JP2005508650A - Gh−1における一塩基多型 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、多型部位を含む成長ホルモン1(GH−1)遺伝子の核酸セグメントを提供する。また、本発明は、成長ホルモン機能不全が疑われる個体が、GH−1機能不全への作用剤を投与するのに適切な候補であるか否かを決定する方法も提供する。
〈一塩基多型〉
全ての生物は、それらの進化の過程で反復的な突然変異を受け、従って祖先の配列のバリアント型を発生させる〔Gusella,Ann.Rev.Biochem.55,831−854(1986)〕。前記バリアント型は、祖先の型と比較して、進化論的な優位性を付与することも付与しないこともある。前記バリアント型は、中立であろう。或る場合には、バリアント型は致死的であり、そしてその生物の更なる世代に遺伝されることがない。別の場合には、バリアント型は、その種に進化論的な優位性を付与し、そして最終的にその種の多くのメンバー又はほとんどのメンバーのDNA中に組み込まれて、実際的に祖先型になる。多くの場合、祖先型及びバリアント型のどちらも生き残り、そして種の集団の中で共存する。この配列の複数の型の共存は、多型を生じさせる。
成長ホルモン1(GH−1)は、下垂体前葉から放出される191アミノ酸の球状タンパク質であり、そして生後の正常な成長に必要である(Niall HD.Nature1971;23:90−1;LiCH.Mol Cell Biochem1982;46:31−41)。成長ホルモン1の不充分な分泌は、生児出生の1/4000〜1/10,000に影響し、成長障害及び低身長をもたらすことがある(Phillips III JA and Cogan JD.J Clinical Endocrinology Metabolism1994;78:11−16)。
従って、成長ホルモン機能不全に対して予測性を有する新たな一塩基多型は明らかに緊急な必要性を有しており、そしてこれが本発明の課題である。
本発明は、GH−1遺伝子多型マーカーのセットを発見したことに基づく。これらのマーカーは、GH−1のコード領域中に位置する。前記GH−1メッセージの配列又はcDNAの配列を、以下に示す。それらの関連するアミノ酸変化を伴う多型を、太字で記載する。
配列番号1(位置68のヌクレオチドが、A又はCのヌクレオチド群から選択される);
配列番号4(位置1665のヌクレオチドが、A又はCのヌクレオチド群から選択される);
配列番号1(位置116のヌクレオチドが、C又はTのヌクレオチド群から選択される);
配列番号4(位置1973のヌクレオチドが、C又はTのヌクレオチド群から選択される);
配列番号1(位置177のヌクレオチドが、C又はTのヌクレオチド群から選択される);
配列番号4(位置2034のヌクレオチドが、C又はTのヌクレオチド群から選択される);
配列番号1(位置212のヌクレオチドが、T又はAのヌクレオチド群から選択される);
配列番号4(位置2069のヌクレオチドが、T又はAのヌクレオチド群から選択される);
配列番号1(位置213のヌクレオチドが、T又はAのヌクレオチド群から選択される);
配列番号4(位置2070のヌクレオチドが、T又はAのヌクレオチド群から選択される);
配列番号1(位置224のヌクレオチドが、C又はTのヌクレオチド群から選択される);
配列番号4(位置2081のヌクレオチドが、C又はTのヌクレオチド群から選択される);
配列番号1(位置279のヌクレオチドが、A又はCのヌクレオチド群から選択される);
配列番号4(位置2345のヌクレオチドが、A又はCのヌクレオチド群から選択される);
配列番号1(位置375のヌクレオチドが、C又はGのヌクレオチド群から選択される);
配列番号4(位置2533のヌクレオチドが、C又はGのヌクレオチド群から選択される);
配列番号1(位置596のヌクレオチドが、G又はCのヌクレオチド群から選択される);
配列番号4(位置3007のヌクレオチドが、G又はCのヌクレオチド群から選択される)
のヌクレオチド長が少なくとも10、12、15、20、25、30、35、40、50、75、100、200、500、又は800の連続するヌクレオチドを含むか、から実質的になるか、又はからなる、単離されたポリヌクレオチドを提供する。
図1:成長ホルモン1のゲノム配列
図1は、Genbankデータベース登録J03071由来のヒト成長ホルモン1に対するゲノム配列を示す。多型部位は、下線が引かれており、太字イタリック体である。実施例1で、PCR断片の生成及び前記断片の配列決定に用いられたプライマーは、下線を引かれ、そしてそのオリゴヌクレオチドの名前及びその方向を前記配列の上に示した。アミノ酸配列は、ヌクレオチド配列の下にある。最初の26(−26〜−1)のアミノ酸は、シグナル配列ペプチドを表す。コード領域の中には、4つのイントロンがある。矢印は、遺伝子の始まりと終わりとを示す。開始メチオニン、ストップコドン、及びポリA付加部位は、太字である。−30〜−25におけるTATAボックス及び−132〜107及び−92〜−67における2つのPIT−1部位は、四角で囲まれている。
配列番号1:多型部位の記載を伴うGH−1cDNA配列
配列番号2:GH−1シグナル−ポリペプチド ペプチド配列
配列番号3:GH−1成熟ポリペプチド配列
配列番号4:GH−1ゲノム配列
配列番号5〜51:プライマー
〈定義〉
用語「GH−1診断ポリヌクレオチド」は、GH−1多型部位(相補体を含む)を含み、GH−1ゲノム配列から誘導される任意のポリヌクレオチド又はGH−1遺伝子から誘導される転写物を意味する〔主要な及び別の転写種[transcript species]は、当業者に周知である〕。主要アイソフォームのメッセージ配列を、配列番号1に記載し、そして相当するゲノム配列を配列番号4に記載する。診断ポリヌクレオチドは、プライマー又はプローブであることができる。
(i)成長不全:標準的身長チャート[Tannerら,Arch Dis Child,45,755−762(1970)]上にプロットした場合に、個体に対して予測される成人身長が、その個体の両親の身長に基づいて予測されるその個体の目標成人身長範囲から、逸脱している成長パターン[一連の身長測定によって描写される;Brook CDG(編)Clinical Pediatric Endocrinology第3版,第9章,p141(1995,Blackwell Science)]として規定される。従って、本発明は、前記の本発明の方法によって検出される若しくは検出可能なGH1のバリアントを更に提供する。判定基準(i)に対する参考文献としては、「Tanner and Whitehouse Arch Dis Child,51,170−179(1976)」が有用である。患者の目標成人身長範囲は、中央−両親身長(mid−parental height:MPH)として計算され、MPHに対して第10百分位数から第90百分位数の範囲を有するが、これは、性別に応じて変化する:
男性のMPH=[父親の身長+(母親の身長+13)]/2±6〜8cm、通常7.5cmの範囲内;及び
女性のMPH=[(父親の身長−13)+母親の身長]/2±6〜8cm、通常は、6cmの範囲内;
(ii)身長速度が、年齢に対する第25百分位数を下回る;及び/又は
(iii)暦年齢と比較した場合の、Tanner−Whitehouse目盛による骨年齢遅延が少なくとも2年;及び/又は
判定基準(ii)及び(iii)に関して、各々の判定基準は、以下に詳述するとおり、当業者に容易に利用することができ及び報告されている公知の方法及びパラメーターによって評価することができる:
(ii)「Tanner JM,Whitehouse RH Atlas of Children’s Growth(1982,London:Academic Press)」;及び「Butlerら,Ann Hum Biol,17,177−198(1990)」は、最初の判定基準の決定を可能にする、すなわち患者の身長速度が患者の年齢に対する第25百分位数未満である統計値の資料である。
(iii)骨年齢遅延の年を評価するための前記Tanner−Whitehouse目盛は、Tanner JM, Whitehouse RH, Cameron Nらによって、「Assessment of Skeletal Maturity and Prediction of Adult Height (1983, London:Academic Press)」に記載されている。本発明の方法においては、前記個体が、(暦年齢と比較した場合に)約3.5〜4年の骨年齢遅延を示すことが好ましい。
1.その遺伝子によってコードされるタンパク質生成物中において、アミノ酸1つを別のアミノ酸に置換する非同義的コード領域変化、
2.遺伝子コードの縮重によりアミノ酸コード配列が変わる同義的変化、
3.遺伝子の転写に変化させるか又は変化させない、プロモーター、エンハンサー、又は他の遺伝的調節要素配列の変化、
4.特に5’末端における(リボソーム結合、開始、又は翻訳の効率を変えることができる)又は3’末端における(mRNAの安定性を変えることができる)、mRNAの非翻訳領域内における変化、及び
5.転写物のスプライシング又は他の遺伝的調節要素の機能を変化させることができる、イントロン領域の中での変化
を挙げることができる。
側鎖の特徴 アミノ酸
脂肪族
非極性 GAP
ILV
極性−非荷電 CSTM
NQ
極性−荷電 DE
KR
芳香族 HFWY
その他 NQDE
側鎖の特徴 アミノ酸
非極性(疎水性)
A.脂肪族: ALIVP
B.芳香族: FW
C.硫黄含有: M
D.ボーダーライン: G
非荷電−極性
A.ヒドロキシル: STY
B.アミド: NQ
C.スルフヒドリル: C
D.ボーダーライン: G
陽電荷(塩基性): KRH
負電荷(酸性): DE
オリジナルの残基 典型的な置換
Ala(A) Val,Leu,Ile
Arg(R) Lys,Gln,Asn
Asn(N) Gln,His,Lys,Arg
Asp(D) Glu
Cys(C) Ser
Gln(Q) Asn
Glu(E) Asp
His(H) Asn,Gln,Lys,Arg
Ile(I) Leu,Val,Met,Ala,Phe,
Leu(L) Ile,Val,Met,Ala,Phe
Lys(K) Arg,Gln,Asn
Met(M) Leu,Phe,Ile
Phe(F) Leu,Val,Ile,Ala
Pro(P) Gly
Ser(S) Thr
Thr(T) Ser
Trp(W) Tyr
Tyr(Y) Trp,Phe,Thr,Ser
Val(V) Ile,Leu,Met,Phe,Ala
成長ホルモン1(GH−1)は、脳下垂体から放出されるアミノ酸数191の球状タンパク質であり、出生後の正常な成長に不可欠である(Niall,1971;Li,1982)。pre−hGH−1は、タンパク質を粗面小胞体の外側に向かわせるアミノ末端のアミノ酸数26のシグナル配列を有している。成長ホルモン1に対する遺伝子(GH−1遺伝子)は、染色体17上の全長48kbのクラスター中に見出された5つの遺伝子の1つである(George,1981)。その他の4つの遺伝子は、成長ホルモン2(GH−2遺伝子)、絨毛性ソマトマンモトロピン1及び2(CSH−1及びCSH−2遺伝子)、並びにCSH偽遺伝子(CSHP−1偽遺伝子)である。各遺伝子は、同じエキソン−イントロン構造を有し、そして5つの遺伝子は、91%〜95%の類似性を有する。これらの類似性にもかかわらず、これらの遺伝子は、組織特異的な発現を示し、GH−1は、脳下垂体前葉のみで転写されるが、その他の遺伝子4つは、胎盤で転写される(Chen,1989)。この組織特異的な転写は、下垂体−特異的転写因子Pit−1/GHF1に対するGH−1のプロモーター領域内の2つの結合部位によって媒介される(Bonder,1988)。前記胎盤遺伝子4つは、それらのプロモーター領域中に、下垂体−特異的レセプター配列を有する(Nachtigal,1992)。
完全成長ホルモン遺伝子座に対するゲノム配列は、「Chenら,Genomics4,479−497(1989)」中に報告されており、そしてアクセッション番号J03071としてGenbank中にある。
本発明の多型の新規同定を説明する実施例を、以下に記載する。
〈材料及び方法〉
〔DNAサンプル〕
匿名の血液サンプル(複数)からDNAサンプルを得た。QiaAmp DNAブラッド・ミニ・キット(キアゲン[Qiagen])を用いて、DNAを調製した。このサンプルは、人口対照西部ミシガンサンプルと称され、CON01のラベルを付されている。またこのサンプルは、各個人の一般的表現型情報のみが知られ、本質的には各個人に関する情報のない、種々の民族性の、主に白人及び黒人の人々を代表している(少なくとも1人は、身長が低かった)。
GH−1遺伝子に対して固有であり、そしてGHクラスター中の別のいずれかの関連する遺伝子とのヌクレオチドミスマッチ少なくとも2つを有するように、プライマー配列を設計した。ABI9600サーモサイクラーを用い、製造元の指示に従って、反応約50μL中でエクスパンド・ハイ・フィデリティー・エンザイム・ミックス[Expand High Fidelity enzyme mix]を使用して、PCRを実施した。
そのサイクルプログラムは、以下のとおりであった:94℃で2分間を1サイクル、次いで94℃で15秒間、次いで68℃で2分間を10サイクル(サイクルごとに1℃減少)、及び次いで94℃で15秒間、58℃で30秒間、72℃で2分間を50サイクル。
(A)RFD1384(1μg/μL)0.3μL,RFD1377(1μg/μL)0.3μL,
(B)RFD1372(1μg/μL)0.3μL,RFD1383(1μg/μL)0.3μL,
(C)RFD1372(1μg/μL)0.3μL,RFD1385(1μg/μL)0.3μL,
RFD1384:GGGAGCCCCAGCAATGC(配列番号5)
RFD1377:ACGGATTTCTGTTGTGTTTCCTC(配列番号6)
RFD1372:GAGCTCAGGGTTTTTCCCGAAGC(配列番号7)
RFD1383:GGGCAGAGATAATAGCAAACAAG(配列番号8)
RFD1385:TGTAGGAAGTCTGGGGTGC(配列番号9)
Taq FSTMポリメラーゼを用い、ABI377蛍光ベースシークエンサー(Perkin Elmer/Applied Biosystems Division,PE/ABD,Foster City,カリフォルニア州)及びABI BigDye(商標)ターミネーター・サイクル・シークエンシング・レディ・リアクション・キット[Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction kit]を使用して、前記PCR断片を直接配列決定した。各サイクルシークエンシング反応は、H2O9.6μL、BigDyeターミネーター混合物8.4μL(Big Dyeターミネーター8μL及びDMSO0.4μL)、DNA1μL(〜0.5μg)、及びプライマー1μL(25ng/μL)を含み、そしてPerkin−Elmer9600中で実施した。98℃で1分間の初期変性、続いて96℃で30秒間、50℃で30秒間アニーリング、及び60℃で4分間伸長の50サイクルを使用して、サイクルシークエンシングを実施した。伸長生成物を,AGTC(商標)ゲルろ過ブロック(Edge BiosSystems,Gaithersburg,メリーランド州)を用いて精製した。各反応生成物を、ピペットによりカラム上に装填し、次いでこれをスウィンギングバケット遠心分離機(SorvallモデルRT6000B卓上遠心分離機)中で、室温において750×gで2分間遠心分離した。カラム−精製サンプルを、減圧下で約60分間乾燥し、次いでDNA添加液2μL(83%脱イオン化ホルムアミド,8.3mM−EDTA,及び1.6mg/mLブルーデキストラン)中に溶解した。次いで、そのサンプルを2.3分間90℃に加熱し、そしてABI377シークエンサーによる配列分析用に、各サンプル0.75μLずつを、そのゲルサンプルウェル中に装填した。その配列クロマトグラムを、コンピュータープログラムphred/Phrap及びConsedを用いて分析した。
図1は、GenbankJ03071由来のヒト成長ホルモン1に対するゲノム配列を示す。この遺伝子は、コード領域内に4つのイントロンを含む。成長ホルモン1に対する遺伝子のみを増幅するために、そのクラスター中の他の遺伝子4つと比較して最も相違する遺伝子の領域からプライマーを設計した。いくつかの組合せを試みたが、前記配列を2.8kb配列におよぶ重複断片2つに分けることによって、最も一致する結果が得られた。この領域は、600bpの5’フランキング配列、エキソン5つ全て、及びイントロン4つ、並びに1kbの3’フランキング配列を含む。図2は、ゲノムDNA25ng、50ng、又は100ngにおける断片RFD1984〜RFD1377(1.5kb)、RFD1372〜RFD1383(1.8kb)、及びRFD1372〜RFD1385(2.1kb)を示す。RFD1384〜1377及びRFD1372〜1383は、3つの濃度全てで強いバンドを示す。RFD1372〜1385は、25ngDNAにおいてバンドを示さず、50ngにおいて弱いバンドを示し、そして100ngにおいて適切に強いバンドを示した。
ドナーサンプル(例えば、身長の低い個体)の更に多種多様なサンプル収集を利用する同様のアプローチを、以下の実施例2に記載する。
〈サンプル選択調製〉
以下の集団からサンプルを得た:
ミシガン:臨床試験ボランティア(ミシガン州から,疾病無し,正常な身長分布,大部分が白人)からの血液サンプル219個。
GCI:前記集団よりも2.5%低い身長を有する182個体(交絡状態無し)。
CRV:Coriellから入手した5つの民族群(白人、アフリカ系−アメリカ人、日本人、中国人、東南アジア人[SE Asian]、及びアメリカインディアン)からの93個体。
実施例1に記載のとおりに、粗製にサンプルを調製した。
前記GHホモログ5つに対するゲノム配列を、公開データベースから検索し、そして相互にアラインメントした。前記アラインメントにより、前記遺伝子5つの間で最も高い保存及び最も低い保存の領域が同定された。GH1に対して特異的な配列を可能な限り多く含むように、慎重にプライマーを位置決めした。特に、第一プライマー(a及びpのラベルが付されている)を、可能であれば、GH1に特有の領域から選択した。
ネステッドPCRによって、それぞれのアンプリコン(単位複製配列)を得た。GH1に対して独特の塩基を含むプライマーを用いるPCR2ラウンドによって、最終生成物の特異性が増加する。
それぞれのアンプリコンを、無作為集団サンプル8つからのDNAからPCR増幅し、そして配列決定した。これらサンプル8種の配列トレースを、全サンプルにおいて現れるヘテロ接合位置の存在(一塩基の違いを有する複数の遺伝子が、PCRの間に増幅されたことを示している)について分析する。前記アンプリコンは、いずれも、全てのサンプル中において、ヘテロ接合位置を含まなかった。
GH−1遺伝子の特定の領域を、分離アンプリコンとして増幅した。前記アンプリコンの位置を以下の表3にまとめる。
DNAを、2.5ng/nLの作業用原液に希釈した。
20μLでPCR反応を実施した。要するに、5×CPCR緩衝液*4μLを、10mMdNTP0.4μL、ddH2O9.3μL、及びPLATINUM(商標)0.3μL(Life Technologies Polymerase(5U/μL)と混ぜ;
2.5uMの作業用原液に予め希釈しておいたフォワードプライマー及びリバースプライマーそれぞれ2μLを、予め2.5ng/nLに希釈しておいたDNAテンプレート2μLに加えた。
*:5×CPCRに対するレシピ
1.0M TrisHCL pH8.8 10.0mL
4M KCL 1.063mL
1M(NH4)SO4 5.0mL
1M MgSO4 1.0mL
20%Triton 2.5mL
体積を100mLにする。
各増幅におけるプライマリーPCR工程に対して、以下のプログラムを使用した:
95℃で5分間DNA初期変性;
4サイクル:96℃で10秒間(変性),58℃で10秒間(アニーリング),72℃で1.5分間(伸長);続いて20サイクル:96℃で10秒間(変性),55℃で10秒間(アニーリング),72℃で1.5分間(伸長)(合計24サイクル)。
前記プライマリーPCR後に、その生成物をH2O中に1:10に希釈した。以下のプロトコル及びプログラムに従って、セカンダリーPCRを実施した。
95℃で5分間DNAの初期変性;
4サイクル:96℃で10秒間(変性),58℃で10秒間(アニーリング),72℃で1.5分間(伸長);続いて20サイクル:96℃で10秒間(変性),55℃で10秒間(アニーリング),72℃で1分間以下(伸長)(合計24サイクル)。
各患者サンプルからアンプリコンDNAを得て、配列決定した。
前記セカンダリーPCR用のプライマーを、M13配列を用いて端部形成する。前記セカンダリーPCRからのPCR生成物を、1mM−EDTA中に1:10に希釈し、そして色素−プライマー化学、及び前記M13末端に相補的なシークエンシングプライマーを用いて、シークエンシング反応を実施した。シークエンシング生成物を、キャピラリーシークエンサー(MegaBace,Molecular Dynamics)又はABI377シークエンサー上で試験した。原トレースを、商標の付いたソフトウェアを用いて、分析及びベース・コール[base−call]した。
前記プロトコル及び実施例1のプロトコルに従った結果として、以下のコード領域突然変異を発見した。「位置」欄に対する出典は、図1の番号付けシステムを意味する。
前記のとおり多型を確認したら、診断及び予測目的のための、あるいは別の表現型と特定の多型の存在との相関関係を確立するための試験に基づいて、確認された多型のどの型が個体中に存在するかを決定することが望ましくなる。
特定のヌクレオチド位置の同一性の決定においては、同様に論じられている種々の適切な方法がある。
A.サンプルの調製
分析される個体からの目的核酸中で多型を検出する。ゲノムDNAのアッセイには、実質的に全ての生物学的サンプル(純粋な赤血球以外)が適している。例えば、便利な組織サンプルとしては、全血、精液、唾液、涙、尿、便、汗、頬、皮膚、及び毛を挙げることができる。cDNA又はmRNAをアッセイするには、組織サンプルは、目的の核酸が発現している器官から得られたものでなければならない。
1.アレル特異的プローブ
多型を分析するためのアレル特異的プローブの設計及び使用については、例えば、「Saikiら,Nature324,163−166(1986)」;「Dattagupta,EP235,726」、「Saiki,WO89/11548」に記載されている。アレル特異的プローブは、或る個体由来の目的DNAのセグメントにハイブリダイズするが、別の個体からの相当するセグメントにはハイブリダイズしないように設計することができ、それは、前記2者からのそれぞれのセグメント中には、異なる多型の型が存在するからである。アレルと好ましくは実質的バイナリー応答[essentially binary response]との間のハイブリダイゼーション強度に有意な差があり、それにより単一のアレルのみにプローブがハイブリダイズするくらいに、ハイブリダイゼーション条件は、充分にストリンジェントであることが好ましい。或る種のプローブは、目的DNAのセグメントにハイブリダイズして、多型部位とプローブの中心位置(例えば、15mer中では7位において;16mer中では8位又は9位において)とをアラインメントするように設計されている。プローブのこの設計は、異なるアレル型の間のハイブリダイゼーションにおける良好な区別を達成することができる。
「ハイブリダイゼーションアッセイ」としては、特に、後出の、アレイ形式でのハイスループットパラレルハイブリダイゼーションを挙げることができる。
アレル特異的プローブは、しばしば、目的配列の基準型に完全マッチするメンバーと、バリアント型に完全マッチするメンバーとの組合せで使用される。従って、同じ目的配列内の複数の多型の同時分析のために、数組のプローブを同じ支持体上に固定化することができる。
アレル特異的プライマーは、多型が重複している目的DNA上のサイトにハイブリダイズし、そしてそのプライマーが完全な相補性を示すアレル型の増幅のみをプライムする。「Gibbs,Nucleic Acid Res.17,2427−2448(1989)」を参照されたい。このプライマーは、離れたサイトにハイブリダイズするセカンドプライマーと組み合わせて用いられる。特定のアレル型が存在することを知らせる検出可能な生成物をもたらすプライマー2つから、増幅が生じる。通常、第2の組合せのプライマー(その一方は、多型部位において一塩基のミスマッチを示し、そしてもう一方は、離れたサイトに対して完全な相補性を示す)を用いて、コントロールを実施する。前記一塩基のミスマッチは、増幅を妨げ、そして検出可能な生成物が形成されない。前記方法は、前記多型と一緒にアラインメントされたオリゴヌクレオチドの最も3’側の位置に、前記ミスマッチが含まれる場合に、最も作用する。なぜならば、この位置は、前記プライマーからの伸長を最も不安定化させるからである。例えば、WO93/22456を参照されたい。当然のことながら、本発明は、離れたミスマッチを有するプライマー、並びに選択される条件のために不安定な塩基対を形成し、従って、不効率にプライムするプライマーをも考慮する。
本発明の多型の配列の直接分析は、ジデオキシチェーンターミネーション法又はマクサム−ギルバート法〔参照:「Sambrookら,Molecular Cloning,A Laboratory Manual(第2版,CSHP,ニューヨーク州1989)」;「Zyskindら,Recombinant DNA Laboratory Manual,(Acad.Press,1988)」〕のいずれかによって達成することができる。DNA配列決定の分野が、過去数年間の間に著しく進歩してきたこと、及び本発明が、このような進歩を考慮していることを、認められたい。最も著しいことは、過去10年の間に、自動DNA配列分析における信頼性が増してきたことである。
前記ポリメラーゼ連鎖反応を用いて生成された増幅生成物を、変性勾配ゲル電気泳動を用いて分析することができる。配列−依存性融点特性及び溶液中のDNAの電気泳動による移動の違いに基づいて、異なるアレルを同定することができる〔「Erlichら,PCR Technology,Principles and Applications for DNA Amplification,W.H.Freeman and Co,ニューヨーク州,1992,第7章」〕。
一本鎖高次構造多型分析〔この同定は、「Oritaら,Proc.Nat.Acad.Sci.86,2766−2770(1989)」に記載されているとおり、一本鎖PCR生成物の電気泳動による移動における違いによる差違に基づく〕を用いて、目的配列のアレルを区別することができる。増幅したPCR生成物は、前記のとおりに生成することができ、そして加熱するか又は変性させて、一本差増幅生成物を形成することができる。一本鎖核酸は、リフォールディングするか又は二次構造(これは、塩基配列に部分的に依存する)を形成することができる。一本鎖増幅生成物の電気泳動による移動の違いは、目的配列のアレル間の塩基配列の違いに関連づけることができる。
オリゴヌクレオチドアレイに基づくハイブリダイゼーションアッセイは、完全マッチした及びミスマッチの目的配列バリアントに対する短いオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション安定性における違いに基づく。多型情報への能率的な到達は、選択された位置で固形支持体(すなわち、チップ)に結合したオリゴヌクレオチドプローブの高密度アレイを含む基本構造を介して得ることができる。各DNAチップは、格子状パターンに配置された個体合成DNAプローブを、数千〜数百万含むことができ、そして10セント硬貨(dime)の大きさまで小型化することができる。
本発明の多型は、GH−1機能不全を発病する危険性が高い人又はGH−1機能不全に罹病している人を同定することができる診断試験を開発するために使用することもできる。本発明の診断方法は、試験対照が、GH−1機能不全の発病の高い危険性に関連する多型マーカーパターンを有するか否か、あるいは、個体が、存在する特定の突然変異に一致するGH−1機能不全に罹病しているか否かを決定するための種々の方法、例えば、ハプロタイプ決定するための個体の染色体の分析、例えば、家系研究、一精子DNA分析、又は体細胞雑種を実施することができる方法、並びにタンパク質レベルで多型を検出するように設計された抗体に基づく方法を用いることができる。
個体における同じ染色体セグメント上の特定の多型部位を占めるヌクレオチド(ハプロタイプ)のアイデンティティーを決定することが、しばしば特に有利である。従って、本発明は、患者からGH−1多型部位を含む核酸を含む材料を得て;配列番号1又は4内の位置における任意の多型部位に隣接するヌクレオチド配列に相補的なオリゴヌクレオチドプライマーのペアを用いて、前記核酸を酵素学的に増幅して、任意の前記多型部位又は別のGH−1多型部位を含む増幅生成物を生成し、そしてGH−1ハプロタイプを決定することによって、患者におけるGH−1ハプロタイプの存在又は不在を決定することによる、GH−1機能不全、又は個体から子孫へのGH−1機能不全の遺伝の傾向の診断方法、あるいはGH−1機能不全に対する疾病素質の決定方法を更に提供する。
前記診断方法においては、好ましくは、核酸サンプルを、個体から得て、そしてこのサンプルを、前記の方法を用いて遺伝子型判定する。前記診断は、1つの多型に基づくこともできるし、又は1群の多型に基づくこともできる。これらのそれぞれの方法において、核酸サンプルを、試験対象から得て、そして多型マーカー1つ以上の多型パターンを表1に記載した。
(a)S1におけるヌクレオチドのアイデンティティーが、コード鎖上のC又は非コード鎖上のGである
(b)S2におけるヌクレオチドのアイデンティティーが、コード鎖上のT又は非コード鎖上のAである
(c)S3におけるヌクレオチドのアイデンティティーが、コード鎖上のT又は非コード鎖上のAである
(d)S4におけるヌクレオチドのアイデンティティーが、コード鎖上のA又は非コード鎖上のTである
(e)S5におけるヌクレオチドのアイデンティティーが、コード鎖上のA又は非コード鎖上のTである
(f)S6におけるヌクレオチドのアイデンティティーが、コード鎖上のT又は非コード鎖上のAである
(g)S7におけるヌクレオチドのアイデンティティーが、コード鎖上のC又は非コード鎖上のGである
(h)S8におけるヌクレオチドのアイデンティティーが、コード鎖上のG又は非コード鎖上のCである
(i)S9におけるヌクレオチドのアイデンティティーが、コード鎖上のC又は非コード鎖上のGである
の1つ以上が存在する場合には、その個体が、GH−1機能不全に罹病している及び/又はGH−1機能不全への作用剤で治療する必要があるかもしれないという結論がくだされるであろう。
本発明者が見出したところによれば、アミノ酸を変化させるコード領域中のSNPの全ては、抗体−ベース診断に受け入れることが可能であろう。
バリアント遺伝子生成物に対して特異的に結合するが、相当する基準遺伝子生成物[reference gene product]に対しては結合しないポリクローナル抗体及び/又はモノクローナル抗体を、想定する。マウス又はその他の動物に、バリアント遺伝子生成物又はその合成ペプチド断片を注射することにより、抗体を製造することができる。例えば、「Harlow & Lane,Antibodies,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Press,ニューヨーク州(1988)」;「Goding,Monoclonal antibodies,Principles and Practice(第2版)Academic Press,ニューヨーク州(1986)」に記載のとおりに、モノクローナル抗体をスクリーニングする。バリアント遺伝子生成物との特異的免疫活性及び相当する原型遺伝子生成物に対する免疫活性の欠如について、モノクローナル抗体を試験する。これらの抗体は、バリアント型を検出するための診断アッセイにおいて、又は医薬組成物中の活性成分として、有用である。前記抗体を使用する診断は、当業者に周知であり、以下に限定されるものでないが、例えば、ウエスタンブロット分析、ELISA分析、及びラジオイムノアッセイを挙げることができる。
核酸レベルにおいてGH−1機能不全を診断するための予測方法における同じ完全なセットが、おそらく特異的抗体であろうことが推測される。
更に、本発明は、前記アレル特異的オリゴヌクレオチド又は前記抗体の少なくとも1つを含むキットを提供する。前記キットは、しばしば、異なる形態の多型に対してハイブリダイズするアレル特異的オリゴヌクレオチドのペア1組以上を含む。或るキットにおいては、前記アレル特異的オリゴヌクレオチドが、基材に固定されて提供される。例えば、同一の基材が、前記多型の両方を検出するためのアレル特異的オリゴヌクレオチドプローブ(複数)を、含むことができる。前記キットの場合により添加する構成品としては、例えば、制限酵素、逆転写酵素、又はポリメラーゼ、その基質のヌクレオシド三リン酸、ラベル付けに使用する手段(例えば、アビジン酵素複合体、及びラベルがビオチンの場合には、酵素基質及び色原体)、及び逆転写、PCR、又はハイブリダイゼーション反応用の適切な緩衝液を挙げることができる。また、通常、前記キットは、前記方法を実施するための指示書も含む。
本発明は、GH−1遺伝子、又は転写物、又は表1に示す希少なアレルをコードする多型部位を有するGH−1多型部位少なくとも1つを含むその一部によってコードされるGH−1ポリペプチドである、GH−1突然変異ポリペプチド(及びコードする核酸)を含む。従って、用語GH−1突然変異ポリペプチドは、位置13、25、29、47、79又は153の1つ以上が、前記の希少なアレルによってコードされるアミノ酸によって占められている(すなわち、位置13=Val、位置25=Ile又はTyr、位置47=Thr、位置79=Cys、及び/又は位置153=His、あるいはこれらの位置における保存的な置換を有する)配列番号3を含むポリペプチドの種類を包含する。前記ナンバリングシステムが、GH−1タンパク質の最も多いアイソフォームに関するナンバリングを参照していることが理解されよう。また、本発明は、付属のリーダー配列又はシグナル配列を有する無処理のGH−1突然変異ポリペプチドを含み、特に、前記シグナル配列又はリーダー配列中に多型性の置換を同様に有する無処理のGH−1突然変異ポリペプチドを包含する。
多型のアイデンティティーを確立したら、成長ホルモン機能不全以外の表現型の存在又は不在と、多型の特定の型との関係づけを試みることが望ましい。
本発明者らは、本発明の或る多型とGH−1機能不全表現型との関連を確立してきたが、本発明が、本発明の多型部位を別の疾病状態(GH−1機能不全又は別の疾病用の薬剤治療に対する感受性)の分析のためのマーカーとして使用することを想定するか、又は任意の完全な又は部分的なヒトゲノムの遺伝地図に含まれることができることは、明白である。
前記の教えに照らして、多くの本発明の変形及び変更が可能であり、従って、これらも、本発明の範囲内である。本明細書で引用した全ての文献の全開示は、参照することにより本明細書に含まれる。
Claims (48)
- 10〜800の連続したヌクレオチドを含む、単離されたGH−1診断ポリヌクレオチド又はその相補体。
- ゲノムDNAから誘導された、請求項1に記載の単離されたGH−1診断ポリヌクレオチド。
- 配列番号4に記載の配列から誘導された、請求項2に記載の単離されたGH−1診断ポリヌクレオチド。
- メッセンジャーRNAから誘導された、請求項1に記載の単離されたGH−1診断ポリヌクレオチド。
- 多型部位がS1であり、そして前記多型部位におけるヌクレオチドが、A又はCのヌクレオチド群から選択される、請求項1に記載の単離されたポリヌクレオチド。
- 多型部位がS2であり、そして前記多型部位におけるヌクレオチドが、C又はTのヌクレオチド群から選択される、請求項1に記載の単離されたポリヌクレオチド。
- 多型部位がS3であり、そして前記多型部位におけるヌクレオチドが、C又はTのヌクレオチド群から選択される、請求項1に記載の単離されたポリヌクレオチド。
- 多型部位がS4であり、そして前記多型部位におけるヌクレオチドが、T又はAのヌクレオチド群から選択される、請求項1に記載の単離されたポリヌクレオチド。
- 多型部位がS5であり、そして前記多型部位におけるヌクレオチドが、T又はAのヌクレオチド群から選択される、請求項1に記載の単離されたポリヌクレオチド。
- 多型部位がS6であり、そして前記多型部位におけるヌクレオチドが、C又はTのヌクレオチド群から選択される、請求項1に記載の単離されたポリヌクレオチド。
- 多型部位がS7であり、そして前記多型部位におけるヌクレオチドが、A又はCのヌクレオチド群から選択される、請求項1に記載の単離されたポリヌクレオチド。
- 多型部位がS8であり、そして前記多型部位におけるヌクレオチドが、C又はGのヌクレオチド群から選択される、請求項1に記載の単離されたポリヌクレオチド。
- 多型部位がS9であり、そして前記多型部位におけるヌクレオチドが、C又はGのヌクレオチドの群から選択される、請求項1に記載の単離されたポリヌクレオチド。
- ヌクレオチド数が400未満である、請求項1に記載の単離されたポリヌクレオチド。
- ヌクレオチド数が50未満である、請求項1に記載の単離されたポリヌクレオチド。
- ヌクレオチド数が30未満である、請求項1に記載の単離されたポリヌクレオチド。
- ヌクレオチド数が25未満である、請求項1に記載の単離されたポリヌクレオチド。
- ポリヌクレオチドの中心の4ヌクレオチド内に多型が含まれる、請求項1に記載の単離されたポリヌクレオチド。
- ポリヌクレオチドの中心に多型が位置する、請求項1に記載の単離されたポリヌクレオチド。
- ポリヌクレオチドの末端に多型が位置する、請求項1に記載の単離されたポリヌクレオチド。
- ポリヌクレオチドがプローブである、請求項1に記載の単離されたポリヌクレオチド。
- ポリヌクレオチドがプライマーである、請求項1に記載の単離されたポリヌクレオチド。
- 多型部位を含む配列番号4のセグメントの増幅において使用するための、ポリヌクレオチド。
- バリアントGH−1遺伝子にハイブリダイズするが、野生型GH−1遺伝子にはハイブリダイズしない一本鎖DNAプローブであって、前記バリアントGH−1遺伝子が、
1665の位置に「C」を有する配列番号4、
1973の位置に「T」を有する配列番号4、
2034の位置に「T」を有する配列番号4、
2069の位置に「A」を有する配列番号4、
2070の位置に「A」を有する配列番号4、
2081の位置に「T」を有する配列番号4、
2345の位置に「C」を有する配列番号4、
2533の位置に「G」を有する配列番号4、
3007の位置に「G」を有する配列番号4、
からなる群から選択される、前記一本鎖DNAプローブ。 - 固体支持体に取付けた核酸分子のアレイであって、請求項24に記載の一本鎖DNAプローブを含む、前記アレイ。
- 診断若しくは予後判定の目的のために、個体から得られるGH−1をコードする核酸分子又はその断片を分類する方法であって、コード鎖上又は非コード鎖上のどちらかにおけるS1、S2、S3、S4、S5、S6、S7、S8、及びS9からなる群から選択されるGH−1多型部位少なくとも1つを占めるヌクレオチドに対応する前記核酸中のヌクレオチドのアイデンティティーを決定することを含む、前記分類方法。
- 前記決定が、少なくとも2つのGH−1多型部位のヌクレオチドのアイデンティティーを決定することを含む、請求項26に記載の方法。
- 患者の処置に用いられる、GH−1機能不全への作用剤による治療を評価する方法であって、
(a)コード鎖上又は非コード鎖上の何れかにおいて、少なくとも1つのGH−1多型部位を占めるヌクレオチドに対応する前記患者から得られる核酸中のヌクレオチドのアイデンティティーを決定し;
(b)前記患者に、前記剤による治療を実施すべきかを評価する
ことを含む、前記評価方法。 - 以下のいずれかの状態:
(a)S1におけるヌクレオチドのアイデンティティーが、コード鎖上のC又は非コード鎖上のGである
(b)S2におけるヌクレオチドのアイデンティティーが、コード鎖上のT又は非コード鎖上のAである
(c)S3におけるヌクレオチドのアイデンティティーが、コード鎖上のT又は非コード鎖上のAである
(d)S4におけるヌクレオチドのアイデンティティーが、コード鎖上のA又は非コード鎖上のTである
(e)S5におけるヌクレオチドのアイデンティティーが、コード鎖上のA又は非コード鎖上のTである
(f)S6におけるヌクレオチドのアイデンティティーが、コード鎖上のT又は非コード鎖上のAである
(g)S7におけるヌクレオチドのアイデンティティーが、コード鎖上のC又は非コード鎖上のGである
(h)S8におけるヌクレオチドのアイデンティティーが、コード鎖上のG又は非コード鎖上のCである
(i)S9におけるヌクレオチドのアイデンティティーが、コード鎖上のC又は非コード鎖上のGである
が存在する場合に、患者に前記剤による治療を実施すべきと決定することを、前記評価が含む、請求項28に記載の方法。 - 前記剤が、ヒト成長ホルモンである、請求項28に記載の方法。
- GH−1多型部位にGH−1機能不全を示すヌクレオチドを有することが予め確定された患者に、ヒト成長ホルモンを投与することを含む、ヒト成長ホルモンの投与方法であって、前記の予めの確定が、以下の状態:
(a)S1におけるヌクレオチドのアイデンティティーが、コード鎖上のC又は非コード鎖上のGである
(b)S2におけるヌクレオチドのアイデンティティーが、コード鎖上のT又は非コード鎖上のAである
(c)S3におけるヌクレオチドのアイデンティティーが、コード鎖上のT又は非コード鎖上のAである
(d)S4におけるヌクレオチドのアイデンティティーが、コード鎖上のA又は非コード鎖上のTである
(e)S5におけるヌクレオチドのアイデンティティーが、コード鎖上のA又は非コード鎖上のTである
(f)S6におけるヌクレオチドのアイデンティティーが、コード鎖上のT又は非コード鎖上のAである
(g)S7におけるヌクレオチドのアイデンティティーが、コード鎖上のC又は非コード鎖上のGである
(h)S8におけるヌクレオチドのアイデンティティーが、コード鎖上のG又は非コード鎖上のCである
(i)S9におけるヌクレオチドのアイデンティティーが、コード鎖上のC又は非コード鎖上のGである
のいずれかの存在を確認する、投与方法。 - (a)コード鎖上又は非コード鎖上のどちらかにおけるS1、S2、S3、S4、S5、S6、S7、S8、及びS9からなる群から選択されるGH−1多型部位少なくとも1つを占めるヌクレオチドに対応するヌクレオチドのアイデンティティーを決定し;
(b)前記GH−1多型部位におけるヌクレオチドのアイデンティティーに基づいて選択される治療のディスクリプタを伝達する
ことを含む、患者に対する治療の選択方法。 - S1、S2、S3、S4、S5、S6、S7、S8、及びS9からなる群から選択される1つ以上のGH−1多型部位を占めるヌクレオチドに対応する単独染色体上のヌクレオチドを決定することを含む、診断若しくは予後判定の目的のために、個体においてハプロタイプを決定する方法。
- S1、S2、S3、S4、S5、S6、S7、S8、及びS9からなる群から選択されるGH−1多型部位を占めるヌクレオチド(単独又は複数)のアイデンティティーを決定するのに必要な成分を、自給式キット中に小容量で含む、診断キット。
- 10〜800の連続ヌクレオチドを含む単離されたGH−1診断ポリヌクレオチドを含む、請求項34に記載の診断キット。
- (a)配列番号2の位置3のアミノ酸を含むエピトープに対する抗体であって、前記アミノ酸位置におけるアラニンからスレオニンを区別することができる前記抗体;又は
(b)配列番号2の位置19のアミノ酸を含むエピトープに対する抗体であって、前記アミノ酸位置におけるセリンからプロリンを区別することができる前記抗体;
(c)配列番号3の位置13のアミノ酸を含むエピトープに対する抗体であって、前記アミノ酸位置におけるバリンからアラニンを区別することができる前記抗体;
(d)配列番号3の位置25のアミノ酸を含むエピトープに対する抗体であって、前記アミノ酸位置におけるイソロイシン又はチロシンからフェニルアラニンを区別することができる前記抗体;
(e)配列番号3の位置28のアミノ酸を含むエピトープに対する抗体であって、前記アミノ酸位置における末端チロシンを同定することができる前記抗体;
(f)配列番号3の位置47のアミノ酸を含むエピトープに対する抗体であって、前記アミノ酸位置におけるスレオニンからアスパラギンを区別することができる前記抗体;
(g)配列番号3の位置79のアミノ酸を含むエピトープに対する抗体であって、前記アミノ酸位置におけるシステインからセリンを区別することができる前記抗体;
(h)配列番号3の位置153のアミノ酸を含むエピトープに対する抗体であって、前記アミノ酸位置におけるヒスチジンからアスパラギン酸を区別することができる前記抗体
からなる抗体の群から選択される抗体。 - 請求項36に記載の抗体を含む、診断キット。
- 以下の突然変異、すなわち:
(a)GH−1多型部位S3によりコードされているアミノ酸がバリンである;
(b)GH−1多型部位S4によりコードされているアミノ酸がイソロイシンである;
(c)GH−1多型部位S5によりコードされているアミノ酸がチロシンである;
(d)GH−1多型部位S7によりコードされているアミノ酸がスレオニンである;
(e)GH−1多型部位S8によりコードされているアミノ酸がシステインである;
(f)GH−1多型部位S9によりコードされているアミノ酸がヒスチジンである;
を1つ以上含む、単離されたGH−1突然変異ポリペプチド。 - 突然変異1つを含む、請求項38に記載の単離された突然変異ポリペプチド。
- 請求項38に記載のGH−1突然変異ポリペプチドをコードする、単離されたポリヌクレオチド。
- 疾病状態の治療が必要な患者に、前記患者の組織中のGH−1活性を変化させるのに充分な量でGH−1突然変異ポリペプチドを投与する工程を含む、疾病状態の治療方法。
- S1、S2、S3、S4、S5、S6、S7、S8、及びS9からなる群から選択されるGH−1多型部位少なくとも1つによってコードされるアミノ酸のアイデンティティーを決定することを含む、ポリペプチドがGH−1突然変異ポリペプチドであるか否かの確定のため、診断若しくは予後判定の目的で個体から得られるGH−1ポリペプチドを分類する方法。
- 決定が、GH−1多型部位少なくとも2つによってコードされるアミノ酸のアイデンティティーを決定することを含む、請求項42に記載の方法。
- 患者の処置に用いる、GH−1機能不全への作用剤による治療を評価する方法であって、
(a)患者から得られるGH−1ポリペプチドがGH−1突然変異ポリペプチドであるかを決定し;
(b)患者に、前記剤による治療を実施すべきかを評価する
ことを含む、評価方法。 - 前記評価が、以下のいずれかの状態:
(a)GH−1多型部位S1によりコードされているアミノ酸のアイデンティティーがアラニンである;
(b)GH−1多型部位S2によりコードされているアミノ酸のアイデンティティーがセリンである;
(c)GH−1多型部位S3によりコードされているアミノ酸のアイデンティティーがバリンである;
(d)GH−1多型部位S4によりコードされているアミノ酸のアイデンティティーがイソロイシンである;
(e)GH−1多型部位S5によりコードされているアミノ酸のアイデンティティーがチロシンである;
(f)GH−1多型部位S6に隣接するアミノ酸のアイデンティティーが末端チロシンである;
(g)GH−1多型部位S7によりコードされているアミノ酸のアイデンティティーがスレオニンである;
(h)GH−1多型部位S8によりコードされているアミノ酸のアイデンティティーがシステインである;
(i)GH−1多型部位S9によりコードされているアミノ酸のアイデンティティーがヒスチジンである;
が存在する場合に、前記剤による治療を患者に実施すべきと決定することを含む、請求項44に記載の方法。 - 前記剤が、ヒト成長ホルモンである、請求項44に記載の方法。
- 突然変異GH−1ポリペプチドを発現することが予め確定された患者にヒト成長ホルモンを投与することを含む、ヒト成長ホルモンの投与方法であって、前記の予めの確定が、以下の条件:
(a)GH−1多型部位S1によってコードされるアミノ酸のアイデンティティーが、アラニンである;
(b)GH−1多型部位S2によってコードされるアミノ酸のアイデンティティーが、セリンである;
(c)GH−1多型部位S3によってコードされるアミノ酸のアイデンティティーが、バリンである;
(d)GH−1多型部位S4によってコードされるアミノ酸のアイデンティティーが、イソロイシンである;
(e)GH−1多型部位S5によってコードされるアミノ酸のアイデンティティーが、チロシンである;
(f)GH−1多型部位S6に隣接するアミノ酸のアイデンティティーが、末端チロシンである;
(g)GH−1多型部位S7によってコードされるアミノ酸のアイデンティティーが、スレオニンである;
(h)GH−1多型部位S8によってコードされるアミノ酸のアイデンティティーが、システインである;
(i)GH−1多型部位S9によってコードされるアミノ酸のアイデンティティーが、ヒスチジンである
のいずれかの存在を確認する、投与方法。 - (a)患者から得られるGH−1ポリペプチドがGH−1突然変異ポリペプチドであるかを決定し;
(b)GH−1多型部位によってコードされるアミノ酸のアイデンティティーに基づいて選択された治療のディスクリプタを伝達する
ことを含む、患者に対する治療の選択方法。
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