EA020795B1 - Генетические маркеры, ассоциированные с ответом на интерферон-альфа - Google Patents

Abstract

Изобретение предоставляет генетические маркеры, расположенные на хромосоме 19 человека, которые ассоциированы с положительным ответом на интерферон-альфа (IFN-α). Указанные маркеры ответа на IFN-α являются полезными, помимо прочего, для выявления пациентов, на которых, по всей вероятности, окажет благоприятное действие лечение фармацевтическими композициями и лекарственными продуктами IFN-α, в способах лечения пациентов, имеющих заболевание, поддающееся лечению IFN-α, и в способах выбора наиболее подходящей терапии для таких пациентов.

Description

Настоящее изобретение относится к генетическим маркерам, расположенным на хромосоме 19 человека, которые являются прогностическими для положительного ответа на терапию ΙΡΝ-α.

Уровень техники изобретения

Идентификация какой-либо публикации в данном разделе или в любом разделе настоящей заявки не является подтверждением того, что такая публикация представляет собой известный уровень техники настоящего изобретения.

Семейство белков интерферона-альфа (ΙΡΝ-α) типа I проявляет клинически важные противовирусные антипролиферативные и иммуномодуляторные активности, и различные белки ΙΡΝ-α были одобрены для лечения ряда заболеваний, включая гепатит и злокачественные опухоли. Ввиду короткого времени полужизни в плазме крови исходно одобренных белков ΙΡΝ-α были разработаны длительно действующие версии: в частности, пег-1Р^а-2а, поставляемый на рынок Нойшаи-Ьа Коске (ΝτιΙΙον. N1) под коммерческим названием ΡΕΟΆδΥδ®; пег-1Р^а-2Ъ, поставляемый на рынок §скетт§-Р1оидк (Кет1\уог1к. N1) под коммерческим названием Ред1йгои® и Л1Ъи1сгоп®. слитый белок человеческого сывороточного альбумина и ΙΡΝ-α-2Ρ который находится на поздней стадии клинической разработки компании Нитап Сеиоте 8с1еисе5.

Белки ΙΡΝ-α воздействуют на ряд клеточных функций, включая репликацию ДНК и синтез РНК и белков в нормальных и патологических клетках. Таким образом, цитотоксические эффекты терапии ΙΡΝ-α не ограничиваются опухолевыми или зараженными вирусом клетками, но также проявляются в нормальных здоровых клетках в такой же мере. В результате во время терапии ΙΡΝ-α возникают нежелательные, но обычно обратимые побочные эффекты, особенно если для достижения терапевтического эффекта необходимы высокие дозы. Например, введение белков ΙΡΝ-α может привести к снижению количества эритроцитов, лейкоцитов и тромбоцитов, и высокие дозы часто вызывают гриппоподобные симптомы (например, лихорадка, утомляемость, головные боли и озноб), желудочно-кишечные нарушения (например, анорексия, тошнота и диарея), изменения настроения и изменение ферментов печени.

Такие побочные эффекты могут иметь особо важное значение из-за продолжительного времени лечения, обычно необходимого при терапии на основе ΙΡΝ-α. Например, рекомендуемая продолжительность комбинированной терапии пег-ШИ-а/рибавирином при инфекции вирусом гепатита С (НСУ) составляет от 24 до 48 недель в зависимости от генотипа НСУ и исходного уровня вирусной нагрузки. Продолжительность лечения при определенных онкологических показаниях может быть даже более длительной, чем подтверждено в недавно завершенном клиническом испытании пег-1РИ-а-2Ъ в качестве адъювантной терапии при резецированной меланоме III стадии, в котором пациенты получали 6 мкг/кг пег-1РИ-а-2Ъ подкожно в течение 8 недель (индуктивная фаза) с последующими 3 мкг/кг в неделю подкожно при планируемой продолжительности лечения 5 лет (фаза стабилизации) (Еддегтои! А.М.М. е! а1., Ьаисе! 372:117-126 [2008]).

Помимо возможности проблематичных побочных эффектов, терапевтический эффект лечения ΓΡΝ-α может значительно варьировать среди пациентов с определенным заболеванием. Например, комбинированная терапия пег-IΡN-α-2Ъ/рибавирином при НСУ дает значение устойчивого вирусологического ответа (8УК) приблизительно от 20 до 93% в различных группах пациентов, определяемых генотипом НСУ и исходным уровнем вирусной нагрузки. Также пациенты с НСУ африканского происхождения имеют значительно более низкие показатели устойчивого вирусологического ответа (8УК), чем пациенты европейского происхождения; см., например, публикации МсСоие, 1. е! а1., Нера!о1оду 48 (4):430А-43 АЪк!г. №. 268 (59!к Аии. М!д. Ат. Аккос. §!ибу Ыует Όίδ., ΑΑδΡΌ, §аи РгапсЬсо, СА, И8А, Ос!. 31№ν. 4, 2008); КеШ, А.Е., Сигг. Нераййк Кер., Уо1. 7, №. 3, р. 120-126 (2008); 1асоЪкоп, ТМ. е! а1. Нера!о1оду, 46 (4): 971-981 (2007). Также Еддегтои! е! а1., выше, сообщали о более благоприятных исходах заболевания у пациентов с ранней III стадией меланомы, чем у пациентов с более поздней стадией заболевания, в частности, о снижении совокупного риска рецидива приблизительно на 18-25%.

Таким образом, с учетом побочного эффекта, вариабельного ответа и профилей чувствительности, наблюдаемых при терапии ΓΡΝ-α, существует потребность в способе определения пациентов, на которых терапия ΣΡΝ-α наиболее вероятно будет оказывать благоприятное действие. Настоящее изобретение направлено на удовлетворение данной потребности.

Сущность изобретения

Настоящее изобретение основано на открытии, что несколько однонуклеотидных полиморфизмов (8ΝΡ) хромосомной области человека 19ц13.13 прочно ассоциированы с ответом на лечение пег-ΡΡΝα/рибавирином у пациентов, хронически инфицированных НСУ генотипа 1.

Один из 8ΝΡ представляет собой полиморфизм С/Т, идентифицируемый как гк12979860 в базе данных δΝΡ ΝΟΒΤ Полиморфизм гк12979860 расположен на 3 т.п.н. выше гена интерлейкина 28В (Й-28В), который кодирует интерферон-лямбда 3 (ΣΡΝ-λ3). Наличие аллеля С ассоциировано с лучшим ответом на лечение, причем генотип С/С ассоциирован с повышением вероятности устойчивого вирусологического ответа (8УК) в 2, в 3 и в 2 раза, по сравнению с генотипом Т/Т у пациентов с НСУ европейского, афри- 1 020795 канского и испанского происхождения соответственно. Кроме того, поскольку генотип С/С представлен со значительно более высокой частотой в популяции европейского происхождения, чем в популяции африканского происхождения, полиморфизм г§12979860 объясняет важный компонент межпопуляционного различия при ответе пациентов с НСУ на комбинированную терапию пегилированным ΙΡΝα/рибавирином. Частота аллеля С Г812979860 существенно снижена в когорте пациентов, хронически инфицированных НСУ, по сравнению с произвольно выбранной популяционной группой с неизвестным статусом гепатита С, что позволяет предположить, что аллель С также ассоциирован с более высокой вероятностью спонтанного клиренса гепатита С генотипа 1.

Авторы изобретения здесь также определили связи между г§12979860 и другими 8ΝΡ на 19ц13.13, которые сами ассоциированы с 8УК. Два из указанных 8ΝΡ находятся в гене 1Ь-28В: г§28416813, полиморфизм С/С, расположенный на 37 оснований выше стартового кодона АТС, и щ8103142, полиморфизм Л/С, расположенный в кодирующей последовательности, который приводит в результате к явлению аминокислотного полиморфизма Ьу8 или Агд в положении 70 аминокислотной последовательности ΙΡΝ-λ3, представленной на фиг. 4 (8ЕС ГО N0: 10). Аллель А полиморфизма г§8103142 кодирует Ьу8 в положении 70 ΙΡΝ-λ3, тогда как полиморфизм С дает в результате Агд в положении 70. На основе недавно опубликованной кристаллической структуры ΙΡΝ-λ3 (Сай, Н.Н. с1 а1., ЙВС 2009, размещенной он-лайн 20 мая 2009 г. как Маищспр! М109.002923), авторы изобретения предполагают здесь, что вариация Агд/Ьук находится в петле АВ области, которая вероятно участвует в связывании ΙΡΝ-λ3 с ΙΡΝ-λΚ1.

8ΝΡ в гене ГО28В представляют особый интерес в качестве кандидатных полиморфизмов, выражающих причинную обусловленность, в качестве кандидатных каузальных полиморфизмов, поскольку экспрессия ΙΡΝ-λ3 вызывается инфицированием НСУ и другими вирусами, и ΙΡΝ-λ3 проявляет антивирусную активность ίη νίνο (8Ьеррагй, Р. с1 а1., №Циге Iттиηο1. 4(1):63-68 (2003); Ко!еико, 8.У., с1 а1., Να1иге Iттиηο1οду 4(1):р. 69-77 (2003); Лик, Ν., е! а1., ί. ГОегТегои & Су1окте Кек. 26:373-379 (2006)). В частности, ассоциация аллеля Агд70 с более слабым ответом на ΙΡΝ-α позволяет предположить, что наличие данного аллеля негативно влияет на способность субъекта производить важные компоненты иммунного ответа на НСУ, которые участвуют в обеспечении 8УК при терапии на основе ΙΡΝ-α. Это может происходить в результате сниженной функции изоформы Агд70 по сравнению с изоформой Ьук70 в результате воздействия изоформы Агд70 на функцию изоформы Ьук70 или из-за комбинации обоих эффектов. Принимая во внимание тот факт, что сниженные уровни изоформы Агд70 в сыворотке крови являются наиболее правдоподобным объяснением фенотипа с более слабым ответом, авторы изобретения обнаружили, что человеческая клеточная линия, сконструированная для экспрессии тус-меченной версии изоформы Ьук70 или изоформы Агд70, секретирует в значительно больших количествах изоформу Ьук70.

8ΝΡ, ассоциированные с ответом на терапию ΙΡΝ-α, описаны в табл. 1 ниже, в которой перечислены полиморфные сайты (Р8), где располагается 8ΝΡ, идентифицируемый с помощью обозначения базы данных 8ΝΡ ΝΟΒΙ, альтернативные аллели, которые обнаружены в Р8, аллель, который ассоциирован с лучшим ответом на терапию ΙΡΝ-α, и гетерозиготные и гомозиготные генотипы, содержащие указанный аллель, которые обозначаются здесь как маркеры ответа на ΙΡΝ-α.

Таблица 1

Маркеры ответа на ΙΡΝ-α

ΡΞ	5ΝΡ	Аллель лучшего ответа	Гетерозиготный маркер ответа на ΙΡΝ-α	Гомозиготный маркер ответа на ΙΡΝ-α
Г312979860	т/с	С	генотип С/Т	генотип С/С
Г328416813	с/с	<3	генотип С/С	генотип С/С
Г38103142	А/а	А	генотип А/С	генотип А/А
Г3129В0275	А/С	А	генотип А/С	генотип А/А
гз8099917	А/С	А	генотип А/С	генотип А/А
Г312972991	т/е	Т	генотип Т/С	генотип Т/Т
Г38109886	А/С	С	генотип С/А	генотип С/С
гз4803223	т/с	т	генотип Т/С	генотип Т/Т
Г312980602	А/С	А	генотип А/С	генотип А/А

Авторы изобретения предполагают здесь, что тестирование субъектов на наличие одного или более маркеров ответа на ΙΡΝ-α табл. 1 будет полезным для ряда фармакогинетических продуктов и методов, которые включают определение пациентов, которые наиболее вероятно ответят на терапию ΙΡΝ-α при заболевании, поддающемся лечению ΙΡΝ-α, для определения субъектов, хронически инфицированных НСУ, которым может быть полезно дополнение комбинированной терапии ΙΡΝ-α/рибавирином, терапией, которая увеличивает уровни изоформы Ьук70 ΙΡΝ-λ3, снижает уровни изоформы Агд70 ΙΡΝ-λ3 или оказывает оба эффекта, и для помощи врачам в принятии решения, назначать ли противовирусную терапию пациенту с острой инфекцией НСУ.

Таким образом, в одном варианте осуществления изобретение предоставляет фармацевтическую

- 2 020795 композицию, содержащую ΙΡΝ-α, для лечения субъекта, имеющего заболевание, поддающееся лечению ΙΡΝ-α, и положительный результат теста по меньшей мере на один маркер ответа на ΙΡΝ-α.

В другом варианте осуществления изобретение предоставляет применение ΙΡΝ-α в получении лекарственного препарата для лечения субъекта, имеющего заболевание, поддающееся лечению ΙΡΝ-α, и положительный результат теста по меньшей мере на один маркер ответа на ΙΡΝ-α.

В еще одном варианте осуществления изобретение предоставляет фармацевтический продукт, который содержит фармацевтическую композицию ΙΡΝ-α и инструкцию-вкладыш, которая включает фармакогенетическое показание, при котором рекомендуется фармацевтическая композиция. Фармакогенетическое показание включает два компонента: заболевание, поддающееся лечению ΙΡΝ-α в фармацевтической композиции, и пациенты, которые имеют заболевание и которые генетически характеризуются наличием по меньшей мере одного маркера ответа на ΙΡΝ-α.

Изобретение также предоставляет способ тестирования субъекта на наличие или отсутствие по меньшей мере одного маркера ответа на ΙΡΝ-α, способ включает получение образца нуклеиновой кислоты субъекта и анализ образца для определения генотипа субъекта по меньшей мере в одном из полиморфных сайтов в табл. 1.

В другом варианте осуществления изобретение предоставляет способ тестирования субъекта на наличие или отсутствие маркера ответа на ΙΡΝ-α в Ρδ г§8103142, способ включает получение биологического образца субъекта и анализ биологического образца на наличие ΙΡΝ-λ3 с Ьу8 в положении аминокислоты 70 или на наличие ΙΡΝ-λ3 с Агд в положении аминокислоты 70. В некоторых вариантах осуществления стадия анализа включает взаимодействие биологического образца с моноклональным антителом, которое способно различать ΙΡΝ-λ3 с Ьу8 в положении аминокислоты 70 и ΙΡΝ-λ3 с Агд в положении аминокислоты 70.

В некоторых вариантах осуществления способ тестирования субъектов на наличие или отсутствие маркера ответа на ΙΡΝ-α дополнительно включает создание отчета по результатам исследования, в котором указан генотип субъекта в анализируемом полиморфном сайте, и при желании предоставление отчета по результатам исследования субъекту или врачу, который лечит субъекта, по поводу заболевания, поддающегося лечению ΙΡΝ-α.

В еще одном аспекте изобретение предоставляет набор для обнаружения маркера ответа на ΙΡΝ-α в образце нуклеиновой кислоты. Набор включает комплект из одного или более олигонуклеотидов, сконструированных для идентификации каждого из аллелей в полиморфном сайте маркера ответа ΙΡΝ-α. В некоторых вариантах осуществления образец нуклеиновой кислоты является образцом, полученным у пациента, имеющего заболевание, поддающееся лечению ΙΡΝ-α. В одном варианте осуществления заболевание является хронической НСУ-инфекцией, субъект ранее перенес трансплантацию печени и образец нуклеиновой кислоты является образцом биопсии трансплантированной печени. В другом варианте осуществления образец нуклеиновой кислоты является образцом донорской печени, которую тестируют для трансплантации пациенту с хронической НСУ-инфекцией.

В еще одном варианте осуществления изобретение предоставляет способ выбора терапии для лечения субъекта, имеющего заболевание, поддающееся лечению ΙΡΝ-α, включающий определение, имеет ли субъект по меньшей мере один маркер ответа на ΙΡΝ-α, и выбор терапии, исходя из результатов стадии тестирования, при котором, если субъект имеет маркер ответа на ΙΡΝ-α, выбираемая терапия включает начальное лечение или продолженное лечение ΙΡΝ-α, и, если субъект не имеет маркера ответа на ΙΡΝ-α, выбранная терапия либо включает введение ΙΡΝ-α в комбинации по меньшей мере с одним другим терапевтическим агентом, который не является ΙΡΝ-α, либо исключает лечение на основе ΙΡΝ-α.

Изобретение также предоставляет метод скрининга для отбора субъектов для начального лечения или продолженного лечения ΙΡΝ-α из группы субъектов, имеющих заболевание, поддающееся лечению ΙΡΝ-α. Указанный метод скрининга включает тестирование каждого члена группы заболевания на наличие по меньшей мере одного маркера ответа на ΙΡΝ-α и отбор для лечения по меньшей мере одного субъекта, положительно тестируемого на маркер ответа на ΙΡΝ-α.

В каждом из приведенных выше вариантов осуществления маркер ответа ΙΡΝ-α представляет собой любой из маркеров ответа на ΙΡΝ-α в гетерозиготном и гомозиготном состоянии, представленных в табл. 1. В предпочтительных вариантах осуществления маркер ответа на ΙΡΝ-α представляет собой один из маркеров ответа в гомозиготном состоянии. В одном предпочтительном варианте осуществления маркер ответа на ΙΡΝ-α представляет собой генотип А/А в Ρδ г§8103142 или генотип С/С в щ28416813. В других вариантах осуществления прогноз ответа на ΙΡΝ-α основан на наличии маркера ответа на ΙΡΝ-α по меньшей мере для двух Ρδ из табл. 1.

В еще одном варианте осуществления изобретение предоставляет способ прогнозирования, ответит ли пациент с хронической НСУ-инфекцией на комбинированную терапию, включающую ΙΡΝ-α-2 и рибавирин. Способ включает получение образца нуклеиновой кислоты субъекта, оценку образца нуклеиновой кислоты на наличие по меньшей мере одного маркера ответа на ΙΡΝ-α в гомозиготном состоянии из

- 3 020795 табл. 1 и проведение прогноза на основе результатов стадии оценки. Если результаты теста на наличие маркера ответа на ΙΡΝ-α в гомозиготном состоянии положительны, прогнозируется, что субъект, вероятно, достигнет §УК, и если результаты теста на наличие маркера ответа на ΙΡΝ-α в гомозиготном состоянии отрицательны (например, субъект имеет генотип С/Т или генотип Т/Т в полиморфном сайте Т812979860), прогнозируется, что субъект, вероятно, не достигнет §УК. В одном варианте осуществления пациент ранее перенес трансплантацию печени и образец нуклеиновой кислоты является образцом биопсии трансплантируемой печени.

В еще одном варианте осуществления изобретение предоставляет способ лечения субъекта с хронической НСУ-инфекцией. Способ включает определение генотипа субъекта по меньшей мере для одного из полиморфных сайтов табл. 1 и назначение схемы лечения, исходя из полученного генотипа. Если генотип представляет собой генотип маркеров ответа на ΙΡΝ-α в гомозиготном состоянии, то схема лечения включает введение субъекту ΙΡΝ-α в комбинации с рибавирином. В некоторых вариантах осуществления схема лечения субъекта с маркером ответа на ΙΡΝ-α в гомозиготном состоянии включает введение субъекту терапевтически эффективных количеств пегилированного ΙΡΝ-α, рибавирина и по меньшей мере одного другого антивирусного агента. В некоторых вариантах осуществления другой противовирусный агент является ингибитором протеазы НСУ или ингибитором полимеразы НСУ. Если полученный генотип не является маркером ответа на ΙΡΝ-α в гомозиготном состоянии (т.е. является гетерозиготным или гомозиготным по аллелю слабого ответа), то в некоторых вариантах осуществления назначаемая схема лечения включает один или более противовирусных агентов, которые не являются ΙΡΝ-α, и в некоторых предпочтительных вариантах осуществления такие противовирусные агенты выбирают из ингибиторов протеазы НСУ, ингибиторов полимеразы НСУ и лекарственных средств, которые увеличивают уровни изоформы ΙΡΝ-λ3 Ьу870, снижают уровни изоформы ΙΡΝ-λ3 Лт§70 или делают и то, и другое.

В еще одном варианте осуществления изобретение предоставляет фармацевтический продукт, содержащий фармацевтическую композицию ΙΡΝ-λ3 Ьу870 и инструкцию-вкладыш, в которой указано, что фармацевтическая композиция рекомендуется для лечения субъекта, инфицированного НСУ, и имеющего положительный результат теста на наличие аллеля С в щ8103142. Фармацевтическая композиция ΙΡΝλ3 Ьу870 включает полипептид ΙΡΝ-λ3 Ьу870 или вектор экспрессии, который кодирует полипептид ΙΡΝλ3 Ьу870. В предпочтительных вариантах осуществления в инструкции-вкладыше дополнительно указано, что фармацевтическая композиция ΙΡΝ-λ3 Ьу870 предназначена для применения в комбинации с терапией на основе ΙΡΝ-α.

В еще одном варианте осуществления изобретение предоставляет фармацевтическую композицию, которая специфически нейтрализует активность ΙΡΝ-λ3 Агд70, но не ΙΡΝ-λ3 Ьу870. В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция включает моноклональное антитело, которое специфически связывается и нейтрализует полипептид, содержащий аминокислоты 23-196 фиг. 4 (δΕφ ΙΌ ΝΟ: 10), в котором аргинин замещен лизином в положении аминокислоты 70, но не связывается с полипептидом, содержащим аминокислоты 23-196 δΕφ ГО ΝΟ: 10, в котором лизин представлен в положении аминокислоты 70. В других вариантах осуществления нейтрализующая фармацевтическая композиция включает молекулу, которая ингибирует экспрессию ΙΡΝ-λ3 Ат§70, но не ΙΡΝ-λ3 Ьу870. В некоторых вариантах осуществления молекула является антисмысловой РНК, δί-РНК или рибозимом.

В некоторых вариантах осуществления любой из приведенных выше композиций и способов, в которых заболевание, поддающееся лечению ΙΡΝ-α, является хронической НСУ-инфекцией, хроническая НСУ-инфекция представляет собой инфекцию с исходным высоким уровнем вирусной нагрузки, с генотипом НСУ, выбранным из группы, состоящей из генотипа 1 (С1 НСУ), генотипа 3 (С3 НСУ) или генотипа 4 (С4 НСУ).

Во всех упомянутых выше вариантах осуществления ΙΡΝ-α предпочтительно представляет собой пегилированный ΙΡΝ-α-2α или пегилированный ΙΡΝ-α-2Ε и в особенно предпочтительных вариантах осуществления ΙΡΝ-α представляет собой РЕСА§У§® (пег-ШЫ-а-2а) или РсДШгоп® (пег-ШЫ-а-2Ъ).

Во всех упомянутых выше вариантах осуществления пациент с заболеванием, поддающимся лечению ΙΡΝ-α, не отвечал соответствующим образом на предшествующую терапию ΙΡΝ-α.

Во всех упомянутых выше вариантах осуществления положительный результат теста на маркер ответа на ΙΡΝ-α может быть использован в комбинации с наличием одного или более других предикторов положительного ответа на терапию ΙΡΝ-α для выявления пациентов, которые, вероятно, ответят на начальную или продолженную терапию ΙΡΝ-α.

В еще одном варианте осуществления изобретение предоставляет способ оценки вероятности того, что пациент, имеющий хроническую инфекцию НСУ генотипа 1, достигнет устойчивого вирусологического ответа с использованием комбинированной терапии пегилированным ΙΡΝ-α-2 и рибавирином. Способ включает получение набора генетических и клинических предикторов ответа пациента, ввод полученных предикторов в компьютер, в котором запускают модель логистической регрессии на основании введенных предикторов для расчета оценки вероятности, и передача оценки вероятности пациенту или

- 4 020795 врачу пациента, где пациент идентифицирует себя как афро-американец или европеец, где ряд генетических и клинических предикторов ответа состоит из генотипа пациента в полиморфном сайте Г512979860. исходного уровня НСУ-вирусной нагрузки пациента, определения пациентом своей этнической принадлежности и оценки исходного уровня фиброза у пациента по шкале МЕТАУ1К. и где логистическая регрессионная модель представляет собой _{Р =}_!_ + 1,7х«+< 1.1ΧΘ+1 где Р - вероятность достижения §УК;

С - генотип Т512979860: ТТ=0, СТ=1, СС=2;

У - исходный уровень вирусной нагрузки: больше или равен 600000 МЕ/мл=0, меньше 600000 МЕ/мл=1;

Е - этническая принадлежность: африканское происхождение=0, европейское происхождение=1;

Р - исходный уровень фиброза: МЕТАУ1К Р3-4=0, Р0-2=1.

В еще одном варианте осуществления изобретение предоставляет способ лечения субъекта, у которого диагностирована острая инфекция НСУ. Способ включает получение генотипа субъекта для Р§ Т812979860 и принятие решения о лечении на основе полученного генотипа. Если генотип является гомозиготным по Т, то лечебным решением является начать пациенту антивирусную терапию. Если генотип является гетерозиготным по С или гомозиготным по С, то лечебным решением является отложить антивирусную терапию до тех пор, пока у субъекта не будет диагностирована хроническая НСУ-инфекция.

Краткое описание чертежей

Фиг. 1 иллюстрирует результаты тестов тенденции изменения генотипа одного маркера в отношении важных детерминант устойчивого вирусологического ответа (8УК) в объединенной группе пациентов европейского, афро-американского и испанского происхождения, хронически инфицированных НСУ генотипа 1 и получавших лечение комбинированной терапией пег-1РЫ-а-2/рибавирином. На верхнем и среднем графиках представлены значения р всех генотипированных 8ΝΡ (ось Υ), полученные в результате анализа всего генома и хромосомы 19 соответственно, и красные вертикальные линии указывают 8ΝΡ. которые показывают статистически значимую связь с 8УР по всему геному, красная стрелка указывает δΝΡ Т812979860. На нижнем графике показано положение известных генов на хромосоме 19, обозначенных вертикальными полосками, при этом некоторые гены указаны по названию и положение гена 1Ь-28В указано голубой стрелкой. Дополнительные детали представлены в примерах.

Фиг. 2 иллюстрирует связь между генотипом полиморфного сайта Т512979860 (Т/Т, Т/С или С/С) (ось Υ) и процентом пациентов каждого генотипа, которые достигли 8УР (ось X и круговая диаграмма) в различных группах пациентов, хронически инфицированных НСУ генотипа 1 и получавших лечение комбинированной терапией пег-1Р^а/рибавирином. Дополнительные детали представлены в примерах.

Фиг. 3 иллюстрирует показатель устойчивого вирусологического ответа (8УК) и частоту аллеля С Т812979860 в различных этнических группах, при этом показатели §УК пациентов европейского, испанского и афро-американского происхождения взяты из двух клинических исследований, описанных здесь в примерах, и показатель §УК пациентов восточно-азиатского происхождения взят из публикации Ьш, С.Н. с1 а1., Реду1а1ей иПегГегоп-а1Га-2а р1и5 пЬазапп ίοτ 1гса1тсп1-паР'с Аиап райеп18 \νί11ι йераййз С νίιπδ дспо1урс 1 тГесйоп: а тиШеейет, гапйоип/ей соп1го11ей 1па1. С1ш 1пГес1 Όίδ А1, 1260-9 (2008). Дополнительные детали представлены в примерах.

Фиг. 4 иллюстрирует референсную аминокислотную последовательность человеческого предшественника 28В (ΙΡΝ-λ3): референсная последовательность из 196 аминокислот, NСВI ΝΡ_742151.2, С1:28144901 (8ЕО ΙΌ ΝΟ: 10), причем предсказанный сигнальный пептид подчеркнут и локализация положений вариантных аминокислот, описанных в базе данных 8ΝΡ NСВI по состоянию на 15 июня 2009 г., указана выделенными буквами в референсной последовательности, и обозначение вариантного аллеля указано выделенной буквой под положением вариантной аминокислоты.

Фиг. 5 иллюстрирует сниженную секрецию изформы ΙΡΝ-λ3 Ат§70 по сравнению с изоформой ΙΡΝλ3 Ьу870, когда они экспрессированы в виде тус-меченных конструкций в клетках Т293, причем на фиг. 5А изображен окрашенный Кумасси голубым гель общего белка, представленного в супернатанте через 48 ч после трансфекции указанной экспрессионной конструкции, и на фиг. 5В представлен вестернблоттинг сдвоенного геля, исследованного с помощью антитела анти-тус.

- 5 020795

Подробное описание изобретения

I. Определения.

С целью облегчения понимания изобретения ниже приводятся следующие технические и научные термины. За исключением случаев, особо указанных в другом месте в настоящем документе, все другие технические и научные термины, применяемые здесь, используются в значении, обычно понимаемом специалистом в области, к которой принадлежит изобретение, если термины применяют в контексте, сходном с используемым здесь контекстом.

В данном контексте, включая прилагаемую формулу изобретения, определения в единственном числе включают соответствующие их упоминания во множественном числе, если из контекста не следует ясно иное.

Приблизительно, когда используется для определения количественно задаваемого параметра, например дозы терапевтического агента, рассматриваемого здесь, или продолжительности времени лечения, означает, что параметр может изменяться на 10% больше или меньше от указанного числового значения для данного параметра. Например, доза приблизительно 1,5 мкг/кг Ред1и1гои® (пег-1РЫ-а-2Ь), используемая при лечении пациентов с НСУ, может изменяться от 1,30 до 1,65 мкг/кг.

Аллель представляет собой определенную форму гена или другого генетического локуса, отличающуюся от других форм своей специфической нуклеотидной последовательностью, термин аллель также включает один из альтернативных полиморфизмов (например, БИР), обнаруживаемых в полиморфном сайте.

Благоприятный результат означает желаемый клинический результат лечения ΙΡΝ-α, включая без ограничения: уменьшение одного или более симптомов заболевания, снижение степени заболевания (например, снижение вирусной нагрузки), стабильное (т.е. неухудшающееся) состояние заболевания, замедление прогрессирования заболевания, улучшение или временное облегчение состояния заболевания, продление выживаемости (по сравнению с ожидаемой выживаемостью при отсутствии лечения), безрецидивная выживаемость, ремиссия (частичная или полная) и выздоровление (т.е. устранение заболевания).

Термин состоит, по существу, из и варианты, такие как состоят, по существу, из или состоящий, по существу, из, которые используют в описании и в формуле изобретения, показывают включение любых перечисленных элементов или группы элементов и необязательное включение других элементов, сходной или другой природы, чем перечисленные элементы, которые не изменяют фактически начальных или новых свойств указанного режима дозирования, способа или композиции.

Субъект, или животное, или пациент, или млекопитающее обозначает любого субъекта, в особенности субъекта-млекопитающего, которому нужны или могут быть полезны любая из заявленных композиций и способов. В предпочтительных вариантах осуществления субъект является человеком. В более предпочтительных вариантах осуществления субъект является взрослым человеком, т.е. по меньшей мере в возрасте 18 лет.

Ответ на ΙΡΝ-α означает желаемый клинический результат лечения ΙΡΝ-α, включая, но без ограничения: уменьшение одного или более симптомов заболевания, снижение степени заболевания (например, снижение вирусной нагрузки), стабильное (т.е. не ухудшающееся) состояние заболевания, замедление прогрессирования заболевания, улучшение или временное облегчение состояния заболевания, продление выживаемости (по сравнению с ожидаемой выживаемостью при отсутствии лечения), безрецидивная выживаемость, ремиссия (частичная или полная) и выздоровление (т.е. устранение заболевания).

Не леченный ранее ΙΡΝ-α означает, что субъект или пациент, которого лечат или проверяют согласно любому из вариантов осуществления, описанных здесь, не получал раньше лечения каким-либо ΙΡΝ-α, включая какой-либо экспериментальный или утвержденный фармацевтический продукт ΙΡΝ-α.

Интерферон-лямбда 3 или ΙΡΝ-λ3 обозначает полипептид, содержащий аминокислоты 23-196 БЕЦ ΙΌ ΝΟ: 10 (непрерывно расположенные аминокислоты на фиг. 4), и включает встречающиеся в природе аллельные варианты БЕЦ ГО ΝΟ: 10, в которых референсная аминокислота в одном или более вариантных положений, показанных на фиг. 4, заменена вариантной аминокислотой. Полипептид ΙΡΝ-λ3 Ьу870 является изоформой ΙΡΝ-λ3, имеющей лизин в положении аминокислоты 70 фиг. 3, и полипептид ΙΡΝ-λ3 Агд70 является изоформой ΙΡΝ-λ3, имеющей аргинин в положении аминокислоты 70 фиг. 4. В контексте терапевтических композиций и способов, описанных здесь, термин полипептид ΙΡΝ-λ3 Ьу870 включает производные, в которых главная аминокислотная цепь ковалентно соединена с другими молекулами для обеспечения одного или более желаемых свойств, таких как увеличенное время полужизни ίη νίνο или сниженная иммуногенность. Неограничивающие примеры производных полипептида ΙΡΝ-λ3 Ьу§70, применимых в настоящем изобретении, включают гликозилированные производные, пегилированные производные, гибридные белки полипептида ΙΡΝ-λ3 Ьу§70 и неинтерфероновый белок, такой как человеческий сывороточный альбумин или Ι§Ο. В контексте терапевтических композиций и способов, описанных здесь, термин полипептид ΙΡΝ-λ3 Ьу870 также включает цистеиновые мутанты, в которых один или более из семи остатков цистеина БЕЦ ГО ΝΟ: 10 замещен другой аминокислотой, чтобы облегчить рекомбинантное получение композиции ΙΡΝ-λ3 Ьу§70, содержащего пример одной ди- 6 020795 сульфидной связи, как описано в патенте США № 7517961. Предпочтительные цистеиновые мутанты включают замену второго или третьего остатков Сук 8Еф ГО N0: 10 серином, аланином, треонином, валином или аспарагином.

Фармацевтическая композиция ΙΡΝ-λ3 Ьук70 обозначает фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель или среду для лекарственного средства и либо (1) полипептид ΙΡΝ-λ3 Ьук70, либо (2) вектор экспрессии, который содержит нуклеотидную последовательность, которая кодирует полипептид ΙΡΝ-λ3 Ьук70, функционально связанную с промоторной последовательностью, которая способна запустить экспрессию полипептида ΙΡΝ-λ3 Ьук70 по меньшей мере в одной ткани человека. В предпочтительных вариантах осуществления ткань человека является печеночной тканью.

Выделенный обычно используется, чтобы отразить состояние очистки биологической молекулы, такой как РНК, ДНК, олигонуклеотид или белок, и в таком контексте обозначает молекулу, по существу, не содержащую других биологических молекул, таких как нуклеиновые кислоты, белки, липиды, углеводы или другие вещества, такие как продукты распада клеток и среды роста. Как правило, термин выделенный не предназначен для обозначения полного отсутствия других биологических молекул или веществ или отсутствия воды, буферов или солей, если только они не представлены в количествах, которые, по существу, не мешают способам настоящего изобретения.

Локус относится к положению на хромосоме или молекуле ДНК, соответствующему гену, физическому признаку, такому как полиморфный сайт, или положению, связанному с фенотипическим признаком.

Нуклеотидная пара представляет собой набор из двух нуклеотидов (которые могут быть одинаковыми или различными), обнаруживаемых в полиморфном сайте на двух копиях хромосомы субъекта.

Олигонуклеотид относится к нуклеиновой кислоте, которая обычно имеет в длину от 5 до 100 непрерывных оснований и наиболее часто 10-50, 10-40, 10-30, 10-25, 10-20, 15-50, 15-40, 15-30, 15-25, 1520, 20-50, 20-40, 20-30 или 20-25 непрерывных оснований в длину. Последовательность олигонуклеотида может быть разработана для специфической гибридизации с любой из аллельных форм локуса; такие олигонуклеотиды обозначаются как аллель-специфические зонды. Если локус представляет собой Р§, содержащий 8ΝΡ. комплементарный аллель для такого 8ΝΡ может находиться в любом положении в аллель-специфическом зонде. Другие олигонуклеотиды, применяемые в применении на практике изобретения, специфически гибридизуются с областью-мишенью рядом с Р8, своим 3'-концом, расположенным на расстоянии приблизительно от одного и не более 10 нуклеотидов от Р§, предпочтительно приблизительно 5 нуклеотидов. Такие олигонуклеотиды, гибридизующиеся рядом с Р8, используются в методах удлинения праймера, опосредованного полимеразой, и обозначаются здесь как олигонуклеотиды удлинения праймеров. В предпочтительном варианте осуществления 3'-конец олигонуклеотида удлинения праймера представляет собой дезоксинуклеотид, комплементарный нуклеотиду, непосредственно прилегающему к Р§.

Парентеральное введение означает внутривенную, подкожную или внутримышечную инъекцию.

Фармацевтически приемлемый относится к молекулярным субстанциям и композициям, которые обычно считаются безопасными - например, которые физиологически переносимы и обычно не вызывают аллергической или подобной нежелательной реакции, такой как желудочное расстройство и т.п., при введении человеку. В другом варианте осуществления указанный термин относится к молекулярным субстанциям и композициям, одобренным регуляторным органом федерального или государственного правительства или перечисленных в фармакопее США, или в другой общепризнанной фармакопее для применения у животных и, в частности, у человека.

Полиморфный сайт или Р§ относится к положению в генетическом локусе или в гене, в котором обнаруживается полиморфизм, например однонуклеотидный полиморфизм (§№), полиморфизм длин рестрикционных фрагментов (КЕЬР), варьирующее число тандемных повторов (νΝΤΚ), динуклеотидный повтор, тринуклеотидный повтор, тетрануклеотидный повтор, простой повтор последовательности, перемещающийся встроенный элемент, такой как А1и, и делеция или вставка одного или более нуклеотидов). В интересующей популяции обычно Р8 предшествуют и за ними следуют высококонсервативные последовательности, и, таким образом, положение Р8 обычно обнаруживают относительно консенсусной последовательности нуклеиновой кислоты, состоящей из тридцати-шестидесяти нуклеотидов, предворяющих и завершающих Р§, которая в случае обычно обозначается как контекстная последовательность §№. Положение Р8 также может быть определено по его локализации в конценсусной или референсной последовательности относительно инициирующего кодона (АТО) трансляции белка. Специалист в данной области понимает, что локализация конкретного Р8 может оказаться не точно в том же самом положении, как в референсной или контекстной последовательности, у каждого субъекта интересующей популяции из-за присутствия у субъекта одной или более вставок или делеций, по сравнению с конценсусной или референсной последовательностью. Кроме того, для специалиста в данной области является обычной процедурой создание надежных, специфичных и точных тестов для обнаружения альтернативных аллелей в полиморфном сайте у любого данного субъекта, если специалисту в данной области известны альтернативные аллели в Р§, которые нужно обнаружить, и контекстная или референсная

- 7 020795 последовательность либо обе указанные последовательности, в которых присутствует Р8. Таким образом, специалисту в данной области будет понятно, что определение локализации любого Р8, описанного здесь, на основе конкретного положения в референсной или в контекстной последовательности (или с учетом кодона инициации в такой последовательности) имеется лишь для удобства, и что любое специфически пронумерованное положение нуклеотида в настоящем смысле включает любое положение нуклеотида того же самого Р8, который фактически располагается в том же самом локусе у субъекта, которого проверяют на наличие или отсутствие генетического маркера изобретения с применением какоголибо из методов генотипирования, описанных здесь, или других методов генотипирования, хорошо известных в данной области.

Лечить или лечение означает введение терапевтического агента, такого как композиция, содержащая любой из белков ΙΡΝ-α, описанных здесь, внутрь или наружно субъекту, который нуждается в терапевтическом агенте. Субъекты, нуждающиеся в агенте, включают субъектов, которые уже имеют или характеризуются высоким риском развития состояния или нарушения, поддающегося лечению агентом, а также субъекты, которые уже имеют или характеризуются высоким риском развития одного или более неблагоприятных эффектов лечения первым терапевтическим агентом, которые могут быть ослаблены вторым терапевтическим агентом. Обычно терапевтический агент вводят в терапевтически эффективном количестве, которое подразумевает оптимальное количество, чтобы произвести один или более благоприятных результатов. Терапевтически эффективное количество определенного агента может изменяться в соответствии с факторами, такими как состояние болезни, возраст и вес пациента, которого лечат, и восприимчивость пациента, например способность отвечать на терапевтический агент. Был ли достигнут благоприятный результат или клинический результат, может быть оценено с помощью какоголибо клинического измерения, обычно используемого врачами или другими медицинскими сотрудниками, чтобы определить наличие, тяжесть или состояние прогрессирования заданного заболевания, симптома или побочного эффекта. Как правило, терапевтически эффективное количество агента будет приводить в результате к улучшению соответствующего клинического измерения (измерений) по сравнению с исходным состоянием или по сравнению с ожидаемым состоянием при отсутствии лечения по меньшей мере на 5%, обычно по меньшей мере на 10%, более часто по меньшей мере на 20%, наиболее часто по меньшей мере на 30%, предпочтительно по меньшей мере на 40%, более предпочтительно по меньшей мере на 50%, наиболее предпочтительно по меньшей мере на 60%, в идеальном случае по меньшей мере на 70%, в более идеальном по меньшей мере на 80% и в наиболее идеальном случае по меньшей мере на 90%. В то время как вариант осуществления настоящего изобретения (например, способ лечения или готовое изделие) может не достигать желаемого клинического благоприятного воздействия или результата у каждого пациента, он должен обеспечивать его у статистически значимого числа пациентов, которое определяют с помощью любого статистического критерия, известного в данной области, например 1критерий Стьюдента, %²-критерий, И-критерий Манна-Уитни, критерий Крускала-Уоллиса (Н-критерий), критерий Джонкхиера-Терпстра и критерий Уилкоксона.

Вирусная нагрузка в контексте лечения хронической НСУ-инфекции означает количество РНК НСУ в сыворотке крови пациента (также обозначаемое в данной области и здесь как РНК НСУ в сыворотке крови и вирусная нагрузка НСУ). Вирусную нагрузку определяют предпочтительно с помощью количественного анализа ПЦР-РВ, например, такого как анализ, описанный здесь в разделе Примеры, или с помощью любого другого анализа, в котором используется другой, но общепринятый в данной области метод, который обеспечивает аналогичный или сходный результат. Более предпочтительно анализ ПЦР-РВ, применяемый для измерения вирусной нагрузки НСУ субъекта, имеет нижний предел обнаружения (БС-О) приблизительно 29 международных единиц/мл (Ιυ/мл) или меньше. Количественное определение вирусной нагрузки НСУ пациента на исходном уровне и в разные моменты времени во время применения антивирусной терапии используется, чтобы определить, имеет ли пациент высокий исходный уровень вирусной нагрузки, указанный в данном документе, и установить фенотип вирусологического ответа пациента, включая любой из фенотипов вирусологического ответа, описанных здесь.

Исходный уровень вирусной нагрузки обозначает уровень РНК НСУ в сыворотке крови до начала терапии одним или более противовирусными агентами. Высокий исходный уровень вирусной нагрузки обозначает количество РНК НСУ, согласно которому, как обычно понимают в данной области, пациента классифицируют как испытывающего сложности в лечении хронической вирусной инфекции НСУ. Два значения исходного уровня вирусной нагрузки, которые использовали для классификации пациентов как тяжелых для лечения, в контексте непрямой терапии пег-1Р%-(/./рибавирино\1. составляют >600000 и >800000 МЕ/мл. В последнее время вирусная нагрузка, применяемая для классификации пациентов как сложных для лечения, составляет >400000 МЕ/мл.

Неопределяемый уровень РНК НСУ обозначает, что РНК НСУ не определялся при использовании теста ПЦР-РВ с нижним пределом обнаружения (ЬЕИ) приблизительно 10 МЕ/мл или меньше или с применением любого другого теста, в котором применяется другая методика, но который является общепринятым в данной области и обеспечивает эквивалентную или сходную чувствительность.

Вирусологический ответ в контексте лечения хронической НСУ-инфекции означает снижение

- 8 020795 уровня РНК НСУ в сыворотке крови после начала антивирусной терапии.

В некоторых вариантах осуществления антивирусная терапия включает ΣΡΝ-α. В других вариантах осуществления терапия включает ΣΡΝ-α и один или более дополнительных противовирусных агентов. Комбинированная терапия, которая включает ΣΡΝ-α, часто обозначается в данной области как терапия на основе ΣΡΝ-α. В других вариантах осуществления вирусологический ответ, который измеряют, является ответом на антивирусную терапию, которая не включает ΣΡΝ-α. Предпочтительные фенотипы вирусологического ответа представляют собой быстрый вирусологический ответ (КУК), ранний вирусологический ответ (ЕУК), вирусологический ответ на лечение (ЕТК), устойчивый вирусологический ответ (8УК), медленный ответ, нулевой ответ, отсутствие ответа (ΝΚ) и рецидив. Определения и моменты времени для оценки указанных фенотипов ответа описаны ниже. В некоторых вариантах осуществления лечение НСУ включает вводный период непрямой антивирусной терапии, такой как комбинированная терапия пег-IΡN-α/рибавирином, с последующей прямой антивирусной терапией, которая используется здесь, что означает, что терапия включает введение по меньшей мере одного прямого противовирусного агента, такого как ингибитор протеазы НСУ, необязательно в комбинации с одним или более непрямыми противовирусными агентами, такими как пегилированный интерферон и рибавирин. В таких многофазных схемах лечения моменты времени вирусологического ответа, описанные ниже, не включают вводный период лечения; скорее, они относятся к продолжительности лечения с прямой антивирусной терапией.

Быстрый вирусологический ответ или КУК в контексте непрямой антивирусной комбинированной терапии, например, включающей пегилированный ΣΡΝ-α и рибавирин, означает неопределяемый уровень РНК НСУ в сыворотке крови в конце четырех недель лечения.

Ранний вирусологический ответ или ЕУК означает уменьшение РНК НСУ в сыворотке крови, больше или равное 2 1од в конце 12 недель антивирусной терапии, при этом полный ЕУК означает неопределяемый уровень РНК НСУ в сыворотке крови в конце 12 недель антивирусной терапии.

Ответ на лечение или ЕТК означает неопределяемый уровень РНК НСУ в сыворотке крови по окончании антивирусной терапии и предпочтительно по окончании любой из схем лечения, описанных здесь или при окончании любой схемы лечения, рекомендованной в инструкции-вкладыше, одобренной регуляторными органами. Неограничивающими примерами моментов времени ЕТК являются 12, 16, 24, 36 и 48 недель.

Устойчивый вирусологический ответ или §УК обозначает неопределяемый уровень РНК НСУ в сыворотке крови при завершении антивирусной терапии и максимум через 24 недели после окончания антивирусной терапии. В некоторых вариантах осуществления §УК измеряют через 12 недель после окончания антивирусной терапии. §УК также описывается в публикации Όγ. 5>1е\'еп Ь. Ρ1атт в !ке йоигпа1 ой !ке Атепсаи МеФса1 Аккоиайои, Уо1. 289, №. 18, р. 2413-2417 (2003).

Медленный ответ в контексте комбинированной терапии пегилированным ΣΡΝ-α/рибавирином означает сниженный больше или равный 2 1од, но еще определяемый уровень РНК НСУ в сыворотке крови в конце 12 недели антивирусной терапии и неопределяемый уровень РНК НСУ в сыворотке крови в конце 24 недели антивирусной терапии.

Нулевой ответ означает уменьшение меньше 1 1од уровня РНК НСУ в сыворотке крови и/или уменьшение меньше 2 1од уровня РНК НСУ в сыворотке крови после 4 недель и после 12 недель антивирусной терапии соответственно.

Отсутствие ответа или Ν^ означает наличие определяемого уровня РНК НСУ на протяжении как минимум 12 недель антивирусной терапии. Фенотип, соответствующий отсутствию ответа, обычно устанавливают, если уровень РНК НСУ в сыворотке крови определяется в конце 4 недели и в конце 12 недели антивирусной терапии.

Рецидив обозначает наличие обнаруживаемого уровня РНК НСУ в любое время после ответа на лечение (ЕТК), включая, но без ограничения в 12 или в 24 недели после ЕТК.

II. Применение маркеров ответа на ΣΡΝ-α изобретения.

Фенотипический эффект маркеров ответа, описываемых здесь, обеспечивает использование указанных маркеров в ряде коммерческих применений, включая, но без ограничения, клинические испытания исследуемых или ранее одобренных лекарственных средств ΣΡΝ-α у пациентов, выбранных на основе наличия или отсутствия одного или более указанных маркеров, фармацевтические композиции и фармацевтические продукты, содержащие ΣΡΝ-α для лечения пациентов, которые имеют по меньшей мере один из указанных маркеров ответа, диагностические методы и фармакогенетические методы лечения, которые включают индивидуализацию лекарственной терапии пациента, исходя из того, имеет ли пациент один или более указанных маркеров.

Полезность любого из коммерческих применений, заявленных здесь, не требует, чтобы взаимосвязь между наличием генетического маркера изобретения и появлением желаемого ответа на ΣΡΝ-α наблюдалась у 100% субъектов, которые получают ΖΕΝ-α; также не требует, чтобы диагностический способ или набор имел определенную степень специфичности или чувствительности в определении наличия или отсутствия маркера ответа у каждого субъекта, также не требует, чтобы диагностический способ, заяв- 9 020795 ленный здесь, являлся 100% точным при прогнозировании для каждого субъекта, будет ли он иметь благоприятный ответ на ΙΡΝ-α. Таким образом, авторы изобретения подразумевают здесь, что термины определить, определение и прогнозирование не следует интерпретировать, как требующие окончательного или определенного результата; напротив, указанные термины следует истолковывать как обозначающие, что заявленный способ обеспечивает точный результат для большинства субъектов или что результат или прогноз для любого данного субъекта более вероятно является правильным, чем неправильным.

Предпочтительно точность результата, предусмотренная диагностическим способом изобретения, представляет собой точность, которую специалист в данной области или регуляторный орган рассматривал бы как подходящую для конкретного применения, в котором используется метод. Аналогичным образом, полезность заявленных фармацевтических продуктов и способов лечения не требует, чтобы они вызывали заявленный или желаемый эффект у каждого субъекта; все, что требуется, это чтобы врач при вынесении своего профессионального суждения в соответствии со всеми применяемыми нормами определял, что шанс достижения заявленного эффекта лечения данного субъекта согласно заявленному способу или с помощью заявленного фармацевтического продукта является достаточно высоким, чтобы обосновать назначение лечения или фармацевтического продукта.

А. Тестирование на маркеры ответа на ΙΡΝ-α изобретения.

Наличие или отсутствие маркера ответа на ΙΡΝ-α может быть обнаружено посредством любого из ряда методов генотипирования, обычно применяемых в данной области. Как правило, в таких методах генотипирования используются один или более олигонуклеотидов, которые комплементарны области, содержащей или расположенной рядом с Ρδ, представляющим интерес. Последовательность олигонуклеотида, применяемого для генотипирования определенного Ρδ, представляющего интерес, обычно разрабатывают на основе контекстной последовательности Ρδ.

Локализация у конкретного субъекта любого из полиморфных сайтов, указанных в табл. 1, представляет собой положение, соответствующее локализации Ρδ, представляющего интерес, в референсной кодирующей или геномной последовательности ДНК окружающей Ρδ, представляющий интерес, или в одной из контекстных последовательностей, описанных в табл. 2 ниже, или в их комплементарных последовательностях. Более длинные контекстные последовательности, используемые при конструировании олигонуклеотидов для генотипа Ρδ табл. 1, представляют собой контекстные последовательности, зарегистрированные в базе данных δΝΡ NСΒI по состоянию на 19 мая 2009 г. Референсные кодирующие и аминокислотные последовательности ΙΡΝ-λ3 представляют собой последовательности, представленные в СепВапк с номером доступа ΑΥ129149 (Уегкюи Υ129149.1, СТ25527104) в базе данных нуклеотидных последовательностей NСВI по состоянию на 19 мая 2009 г.

Таблица 2

Контекстные последовательности для δΝΡ, ассоциированных с ответом на ΙΡΝ-α

Р8	Короткая контекстная последовательность1	5Е<Э Ю ЫО
Г312979860	СТЙААССАСОСАЙСТССССЙААОЙСС УЙААССАЙССТТЙААТТССАСТССЙС	1
Г328416813	САОАЙАЙАААЙЙСАЙСТСАЙЙСААТЙ ЗАЙАСеСТОСССАСТСАССЙСАЙССЙ	2
Г38103142	ТССТОССОДАОАОССССеАСССбСАС! УТЙСАСТССТТСАЙСАСААЙССАСТС	3
Г312980275	СТЙАЙАСААСТСАААТТССТАСАААС КЙАССТСТСТАААТАТТТСССЙЙЙЙТ	4
гз8099917	СТТТТЙТТТТССТТТСТЙТЙАОСААТ КТСАСССАААТТЙЙААССАТССТЙТА	5
Г312972991	АСААСАААТЙСТЙТАТСАТТСССССТ МСАТЙАЙЙТЙСТЙАСАЙААЙТСАААТ	6
Г38109886	ТАТТСАТТТТТССААСААССАТССТ6 МСССАССТСССТСТСТСТСТСТСААТ	7
гз4803223	ССТАААТАТСАТТТССТАААТСАТАС ЕСАСАТАТТТССТТСССАССТАТАСА	8
Г312980602	ТСАТАТААСААТАТСАААСССАСАСА УАССТССТСТСАСАСАСАСАТСААСА	9

контекстные последовательности, описанные в базе данных δΝΡ NСВI на 20 мая 2009 г.;

Υ обозначает С или Т, δ обозначает С или С, К. обозначает С или А, К=С или Т, М=А или С.

Как понятно специалисту в данной области, образцы нуклеиновой кислоты, содержащие определенный Ρδ, могут представлять собой комплементарные двухцепочечные молекулы, и таким образом

- 10 020795 ссылка на определенный сайт на смысловой цепи также относится к соответствующему сайту на комплементарной антисмысловой цепи. Аналогичным образом, ссылка на определенный генотип, полученный для Р8 на обеих копиях одной цепи хромосомы, является равнозначной по отношению к комплементарному генотипу, полученному для того же самого Р8 на обеих копиях другой цепи. Таким образом, генотип А/А для Р8 гз8103142 на кодирующей цепи гена 1Ь28В эквивалентен генотипу Т/Т указанного Р8 некодирующей цепи.

Контекстные последовательности, перечисленные здесь, а также их комплементарные последовательности, могут быть использованы для построения зондов и праймеров для генотипирования полиморфных сайтов табл. 1 в образце нуклеиновой кислоты, полученном от субъекта-человека, представляющего интерес, с применением любого из множества методов, хорошо известных в данной области, который позволяет определить, является ли субъект гетерозиготным или гомозиготным по аллелю лучшего ответа, установленному в табл. 1. Молекулы нуклеиновой кислоты, используемые в таких методах, обычно включают РНК, геномную ДНК или кДНК, полученную из РНК.

Как правило, методы генотипирования включают анализ образца нуклеиновой кислоты, выделенной из биологического образца, полученного у субъекта, для определения природы нуклеотида или нуклеотидной пары, представленных в одном или более полиморфных сайтов, представляющих интерес. Образцы нуклеиновой кислоты могут быть получены практически из любого биологического образца. Например, подходящие образцы включают сыворотку цельной крови, семенную жидкость, слюну, слезы, каловые массы, мочу, пот, буккальный материал, кожу и волосы. Соматические клетки являются предпочтительными, поскольку они позволяют провести определение природы обоих аллелей, представленных в Р8, представляющем интерес.

Образцы нуклеиновой кислоты могут быть получены для анализа с применением метода, известного специалистам в данной области. Предпочтительно такие методы дают в результате выделение геномной ДНК, достаточно чистой для определения генотипа желаемого полиморфного сайта (сайтов) молекулы нуклеиновой кислоты. Для увеличения чувствительности и специфичности указанного определения часто желательно амплифицировать из образца нуклеиновой кислоты область-мишень, содержащую Р8, который нужно генотипировать. Методы выделения и амплификации нуклеиновой кислоты можно найти, например, в публикации 8ашЬтоок, е! а1., Мо1еси1аг С1ошпд: А йаЬогаЮгу Мапиа1 (Со1б 8рппд НатЬот ЬаЪотаШгу, №\ν Уотк) (2001).

Любой метод амплификации, известный специалисту в данной области, может быть использован в осуществлении настоящего изобретения, включая, но без ограничения, методы полимеразной цепной реакции (ПЦР). Реакция ПЦР может быть проведена с использованием материалов и методов, известных специалистам в данной области (см. в целом РСК Тесйпо1оду: Рппс/аЕ апб Аррйсайопз ίότ ΌΝΑ Ашрййсайоп (еб. Н.А. Етйсй, Ртеешап Ргезз, ΝΥ, Ν. Υ., 1992); РСК Рго!осо1з: А Сшбе !о Ме!йобз апб Аррйсайопз (ебз. Ιηηΐδ, е! а1., Асабешю Ргезз, 8ап О1едо, СайГ., 1990); Май11а е! а1., №с1ею Аабз Кез. 19: 4967 (1991); Ескей е! а1., РСК Ме!йобз апб Аррйсайопз 1: 17 (1991); РСК (ебз. МсРйегзоп е! а1., 1КЬ Ргезз, Ох&тб) и патент США № 4683202. Другие подходящие методы амплификации включают лигазную цепную реакцию (ЬСК) (см. \Уи апб Зайасе, Сепописз 4: 560 (1989) и Ьапбедтеп е! а1., 8аепсе 241:1077 (1988)), амплификацию посредством транскрипции (К^ой е! а1., Ргос. №!1. Асаб. 8а. И8А 86: 1173 (1989)), самоподдерживающуюся репликацию последовательностей (Сиа!е1й е! а1., Ргос. Ν;·ιΙ. Асаб. 8а. И8А, 87: 1874 (1990)); изотермические методы (^а1кет е! а1., Ргос. №!1. Асаб. 8а. И8А 89:392-6 (1992)) и амплификацию, основанную на последовательности нуклеиновых кислот ^А8ВА).

Амплифицированную область-мишень анализируют, чтобы определить природу по меньшей мере одного из аллелей, представленных в Р8 в области-мишени. Если оба аллеля локуса представлены в амплифицированной мишени, специалисту в данной области будет понятно, что только один аллель будет определяться в Р8 у субъектов, которые являются гомозиготными в указанном Р8, тогда как два различных аллеля будут обнаруживаться, если субъект является гетерозиготным по указанному Р8.

Аллель можно идентифицировать непосредственно, путем положительной идентификации или с помощью логического заключения путем отрицательной идентификации. Например, если известно, что 8№ соответствует гуанину или цитозину в референсной популяции, Р8 можно определить путем положительной идентификации как гуанин или цитозин, если субъект является гомозиготным по указанному участку, или как и гуанин, и цитозин, если субъект является гетерозиготным по указанному участку. Альтернативно, Р8 можно определить путем отрицательной идентификации, как не являющийся гуанином (то есть цитозин/цитозин) и не являющийся цитозином (то есть гуанин/гуанин).

Идентификация аллеля или пары аллелей (например, двух нуклеотидов в случае 8№) в Р8 в образце нуклеиновой кислоты, полученном у субъекта, может быть выполнена с использованием любой методики, известной специалистам в данной области. Предпочтительные методики позволяют быстрый, точный анализ множества Р8 с минимальной обработкой проб. Некоторые примеры подходящих методик включают, но без ограничения, прямое секвенирование ДНК амплифицированной области-мишени, капиллярный электрофорез, гибридизацию аллель-специфических зондов, анализ одноцепочечного конформационного полиморфизма, электрофорез в градиенте денатурирующего геля, гель-электрофорез с градиентом температуры, обнаружение несоответствий в последовательностях; олигонуклеотидные мик- 11 020795 рочипы, специфическое удлинение праймеров, обнаружение с помощью белков и другие методики, хорошо известные в данной области; см., например, 8атЬгоок, е! а1., Мо1еси1аг С1отпд: А ЬаЪотаФту Мапиа1 (Со1б 8ртшд НагЬог ЬаЬотаФту, Ые\у Уотк) (2001); АикиЬе1, е! а1., Ситтеп! Рго1осо1к ίη Мо1еси1аг Вю1оду Цойп \УПеу апб 8опк, Ыете Уотк) (1997); Отйа е! а1., Ргос. Ыа!. Асаб. 8с1. И8А 86, 2766-2770 (1989); Нитрйпек е! а1., шМОЬЕСиЬАК 1)1АС.ЫО818 ОР СЕЫЕТ1С П18ЕА8Е8, Е11е8, еб., р. 32 1-340, 1996; №айе11 е! а1., Ыис1. Ашбк Кек. 18:2699-706 (1990); Нки е! а1. (1994) Сатшподепеык 15: 1657-1662; 8йе£йе1б е! а1., Ргос. Ыа!1. Асаб. 8с1. И8А 86:232-6 (1989); А'пИег е! а1., Ргос. ЫаП. Асаб. 5ш. И8А 82:7575 (1985); Муегк е! а1. (1985) Ыа!иге 313:495; КокепЬаит апб Кейкпег (1987) Вюрйук Сйет. 265: 12753, Мобпск Апп. Кеу. Сепе!. 25:229-53 (1991); патент США № 6300063; патент США № 5837832; патент США № 5459039; и Ни8ЫР Марршд Аккау, геадеп! кй апб икег тапиа1, АГГуте1п\ Рай Ыо. 90094 (АГГутеОгх. 8ап!а С1ага, СА).

В предпочтительных вариантах осуществления природу аллеля (аллелей) в Р8 определяют с применением метода удлинения праймера с применением полимеразы. Такие методы описаны в патентной и научной литературе и включают метод анализа генетической информации или удлинение на твердой фазе СепеОс Βί! Апа1ук1к (^О92/15712) и анализ генетической информации с помощью лигазы/полимеразы (патент США № 5679524). Связанные методы раскрыты в международных патентах №О91/02087, №О90/09455, №О95/17676 и в патентах США №№ 5302509 и 5945283. Удлиненные праймеры, содержащие участок, комплементарный полиморфизму, можно обнаружить с помощью массспектрометрии, как описано в патенте США № 5605798.

В другом методе удлинения праймера используется аллель-специфическая ПЦР (Киапо, С. е! а1., Ыис1. Ашбк Кек. 17:8392 (1989); Киапо, С. е! а1., Ыис1. Ашбк Кек. 19:6877-82 (1991); №О93/22456; ТитЫ е! а1., ί. Сип. 1пуек!. 95:1635-41 (1995)). Кроме того, множественные Р8 можно исследовать путем одновременного амплифицирования множества областей нуклеиновой кислоты с применением наборов аллельспецифических праймеров, как описано в международном патенте \УО89/10414.

Еще в одном методе удлинения праймера для определения и анализа полиморфизмов используется удлинение на одно основание (8ВЕ) флуоресцентно-меченого праймера, объединенное с резонансным переносом энергии флуоресценции (РКЕТ) между меткой добавляемого основания и меткой праймера. Как правило, в методе, таком как метод, описанный Сйеп е! а1., Ргос. Ыа!. Асаб. 8ст 94:10756-61 (1997), используется локус-специфический олигонуклеотидный праймер, меченный на 5'-конце 5карбоксифлуоресцеином (РАМ). Указанный меченый праймер сконструирован так, что 3'-конец непосредственно прилегает к полиморфному сайту, представляющему интерес. Меченый праймер гибридизуется с локусом, и удлинение на одно основание меченого праймера осуществляется флуоресцентномеченными дидезоксирибонуклеотидами (ббЫТР) с терминацией последовательности в присутствии красителя, причем дезоксирибонуклеотиды не представлены. Увеличение флуоресценции добавленного ббЫТР в ответ на возбуждение при длине волны меченого праймера используется, чтобы сделать заключение о природе добавленного нуклеотида.

Предпочтительным тестом для генотипирования является ТадМап® 8ЫР Сепо1уршд Аккау от Аррйеб Вюкук!етк или тест, характеризующийся приблизительно такой же надежностью, точностью и специфичностью.

Во всех упомянутых выше методах точность и специфичность теста, разработанного для определения природы аллеля (аллелей) в каком-либо Р8, обычно подтверждают путем выполнения теста на образцах ДНК, в которых природа аллеля (аллелей) в указанном Р8 известна. Предпочтительно образец, представляющий каждый возможный аллель, включают в процесс валидации. Для диплоидных локусов, таких как локусы на аутосомной и на Х-хромосомах, проверочные образцы, как правило, включают образец, который является гомозиготным по главному аллелю Р8, образец, который является гомозиготным по минорному аллелю Р8, и образец, который является гетерозиготным в указанном Р8. Указанные проверочные образцы, как правило, также включают в качестве контролей при выполнении теста с опытным образцом (т.е. образец, в котором природа аллеля (аллелей) Р8 неизвестна). Специфичность теста также можно подтвердить путем сравнения результата теста опытного образца с результатом, полученным для того же самого образца с помощью другого типа теста, например с помощью определения последовательности амплифицированной области-мишени, которая, как считают, содержит Р8, представляющий интерес, сравнения установленной последовательности с контекстными последовательностями, общеизвестными в данной области, такими как контекстные последовательности, предоставленные в описании.

Длина контекстной последовательности, необходимая для доказательства, что проверяется правильное положение в геноме, будет меняться с учетом уникальности последовательности в областимишени (например, может быть одно или более высокогомологичных последовательностей, расположенных в других областях генома). Специалист в данной области может без труда определить соответствующую длину контекстной последовательности для любого Р8, используя известные приемы, такие как сравнение с помощью программы ВЬА8Т контекстной последовательности с последовательностями из общедоступных баз данных. Для амплифицированных областей-мишеней, которые обеспечивают первый уровень специфичности, рассмотрение контекстной последовательности приблизительно из 30-60 оснований на каждой стороне Р8 в известных образцах, как правило, является достаточным, чтобы гарантировать специфичность выполнения теста для Р8, представляющего интерес. Иногда валидированный

- 12 020795 тест может не дать однозначного результата для опытного образца. Обычно это результат образца, содержащего ДНК несоответствующей чистоты или качества, и неоднозначный результат обычно получают при повторной очистке или повторном выделении образца ДНК или при тестировании образца с помощью другого типа анализа.

Кроме того, при выполнении любого из описанных здесь методов, которые требуют определения наличия или отсутствия определенного маркера ответа на ΙΡΝ-α, такое определение может быть выполнено путем получения справочной информации из хранилища данных, которое содержит достаточную информацию о наборе генов пациента, чтобы определить, имеет ли пациент маркер, представляющий интерес. Предпочтительно хранилище данных регистрирует какой маркер(ы) ответа на ΙΡΝ-α присутствует и отсутствует у субъекта. Хранилище данных должно содержать личные истории болезни, карту клинических данных, файл (например, не структурированный ΆδΟΙΙ файл), доступный компьютеру или другому электронному или неэлектронному носителю, на котором может сохраняться соответствующая информация или генетические данные. Используемая здесь карта клинических данных является портативным запоминающим устройством, таким как магнитная карта, смарт-карта, которая имеет встроенное устройство обработки данных, и которое продается производителем, таким как §1етеп8 о£ Митсй Сегтапу, или карта флэш-памяти. Если хранилище данных является хранилищем данных с доступными файлами для компьютера; такие файлы могут быть расположены на различных носителях, включая сервер, клиент, жесткий диск, СИ, ИУО, персональный цифровой органайзер, такой как Ра1т Ρϊΐοΐ, магнитная лента, ζίρ-дисковод, компьютерное встроенное ПЗУ (постоянное запоминающее устройство) либо Интернет или всемирная паутина. Другие носители для хранения файлов, доступных компьютеру, будут очевидны специалисту в данной области.

Изобретение также предполагает, что тестирование на маркер ответа на ΙΡΝ-α может ограничиваться определением, имеет ли субъект аллель, например нуклеотид, в другом локусе, который имеет высокую степень неравновесного сцепления (ЬИ) с аллелем лучшего ответа для любого из δΝΡ, перечисленных в табл. 1. Два определенных аллеля в различных локусах на одной хромосоме считаются находящимися в ЬИ, если присутствие одного из аллелей в одном локусе предполагает присутствие другого аллеля в другом локусе. Такие варианты, обозначенные здесь как сцепленные варианты или заместительные варианты (ргоху уапаШЦ. могут представлять собой любой тип варианта (например, δΝΡ, вставка или делеция), который имеет высокую степень ЬИ с аллелем лучшего ответа, представляющим интерес.

Сцепленные варианты легко идентифицируют путем определения степени неравновесного сцепления (ЬИ) между аллелем лучшего ответа любого из δΝΡ табл. 1 и кандидатным сцепленным аллелем в полиморфном сайте, расположенным в хромосомной области 19с|13.13 или в другом месте на хромосоме 19. Кандидатный сцепленный вариант может быть аллелем полиморфизма, который известен в настоящее время. Другие кандидатные сцепленные варианты могут быть легко идентифицированы специалистом в данной области с применением любой методики, хорошо известной в данной области, для нахождения полиморфизмов.

Степень ЬИ между аллелем лучшего ответа из табл. 1 и кандидатным сцепленным вариантом может быть определена с помощью любого показателя ЬИ, известного в данной области. Показатели ЬИ в области генома легко определяют опытным путем в соответствующим образом выбранных образцах с использованием различных методик, известных в данной области для определения существует ли между двумя аллелями (например, между нуклеотидами в различных Ρδ) неравновесное сцепление (см., например, СЕОТЛС ΌΆΤΆ ΛΝΆΣΥδΙδ II, ХУеш δίικι,ΚΓ Л88ос1а1е8, 1пс. РиЬйкйетк, δικιώΜαί!! МА 1996). Специалист в данной области может без труда выбрать, какой метод определения ЬИ будет подходить наилучшим образом для популяционной группы определенного размера и для области генома. Одним из наиболее часто используемых показателей неравновесного сцепления является г², который рассчитывают с помощью формулы, описанной Иеу1ш е1 а1. (Сепотюк, 29(2):311-22 (1995)). Значение г² является показателем того, насколько хорошо аллель X в первом локусе предсказывает появление аллеля Υ во втором локусе на той же самой хромосоме. Показатель достигает значения 1,0, только если предсказание является совершенным (например, X, если, и только если, Υ).

Предпочтительно локус сцепленного варианта находится в области генома, состоящей приблизительно из 100 тысяч пар нуклеотидов, более предпочтительно приблизительно 10 т.п.н., которая перекрывает любой из Ρδ табл. 1. Другие сцепленные варианты представляют собой варианты, у которых ЬИ с аллелем лучшего ответа имеет значение г², которое измеряют в соответствующей референсной популяции, по меньшей мере 0,75, более предпочтительно по меньшей мере 0,80, еще более предпочтительно по меньшей мере 0,85 или по меньшей мере 0,90, еще более предпочтительно по меньшей мере 0,95 и наиболее предпочтительно 1,0. Референсная популяция, используемая для такого измерения г², может быть генеральной популяцией, популяцией, использующей ΙΡΝ-α, популяцией с диагносцированным определенным состоянием, для которого показана эффективность ΙΡΝ-α (такое как хроническая НСУинфекция), или популяция, члены которой идентифицируют свою принадлежность к одной этнической группе, например европеец, афро-американец, испаноговорящий, латиноамериканец, коренной американец и т.п., или может быть любой комбинацией из указанных категорий. Предпочтительно референсная

- 13 020795 популяция отражает генетическое разнообразие популяции пациентов, которых лечат ΙΡΝ-α.

В некоторых вариантах осуществления врач определяет, имеет ли пациент маркер ответа на ΙΡΝ-α, описанный здесь, назначая диагностический тест, который предназначен для определения, имеет ли пациент по меньшей мере один аллель лучшего ответа в одном или более полиморфных сайтов табл. 1. Предпочтительно тест определяет природу обоих аллелей, т.е. генотип, в указанном Р§. В некоторых вариантах осуществления лаборатория тестирования будет получать образец нуклеиновой кислоты из биологического образца (такого как образец крови или буккальный мазок), полученного у пациента. В некоторых вариантах осуществления образец крови у пациента берет врач либо медицинский сотрудник или лаборант диагностической лаборатории. В некоторых вариантах осуществления пациенту предоставляется набор для приготовления буккального мазка с внутренней стороны щеки, который затем пациент отдает медицинскому сотруднику или отправляет непосредственно в диагностическую лабораторию.

В некоторых вариантах осуществления в лаборатории тестирования неизвестны идентификационные данные субъекта, чей образец тестируется; т.е. образец, принимаемый лабораторией, делают анонимным каким-либо образом перед отправкой в лабораторию. Например, образец может быть идентифицирован просто с помощью номера или какого-либо другого кода (ГО образца) и результаты диагностического метода могут быть сообщены стороне, назначившей тест, с использованием ГО образца. В предпочтительных вариантах осуществления связь между идентификационной информацией субъекта и образцом субъекта известна только субъекту или врачу субъекта.

В некоторых вариантах осуществления после того, как получены результаты теста, лаборатория тестирования составляет отчет по результатам исследования, в котором указано наличие или отсутствие аллеля лучшего ответа в генотипированном полиморфном сайте, и предпочтительно указано является ли пациент гетерозиготным или монозиготным по аллелю наилучшего ответа. В некоторых вариантах осуществления отчет по результатам исследования является письменным документом, подготовленным лабораторией тестирования и отправленным пациенту или врачу пациента в виде печатного документа или с помощью электронной почты. В других вариантах осуществления отчет по результатам исследования создается с помощью компьютерной программы и демонстрируется на видеомониторе в кабинете врача. Отчет по результатам исследования также может включать в себя устное сообщение результатов теста непосредственно пациенту либо врачу пациента или сотруднику с разрешенным допуском в кабинете врача. Аналогичным образом, отчет по результатам исследования может содержать запись о результатах теста, которую врач описал в файле пациента.

В одном предпочтительном варианте осуществления, если пациент является гомозиготным по аллелю лучшего ответа, то в отчете по результатам исследования дополнительно указано, что пациент тестирован положительно на генетический маркер, ассоциированный с возможным ответом на лечение ΙΡΝ-α, тогда как, если субъект является гетерозиготным по аллелю лучшего ответа или является гомозиготным по другому аллелю, то в отчете по результатам исследования дополнительно указано, что пациент отрицательно тестирован на генетический маркер, ассоциированный с возможным ответом на лечение ΙΡΝ-α. В некоторых вариантах осуществления результат теста будет включать оценку вероятности достижения благоприятного ответа на ΙΡΝ-α, которую получают в результате выполнения модели, которая взвешивает различные параметры пациента (например, возраст, пол, вес, раса, результаты тестов на другие фармакогинетические маркеры для ΙΡΝ-α) и характеристики заболевания (например, тяжесть заболевания), которые связаны с ответом на ΙΡΝ-α в популяции с соответствующим заболеванием. Вес, придаваемый каждому параметру, основан на его вкладе по сравнению с другими параметрами в объяснение межсубъектной вариабельности ответа на ΙΡΝ-α в популяции с рассматриваемым заболеванием. Доктор может использовать указанную оценку вероятности ответа как показатель в выборе терапии или схемы лечения для пациента. Например, при хронической НСУ-инфекции параметры пациента, ассоциированные с достижением §УК, включают расу и параметры заболевания включают генотип НСУ, исходный уровень вирусной нагрузки и степень фиброза.

Как правило, субъект может быть проверен на наличие маркера ответа на ΙΡΝ-α до начала терапии ΙΡΝ-α, но предусматривается, что такое тестирование может быть проведено в любое время после введения субъекту первой дозы ΙΡΝ-α. Например, лечащий врач может быть обеспокоен тем, что пациент не отвечает соответствующим образом на лечение и хочет назначить тест субъекту, чтобы определить обосновано ли продолжение лечения ΙΡΝ-α. В некоторых вариантах осуществления врач может определить, следует или нет субъекту проводить тест на маркеры ответа на ΙΡΝ-α. Например, врач может оценивать, назначать ли пациенту фармацевтический продукт, который показан для пациентов, положительно тестированных на маркер ответа на ΙΡΝ-α. В вариантах осуществления, где пациент имеет обнаруживаемый уровень РНК НСУ в сыворотке крови и перенес трансплантацию печени, врач может принять решение о проведении биопсии трансплантированной печени для проверки маркера ответа на ΙΡΝ-α, чтобы облегчить принятие лечебных решений в отношении пациента.

При принятии решения, как использовать результаты теста на маркер ответа на ΙΡΝ-α в лечении какого-либо отдельного пациента, врач также может принимать во внимание другие соответствующие условия, такие как заболевание или состояние, которое лечат, возраст, вес, пол, наследственность и расу

- 14 020795 пациента, включая ввод комбинации указанных факторов и результатов теста на генетический маркер в модель, которая помогает врачу провести выбор терапии и/или схемы лечения для указанной терапии.

Определение наличия или отсутствия любого из маркеров ответа табл. 1 может быть осуществлено с применением набора, который специально разработан для данной цели. В одном варианте осуществления набор изобретения содержит ряд олигонуклеотидов, предназначенных для идентификации каждого из аллелей в РЗ по меньшей мере одного маркера табл. 1, в предпочтительных вариантах осуществления РЗ представляет собой т§12980275, Т528416813 или Т58103142. В другом варианте осуществления разрабатывается ряд олигонуклеотидов для идентификации аллелей в любой комбинации двух или более РЗ табл. 1. В предпочтительном варианте осуществления комбинация РЗ включает по меньшей мере РЗ Т528416813 и РЗ Т58103142. В другом предпочтительном варианте осуществления комбинация РЗ включает каждый из полиморфных сайтов табл. 1.

В некоторых вариантах осуществления олигонуклеотиды в наборе являются либо аллельспецифичными зондами, либо аллель-специфичными праймерами. В других вариантах осуществления набор содержит олигонуклеотиды для удлинения праймера. В других вариантах осуществления набор олигонуклеотидов представляет собой комбинацию аллель-специфичных зондов, аллель-специфичных праймеров и олигонуклеотиды для удлинения праймера. Набор может содержать олигонуклеотиды, предназначенные для обнаружения наличия других генетических маркеров, ассоциированных с ответом на ΙΡΝ-α.

Олигонуклеотиды в наборах изобретения должны быть способны специфически гибридизоваться с целевой областью полинуклеотида. Используемая здесь специфическая гибридизация означает, что олигонуклеотид образует антипараллельную двухцепочечную структуру с областью-мишенью в определенных условиях гибридизации и в то же время не способен образовать такую структуру с областями, не являющимися мишенями, при их инкубации с полинуклеотидом в тех же самых условиях гибридизации. В некоторых вариантах осуществления область-мишень содержит РЗ, представляющий интерес, тогда как в других вариантах осуществления область-мишень расположена на расстоянии 1-10 нуклеотидов рядом с РЗ.

Состав и длина каждого олигонуклеотида в наборе будет зависеть от природы геномной области, содержащей РЗ, а также от типа теста, который нужно выполнить с помощью олигонуклеотида, и они могут быть легко определены специалистом в данной области.

Например, полинуклеотид, который используют в тесте, может составлять продукт амплификации, и таким образом требуемая специфичность олигонуклеотида существует в отношении гибридизации с областью-мишенью в продукте амплификации, скорее чем в геномной ДНК или кДНК, выделенной у субъекта. В качестве другого примера, если набор предназначен для генотипирования двух или более полиморфных сайтов одновременно, температуры плавления олигонуклеотидов для каждого РЗ в наборе обычно будут находиться в узком диапазоне, предпочтительно меньше 5 и более предпочтительно меньше 2°С.

В некоторых вариантах осуществления каждый олигонуклеотид в наборе совершенно комплементарен своей области-мишени. Олигонуклеотид называется совершенно или полностью комплементарным другой молекуле нуклеиновой кислоты, если каждый нуклеотид одной из молекул комплементарен нуклеотиду в соответствующем положении другой молекулы. В то время как совершенно комплементарные олигонуклеотиды предпочтительны для обнаружения полиморфизмов, предусматриваются отклонения от полной комплементарности, если такие отклонения не препятствуют специфической гибридизации молекулы с областью-мишенью, как определено выше. Например, олигонуклеотидный праймер может иметь некомплементарный фрагмент на 5'-конце, при этом оставшаяся часть праймера полностью комплементарна области-мишени. Альтернативно, некомплементарные нуклеотиды могут быть расположены вразброс в зонде или праймере при условии, что полученный зонд или праймер попрежнему способен специфически гибридизоваться с областью-мишенью.

В некоторых предпочтительных вариантах осуществления каждый олигонуклеотид в наборе специфически гибридизуется со своей областью-мишенью в жестких условиях гибридизации. Жесткие условия гибридизации зависят от последовательности и варьируют в зависимости от обстоятельств. В целом жесткие условия выбирают так, что температура приблизительно на 5°С ниже, чем температурная точка плавления (т.пл.) для конкретной последовательности при определенной ионной силе и значении рН. Т.пл. представляет собой температуру (при определенной ионной силе, рН и концентрации нуклеиновой кислоты), при которой 50% зондов, комплементарных последовательности-мишени, гибридизуются с последовательностью-мишенью в равновесном состоянии. Поскольку последовательности-мишени обычно представлены в избытке, при т.пл. 50% зондов находятся в равновесном состоянии.

Как правило, жесткие условия включают концентрацию соли по меньшей мере приблизительно 0,01-1,0 М концентрации ионов натрия (или других солей) при значении рН 7,0-8,3 и температура составляет по меньшей мере приблизительно 25°С для коротких олигонуклеотидых зондов (например, 1050 нуклеотидов). Жесткие условия также могут быть получены при добавлении дестабилизирующих агентов, таких как формамид. Например, условия 5хЗЗРЕ (750 мМ ΝαΤΊ. 50 мМ фосфат натрия, 5 мМ

- 15 020795

ЭДТА, рН 7,4) и температура 25-30°С предназначены для гибридизации аллель-специфических зондов. Дополнительные жесткие условия могут быть найдены в руководстве Мо1еси1аг С1отпд: А ЬаЬогаФгу Мапиа1, БатЬгоок е1 а1., Со1й Брппд НагЬог Ргекк, Со1й Брппд НагЬог, ΝΥ (1989), скар1егк 7, 9, апй 11 и в НиСЕЕК’ АСИ) ΗΥΒΚΙΌΙΖΑΤΙΟΝ, А РКАСПСАЬ АРРКОАСН, Наутек е1 а1., ΙΗΕ Ргекк, ^акЫпдЮп, 1).С., 1985.

Один неограничивающий пример жестких условий гибридизации включает гибридизацию в 4х буфере хлорид натрия/цитрат натрия (ББС) приблизительно при 65-70°С (или, альтернативно, гибридизацию в 4хББС плюс 50% формамид приблизительно при 42-50°С) с последующей одной или более промывками в 1хББС приблизительно при 65-70°С. Неограничивающий пример высокожестких условий гибридизации включает гибридизацию в 1хББС приблизительно при 65-70°С (или, альтернативно, гибридизацию в 1хББС плюс 50% формамид приблизительно при 42-50°С) с последующей одной или более промывками в 0,3 х ББС приблизительно при 65-70°С. Неограничивающий пример условий гибридизации пониженной жесткости включает гибридизацию в 4хББС приблизительно при 50-60°С (или, альтернативно, гибридизацию в 6хББС плюс 50% формамид приблизительно при 40-45°С) с последующей одной или более промывками в 2хББС приблизительно при 50-60°С. Подразумевается, что жесткие условия в пределах от средних значений до указанных выше значений, например, при 65-70°С или при 42-50°С также включены в настоящее изобретение. Буфер ББРЕ (1хББРЕ представляет собой 0,15 М №С1, 10 мМ NаΗ₂РΟ₄ и 1,25 мМ ЭДТА, рН 7,4) может быть заменен на буфер ББС (1хББС представляет собой 0,15 М №С1 и 15 мМ цитрат натрия) в гибридизационном и промывочном буферах; промывки производят в течение 15 мин, каждая после того, как гибридизация завершена.

Температура гибридизации для гибридов с предполагаемой длиной меньше 50 пар оснований должна быть на 5-10°С ниже, чем температура плавления (т.пл.) гибрида, где т.пл. определяют согласно следующим уравнениям. Для гибридов длиной меньше 18 пар оснований т.пл. (°С)=2(# оснований А+Т)+4(# оснований О+С). Для гибридов длиной от 18 до 49 пар оснований т.пл. (°С)=81,5+16,6(1одю|№+])+0,41(%0+С)-(600/К), где Ν представляет собой число оснований в гибриде и |Νη+| представляет собой концентрацию ионов натрия в гибридизационном буфере (|Νη+| для 1хББС=0,165 М).

Олигонуклеотиды в наборах изобретения могут состоять из рибонуклеотидов, дезоксирибонуклеотидов, ациклических нуклеотидных производных и других функционально эквивалентных производных в любом состоянии фосфорилирования. Альтернативно, олигонуклеотиды могут иметь основную цепь, не содержащую фосфатов, которая может быть составлена из звеньев, таких как карбоксиметил, ацетамидат, карбамат, полиамид (пептидная нуклеиновая кислота ^ΝΆ)) и т.п. (Уагта, в ΜΟΕ-ЕСиЕАР ΒΙΟΕΟΟΥ А\1) ВЮТЕС1ΙΝΟΕΟΟΥ А ^МР^НЕ^^ 1)ЕБК КЕРЕКЕХСЕ, Меуегк, ей., р. 6, 17-20, УСН РиЬНккегк, Фс., 1995). Олигонуклеотиды могут быть получены с помощью химического синтеза с использованием любой подходящей методики, известной в данной области, или могут быть получены из биологического образца, например, путем ограниченного расщепления. Олигонуклеотиды могут содержать детектируемую метку в соответствии с любым способом, известным в данной области, включая применение радиометок, флуоресцентных меток, ферментных меток, белков, гаптенов, антител, маркирующих последовательностей и т.п. Олигонуклеотиды в наборе могут быть произведены и представлены на рынке в виде аналит-специфических реагентов (АБК) или могут быть составными компонентами одобренного диагностического устройства.

В некоторых вариантах осуществления набор олигонуклеотидов в наборе содержит различные метки, чтобы обеспечить одновременное определение идентичности аллелей в двух или более полиморфных сайтах. Олигонуклеотиды также могут составлять требуемый ряд олигонуклеотидов, иммобилизованных на твердой поверхности, такой как микрочип, кремниевые гранулы (например, технология ВеайАггау от Шитта, Бап О|едо, СА) или стеклянная пластина (см., например, ΑΟ98/20020 и ΑΟ98/20019). Наборы, содержащие такие иммобилизованные олигонуклеотиды, могут быть предназначены для выполнения ряда тестов для определения полиморфизма, включая, но без ограничения, тесты на основе метода гибридизации зондов и удлинения праймера с применением полимеразы.

Наборы изобретения также могут содержать другие реагенты, такие как гибридизационный буфер (например, если олигонуклеотиды используют в качестве аллель-специфичных зондов) или дидеоксинуклеотидные трифосфаты (ййИТР; например, если аллели в полиморфных сайтах определяют с помощью удлинения праймера). Наборы, предназначенные для применения в тестах генотипирования с применением полимеразы, также могут содержать полимеразу и реакционный буфер, оптимизированный для выполнения теста с применением полимеразы.

Наборы изобретения также могут содержать реагенты для определения, произошла ли специфическая гибридизация или произошло ли специфическое удлинение праймера, опосредуемое полимеразой. Такие реагенты для обнаружения могут включать биотин-меченные или флуоресцентно-меченные олигонуклеотиды или ййЫТР и/или меченное ферментом антитело и один или более субстратов, которые производят детектируемый сигнал, когда на них воздействует фермент.

Специалисту в данной области понятно, что набор олигонуклеотидов и реагенты для выполнения

- 16 020795 теста предоставляются в отдельных емкостях, помещенных при необходимости в контейнер набора, чтобы сохранить биологическую или химическую активность и обеспечить надлежащее использование при проведении теста.

В других вариантах осуществления проверяли качество каждого из олигонуклеотидов и всех других реагентов в наборе для оптимального выполнения теста, предназначенного для определения генотипа одного или более Р8 табл. 1. В некоторых вариантах осуществления набор содержит инструкцию о порядке работы, в которой описано, как использовать расшифрованный генотип, чтобы определить в тестируемом образце нуклеиновой кислоты наличие или отсутствие маркера ответа.

В некоторых предпочтительных вариантах осуществления набор олигонуклеотидов в наборе представляет собой алелль-специфические олигонуклеотиды. Используемый здесь термин алелльспецифический олигонуклеотид (А8О) обозначает олигонуклеотид, который способен в достаточно жестких условиях специфически гибридизоваться с одним аллелем Р8 в области-мишени, содержащей Р8, и в то же время не гибридизоваться с той же областью, содержащей другой аллель. Специалисту в данной области понятно, что специфичность связывания аллеля будет зависеть от ряда легко оптимизируемых условий жесткости, включая концентрацию соли и формамида, а также от температуры на стадии гибридизации и на стадии промывки.

Примеры условий гибридизации и промывки, обычно применяемых для А8О-зондов и праймеров, можно найти в публикации Кодаи е! а1., Сеиейс РгеФсйои о£ НеторБШа А ίη РСК РКОТОСОБ8, А СиГОЕ ТО МЕТНОИ8 АИИ АРРПСАТЮХ8. Асабепис Рге§5, 1990 и КиаДо е! а1., Ргос. ИаИ. Асаб. 8с1. И8А 87:6296-300 (1990).

Как правило, А8О будет полностью комплементарен одному аллелю и в то же время будет иметь ошибочное спаривание пары оснований с другим аллелем. В А8О-зондах ошибочное спаривание пары оснований происходит предпочтительно в центральном положении олигонуклеотидного зонда при его выравнивании с полиморфным сайтом в области-мишени (например, приблизительно 7-е или 8-е положение в 15тег, 8-е или 9-е положение в 16тег и 10-е или 11-е положение в 20тег). Ошибочное спаривание пары оснований в А8О-праймерах находится в 3'-концевом нуклеотиде или предпочтительно в 3'предпоследнем нуклеотиде. А8О-зонды и А8О-праймеры, гибридизующиеся с кодирующей или с некодирующей цепью, предусматриваются изобретением.

В некоторых вариантах осуществления набор содержит пару аллель-специфических олигонуклеотидов для каждого Р8, который исследуют, причем один член пары специфичен для одного аллеля (например, аллель лучшего ответа) и другой член является специфичным для другого аллеля. В таких вариантах осуществления олигонуклеотиды в паре могут быть разной длины или могут содержать различные детектируемые метки, чтобы позволить пользователю набора определить генотип в исследуемом Р8.

В других предпочтительных вариантах осуществления олигонуклеотиды в наборе являются олигонуклеотидами удлинения праймера. Для остановки реакции удлинения, опосредуемого полимеразой, выбирают смеси любых указанных олигонуклеотидов, чтобы прекратить удлинение олигонуклеотида в интересующем Р8, или выбирают одно основание соответственно в зависимости от противоположных нуклеотидов, представленных в Р8.

В одном варианте осуществления набор содержит пару аллель-специфических олигонуклеотидных зондов для генотипирования по меньшей мере одного из полиморфных сайтов табл. 1. В одном варианте осуществления один А8О-зонд в паре содержит нуклеотидную последовательность по меньшей мере из 15 нуклеотидов, которая идентична или полностью комплементарна аллелю лучшего ответа в контекстной последовательности, представленной в табл. 2, и другой А8О-зонд в паре содержит нуклеотидную последовательность по меньшей мере из 15 нуклеотидов, которая идентична или полностью комплементарна другому аллелю в контекстной последовательности, представленному в табл. 2. В одном предпочтигельном варианте осуществления набор содержит такие А8О-зонды для генотипирования по меньшей мере одного Р8, выбранного из группы, состоящей из т§8103142 и т§8103142. В другом предпочтительном варианте осуществления набор содержит такие А8О-зонды для генотипирования обоих Р8. В другом варианте осуществления набор содержит такие А8О-зонды для генотипирования каждого Р8 табл. 1.

В. Фармацевтические композиции, фармацевтические продукты и схемы лечения.

Субъект, которого тестируют или лечат с помощью любого из способов и продуктов, описанных здесь, является субъектом-человеком, нуждающимся в лечении ΙΡΝ-α. В некоторых вариантах осуществления у субъекта диагносцирован или проявляется симптом, заболевание, поддающееся лечению ΙΡΝ-α. В других вариантах осуществления лекарственное средство ΙΡΝ-α, которое используют, одобрено для применения в лечении показания, которое было диагносцировано у субъекта. В других вариантах осуществления лекарственное средство ΙΡΝ-α, которое используют, не одобрено для лечения диагносцированного заболевания или выявленного симптома (симптомов), но лечащий врач считает, что лекарственное средство может быть полезно в лечении субъекта.

ΙΡΝ-α, используемый в фармацевтических композициях, фармацевтических продуктах и способах настоящего изобретения, может быть любым из многих подтипов белков ΙΡΝ-α, экспрессируемых у человека и многих других видов (Ре§1ка, 8. е! а1., Iттиηо1. КеОе\У5 202:8-32 (2004); Οίη/. М.О., е! а1., ί. Ιη- 17 020795 (сгГсгоп Су1ок|пс Кек 16: 179-180 (1996)). В предпочтительных вариантах осуществления белок ΙΡΝ-α является белком, полученным рекомбинантным способом, который состоит или по существу состоит из зрелой аминокислотной последовательности одного из следующих подтипов ΙΡΝ-α человека: ΙΡΝ-α1, ΙΡΝ-α2, ΙΡΝ-α4, ΙΡΝ-α5, ΙΡΝ-α6, ΙΡΝ-α7, ΙΡΝ-α8, ΙΡΝ-α10, ΙΡΝ-α13, ΙΡΝ-α14, ΙΡΝ-α16, ΙΡΝ-α17, ΙΡΝα21 (Вск15/. 1. е! а1., Ого\\1к Рае1от8 22(4):243-351 (2004)), а также аллельных вариантов любого из указанных подтипов, например ΙΡΝ-α2;τ ΙΡΝ-α26 и ΙΡΝ-α2ο. Подтипы ΙΡΝ-α человека характеризуются 7599% идентичности аминокислотной последовательности и зрелой аминокислотой из 166 а.к., за исключением ΙΡΝ-α2, который состоит из 165 а.к. в результате делеции в положении 44 (ВекГ/, 1., е! а1., выше). Другие рекомбинантные белки ΙΡΝ-α, предусмотренные для применения в настоящем изобретении, включают любой консенсусный белок ΙΡΝ-α, в котором аминокислотная последовательность создана путем отбора для каждого положения аминокислоты, которая чаще всего встречается в таком положении в различных нативных подтипах ΙΡΝ-α.

Особенно предпочтительные композиции ΙΡΝ-α для применения в фармацевтических продуктах и способах настоящего изобретения представляют собой продукты ΙΡΝ-α-2, одобренные государственным регуляторным органом, включая любые из перечисленных: КоГетои®-Л (ΙΡΝ-α 2А, рекомбинантный), поставляемый НоГГтапп Ьа-Коске, №п1еу ΝΙ), и его пегилированные версии, такие как ΡΕΟΑ8Υ8® (пегΙΗΝ-α^), поставляемый НоГГтапп Ьа-Коске, №.111еу ΝΙ); ΙΝΤΚΟΝ® А (ΙΡΝ-α-2Ε рекомбинантный), поставляемый 8скеппд Сотротакоп, КешруоПк Ν1) и его пегилированные версии, такие как РедкИгоп® (πег-IΡN-α-2Ь); (ΙΝΡΕΚΟΕΝ® (IΡN-α-соп-1), консенсусный ΙΡΝ-α, первоначально разработанный Атдеп, Ткоикапб Оакк, СА и в настоящее время поставляемый Ткгее Ктуетк РкаттасеиксаП, ^атгепйа1е, ΡΑ. Другие интерфероны, предусмотренные для применения в настоящем изобретении, включают гибриды ΙΡΝ-α и неинтерферонового белка, такие как А1ЬиГетоп® (альб-IΡN-α-2Ь), который разрабатывается Нитап Оепоте 8с1епсек, КоскуШе, ΜΌ и №гуаШ8, Ваке1, 8\\к/ег1апб; Ьос1егоп, проходящая клиническое испытание композиция с контролируемым высвобождением ΙΡΝ-α (Вю1ех/Ос!оР1ик); и Ве1егоГоп®, вариант природного α-ΙΡΝ с заменой одной аминокислоты, разработанный Ν;ηιΙί1ιΐ5 Вю!еск. Любая из названных выше композиций ΙΡΝ-α также может продаваться под различными торговыми названиями, такими как νΙΚΑΕΕΚΟΝΡΕΟ®, ^^ΙΡΝ-α^, который представляет собой такую же композицию, как и РедШ!гоп®, πег-IΡN-α-2Ь.

ΡΕΟΑ8Υ8® пег-IΡN-α-2а получают путем ковалентного связывания одного разветвленного ΡΕΟполимера с молекулярным весом 40 кДа с помощью амидной связи с боковой цепью лизина молекулы ΙΡΝ-α-2Κ см., например, Пка11шп, С. е! а1., Вюсоп)ида!е Скет. 16:504-517 (2005) и патент США № 7201897. Конечный продукт представляет собой смесь шести основных монопегилированных позиционных изомеров фкаИшп, С., выше, кокег, 8. е! а1., 1. Рго!. Εχρ. РштГ. 30: 78-87 [2003]). ΡΕΟΑ8Υ8® (пегΙΡΝ-α-2;·ι) и его биоаналоги также обозначаются здесь как ЬΡΕΟ40К-IΡN-α-2а.

РедкИгоп® (пег-IΡN-α-2Ь) получают при ковалентном взаимодействии рекомбинантного ΙΡΝ-α^ с сукцинимидилкарбонатом ΡΕΟ со средним молекулярным весом 12000 Да (8С-РБО12к) в 100 мМ фосфате натрия, рН 6,5 (см., например, Отасе, Μ. е! а1., 1. кИегГегоп Су!окШе Кек. 21:1103-1115 (2001); ^апд, Υ.8. е! а1., Αάν. Эгид ОеИуету Кеу. 54:547-570 (2000) и патент США № 5951974). Конечный продукт представляет собой смесь главным образом монопегилированных видов, в которых ΡΕО12к присоединен к различным остаткам ΙΡΝ-α^ с помощью уретановой связи, причем основной позиционный изомер имеет уретановую связь в положении гистидин 34 (см., например, ^апд, Υ.8. е! а1. выше и патент США № 5951974). РедкИгоп® (^^ΙΡΝ-α^) и его биоаналоги также обозначены здесь как ΡΕО12к-IΡN-α-2Ь.

Другие продукты ΙΡΝ-α, предусмотренные для применения в изобретении, которые были одобрены ранее или представлены в настоящее время на рынке, включают ВегоГог® α-2 (рекомбинантный ΙΡΝ-α2С, Воекппдег ШдеШеип Ркаттасеи!1са1, Шс., КМдейеМ, СТ; ΙΡΝ-α-пР очищенная смесь природных-αΙΡΝ, известная как 8иттГегоп® (8иткото, 1арап) или как \Уе11Гегоп® ΙΡΝ-α-π1 (ΙΝ8), О1ахо-\Уе11соте Ь!Д., Еопбоп, Огеа! Вгкат; консенсусный ΙΡΝ-α, такой как интерфероны, описанные в патентах США №№ 4897471 и 4695623 (особенно примеры 7, 8 или 9); ΑΣΡΕΚΟΝ Ν РцесОоп® |ΙΡΝ-α-π3 (полученный из лейкоцитов человека)], смесь многочисленных видов природных α-ΙΡΝ, предоставляемая Нет1кркетх Вюркатта, Шс., Рк11абе1рк1а, ΡΑ.

Другие конъюгаты ΙΡΝ-α-полимер, применяемые в настоящем изобретении, описаны в патенте США № 4766106, патенте США № 4917888, европейской патентной заявке № 0236987, европейских патентных заявках №№ 0510356, 0593868 и 0809996 и в международной публикации \УО95/13090.

Также для применения в настоящем изобретении предусмотрена любая фармацевтическая композиция пегилированного ΙΡΝ-α 2а или 2Ь, которая одобрена регуляторным органом на основе по меньшей мере в части идентичности преклинических и/или клинических данных, ранее представленных регуляторному органу в связи с утверждением любого из описанных выше представленных на рынке продуктов пегилированного ΙΡΝ-α, т.е. ΡΕΟΑ8Υ8® (пег-IΡN-α-2а) и РедкИгоп® (пег-IΡN-α-2Ь). Такие позднее одобренные продукты могут быть описаны регуляторным органом в терминах, таких как генерический,

- 18 020795 биоэквивалентный, биоаналог или заменяющий в отношении ранее одобренного продукта, указанные термины могут быть определены или не определены в явной форме регуляторным органом.

Фармацевтические композиции пегилированных ΙΡΝ-α, предназначенные для парентерального введения, могут быть включены в состав с подходящим буфером, например Тп5-НС1, ацетатным или фосфатным, таким как буфер двухосновный фосфат натрия/одноосновный фосфат натрия, и фармацевтически приемлемыми средами для лекарственного средства (например, сахароза, трегалоза), носителями (например, человеческий сывороточный альбумин), токсическими агентами (например, №С1), консервантами (например, тимеросал, крезол или бензиловый спирт) и сурфактантами (например, твин или полисорбаты) в стерильной воде для инъекций; см., например, патент США № 6180096 и международную патентную заявку \νθ2006/020720. Такие композиции могут быть сохранены в виде лиофилизированных порошков при охлаждении до 2-8°С и могут быть восстановлены стерилизованной водой перед применением. Такие восстановленные водные растворы обычно стабильны при хранении и использовании в течение 24 ч после восстановления; см., например, патенты США №№ 4492537, 5762923 и 5766582. Композиции леофилизированного пегилированного интерферона могут быть предоставлены в шприце-ручке, которая включает в себя стеклянный картридж, содержащий разбавитель (т.е. стерилизованную воду) в одном отделении и порошок лиофилизированного пегилированного ΙΡΝ-α в специальном отделении.

Примеры водных композиций пегилированного интерферона описаны в патенте США № 5762923. Такие композиции могут храниться в предварительно заполненных, многодозовых шприцах, таких как шприцы, применяемые для доставки лекарственных средств, таких как инсулин. Типичные соответствующие шприцы включают системы, содержащие предварительно заполненный пузырек, прикрепленный к ручке-шприцу, такому как ΝΟνΟΡΕΤ Νονο Реп, доступному в Νονο ΝοΓάίκΚ, а также предварительно заполненные ручки-шприцы, которые позволяют пользователю легко ввести инъекцию самому себе.

Настоящее изобретение также предполагает применение любого из упомянутых выше ΙΡΝ-α в комбинации с агонистом Τοΐΐ-подобного рецептора (ТЬК), который, как предполагают, индуцирует ответ на интерферон. Например, агонисты ТЬК3, ТЬК7 и ТЬК9 проходят оценку для применения в лечении Ηί','ν.

Заболевания и состояния, которые могут лечить по настоящему изобретению, обычно являются такими, которые поддаются лечению ΙΡΝ-α, т.е. ΙΡΝ-α обеспечивает клинически измеримый благоприятный результат в группе пациентов заболевания, например уменьшение вирусной нагрузки у ΗΟνинфицированных пациентов. Типичные заболевания и состояния, поддающиеся лечению ΙΡΝ-α, включают, но без ограничения, заболевания, вызываемые клеточной пролиферацией, в особенности вирусные инфекции и злокачественные опухоли. Предпочтительно заболевание представляет собой заболевание, для которого ΙΡΝ-α одобрен регуляторным органом, таким как Управление по контролю качества пищевых продуктов и лекарственных средств США.

Вирусные инфекции включают гепатит А, гепатит В, гепатит С, гепатит Ό, другой гепатит не-А/неВ, вирус герпеса, вирус Эпштейн-Барра (ΕΒν), цитомегаловирус (СМУ), простой герпес, вирус герпеса человека тип 6, папилломавирусы, поксвирус, пикорнавирус, аденовирус, риновирус, человеческий Тлимфотропный вирус типа 1 и 2, человеческий ротавирус, вирус бешенства, ретровирусы, включая вирус иммунодефицита человека (ВИЧ), энцефалит и респираторные вирусные инфекции. В предпочтительных вариантах осуществления вирусная инфекция представляет собой ΗΟΫ или ΗΒν. В особенно предпочтительном варианте осуществления вирусная инфекция представляет собой хроническую ΗСV-инфекцию.

В предпочтительных вариантах осуществления маркеры ответа на ΙΡΝ-α настоящего изобретения применяются совместно с любой схемой лечения монотерапии ΙΡΝ-α или комбинированной терапии, одобренной регуляторным органом при показании хронический ΗΒν или хронический ΗΟν, и в особенно предпочтительных вариантах осуществления совместно с любой из схем дозирования и лечения хронического гепатита С, описанных в листке-вкладыше для продуктов ΡόΚγοι'1®-Λ (ΙΡΝ-α 2А, рекомбинантный), РЕОА§У§® (№ΙΡΝ-α-2!ΐ), ΙΝΓΚΟΝ® А (ΙΡΝ-α-2ϋ, рекомбинантный) и РедБигоп® (пег-ΙΡΝα-2ό). Одобренные схемы комбинированной терапии при хронической ΗСV-инфекции обычно включают рибавирин, нуклеозидный аналог в дополнение к белку ΙΡΝ-α. Для продукта РедШгоп® (пег-IΡN-α-2Ь) такие одобренные комбинированные схемы рекомендуют терапию в течение 24 недель для пациентов, хронически инфицированных ΗΟΫ генотипа 2 или 3, и до 48 недель для пациентов, хронически инфицированных ΗΟν генотипа 1, причем 24-недельная терапия одобрена в Европе для подгруппы пациентов с генотипом 1 инфекции и пациентов с низкой вирусной нагрузкой (меньше 600000), которые являются ΗСV РНК-отрицательными на четвертой неделе лечения и остаются ΗΟΫ РНК-отрицательными на 24-й неделе лечения.

В других вариантах осуществления маркеры ответа на ΙΡΝ-α используются совместно с тестированием вирусологического ответа для определения соответствующей продолжительности лечения комбинированной терапией ΙΡΝ-α/рибавирином пациентов, инфицированных ΗСV генотипа 1. Пациенты, положительно тестированные на маркер ответа на ΙΡΝ-α в гомозиготном состоянии и которые имеют неопределяемый уровень РНК ΗСV на 4 и на 12 неделях лечения, могут быть кандидатами для лечения продолжительностью 12-36 недель, например 12, 18, 24, 30 или 36 недель. В некоторых предпочтительных

- 19 020795 вариантах осуществления выбираемая продолжительность лечения составляет 24 недели для не получавшего ранее лечения пациента, хронически инфицированного НСУ генотипа 1 с высоким исходным уровнем вирусной нагрузки, который положительно тестирован на маркер ответа на ΙΡΝ-α в гомозиготном состоянии и имеет неопределяемый уровень РНК НСУ в каждую из недель лечения 4 и 12. В особенно предпочтительных вариантах осуществления ΙΡΝ-α представляет собой пегилированный ПР№-а-2а или -2Ь или слитый белок альбумин4РМ-а-2а или -2Ь.

Комбинированные схемы на основе ΙΡΝ-α, включающие нуклеозидный аналог, другой, чем рибавирин, также рассматриваются для лечения НСУ-инфекции у субъектов, положительно тестированных на маркер ответа на ΙΡΝ-α. Примеры таких нуклеозидных аналогов включают производные рибавирина, такие как тарибавирин (также известный как вирамидин и Ιί','Ν 3142), который разрабатывается Уа1еап1 Ркагтасеийсак йИегпакопй (АЙ8О У1е.)о, СА), и соединения, описанные в патентах США №№ 6403564 и 6924270.

Маркеры ответа на ΙΡΝ-α настоящего изобретения также могут быть использованы для отбора пациентов, хронически инфицированных НСУ, которые, по-видимому, получат наибольшую пользу от лечения терапией на основе ΙΡΝ-α (с рибавирином или без него) в комбинации с одним или более дополнительными противовирусными агентами. Неограничивающие примеры противовирусных агентов, применяемых в таких схемах комбинированного лечения, включают ингибитор протеазы НСУ, ингибитор протеазы Ν83, ингибитор полимеразы НСУ, ингибитор НСУ Ν85Λ. ингибитор ШЕ8, ингибитор Ν84Β, ингибитор хеликазы НСУ, ингибитор входа, ингибитор продукции вирионов НСУ и другие интерфероны.

В одном варианте осуществления противовирусный агент представляет собой ингибитор протеазы

НСУ.

Ингибиторы протеазы НСУ, используемые в таких комбинированных схемах лечения, описаны в опубликованных международных патентных заявках №№ ^02009/038663, \νθ2007/092616 и \νθ2002/18369 и в опубликованной патентной заявке США 2007/0042968.

Другие ингибиторы протеазы НСУ, используемые в способах и комбинированных терапиях настоящего изобретения, включают боцепревир (8СН503034) и 8СН900518 (8скейп§-Р1ои§к); телапревир (УХ-950), УХ-500 и УХ-813 (Уейех Ркагтасеийсак); МК-7009 (Мегск) и ΙΓΜΝ-191 (К7227) (Юегтипе апй Коске); ТМС-435 (МейМг/Т1Ьо!ес); МК-7009 (Мегск); С8-9132 и АСН-1095 (Сйеай/АсЫ11оп); РНХ1766 (Ркепоних); АВТ-450 НСУ (АЬЬо!!/Епап!а Ркагтасеийсак) и ΒΙΕΝ 2061 и ΒΙ 201335 (Воекгтдег Ищейкит).

Дополнительные примеры ингибиторов протеазы НСУ, используемых в способах и комбинированных терапиях настоящего изобретения, включают ингибиторы, раскрытые в публикациях Ьапйго е! а1., Вюскеткйу, 36 (31):9340-9348 (1997); ШдаШпека е! а1., Вюскеткйу, 37(25): 8906-8914 (1998); ЬкпазВгипе! е! а1., Вюогд Мей Скет Ье!!, 8(13): 1713-1718 (1998); Магйп е! а1., Вюскеткйу, 37(33):11459-11468 (1998); 1)пиа81 е! а1., I Уио1, 71 (10): 7461-7469 (1997); Магйп е! а1., Рго!еш Епд, 10(5):607-614 (1997); Е1ζοιιΚί е! а1., I Нера!, 27(1):42-48 (1997); Вю^ойй Тойау, 9(217):4 (10 ноября 1998 г.); в патентных публикациях США №№ И82005/0249702 и И82007/0274951; и в международных патентах №№ ν098/14181, №098/17679, №098/17679, №098/22496, №099/07734 и №005/087731.

Другие примеры ингибиторов протеазы НСУ, используемые в настоящих композициях и способах, включают, но не ограничиваются следующими соединениями:

- 20 020795

В другом варианте осуществления противовирусный агент представляет собой ингибитор протеазы N83. Ингибиторы сериновой протеазы N83, используемые в настоящих способах и комбинированных терапиях настоящего изобретения, включают без ограничения ингибиторы, раскрытые в патентах США №№ 7494988, 7485625, 7449447, 7442695, 7425576, 7342041, 7253160, 7244721, 7205330, 7192957, 7186747, 7173057, 7169760, 7012066, 6914122, 6911428, 6894072, 6846802, 6838475, 6800434, 6767991, 5017380, 4933443, 4812561 и 4634697; в патентных публикациях США №№ υ820020068702, υ820020160962, υ820050119168, υ820050176648, υ820050209164, υ820050249702 и υ820070042968 и в международных патентных публикациях №№ ν003/006490, ν003/087092, \νθ04/092161 и

- 21 020795 №008/124148.

В еще одном варианте осуществления противовирусный агент представляет собой ингибитор полимеразы НСУ. Ингибиторы полимеразы НСУ, используемые в способах и в комбинированных терапиях настоящего изобретения, включают, но не ограничиваются: УР-19744 (№уе!к/У1гоРкагта), Р81-7851 (Ркагтакке!), К7128 (Коске/Ркагтакке!), ΡΡ-00868554 (РП/ег), УСН-759 и УСН-916 (УкоСкет/Уекех), НСУ-796 (№уе!к/УиоРкагта), ГОХ184 (Мешх), ММ-283 (Шетх/ХохагПк), К-1626 (Коске), МК-0608 (Ык/Мегск), С8 9190 (СПеак), АВТ-333 (АЪЪо!!), А-848837 и А-837093 (АЪЪой), С8К-71185 (С1ахо §тккК1те), АЫА598 (Аиайук), С8К-625433 (С1ахо 8тккК1ше), ХТЬ-2125 (ХТЬ Вюркагтасеикса1к) и ингибиторы полимеразы НСУ, раскрытые в публикациях Νί е! а1., Сштеи! Оршюи ίη Эгид ^^ксоνе^у апй ^еνе1ортеи!, 7(4):446 (2004); Таи е! а1., №!иге Ке\ае\ук, 1:867 (2002), Веаикеи е! а1., Сиггеи! Оршюи ш Iиνек!^да!^оиа1 Эгидк, 5:838 (2004) и в международных патентных публикациях №№ №008/082484, №008/082488, №008/083351, №008/136815, №009/032116, №009/032123, №009/032124 и №009/032125.

В другом варианте осуществления противовирусный агент является ингибитором Nδ5Α НСУ. Неограничивающие примеры ингибиторов Nδ5Α НСУ, применимые в способах и комбинированных терапиях настоящего изобретения, представляют собой А2Э2836 (А-831) и А2Э7295 (А-689) (Агготе Ткегареикск) и ВМ8-790052 (Вкк!о1-Муегк 5>с.|шЪЪ).

В одном варианте осуществления противовирусный агент является ингибитором №4В, таким как гидрохлорид клемизола и другие соли клемизола.

В одном варианте осуществления противовирусный агент является ингибитором репликазы НСУ, включая ингибиторы, раскрытые в патентной публикации США № И820090081636.

В другом варианте осуществления противовирусный агент является ингибитором хеликазы НСУ, таким как триоксален.

В другом варианте осуществления противовирусный агент представляет собой ингибитор входа НСУ, включая, но без ограничения, ОХ5061 и ОХ4520 (Окегх)), РК0 206 (Ргодешек) и селгосивир (МХ3253), МЮЕКЕХ.

В другом варианте осуществления противовирусный агент является соединением РНК-ί, например ТТ-033 (Тасеге Ткегареикск, Шс., 8аи Шке, СА).

В еще одном варианте осуществления противовирусный агент представляет собой другой интерферон типа 1 (например, ΚΝ-β или !ΡΝ-ω), интерферон типа II (например, ШМу) или интерферон типа III (например, П-28 или П-29).

Примеры интерферонов типа III, предусмотренных для применения в способах и комбинированных терапиях настоящего изобретения, включают, но не ограничиваются, РЕС-ШЛА (2ушоСеиекск/Вкко1 Муегк 5>с.|шЪЪ).

Примеры других дополнительных противовирусных агентов, предусмотренных для применения в способах и комбинированных терапиях настоящего изобретения, включают, но не ограничиваются, ТТ033 (Вет!ес/Тасеге Вю/РП/ег), §1та-034 (§1та Ткегареикск), С№-104 (СЕМттиие), ГОХ-102 (Иетх), ^еνоν^^^и™ (Κ',’Ν Ркагтасеикса1к, Сок!а Мека, СаНГопиа); Нитах (СеитаЪ), ОХ-2155 (I!к^еx/Nоνа^кк), РК0 206 (Ргодешек), НераСИей (NаиоУ^^ос^άек), МХ3235 (М1детх), 8СУ-07 (§аС1оие Ркагта), КРЕ02003002 (Кетш Ркагта), Ьеиос!а (УюОнек! Ркагтасеикса1к), ШТ - ШегГегои Еикаисшд Ткегару (Тгашйюи Ткегареикск), 2акахш (§с1С1оие Ркагта), УР 50406™ (Уиоркагта, ИсогрогаЮй, Ех!ои, Реиикуката); 14803™ (ШШ Ркагтасеикса1к, Саг1кЪай, СаЛГогта); Нер1а/уте™ (ШЪо/уте

Ркагтасеикса1к, ВоиИег, Со1огайо); Ткутокт™ (§аС1оие Ркагтасеикса1к, 8аи Ма!ео, СаЛГогта); Махатше™ (Мают Ркагтасеикса1к, 8аи 01едо, СаЛГогта); NКΒ-122 ДеиКеи Вюкаеисе Ис., №йк Сагокиа); Акта (Котагк ЬаЪога!окек), ЮТ0КМ-1 (комбинация К7128, ОММ191 и рибавирина); и микофенолята мофетил (ПоГГпит-ПаКоске, №Йеу, №\у Легкеу), δΟΥ-635 (δСΥNΕXIδ), ΑNΑ773 (Аиакук), СΥТ107 (Су!кекк), 8РС3649 (6аи!акк Ркагта), Акита (нитазоксанид) (Котагк); оглуфанида динатрий (ПпрПск Вюкаеисе), СТ8-1027 (Соиа!ик); NОУ-205 (Nоνе1ок Ткегареикск), ПМ0-2125 (Шега Ркагтасеиксак) и СΡ102 (СΑN-ΡIТΕ).

Изобретение также предполагает лечение пациентов с НСУ, которые являются гетерозиготными или гомозиготными по аллелю С гк8103142, терапевтическим агентом, который увеличивает уровни изоформы Ьук70 ΞΗΝ-λβ, снижает уровни изоформы Агд70 ΧΗΝ^ или оказывает оба эффекта.

Иллюстративные примеры терапевтических агентов, которые могли бы увеличить уровень изоформы Ьук70 IΡN-λ3, включают полипептид IΡN-λ3 Ьук70 и вектор экспрессии, который кодирует полипептид IΡN-λ3 Ьук70. Полипептид IΡN-λ3 Ьук70 может быть получен с помощью методик, хорошо известных в данной области техники; см., например, ОеИдгеи, С. е! а1., Сеиек аий ПптшШу 10:125-131 (2009) и патент США № 7517961. Предпочтительно вектор экспрессии представляет собой вектор, который воздействует на экспрессию кодируемого полипептида IΡN-λ3 Ьук70 в гепатоцитах печени человека. Такая таргентная генотерапия печени с использованием аденоассоциированных вирусных векторов была описана; см., например, публикацию НакЪгоиск, МС. е! а1., Сеие Ткегару 15:870-875 (2008) и материалы, использованные при экспертизе заявки, №ису διηνίΐι Тетр1е!ои, Сеие аий Се11 Ткегару: Ткегареикс Меска- 22 020795 тктк аий 81га1ед1ек, 3^ий ЕйШои, опубликовано СКС Ргекк (2008), Магк А. Ршйе15, Νοηνίπιΐ уесЮгк Тог деие (Негару: тейюйк аий ргоЮсок опубликовано Нитаиа Ргекк (2001).

Агенты, которые могли бы снизить уровень изоформы Агд70 ΙΡΝ-λ3, включают антисмысловые РНК, малые интерферирующие РНК (κί-РНК) и рибозимы. Специалист в данной области может легко разработать и проверить такие агенты с применением методик, известных в данной области; см., например, 81аи1еу Т. Сгооке, Аийкеике йгид 1ес1ию1оду: ргшщркк, 51га1ед1ек, аий аррЬсайоик, 2^ий ЕйШои: 2, опубликовано СКС Ргекк (2007) Кеут 1 8саи1ои, ТЬегареиЕс аррНсаЬоик оТ пЬо/утек. опубликовано Нитаиа Ргекк (1998).

Другой агент, который мог бы снизить уровень изоформы Агд70 ΙΡΝ-λ3, представляет собой моноклональное антитело, которое связывается и нейтрализует изоформу Агд70, но не изоформу Ьук70. Выделение таких антител должно быть легко осуществимым, поскольку положение аминокислоты 70, как считают, представлено на внешней поверхности ΙΡΝ-λ3.

Аллель С гк12979860 также ассоциирован с более высокой вероятностью естественного клиренса НСУ у пациентов с острым гепатитом С, который относится к первым 6 месяцам после заражения НСУ. Во время острой фазы симптомы не развиваются у 60-70% инфицированных людей. Однако некоторые пациенты имеют симптомы острой инфекции гепатита С, которые включают сниженный аппетит, утомляемость, боли в животе, желтуху, зуд и гриппоподобные симптомы, что приводит к раннему выявлению заболевания. У других пациентов выявляют острый гепатит С в результате проверки на НСУ-инфекцию после известного воздействия источника инфекции, такого как травма от иглы. Вирус гепатита С обычно обнаруживается в крови с помощью ПЦР в течение от одной до трех недель после инфицирования, и антитела к вирусу обычно обнаруживаются в течение от 3 до 15 недель.

Поскольку у 50% пациентов происходит спонтанная элиминация вируса во время острой фазы, врачи обычно крайне неохотно и вынужденно подвергают пациента, у которого обнаружен острый гепатит, расходам и побочным эффектам антивирусной терапии, прежде чем у пациента не разовьется хроническая НСУ-инфекция, т.е. инфекция позднее более 6 месяцев. Определение генотипа пациента в Р8 гк12979860 может быть другим фактором, который следует учитывать врачу, принимая решение, начинать ли антивирусную терапию или отложить терапию на шесть месяцев после выявления острой НСУинфекции. Если генотип пациента является гетерозиготным или гомозиготным по С, врач может принять решение отложить терапию на шесть месяцев. Если генотип пациента является гомозиготным по Т, врач может полагать, что ранняя противовирусная терапия оправдана, поскольку спонтанная элиминация вируса у пациента является маловероятной.

Дозы и схемы дозирования других агентов, используемых в комбинированных терапиях настоящего изобретения для лечения НСУ-инфекции, могут быть определены лечащим врачом с учетом одобренных доз и схемы дозирования, указанных в листке-вкладыше; и возраста, пола и общего состояния здоровья пациента. Агенты, вводимые в комбинированной терапии НСУ, могут быть введены одновременно (т.е. в одной и той же композиции или в отдельных композициях один сразу после другого) или последовательно. Это особенно удобно, если компоненты комбинации предоставляются в различных схемах дозирования, например один компонент вводят один раз в день и другой компонент вводят каждые 6 ч, или если предпочтительные фармацевтические композиции являются различными, например одна представляет собой таблетку и другая представляет собой капсулу. Набор, содержащий отдельные лекарственные формы, соответственно является предпочтительным.

Если ΙΡΝ-α представляет собой РЕС12к-Ш^а-2Ь, такой как РедИИгои® (пег4Р^а-2Ь) или его биоаналог, предпочтительная схема лечения хронической НСУ-инфекции включает 1,5 мкг/кг РЕС12кΙΡΝ-α^ один раз в неделю в комбинации с дневными дозами 800-1400 мг рибавирина. Доза рибавирина учитывает вес пациента: 800 мг/день для пациентов весом 40-65 кг, 1000 мг/день для пациентов весом больше 65 и до 85 кг, 1200 мг/день для пациентов весом больше 85 и до 105 кг и 1400 мг/день для пациентов весом больше 105 кг. В некоторых вариантах осуществления рекомендованная недельная доза ΡЕС12к-IΡN-α-2Ь составляет 0,5, 0,75 или 1,0 мкг/кг, и дневная доза рибавирина составляет 600-1400 мг рибавирина, исходя из веса пациента.

Если ΙΡΝ-α представляет собой ЬΡЕС40К-IΡN-α-2а, такой как РЕСА8У8® (пег-IΡN-α-2а) или его биоаналог, предпочтительная схема лечения хронической НСУ-инфекции включает 180 мкг/неделю ЬΡЕС40К-IΡN-α-2а в комбинации с дневной дозой рибавирина 1000 мг для пациентов весом меньше 75 кг и 1200 мг для пациентов весом больше или равным 75 кг. В некоторых вариантах осуществления рекомендованная недельная доза ЬΡЕС40К-IΡN-α-2а является по меньшей мере на 25% меньше 180 мкг.

В некоторых предпочтительных вариантах осуществления схема комбинированного лечения, применяемая для лечения пациентов, хронически инфицированных НСУ генотипа 1 с высокой вирусной нагрузкой и положительно тестируемых по меньшей мере на один маркер ответа на ΙΡΝ-α, включает вводный период лечения от приблизительно 2 до 17 недель, во время которого ΙΡΝ-α, такой как РЕС12кΙΡΝ-α^ и ЬΡЕС40К-IΡN-α-2а, вводят в комбинации с рибавирином, за которым следует второй период лечения от приблизительно 12 до приблизительно 28 недель, во время которого вводят трехкомпонентную комбинацию ΙΡΝ-α, рибавирина и ингибитора протеазы, такого как боцепревир или телапревир. Та- 23 020795 кие двухфазные схемы лечения описаны в публикации международной патентной заявки ν02009/038663. В особенно предпочтительных вариантах осуществления вводный период составляет приблизительно 4 недели и второй период лечения составляет приблизительно 24 недели.

Злокачественные опухоли, поддающиеся лечению ΙΡΝ-α, включают меланому, хронический миелолейкоз (СМЬ), почечно-клеточный рак (КСС), волосатоклеточный лейкоз, саркому Капоши, множественную миелому, базально-клеточную карциному, злокачественную меланому, поверхностный рак мочевого пузыря (8ВС), рак яичников, фолликулярную лимфому, неходжкинскую лимфому, кожную Тклеточную лимфому, кондилому остроконечную, грибовидный микоз, карциноидный синдром, колоректальный рак, папилломатоз гортани и старческий кератоз. Предпочтительные злокачественные новообразования и соответственно схемы дозирования описаны в схемах для хронического гепатита С, указанных в маркировке и в инструкции-вкладыше продуктов Ко£егоп®-А (ΙΡΝ-α 2А, рекомбинантный) и ΙΝΤΚ0Ν® А (ΙΡΝ-α-2ϋ, рекомбинантный).

В предпочтительных вариантах осуществления маркеры ответа на ΙΡΝ-α настоящего изобретения применяются совместно с пегилированным ΙΡΝ-α для лечения пациентов с меланомой, хроническим миелолейкозом (СМЬ) или почечно-клеточным раком (КСС), включая, например, схемы лечения, описанные в патентах США №№ 6923966 (меланома), 6605273 (КСС) и 6362162 (СМЬ); Вико\\ък1 К., е1 а1., Сапсег 95 (2):389-396 (2002); ВикотеЫ К., е! а1., к С1ш Опсо1. 20(18):3841-348 (2002); Оагаа-Мапего, О. е! а1., Сапсег 97 (12):2010-2016 (2003); Оагаа-Мапего, О. е! а1., Сапсег 98(3): 437-457 (2003); М1сЬа11е1, М. е! а1., Ьеикеш1а 18:309-315 (2004); МоУег, К.1 е! а1., к С1ш Опсо1. 19(5): 1312-1319 (2001); МоУег, К! е! а1., Апп. Опсо1. 13:1799-1805 (2002); Ырфп, кН., е! а1., В1оо4 100:782а ЛЬЧгаа 3091 (2002); Носккаик, А., е! а1., В1оо4 100:164а ЛЬЧгаа 616 (2002); и Бцттег е! а1., Ргос. Ат. 8ос. С1т. Опсо1. 22:712 АЬЧгас! 2861 (2003).

В одном предпочтительном варианте осуществления маркеры ответа на ΙΡΝ-α изобретения используются для выявления пациентов с меланомой высокой степени риска, которые являются подходящими кандидатами для терапии ΙΡΝ-α, особенно пациенты на стадии ПВ (повреждения >4 мм, но без вовлечения лимфоузлов) и на стадии ΙΙΙ (повреждения >4 мм и с вовлечением лимфоузлов) первичной кожной меланомы. Предпочтительно терапия ΙΡΝ-α используется в качестве адъювантной терапии после того, как пациенты были прооперированы по поводу меланомы стадии ПВ или стадии ΙΙΙ.

В более предпочтительных вариантах осуществления ΙΡΝ-α, используемый в качестве адъювантной терапии, представляет собой пегилированный ΙΡΝ-α. Пациенты с меланомой, которых лечат согласно улучшенным способам настоящего изобретения, включают пациентов с впервые выявленным заболеванием, у которых не обнаруживали заболевания после операции, но которые имеют высокий риск системного рецидива заболевания. Термин пациенты высокого риска, который используется здесь, обозначает пациентов с меланомой, у которых толщина повреждений по Бреслоу >4 мм, а также пациентов с любой толщиной повреждений по Бреслоу с первичным или рекуррентным вовлечением лимфоузлов. Лечение пегилированным ΙΡΝ-α по настоящему изобретению будет продолжаться до пяти лет, если только нет клинических данных о прогрессировании заболевания, неприемлемой токсичности или пожеланий пациентов прекратить терапию.

Если пегилированный ΙΡΝ-α, применяемый для лечения пациента с меланомой высокого риска, представляет собой РЕО12к4Р^а-2Ъ, такой как РеЦШгоп® (пег4Р^а-2Ъ) или его биоаналог, предпочтительная схема лечения включает введение пациенту начальной дозы 3,0-9,0 мкг на 1 кг один раз в неделю (Ον), предпочтительно в пределах от 4,5 до 6,5 мкг на 1 кг Ο\ν, более предпочтительно в пределах 5,5-6,5 мкг на 1 кг ρ\ν и наиболее предпочтительно приблизительно 6,0 мкг на 1 кг ρ\ν. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления пациент с меланомой высокого риска первоначально получал лечение 6,0 мкг на 1 кг РЕО12к-Ш^а-2Ъ Ον в течение восьми недель и затем 3,0 мкг на 1 кг или меньше РЕО12к4Р^а-2Ъ Ον в течение периода времени продолжительностью пять лет минус восемь недель начального лечения. Если пациент получает дозу меньше 3,0 мкг на 1 кг, например, для поддержания переносимости пациентом лечения дозу предпочтительно уменьшают на 1 мкг на 1 кг во время каждого уменьшения, например от 3,0 до 2,0 до 1,0.

Если пегилированный ΙΡΝ-α, применяемый для лечения пациента с меланомой высокого риска, представляет собой ЪРЕО40К4Е^а-2а, такой как РЕОА8У8® (пег4Р^а-2а) или его биоаналог, схема лечения включает введение пациенту дозы приблизительно от 50 до 500 мкг Ο\ν, предпочтительно приблизительно от 200 до 250 мкг Ο\ν.

При введении комбинированной терапии, которую выбирают для лечения пациента на основе наличия или отсутствия маркера ответа на ΙΡΝ-α у пациента, терапевтические агенты в комбинации или фармацевтической композиции либо в композициях, содержащих терапевтические агенты, могут быть введены в любом порядке, например последовательно, параллельно, совместно, одновременно и т.д. Количества различных терапевтических агентов такой комбинированной терапии могут представлять собой различные количества (различные размеры дозировки) или одинаковые количества (одинаковые размеры дозировки). В некоторых вариантах осуществления агенты в комбинации вводят в дозах, обычно приме- 24 020795 няемых, когда такие агенты используют в виде монотерапии для лечения заболевания или состояния пациента, тогда как в других вариантах осуществления агенты вводят в дозах более низких, чем дозы, обычно применяемые, когда такие агенты используют в виде монотерапии для лечения заболевания или состояния.

В некоторых вариантах осуществления терапевтические агенты, используемые в комбинированной терапии, представлены в той же самой фармацевтической композиции, которая может быть применима для перорального введения, внутривенного введения, подкожного введения или парентерального введения.

Авторы изобретения также предполагают, что маркеры ответа на ΙΡΝ-α, описанные здесь, могли бы быть использованы при обращении за разрешением регуляторного органа для реализации на рынке нового фармацевтического продукта ΙΡΝ-α с фармакогенетическим показанием, т.е. показанием, которое включает компонент заболевания и компонент маркера ответа ΙΡΝ-α. Компонент заболевания представляет собой заболевание, поддающееся лечению ΙΡΝ-α, и компонент генетического маркера представляет собой пациента, который положительно тестирован по меньшей мере на один из маркеров ответа на ΙΡΝα, описанных здесь. Аналогичным образом, авторы изобретения предполагают здесь, что указанные маркеры ответа на ΙΡΝ-α являются полезными при обращении за разрешением регуляторного органа в отношении таких фармакогенетических показаний для одобренных в настоящее время лекарственных средств ΙΡΝ-α, которые врачи назначают с неохотой при определенных заболеваниях, исходя из отношения получаемой пользы/риска препарата для лечения таких заболеваний в общей популяции.

Обращение за разрешением регуляторного органа в отношении фармакогенетического показания обычно предусматривает измерение числа случаев желательного ответа на лекарственный препарат в двух отдельных группах пациентов, получавших лечение лекарством. Каждый субъект в одной из групп имеет заболевание и генетические профили, по которым пациента относят к предлагаемому фармакогенетическому показанию. Субъекты в другой группе могут быть выбраны случайным образом независимо от того имеют ли они компонент генетического маркера предлагаемого фармакогенетического показания. С другой стороны, субъектов распределяют в другую группу таким способом, который дает в результате контрольную группу, в которой процент субъектов, которые соответствуют и не соответствуют компоненту генетического маркера, аналогичен наблюдаемому в общей популяции или в популяции пациентов с компонентом заболевания предлагаемого фармакогенетического показания. Фармацевтический продукт, для которого получают разрешение, может быть введен двум группам в проспективном клиническом исследовании. Альтернативно, может быть произведен ретроспективный фармакогенетический анализ пациентов, получавших лечение лекарственным средством в прошлом.

Фармацевтический продукт, для которого ведут поиск фармакогенетического показания, может оцениваться с другими терапевтически активными агентами, например другое лекарственное средство с эффективностью для лечения заболевания или состояния в предлагаемом фармакогенетическом показании, или агент, который предназначен для уменьшения числа случаев нежелательного эффекта, вызываемого лекарственным средством. В некоторых вариантах осуществления фармакогенетическое показание, для которого получают разрешение регуляторного органа, может включать другие маркеры (генетические маркеры или биомаркеры) или предикторы ответа на лекарственное средство. Например, быстрый вирусологический ответ НСУ (КУК) на комбинированную терапию пегилированным ΙΡΝ-α и рибавирином является хорошим предиктором достижения §УК.

Фармакогинетическое исследование может быть разработано после консультации с представителями регуляторного органа или государственной организации, утверждение которой необходимо перед продвижением на рынке фармакогенетического фармацевтического продукта в определенной стране.

Предпочтительно регуляторный орган уполномочен правительством крупной промышленноразвитой страны, такой как Австралия, Канада, Китай, страна - член Европейского союза, Япония и т.п. Наиболее предпочтительно регуляторный орган уполномочен правительством Соединенных Штатов и тип заявки, которая подается для утверждения, будет зависеть от юридических требований, установленных в последней принятой версии Закона о пищевых продуктах, лекарственных препаратах и косметических средствах, которые применимы к фармацевтическому продукту и также могут включать другие соображения, такие как стоимость составления обязательной отчетности и маркетинговая стратегия для фармацевтического продукта. Например, если фармацевтическая композиция в фармацевтическом продукте была ранее утверждена для компонента заболевания, предлагаемого фармакогенетического показания, то заявка может представлять собой бумажную ΝΏΆ, дополнительную ΝΏΆ или сокращенную ΝΏΆ, но может потребоваться, чтобы заявка являлась полной ΝΏΆ, если фармацевтическая композиция не была утверждена ранее; причем указанные термины имеют значения, применимые к ним специалистами в фармацевтической области или как определено в законе О ценовой конкуренции на рынке лекарственных средств и восстановлении срока действия патента от 1984 г.

Один ожидаемый результат фармакогенетического клинического испытания с использованием маркеров ответа на ΙΡΝ-α изобретения представляет собой одобренный для представления на рынке фармацевтический продукт, который включает (1) фармацевтическую композицию ΙΡΝ-α и (2) инструкцию- 25 020795 вкладыш, которая включает фармакогенетическое показание, для которого рекомендована фармацевтическая композиция. Инструкция-вкладыш обычно находится в листке-вкладыше, также часто называемом листок-вкладыш в упаковке или этикетка для лекарственного средства.

Как обсуждалось выше, фармакогенетическое показание имеет два компонента: компонент заболевания и компонент маркера ответа на ΙΡΝ-α. Таким образом, инструкция-вкладыш описывала бы генетически определяемые группы пациентов, в которых была показана эффективность лекарственного препарата в отношении одного или более заболеваний, симптомов или медицинских состояний. В некоторых вариантах осуществления в инструкции-вкладыше будет рассматриваться, как идентифицировать субъектов, которые составляют генетически определяемую группу. Например, в некоторых вариантах осуществления в инструкции-вкладыше определено, что лекарственный препарат показан субъектам, положительно тестированным на один или более маркеров ответа на ΙΡΝ-α, описанных здесь. С другой стороны, в инструкции-вкладыше может говориться, что лекарственное средство противопоказано субъектам, отрицательно тестированным на один или более из всех указанных маркеров ответа ΙΡΝ-α. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления инструкция-вкладыш включает название по меньшей мере одного утвержденного диагностического теста, который используют для обнаружения наличия или отсутствия предусмотренного компонента генетического маркера фармакогенетического показания. Как описано выше, фармакогенетическое показание для фармакогенетического фармацевтического продукта изобретения может включать дополнительные маркеры или предикторы ответа на фармацевтическую композицию ΙΡΝ-α и/или требование использовать лекарственное средство в комбинации с одним или более других терапевтически активных агентов. Инструкция-вкладыш может содержать информацию о рекомендованных дозах и схемах лечения.

В некоторых вариантах осуществления фармакогенетический фармацевтический продукт предоставляется в виде композиции или в упаковке, которая имеет характерный внешний вид, который производитель ввел для идентификации фармацевтического продукта в качестве фармакогенетического продукта, чтобы помочь фармацевтам и врачам отличить указанный продукт от других продаваемых продуктов, содержащих такой же или похожий активный ингредиент ΙΡΝ-α, который, однако, не имеет фармакогенетического показания. Использование оформления фармацевтических композиций и упаковки фармацевтического продукта как части создания характерного бренда фармацевтических продуктов хорошо известно в данной области и включает форму и цвет таблеток или капсул, а также символы или логотипы, проштампованные на них или на упаковочном материале фармацевтического продукта.

В предпочтительных фармакогинетических фармацевтических продуктах изобретения фармацевтическая композиция включает пегилированный ΙΡΝ-α-23, пегилированный ΙΡΝ-α-2Ρ или альб-ГРН-а-2Ъ. Более предпочтительно фармацевтическая композиция включает ЪРЕО40К-ШЫ-а-2а или РЕО12к-ШЫ-а2Ъ. Предпочтительное фармакогенетическое показание для фармацевтических продуктов изобретения включает применение фармацевтической композиции для лечения пациентов хронически инфицированных НСУ генотипа 1 и которые имеют положительный результат теста по меньшей мере на один из маркеров ответа на ΙΡΝ-α в гомозиготном состоянии, описанных здесь. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления пациенты имеют высокую исходную вирусную нагрузку НСУ, как определено выше. В более предпочтительных вариантах осуществления в инструкции-вкладыше указано, что фармацевтическая композиция ΙΡΝ-α показана в комбинации по меньшей мере с одним другим противовирусным агентом для лечения пациентов, хронически инфицированных НСУ генотипа 1 с высоким исходным уровнем вирусной нагрузки. Противовирусный агент может представлять собой рибавирин, ингибитор протеазы НСУ и ингибитор полимеразы НСУ или другой агент, который специфически ингибирует репликацию НСУ. В инструкции-вкладыше может быть рекомендовано применение фармацевтической композиции ΙΡΝ-α в комбинации с любой комбинацией из двух или более указанных противовирусных агентов. Кроме того, инструкция-вкладыш может включать рекомендованную схему лечения, причем предпочтительными схемами лечения являются любые из схем, описанных выше для фармацевтических композиций РЕО12к-ШЫ-а-2Ъ и ЪРЕО40КЛР^а-2а.

Любая или все аналитические и математические операции, предусмотренные при осуществлении способов, описанных здесь, или при использовании наборов и продуктов, описанных здесь, могут быть выполнены с помощью компьютера. Например, компьютер может выполнять компьютерную программу, которая определяет наличие или отсутствие маркера ответа на ΙΡΝ-α у субъекта на основе данных о генотипе, введенных сотрудником лаборатории тестирования или лечащим врачом, кроме того, тот же самый компьютер или другой компьютер может выводить прогнозируемый ответ на терапию ΙΡΝ-α на основе определения маркера ответа. В некоторых вариантах осуществления компьютер выполняет компьютерную программу, которая производит оценку вероятности ответа пациента, исходя из различных параметров пациента и заболевания, связанных с ответом на ΙΡΝ-α, включая наличие или отсутствие маркера ответа на ΙΡΝ-α. Данные, относящиеся к наличию или отсутствию маркеров ответа на ΙΡΝ-α у субъекта, могут быть сохранены в виде части реляционной базы данных (например, базы данных Огас1е или набора простых файлов АЗСП), содержащей другие клинические и/или генетические данные субъекта. Указанные данные могут храниться на жестком диске компьютера или могут храниться, например, на

- 26 020795

СО-КОМ или на одном или более устройств хранения, доступных компьютеру. Например, данные могут храниться в одной или более базах данных, соединенных с компьютером посредством сети.

Примеры

Следующие примеры предоставляются для более понятного описания настоящего изобретения и не должны интерпретироваться как ограничивающие объем изобретения.

Пример 1. Количественный метод ПЦР-РВ. Тест на РНК НСУ.

A. Принцип.

Обнаружение НСУ-ΡΗΚ определяется выделением общей РНК из биологического образца и выполнением полимеразной цепной реакции с обратной транскриптазой (ПЦР-РВ). Используемая ПЦР-РВ является автоматизированным методом, который позволяет количественное определение в реальном масштабе времени заданных молекул нуклеиновой кислоты. В указанном методе используется активность обратной транскриптазы, 5'-экзонуклеазная и ДНК-полимеразная активности ДНК-полимеразы гНН. ДНК-полимераза гНН производит копии ДНК вирусной РНК (активность обратной транскриптазы) и затем приступает к изготовлению копии ДНК (полимеразная активность). В то время как происходит амплификация, 5'-экзонуклеазная активность ДНК-полимеразы гНН расщепляет сайт-специфический зонд. Указанное действие высвобождает флуоресцентный сигнал, позволяющий количественное определение вводимых копий РНК.

Генотип НСУ определяют секвенированием ПЦР-амплифицированного фрагмента ДНК 5'нетранслируемой области генома НСУ. Затем проводят выравнивание последовательности с опубликованными последовательностями генотипов НСУ, чтобы прийти к определению.

B. Выделение РНК из образца.

Общую РНК выделяют с помощью автоматизированного высокопроизводительного устройства Ыцшб Напб1ег и с использованием набора для экстракции РНК ΟΙΑαιηρ 96 Уиа1 ΡΝΑ от ЦМСЕХ (Сегтап1о\уп, МО). Указанный метод обеспечивает получение РНК высокого качества, применимой в ПЦРРВ.

C. Количественная ПЦР-РВ для НСУ.

Одностадийную ПЦР-РВ осуществляют с применением ДНК-полимеразы гНН. Прямое обнаружение продукта ПЦР-РВ достигается путем мониторинга увеличения флуоресценции меченого красителем зонда. Во время ПЦР, если присутствует представляющая интерес мишень, зонд специфически гибридизуется с мишенью. 5'-экзонуклеазная активность ДНК-полимеразы гНН расщепляет зонд с высвобождением флуоресценции. Указанный процесс происходит в каждом цикле во время ПЦР и не препятствует экспоненциальному накоплению продукта. Увеличение флуоресценции (пропорциональное количеству накопленного продукта ПЦР) обнаруживается, только если последовательность-мишень комплементарна зонду и амплифицируется во время ПЦР. Благодаря указанным требованиям, неспецифическая амплификация не обнаруживается.

Система может измерить продукты ПЦР после каждого цикла амплификации. Начальное число копий матрицы-мишени определяют путем анализа изменения сигнала флуоресценции (.Кп) от цикла к циклу в виде результата амплификации матрицы во время ПЦР.

Требуется несколько циклов, чтобы достичь детектируемого сигнала флуоресценции (представляемого как С1, пороговый цикл), большего, чем сигнал, соответствующий начальному числу копий. Приложение для определения последовательностей определяет начальные количества копий, которые неизвестны, с помощью интерполяции на стандартную кривую, построенную на основании стандартных растворов с известным начальным количеством копий.

Ό. Контроль качества/гарантия качества.

К каждой пробе добавляют внутренний РНК-контроль для проверки эффективности выделения РНК и ПЦР-РВ. Различные разведения предварительно откалиброванного контроля НСУ РНК запускают в каждом тесте для построения стандартной кривой. В качестве положительных контролей в каждом тесте запускают образец из набора НСУ ΡιόΠ№ικ:\· Ραι^ΐ МетЬегк. Нормальную человеческую сыворотку и воду запускают в качестве отрицательного контроля при выделении РНК и ПЦР-РВ.

Определения ПЦР-РВ НСУ-ΡΠΚ, выполненные с использованием указанного выше теста, проверяли в сравнении с международными стандартами ВОЗ для РНК вируса гепатита С и с тест-системой НСУ Ραΐ'ΒΐΙ от Аего Мейгх. Нижний предел количественного определения для данного теста составляет 29 международных единиц/мл (МЕ/мл). Все результаты НСУ^НК представлены здесь в МЕ/мл.

Пример 2. Идентификация однонуклеотидного полиморфизма (δΝΡ), ассоциированного с ответом НСУ на лечение комбинированной терапией пег-ШЫ-а-2/рибавирин.

Чтобы определить вклад генетических факторов в ответ на терапию, авторы изобретения провели полногеномное ассоциативное исследование на геномных образцах, полученных из двух проспективных клинических исследований. Более 1500 субъектов приняли участие в исследовании ГОЕАЬ, дизайн которого описан в публикации МсНйсЫпкоп е1 а1., ί. У1га1 Нера1о1, Уо1. 15, №. 7, би1у 2008, р. 475-481. С целью увеличения числа афро-американцев в полногеномном ассоциативном анализе, также были включены 67 человек из другого проспективного исследования, в котором изучали лечение афро-американцев

- 27 020795 ^^ΙΡΝ-α^ϋ и рибавирином (Мшг, А.1. ВогпМет, Ю. & КШеиЬегд, ΡΌ. редпКегГегоп а1Га-2Ь апй пЪаути Гог (Не (геа(теп( оГ сНгошс НераННк С ш Ь1аскк апй поп-Нкрашс теННек. Ν Епд1 ί. Мей 350, 2265-71 (2004)).

Вкратце, в исследовании ГОЕАЬ ранее нелеченные пациенты, хронически инфицированные НСУ генотипа 1, были рандомизированы (1:1:1) для получения одной из следующих 48-недельных схем лечения: ^^ΙΡΝ-α^ ЩЕС2Ь) по 1,5 мкг/кг/неделю плюс рибавирин (КВУ); ΡЕС2Ь по 1,0 мкг/кг/неделю плюс КВУ; или ^^ΙΡΝ-α^ ЩЕС2а) по 180 мкг/неделю+КВУ. В схемах ΡЕС2Ь пациенты весом 40-65 кг получали 800 мг/день КВУ; пациенты весом больше 65 и до 85 кг получали 1000 мг/день КВУ; пациенты весом больше 85 и до 105 кг получали 1200 мг/день КВУ и пациенты весом больше 105 кг получали 1400 мг/день КВУ. В схемах ΡЕС2а пациенты весом меньше 75 кг получали 1000 мг/день КВУ, тогда как пациенты весом больше или равном 75 кг получали 1200 мг/день КВУ. Статус РНК НСУ определяли на исходном уровне в 12 и 24 недели лечения, в конце 48 недель лечения и на 24 неделе после лечения. Субъекты с недостаточным вирусологическим ответом в 12 или 24 недели досрочно выбывали из исследования ввиду отсутствия эффекта терапии. Результаты исследования ГОЕАЬ продемонстрировали, по существу, эквивалентную эффективность схем ΡЕС2Ь (1,5 мкг/кг/неделя) плюс КВУ и ΡЕС2а со значительно более низким ответом в хорошо подобранной группе афро-американцев по сравнению с группой европейцев.

Все пациенты, включенные в полногеномный анализ, являлись ранее нелеченными и хронически инфицированными НСУ генотипа 1. Пациенты получали лечение в течение 48 недель (субъекты с недостаточным вирусологическим ответом в 12 или 24 недели досрочно выбывали из исследования по протоколу ввиду отсутствия эффекта терапии) и 24 недели продолженного наблюдения. Геномные образцы 1630 субъектов генотипировали с применением набора Нитап610-циай ВеайСЫр от Шитша® (^ап 01едо, СА), который содержит приблизительно 600000 меченых δΝΡ, полученных на основании данных фазы ΙΙ НарМар (НитапНар 610 сщай У 1.0). Результаты генотипирования анализировали в отношении детерминант ответа на терапию (клиренс вируса или δΎΕ) в качестве основной конечной точки. Ответ на терапию и отсутствие ответа (ΝΒ) устанавливали согласно стандартным определениям (СНапу, М.С. е( а1., δΙπ^Γ, Э.В., ТНотак, Ц.Ь. & δееГГ, Ь.В. Атепсап Аккоаайоп Гог (Не δΐийу оГ Ыуег Экеакек: Ггас(1се СшйеПпек; О|адпок1к, Мападетеп(, апй Тгеа(теп( оГ НераННк С: Ап ирйа(е (2009)). Устойчивый вирусологический ответ определяли, как недетектируемый сывороточный уровень РНК НСУ, с применением чувствительного теста ПЦР-РВ через 24 недели после прекращения лечения (или недетектируемые вирусные уровни в 12 недель продолженного наблюдения, если дальнейшее продолженное наблюдение было невозможно). Отсутствие ответа определяли либо как невозможность достичь, по меньшей мере, уменьшения на 2-1одх₀ уровня РНК НСУ в сыворотке в 12 недель лечения, либо как детектируемый уровень РНК НСУ в сыворотке крови в конце периода продолженного наблюдения. Все пациенты, которые достигали δΥΡ, были включены в анализ в качестве респондентов. Чтобы убедиться, что оценивали только нереспондентов с соответствующим воздействием лекарственного средства (истинные биологические нереспонденты), только пациенты, получившие минимум 12 недель терапии и с соблюдением режима терапии более 80% для ΡедIΡN и КВУ, были включены в анализы ассоциации. Проводили серии процедур контроля качества, чтобы гарантировать качество данных. Всего 1143 пациента с гепатитом С и с достаточными данными ответа на лечение отвечали указанным критериям и затем были включены в анализы ассоциации (табл. 3).

Первичные тесты ассоциации δΑΉ. включали тесты определения тенденции изменения генотипа одного маркера, выполненные в трех независимых этнических популяциях (европейцы, Ν=874; афроамериканцы, Ν=191, и испаноговорящие, Ν=78), с применением логистических регрессионных моделей, реализованных в программном обеспечении ΡΕΙΝΚ (ГигсеИ, δ. е( а1. Ат ί. Нит Сепе(. 81 (2007)) с коррекциями для числа клинических ковариантов, включая исходную (до лечения) сывороточную вирусную нагрузку НСУ и тяжесть фиброза.

- 28 020795

Таблица 3

Клинические характеристики популяций гепатита С при изучении 8УК

	Популяции
Европейцы	Афро-американцы	Испаноговорящее население
N	874	191	78
Пол (М/Ж)	332/542	71/120	30/48
Возраст (годы)	47,5 (7,2)	50,1 (6,5)	45,3 (9,1)
ΒΜΙ (кг/м2)	28,0 (4,4)	29,9 (4,8)	29,3 (5,5)
Исходный уровень вирусной нагрузки (1одю МЕ/мл)	6,4 (0,6)	6,3 (0,5)	6,2 (0,7)
Исходная стадия фиброза печение (п, %)
Минимальный (Р02)	773 (88,4%)	174 (91,1%)	66 (84,6%)
Распространенный (РЗ-4}	101 (11,6¾)	17 (8,9%)	12 (15,4%)
ЗУК/ΝΚ (ВУК%)	490/384 (56,1%)	45/146 (23,6%)	40/38 (51,3%)

8УК, устойчивый вирусологический ответ (8УК24=539, 8УК12=36); ΝΡ.. отсутствие ответа; ВМ1, индекс массы тела. Исходная вирусная нагрузка логарифмически преобразована. Фиброз оценивали в баллах по шкале МЕТАУ1К, стадию на исходном уровне централизованно оценивали путем проведения биопсии печени; Нера!о1оду 20, 15-20 (1994); МсНи!сЙ1зоп, ТО. е! а1. N Епд1. I Меб. 1п ргезз (2009). Данные представлены в виде среднего значения (80), если не указано иначе.

Затем ассоциативные сигналы (Р-значения) комбинировали с использованием метода Стауффера для взвешенных Ζ-величин (^йй1оск, М.С., е! а1. Б Еуо1 Вю1. 18, 1368-73 (2005)), корректно принимая в расчет размеры групп, эффект размеров и направления эффектов в каждой популяции. Указанные комбинированные Р-значения затем представляли как основной результат, вместе с Р-значениями в каждой этнической популяции. Серии стадий контроля качества дали в результате 565759 полиморфизмов тестов на проверку ассоциативности. Применяли методы для оценки вариантов числа копий (ΟΝν) и проверяли взаимосвязь между СNV и 8УК. Для контроля возможных кажущихся зависимостей, обусловленных стратификацией популяции, применяли модифицированный метод Е1ОЕ№ТКАТ (Рпсе, А.Ь. е! а1. Ν;·ιΙ Оепе! 38, 904-9 (2006)) для введения поправки на осях популяционного происхождения в пределах каждой этнической популяции. Статическую значимость оценивали с помощью поправки по методу Бонферрони (Р си!ой=2,9х10^-8).

Указанные анализы показали, что полиморфизм на хромосоме 19, гз12979860, строго ассоциирован с 8УК во всех исследуемых группах пациентов, причем группа пациентов европейского происхождения показала очень высокую значимость (Р=1,17х10^-25) по всему геному. При объединении р-значений популяционных групп вариант выявляет ассоциацию 1,21 х 10^-28 (фиг. 1 и табл. 4).

Таблица 4

Результаты О\УА8 для клиренса НСУ, вызванного лечением, в отдельных популяциях и в объединенной популяции гепатита С

	ЗУЕ
ы	Р-значения
Европейцы	874	1,17х10'25
Афро-американцы	191	2,07х103
Испаноговорящее население	78	2,52х10‘3
Объединенная популяция	1143	1,21х10’28*

*Эффекты были согласованы по направлению и Р-значения объединяли с помощью метода Стауффера для взвешенных Ζ-величин².

В группе пациентов европейского происхождения геном СС ассоциирован с 2-кратным увеличением показателя 8УК по сравнению с геномом ТТ (фиг. 2), причем сходные отношения наблюдаются в группах пациентов афро-американского (3-кратное увеличение) и испанского (2-кратное увеличение) происхождения. Что особенно важно, в то время как показатель 8УК отличался в 2,4 раза у субъектов европейского и афро-американского происхождения, распределенным по группам только на основе собственной оценки этничности (56,1/23,6%), указанная вариабельность падала до 1,5-кратного различия между группами европейцев и афро-американцев, которые имели генотип С/С (81,7/53,3%). Авторы изобретения считают, что значительное число афро-американских пациентов с низкими показателями 8УК объясняется различием в частоте аллеля С в группах пациентов афро-американского и европейского происхождения: 0,395 по сравнению с 0,635 соответственно (фиг. 2, табл. 5 ниже).

Примечательно, что, как было убедительно подтверждено документальными доказательствами, во- 29 020795 сточные азиаты имеют более высокие показатели 8УК, чем европейцы (Ьш, С.Н., е! а1. СПп ПтГсс! Ό ίδ 47, 1260-9 (2008); Уап, К.К. е! а1., \Уог1б ί. Саδ!^оеη!е^о1 14, 3416-20 (2008)). При рассмотрении рандомизированной полиэтнической популяционной группы с неизвестным статусом гепатита С авторы изобретения наблюдали значительно более высокую частоту аллеля С у восточных азиатов (фиг. 3). В совокупности, как показано на фиг. 3, горизонтальные показатели 8УК различных этнических групп проявляли убедительное соответствие между частотой аллеля С и показателями оценки 8УК реакции на лекарственное средство в каждой группе.

Наконец, также заслуживает внимания, что афро-американцы с генотипом СС имеют значительно более высокий уровень ответа (53,3%), чем субъекты европейского происхождения, которые имеют генотип ТТ (33,3%, р<0,05), что подчеркивает важность индивидуального генотипа по сравнению с этничностью в прогнозировании ответа на терапию (ЛУНхоп ΕΡ. е! а1. Рори1айоп депейс 51гис1иге оГ уапаЪ1е бтид ^еδроηδе. №И Сепе! 29, 265-9 (2001)).

Пример 3. Идентификация кандидатных казуальных вариантов, ответственных за вариабельность

8УК.

Чтобы идентифицировать каузальный вариант, или варианты, ответственные за указанные ассоциации, авторы изобретения вначале анализировали взаимосвязь между τδ12979860 8ΝΈ и экспрессией гена в мононуклеарных клетках периферической крови 80 субъектов (неинфицированная контрольная популяция), используя базу данных 8ИРЕхртехх, которая содержит информацию по связи геномных полиморфизмов с геномным характером экспрессии в двух первичных популяциях клеток (Нет/еп Е.Ь. е! а1. Иххие-хресШс депейс соп!го1 оГ хрйсшд: шрйсайопх Гог 1йе х!ибу оГ сотр1ех ΐΓηίΙδ. РЬо8 Вю1. 6, е1 (2008)). Авторы изобретения не обнаружили корреляции в случае уровней экспрессии ΙΕ28Β с наилучшим представителем для гх12979860, доступным в базе данных (гх12980275, г²=0,88 с гх12979860), хотя уровни экспрессии ΙΕ28Β при отсутствии инфекции были ниже. Необходимы дополнительные исследования, чтобы оценить эффект гх12979860 на экспрессию Ш28В при наличии НСУ-инфекции и более конкретно в НСУ-инфицированных гепатоцитах.

Шесть других 8NР в той же области генома, что и гх12979860, имели сигналы достоверной на уровне генома ассоциации при анализе на микрочипе Шитта Нитап610-циаб ВеабСЫр (гх12980275, τδ8099917, τδ12972991, τδ8109886, τδ4803223, τδ12980602, табл. 1). Указанные 8ΝΓ являются возможными кандидатами, которые ответственны за указанную ассоциацию, но сигналы ассоциации указанных 8ΝΓ могут быть объяснены в значительной мере сигналом τδ12979860, исходя из неравновесного сцепления между каждым из этих 8ΝΓ и τδ12979860, как показано в табл. 4А ниже.

Таблица 4А

8ΝΓ в области Ш28В, показывающие ассоциацию с 8УК во всем геноме

3ΝΡ	Р	Европейцы	Афро- американцы	Испаноговорящее население
г2	Пг	г2	ϋ'	г2	ϋ'
Г31297Э860	1,21x10 28	-	-	-	-	-	-
Г312980275	2,82x1ο'27	0,88	0,98	0,56	0,90	0,88	1,00
Г38099917	4,37х1О’20	0,52	0,99	0,07	1,00	0,78	1,00
Г312972991	1,88х10'21	0,63	0,96	0,08	1,00	0,78	1,00
Г38109888	1,32х10'18	0,61	1,00	0,38	0,97	0,77	1,00
гз4803223	7,87х10‘18	0,26	0,80	0,04	0,82	0, 68	0,90
Г312980602	5,94x10®	0,15	0,50	0,01	0,22	0,52	0,72

Проведены измерения неравновесного сцепления (г² и Ό') между каждым 8ΝΓ и τδ12979960.

Вследствие близости расположения τδ12979860 к гену Ш-28В все экзоны гена Ш28В были секвенированы в 96 образцах. Два строго ассоциированных предположительно функциональных 8ΝΓ находились в гене Ш28В: полиморфизм замены аминокислоты в положении 70 (^уδ70А^д, или с.213А>С, или τδ8103142) и один полиморфизм в промоторной области (-37С>С, или τδ28416813). Оба 8ΝΓ являются кандидатами, которые ответственны за указанную ассоциацию и также включены в табл. 1.

Пример 4. Определение частот аллелей и генотипов в группах пациентов НСУ для 8ΝΓ, ассоциированных с 8УК.

Чтобы оценить распространенность аллеля С и генотипа С/С у хронически инфицированных НСУ пациентов и в общей популяции, частоты трех возможных генотипов для τδ12979860 Р8 определяли для всех субъектов, участвовавших в анализе ассоциации в примере 1, а также в рандомизированной популяции субъектов, идентифицирующих себя как европейцы, с неизвестным статусом гепатита С, т.е. европейская контрольная популяция. Указанные результаты представлены в табл. 5 ниже.

- 30 020795

Таблица 5

Частоты аллелей и генотипов для гк12979860 БИР

Популяция	Число субъектов	Аллель С	Генотип С/С	Генотип С/Т	Генотип Т/Т
Контроль, европейцы	263	0,732	0,513	0,437	0,049
Пациенты с НСУ европейского происхождения	876	0,635	0,387	0,497	0,116
Пациенты с НСУ афро-американцы	191	0,395	0,157	0,476	0,366
Испаноговорящие пациенты с НСУ	78	0,583	0,346	0,474	0,179

Если полиморфизм имеет влияние на естественную элиминацию вируса, то можно ожидать разницы частот при таком сравнении, поскольку все субъекты со спонтанным разрешением вирусной инфекции будут исключены из группы хронической инфекции. Данные в табл. 2 соответствуют указанной оценке, поскольку наблюдали статистически значимое отличие частоты аллелей С у субъектов европейского происхождения в группе НСУ (0,635) и в этнически соответствующей контрольной популяции с неизвестным статусом НСУ (0,732) (Р=2,48х10^-6). Данные показывают, что субъекты с аллелем С избирательно исключаются из группы НСУ. Указанное сравнение показывает, что аллель С гк12979860, ассоциированный с лучшим ответом на лечение, также ассоциирован с большей вероятностью спонтанной элиминации гепатита С, хотя значение такого эффекта сложно оценить из-за отсутствия более прямого сравнения группы субъектов с известной естественной элиминацией вируса и аналогично подобранных хронически инфицированных пациентов.

Частоты двух БNР в гене ΙΕ28Β выглядят следующим образом:

ГК28416813

-37О>С: минус-цепь содержит референсный аллель О, который ассоциирован с БУК,

-37С частота аллеля=0,345, у п=55 белых,

-37С частота аллеля=0,500, у п=11 черных, аллель О ассоциирован с БУК.

ГК8103142

с.213А>О: минус-цепь содержит референсный аллель А, который ассоциирован с БУК, Ьук70Агд (референсный аллель С.213А кодирует Ьук70),

Аг§70 частота аллеля=0,361, у п=54 белых,

Аг§70 частота аллеля=0,545, у п=11 черных, аллель А (Ьук70) ассоциирован с БУК.

Пример 5. Неравновесное сцепление различных БМР, ассоциированных с БУК.

Оценка ЬО у белых

- 31 020795

Оценка ЬЭ у черных (предварительная из-за небольшого объема выборки, п=11)

Г328416813 (-37С>С) с Г38103142 (213А>С): г²=0,83; И'=1,00 Г&28416813 (-370>С) С:

Г312979860: г²=0,69,- И’=1,00 Г312980275: Г²=О,83; И’=1,00 Г38099917: г²=0,22; И’=1,00 Г312972991: г²=0,16; И'=1,00 Г38109886 ; г²=0,38,· Ц'=1,00 ГВ4803223: г²=0,10; Ц'=1,00 Г312980602: г²=0,18; Ό'=0,61

ГВ8103142 (213А>0) С:

Г312979860: г²=0,83; Ό'=1,00 Г312980275: г²=0,69; П'=1,00 Г3809Э917: г²=0,19; О'=1,00 Г312972991: г²=0,13; П'=1,00 Г381О9886: г²=0,45; И'=1,00 Г34803223: г²=0,12; Ц'=1,00 Г312980602: г²=0,23; Ц'=0,64

Пример 6. Сравнение генетических и клинических предикторов δνΚ.

Для количественного сравнения значения величины различных предикторов ответа в отношении пациентов, оцениваемых здесь, авторы изобретения разработали простую логистическую регрессионную модель, которая связывает несколько известных клинических предикторов, а также генотип г§12979860, с показателями ответа.

р-_ί_

14· е‘1⁽¹*^4х<э+( ι.¹*Θ*ί 1.1хР)-з.8) где Ρ - вероятность достижения δνΚ;

О - генотип Г512979860: ТТ=0, СТ=1, СС=2;

V - исходный уровень вирусной нагрузки: больше или равен 600000 МЕ/мл=0, меньше 600000 МЕ/мл=1;

Е - этническая принадлежность: африканское происхождение=0, европейское происхождение=1;

Р - исходный уровень фиброза: ΜΕΤΑνίΚ Р3-4=0, Р0-2=1.

Указанная модель регрессии показывает, что генотип СС ассоциирован с более существенным отличием показателя ответа, чем другие известные предикторы на основе исходного состояния, включенные в модель.

Пример 7. Полиморфизм г§12979860 ассоциирован со спонтанной элиминацией вируса.

Авторы изобретения проверяли, влияет ли полиморфизм г§12979860 на естественную элиминацию гепатита С путем сравнения частоты аллелей у хронически инфицированных пациентов данного исследования (табл. 3 выше) с рандомизированной полиэтнической популяционной группой практически здоровых субъектов с неизвестным статусом гепатита С. Все субъекты подписали информированное согласие на участие в генетических исследованиях. Они были генотипированы с применением платформы Шитта Нитап 610-Циаб ВеабСЫр, и данные генотипирования подвергали процедурам контроля качества, как описано для группы НСУ. В табл. 6 ниже представлены основные характеристики данной популяционной группы.

Таблица 6

Общие характеристики рандомизированной полиэтнической популяционной группы

	Популяции
Европейцы	Афро- | американцы	Испаноговор ящее население	Восточные азиаты
N	271	1 61	16	107
Пол (М/Ж)	141/130	I 41/20	7/9	59/48
Возраст (годы)	23,5 (7,4)	28,5 (12,2)	23,3 (6,8)	21,1 (2,6)

Данные представлены в виде среднего значения (δϋ), если не указано иначе. Этническая принадлежность была определена пациентом.

Если полиморфизм Г512979860 влияет на естественную элиминацию вируса, можно ожидать разницы частот при таком сравнении, поскольку все субъекты со спонтанным разрешением вирусной инфекции будут исключены из группы хронической инфекции, уменьшая, таким образом, частоту аллеля, который увеличивает вероятность естественной элиминации. Авторы изобретения обнаружили, что частота аллеля С была значительно снижена в группе хронически инфицированных, с частотой 0,63 у субъектов европейского происхождения в группе ΗΟν по сравнению с частотой 0,732 в этнически соответствую- 32 020795 щих контролях с коррекцией скрытой статификации (Р=2,48х10^-6), что указывает, что субъекты с аллелем С избирательно исключаются из группы ΗΟν. Указанное сравнение показывает, что аллель С гк12979860, ассоциированный с лучшим ответом на лечение, также ассоциирован с большей вероятностью спонтанной элиминации гепатита С. Значение такого эффекта сложно оценить из-за отсутствия более прямого сравнения группы субъектов с известной естественной элиминацией вируса и аналогично подобранных хронически инфицированных пациентов.

Пример 8. Изоформа ΙΡΝ-λ3 Агд70 является нестабильной при экспрессии в бактериях.

Чтобы оценить, воздействует ли аллель О гк8103142 §№ на экспрессию или функцию изоформы ΙΡΝ-λ3 Агд70, Ηίκ-меченная ΙΡΝ-λ3 Ьук70 и Ηίκ-меченная ΙΡΝ-λ3 Агд70 изоформы, экспрессированные в бактериальных клетках, очищали и антивирусную активность каждой очищенной изоформы оценивали с применением тестовой системы ΕМСV νίπικ скаПепде. Как ни удивительно, во время очистки наблюдали обширную деградацию изоформы Агд, но не изоформы Ьук, но сравнимую антивирусную активность наблюдали, когда использовали эквивалентные количества полноразмерных очищенных изоформ. Значительно более низкое значение Ηίκ-меченной ΙΡΝ-λ3 Агд70 изоформы был выделен от см. пример 9.

Пример 9. Пониженная секреция изоформы ΙΡΝ-λ3 Агд70 по сравнению с изоформой ΙΡΝ-λ3 Ьук70 человеческими клетками 293Т.

Чтобы оценить, является ли изоформа ΙΡΝ-λ3 Агд70 также нестабильной, когда она экспрессируется в клетках человека, проводили следующий эксперимент.

Конструкции для экспрессии в клетках млекопитающих: генетические последовательности изоформы ΙΡΝ-λ3 Ьук70 и изоформы ΙΡΝ-λ3 Агд70, в которые кодирующие последовательности ДНК для эпитопа антитела к тус были включены на 3'-конце кодирующих последовательностей гена ΙΡΝ-λ3, были синтезированы ίη νίΐτο (Оеп§гтр1, РйсаЦцуау, Νί). Получаемые в результате области, кодирующие меченый ген IΡN-λ3-тус, включали в вектор экспрессии млекопитающих рСДНК3.1(+) Дпукгодеп, Сат1кЬак, СА), с помощью стандартного расщепления ферментом рестрикции и лигирования, так что экспрессия гена ΙΡΝ-λ3 регулировалась ранним энхансером/промотором цитомегаловируса (СМУ). Полученные конструкции были названы рсДНК3.1(+)IΡN-λ3 Ьук70 и рсДНК3.1(+)IΡN-λ3 Агд70.

Обнаружение экспрессированных белков ΙΡΝ-λ3: клетки 293Т (СКЬ-11268) приобретали в АТСС (Мапаккак, УА) и сохраняли в среде ΌΜΕΜ, дополненной 10% ΡΒδ и 300 мкг/мл О418. Для обнаружения экспрессии ΙΡΝ-λ3 клетки 293Т в количестве 3х10⁶ помещали на 100-мм культуральные чашки (Соттд, Сстшд, ΝΥ) и через 24 ч трансфицировали 10 мкг плазмиды рсДНК3.1(+)IΡN-λ3 Ьук70 или рсДНК3.1(+)IΡN-λ3 Агд70 кальций-фосфатным методом, применением системы Ρ^οΡесΐ^οη® Маттакап Тгапк1сс1юп (Рготеда Согр., Ма^^п, νΙ). Через 48 ч после трансфекции собирали клеточные супернатанты и равные объемы загружали на одинаковые 10% бис-трис-гели NиΡАОΕ Дткгодеп, Сат1кЬак, СА). Один из гелей NиΡАОΕ окрашивали кумасси голубым Дпукгодеп, Сат1кЬак, СА) для подтверждения одинаковой нагрузки по белку и белки из другого геля NиΡАОΕ переносили на мембрану РУЭЕ ДпуПгодеп, Сат1кЬак, СА). Затем мембраны РУЭк анализировали с помощью вестерн-блоттинга с анти-с-Мус (АЬ-1) мышиным моноклональным антителом 9Е10 (Са1Ьюскет, Ьа ίο11η, СА) для обнаружения тус-меченных изоформ ΙΡΝ-λ3 Ьук70 и ΙΡΝ-λ3 Агд70.

Как показано на фиг. 5, секреция тус-меченной изоформы ΙΡΝ-λ3 Агд70 была значительно ниже, чем секреция тус-меченной изоформы ΙΡΝ-λ3 Ьук70. Указанное различие подсчитывали путем измерения интенсивности полосок геля для каждой изоформы. Общая интенсивность для изоформы Ьук70 составляла 9441, тогда как для изофрмы Агд70 она составляла только 2541, снижение в 3,72 раза. Указанный результат соответствует гипотезе, что аллель О δ№ гк8103142 является причинно-вовлеченным в уменьшение ответа пациентов с ΗСV на комбинированную терапию пег-IΡN-α-2Ь/рибавирином.

Настоящее изобретение не ограничивается в объеме конкретными вариантами осуществления, описанными здесь. В действительности, различные модификации изобретения в дополнение к тем, которые описаны здесь, будут очевидны специалистам в данной области из вышеуказанного описания. Предполагается, что указанные модификации находятся в рамках прилагаемой формулы изобретения.

В настоящей заявке цитируются патенты, патентные заявки, публикации описания продуктов и протоколы, раскрытия которых включены в нее посредством ссылки во всей полноте и для любых целей.

- 33 020795

Список последовательностей <110> ВегСе1зеп, АгСЬиг Ре Нау, Дасдиез Ое, ОопдИапд Οοΐάδίβϊη, Ε^νΐά в.

МсНиЬсЫзоп, ЛЫК! С Мигдо1о, И1сНо1аз Д.

Охи, Р1пд

Ка1зЛоп II, ВоЬегб ΟΓνΐΙΙβ ЗЫаппа, Κ©νΐη 5ΐτηοη, ^зоп 5.

ТЬотрзоп, А1ехапдег .1. игЬап, ТЬотав <120> ГЕНЕТИЧЕСКИЕ МАРКЕРЫ, АССОЦИИРОВАННЫЕ С ОТВЕТОМ НА ИНТЕРФЕРОН-АЛЬФА <130> СЕ2009.6992 <140> РСТ/и310/35782 <141> 2010-05-21 <160> 10 <170> Патент в версии 3.5 <210> 1 <211> 52 <212> ДНК <213> Нотпо зархепз <220>

<221> дополнительные особенности <222> (27) .,(27} <223> У указывает С или Т <400> 1 сбдаассадд дадс^ссссд ааддсдудаа ссадддеСда аСЪдсасбсс дс 52 <210> 2 <211> 52 <212> ДНК <213> Нолю зархепз <220>

<221> дополнительные особенности <222> (27)..(27) <223> 5 указывает <3 или С <400> 2 садададааа дддадсЬдад ддаабдзада ддсбдсссас рдадддсадд дд <210>

<211>

<212>

<213>

ДНК

Ногоо зархепз

- 34 020795 <220>

<221> дополнительные особенности <222> (27) . . (27) <223> Υ указывает С или т <400> 3

ьесЪддддаа даддсдддад	сддсасуЬдс адСссС.Рсад	садаадсдас	Рс	52
<210>	4
<211>	52
<212>	ДНК
<213>	Лото зархепе
<220>
<221>	дополнительные	особенности
<222>	(27) .. (27)
<223>	И указывает С или Т
<400>	4
сбдададаад СсаааОбссб	адааасгдас дддбсбаааб	аЬррдссддд	дь	52
<210>	5
<211>	52
<212>	ДНК
<213>	Нолю зархепз
<220>
<221>	дополнительные	особенности
<222>	(27) , .(27)
<223>	К = О или Т
<400>	5
сьъдддъесь сс^ъъсодьд	адсааСкИса сссаааСЬдд	аассабдсод	Ра	52
<210>	6
<211>	52
<212>	ДНК
<213>	Ноте зартепБ
<220>
<221>	дополнительные	особенности
<222>	(27)..(27)
<223>	М = А или С
<400>	б
адаасаааЬд с£дЪаСда££	сссссЪтсаЬ даддЬдсИда	дадаадЪсаа	аР	52
<210>	7
<211>	52
<212>	ДНК
<213>	Ното зар1епз

<220>

- 35 020795 <221> дополнительные особенности <222? (27) . .(27) <223? М = А или С <400? 7

Сакьсаъгоь Сссаасаадс аСссЬдтпосс аддЬсдсСсЪ д^сСдъсЬса аг <210> 8 <211? 52 <212? ДНК <213? Нотпо зархепз <220?

<221? дополнительные особенности <222? (27)..(27) <223? К указывает с или т <400? 8 ссСаааНаРд аСЬГссГааа ГсаСасгдас аГаЪГСссГГ дддадсСаГа са <210? 9 <211? 52 <212? ДНК <213? Нотпо зархепэ <220?

<221> дополнительные особенности <222? (27)..(27) <223? Υ указывает С или Т <400? 9

ОсаРаЪааса аСаЪдааадс сададауадс ЬсдЬсСдада сасадаГдаа са

<210?	10
<211?	196
<212?	Белок
<213?	Нотпо 4
<400?	10
МеЬ ТЬг <31у 2

ТЬг Уа1 ТЬг О1у А1а Уа1 Рго Уа1 А1а Агд Ьей Агд С1у А1а Ьей Рго 20 25 30

Азр А1а Агд С1у Суз Нгз Не А1а С1п РЬе Ьуз Зег Ьей Зег Рго <31п 35 40 45

Οΐυ Ьей С1п А1а РЬе Ьуз Агд А1а Ьуз Азр А1а Ьей С1и С1и Зег Ьей 50 55 60

Ьеи Ьеи 65	Ьуз Азр Суз	Ьуз 70	Суз Агд	Зег	Агд Ьеи РЕе 75	Рго	Агд	ТЕг	Тгр 80
Азр Ьеи	Агд С1п Ьеи	С1п	Уа1 Агд	С1и	Агд Рго Уа1	А1а	Ьеи	С1и	А1а
	85				90			95
<31и Ьеи	А1а Ьеи ТЬг	Ьеи	Ьуз Уа1	Ьеи	<31и А1а ТЬг	А1а	Азр	ТЬг	Азр
	100			105			110
Рго А1а	Ьеи О1у Азр	Уа1	Ьеи Азр	С1п	Рго Ьеи Ηΐβ	ТЬг	Ьеи	ΗΪ3	ΗΪΞ
	115		120			125
Не Ьеи	Зег С1п Ьеи	Агд	А1а Суз	Не	О1п Рго С1п	Рго	ТЕг	А1а	С1у
130			135		140
Рго Агд	ТЬг Агд С1у	Агд	Ьеи Ήΐ3	Н1з	Тгр Ьеи ΗΪ3	Агд	Ьеи	С1п	С1и
145		150			155				160
А1а Рго	Ьуз Ьуз С1и	Зег	Рго О1у	Суз	Ьеи С1и А1а	Зег	Уа1	ТЬг	РЬе
	165				170			175
Азп Ьеи	РЬе Агд Ьеи	Ьеи	ТЕг Агд	Азр	Ьеи Азп Суз	Уа1	А1а	Зег	С1у
	180			185			190
Азр Ьеи	Суе Уа1
	195
	ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Способ тестирования индивида-человека с хронической инфекцией, вызванной вирусом гепатита

Claims (15)

1. Способ тестирования индивида-человека с хронической инфекцией, вызванной вирусом гепатита С генотипа 1 (НСУ), на наличие или отсутствие по меньшей мере одного маркера ответа на ΙΡΝ-α, где способ включает получение образца нуклеиновой кислоты от указанного индивида и проведение анализа образца нуклеиновой кислоты для определения генотипа индивида в полиморфном сайте (РЗ), согласно таблице, представленной ниже

РЗ ЗЫР Аллель лучшего ответа Гетерозиготный маркер ответа на ΙΡΝ-α Гомозиготный маркер ответа на ΙΡΝ-α Г312979860 т/с С генотип С/Т генотип С/С Г328416813 с/с С генотип С/С генотип С/С Г38Ю3142 А/С А генотип А/С генотип А/А Г312980275 А/С А генотип А/С генотип А/А ГЗ&099917 А/С А генотип А/С генотип А/А Г312972991 Т/С Т генотип Т/С генотип Т/Т ГЗЙ109886 А/С С генотип С/А генотип С/С гз4803223 Т/С т генотип Т/С генотип Т/Т Г312980602 А/С А генотип А/С генотип А/А

где если индивид является гетерозиготным или гомозиготным по аллелю лучшего ответа указанного в таблице РЗ, то маркер ответа на ΙΡΝ-α присутствует, и если индивид является гомозиготным по другому аллелю указанного РЗ, то маркер ответа на ΙΡΝ-α отсутствует.

2. Способ по п.1, где маркер ответа ΙΡΝ-α является гомозиготным по А в г§8103142, гомозиготным по С в Г528416813 или гомозиготным по С в Г512979860.

3. Набор для тестирования индивида-человека, страдающего хронической инфекцией, вызванной НСУ генотипа 1, на наличие или отсутствие маркера ответа на ΙΡΝ-α, который содержит набор олигонуклеотидов, разработанных для генотипирования по меньшей мере одного полиморфного сайта (РЗ), выбранного из группы полиморфных сайтов в табл. 1.

4. Набор по п.3, где полиморфный сайт представляет собой г§12979860, г§8103142 или г§28416813.

5. Способ выбора терапии для лечения индивида-человека, страдающего хронической инфекцией, вызванной НСУ генотипа 1, включающий определение генотипа индивида в полиморфном сайте (РЗ), выбранном из полиморфных сайтов табл. 1, и выбор терапии на основе результатов стадии определения, где если индивид является гетерозиготным или гомозиготным по аллелю лучшего ответа в выбранном РЗ, то выбранная терапия включает начальное лечение или продолженное лечение ΙΡΝ-α, и где если индивид является гомозиготным по другому аллелю в выбранном РЗ, то выбранная тера- 37 020795 пия включает введение индивиду ΙΡΝ-α в комбинации по меньшей мере с одним терапевтическим агентом, который не является ΙΡΝ-α, или выбранная терапия исключает терапию на основе ΙΡΝ-α.

6. Способ по п.5, где ΙΡΝ-α представляет собой пегилированный белок ΙΡΝ-α-За или слитый белок альбумин-IΡN-α-2а.

7. Способ по п.6, где ΙΡΝ-α представляет собой пегилированный IΡN-α-2Ь или слитый белок альбумин-IΡN-α-2Ь.

8. Способ лечения индивида-человека с хронической инфекцией НСУ генотипа 1, который включает определение генотипа индивида по меньшей мере в одном полиморфном сайте (Р8) табл. 1 и назначение схемы лечения на основе полученного генотипа, где если генотип является гомозиготным по аллелю лучшего ответа, то схема лечения включает введение индивиду ΙΡΝ-α в комбинации с рибавирином, и где если генотип индивида является гетерозиготным или гомозиготным по другому аллелю, то схема лечения включает введение индивиду ΙΡΝ-α в комбинации с рибавирином и по меньшей мере одним противовирусным агентом, который не является ΙΡΝ-α, или схема лечения исключает терапию на основе ΙΡΝ-α.

9. Способ по п.10, где ΙΡΝ-α представляет собой пегилированный белок IΡN-α-2а или слитый белок альбумин-IΡN-α-2а.

10. Способ по п.9, где ΙΡΝ-α представляет собой пегилированный IΡN-α-2Ь или слитый белок альбумин-ΙΡΝ - α-2Ρ

11. Способ по любому из пп.8-10, где по меньшей мере один противовирусный агент представляет собой боцепревир или телапревир.

12. Способ по любому из пп.8-11, где полиморфный сайт представляет собой гз8103142 и где если генотип индивида является гетерозиготным или гомозиготным по аллелю С, то схема лечения включает введение индивиду ΙΡΝ-α в комбинации с рибавирином и по меньшей мере одним терапевтическим агентом, который не является ΙΡΝ-α.

13. Способ по любому из пп.8-12, где индивид не получал ранее лечение ΙΡΝ-α.

14. Способ скрининга для отбора индивидов для начального лечения или продолженного лечения ΙΡΝ-α из группы индивидов-людей с диагностированной хронической инфекцией, вызванной НСУ генотипа 1, включающий тестирование каждого члена группы заболевания на наличие по меньшей мере одного маркера ответа на ΙΡΝ-α и отбор для лечения по меньшей мере одного индивида, тестированного положительно на маркер ответа на ΙΡΝ-α, где положительный результат теста на маркер ответа на ΙΡΝ-α соответствует гетерозиготному генотипу или гомозиготному генотипу по аллелю лучшего ответа по меньшей мере для одного полиморфного сайта (Р8), выбранного из полиморфных сайтов табл. 1.

15. Способ по п.14, где ΙΡΝ-α представляет собой пегилированный IΡN-α-2а или пегилированный ΙΡΝ-α-2Β.