는, 피부 상태에 대한 개인의 소인을 판정하는 방법을 제공한다.

본 발명은 또한 개인에게서 채취한 시료의 게놈에 존재하는 프로필라그린 대립유전자를 동정하는 수단을 포함하는, 피부 상태에 대한 개인의 소인을 판정하는 시스템을 제공한다.

본 발명은 또한 프로필라그린, 또는 그의 변이체 또는 단편의 서열을 포함하는 폴리펩티드, 또는 이들 중 어느 하나를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 투여하는 것을 포함하는, NMF 생산을 증가시키고(증가시키거나) 피부 건조 및(또는) 비듬을치료하거나 예방하는 방법을 제공한다. 바람직한 실시태양에서, 이 방법은 세제 유발 홍반을 치료하거나 예방하기 위한 것이다. 바람직하게는, 상기 폴리펩티드는 12 개의 필라그린 반복부를 가진 프로필라그린 대립유전자형의 서열을 포함한다.

본 발명은 또한 프로필라그린 대립유전자형, 또는 그의 변이체 또는 단편의 서열을 포함하는 폴리펩티드, 또는 이들 중 어느 하나를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 의약 용도를 제공한다. 바람직하게는, 상기 폴리펩티드는 12 개의 필라그린 반복부를 가진 프로필라그린 대립유전자형의 서열을 포함한다.

본 발명은 또한 피부 상태 치료용 조성물 (예컨대 화장품 조성물 또는 의약)의 제조를 위한, 프로필라그린 대립유전자형, 또는 그의 변이체 또는 단편의 서열을 포함하는 폴리펩티드, 또는 이들 중 어느 하나를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 용도를 제공한다. 바람직하게는, 상기 폴리펩티드는 12 개의 필라그린 반복부를 가진 프로필라그린 대립유전자형의 서열을 포함한다.

본 발명은 또한, 5' GGA TGA AGC CTA TGA CACCAC 3' 또는 5' GA CAG GAA AAG ATA ACT TCC C 3'의 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 본 발명은 또한 피부 상태에 대한 개인의 소인을 판정하는 데 있어 그러한 폴리뉴클레오티드의 용도를 제공한다.

본 발명은 또한 개인의 프로필라그린 유전자형을 동정하고 그렇게 확인된 프로필라그린 유전자형에 사용하기에 적합한 것으로 알려진 개인 위생용품을 선별하는 것을 포함하는, 그 개인이 사용하기에 적합한 개인 위생용품을 동정하는 방법을 제공한다.

본 발명은 또한 개인에게서 채취한 시료의 게놈에 존재하는 프로필라그린 대립유전자를 동정하는 수단을 포함하는 진단 키트를 제공한다.

발명의 상세한 설명

본 발명은 환경 조건, 또는 피부관리 제품, 화장품, 세정 제품 또는 모발관리 제품과 같은 개인 위생용품 또는 섬유 세제, 섬유 유연제, 설거지 세제 등과 같은 가정용품과의 접촉과 같은 조건에 대해 개인의 피부가 어떻게 반응할 것인지를 판단해야 하는 요청을 해결한다. 피부관리 제품의 예로는 보습제, 셀프 태닝 제제, 선탠 로션, 마사지 오일, 목욕용 오일, 향수, 립밤, 크림, 얼굴 팩, 면도용 폼 및 겔 등이 있다. 화장품의 예로는 립스틱, 파운데이션, 아이섀도우, 아이라이너, 블러셔 및 컨실러 등이 있다. 세정 제품의 예로는 샴푸 (특히 비듬방지용 샴푸), 비누, 샤워 젤 및 거품목욕제를 포함한 전신 세정 제품 및 섬유 세제 및 설거지 세제 등이 있다. 모발관리 제품의 예로는 스타일링 무스, 스타일링 스프레이, 스타일링 젤, 헤어 컨디셔너 또는 모발 염색제 등이 있다.

개체의 프로필라그린 유전자형을 분석함으로써 피부 상태에 대한 그 개체의 소인을 판정하는 것이 가능하다. "프로필라그린 유전자형"이라 함은 개체의 게놈에 있는 프로필라그린 대립유전자의 정체를 뜻한다. 본 발명의 방법으로 시험되는 개체는 전형적으로는 포유류이다. 한 실시태양에서는, 포유류가 설치류일 수 있다. 다른 실시태양에서는 포유류가 사람일 수 있다. 이와 같이 본 발명의 방법으로 시험되는 개체는 이배체형이며 따라서 게놈 내에 프로필라그린 유전자 카피 두개를 포함한다. 어떤 개체가 두 개의 동일한 프로필라그린 유전자 카피를 가지면 그 개체는 그 대립유전자에 대해 동형접합이다. 어떤 개체가 두 개의 상이한 프로필라그린 유전자 카피를 가지면, 즉 하나가 다른 하나에 대한 다형이면, 그 개체는 그 대립유전자에 대해 이형접합이다. "소인"이라 함은 개체의 게놈에 어떤 개별 프로필라그린 대립유전자가 존재하는 것 또는 개체의 게놈 내에 존재하는 프로필라그린 대립유전자의 조합이 어떤 피부 상태와 연관되거나 그 피부 상태의 전조가 되는 것을 뜻한다.

본 명세서에서 사용하는 "피부 상태"라는 용어는 그 의미 내에 수분 보유, 물질 생산 또는 장벽 형성과 같은, 두피를 포함한 피부의 모든 물리적 매개변수를 포함한다. 한 실시태양에서는, "피부 상태"라는 용어가 건강한 수준의 NMF 생산을 유지하는 피부의 능력을 가리킨다. 따라서, 본 발명은 건강한 수준의 NMF 생산을 유지하는 데 대한 개인의 소인을 판정하는 방법을 제공한다. 달리 말하면, 본 발명은 NMF 생산 이상에 관련된 상태에 대한 개인의 감수성을 판정하는 방법을 제공한다. 전형적으로, NMF 생산 이상에 의해 유발되거나 악화되는 피부 상태는 건강한 피부에 의한 것보다 적은 NMF 생산에 의해 유발된다. 필라그린 및 NMF 생산 이상과 연관된 상태에는 심상성 어린선이 포함된다. 다른 한 실시태양에서는, "피부 상태"가 피부 건조를 말한다. 피부 건조 상태에는 노인성/폐경기후 건조증, 계면활성제 유발 건조증, 동절기 건조증, 일광화상이 포함된다. 다른 한 실시태양에서는, "피부 상태"가 비듬과 같은 두피의 상태를 말한다. 다른 한 실시태양에서는 "피부 상태"라는 용어가 세제 유발 홍반과 같은 홍반을 말한다.

따라서, 본 발명의 방법은 개인들을 그들의 피부 특성에 의해 분류하는 수단을 제공한다. 이것은 치료적 및 치료외적 응용 양쪽에서 유용할 수 있다. 한 실시태양에서, 본 발명의 방법은 치료적 응용을 위해 사용된다. 다른 한 실시태양에서는 본 발명의 방법이 치료외적 응용, 예컨대 화장품을 위해 사용된다.

본 발명의 방법의 치료적 응용에는 의학적인 피부 상태의 원인을 진단하는 수단이 포함된다. 따라서, 해당 의학적 피부 상태에 대한 치료 방법을 개인의 표현형을 보완하도록 맞출 수 있다. 본 발명의 방법의 치료적 응용에는 개인의 피부가 제약 제제, 예컨대 국소 도포되는 제약 제제에 대해 부작용을 일으키기 쉬운지를 판정하는 수단 역시 포함된다. 이 경우, 개인의 피부 상태에 대한 원치 않는 효과를 최소화하거나 피하는 한편으로 최대의 치료상 이익을 제공하기 위해 해당 개인을 특정한 제약 제제와 매치시킬 수 있다.

본 발명의 방법의 치료외적 응용에는 제제, 예를 들면 화장품 또는 기타 체내로 도입되는 임의의 형태의 제제를 위한 시험을 목적으로 개인을 분류하는 수단이 포함된다. 이것은 그러한 시험에서 얻어진 결과를 해석하는 데, 예컨대 시험 과정에서 서로 다른 개인의 피부의 반응이 균일하지 않은 경우에 유용할 수 있다. 반응의 비균일성은 개인들을 피부 상태에 대한 그들의 소인에 따라 분류하거나 계층화 구분함으로써 더 명확하게 해석될 수 있을지도 모른다. 당업자는 이 방법을 사용하면 일부 개인들에게 사용하기에는 적합하지만 다른 일부에게는 적합하지 않은 제제를 개발하는 것이 가능할 수 있음을 인식할 것이다. 따라서, 서로 다른 개인들에게 사용하는 데 적합성을 갖는 서로 다른 제제를 포함하는, 제제의 일단을조성할 수 있다. 시험을 거쳐, 그러한 제제를 사용하고 싶은 개인들은 본 발명의 방법을 이용하여 피부 상태에 대한 자신의 소인을 기초로 어떤 제제가 사용하기에 가장 적합한지 결정할 수 있다. 따라서 본 발명의 방법은 개인을 상기 열거한 것과 같은 개인 위생용품과 매치시킬 수 있게 한다.

개인의 프로필라그린 유전자형을 동정하는 방법은 그 개인에게서 얻은 생물학적 물질에 대해 수행한다. 바람직하게는, 상기 생물학적 물질은 동정 방법을 수행하기 전에 해당 개인에게서 분리한다. 달리 말하면, 전형적으로 상기 생물학적 물질은 생체외 상태이다. 이 생체외 물질을 상기 방법을 수행하기 전에 시험관내에서 추가로 배양할 수 있다.

생체외 시료는 신체의 임의의 부분에서 취한 조직 또는 세포를 포함할 수 있다. 바람직한 생체외 시료는 순환계에서 취한 물질, 또는 구강과 같은 체강에서 취한 물질을 포함할 수 있다. 특히 바람직한 생체외 시료는 타액 시료이다. 개인이 가진 대립유전자는 문헌 [Schie and Wilson (1997,Journal of Immunological Methods, 208, 91-101)]에 기재된 것과 같이 당업계에 공지된 방법을 사용하여 타액 시료로부터 확정할 수 있다.

따라서, 생체외 시료는 특수한 수집 수단을 사용할 필요 없이 개인에 의해 제공될 수 있다. 예를 들면, 타액 시료 또는 구강 면봉을 개인이 시험에 앞서 간단히 제출할 수 있다.

프로필라그린 유전자 및 단백질은 당업계에 잘 알려져 있으며, 상기한 문헌들과 문헌 [Gan 등 (1990,Biochemistry, 29, 9432-9440)]에 기재되어 있다. 다수의 프로필라그린 서열이 공중이 이용할 수 있는 데이터베이스에 기탁되어 있다.

프로필라그린 유전자는 여러 개의 필라그린 반복부, 통상 10, 11 또는 12 개의 반복부를 포함한다. 필라그린 반복부는 전형적으로 길이가 서로 같지만 (사람의 경우 972 bp, 324 아미노산), mRNA의 5'- 및 3'-말단에 있는 필라그린 반복부에 있어서는 덜 전형적인 경우이다. 필라그린 반복부는 같은 대립유전자 상의 반복부들 사이에, 그리고 상이한 대립유전자 사이에 전형적으로는 0-50％, 더 전형적으로는 2-30％, 더더욱 전형적으로는 10-15％의 상당한 서열 변동을 보일 수 있다. 통상 변동은 단일 염기 변경에 기인한 것이지만 전하의 변화가 관련되었을 수도 있다 (Gan 등 (1990)Biochemistry, 29, 9432-9440). 사람 필라그린 반복부의 공통 아미노산 서열 맵이 공지되어 있으며 (Gan 등 (1990)Biochemistry, 29, 9432-9440), 바람직하게는 필라그린 반복부는 공통 서열 또는 문헌[Gan 등 (1990,Biochemistry, 29, 9432-9440)]에 기재된 공통 서열의 변이체에 대해 50％ 이상, 더 바람직하게는 75％ 이상, 더 바람직하게는 90％, 더더욱 바람직하게는 95％ 이상의 서열 동일성을 보일 것이다. 보통은 아미노 및 카르복시 말단을 코딩하는 아미노산 서열이 더 보존적이며, 유전자의 코딩 영역에 인접한 5' 및 3' DNA 서열 역시 그러하다 (Presland 등 (1992)J Biol Chem, 267(33), 23772-23781).

개인의 게놈에 상이한 프로필라그린 대립유전자가 존재하는 것은 구조가 조금씩 다른 거대분자를 구별하는 당업계에 공지된 방법으로 확인할 수 있다. 본 명세서에서 프로필라그린과 관련하여 사용되는 "대립유전자"라는 용어는 다형태를 구성하는 임의의 프로필라그린 유전자를 말한다. 바람직한 실시태양에서, 프로필라그린과 관련하여 "대립유전자"라는 용어는 코딩하는 필라그린 반복부의 수에 의해 동정할 수 있는 프로필라그린 유전자를 말한다. 그러나, 당업자는 프로필라그린 유전자의 많은 다른 다형태가 가능하며 모든 프로필라그린 대립유전자가 본 발명의 범위 내에 포함된다는 것을 인식할 것이다. 예를 들면, 10, 11 또는 12 개의 필라그린 반복부를 갖는 프로필라그린을 코딩하는 프로필라그린 대립유전자를 가진 개인들 사이에서 관찰되는 상이한 표현형은 필라그린 생산의 차이에서 오는 직접적인 결과일 수 있다. 그러나 당업자는 필라그린 반복부의 수가 상이한 프로필라그린 대립유전자들에 존재하는, 또는 표피 분화 복합체 내의 다른 어떤 유전자에 존재하는 모종의 다른 서열 다형성에 대한 '표지'일 수도 있음을 인식할 것이다. 이와 같이, 표현형이 존재하는 필라그린 반복부의 수에 직접적으로 관련되지 않을 수도 있다. 따라서, 본 명세서에 기재된 방법이 임의의 프로필라그린 대립유전자들 간의 차이를 확인하는 데 적합할 것이며 본 발명이 필라그린 반복부의 수에 관한 다형성에 한정되지 않는다는 것을 이해하게 될 것이다.

접수번호 M60494는 사람 프로필라그린 유전자의 3' 단부를 확인시켜 주며 (또한 문헌[Gan 등 (1990,Biochemistry, 29, 9432-9440)]에 개시된 프로필라그린의 아미노 말단 서열임), 양쪽 EF-핸드, 인트론 2, N-말단 및 중간절단된 반복부 및 링커 2에서 끝나는 첫 번째 완전 필라그린 반복부를 포함한다.

접수번호 LO1089는 사람 프로필라그린 유전자의 엑손 2 - 3을 확인시켜 준다 (또한 문헌[Presland 등 (1992)J Biol Chem, 267(33), 23772-23781)]에 개시된 프로필라그린의 아미노 말단 서열임). 여기에는 EF-핸드 2 (EF-핸드 1은 엑손 1L01088에 있음), 중간절단된 반복부, 첫 번째 링커 및 첫 번째 완전 필라그린 반복부의 반 정도가 포함된다.

접수번호 AH003056은 프로필라그린의 카르복시 말단 서열을 확인시켜 주며 (문헌[Gan 등 (1990,Biochemistry, 29, 9432-9440)]에 게재된 M60501.1, M60502.1 및 M60503.1을 합친 것임), 마지막 완전 필라그린 반복부, 중간절단된 반복부, c-말단 및 폴리 A 꼬리를 포함한다.

전형적으로, 대립유전자는 폴리뉴클레오티드 수준에서, 예컨대 게놈 DNA 또는 mRNA의 분석에 의해 확인할 수 있다. 당업자는 여러 폴리뉴클레오티드의 존재 또는 부재를 확정하는 방법을 잘 알고 있다. 특정한 RNA 서열의 존재 또는 부재를 판정하는 공지된 방법에는 노던 블롯, 역전사와 PCR (RT-PCR) 및 리보뉴클레아제 보호 분석법 (Sambrook and Russell, (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 3rd edition, Cold Spring Harbour Laboratory Press, New York, USA) 등이 있다. 특정한 DNA 서열의 존재 또는 부재를 판정하는 공지된 방법에는 서던 블롯, 게놈 DNA의 PCR 증폭 및 제한효소 단편 길이 다형성(RFLP) 분석 등이 있다. 문헌[Sambrook and Russell (2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 3rd edition, Cold Spring Harbour Laboratory Press, New York, USA), Innis 등, (1995,PCR Strategies, Academic Press, Inc.: NY); Dieffenbach 등 (1995,PCR Primer: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Press)] 참조. DNA 서열 분석은 변성제가 들어있거나 없는 겔 중에서의 DNA 단편의 전기영동 이동성의 변화를 검출함으로써 이루어질 수도 있다. 차이는 고분해능 겔 전기영동에 의해가시화되거나 DNA 서열 융점 차이에 따라 구별될 수도 있다. 문헌[Myers 등 (1982,Science, 230, 1242) 등] 참조. 특정한 서열의 존재를 검출하는 방법에는 형광에 기초한 검출법과 같은 검출 기술, RIA 등 면역에 기초한 분석법, 웨스턴 블롯 분석법과 같은 항체 염색 또는 적절히 표지된 프로브를 이용한 제자리 혼성화 등이 포함된다.

관심대상 서열의 존재를 검출하는 데 사용하기에 적합한 프로브를 구성하는 데 유용한 서열에는 Blast 검색에 의할 때 공지된 프로필라그린 유전자 또는 그의 단편의 서열에 대해 약 50％ 이상, 바람직하게는 70％ 이상, 더 바람직하게는 80％ 이상의 서열 동일성 또는 상동성을 갖는 임의의 핵산 서열이 포함된다. "서열 동일성 백분율(％)" 또는 "서열 상동성 백분율(％)"은 서열들을 정렬하고 최대의 서열 동일성 백분율을 얻기 위해 필요하다면 갭을 도입한 후, 그러나 보존적 치환은 서열 동일성의 부분으로 고려하지 않을 때, 관심대상 서열의 핵산 잔기와 동일한 후보 서열의 핵산 잔기의 백분율로 정의된다. 서열 정렬을 수행하고 서열 동일성을 결정하는 방법은 당업계에 공지되어 있고, 과도한 실험 없이도 수행할 수 있으며,％ 동일성 값의 계산치는 예컨대 WU-BLAST-2와 같은 입수가능한 컴퓨터 프로그램을 이용하여 얻을 수 있다 (Altschul 등, 1996,Methods in Enzymology266,460-480). 경우에 따라서는 컴퓨터 소프트웨어 프로그램 (Blast 검색, MacVector 및 Vector NTI)의 고정된 기본 매개변수를 이용하여 정렬을 행할 수도 있다. 특정한 대립유전자의 제한효소 지도를 바탕으로 하여, 서던 블롯을 관심대상 서열을 인식하는 프로브와 혼성화시킬 때 밴드 패턴을 예측할 수 있다. 사용되는 혼성화 엄격도의 수준은 원하는 감도 수준, 특정한 프로브 특성, 예컨대 프로브 길이 및(또는) 어닐링 온도, 또는 프로브 서열과 관심대상 서열간의 상동성 정도에 따라서 달라질 수 있다. 따라서, 감도 및 특이성에 대한 고려가 특정한 분석에 요구되는 혼성화의 엄격도를 결정하게 된다.

혼성화 반응의 "엄격도"는 당업계의 숙련자에 의해 용이하게 결정될 수 있으며, 일반적으로 프로브 길이, 세척 온도 및 염 농도에 의존하는 실험적 계산치이다. 일반적으로, 프로브가 길면 적정 어닐링에 더 높은 온도가 요구되고, 프로브가 짧으면 더 낮은 온도가 필요하다. 혼성화는 대체로 변성된 DNA가 용융 온도보다 낮은 환경에서 상보적인 가닥이 존재할 때 재어닐링되는 능력에 의존한다. 프로브와 혼성화가능한 서열간의 희망하는 상동성의 정도가 높을수록 사용할 수 있는 상대적 온도가 더 높다. 혼성화 반응의 엄격도에 대한 추가의 세부사항 및 설명에 대해서는 문헌[Ausubel 등 (1995,Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers)] 또는 프로토콜 온라인 (URL: www.protocol-online.net/molbio/index.htm)을 참조한다.

본 명세서의 정의에 의하면 "엄격한 조건" 또는 "고엄격도"는 (1) 세척에 낮은 이온 강도 및 고온, 예컨대 65-70℃에서 0.1X SSC, 0.2％ SDS를 이용하는 것이라고 할 수 있다.

"중간 엄격한 조건"은 문헌[Sambrook and Russell (2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd edition)]에 기재된 것과 같다고 할 수 있으며, 상술한 것보다 덜 엄격한 세척 용액 및 혼성화 조건 (예, 온도, 이온 강도 및％ SDS)의 사용을 포함한다. 중간 엄격한 조건의 한 예는 58-65℃에서 0.2X SSC, 0.1％ SDS를 사용하는 것이다. 당업자는 프로브 길이, 프로브와 표적 부위 간의 상동성 정도 등과 같은 인자들에 맞추는 데 필요한 대로 온도, 이온 강도 등을 어떻게 조정하는지를 알 것이다. 따라서, 관심대상 서열뿐 아니라 관심대상 서열의 것에서 벗어나는 추가 또는 대체 프로브 서열 역시 관심대상 서열을 위해 스크리닝하는 데 유용하리라는 것이 예상된다.

바람직한 실시태양에서, 프로필라그린 대립유전자는 존재하는 필라그린 반복부의 수에 의해 확인된다. 그에 따라, 전형적으로, 개인의 게놈에 존재하는 프로필라그린 대립유전자를 동정하는 방법은 존재하는 대립유전자가 10개, 11개 아니면 12 개의 필라그린 반복부를 가졌는지를 파악하는 것을 포함한다.

한 바람직한 실시태양에서는, PCR을 이용하여 대립유전자 동정을 수행한다. 포워드 및 리버스 프라이머는 당업계에 공지된 기술을 이용하여 제조하며, 다형성 필라그린 반복부를 코딩하는 프로필라그린 유전자 코딩 영역의 서열에 대해 각각 상류 영역과 하류 영역에 기초한 서열을 포함한다. 바람직하게는, 프라이머 설계를 위해 선택된 상류 및 하류 영역은 상이한 대립유전자들 간에 실질적으로 보존되어 있을 것이다. "실질적으로 보존됨"은 그 의미에 최소 50％, 60％, 70％, 80％, 90％, 95％, 98％, 99％ 또는 100％의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 따라서, 예를 들어 축퇴성 프라이머를 사용하거나 프라이머 내에 이노신과 같이 상보성 면에서 특이성이 떨어지는 뉴클레오티드를 포함시킴으로써, 유사하지만 동일하지는 않은 서열에 결합하도록 프라이머를 설계할 수 있다. 포워드 및 리버스 프라이머 중 바람직하게는 하나, 또는 더 바람직하게는 둘 다가 각 프로필라그린 대립유전자의 상류 및(또는) 하류 영역과 100％ 동일하다.

상류 및 하류 프라이머는 공중이 이용할 수 있는 데이터베이스에 있는 서열로부터 유도할 수 있다. 예를 들면, 후술하는 실시예에 사용된 프라이머들 중 하나는 접수번호 LO1089가 지정하는 서열의 염기 3112-3132 (접수번호 M60494가 지정하는 서열의 염기 1530-1551의 균등물)에 의거하여 설계된 것이고 다른 쪽 프라이머는 접수번호 AH003056이 지정하는 서열의 염기 3341-3361에 의거하여 설계된 것이다.

이들 프라이머를 사용한 프로필라그린 대립유전자의 증폭에 의하면 코딩된 필라그린 반복부의 수에 따라 서로 다른 크기를 갖는 산물이 생성될 것이다. 반복부가 10 개인 대립유전자는 11,610 bp짜리 단편을 생성시켜야 하고, 반복부가 11 개인 대립유전자는 12,582 bp짜리 단편을 생성시켜야 하며, 반복부가 12 개인 대립유전자는 13,554 bp짜라 단편을 생성시켜야 하는 것으로 여겨진다. 따라서, 포워드 프라이머의 설계에 이용되는 바람직한 상류 영역은 적어도, 아미노 말단을 코딩하는 프로필라그린 유전자 영역 또는 이 유전자의 코딩 부분의 상류에 있는 5' DNA 서열의 일부이다. 바람직하게는, 포워드 프라이머의 서열은 5' GGA TGA AGC CTA TGA CACCAC 3'이다.

리버스 프라이머의 설계에 이용되는 바람직한 하류 영역은 적어도, 카르복시 말단을 코딩하는 프로필라그린 유전자 영역 또는 이 유전자의 코딩 부분의 하류에 있는 3' DNA 서열의 일부이다. 바람직하게는, 리버스 프라이머의 서열은 5' GACAG GAA AAG ATA ACT TCC C 3'이다.

개인에게서 채취한 시료에서 나온 생물학적 물질로부터 얻어진 DNA를 증폭시키기 위해 PCR 반응을 수행한다. 한 실시태양에서, 이 DNA는 상기 생물학적 물질로부터 추출한 게놈 DNA이다. 다른 한 실시태양에서는 이 DNA가 생물학적 물질로부터 추출된 RNA, 전형적으로는 mRNA로부터 역전사시킨 cDNA이다. 게놈 DNA를 추출하는 방법, RNA를 추출하는 방법, mRNA를 추출하는 방법 및 RNA의 역전사 방법은 당업계에 공지되어 있으니 예컨대 문헌[Sambrook and Russell (2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 3rd edition, Cold Spring Harbour Laboratory Press, New York, USA)]을 참조한다.

바람직한 실시태양에서, DNA는 게놈 DNA이고 시료는 타액 시료 또는 구강 면봉이다. 타액 시료나 구강 면봉으로부터 DNA를 추출하는 방법은 당업계에 공지되어 있다 (Schie and Wilson (1997)Journal of Immunological Methods, 208, 91-101).

PCR 반응은 당업계에 공지된 조건 하에서, 또는 시판되는 PCR 키트의 제조사에서 제안하는 대로 수행할 수 있다. 예를 들면, 0.1 내지 30 ㎍/ml의 DNA 기질을 사용하여 증폭을 행할 수 있다. 2 μM 내지 2 mM dNTP를 사용하여 증폭을 행할 수 있다. 2 μM 내지 2 mM의 포워드 및 리버스 프라이머를 사용하여 증폭을 행할 수 있다. 17 μM 내지 170 mM Mg²⁺를 사용하여 증폭을 행할 수 있다. 바람직한 실시태양에서는, 약 200 μM의 dNTP를 사용하여 증폭을 행한다. 바람직한 실시태양에서는, 약 200 μM의 포워드 및 리버스 프라이머를 사용하여 증폭을 행한다. 바람직한 실시태양에서는, 약 1.7 mM의 Mg²⁺를 사용하여 증폭을 행한다. "약"은 사용된 농도에 언급된 농도와 50％, 25％, 10％ 또는 5％ 이하의 차이가 있음을 뜻한다. 가장 바람직하게는, PCR 반응을 실질적으로 아래의 예시된 방법에서 설명된 대로 수행한다.

그 다음 PCR 생성물을 적절한 방법으로 분석할 수 있다. 전형적으로는, PCR 생성물을 크기 분별에 의해, 통상은 당업계에 공지된 기술에 의거하여 수행하는 겔 전기영동을 이용하여 분석한다 (문헌[Sambrook and Russell (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 3rd edition, Cold Spring Harbour Laboratory Press, New York, USA] 참조). 가장 바람직하게는, PCR 생성물을 실질적으로 아래의 예시된 방법에서 설명된 대로 분석한다.

개인의 게놈에 존재하는 프로필라그린 대립유전자를 동정하는 데 적합한 다른 방법으로는 대립유전자 특이적 혼성화, 대립유전자 특이적 올리고뉴클레오티드 혼성화 및 프라이머 특이적 연장 등이 있다.

대립유전자 특이적 혼성화에는 하나 이상의 프로필라그린 대립유전자의 한 영역과 중첩되며 다형성 영역을 둘러싼 약 5, 10, 20, 25 또는 30 뉴클레오티드를 갖는 프로브가 사용된다. 바람직한 실시태양에서는, 다른 프로필라그린 대립유전자에 특이적으로 혼성화할 수 있는 몇몇 프로브를 고상 지지체, 예컨대 "칩" (최대 약 250,000 개의 올리고뉴클레오티드를 고정할 수 있음)에 부착시킨다. 올리고뉴클레오티드는 리도그래피를 비롯한 다양한 방법에 의해 고상 지지체에 결합시킬 수 있다. "DNA 프로브 배열체"라고도 지칭되는, 올리고뉴클레오티드를 함유한 그러한 칩을 이용한 돌연변이 검출 분석법이 문헌[Cronin 등 (1996,Human Mutation7, 244)] 등에 기재되어 있다. 한 실시태양에서, 칩은 프로필라그린 유전자의 적어도 한 다형성 영역의 모든 대립유전자 변이형을 함유한다. 그 다음 고상 지지체를 시험 대상 핵산과 접촉시키고, 특이적 프로브에 대한 혼성화를 검출한다. 따라서, 하나 이상의 유전자의 수많은 대립유전자 변이형의 정체를 간단한 혼성화 실험에서 확인할 수 있다.

이들 기술은 또한 분석에 앞서 핵산을 증폭시키는 단계를 포함할 수도 있다. 증폭 기술은 당업자에게 공지되어 있으며, 클로닝, 중합효소 연쇄 반응 (PCR), 특정 대립유전자의 중합효소 연쇄 반응 (ASA), 리가아제 연쇄 영역 (LCR), 2 단계 내부 (nested) 중합효소 연쇄 반응, 자가 유지 서열 복제 (Guatelli 등 (1990)Proc Natl Acad Sci USA87, 1874-1878), 전사 증폭 시스템 (Kwoh 등 (1989)Proc Natl Acad Sci USA86, 1173-1177), 및 Q-베타 레플리카제 (Lizardi (1988)Bio/Technology6, 1197)를 포함하나 그에 한정되지는 않는다.

증폭 산물은 크기 분석, 제한효소 소화에 이은 크기 분석, 반응 생성물 중의 특정한 표지된 올리고뉴클레오티드 프라이머의 검출, 대립유전자 특이적인 올리고뉴클레오티드 (ASO) 혼성화, 대립유전자 특이적인 5' 엑소뉴클레아제 검출, 서열결정, 혼성화 등을 포함한 다양한 방식으로 분석할 수 있다.

예시적인 실시태양에서, 프로필라그린 대립유전자를 동정하는 방법은 (i) 개인에게서 수집한 시료의 세포로부터 핵산 (예, 게놈 핵산, RNA 또는 둘 다)을 단리하는 단계, (ii) 혼성화 및 대립유전자의 다형성 영역의 증폭이 일어나도록 하는 조건 하에서 프로필라그린 대립유전자에 있는 하나 이상의 다형성 부분의 5' 및 3' 쪽에 특이적으로 혼성화하는 하나 이상의 프라이머와 핵산 시료를 접촉시키는 단계 및 (iii) 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함한다. 이러한 검출 방안은 핵산 분자가 아주 낮은 수로 존재하는 경우 그러한 분자의 검출에 특히 유용하다.

프로필라그린의 대립유전자는 제한효소 절단 패턴의 변화에 의해 동정할 수 있다. 예를 들면, 시료 및 대조용 DNA를 단리하고, 증폭 (경우에 따라)시키고 하나 이상의 제한 엔도뉴클레아제로 소화시킨 다음 단편의 길이를 겔 전기영동 등에 의해 측정한다.

또다른 실시태양에서는, 당업계에 공지된 다양한 서열결정 반응 중 임의의 것을 이용하여 대립유전자를 직접적으로 서열결정한다. 예시적인 서열결정 반응에는 Maxim 및 Gilbert (1997,Proc Natl Acad Sci USA74, 560) 또는 Sanger 등 (1977,Proc Nat Acad Sci USA74, 5463)이 개발한 기술에 기초한 것들이 포함된다. 대상 분석을 수행할 때 다양한 자동화된 서열결정 절차들 중 임의의 것을 활용할 수 있다는 것도 고려되는데 (Biotechniques(1995) 19, 448 등 참조), 여기에는 질량 분광분석법에 의한 서열결정 (예, 국제특허공개 제94/16101호; Cohen 등 (1996) Adv Chromatogr 36, 127-162; 및 Griffin 등 (1993)Appl Biochem Biotechnol38, 147-159)도 포함된다. 일부 실시태양에서는 서열결정 반응에서 하나, 둘 또는 세 가지의 핵산 염기의 존재상태만을 확정하면 된다는 것이 당업자에게 자명해질 것이다. 예를 들면, 한 가지 핵산만을 검출하는 경우 예컨대 A-트랙 등을 확인할 수 있다.

프로필라그린 대립유전자는 절단제 (예컨대 뉴클레아제, 히드록실아민 또는 오스뮴 테트록사이드 및 피페리딘)를 사용하여 RNA/RNA 또는 RNA/DNA 또는 DNA/DNA 헤테로이중가닥 핵산의 짝이 맞지 않는, 즉 미스매치된 염기를 검출함으로써 동정할 수 있다 (Myers 등 (1985)Science230, 1242). 일반적으로, "미스매치 절단"이라는 기법은 야생형 대립유전자를 포함하고 있는 (표지된) RNA 또는 DNA를 시료와 혼성화시킴으로써 형성된 헤테로이중가닥 핵산을 제공하는 것으로 시작한다. 두 가닥으로 된 이중가닥 핵산을, 대조용과 시료 가닥 간의 염기쌍 미스매치로 인해 존재하게 되는 것과 같은 이중가닥 핵산의 한 가닥으로 된 영역을 절단하는 제제로 처리한다. 예를 들면, RNA/DNA 이중가닥 핵산은 RNase로, 그리고 DNA/DNA 혼성체는 S1 뉴클레아제로 처리하여 미스매치된 영역을 효소적으로 소화시킬 수 있다. 다른 실시태양에서는, 미스매치된 영역을 소화시키기 위해 DNA/DNA 또는 RNA/DNA 이중가닥을 히드록실아민 또는 오스뮴 테트록사이드, 및 피페리딘으로 처리할 수 있다. 미스매치된 영역의 소화 후, 얻어지는 물질을 이어서 크기에 의해, 예를 들면 변성 폴리아크릴아미드 겔을 사용하여 분리시켜 돌연변이 부위를 확인한다. 예를 들면, 문헌[Cotton 등 (1988)Proc Natl Acad Sci USA85, 4397; 및 Saleeba 등 (1992)Methods Enzymol217, 286-295] 참조. 바람직한 한 실시태양에서는, 검출을 위해 대조 DNA 또는 RNA에 표지를 할 수 있다.

또다른 실시태양에서는, 미스매치 절단 반응에 이중 가닥 DNA에 있는 미스매치된 염기쌍을 인식하는 한 가지 이상의 단백질 (이른바 "DNA 미스매치 복구" 효소)를 이용한다. 예를 들면, 대장균의 mutY 효소는 G/A 미스매치의 A를 절단하고, HeLa 세포에서 유래한 티미딘 DNA 글리코실라제는 G/T 미스매치의 T를 절단한다 (Hsu 등. (1994)Carcinogenesis15, 1657-1662). 예시적인 한 실시태양에 따르면, 선택된 프로필라그린 대립유전자에 기초한 프로브를 시험 세포에서 나온 cDNA 또는 다른 DNA 산물과 혼성화시킨다. 이 이중가닥 핵산을 DNA 미스매치 복구 효소로 처리하고, 절단 산물이 있으면 전기영동 프로토콜 등을 통해 검출할 수 있다. 미국특허 제5,459,039호 등 참조.

대립유전자를 검출하는 다른 기술의 예는 선택적 올리고뉴클레오티드 혼성화, 또는 선택적 프라이머 연장법을 포함하나, 여기에 한정되지는 않는다. 예를 들면, 공지된 돌연변이 또는 뉴클레오티드 차이 (예, 대립유전자 변이체에서 보이는 것)가 중앙 부분에 위치하는 올리고뉴클레오티드 프라이머를 제조한 다음 완전한 매치가 이루어지는 경우에만 혼성화를 허용하는 조건 하에서 표적 DNA에 혼성화시킬 수 있다 (Saiki 등 (1986)Nature324, 163; Saiki 등 (1989)Proc Natl Acad Sci USA86, 6230). 그러한 대립유전자 특이적 올리고뉴클레오티드 혼성화 기법은 올리고뉴클레오티드를 PCR 증폭된 표적 DNA에 혼성화시킬 때 한 반응 당 하나의 돌연변이 또는 다형성 영역을 시험하거나, 올리고뉴클레오티드를 혼성화 멤브레인에 부착시키고 표지된 표적 DNA와 혼성화시킬 때 다수의 상이한 돌연변이 또는 다형성 영역을 시험하는 데 사용할 수 있다.

다른 한 실시태양에서는, 프로필라그린 대립유전자의 동정을 미국특허제4,998,617호 및 문헌[Landegren 등 (1988,Science241, 1077-1080)]에 기재된 바와 같이 올리고뉴클레오티드 연결(ligation) 분석법 (OLA)을 이용하여 수행할 수 있다. OLA 프로토콜은 표적의 한 단일 가닥의 인접해 있는 서열들에 혼성화할 수 있도록 설계된 두 가지 올리고뉴클레오티드를 사용한다. 이들 올리고뉴클레오티드 중 하나는 분리 표지자에 연결, 예컨대 비오티닐화되어 있으며, 나머지 하나는 검출가능하게 표지되어 있다. 표적 분자에서 정확한 상보적 서열이 발견되면, 이들 올리고뉴클레오티드는 서로의 말단끼리 인접하도록 혼성화하여 연결 기질을 생성할 것이다. 이후 연결 반응을 거치면, 표지된 올리고뉴클레오티드를 아비딘 또는 다른 비오틴 리간드를 이용하여 회수할 수 있다. 니커슨 (Nickerson) 등은 PCR과 OLA의 속성을 결합시킨 핵산 검출 분석법을 기술한 바 있다 (Nickerson 등 (1990)Proc Natl Acad Sci USA87, 8923-27). 이 방법에서는, PCR을 이용하여 표적 DNA를 지수적으로 증폭시키고, 이어서 OLA를 이용하여 표적 DNA를 검출한다.

이 OLA법을 기초로 한 몇 가지 기술이 개발되어 있으며, 프로필라그린 대립유전자 검출에 사용할 수 있다. 예를 들면, 미국특허 제5,593,826호에는 3'-아미노기를 가진 올리고뉴클레오티드와 5'-포스포릴화된 올리고뉴클레오티드를 사용하여 포스포르아미데이트 연결부를 가진 콘쥬게이트를 형성하도록 하는 OLA가 개시되어 있다. 문헌[Tobe 등 (1997,Nucleic Acids Res24, 3728)]에 기재된 OLA의 다른 변형에서는, PCR과 연계한 OLA를 통해 한 개의 마이크로타이터 웰에서 두 가지 대립유전자를 확인해낼 수 있다. 대립유전자 특이적인 프라이머 각각을 독특한 합텐, 즉 디곡시제닌 및 플루오레세인으로 표지함으로써, 상이한 효소 리포터인 알칼린 포스파타제 또는 고추냉이 퍼옥시다제로 표지한 합텐 특이적 항체를 사용하여 각각의 OLA 반응을 검출할 수 있다. 이 방식은 두 가지 상이한 색이 생성되게 하는 고처리량 방식을 이용하여 두 가지 대립유전자의 검출이 가능하게 한다.

개인의 프로필라그린 유전자형이 확정되었으면, 개인을 어떤 피부 상태에 대한 소인이 높거나 낮은 것으로 분류할 수 있다. 그러므로 본 발명의 방법은 피부 상태에 대한 개인의 소인을 판정하기 위하여 개인의 프로필라그린 유전자형을 동정하는 데 사용할 수 있다. 따라서, 본 발명은 개인에게서 채취한 시료의 게놈에 존재하는 프로필라그린 대립유전자를 동정하는 수단을 포함하는, 피부 상태에 대한 개인의 소인을 판정하는 시스템을 제공한다.

한 실시태양에서, 본 발명은 다형태를 포함하는 프로필라그린 유전자 영역을 증폭하는 데 사용하기 위한 프라이머의 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 바람직한 실시태양에서, 프라이머는 5' GGA TGA AGC CTA TGA CACCAC 3' 또는 5' GA CAG GAA AAG ATA ACT TCC C 3'이다.

본 발명은 또한 피부 상태에 대한 개인의 소인을 판정하는 상기한 방법에 관련된 본 발명의 프라이머의 용도를 제공한다. 그에 따라, 상기한 바와 같은 PCR 프라이머 및 혼성화용 올리고뉴클레오티드를 포함하는 키트 및 분석 성분은 본 발명의 또다른 일면을 이룬다.

본 발명의 프라이머 키트는 중합효소 연쇄 반응을 이용하여 프로필라그린 대립유전자를 동정하는 데 유용하다. 이 키트는 유전자 자체의 DNA 합성을 증폭시키는 것을 프라이밍하기 위해 관련된 염색체 상의 프로필라그린 유전자 내에 있거나둘레에 있으며 다형성 부위에 인접한 서열에 어닐링시킬 수 있는 단일 가닥 DNA 프라이머쌍 조합을 포함한다. 완전한 조합은 프로필라그린 대립유전자 코딩 서열, 즉 엑손의 뉴클레오티드 전부의 합성을 허용할 수도 있고, 전체 코딩 영역에 미치지 못하는 것의 합성을 허용할 수도 있다. 프라이머 조합은 바람직하게는 인트론과 엑손 서열 모두의 합성을 허용하는 것인데, 이는 대립유전자성 변이가 프로필라그린 유전자 인트론에서 발견될 수도 있기 때문이다. 키트에는 DNA 중합효소, 바람직하게는 호열성 DNA 중합효소, 더 바람직하게는 Taq 중합효소, 더더욱 바람직하게는 에롱가제 (Elongase) (GIBCOBRL Life Technologies) 및 적합한 반응 완충액도 들어갈 수 있다. 이러한 구성품들은 당업계에 공지되어 있다.

증폭된 서열의 후속적인 클로닝을 용이하게 하기 위해, 프라이머의 5' 말단에 제한효소 부위가 부가되도록 할 수 있다. 그러므로, 제한효소 부위를 형성하는 데 필요한 소수의 뉴클레오티드를 제외하면 프라이머의 모든 뉴클레오티드는 프로필라그린 유전자 서열 또는 이 유전자에 인접한 서열에서 유래한 것이다. 그러한 효소 및 부위는 당업계에 공지되어 있다. 프라이머 자체는 당업계에 공지된 기술을 사용하여 합성할 수 있다. 일반적으로, 프라이머는 시판되는 합성 기계를 사용하여 만들 수 있다. 당업계에 공지된 프로필라그린 대립유전자성 변이의 서열이 주어지면, 구체적인 프라이머의 설계는 당업계의 기술수준으로 충분히 가능하다.

본 발명의 키트는 경우에 따라 개인 위생용품, 예컨대 특정한 프로필라그린 유전자형을 가진 개인에게 사용하기에 적합한 상술한 바와 같은 화장품 제제를 더 포함한다.

본 발명에 따른 키트의 한 예는 핵산 단리 수단, 예컨대 QIAamp DNA Blood Midi 키트 또는 Epicentre BuccalAmp 키트 및 원심분리기와 같은 관련 장비, 분광광도계와 같은 DNA 정량 수단, DNA 증폭기와 같은 PCR 반응 수행 수단 및 겔 전기영동 키트와 같은 PCR 생성물 분석 수단을 포함할 수 있다. 그러나 이들 품목 중 다수 또는 전부가 분자생물학 실험실에서는 쉽게 입수할 수 있는 것일 터이다. 따라서, 본 발명에 따른 키트는 최종 농도 200 μM로 희석하기에 적합한 dNTP, 한 쌍의 올리고뉴클레오티드 프라이머, 예컨대 5' GGA TGA AGC CTA TGA CACCAC 3' 및 5' GA CAG GAA AAG ATA ACT TCC C 3', Mg²⁺최종 농도 1.7 mM로 희석하기에 적합한 염화마그네슘 용액 및 에롱가제 (GIBCOBRL Life Technologies)와 같은 열안정성 DNA 중합효소를 포함할 수 있다. 이 키트는 구성품의 사용설명서를 더 포함할 수 있고, 따라서 다음과 같은 PCR 싸이클의 수행을 위한 설명서를 포함할 수 있다.

반응물을 94℃로 5 분간 가열

에롱가제 반응 혼합물을 1/50 희석으로 첨가 (고온 시작)

아래 프로그램 시작:

5 분 94℃1 싸이클

30초 94℃ ┒

30 초 57℃ ┣35 싸이클

12 분 68℃ ┛

침지 4℃

본 발명의 키트는 PCR 생성물과의 비교 및 PCR 생성물의 크기 파악을 위해 기지의 크기를 가진 폴리뉴클레오티드를 더 포함할 수 있다. 그러한 폴리뉴클레오티드는 예를 들면 연장 사다리형 표지자 (GIBCO-BRL에서 제조하는 것과 같은 것) 또는 기존에 동정된 변이체를 포함하고 있는 기준 게놈 DNA일 수 있다.

본 발명은 또한 특정한 프로필라그린 유전자형을 가진 개인에게 사용하기에 적합한 화장품 제제를 확인하기 위해 상술한 방법으로 개인의 프로필라그린 유전자형을 판정하는 단계와 그렇게 확인된 화장품 제제를 그 개인에게 사용하는 단계를 포함하는 미용 처치 방법을 상정한다. 화장품 제제의 사용은 보통의 방식으로 사용하는 것을 뜻한다. 전형적으로, 이것은 개인의 피부 또는 두피에 국소 도포하는 것을 뜻할 것이다. 화장품 제제는 상술한 임의의 제제일 수 있다.

본 발명은 또한 개인의 표피 내의 프로필라그린 대립유전자의 유형 및(또는) 이용가능성에 영향을 미침으로써 피부 상태를 치료하는 방법을 상정한다. 이것은 프로필라그린 대립유전자형 또는 그의 변이체 또는 단편의 서열을 포함하고 있는 폴리펩티드를 투여함으로써 이루어질 수 있다. 이것은 또한 프로필라그린 대립유전자형 또는 그의 변이체 또는 단편을 코딩하는 서열을 포함하고 있는 폴리뉴클레오티드를 투여함으로써 이루어질 수도 있다. 그러므로 본 발명은 개인의 표피 내 NMF 생산을 변화시키는, 바람직하게는 증가시키는 방법을 상정한다. 본 발명은 또한 피부 건조 및(또는) 세제 유발 홍반을 치료하는 방법 역시 상정한다. 본 발명은 또한 비듬 치료 방법도 상정한다. 상기한 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드를 화장품 제제와 배합하여 그 화장품의 유익한 효과를 증강시키거나 그 화장품의 바람직하지 않은 효과를 완화시키도록 할 수 있다. 따라서, 바람직한 실시태양에서, 본 발명의 방법은 프로필라그린 생산을 증가시킬 수 있다.

바람직하게는, 생산되는 프로필라그린 대립유전자는 필라그린 반복부를 12 개 가진다.

"단편" 및 "변이체"는 그 의미에 프로필라그린 또는 그의 돌연변이 형태에 특이적으로 결합하게 되는 항체를 제조하는 데 유용한 폴리펩티드를 포함한다. 필라그린 반복부에 서열 차이가 발생한다는 것은 공지되어 있다 (Gan 등 (1990)Biochemistry, 29, 9432-9440).

프로필라그린 "변이체"는 그 의미에 하나 이상의 위치에 아미노산 삽입, 결실, 또는 보존적 또는 비보존적 치환이 이루어진 폴리펩티드를 포함하되, 그러한 변화가 결합 활성 (유형 및 친화도), 열안정성, 특정 pH 범위에서의 활성 (pH 안정성) 등의 기본적 속성이 현저히 달라지지 않은 단백질로 이어지는 경우로 한정한다. 이 맥락에서 "현저히"는 당업자들이 변이체의 속성이 원래 단백질의 속성에 비추어 다를 수는 있지만 비자명하지는 않을 거라고 할 것임을 뜻한다. "보존적 치환"이라 함은 다음과 같은 조합을 말하려는 것이다: Gly, Ala; Val, Ile, Leu; Asp, Glu; Asn, Gln; Ser, Thr; Lys, Arg; 및 Phe, Tyr.

"단편"은 온전한 폴리펩티드의 100％에 못미치는 것이다. 예를 들면, 온전한 프로필라그린 단백질의 99％, 98％, 95％, 90％, 80％, 60％, 40％, 30％, 25％ 또는 20％ 이상이다.

당업자들은 본 발명의 폴리펩티드를 공지된 폴리펩티드 수식 기술로 수식할수 있다는 것을 인식할 것이다. 이들 기술에는 본 명세서에 포함시키기로 하는, 스티븐스(Stevens)에게 1981년 11월 24일자로 허여된 미국특허 제4,302,386호에서 개시된 기술이 포함된다. 그러한 수식은 항원의 면역원성을 변경, 바람직하게는 증강시킬 수도 있고, 그러한 면역원성에 아무런 영향을 미치지 않을 수도 있다. 예를 들면, 소수의 아미노산 잔기를 변경할 수 있다.

다른 경우로, 폴리펩티드의 항원성 부분에 해당하는 더 작은 폴리펩티드들을 당업계에 공지된 방법에 의해 화학적으로 합성할 수 있다. 이들 방법에는 본 명세서에 포함시키기로 하는, 골드버그(Goldberg)에게 1981년 9월 22일자로 허여된 미국특허 제4,290,944호에서 개시된 기술이 포함된다.

따라서, 본 발명의 방법에 사용하기 위한 폴리펩티드에는 본 발명의 범위 내에 있는 기원, 구조 및 면역원성이라는 공통의 요소를 가진, 합성에 의해 얻어진 폴리펩티드 또는 원래 폴리펩티드의 단편을 비롯한 한 부류의 수식된 폴리펩티드가 포함된다.

본 발명의 방법에 사용하기 위한 단리된 폴리뉴클레오티드는 본 발명의 방법에 사용하기 위한 프로필라그린 유전자 또는 상술한 그의 변이체 또는 단편을 코딩하는 서열을 포함하고 있을 수 있다. 본 명세서에서, "단리된"이라는 용어는 유전자가 적어도 그 유전자가 위치하는 사람 염색체의 대부분으로부터 격리되어 있다는 것을 뜻하며, 달리 말하면 유전자가 기존에 존재해왔던 형태로 있는 것이 특허청구되지 않았다는 것이다. 따라서, 본 발명의 유전자에는 그 유전자가 세균 벡터, 예컨대 플라스미드, 또는 바이러스 벡터, 예컨대 박테리오파지 내로 클로닝되었을 때의 유전자가, 그러한 클론이 관련된 염색체의 DNA 라이브러리를 구성하는 클론들로부터 격리되어 있다는 것을 조건으로 포함된다.

"유전자"는 통상적으로 그 발현을 제어하는 프로모터 및(또는) 기타 발현 조절 서열을 포함할 수 있으며, 인트론을 포함할 수도 있고, 코딩 서열만으로, 예컨대 cDNA 서열로 이루어질 수도 있다.

이와 다른 경우로, 안티센스 폴리뉴클레오티드를 본 발명의 방법에 사용할 수 있다. 안티센스 폴리뉴클레오티드는 상보적인 핵산 서열에 특이적으로 결합할 수 있는 단일 가닥 핵산이다. 적합한 표적 서열에 결합하면 RNA-RNA, DNA-DNA, 또는 RNA-DNA 이중가닥이 형성된다. 이러한 핵산은 흔히 "안티센스"라고 명명되는데, 그 이유는 이들 핵산이 유전자의 센스 또는 코딩 가닥에 대해 상보적이기 때문이다. 최근, 삼중 나선의 형성이 가능한 것으로 증명되었는데, 이것은 폴리뉴클레오티드가 DNA 이중가닥에 결합되어 있는 것이다. 폴리뉴클레오티드가 DNA 이중 나선의 큰 홈에 있는 서열을 인식할 수 있다는 것이 밝혀졌다. 그에 따라 삼중 나선이 형성되었다. 이것은 큰 홈의 수소결합 부위 인식을 통해 두 가닥 DNA에 특이적으로 결합하는 서열 특이적 분자를 합성하는 것이 가능함을 시사한다.

프로필라그린 표적 핵산에 결합함으로써, 상기 폴리뉴클레오티드는 표적 핵산의 기능을 저해할 수 있다. 이것은 예를 들면 전사, 프로세싱, 폴리(A) 부가, 복제, 번역을 차단하거나, RNA 분해를 촉진하는 등 세포의 저해 기전을 증진시킨 결과일 수 있다.

안티센스 폴리뉴클레오티드는 실험실에서 제조한 다음 미세주입 또는 세포배양 배지에서 세포 내로의 흡수 등에 의해 세포 내로 도입시킬 수도 있고, 그렇지 않으면 안티센스 유전자를 담은 플라스미드 또는 레트로바이러스 또는 기타 벡터로 트랜스펙션 후 세포에서 발현시킨다. 안티센스 폴리뉴클레오티드는 처음에 라우스 육종 바이러스, 수포성 구내염 바이러스, 대상포진 바이러스 제I형, 유인원 바이러스 및 인플루엔자 바이러스의 세포 배양에서 바이러스의 복제 또는 발현을 저해하는 것으로 밝혀졌다. 그 이후, 안티센스 폴리뉴클레오티드에 의한 mRNA 번역의 저해가 토끼 망상적혈구 용해물 및 맥아 추출물을 비롯한 무세포 시스템에서 광범위하게 연구되어왔다. 안티센스 폴리뉴클레오티드에 의한 바이러스 기능의 저해는 AIDS HIV 레트로바이러스 RNA에 상보적인 폴리뉴클레오티드를 사용하여 시험관 내에서 입증되었다 (Goodchild, J. 1988 "Inhibition of Human Immunodeficiency Virus Replication by Antisense Oligodeoxynucleotides", Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 85(15), 5507-11). 굿챠일드(Goodchild)의 연구는 가장 효과적이었던 폴리뉴클레오티드가 폴리(A) 신호에 상보적이었고, RNA의 5' 말단, 특히 프라이머 결합 부위 바로 다음 및 프라이머 결합 부위에 있는 캡 및 5' 미번역 영역을 표적으로 한 것들 역시 효과적이었음을 보여주었다. 캡, 5' 미번역 영역, 및 폴리(A) 신호는 레트로바이러스 RNA의 말단에서 반복되는 서열 (R 영역) 내에 놓여있으며, 이들에 대해 상보적인 폴리뉴클레오티드는 RNA에 두 번 결합할 수 있다.

전형적으로, 안티센스 폴리뉴클레오티드는 길이가 15 내지 35 염기이다. 예를 들면, 20-mer 폴리뉴클레오티드가 표피 성장 인자 수용체 mRNA의 발현을 저해하는 것으로 밝혀진 바 있고 (Witters 등,Breast Cancer Res Treat53:41-50(1999)), 25-mer 폴리뉴클레오티드가 부신피질자극 호르몬의 발현을 90％ 넘게 감소시키는 것으로 밝혀진 바 있다 (Frankel 등,J Neurosurg91:261-7 (1999)). 그러나, 길이가 상기한 범위에서 벗어나는, 예를 들면 10, 11, 12, 13, 또는 14 염기, 또는 36, 37, 38, 39 또는 40 염기인 폴리뉴클레오티드를 사용하는 것이 좋을 수도 있다는 것이 인정된다.

상기한 폴리펩티드 및 폴리뉴클레오티드 또는 그 제제는 피부 상태가 있는 부위에 국소도포로, 경구로, 또는 비경구 (예, 피하 또는 근육내) 주사로 하는 것을 비롯하여 임의의 통상적인 방법으로 투여할 수 있다. 치료는 1회 투여 또는 일정 기간에 걸친 복수 회의 투여로 이루어질 수 있다.

폴리뉴클레오티드는 전신투여할 수 있다. 다른 방법으로는, 폴리뉴클레오티드의 이용가능성을 생체 내 의도하는 부위로 제한함으로써 염기쌍 형성의 특징을 나타내는 폴리뉴클레오티드의 고유한 결합 특이성을 증강시켜 더 낮은 용량을 사용할 수 있고 전신 효과를 최소화한다. 따라서, 원하는 효과를 얻기 위해 폴리뉴클레오티드를 국소 도포할 수 있다. 원하는 부위에서의 폴리뉴클레오티드 농도는 폴리뉴클레오티드를 전신투여하는 경우보다 훨씬 높고, 현저히 낮은 총량을 사용하여 치료 효과를 얻을 수 있다. 국소에서의 높은 폴리뉴클레오티드 농도는 표적으로 삼은 세포에 대한 침투를 증진시키며 표적 핵산 서열의 번역을 효과적으로 차단한다.

폴리뉴클레오티드는 약물의 집중 투여에 적합한 임의의 수단에 의해 특정 부위로 전달될 수 있다. 예를 들면, 폴리뉴클레오티드의 용액을 특정 부위에 직접주사할 수도 있고, 관주 펌프를 이용하여 관주에 의해 전달할 수도 있다. 폴리뉴클레오티드는 원하는 부위에 인접한 곳에 넣어 두면 폴리뉴클레오티드가 주변의 작용 부위로 방출되도록 하는 이식용 장치 내에 넣을 수도 있다.

폴리뉴클레오티드는 하이드로겔 물질을 통해 투여할 수도 있다. 하이드로겔은 염증유발성이 없고 생분해성이다. 천연 및 합성 중합체로부터 만들어진 것을 비롯하여 그러한 재료가 현재 많이 알려져 있다. 바람직한 한 실시태양에서, 이 방법은 체온보다 낮은 온도에서는 액체이나 체온 또는 그 부근에서는 겔화하여 형상을 유지하는 반고상 하이드로겔을 형성하는 하이드로겔을 이용한다. 바람직한 하이드로겔은 에틸렌 옥사이드-프로필렌 옥사이드 반복 단위로 된 중합체이다. 중합체의 성질은 중합체의 분자량과 중합체 내의 폴리에틸렌 옥사이드 및 폴리프로필렌 옥사이드의 상대 백분율에 달려있다. 바람직한 하이드로겔은 약 10 내지 약 80 중량％의 에틸렌 옥사이드와 약 20 내지 약 90 중량％의 프로필렌 옥사이드를 함유한다. 특히 바람직한 하이드로겔은 약 70％의 폴리에틸렌 옥사이드와 30％의 폴리프로필렌 옥사이드를 함유한다. 사용할 수 있는 하이드로겔은 예컨대 미국 뉴저지주 파시파니 소재 BASF Corp.사로부터 상표명 Pluronic(등록상표)으로 구입할 수 있다.

이 실시태양에서는, 하이드로겔을 액체 상태로 냉각하고, 올리고뉴클레오티드를 이 액체에 하이드로겔 1 g 당 폴리뉴클레오티드 약 1 mg의 농도로 첨가혼합한다. 그 다음, 생성된 혼합물을 수술 도중에 분무하거나 발라서, 또는 카테터 또는 내시경 방식을 이용하는 등으로 치료할 표면 상에 도포한다. 중합체는 따뜻해짐에따라 고형화되어 겔을 형성하고, 겔의 정확한 조성에 의해 규정되는 기간에 걸쳐 폴리뉴클레오티드가 겔 밖으로 확산되어 주위의 세포 내로 들어간다.

폴리뉴클레오티드는 시판되거나 과학 문헌에 설명되어 있는 다른 이식물, 예컨대 리포좀, 마이크로캡슐 및 이식용 장치를 이용하여 투여할 수 있다. 예를 들면, 폴리무수물, 폴리오르토에스테르, 폴리락트산 및 폴리글리콜산 및 그의 공중합체, 콜라겐 및 단백질 중합체와 같은 생분해성 재료 또는 에틸렌 비닐 아세테이트 (EVA), 폴리비닐 아세테이트, 에틸렌 비닐 알콜 및 그의 유도체와 같은 비생분해성 재료로 만들어진 이식물을 사용하여 폴리뉴클레오티드를 국소적으로 전달할 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 재료가 중합되거나 고형화될 때 용융 또는 용매 증발 기술을 이용하여 재료 내에 도입시키거나, 재료와 기계적으로 혼합할 수 있다. 한 실시태양에서는, 폴리뉴클레오티드를 덱스트란 코팅된 실리카 비드와 같은 이식용 장치, 스텐트 또는 카테터의 코팅 중에 혼합하거나 코팅 상에 도포한다.

폴리뉴클레오티드의 투여 용량은 폴리뉴클레오티드의 크기 및 투여 목적에 달려있다. 일반적으로, 그 범위는 치료할 조직의 표면적을 기초로 산출한다. 폴리뉴클레오티드의 유효량은 폴리뉴클레오티드의 길이 및 화학 조성에 다소 의존하지만 일반적으로 조직 표면적 1 cm²당 약 30 내지 3000 ㎍ 범위이다.

폴리뉴클레오티드는 미용, 치료 및 예방 목적으로 전신투여할 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 임의의 효과적인 방법으로, 예를 들면 비경구로 (예, 정맥내로, 피하로, 근육내로), 또는 경구, 비내, 또는 올리고뉴클레오티드가 환자의 혈류에도달하고 순환하는 것을 허용하는 다른 수단으로 투여할 수 있다. 전신투여되는 폴리뉴클레오티드는 바람직하게는 국소투여되는 폴리뉴클레오티드에 부가적으로 주어지지만, 국소 투여가 없는 경우에도 유용성을 가진다. 성인 1회 투여 당 약 0.1 내지 약 10 g 범위의 단위투여량이 이 목적에 일반적으로 효과적일 것이다.

안티센스 제제에는 상기 프로필라그린 mRNA 또는 유전자에 결합하여 상기 프로필라그린 mRNA 또는 유전자의 발현을 실질적으로 방지하고 상기 프로필라그린 단백질의 발현을 실질적으로 방지하는 더 큰 분자도 포함된다는 것을 알 수 있을 것이다. 따라서, 상기 프로필라그린 mRNA에 실질적으로 상보적인 안티센스 분자의 발현은 본 발명의 일부로 파악된다.

상기한 더 큰 분자는 아래에 설명된 것과 같은 임의의 적절한 유전자 구조물로부터 발현되고 환자에게 전달될 수 있다. 전형적으로는, 상기 안티센스 분자를 발현하는 유전자 구조물은 적어도 상기 프로필라그린 cDNA 또는 유전자의 일부를, 세포 내에서 그 안티센스 분자를 발현시킬 수 있는 프로모터에 작동가능하게 연결된 상태로 포함하고 있다.

폴리뉴클레오티드의 전달을 위한 유전자 구조물은 DNA 또는 RNA일 수 있으나, DNA인 것이 바람직하다.

바람직하게는, 유전자 구조물은 사람 세포로의 전달에 적합하게 된 것이다.

유전자 구조물을 동물 신체의 세포 내로 도입시키는 수단 및 방법은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들면, 본 발명의 구조물은 임의의 편리한 방법, 예컨대 레트로바이러스를 이용하는 방법으로 세포 내로 도입시켜 구조물이 세포의 게놈 내에 삽입되도록 할 수 있다. 예를 들어, 문헌[Kuriyama 등 (1991)Cell Struc. and Func.16, 503-510]에서는 정제된 레트로바이러스를 투여한다. 상술한 것과 같은 폴리뉴클레오티드를 포함하고 있는 레트로바이러스 DNA 구조물은 당업계에 잘 알려진 방법을 사용하여 만들 수 있다. 그러한 구조물로부터 활성이 있는 레트로바이러스를 생산하려면 10％ 우태아 혈청 (FCS)을 함유한 Dulbecco 조정 이글 배지 (DMEM)에서 성장시킨 에코트로픽 psi2 패키징 세포주를 사용하는 것이 통상적이다. 이 세포주의 트랜스펙션은 인산칼슘 공침법에 의해 간편히 이루어지며, 안정적인 형질전환체는 (레트로바이러스 구조물이 neo(등록상표) 유전자를 함유한다고 가정할 때) G418을 최종 농도 1 mg/ml로 첨가하여 선별한다. 독립적인 콜로니를 단리하여 확장시키고, 배양 상층액을 수거하여 공경 0.45 ㎛의 필터로 여과한 다음 -70℃에 보관한다. 레트로바이러스를 종양 세포 내로 도입시키기 위해서는 10 ㎍/ml Polybrene을 첨가한 레트로바이러스 상층액을 직접 주입하는 것이 간편하다. 직경이 10 mm를 초과하는 종양에 대해서는, 레트로바이러스 상층액을 0.1 ml 내지 1 ml, 바람직하게는 0.5 ml 주입하는 것이 적절하다.

다른 방법으로는, 문헌[Culver 등 (1992)Science256, 1550-1552]에 기재된 바와 같이, 레트로바이러스를 생산하는 세포를 주입한다. 그렇게 도입되는 레트로바이러스 생산 세포는 레트로바이러스 벡터 입자를 능동적으로 생산하여 벡터의 지속적인 생산이 종양 덩어리 내 제자리에서 일어나도록 설계조작된 것이다. 그러므로, 증식하는 표피 세포를 레트로바이러스 벡터 생산 세포와 섞으면, 표피 세포에 성공적으로 생체 내 형질도입을 행할 수 있다.

표적이 정해진 레트로바이러스 역시 본 발명에서 사용하기 위해 입수할 수 있는데, 그 예로 특이적 결합 친화도를 부여하는 서열을 이미 존재하는 바이러스env유전자 내로 삽입시킬 수 있다 (이 벡터 및 유전자 요법을 위한 기타 표적화 벡터의 고찰에 대해서는 문헌[Miller ＆ Vile (1995)Faseb J.9, 190-199] 참조).

다른 방법은 제한된 시간 동안의, 또는 게놈 내로의 통합에 이어 더 긴 시간 동안의 세포 내에서의 발현을 위해 세포 내로 구조물을 단순히 전달하는 것을 포함한다. 나중 방식의 예에는 리포좀이 포함된다 (Nassander 등 (1992)Cancer Res.52, 646-653).

면역 리포좀의 제조를 위해서는 MPB-PE (N-[4-(p-말레이미도페닐)부티릴]-포스파티딜에탄올아민)을 문헌[Martin ＆ Papahadjopoulos (1982)J. Biol. Chem.257, 286-288]의 방법에 따라 합성한다. MPB-PE를 리포좀 이중층 내로 편입시켜 항체 또는 그의 단편이 리포좀 표면에 공유결합으로 연결될 수 있도록 한다. 리포좀에는 표적 세포에 전달하기 위한 본 발명의 DNA 또는 기타 유전자 구조물을 간편하게 실을 수 있는데, 예를 들면 상기 리포좀을 DNA 또는 기타 유전자 구조물의 용액 중에서 형성시킨 뒤, 최대 0.8 MPa의 질소 압력 하에서 공경 0.6 ㎛ 및 0.2 ㎛인 폴리카르보네이트 멤브레인 필터를 통해 순차 통과시키는 것이다. 필터 통과 후, 80 000 x g에서 45 분 동안 초원심분리함으로써 리포좀에 잡힌 DNA 구조물을 유리 DNA 구조물로부터 분리한다. 새로 제조한, 탈산소 완충액 중의 MPB-PE-리포좀을 새로 제조한 항체 (또는 그 단편)와 혼합하고, 커플링 반응을 질소 분위기, 4℃에서, 지속적인 길이방향 회전 하에 하룻밤동안 수행한다. 80 000 x g에서 45분 동안 초원심분리시켜 면역리포좀을 콘쥬게이션되지 않은 항체로부터 분리한다. 면역리포좀은 복강내로, 또는 직접적으로 종양 내로 주사할 수 있다.

다른 전달 방법에는 항체-폴리리신 다리를 통해 외부 DNA를 운반하는 아데노바이러스 (CurielProg. Med. Virol.40, 1-18 참조) 및 트랜스페린-폴리양이온 콘쥬게이트를 운반체로 하는 것 (Wagner 등 (1990)Proc. Natl. Acad. Sci. USA87, 3410-3414) 등이 있다. 이들 중 첫 번째 방법에서는 폴리양이온-항체 복합체를 본 발명의 DNA 구조물 또는 다른 유전자 구조물로 형성시키는데, 여기서 항체는 야생형 아데노바이러스 또는 항체에 결합하는 새로운 에피토프가 도입된 변이체 아데노바이러스에 대해 특이적이다. 폴리양이온 잔기는 인산기 골격과의 정전기적 상호작용을 통해 DNA에 결합한다. 아데노바이러스는 변경되지 않은 섬유 및 펜톤 단백질을 함유하고 있기 때문에 세포 내로 도입되며, 바이러스 자체와 함께 본 발명의 DNA 구조물을 세포 내로 운반한다. 폴리양이온이 폴리리신인 것이 바람직하다.

DNA는 예를 들면 아래에서 설명하는 것처럼 아데노바이러스 입자 내에 존재하는 상태로 아데노바이러스에 의해 전달될 수도 있다.

또다른 방법에서는, DNA 거대분자를 세포 내로 운반하는 데 수용체 매개 엔도시토시스를 이용하는 고효율 핵산 전달 시스템을 사용한다. 이것은 철 수송 단백질인 트랜스페린을 핵산에 결합하는 폴리양이온에 콘쥬게이션시킴으로써 이루어진다. 사람 트렌스페린 또는 닭 상동체인 콘알부민, 또는 이들의 조합을 작은 DNA-결합 단백질인 프로타민 또는 다양한 크기의 폴리리신에 이황화 연결기를 통해 공유결합으로 연결시킨다. 이들 수식된 트랜스페린 분자는 관련된 수용체에 결합하고 세포 내로의 효율적인 철 수송을 매개하는 능력을 유지한다. 트랜스페린-폴리양이온 분자는 핵산 크기와 무관하게 (짧은 올리고뉴클레오티드에서부터 21 kb의 DNA까지) 본 발명의 DNA 구조물 또는 다른 유전자 구조물과 전기영동상 안정한 복합체를 형성한다. 트랜스페린-폴리양이온과 본 발명의 DNA 구조물 또는 다른 유전자 구조물의 복합체를 종양 세포에 공급하면, 세포 내의 구조물로부터 높은 수준의 발현이 예상된다.

문헌[Cotten 등 (1992)Proc. Natl. Acad. Sci. USA89, 6094-6098]의 방법에 의해 생산된 불완전하거나 화학적으로 불활성화된 아데노바이러스 입자의 엔도좀 파괴 활성을 이용한 본 발명의 DNA 구조물 또는 다른 유전자 구조물의 고효율 수용체 매개 전달 역시 이용할 수 있다. 이 접근법은, 아데노바이러스가 리소좀을 통과하지 않고 엔도좀으로부터 그 DNA가 방출될 수 있게 하기에 적합하며, 본 발명의 DNA 구조물 또는 다른 유전자 구조물에 연결된 트랜스페린 등의 존재시 그 구조물이 아데노바이러스 입자와 동일한 경로로 세포에 의해 흡수된다는 사실에 의존하고 있는 것으로 보인다.

이 접근법에는, 복잡한 레트로바이러스 구조물을 사용할 필요가 없고, 레트로바이러스 감염에서 발생하는 게놈의 영구적인 변조가 없으며, 표적화된 발현 시스템이 표적화된 전달 시스템과 연계되어 다른 세포 유형에 대한 독성을 줄인다는 장점이 있다.

"네이키드 DNA" 및 양이온성 및 중성 지질과 복합체를 이룬 DNA 역시 본 발명의 DNA를 치료할 개인의 세포 내로 도입시키는 데 유용할 수 있다는 것을 인식할수 있을 것이다. 유전자 치료에 대한 비-바이러스 접근법은 문헌[Ledley (1995)Human Gene Therapy6, 1129-1144]에 기재되어 있다.

다른 표적화된 전달 시스템 역시 공지되어 있으며, 예컨대 국제특허 공개 제94/10323호에 기재된 변형된 아데노바이러스 시스템이 있는데, 여기서는 전형적으로 DNA가 아데노바이러스 입자, 또는 아데노바이러스-유사 입자 내에 든 상태로 운반된다. 문헌[Michael 등 (1995)Gene Therapy2, 660-668]에는 섬유 단백질 내에 세포 선택적인 잔기를 추가하기 위해 아데노바이러스를 변형시키는 것이 기재되어 있다. p53 결여 사람 종양 세포에서 선택적으로 복제되는 돌연변이 아데노바이러스, 예컨대 문헌[Bischoff 등 (1996)Science274, 373-376]에 기재된 것들 역시 본 발명의 유전자 구조물을 세포에 전달하는 데 유용하다. 그러므로, 본 발명의 또다른 일면이 본 발명의 유전자 구조물을 포함하고 있는 바이러스 또는 바이러스 유사 입자를 제공하는 것임을 인식할 수 있을 것이다. 다른 적절한 바이러스 또는 바이러스 유사 입자에는 HSV, AAV, 바씨니아 및 파보바이러스가 포함된다.

본 발명의 유전자 구조물은 당업계에 공지된 방법을 이용하여 제조할 수 있다.

폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드를 단독으로 투여하는 것이 가능하기도 하지만, 이들을 하나 이상의 허용되는 담체와 함께 제약 제제로 제공하는 것이 바람직하다. 담체는 본 발명의 화합물과 상용성이고 투약자에게 해롭지 않다는 의미로 "허용되는" 것이어야 한다. 전형적으로는, 담체는 멸균되고 발열원이 없는 물 또는 염수가 될 것이다.

본 발명을 다음과 같은 도면 및 실시예를 참조하여 더 상세히 설명한다.

방법

DNA 단리는 QIAamp DNA Blood Midi 키트 (Qiagen)를 사용하여 수행하였으며, 방법을 문헌[Schie and Wilson (1997,Journal of immunological Methods, 208, 91-101)]에 기재된 대로 타액 시료에 맞도록 조정하였다. 타액 5 ml를 5 ml의 PBS (Sigma)로 희석하고 3000 g에서 5 분 동안 원심분리하였다. 상층액을 버리고 펠렛을 10 ml의 PBS에 재현탁시켰다. 재현탁된 펠렛을 3000 g에서 5 분 동안 원심분리하고, 상층액을 버린 후 펠렛을 750 ㎕의 PBS에 재현탁시켰다. 1 ml의 키트 Lysis 완충액 및 100 ㎕의 키트 프로테아제를 키트 프로토콜에 따라 첨가하였다. 5 ㎕의 RNase (7 단위/㎕)를 가하고 뒤이어 혼합한 다음 70℃에서 20 분 동안 인큐베이션하였다. 1 ml의 무수 에탄올을 가하고, 키트 프로토콜에 따라 DNA를 정제하였다. 최종 제제를 300 ㎕의 키트 용리 완충액으로 용리하고, 제제를 농축시키기 위해 용출액을 컬럼에 한 번 다시 전개하였다. 용출액을 분할하여 -20℃에 보관하였다.

DNA 정량은 1/10 희석 상태로 분광광도계 측정에 의해 행하였다 (Sambrook and Russell, (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 3rd edition, Cold Spring Harbour Laboratory Press, New York, USA).

PCR 반응은 다음 조건을 사용하여 50 ㎕ 부피로 행하였다: 150 ng 게놈 DNA 시료; 200 μM 최종 농도의 dNTP; 200 μM 최종 농도의 포워드 (5' GGA TGA AGC CTA TGA CACCAC 3') 및 리버스 (5' GA CAG GAA AAG ATA ACT TCC C 3') 프라이머; 1.7 mM 최종 농도의 Mg²⁺. 50 ㎕ 에롱가제 (GIBCOBRL Life Technologies) 반응에 3 ㎕의 완충액 A + 7 ㎕의 완충액 B를 사용한다. PCR 반응은 다음 조건을 사용하여 행하였다:

반응물을 94℃로 5 분간 가열

에롱가제 반응 혼합물을 1/50 희석으로 첨가 (고온 시작)

아래 프로그램 시작:

5 분 94℃1 싸이클

30초 94℃ ┒

30 초 57℃ ┣35 싸이클

12 분 68℃ ┛

침지 4℃

PCR 생성물은 당업계에 공지된 기술을 사용하여 겔 전기영동으로 분석하였다 (Sambrook and Russell, (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 3rdedition, Cold Spring Harbour Laboratory Press, New York, USA). 샘플 로딩 완충액 GIBCO-BRL을 PCR 생성물 소량에 l x 최종 농도로 가하였다. 20 ㎕의 PCR 반응 생성물을 0.6％ 아가로스 (1 x TBE Sigma) 겔 상에서 30V로 전기영동시켜 크기에 따라 분별하였다 (연장 사다리형 표지자 사용-Life Technologies).

실시예 1

43명의 무작위적으로 선택된 여성으로 된 그룹이 DNA 분석용 타액 시료 및 피부 상태 이력에 대한 정보를 제공하여 주었다. 패널 참가자가 1％ SLS (소듐 도데실 술페이트) 패치를 24 시간 동안 붙이고 있도록 하고, 홍반의 정도를 패치 후 4, 24 및 48 시간 시점에 채점하였다. 별도의 조사에서는, 무작위적으로 선택된 20인으로 된 혼성 그룹이 DNA 분석용 타액 시료, NMF 분석용 시아노아크릴레이트 생검물 (Marks (1972)British journal of Dermatology86:20-26) 및 피부/두피 상태 이력을 제공하여 주었다. 타액 시료로부터 게놈 DNA를 추출하고, PCR로 분석하여 각 개인의 프로필라그린 유전자형을 판정하였다 (도 1). 각질층의 NMF 함량은 표준 TNBS 분석법 (Hazra 등 1984Analytical Biochemistry137: 437-443)을 사용하여 측정하고, 총 단백질에 대해 정규화시켰다.

세 가지 변이체 모두 다음의 빈도로 확인되었다:

10 반복부 (18％), 11 반복부 (60％) 및 12 반복부 (22％).

염색체쌍 당 필라그린 반복부의 수와 각질층 NMF 수준의 관계를 작도한 결과는 이들 두 매개변수 사이에 직접적인 관계가 있음을 드러내 주었다 (도 2). 반복부의 수가 더 많은 개인들이 더 높은 NMF 수준을 보였다. 피부/두피 상태 이력은,비듬으로 고생한다고 주장하는 사람들은 12 반복부 대립유전자를 한 카피 이상 갖고 있음을 드러내 주었다 (도 3). 이러한 결과는 개인의 게놈 내 12 반복부 대립유전자의 존재와 비듬에 대한 감수성 사이에 연관이 있음을 시사한다.

SLS 패치 후의 홍반 점수 그래프 (도 4)는 12 반복부 대립유전자를 하나 이상 가진 사람들이 패치 공격 48 시간 후에 더 낮은 홍반 점수를 보이는 것을 드러내 주었다. 이러한 결과는 12 반복부 대립유전자의 존재와 세제 공격 후 피부 장벽의 회복 사이에 연관이 있음을 시사한다.

실시예 2

140명의 무작위적으로 선택된 패널 참가자로 된 그룹이 DNA 분석용 타액 시료 및 피부 상태 이력에 대한 정보를 제공하여 주었다. 질문지에 대한 응답을 기초로, 패널 참가자들을 자각되는 피부 건조 빈도가 '빈번한' 그룹 (항상, 매일 및 매주 경험하는 경우 포함)과 '드문' 그룹 (매달 또는 그보다 드물게 경험하는 경우)으로 지정하였다. 패널 참가자의 미처치 다리 피부의 상태에 대한 육안 평가를 5일 연속 행하고, 패널 참가자를 '피부 건조 없음' 그룹 (가시적인 건조증이 없다는 평가 3회 이상) 또는 '피부 건조' 그룹 (가시적인 건조증이 있다는 평가 2회 초과)에 배당하였다. 패널 참가자가 1％ SLS 패치를 24 시간 동안 붙이고 있도록 하고, 홍반의 정도를 패치 후 4, 24 및 48 시간 시점에 채점하였다. 타액 시료로부터 게놈 DNA를 추출하고, PCR로 분석하여 각 개인의 프로필라그린 유전자형을 판정하였다 (도 1).

세 가지 변이체 모두 다음의 빈도로 확인되었다:

10 반복부 (24％), 11 반복부 (56％) 및 12 반복부 (20％).

12 반복부 대립유전자가 하나 이상 있는 패널 참가자 중 빈번한 피부 건조를 겪는다고 주장하는 사람의 비율은 6％에 불과한 데 비해, 12 반복부 대립유전자가 없는 패널 참가자의 경우에는 27％였다 (도 5). 이것은 12 반복부 대립유전자가 피부 건조 자각증상을 보고하는 경향의 감소와 연관된다는 것을 입증해 주었다.

11 반복부 대립유전자가 하나 이상 있는 패널 참가자 중 가시적인 다리 건조증을 보인 사람의 비율은 73％인 데 비해, 11 반복부 대립유전자가 없는 패널 참가자의 경우에는 52％에 불과하였다 (도 6). 이것은 11 반복부 대립유전자가 가시적인 다리 건조증에 대한 경향의 증가와 연관된다는 것을 입증해 주었다.

12 반복부 대립유전자가 하나 이상 있는 패널 참가자 중 SLS 패치 후 4 시간에서 48 시간 사이에 홍반 감소를 보인 사람의 비율은 66％인 데 비해, 12 반복부 대립유전자가 없는 패널 참가자의 경우에는 47％에 불과하였다 (도 7). 이것 역시 12 반복부 대립유전자가 세제 공격 후 피부가 회복되는 경향의 증가와 연관된다는 것을 입증해 주었다.

Claims (25)

1. 개인에게서 채취한 생체외 시료의 게놈에 존재하는 프로필라그린 대립유전자를 동정하는 것을 포함하는, 피부 상태에 대한 개인의 소인을 판정하는 방법.
2. 제1항에 있어서, 천연 보습 인자 (NMF)를 생산하는 개인의 능력을 판정하는 방법.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 피부 건조에 대한 개인의 소인을 판정하는 방법.
4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 세제 유발 홍반에 대한 소인을 판정하는 방법.
5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 프로필라그린 대립유전자가 코딩하는 필라그린 반복부의 수를 확인함으로써 프로필라그린 대립유전자가 동정되는 방법.
6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 생체외 시료가 구강에서 수집된 시료인 방법.
7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,

   (a) 기질로서 생체외 시료에서 나온 DNA를 제공하는 단계;

   (b) 기질 중 필라그린 반복부 코딩 서열을 포함하는 한정된 영역을 증폭하는 단계; 및

   (c) 생성된 증폭 산물 또는 산물들의 크기를 측정함으로써 시료의 게놈에 존재하는 프로필라그린 대립유전자를 확인하는 단계

   를 포함하는 방법.
8. 제7항에 있어서, 단계 (b)를 중합효소 연쇄 반응 (PCR)으로 수행하는 방법.
9. 제8항에 있어서, 기질 DNA의 필라그린 반복부 코딩 서열에 인접한 위치에 혼성화할 수 있는 서열을 가진 한 쌍의 올리고뉴클레오티드를 제공하는 것을 포함하는 방법.
10. 제9항에 있어서, 한 쌍의 올리고뉴클레오티드 중 하나의 서열이 5' GGA TGA AGC CTA TGA CACCAC 3'인 방법.
11. 제9항 또는 제10항에 있어서, 한 쌍의 올리고뉴클레오티드 중 하나의 서열이 5' GA CAG GAA AAG ATA ACT TCC C 3'인 방법.
12. 제7항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 0.1 내지 30 ng/ml의 DNA 기질, 2 μM 내지 2 mM의 dNTP, 2 μM 내지 2 mM의 포워드 및 리버스 프라이머, 및 17 μM 내지 170 mM의 Mg²⁺를 사용하여 증폭을 행하는 방법.
13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 임상시험 패널을 목적으로 개인을 분류하는 방법.
14. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 개인을 개인 위생용품과 매치시키는 방법.
15. 개인에게서 채취한 시료의 게놈에 존재하는 프로필라그린 대립유전자를 동정하는 수단을 포함하는, 피부 상태에 대한 개인의 소인을 판정하는 시스템
16. 개인의 피부 상태를 치료하는 조성물의 제조를 위한, 프로필라그린 대립유전자형, 또는 그의 변이체 또는 단편의 서열을 포함하는 폴리펩티드, 또는 이들 중 어느 하나를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 용도.
17. 제16항에 있어서, 개인의 프로필라그린 유전자형이 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항의 방법으로 판정되어 있는 용도.
18. 제16항 또는 제17항에 있어서, 피부 상태가 NMF 생산과 연관된 것인 용도.
19. 제16항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 피부 상태가 피부 건조인 용도.
20. 5' GGA TGA AGC CTA TGA CACCAC 3' 또는 5' GA CAG GAA AAG ATA ACT TCC C 3'의 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드.
21. 피부 상태에 대한 개인의 소인을 판정하기 위한 제20항의 폴리뉴클레오티드의 용도.
22. 개인의 프로필라그린 유전자형을 동정하고 그렇게 확인된 프로필라그린 유전자형에 사용하기에 적합한 것으로 알려진 개인 위생용품을 선별하는 것을 포함하는, 그 개인이 사용하기에 적합한 개인 위생용품을 동정하는 방법
23. 제22항에 있어서, 그렇게 확인된 프로필라그린 유전자형을 가진 개인에게 사용하기에 적합한 개인 위생용품을 제공하는 것을 더 포함하는 방법.
24. 제22항 또는 제23항에 있어서, 개인 위생용품이 보습 피부관리 제품인 방법.
25. 제22항 또는 제23항에 있어서, 개인 위생용품이 세제계 세정 제품인 방법.