JP2015231387A - ヒトインターフェロンアルファサブタイプを検出するための組成物および使用方法 - Google Patents

Abstract

【課題】インターフェロンサブタイプ間の同定および識別のためのプライマー、プローブ、アッセイキットおよび方法を提供すること。【解決手段】本発明は、少なくとも１つのＩＦＮサブタイプおよび／またはＩＦＮサブタイプアロタイプ変異体を検出するための、高感度、高特異的および高効率の定量的リアルタイムＰＣＲ組成物、方法およびアッセイキットを提供する。目的のＩＦＮサブタイプのコーディング配列に対して相補的なプライマー／プローブセットは、分解されたｍＲＮＡの偽性検出を回避し、本発明のアッセイによって計測されたＩＦＮサブタイプと実際に発現されたタンパク質との間の相互関連を増強する。また、本発明は、プライマーの設計方法ならびに該組成物を使用する方法およびアッセイキットを提供する。本発明の組成物、キットおよび方法は、例えば、ワクチンの有効性、自己免疫疾患、慢性感染症または腫瘍治療をモニターするために使用され得る。【選択図】なし

Description

配列表
本願は、ＥＦＳ−Ｗｅｂにより提出された配列表を含み、この配列表はその全体が本明細書中に参考として援用される。このＡＳＣＩＩコピーは、２００９年１１月２０日に作成され、ＰＢＬＩ０２２Ｗ．ｔｘｔという名称であり、サイズは５２，２６３バイトである。

政府支援の研究および開発の下で成された発明への権利の陳述
本開示の開発の間成された発明は、国立衛生研究所および食品医薬品局からの相互の支援を受けた。合衆国政府は、本発明に一定の権利を有する。

背景
本発明は、インターフェロン（ＩＦＮ）サブタイプ間の同定および識別のためのプライマー、プローブ、アッセイキットおよび方法に関する。

インターフェロンは、配列類似性および受容体使用に基づくタイプＩ、タイプＩＩおよびタイプＩＩＩファミリーを含む分泌細胞タンパク質である。ＩＦＮ−γは免疫インターフェロンとしても知られ、唯一のタイプＩＩインターフェロンであるのに対し、タイプＩヒトインターフェロンはいくつかのクラス、すなわちＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−ε、ＩＦＮ−ω、ＩＦＮ−κおよびＩＦＮ−τからなる。ＩＦＮ−τは、有蹄動物においてのみ見出され、ヒトＩＦＮ−τは存在しない。ただ１つのヒトＩＦＮ−βおよび１つのヒトＩＦＮ−ωが存在するが、複数のＩＦＮ−α種のファミリー、すなわち、１３個の高相同性遺伝子（このうち２個は同一のコーディング配列を有する）が存在する。ＩＦＮは、様々な自然性および病原性刺激に反応して増加する。ウイルス等の病原体は、トル様受容体（ＴＬＲ）およびレチノイン酸誘導遺伝子Ｉ様（ＲＩＧ−１）受容体を包含する生得的な免疫システムの構成成分によって認識される。適切なサイトカイン反応と連携する病原体刺激の迅速な認識は、多くの病原性生物の制御に重要である。説明のため、特異的な感染因子に反応する単一のインターフェロンよりも、宿主インターフェロン反応は、ａ）感染細胞における病原体の複製を制限するため、およびｂ）播種を制限するために適応性のある免疫系と連携するために設計された多くの異なるインターフェロン遺伝子およびタンパク質の連携された発現を含む。この「インターフェロン発現サイン」は経時的に変化し、数千の遺伝子の発現を調整し、反応する。

重要なことに、各個々のインターフェロンタンパク質は特異な生物学的活性を有することが文献において明確に確立されてきた。さらに、制限された定性研究は、インターフェロンアルファサブタイプの発現パターンは刺激および時間によって変化することが示されてきた。結果的に、アッセイは、各個々のインターフェロンを検出し識別することができると是認される。

ＩＦＮは、抗ウイルス、免疫調節および抗増殖活性を呈し、インターフェロンの臨床的可能性が認識されてきた。しかしながら、ＩＦＮ−アルファサブタイプの個別の発現を計測するための敏感且つ特異的なシステムが存在しないことから、どの個別のＩＦＮ−アルファサブタイプに対しても特異な役割についてほとんど知られていない。

従って、インターフェロン世界における現在の学術研究のジレンマの一つは、様々な疾患における様々なＩＦＮタイプおよびサブタイプの役割である。現在、これらの問題を扱う手段は利用可能ではないが、いくつかの製薬会社が、全身紅斑性エリテマトーデス、多発性硬化症、様々な癌、Ｃ型肝炎、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）およびその他を包含する様々なヒト疾患に対する可能性のある治療として個別のＩＦＮサブタイプの調節を研究している。個別および組み合わされたインターフェロンおよび／または他のサイトカインの発現プロファイルの両方を扱う手段の利用可能性は、現在の研究に大いに役立つのみならず、好適な手段を欠くためにインターフェロンが関連づけられてすらいない疾患研究の他の領域をも可能とするであろう。

本明細書に記載される発明は、高度に関連づけられた核酸分子間を識別するための核酸増幅技術を提供する。本実施態様において、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）および新規プローブ／プライマー対は、ＩＦＮサブタイプ間を識別するために使用される。本明細書に記載される発明は、様々な密接に関連づけられたインターフェロンおよびサブタイプの根本的な役割を解明するために有用であり、プロセスにおいて、特にヒト間の微妙な遺伝的相違の状況での免疫学的プロセスについて知られていることを大いに前進させるであろう。本発明は、他の生物学的分子に関して、体内で生じる、異なった、関連性の高いサブタイプに有用となることが期待される。本発明は、例えば、臨床治験においてワクチンの有効性の代理マーカーとしてＩＦＮのサブタイプを同定すること、慢性感染症、自己免疫疾患もしくは癌の臨床的な進行または緩和をモニターすること、またはそれらおよび他の疾患に対する治療への反応を測定することのために有用な可能性がある。さらに、本発明は、とりわけ、分子診断方法および個々の患者および存在する特定の医学的症状に対する治療的処置計画を当業者が個々に設計および仕立てることを可能にするために有用な可能性がある。個別化された医薬を輸送する能力は、ケアの標準的計画に不応の個人の処置において特に重要な可能性がある。従って、ＩＦＮサブタイプの存在を測定する迅速で包括的な試験が必要とされている。

各ＩＦＮサブタイプおよびＩＦＮのアロタイプ変異体を検出するための高感度かつ特異的な定量的リアルタイムＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）アッセイが提供される。前記アッセイは、プローブベースＲＴ−ＰＣＲの２つの修飾を開発し、それはすなわち、分子標識（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｅａｃｏｎｓ）（ＭＢ）およびロックド核酸（ＬＮＡ）である。本発明は、有利に、全てのＩＦＮサブタイプ、またはそのグループ内のサブセットの増幅および検出を、同時に同様の感度、かつ同一反応条件下で可能とする。いくつかの実施態様において、ｍＲＮＡ転写物の３’非翻訳領域は下流コーディング配列の分解を開始するマイクロＲＮＡ分子に対する標的サイトを有する可能性があることから、プライマー／プローブセットの標的配列は、成熟コード配列に相補的である。コーディング配列に相補的なプライマー／プローブセットは、分解されたｍＲＮＡの偽性検出を回避し、このアッセイによって計測されるＩＦＮサブタイプｍＲＮＡと実際に発現されるタンパク質との相互関連を増強する。プライマー／プローブセット、それらを使用する関連する方法（およびそのような方法を行うための診断キット）を、感染、自己免疫および癌を包含する多数の疾患からの保護、または発病と関連し得るＩＦＮサブタイプ発現のパターンを確立するために使用されることができる。ＩＦＮサブタイプ発現のパターンの同定を、２〜３例を挙げると、ワクチン有効性、様々な自己免疫疾患の処置および慢性感染症、または腫瘍治療の処置をモニターするために使用してもよい。

１つの側面において、本発明は、目的のＩＦＮ−アルファサブタイプをコードする少なくとも１つの配列を増幅するための組成物であって、共に、複数のＩＦＮサブタイプテンプレートを含む組成物から目的のＩＦＮ−アルファサブタイプをコードする配列の特異的な増幅を可能とするフォワードプライマーおよびリバースプライマーを含む組成物を提供する。目的のＩＦＮ−アルファサブタイプをコードする少なくとも１つの配列は、単一対立遺伝子変異型であってもよい。ＩＦＮ−アルファサブタイプは、ＩＦＮ−アルファ１ａ／ｂ、ＩＦＮ−アルファ１ｂ、ＩＦＮ−アルファ１ａ、ＩＦＮ−アルファ２ａ／ｂ、ＩＦＮ−アルファ２ａ、ＩＦＮ−アルファ２ｂ、ＩＦＮ−アルファ４ａ／ｂ、ＩＦＮ−アルファ４ａ、ＩＦＮ−アルファ４ｂ、ＩＦＮ−アルファ５、ＩＦＮ−アルファ６、ＩＦＮ−アルファ７、ＩＦＮ−アルファ８、ＩＦＮ−アルファ１０、ＩＦＮ−アルファ１４、ＩＦＮ−アルファ１６、ＩＦＮ−アルファ１７、およびＩＦＮ−アルファ２からなる群より選択されてもよい。

いくつかの実施態様において、ＩＦＮ−アルファサブタイプをコードする少なくとも１つの配列に対するフォワードプライマーおよびリバースプライマーは、以下からなる群より選択される：ＩＦＮ−アルファ１ａ／ｂに対し、配列番号３０を含むフォワードプライマーおよび配列番号４５を含むリバースプライマー；ＩＦＮ−アルファ２に対し、配列番号３１を含むフォワードプライマーおよび配列番号４６を含むリバースプライマー；ＩＦＮ−アルファ４ａ／ｂに対し、配列番号３２を含むフォワードプライマーおよび配列番号４７を含むリバースプライマー；ＩＦＮ−アルファ４ａに対し、配列番号３３を含むフォワードプライマーおよび配列番号４８を含むリバースプライマー；ＩＦＮ−アルファ４ｂに対し、配列番号３４を含むフォワードプライマーおよび配列番号４９を含むリバースプライマー；ＩＦＮ−アルファ５に対し、配列番号３５を含むフォワードプライマーおよび配列番号５０を含むリバースプライマー；ＩＦＮ−アルファ６に対し、配列番号３６を含むフォワードプライマーおよび配列番号５１を含むリバースプライマー；ＩＦＮ−アルファ７に対し、配列番号３７を含むフォワードプライマーおよび配列番号５２を含むリバースプライマー；ＩＦＮ−アルファ８に対し、配列番号３８を含むフォワードプライマーおよび配列番号５３を含むリバースプライマー；ＩＦＮ−アルファ１０に対し、配列番号３９を含むフォワードプライマーおよび配列番号５４を含むリバースプライマー；ＩＦＮ−アルファ１４に対し、配列番号４０を含むフォワードプライマーおよび配列番号５５を含むリバースプライマー；ＩＦＮ−アルファ１６に対し、配列番号４１を含むフォワードプライマーおよび配列番号５６を含むリバースプライマー；ＩＦＮ−アルファ１７に対し、配列番号４２を含むフォワードプライマーおよび配列番号５７を含むリバースプライマー；ならびにＩＦＮ−アルファ２１に対し、配列番号４３を含むフォワードプライマーおよび配列番号５８を含むリバースプライマー。

前記組成物中の各フォワードおよびリバースプライマーは、５０℃〜６０℃の間のプライマー伸長温度を有してもよい。いくつかの組成物は、各ＩＦＮ−アルファサブタイプに対するフォワードプライマーおよびリバースプライマーを含んでもよい。

前記組成物は、さらに阻害剤を含んでもよい。前記組成物は、さらにプローブを含んでもよい。阻害剤、フォワードプライマー、リバースプライマーまたはプローブの少なくとも１つは、ロックド核酸を含んでもよい。フォワードプライマー、リバースプライマーまたはプローブの少なくとも１つは分子標識を含んでもよい。ＩＦＮ−アルファサブタイプをコードする配列に対する阻害剤は、ＩＦＮ−アルファ４ａ／ｂに対して、配列番号４４および８９を含む阻害剤；ＩＦＮ−アルファ４ａに対して、配列番号８８を含む阻害剤；ならびにＩＦＮ−アルファ４ｂに対して、配列番号８８を含む阻害剤からなる群より選択されてもよい。

前記プローブは、単一ＩＦＮ−アルファサブタイプ対立遺伝子変異型をコードする配列を同定し得る。ＩＦＮ−アルファサブタイプをコードする配列に対するプローブは、以下からなる群より選択されてもよい：ＩＦＮ−アルファ１ａ／ｂに対して、配列番号５９を含むプローブ；ＩＦＮ−アルファ２に対して、配列番号６０を含むプローブ；ＩＦＮ−アルファ４ａ／ｂに対して、配列番号６１を含むプローブ；ＩＦＮ−アルファ４ａに対して、配列番号６２を含むプローブ；ＩＦＮ−アルファ４ｂに対して、配列番号６３を含むプローブ；ＩＦＮ−アルファ５に対して、配列番号６４を含むプローブ；ＩＦＮ−アルファ６に対して、配列番号６５を含むプローブ；ＩＦＮ−アルファ７に対して、配列番号６６を含むプローブ；ＩＦＮ−アルファ８に対して、配列番号６７を含むプローブ；ＩＦＮ−アルファ１０に対して、配列番号６８を含むプローブ；ＩＦＮ−アルファ１４に対して、配列番号６９を含むプローブ；ＩＦＮ−アルファ１６に対して、配列番号７０を含むプローブ；ＩＦＮ−アルファ１７に対して、配列番号７１を含むプローブ；およびＩＦＮ−アルファ２１に対して、配列番号７２を含むプローブ。

前記組成物は、ＤＳ剤をさらに含んでもよい。ＤＳ剤は、二本鎖核酸に結合する染料であってもよい。前記染料は、サイバーグリーンであってもよい。プローブは、Ｔｅｘａｓ−Ｒｅｄ（登録商標）、フルオレセインイソチオシアネート、ＦＡＭ、ＴＡＭＲＡ、Ａｌｅｘａ ｆｌｕｏｒ、シアニン染料、クエンチャーまたはビオチン等の捕捉領域または検出可能な標識をさらに含んでもよい。

前記組成物は、さらにコントロールを含んでもよい。前記組成物は、少なくとも約１．９または少なくとも約１．９５の効率を有してもよい。前記組成物は、１反応あたり、目的のＩＦＮ−アルファサブタイプをコードする配列の少なくとも約１〜１０コピーを検出するために十分な感度を有してもよい。前記組成物は、特異的および非特異的増幅の間において少なくとも約５サイクルの相違の特異性を有してもよい。前記効率、感度および特異性は、以下を含むＰＣＲ反応条件により達成される：ステージ１：５０℃で２分間；ステージ２：９５℃で３分間；およびステージ３：９５℃で１５秒間の後５９℃で１分間を、４０反復。

他の実施態様において、本発明は上記組成物を含む特異的なＩＦＮ−アルファサブタイプの少なくとも１つを検出するためのキットを提供する。前記キットは各ＩＦＮ−アルファサブタイプに対するコンテナーをさらに含んでもよく、各コンテナーは、共に、複数のＩＦＮサブタイプテンプレートを含む組成物から単一のＩＦＮ−アルファサブタイプをコードする配列の特異的な増幅を可能とするフォワードプライマーおよびリバースプライマーを含む。目的のＩＦＮ−アルファサブタイプをコードする少なくとも１つの配列は、単一対立遺伝子変異型であってもよい。前記ＩＦＮ−アルファサブタイプは、ＩＦＮ−アルファ１ｂ、ＩＦＮ−アルファ１ａ、ＩＦＮ−アルファ２ａ、ＩＦＮ−アルファ２ｂ、ＩＦＮ−アルファ４ａ、ＩＦＮ−アルファ４ｂ、ＩＦＮ−アルファ５、ＩＦＮ−アルファ６、ＩＦＮ−アルファ７、ＩＦＮ−アルファ８、ＩＦＮ−アルファ１０、ＩＦＮ−アルファ１４、ＩＦＮ−アルファ１６、ＩＦＮ−アルファ１７、およびＩＦＮ−アルファ２１からなる群から選択されてもよい。

前記キットのコンテナーは、単一ＩＦＮ−アルファサブタイプをコードする配列に特異的にハイブリダイズするプローブをさらに含んでもよい。各コンテナーは、阻害剤および／またはコントロールをさらに含んでもよい。前記コンテナーは、チューブ、マルチウェルプレートにおけるウェル、チャネルおよびチップ上のウェルであってもよい。前記キット中の各フォワードおよびリバースプライマーは、５０℃〜６０℃の間のプライマー伸長温度を有してもよい。

前記キットにおける各増幅反応は、少なくとも約１．９０の効率；１反応あたり目的のＩＦＮサブタイプをコードする配列の少なくとも約１〜１０コピーを検出するために十分な感度；および特異的および非特異的増幅の間における少なくとも約９サイクルの相違の特異性を有してもよい。効率、感度および特異性の少なくとも１つは、以下を含むＰＣＲ反応条件により達成され得る：ステージ１：５０℃で２分間；ステージ２：９５℃で３分間；およびステージ３：９５℃で１５秒間の後５９℃で１分間を、４０反復。また、前記キットは、単一マルチプレックス反応容器中に複数のフォワードプライマーおよびリバースプライマーを含んでもよく、ここで、各フォワードプライマーおよびリバースプライマーセットは、共に、複数のＩＦＮサブタイプテンプレートを含む組成物からの単一ＩＦＮ−アルファサブタイプをコードする配列の特異的な増幅を可能とする。

他の実施態様において、本発明は、試料中の少なくとも１つの目的のＩＦＮ−アルファサブタイプの存在の検出方法であって：ａ）目的のＩＦＮ−アルファサブタイプの核酸配列の増幅に好適な条件下で、試料と請求項１〜２５のいずれか１項の組成物または請求項２６〜３６のいずれか１項のキットとを接触させること；およびｂ）目的のＩＦＮ−アルファサブタイプに対する増幅産物を検出すること（ここで、増幅産物の存在は、目的のＩＦＮ−アルファサブタイプが試料中に存在することを示す）を含む方法を提供する。

他の実施態様において、本発明は、症状に対する処置の効果をモニターする方法であって：ａ）少なくとも１つの目的のＩＦＮ−アルファサブタイプの増幅に好適な条件下で、試料と請求項１〜２４のいずれか１項の組成物または請求項２５〜３５のいずれか１項のキットとを接触させること；ｂ）目的のＩＦＮ−アルファサブタイプに対する増幅産物を検出すること；およびｃ）少なくとも１つの目的のＩＦＮ−アルファサブタイプに対する発現プロファイルを作成することを含む方法を提供する。前記処置は、免疫調節薬を投与することを含んでもよい。前記方法は、少なくとも１つの目的のＩＦＮ−アルファサブタイプに対する発現プロファイルを、前記症状を伴わない試料における少なくとも１つの目的のＩＦＮ−アルファサブタイプに対する発現パターンと比較することをさらに含んでもよい。前記処置は、ワクチン、免疫調節薬、癌化学療法および自己免疫症状治療からなる群より選択される。

他の実施態様において、本発明は、症状または症状に対する易罹患性を検出する方法であって：ａ）少なくとも１つの目的のＩＦＮ−アルファサブタイプの核酸配列の増幅に好適な条件下で、試料と請求項１〜２４のいずれか１項の組成物または請求項２５〜３５のいずれか１項のキットとを接触させること；ｂ）目的のＩＦＮ−アルファサブタイプに対する増幅産物を検出すること；ｃ）少なくとも１つの目的のＩＦＮ−アルファサブタイプに対する発現プロファイルを作成すること；およびｄ）少なくとも１つの目的のＩＦＮ−アルファサブタイプに対する発現プロファイルを、少なくとも１つの目的のＩＦＮ−アルファサブタイプの１以上の公知の遺伝子発現プロファイルと比較すること（ここで、公知の遺伝子発現プロファイルは疾患と関連する）を含む方法を提供する。前記方法は、複数の試料について行われてもよく、各試料は細胞または組織の異なる領域を含む。

これらのいずれの方法も、ＩＦＮ−アルファ１ｂ、ＩＦＮ−アルファ１ａ、ＩＦＮ−アルファ２ａ、ＩＦＮ−アルファ２ｂ、ＩＦＮ−アルファ４ａ、ＩＦＮ−アルファ４ｂ、ＩＦＮ−アルファ５、ＩＦＮ−アルファ６、ＩＦＮ−アルファ７、ＩＦＮ−アルファ８、ＩＦＮ−アルファ１０、ＩＦＮ−アルファ１４、ＩＦＮ−アルファ１６、ＩＦＮ−アルファ１７、およびＩＦＮ−アルファ２１からなる群から選択されるＩＦＮ−アルファサブタイプを検出するために使用されてもよい。

試料は、癌、ウイルス感染、微生物感染、炎症性疾患および自己免疫疾患からなる群より選択される症状を有する被験者由来であってもよい。前記試料は、組織試料、細胞試料、体液、尿、血液、血清、血漿、白血球、単球、末梢白血球（ＰＢＬ）、リンパ液、唾液、脳脊髄液（ＣＳＦ）、関節液、気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬ）、心膜液、脊髄液、胸膜液、胸膜滲出液、粘液、母乳、羊水、膣液、精液、前立腺液、腹水（ａｓｃｉｔｅｓ）、腹水（ａｓｃｉｔｉｃ ｆｌｕｉｄ）、腹腔液、眼房水、硝子体液、涙、カタル性分泌液、汗、嚢胞液、胃酸および腫瘍組織試料からなる群より選択されてもよい。

他の実施態様において、本発明は、ＩＦＮ−アルファサブタイプをコードする配列に対するプライマー対の設計方法であって：ａ）ＩＦＮ−アルファサブタイプ配列の特異領域を同定すること；ｂ）ＩＦＮ−アルファサブタイプ配列の特異領域にハイブリダイズする少なくとも一対のプライマーを作製すること；ｃ）少なくとも一対のプライマーの感度を測定し、１反応あたりの目的のＩＦＮ−アルファサブタイプをコードする配列の少なくとも約１〜１０コピーを検出するために十分な感度を有する少なくとも１つのプライマーを選択すること；ｄ）（ｃ）において選択された少なくとも１つの（ａｔ ｌｅａｓｔ ｏｎ）プライマー対の特異性を測定し、特異的および非特異的増幅の間の少なくとも約５サイクルの相違の特異性を有する少なくとも１つのプライマー対を選択すること；ｅ）（ｄ）において選択された少なくとも１つの（ａｔ ｌｅａｓｔ ｏｎ）プライマー対の効率を測定し、少なくとも約１．９０の効率を有する少なくとも１つのプライマー対を選択することを含む方法を提供する。前記プライマー対は、５０℃〜６０℃の範囲におけるプライマー伸長温度を有してもよい。
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
（項目１）
目的のＩＦＮ−アルファサブタイプをコードする少なくとも１つの配列を増幅するための組成物であって、共に、複数のＩＦＮサブタイプテンプレートを含む組成物から目的のＩＦＮ−アルファサブタイプをコードする配列の特異的な増幅を可能とするフォワードプライマーおよびリバースプライマーを含む組成物。
（項目２）
前記目的のＩＦＮ−アルファサブタイプをコードする少なくとも１つの配列が単一対立遺伝子変異型である、項目１の組成物。
（項目３）
前記ＩＦＮ−アルファサブタイプが、ＩＦＮ−アルファ１ａ／ｂ、ＩＦＮ−アルファ１ｂ、ＩＦＮ−アルファ１ａ、ＩＦＮ−アルファ２ａ／ｂ、ＩＦＮ−アルファ２ａ、ＩＦＮ−アルファ２ｂ、ＩＦＮ−アルファ４ａ／ｂ、ＩＦＮ−アルファ４ａ、ＩＦＮ−アルファ４ｂ、ＩＦＮ−アルファ５、ＩＦＮ−アルファ６、ＩＦＮ−アルファ７、ＩＦＮ−アルファ８、ＩＦＮ−アルファ１０、ＩＦＮ−アルファ１４、ＩＦＮ−アルファ１６、ＩＦＮ−アルファ１７、およびＩＦＮ−アルファ２１からなる群より選択される、項目１の組成物。（項目４）
前記ＩＦＮ−アルファサブタイプをコードする少なくとも１つの配列に対するフォワードプライマーおよびリバースプライマーが以下からなる群より選択される、項目３の組成物：
ａ）ＩＦＮ−アルファ１ａ／ｂに対し、配列番号３０を含むフォワードプライマーおよび配列番号４５を含むリバースプライマー；
ｂ）ＩＦＮ−アルファ２に対し、配列番号３１を含むフォワードプライマーおよび配列番号４６を含むリバースプライマー；
ｃ）ＩＦＮ−アルファ４ａ／ｂに対し、配列番号３２を含むフォワードプライマーおよび配列番号４７を含むリバースプライマー；
ｄ）ＩＦＮ−アルファ４ａに対し、配列番号３３を含むフォワードプライマーおよび配列番号４８を含むリバースプライマー；
ｅ）ＩＦＮ−アルファ４ｂに対し、配列番号３４を含むフォワードプライマーおよび配列番号４９を含むリバースプライマー；
ｆ）ＩＦＮ−アルファ５に対し、配列番号３５を含むフォワードプライマーおよび配列番号５０を含むリバースプライマー；
ｇ）ＩＦＮ−アルファ６に対し、配列番号３６を含むフォワードプライマーおよび配列番号５１を含むリバースプライマー；
ｈ）ＩＦＮ−アルファ７に対し、配列番号３７を含むフォワードプライマーおよび配列番号５２を含むリバースプライマー；
ｉ）ＩＦＮ−アルファ８に対し、配列番号３８を含むフォワードプライマーおよび配列番号５３を含むリバースプライマー；
ｊ）ＩＦＮ−アルファ１０に対し、配列番号３９を含むフォワードプライマーおよび配列番号５４を含むリバースプライマー；
ｋ）ＩＦＮ−アルファ１４に対し、配列番号４０を含むフォワードプライマーおよび配列番号５５を含むリバースプライマー；
ｌ）ＩＦＮ−アルファ１６に対し、配列番号４１を含むフォワードプライマーおよび配列番号５６を含むリバースプライマー；
ｍ）ＩＦＮ−アルファ１７に対し、配列番号４２を含むフォワードプライマーおよび配列番号５７を含むリバースプライマー；ならびに
ｎ）ＩＦＮ−アルファ２１に対し、配列番号４３を含むフォワードプライマーおよび配列番号５８を含むリバースプライマー。
（項目５）
各フォワードおよびリバースプライマーが５０℃〜６０℃の間のプライマー伸長温度を有する、項目１〜４のいずれか１項の組成物。
（項目６）
各ＩＦＮ−アルファサブタイプに対するフォワードプライマーおよびリバースプライマーを含む、項目３の組成物。
（項目７）
さらに阻害剤を含む、項目１〜６のいずれか１項の組成物。
（項目８）
さらにプローブを含む、項目１〜７のいずれか１項の組成物。
（項目９）
阻害剤、フォワードプライマー、リバースプライマーまたはプローブのうちの少なくとも１つがロックド核酸を含む、項目７〜８のいずれか１項の組成物。
（項目１０）
フォワードプライマー、リバースプライマーまたはプローブのうちの少なくとも１つが分子標識を含む、項目８の組成物。
（項目１１）
ＩＦＮ−アルファサブタイプをコードする配列に対する前記阻害剤が、以下からなる群より選択される項目７〜１０のいずれか１項の組成物：
ａ）ＩＦＮ−アルファ４ａ／ｂに対して、配列番号４４および８９を含む阻害剤；
ｂ）ＩＦＮ−アルファ４ａに対して、配列番号８８を含む阻害剤；ならびに
ｃ）ＩＦｎ−アルファ４ｂに対して、配列番号８８を含む阻害剤。
（項目１２）
前記プローブが単一ＩＦＮ−アルファサブタイプ対立遺伝子変異型をコードする配列を同定する、項目８〜１１のいずれか１項の組成物。
（項目１３）
ＩＦＮ−アルファサブタイプをコードする配列に対する前記プローブが以下からなる群より選択される、項目８〜１２のいずれか１項の組成物：
ａ）ＩＦＮ−アルファ１ａ／ｂに対して、配列番号５９を含むプローブ；
ｂ）ＩＦＮ−アルファ２に対して、配列番号６０を含むプローブ；
ｃ）ＩＦＮ−アルファ４ａ／ｂに対して、配列番号６１を含むプローブ；
ｄ）ＩＦＮ−アルファ４ａに対して、配列番号６２を含むプローブ；
ｅ）ＩＦＮ−アルファ４ｂに対して、配列番号６３を含むプローブ；
ｆ）ＩＦＮ−アルファ５に対して、配列番号６４含むプローブ；
ｇ）ＩＦＮ−アルファ６に対して、配列番号６５を含むプローブ；
ｈ）ＩＦＮ−アルファ７に対して、配列番号６６を含むプローブ；
ｉ）ＩＦＮ−アルファ８に対して、配列番号６７を含むプローブ；
ｊ）ＩＦＮ−アルファ１０に対して、配列番号６８を含むプローブ；
ｋ）ＩＦＮ−アルファ１４に対して、配列番６９を含むプローブ；
ｌ）ＩＦＮ−アルファ１６に対して、配列番号７０を含むプローブ；
ｍ）ＩＦＮ−アルファ１７に対して、配列番号７１を含むプローブ；および
ｎ）ＩＦＮ−アルファ２１に対して、配列番号７２を含むプローブ。
（項目１４）
ＤＳ剤をさらに含む、項目１〜１３のいずれか１項の組成物。
（項目１５）
前記ＤＳ剤が２本鎖核酸に結合する染料である、項目１４の組成物。
（項目１６）
前記染料がサイバーグリーンである、項目１５の組成物。
（項目１７）
前記プローブが捕捉領域をさらに含む、項目８〜１３のいずれか１項の組成物。
（項目１８）
前記プローブが検出可能な標識を含む、項目８〜１４のいずれか１項の組成物。
（項目１９）
前記検出可能な標識が、Ｔｅｘａｓ−Ｒｅｄ（登録商標）、フルオレセインイソチオシアネート、ＦＡＭ、ＴＡＭＲＡ、Ａｌｅｘａ ｆｌｕｏｒ（登録商標）、シアニン染料、クエンチャーおよびビオチンからなる群より選択される、項目１８の組成物。
（項目２０）
コントロールをさらに含む、項目１〜１９のいずれか１項の組成物。
（項目２１）
少なくとも約１．９０の効率を有する、項目１〜２０のいずれか１項の組成物。
（項目２２）
少なくとも約１．９５の効率を有する、項目１〜２１のいずれか１項の組成物。
（項目２３）
１反応あたり、目的のＩＦＮ−アルファサブタイプをコードする配列の少なくとも約１〜１０コピーを検出するために十分な感度を有する、項目１〜２２のいずれか１項の組成物。
（項目２４）
特異的および非特異的増幅間において少なくとも約５サイクルの相違の特異性を有する、項目１〜２３のいずれか１項の組成物。
（項目２５）
効率、感度および特異性のうちの少なくとも１つが、以下を含むＰＣＲ反応条件により達成される、項目２１〜２４のいずれか１項の組成物：
ａ）ステージ１：５０℃で２分間；
ｂ）ステージ２：９５℃で３分間；および
ｃ）ステージ３：９５℃で１５秒間の後５９℃で１分間を、４０反復。
（項目２６）
項目１〜２５のいずれか１項の組成物を含む、少なくとも１つの特異的ＩＦＮ−アルファサブタイプを検出するためのキット。
（項目２７）
各ＩＦＮ−アルファサブタイプに対するコンテナーをさらに含む項目２６のキットであって、各コンテナーが、共に、複数のＩＦＮサブタイプテンプレートを含む組成物から単一のＩＦＮ−アルファサブタイプをコードする配列の特異的な増幅を可能にするフォワードプライマーおよびリバースプライマーを含むキット。
（項目２８）
目的の前記ＩＦＮ−アルファサブタイプをコードする少なくとも１つの配列が単一対立遺伝子変異型である、項目２７のキット。
（項目２９）
前記ＩＦＮ−アルファサブタイプが、ＩＦＮ−アルファ１ｂ、ＩＦＮ−アルファ１ａ、ＩＦＮ−アルファ２ａ、ＩＦＮ−アルファ２ｂ、ＩＦＮ−アルファ４ａ、ＩＦＮ−アルファ４ｂ、ＩＦＮ−アルファ５、ＩＦＮ−アルファ６、ＩＦＮ−アルファ７、ＩＦＮ−アルファ８、ＩＦＮ−アルファ１０、ＩＦＮ−アルファ１４、ＩＦＮ−アルファ１６、ＩＦＮ−アルファ１７、およびＩＦＮ−アルファ２１からなる群より選択される、項目２７または項目２８のキット。
（項目３０）
各コンテナーが、単一ＩＦＮ−アルファサブタイプをコードする配列に特異的にハイブリダイズするプローブをさらに含む、項目２７〜２９のいずれか１項のキット。
（項目３１）
各コンテナーが阻害剤をさらに含む、項目２７〜３０のいずれか１項のキット。
（項目３２）
コントロールを含むコンテナーをさらに含む、項目２６〜３１のいずれか１項のキット。
（項目３３）
前記コンテナーが、チューブ、マルチウェルプレートにおけるウェル、チャネルおよびチップ上のウェルからなる群より選択される、項目２６〜３２のいずれか１項のキット。
（項目３４）
各フォワードおよびリバースプライマーが５０℃〜６０℃の間のプライマー伸長温度を有する、項目２６〜３３のいずれか１項のキット。
（項目３５）
各増幅反応が以下を有する、項目２６〜３４のいずれか１項のキット：
ａ）少なくとも約１．９０の効率；
ｂ）１反応あたり目的のＩＦＮサブタイプをコードする配列の少なくとも約１〜１０コピーを検出するために十分な感度；および
ｃ）特異的および非特異的増幅間における少なくとも約９サイクルの相違の特異性。
（項目３６）
効率、感度および特異性の少なくとも１つが、以下を含むＰＣＲ反応条件により達成される、項目３５のキット：
ａ）ステージ１：５０℃で２分間；
ｂ）ステージ２：９５℃で３分間；および
ｃ）ステージ３：９５℃で１５秒間の後５９℃で１分間を、４０反復。
（項目３７）
試料中の少なくとも１つの目的のＩＦＮ−アルファサブタイプの存在の検出方法であって：
ａ）目的のＩＦＮ−アルファサブタイプの核酸配列の増幅に好適な条件下で、該試料と項目１〜２５のいずれか１項の組成物または項目２６〜３６のいずれか１項のキットとを接触させる工程；および
ｂ）目的のＩＦＮ−アルファサブタイプに対する増幅産物を検出する工程であって、該増幅産物の存在は、目的のＩＦＮ−アルファサブタイプが試料中に存在することを示す、工程
を含む方法。
（項目３８）
症状に対する処置の効果をモニターする方法であって：
ａ）少なくとも１つの目的のＩＦＮ−アルファサブタイプの増幅に好適な条件下で、試料と項目１〜２４のいずれか１項の組成物または項目２５〜３５のいずれか１項のキットとを接触させる工程；
ｂ）目的のＩＦＮ−アルファサブタイプに対する増幅産物を検出する工程；および
ｃ）少なくとも１つの目的のＩＦＮ−アルファサブタイプに対する発現プロファイルを作成する工程
を含む方法。
（項目３９）
前記処置が免疫調節薬を投与することを含む、項目３８の方法。
（項目４０）
少なくとも１つの目的のＩＦＮ−アルファサブタイプに対する発現プロファイルを、前記症状を伴わない試料における少なくとも１つの目的のＩＦＮ−アルファサブタイプに対する発現パターンと比較する工程をさらに含む、項目３８または３９の方法。
（項目４１）
前記処置が、ワクチン、免疫調節薬、癌化学療法および自己免疫症状治療からなる群より選択される、項目３８または４０の方法。
（項目４２）
症状または症状に対する易罹患性を検出する方法であって：
ａ）少なくとも１つの目的のＩＦＮ−アルファサブタイプの核酸配列の増幅に好適な条件下で、試料と項目１〜２４のいずれか１項の組成物または項目２５〜３５のいずれか１項のキットとを接触させる工程；
ｂ）目的のＩＦＮ−アルファサブタイプに対する増幅産物を検出する工程；
ｃ）少なくとも１つの目的のＩＦＮ−アルファサブタイプに対する発現プロファイルを作成する工程；および
ｄ）少なくとも１つの目的のＩＦＮ−アルファサブタイプに対する発現プロファイルを、少なくとも１つの目的のＩＦＮ−アルファサブタイプの１以上の公知の遺伝子発現プロファイルと比較する工程であって、該公知の遺伝子発現プロファイルは疾患と関連する、工程
を含む方法。
（項目４３）
複数の試料について前記方法を行う工程を含み、各試料が細胞または組織の異なる領域を含む、項目４２の方法。
（項目４４）
前記ＩＦＮ−アルファサブタイプが、ＩＦＮ−アルファ１ｂ、ＩＦＮ−アルファ１ａ、ＩＦＮ−アルファ２ａ、ＩＦＮ−アルファ２ｂ、ＩＦＮ−アルファ４ａ、ＩＦＮ−アルファ４ｂ、ＩＦＮ−アルファ５、ＩＦＮ−アルファ６、ＩＦＮ−アルファ７、ＩＦＮ−アルファ８、ＩＦＮ−アルファ１０、ＩＦＮ−アルファ１４、ＩＦＮ−アルファ１６、ＩＦＮ−アルファ１７、およびＩＦＮ−アルファ２１からなる群から選択される、項目３７〜４３のいずれか１項の方法。
（項目４５）
前記試料が、癌、ウイルス感染、微生物感染、病原体、炎症性疾患および自己免疫疾患からなる群より選択される症状を有する被験者由来である、項目３８〜４４のいずれか１項の方法。
（項目４６）
前記試料が組織試料、細胞試料、体液、尿、血液、血清、血漿、白血球、単球、末梢白血球（ＰＢＬ）、リンパ液、唾液、脳脊髄液（ＣＳＦ）、関節液、気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬ）、心膜液、脊髄液、胸膜液、胸膜滲出液、粘液、母乳、羊水、膣液、精液、前立腺液、腹水（ａｓｃｉｔｅｓ）、腹水（ａｓｃｉｔｅｃ ｆｌｕｉｄ）、腹腔液、眼房水、硝子体液、涙、カタル性分泌液、汗、嚢胞液、胃酸および腫瘍組織試料からなる群より選択される項目３８〜４５の方法。
（項目４７）
ＩＦＮ−アルファサブタイプをコードする配列に対するプライマー対の設計方法であって：
ａ）ＩＦＮ−アルファサブタイプ配列の特異領域を同定する工程；
ｂ）ＩＦＮ−アルファサブタイプ配列の特異領域にハイブリダイズする少なくとも一対のプライマーを作製する工程；
ｃ）少なくとも一対のプライマーの感度を測定し、１反応あたりの目的のＩＦＮ−アルファサブタイプをコードする配列の少なくとも約１〜１０コピーを検出するために十分な感度を有する少なくとも１つのプライマー対を選択する工程；
ｄ）（ｃ）において選択された少なくとも１つのプライマー対の特異性を測定し、特異的および非特異的増幅の間の少なくとも約５サイクルの相違の特異性を有する少なくとも１つのプライマー対を選択する工程；
ｅ）（ｄ）において選択された少なくとも１つのプライマー対の効率を測定し、少なくとも約１．９０の効率を有する少なくとも１つのプライマー対を選択する工程
を含む方法。
（項目４８）
前記プライマー対が５０℃〜６０℃の範囲におけるプライマー伸長温度を有する、項目４７の方法。
（項目４９）
単一マルチプレックス反応容器中に複数のフォワードプライマーおよびリバースプライマーを含む項目２６、２８〜２９または３１〜３６のいずれか１項のキットであって、ここで各フォワードプライマーおよびリバースプライマーのセットが共に、複数のＩＦＮサブタイプテンプレートを含む組成物からの単一ＩＦＮ−アルファサブタイプをコードする配列の特異的な増幅を可能とするキット。

図１は、ＩＦＮ−アルファおよびＩＦＮ−ラムダサブタイプに対する代表的なフォワードプライマー、リバースプライマー、プローブおよび阻害剤のチャートである。 図２は、各ＩＦＮ−アルファプライマー／プローブセットに対するテンプレート希釈を示すグラフのパネルである。各サブパネルにおいて、プライマー／プローブセット、プローブの型（ＭＢまたはＬＮＡ）およびテンプレートを示す。蛍光振幅はＹ軸上に提供される一方、サイクル数はＸ軸上に示される。効率計算は、各グラフに対して示される。 図３は、特異性を計測するための各ＩＦＮ−アルファプライマー／プローブセットに対するテンプレート希釈を示すグラフのパネルである。特異的テンプレートの増幅および最も高い非特異的シグナル間の（サイクルにおける）間隔は、水平バーの下に示される。 図４は、効率（上段）および特異性（下段）を計測するためのＩＦＮ−ラムダサブタイププライマー／プローブセットに対するテンプレート希釈を示すグラフのパネルである。各プライマー／プローブセットの効率は、グラフの左下の角に示される。特異的テンプレートの増幅および最も高い非特異的シグナル間の（サイクルにおける）間隔は、水平バーの下に示される。特異性は、全ての他のＩＦＮ−アルファサブタイプ（ＩＦＮ−アルファ４ｂ以外）、全ての他のｒＩＦＮ−ラムダサブタイプ、ＩＦＮ−ベータおよびＩＦＮ−ガンマに対して試験された。 図５は、ＩＦＮ−ラムダ１に対するプライマー／プローブセットの特異性を示すグラフである。特異性は、ＩＦＮ−アルファ４ｂに対して試験された。 図６は、ＩＦＮ−アルファおよびＩＦＮ−ラムダＲＴ−ＰＣＲ検出キットの３８４ウェルプレートフォーマットの代表的な物理的配置を示す。カラム１〜４におけるウェルは固定化されたテンプレート濃度を表わす一方、カラム５における指定されたウェルはＩＦＮ−ラムダ標準および標準曲線が得られるであろう非テンプレートコントロール（ｎｏ−ｔｅｍｐｌａｔｅ ｃｏｎｔｒｏｌｓ）としての役割を果たす。標準の濃度は、定量的濃度範囲における相違により、サブタイプ間で変化する。各プレートは１６個の試料を保持し、Ｐまでの列において、１列あたり１サンプルを保持する。 図７は、ＩＦＮ−アルファ４ａプライマー／プローブセットがＩＦＮアルファ４ａｃＤＮＡを増幅するが、ＩＦＮ−アルファ４ｂｃＤＮＡを増幅せず、ＩＦＮ−ａ４ｂプライマー／プローブセットはＩＦＮ−アルファ４ｂｃＤＮＡを増幅するが、ＩＦＮ−アルファ４ａｃＤＮＡを増幅しないことを示すグラフである。 図８は、全細胞ＲＮＡに対するＩＦＮ−アルファプライマー／プローブセットの特異性を示す一連のグラフを示す。特異的テンプレートの増幅および最も高い非特異的シグナル間の（サイクルにおける）間隔は、水平バーの下に示される。 図９は、単球（図９Ａ）、単球由来マクロファージ（ＭＤＭ）（図９Ｂ）、単球由来樹状細胞（ＭＤＤＣ）（図９Ｃ）、形質細胞様樹状細胞（ｐＤＣ）（図９Ｄ）、骨髄系樹状細胞（ｍＤＣ）（図９Ｅ）およびヒトＢ細胞（図９Ｆ）における、様々な、ＩＦＮ−アルファ、ＩＦＮ−ベータ、ＩＦＮ−ガンマおよびＩＦＮ−ラムダサブタイプの発現プロファイルを示す一連のグラフである。 図９は、単球（図９Ａ）、単球由来マクロファージ（ＭＤＭ）（図９Ｂ）、単球由来樹状細胞（ＭＤＤＣ）（図９Ｃ）、形質細胞様樹状細胞（ｐＤＣ）（図９Ｄ）、骨髄系樹状細胞（ｍＤＣ）（図９Ｅ）およびヒトＢ細胞（図９Ｆ）における、様々な、ＩＦＮ−アルファ、ＩＦＮ−ベータ、ＩＦＮ−ガンマおよびＩＦＮ−ラムダサブタイプの発現プロファイルを示す一連のグラフである。 図９は、単球（図９Ａ）、単球由来マクロファージ（ＭＤＭ）（図９Ｂ）、単球由来樹状細胞（ＭＤＤＣ）（図９Ｃ）、形質細胞様樹状細胞（ｐＤＣ）（図９Ｄ）、骨髄系樹状細胞（ｍＤＣ）（図９Ｅ）およびヒトＢ細胞（図９Ｆ）における、様々な、ＩＦＮ−アルファ、ＩＦＮ−ベータ、ＩＦＮ−ガンマおよびＩＦＮ−ラムダサブタイプの発現プロファイルを示す一連のグラフである。 図１０は、扁桃組織の３つの切片（すなわち、胚中心Ｂ細胞（ＧＢＣ）、形質細胞様樹状細胞が豊富なＴ細胞ゾーン、および形質細胞様樹状細胞に乏しいＴ細胞ゾーン）における様々なＩＦＮ−アルファ、−ベータ、−ガンマおよびラムダサブタイプの発現プロファイル（直線ｄＣｔのｌｏｇ１０）を示すグラフである。

詳細な説明
他に定義のない限り、本明細書中で使用される全ての技術用語および科学用語は本発明が属する技術分野の当業者によって通常理解されているものと同じ意味を有する。代表的な方法および材料が以下に記載されるが、本明細書に記載されるものと同様または等価の方法および材料もまた、本発明の実施および試験において使用され得る。本明細書において言及される全ての出版物および他の参照は、それらの全てにおいて参照により組み込まれる。相矛盾する場合、定義を含む、本明細書が統制するであろう。本明細書において多数の文献が引用されるが、この引用は、これらの文献のいずれもが当該分野における通常の一般的知識の一部を形成するとの承認を構成するものではない。本明細書および請求項を通し、単語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」もしくは「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」等の変化は、提示された整数または一群の整数の包含を意味するが、いかなる他の整数または一群の整数を除外するものではないことが理解されるであろう。文脈により特に必要とされない限り、単数形の用語は複数形を包含し、複数形の用語は単数形を包含するであろう。材料、方法および実施例は単なる実例であり、限定を意図するものではない。

本発明の実施は、他に指定のない限り、当該分野の技術内の細胞生物学、細胞培養、分子生物学、遺伝子導入生物学、微生物学、組換えＤＮＡおよび免疫学の従来の技術を採用するであろう。そのような技術は、論文に記載されている。例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ Ｅｄ．，ｅｄ．ｂｙ Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ＦｒｉｔｓｃｈおよびＭａｎｉａｔｉｓ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ：１９８９）；ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｖｏｌｕｍｅｓ ＩおよびＩＩ（Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ ｅｄ．，１９８５）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ ｅｄ．，１９８４）；Ｍｕｌｌｉｓら、米国特許番号４，６８３，１９５；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ＆Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ ｅｄｓ．１９８４）；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ＆Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ ｅｄｓ．１９８４）；Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，１９８７）；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ Ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ
（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，１９８６）；Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ Ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）；ｔｈｅ ｔｒｅａｔｉｓｅ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎ．Ｙ．）；Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ Ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ（Ｊ．Ｈ．Ｍｉｌｌｅｒ ａｎｄ Ｍ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ ｅｄｓ．，１９８７，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）；Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｓ．１５４および１５５（Ｗｕらｅｄｓ．），Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｃｅｌｌ Ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（ＭａｙｅｒおよびＷａｌｋｅｒ，ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ，１９８７）；Ｈａｎｄｂｏｏｋ Ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ−ＩＶ（Ｄ．Ｍ．ＷｅｉｒおよびＣ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，ｅｄｓ．，１９８６）；Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ，（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８６）を参照。

配列表内の本明細書に記載されるヌクレオチドおよびアミノ酸配列において、ヌクレオチド配列に関し、「ｎ」または「ｘ」はあらゆるヌクレオチドを指すことができ、一方、タンパク質配列に関し、「ｎ」または「ｘ」はあらゆるアミノ酸を指すことができる。

本明細書に使用されるように、用語「含む」は、具体的な要素を包含する開放型（ｏｐｅｎ−ｅｎｄｅｄ）用語であり、追加の記載されていない要素を包含し得る。「含む」は、「包含する（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」または「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」と同義であってもよい。また、「含む」は、上記定義とは個別にかつ独立して「本質的に…からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」または「…からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」としても読まれてもよい。本明細書に使用されるように、「…からなる」は記載された具体的な要素のみを包含する閉鎖型用語（ｃｌｏｓｅｄ ｔｅｒｍ）であり、「本質的に…からなる」は記載された具体的な要素を包含し、追加の記載されていない非無形の要素を包含してもよい。

用語「配列」は、ヌクレオチドおよびアミノ酸配列を包含する。

用語オリゴペプチドは、２〜約２０アミノ酸長のアミノ酸配列を指す。用語オリゴヌクレオチドは、２〜約５０ヌクレオチド長のヌクレオチド配列を指す。

「対立遺伝子（ａｌｌｅｌｅ）」は、染色体上の同一の遺伝子座を占領する遺伝子の２以上の代替形態のいずれかを指す。二倍体個体内の２つの対立遺伝子が家系によって同一である（すなわち、両方の対立遺伝子が、先祖における単一対立遺伝子の直接的な子孫である）場合、そのような対立遺伝子は同質接合（ａｕｔｏｚｙｇｏｕｓ）と呼ばれる。その対立遺伝子が家系によって同一でない場合、それらはアロ接合（ａｌｌｏｚｙｇｏｕｓ）と呼ばれる。同一対立遺伝子の２つのコピーが１個体に存在する場合、その個体はその遺伝子についてホモ接合である。異なる対立遺伝子が１個体に存在する場合、その個体はその遺伝子についてヘテロ接合である。

用語「病態」は、細胞または身体機能、全身もしくは臓器の中断、停止または障害が生じた細胞、組織、臓器または哺乳類全身の生理学的状態を指す。

他に明確に提供されない限り、本明細書において使用される用語「インターフェロン」、「ＩＦＮ」、「ヒトインターフェロン」、「ヒトＩＦＮ」および「ｈＩＦＮ」は、現在公知であるかまたは今後発見されるかに関わらず、ヒトインターフェロンの天然および／または新規の配列の全種を指し、ヒトインターフェロンの天然配列の全てのサブタイプを包含する。本発明は、ＩＦＮ−アルファ、ＩＦＮ−ベータ、ＩＦＮ−デルタ、ＩＦＮ−イプシロン、ＩＦＮ−カッパ、ＩＦＮ−タウ、ＩＦＮ−オメガ、リミチン、ＩＦＮ−ガンマ、ＩＦＮ−ラムダ−１、ラムダ−２、ラムダ−３等を包含するがこれらに限定されないＩＦＮの全てのタイプを含む。ＩＦＮ−ベータヌクレオチドに対する代表的な配列は、配列番号８６に示される。ＩＦＮ−ガンマヌクレオチド配列に対する代表的な配列は、配列番号８７に示される。特定の好ましい実施態様において、ＩＦＮはサブタイプ、すなわち、ＩＦＮ−アルファサブタイプ、ＩＦＮ−ラムダ２およびＩＦＮ−ラムダ３を有する。ＩＦＮ−アルファは、本明細書を通して代表的な実施態様として使用される。しかしながら、本明細書に記載される実施態様は他のいかなるＩＦＮサブタイプにも適用されることが当業者に理解されるであろう。

本明細書において使用される「ロックド核酸」または「ＬＮＡ」は、そのリボース環が２’−Ｏ原子と４’−Ｃ原子とを結合するメチレンブリッジによって「ロックド（ｌｏｃｋｅｄ）」される、類似する一群の核酸を指す。ＬＮＡヌクレオチドは、ＤＮＡおよびＲＮＡ中に現れ、従って標準的なワトソン−クリック塩基対合ルールに従って塩基対を形成することが可能な、６つの共通の核酸塩基（Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ａ、ＵおよびｍＣ）を含有する。ＬＮＡを組み込むオリゴヌクレオチドは、向上した熱安定性を有し、それらの核酸標的に応じて改善された識別力を有する。ＬＮＡを、標準的なホスホラミダイト合成化学を用いてＤＮＡ、ＲＮＡおよび他の核酸アナログと混合することが可能である。ＬＮＡオリゴヌクレオチドは、ＤＩＧ、蛍光染料、ビオチン、アミノリンカー等の標準的なオリゴヌクレオチドタグで容易に標識され得る。

本明細書において使用される「分子標識（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｅａｃｏｎ）」または「ＭＢ」は、ポリヌクレオチドの一端に付着された蛍光標識、および他方に付着されたクエンチャーを含むプローブを指す。標識およびクエンチャー付近の相補的塩基対はヘアピン様構造を生じ、フルオロフォアおよびクエンチャーを極めて近くに置く。このヘアピンは、蛍光発光の増加を生じる標的の存在下において開く。フルオロフォアとクエンチャーとの近さは、９８％までの蛍光強度の減少を結果として生じ得る。この効率は、標的の非存在下での解放状態（ｏｐｅｎ ｓｔａｔｅ）における標識数に影響する幹強度（ｓｔｅｍ ｓｔｒｅｎｇｔｈ）（幹の長さ）を変えることによって、さらに調整され得る。

Ｉ型またはＩＩ型インターフェロン、または他のあらゆるポリペプチドとの関連において用語「天然配列」は、調製様式に関わらず、天然由来の対応するポリペプチドと同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを指す。そのような天然配列ポリペプチドは、天然から単離されることが可能であり、組換えおよび／または合成手段、もしくはこれらの組み合わせによって産生されることが可能である。用語「天然配列」は、具体的には、天然起源の切断または分泌形態（例えば、細胞外ドメイン配列）、天然起源の変異形態（例えば、選択的にスプライシングされた形態）および全長ポリペプチドの天然起源の対立遺伝子変異型を含む。

核酸は、他の核酸配列と機能的関係におかれる場合、「制御可能に連結」される。例えば、プレ配列または分泌リーダー（ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ ｌｅａｄｅｒ）に対するＤＮＡは、それがポリペプチドの分泌に参加するプレタンパク質として発現される場合にはポリペプチドに対するＤＮＡに制御可能に連結され、すなわち、配列の転写に影響を与える場合にはプロモーターまたはエンハンサーがコーディング配列に制御可能に連結され、または、翻訳を促進する様に配置される場合にはリボソーム結合部位がコーディング配列に制御可能に連結される。一般に、「制御可能に連結」は、連結されるＤＮＡ配列が隣接しており、分泌リーダーの場合隣接し、かつリーディングフェーズであることを意味する。しかしながら、エンハンサーは隣接する必要はない。連結は、簡便な制限酵素部位でライゲーションによって達成される。そのような部位が存在しない場合、合成核酸アダプターまたはリンカーを、従来法に従って使用する。

本明細書で参照されるポリペプチド配列に関する「パーセント（％）アミノ酸配列同一性」は、必要であれば、最大パーセント配列同一性を達成するために配列を整列させ、ギャップを導入した後、配列同一性の一部としてあらゆる保存的置換を考慮することなく、配列におけるアミノ酸残基との同一である候補配列におけるアミノ酸残基のパーセントとして定義される。パーセントアミノ酸配列同一性を決定する目的のアラインメントは、当該分野の技術内の様々な方法、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２またはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェア等の公的に利用可能なコンピューターソフトウェアを用いて、達成され得る。当業者は、比較される配列の全長に対する最大のアラインメントを達成するために必要なあらゆるアルゴリズムを包含する、アラインメントを計測するための適切なパラメーターを決定することが可能である。

本明細書における目的のため、提示されるアミノ酸配列Ｂへの、との、または、に対する提示されるアミノ酸配列Ａの％アミノ酸配列同一性（それは代替的に、提示されるアミノ酸配列Ｂへの、とのまたは、に対する特定の％アミノ酸配列同一性を有するまたは含む提示されるアミノ酸配列Ａと表現され得る）は以下の通り計算される：
分数Ｘ／Ｙの１００倍
ここで、Ｘは配列アラインメントプログラムのＡおよびＢのアラインメントによって同一マッチとしてスコアされたアミノ酸残基の数であり、ＹはＢにおけるアミノ酸残基の総数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと等しくない場合、Ｂに対するＡの％アミノ酸配列同一性は、Ａに対するＢの％アミノ酸配列同一性と等しくないであろうと理解されるであろう。アミノ酸配列同一性は、配列比較プログラムＮＣＢＩ−ＢＬＡＳＴ２（Ａｌｔｓｃｈｕｌら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２（１９９７））を用いて決定されてもよい。ＮＣＢＩ−ＢＬＡＳＴ２配列比較プログラムを、ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ．からダウンロードしてもよい。ＮＣＢＩ−ＢＬＡＳＴ２は、数個の検索パラメーターを使用し、ここで、それら全ての検索パラメーターは、例えば、ｕｎｍａｓｋ＝ｙｅｓ、ｓｔｒａｎｄ＝ａｌｌ、ｅｘｐｅｃｔｅｄ
ｏｃｃｕｒｒｅｎｃｅｓ＝１０、ｍｉｎｉｍｕｍ ｌｏｗ ｃｏｍｐｌｅｘｉｔｙ ｌｅｎｇｔｈ＝１５／５、ｍｕｌｔｉ−ｐａｓｓ ｅ−ｖａｌｕｅ＝０．０１、ｃｏｎｓｔａｎｔ ｆｏｒ ｍｕｌｔｉ−ｐａｓｓ＝２５、ｄｒｏｐｏｆｆ ｆｏｒ ｆｉｎａｌ ｇａｐｐｅｄ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ＝２５およびｓｃｏｒｉｎｇ ｍａｔｒｉｘ＝ＢＬＯＳＵＭ６２を包含する既定値に設定される。

ＮＣＢＩ−ＢＬＡＳＴ２がアミノ酸配列比較について採用される場合、提示されるアミノ酸配列Ｂへの、との、または、に対する提示されるアミノ酸配列Ａの％アミノ酸配列同一性（それは代替的に、提示されるアミノ酸配列Ｂへの、とのまたは、に対する特定の％アミノ酸配列同一性を有するまたは含む提示されるアミノ酸配列Ａと表現され得る）は以下の通り計算される：
分数Ｘ／Ｙの１００倍
ここで、ＸはそのプログラムのＡおよびＢのアラインメントにおいて、配列アラインメントプログラムＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴ２により同一マッチとしてスコアされたアミノ酸残基の数であり、ＹはＢにおけるアミノ酸残基の総数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと等しくない場合、Ｂに対するＡの％アミノ酸配列同一性は、Ａに対するＢの％アミノ酸配列同一性と等しくないであろうと理解されるであろう。

本明細書における目的のため、提示される核酸配列Ｂへの、との、または、に対する提示される核酸配列Ａの％核酸配列同一性（それは代替的に、提示されるアミノ酸配列Ｂへの、とのまたは、に対する特定の％核酸配列同一性を有するまたは含む提示される核酸配列Ａと表現され得る）は以下の通り計算される：
分数Ｘ／Ｙの１００倍
ここで、Ｘは配列アラインメントプログラムのＡおよびＢのアラインメントによって同一マッチとしてスコアされた核酸残基の数であり、ＹはＢにおける核酸残基の総数である。核酸配列Ａの長さが核酸配列Ｂの長さと等しくない場合、Ｂに対するＡの％核酸配列同一性は、Ａに対するＢの％核酸配列同一性と等しくないであろうと理解されるであろう。核酸配列同一性は、配列比較プログラムＮＣＢＩ−ＢＬＡＳＴ２（Ａｌｔｓｃｈｕｌら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２（１９９７））を用いて決定されてもよい。ＮＣＢＩ−ＢＬＡＳＴ２配列比較プログラムを、例えば、ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ．からダウンロードしてもよい。ＮＣＢＩ−ＢＬＡＳＴ２は、数個の検索パラメーターを使用し、ここで、それら全ての検索パラメーターは、例えば、ｕｎｍａｓｋ＝ｙｅｓ、ｓｔｒａｎｄ＝ａｌｌ、ｅｘｐｅｃｔｅｄ ｏｃｃｕｒｒｅｎｃｅｓ＝１０、ｍｉｎｉｍｕｍ ｌｏｗ ｃｏｍｐｌｅｘｉｔｙ ｌｅｎｇｔｈ＝１５／５、ｍｕｌｔｉ−ｐａｓｓ ｅ−ｖａｌｕｅ＝０．０１、ｃｏｎｓｔａｎｔ ｆｏｒ ｍｕｌｔｉ−ｐａｓｓ＝２５、ｄｒｏｐｏｆｆ ｆｏｒ ｆｉｎａｌ ｇａｐｐｅｄ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ＝２５およびｓｃｏｒｉｎｇ ｍａｔｒｉｘ＝ＢＬＯＳＵＭ６２を包含する既定値に設定される。

ＮＣＢＩ−ＢＬＡＳＴ２が核酸配列比較について採用される場合、提示される核酸配列Ｂへの、との、または、に対する提示される核酸配列Ａの％核酸配列同一性（それは代替的に、提示される核酸配列Ｂへの、とのまたは、に対する特定の％核酸配列同一性を有するまたは含む提示される核酸配列Ａと表現され得る）は以下の通り計算される：
分数Ｘ／Ｙの１００倍
ここで、ＸはそのプログラムのＡおよびＢのアラインメントにおいて、配列アラインメントプログラムＮＣＢＩ−ＢＬＡＳＴ２により同一マッチとしてスコアされる核酸残基の数であり、ＹはＢにおける核酸残基の総数である。核酸配列Ａの長さが核酸配列Ｂの長さと等しくない場合、Ｂに対するＡの％核酸配列同一性は、Ａに対するＢの％核酸配列同一性と等しくないであろうと理解されるであろう。

「ポリメラーゼ連鎖反応」または「ＰＣＲ」は、例えば、１９８７年７月２８日付発行の米国特許番号４，６８３，１９５において一般的に記載されるように、核酸、ＲＮＡおよび／またはＤＮＡの微量の特異的断片が増幅される手法または技術を指す。一般的に、目的の領域の末端から、または入手可能な必要性を超えた配列情報（例えば、オリゴヌクレオチドプライマー）を設計することができ、すなわち、これらのプライマーは、増幅されるテンプレートの逆の鎖に対し、配列において同一または類似であろう。２つのプライマーの５’末端ヌクレオチドは、増幅された材料の末端と一致し得る。ＰＣＲは、例えば、特異的ＲＮＡ配列、全ゲノムＤＮＡ由来特異的ＤＮＡ配列、および全細胞ＲＮＡ、バクテリオファージまたはプラスミド配列由来のｃＤＮＡ転写物を増幅するために使用され得る。一般的には、Ｍｕｌｌｉｓら，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．５１：２６３（１９８７）；Ｅｒｌｉｃｈ，ｅｄ．，ＰＣＲ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，１９８９）を参照。本明細書で使用されるように、ＰＣＲは、プライマーとしての公知の核酸、および特異的核酸断片の増幅または作製のための核酸ポリメラーゼの使用を含む、核酸試験試料の増幅のための核酸ポリメラーゼ反応法の一例として考えられるが、これのみではない。

用語「プライマー」は、条件がプライマー伸長産物の合成に好適である場合、相補鎖に沿った合成の開始点としてはたらくことが可能な核酸を指す。合成条件は、４つの異なる塩基の存在、および逆転写酵素またはＤＮＡポリメラーゼ等の少なくとも１つの重合誘導剤を包含する。これらは、好適な緩衝溶液中に存在し、それは、補助因子または様々な好適な温度においてｐＨ等の条件に影響する構成成分を包含してもよい。プライマーは、好ましくは、増幅効率が最適化されるように一本鎖配列であるが、二本鎖配列を利用してもよい。

用語「プローブ」は、標的配列にハイブリダイズする核酸を指す。いくつかの実施態様において、プローブは、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、または約２０ヌクレオチドを包含する。また、プローブは、約２５ヌクレオチド、約３０ヌクレオチド、約４０ヌクレオチド、約５０ヌクレオチド、約６０ヌクレオチド、約７０ヌクレオチド、約７５ヌクレオチド、約８０ヌクレオチド、約９０ヌクレオチド、約１００ヌクレオチド、約１１０ヌクレオチド、約１１５ヌクレオチド、約１２０ヌクレオチド、約１３０ヌクレオチド、約１４０ヌクレオチド、約１５０ヌクレオチド、約１７５ヌクレオチド、約１８７ヌクレオチド、約２００ヌクレオチド、約２２５ヌクレオチド、および約２５０ヌクレオチド、またはこの間のあらゆる整数を包含する。プローブは、さらに、検出可能な標識を包含し得る。プローブは、検出可能な標識を包含してもよく、フルオロフォア（例えば、Ｔｅｘａｓ−Ｒｅｄ（登録商標）、フルオレセインチオシアネート等）およびハプテン（例えば、ビオチン）を包含するが、これらに限定されない。検出可能な標識を、例えば、プローブの５’末端またはプローブの３’末端に位置して、プローブオリゴヌクレオチドへ直接、共有結合的に付着することができる。また、フルオロフォアを包含するプローブは、さらにクエンチャー（例えば、Ｂｌａｃｋ Ｈｏｌｅ Ｑｕｅｎｃｈｅｒ（商標）、Ｉｏｗａ Ｂｌａｃｋ（商標）等）を包含してもよい。

用語「核酸」および「ポリヌクレオチド」は、本明細書において、あらゆる長さのポリマー（例えば、約１０塩基より大きい、約１００塩基より大きい、約５００塩基より大きい、約１０００塩基より大きい、通常約１０，０００以上まで、またはその間のあらゆる整数）を記載するために互換的に使用される。核酸は、ヌクレオチド、例えば、デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチド、または合成的に産生される化合物（例えば、米国特許番号５，９４８，９０２およびそこに引用される文献に記載されるＰＮＡ）で構成され、これは、例えば、ワトソン−クリック塩基対合相互作用に参加することが可能な２つの天然起源の核酸のそれに類似の天然起源の核酸に、配列特異的にハイブリダイズすることが可能である。

本明細書において使用される用語「リボ核酸」および「ＲＮＡ」は、リボヌクレオチドで構成されるポリマーを意味する。

本明細書において使用される用語「デオキシリボ核酸」および「ＤＮＡ」は、デオキシリボヌクレオチドで構成されるポリマーを意味する。

用語「融点」または「Ｔ_ｍ」は、ＤＮＡ二本鎖が分離され一本鎖になる温度を指す。従って、Ｔｍは二本鎖安定性の指標である。

当業者に公知の用語「ハイブリダイズ」または「ハイブリダイゼーション」は、好適な条件下（例えば、ストリンジェントな条件下）での特定のヌクレオチド配列への核酸分子の結合または二本鎖化（ｄｕｐｌｅｘｉｎｇ）を指す。本明細書において使用される用語「ストリンジェントな条件」（または「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」）は、所望の特異性を提供するために不十分な相補性の結合メンバー間での結合対の形成には適合性が低いが、アッセイにおいて所望のレベルの特異性を提供するために十分な相補性の核酸の結合対（例えば、表面結合および液相核酸）を産生するために適合する条件を指す。ストリンジェントな条件は、ハイブリダイゼーションおよび洗浄条件の両方の合計または（全体としての）組み合わせである。

本明細書において使用される用語「ストリンジェントアッセイ条件」は、所望の特異性を提供するために不十分な相補性の結合メンバー間での結合対の形成には適合性がより低いが、アッセイにおいて所望のレベルの特異性を提供するために十分な相補性の核酸の結合対（例えば、プローブおよび標的）を産生するために適合する条件を指す。用語ストリンジェントアッセイ条件は、ハイブリダイゼーションおよび洗浄条件の組み合わせを指す。

核酸ハイブリダイゼーション（例えば、アレイにおける、サザンまたはノザンハイブリダイゼーションとして）との関連で「ストリンジェントなハイブリダイゼーション」および「ストリンジェントなハイブリダイゼーション洗浄条件」は配列依存性であり、異なる環境パラメーター下において異なる。本発明の範囲内において核酸を同定するために使用され得るストリンジェントハイブリダイゼーション条件は、例えば、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣおよび１％ＳＤＳを含む緩衝溶液中における４２℃でのハイブリダイゼーション、または５×ＳＳＣおよび１％ＳＤＳを含む緩衝溶液中における６５℃でのハイブリダイゼーション（いずれも６５℃での０．２×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳの洗浄を伴う）を包含し得る。また、代表的なストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、４０％ホルムアミド、１Ｍ ＮａＣｌおよび１％ＳＤＳの緩衝溶液中における３７℃でのハイブリダイゼーション、および４５℃での１×ＳＳＣの洗浄を包含してもよい。あるいは、６５℃での０．５Ｍ ＮａＨＰＯ_４、７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、１ｍｎＭ ＥＤＴＡ中でのフィルター結合ＤＮＡへのハイブリダイゼーション、および６８℃での０．１×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中での洗浄を採用してもよい。さらに追加のストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、６０℃もしくはそれ以上でのハイブリダイゼーション、および３×ＳＳＣ（４５０ｍＭ塩化ナトリウム／４５ｍＭクエン酸ナトリウム）、または４２℃での３０％ホルムアミド、１Ｍ ＮａＣｌ、０．５％サルコシン酸ナトリウム、５０ｍＭ ＭＥＳ、ｐＨ６．５を含有する溶液中におけるインキュベーションを包含する。当業者は、類似のストリンジェンシー条件を提供するために、代替であるが同等のハイブリダイゼーションおよび洗浄条件を利用できることを容易に認識するであろう。

特定の実施態様において、洗浄条件のストリンジェンシーは、核酸がプローブに特異的にハイブリダイズするかどうかを決定する。核酸を同定するために使用される洗浄条件は、例えば、ｐＨ７において約０．０２Ｍの塩濃度、および約２０℃〜約４０℃の温度；または７２℃において約０．１５Ｍ ＮａＣｌの塩濃度で約１５分間；または約３０℃〜約５０℃の温度において約０．２×ＳＳＣの塩濃度で約２〜約２０分間；または室温で１％ＳＤＳを含有する約２×ＳＳＣの塩濃度を有する溶液で１５分間ハイブリダイゼーション複合体を２回洗浄し、その後、１５分間、３７℃において０．１％ＳＤＳを含有する０．１×ＳＳＣによって２回洗浄する；または同等の条件を包含してもよい。洗浄用のストリンジェントな条件は、例えば、４２℃で０．２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳであってもよい。同等のハイブリダイゼーションおよび洗浄条件、ならびに試薬および緩衝溶液（例えば、ＳＳＣ緩衝溶液ならびに同等の試薬および条件）の詳細な記述について、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ＡｕｓｕｂｅｌまたはＴｉｊｓｓｅｎ（下記で引用）を参照。

本明細書において使用される用語「感度」は、検出され得る標的の分子の最小数を指す。

本明細書において使用される用語「特異性」は、あらゆる他の類似の配列に関連する探索されているテンプレートの選択的検出を指す。特異性は、他のいかなる類似の配列でもなく、探索されているテンプレートのみの検出として定義される、全特異性により等級づけられてもよい（例えば、全特異性よりも小さい高特異性）。

本明細書において使用される用語「遺伝子型」は、個体における一対の相同染色体上の遺伝子座における１以上の多型性部位で見出されるヌクレオチド対の配列を意味する。遺伝子型は、各ＩＦＮサブタイプに対する遺伝子の特異的配列を指す。

本明細書において使用される用語「サブタイプ」は、ＩＦＮサブタイプポリペプチドまたはポリヌクレオチドを指す。「サブタイプ」は、同一または類似のアミノ酸配列を有し、異なる遺伝子、または異なるエクソンが除去された同一の遺伝子からのＲＮＡ転写物のいずれかによってコードされる、２以上の機能的に類似のタンパク質のいずれかを指す。また、「サブタイプ」は、成熟および未成熟配列を包含する、そのようなタンパク質をコードするいずれかの配列を指してもよい。従って、「サブタイプ」は、他に規定のない限り、それらのいずれか一方のみを参照すると理解され、ＩＦＮサブタイプ遺伝子のみならず、ＩＦＮサブタイプ遺伝子のタンパク質産物をも含む。

本明細書において使用される、本発明の組成物における、または本発明の方法において採用される成分、パラメーター、計算または計測の量を修飾する用語「約（ａｂｏｕｔ）」は、例えば、本発明の組成物または方法の化学的または物理的属性に実質的に影響することのない、現実世界におけるＤＮＡ、プローブ、プライマーまたは溶液を作製するために使用される典型的な計測および液体の取り扱い手法を通して；これらの手法における不測の誤りを通して；組成物を作製するため、または方法を実施するために採用される成分の製造、起源または精製度における相違等を通して生じ得る、数として表わされる量における変化を指す。また、用語、約は、特定の最初の混合物から生じた組成物に対する異なる平衡状態に起因して相違する量を含む。用語「約」によって修飾されるか否かにかかわらず、請求項はその量に対する等価物を包含する。

本明細書において使用される用語「オリゴマー阻害剤」は、核酸配列へのプライマーまたはプローブのアニーリングを阻止する能力を有する阻害剤を意味する。阻害剤は、標的テンプレート配列に類似であるが同一ではないｃＤＮＡに対するプライマーまたはプローブの結合を競合的に阻害するように設計されたポリヌクレオチドであってもよい。「オリゴマー阻害剤」は、非特異的標的配列に相補的またはおよそ相補的な配列を含有してもよい。ポリヌクレオチドオリゴマー阻害剤は、約３〜約１００ヌクレオチド、約５〜約５０ヌクレオチド、約７〜約２０ヌクレオチド、約８〜約１４ヌクレオチドのサイズにおいて変化してもよい。

本開示は、生物学的試料中のＩＦＮサブタイプをコードする配列の存在および／または量を測定するための試薬、方法およびキットを提供する。１つの側面において、各ＩＦＮサブタイプおよびアロタイプ変異体（ＩＦＮ−アルファ１、ＩＦＮ−アルファ２またはＩＦＮ−アルファ４のアロタイプ変異体等）をコードする配列を検出するための高感度および特異的定量的リアルタイムＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）アッセイを提供する。前記アッセイは、プローブ系ＲＴ−ＰＣＲの２つの改変、すなわち分子標識（ＭＢ）およびロックド核酸（ＬＮＡ）を開発するものである。いくつかの実施態様において、プライマー／プローブセットの標的配列は、ｍＲＮＡ転写物の３’（３−ｐｒｉｍｅ）非翻訳領域が下流のコーディング配列の分解を開始するマイクロＲＮＡ分子に対する標的部位を有する可能性があることから、成熟コーディング配列に対して相補的である。コーディング配列に対して相補的なプライマー／プローブセットは、分解されたｍＲＮＡの偽性検出を回避し、本アッセイによって計測されるＩＦＮサブタイプｍＲＮＡと実際に発現されるタンパク質との間の相互関係を増強する。診断キットは、感染、自己免疫および癌を包含する多数の疾患からの保護または疾患の発症と関連し得るＩＦＮサブタイプの発現パターンを確立することができる。ＩＦＮサブタイプの発現パターンは、ワクチン有効性、自己免疫疾患、慢性感染症または腫瘍治療をモニターするために使用され得る。

代表的な実施態様として、ＩＦＮ−アルファ遺伝子ファミリーは、１２のサブタイプを有する１３の遺伝子を包含する。サブタイプ１および１３に対する遺伝子から結果として生じるタンパク質は同一の配列を有する。ＩＦＮ−アルファサブタイプは、ＩＦＮ−アルファ１ｂ、ＩＦＮ−アルファ１ａ、ＩＦＮ−アルファ２ａ、ＩＦＮ−アルファ２ｂ、ＩＦＮ−アルファ４ａ、ＩＦＮ−アルファ４ｂ、ＩＦＮ−アルファ５、ＩＦＮ−アルファ６、ＩＦＮ−アルファ７、ＩＦＮ−アルファ８、ＩＦＮ−アルファ１０、ＩＦＮ−アルファ１４、ＩＦＮ−アルファ１６、ＩＦＮ−アルファ１７およびＩＦＮ−アルファ２１を包含する。異なるサブタイプのＩＦＮ−アルファをコードする典型的な核酸配列は公知であり、実施例１の表２および表３に列挙される。対立遺伝子変異型は、２ａおよび２ｂ、ならびに４ａおよび４ｂを包含すると記載されている。２つの異なる命名法がＩＦＮ−アルファサブタイプについて通常使用されることから、実施例１の表２は、これらの表記システムと共に、本明細書において使用される表記システムの両方を特定するために提供する。

上述のように、ＩＦＮ−アルファサブタイプをコードする配列を包含する、ＩＦＮサブタイプをコードする多くの配列は、配列同一性を共有するため（例えば、７５〜９５％配列同一性）、特に、１より多いサブタイプに対するＲＮＡまたはＤＮＡを含有する試料中の全ての他のサブタイプから１つのサブタイプをコードする配列を区別するプライマーおよびプローブを同定することは困難である。また、ＩＦＮ−アルファサブタイプに対するプライマー設計は、ＩＦＮ−アルファサブタイプをコードする特定の配列の３’非翻訳領域において結合するように設計されたプライマーは、分解されたｍＲＮＡまたはｓｉＲＮＡによって標的とされる下流配列に結合する可能性があるため、困難である。これは、非特異的プライマー結合に寄与する。

例えば、ＩＦＮ−アルファ４をコードする２つの異なる対立遺伝子が存在する。従って、ＩＦＮ−アルファ４サブタイプは、対立遺伝子変異型ＩＦＮ−アルファ４ａおよびＩＦＮ−アルファ４ｂを包含する。これらの対立遺伝子変異型は２つのみの核酸変化によって異なり、５１位でのアラニンからスレオニンへのアミノ酸変化および１１４位におけるグルタミン酸からバリンへのアミノ酸変化を含む成熟タンパク質を結果として生じる（表３および４を参照）。また、ＩＦＮ−アルファ１に対する２つの異なる対立遺伝子が存在する。ＩＦＮ−アルファ１は、対立遺伝子変異型ＩＦＮ−アルファ１ａおよびＩＦＮ−アルファ１ｂを包含する。これらの対立遺伝子変異型は、ＣからＴの単一のヌクレオチド置換のみによって異なり、表３および４に示されるように、１１４位における成熟タンパク質中のアラニンからバリンへの変化を結果として生じる。他の例として、ＩＦＮ−アルファ１３によってコードされる成熟タンパク質は、ＩＦＮ−アルファ１ａによってコードされる成熟タンパク質のアミノ酸配列と１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。ＩＦＮ−アルファ１３およびＩＦＮ−アルファ１ａによってコードされるタンパク質間のアミノ酸配列における唯一の相違は、推定されるリーダー配列に存在し、ここで、ＩＦＮ−アルファ１３はアラニンを有し、ＩＦＮ−アルファ１ａがバリンを有する。ＩＦＮ−アルファ１３に対する遺伝子配列は、５’非翻訳領域中に追加の１５塩基を有する。３’非翻訳領域において、前記配列は、ＩＦＮ−アルファ１におけるＡＡＡＡＣＡＡ対ＩＦＮ−アルファ１３におけるＡＡＡ−ＣＡＡＡ以外、完全に整列する。さらにＩＦＮ−アルファ１は、３’非翻訳領域において追加の１７５塩基を有する。

従って、本発明の１つの側面は、フォワードおよびリバースプライマーを提供し、各々は、複数のＩＦＮサブタイプテンプレートを含む組成物から、１種のみのＩＦＮサブタイプをコードする少なくとも１つの配列（１種のみのＩＦＮ−アルファサブタイプをコードする配列等）に特異にハイブリダイズする。フォワードプライマーおよびリバースプライマーのセットは、共に、複数のＩＦＮサブタイプテンプレートを含む組成物から目的の単一のＩＦＮ−アルファサブタイプをコードする少なくとも１つの配列の特異的な増幅を可能とする。プライマーは、ＩＦＮサブタイプをコードする特異配列の増幅を可能とし得る。いくつかの実施態様において、特異配列は単一コドンであってもよい。１つまたは両方のプライマーは、例えば、リーダー配列の一部を包含する未成熟ペプチドをコードする配列のタンパク質にハイブリダイズし得る。他の実施態様において、１つまたは両方のプライマーは、成熟ペプチドをコードする配列の一部にハイブリダイズし得る。従って、本発明は、特定の実施態様におけるＩＦＮ−サブタイプの成熟ポリペプチドの増幅を可能にするプライマーセット、ならびに特定の実施態様におけるＩＦＮ−サブタイプの未成熟ポリペプチドの増幅を可能とするプライマーセットを包含する。フォワードおよびリバースプライマーは、それぞれ、センスおよびアンチセンスの特異配列にハイブリダイズし、増幅を可能とし得る。加えて、フォワードおよびリバースプライマーは、特異配列（例えば、特異なコドン）の一端または両端上の追加のヌクレオチドにハイブリダイズし得る。

本発明の１つの実施態様において、フォワードおよびリバースプライマーは、ＩＦＮ−アルファ１ａ、ＩＦＮ−アルファ１ｂ、ＩＦＮ−アルファ２ａ、ＩＦＮ−アルファ２ｂ、ＩＦＮ−アルファ４ａまたはＩＦＮ−アルファ４ｂ等であるがこれらに限定されない、ＩＦＮサブタイプの単一対立遺伝子変異型をコードする配列を認識し増幅を可能とし得る。当業者は、本発明の組成物、キットおよび方法は、現在公知のまたは今後発見されるあらゆるＩＦＮサブタイプ対立遺伝子変異型に適用され得ることを認識するであろう。

１つの実施態様において、前記組成物は、複数のＩＦＮ−サブタイプまたはＩＦＮ−サブタイプの様々な組み合わせに対するフォワードおよびリバースプライマーを包含する。例えば、いくつかの実施態様において、組成物は、少なくとも１個のＩＦＮ−サブタイプ、少なくとも２個のＩＦＮ−サブタイプ、少なくとも３個のＩＦＮ−サブタイプ、少なくとも４個のＩＦＮ−サブタイプ、少なくとも５個のＩＦＮ−サブタイプ、少なくとも６個のＩＦＮ−サブタイプ、少なくとも７個のＩＦＮ−サブタイプ、少なくとも８個のＩＦＮ−サブタイプ、少なくとも９個のＩＦＮ−サブタイプ、少なくとも１０個のＩＦＮ−サブタイプ、少なくとも１１個のＩＦＮ−サブタイプ、少なくとも１２個のＩＦＮ−サブタイプ、少なくとも１３個のＩＦＮ−サブタイプ、少なくとも１４個のＩＦＮ−サブタイプ、少なくとも１５個のＩＦＮ−サブタイプ、少なくとも１６個のＩＦＮ−サブタイプ、少なくとも１７個のＩＦＮ−サブタイプ、少なくとも２０個のＩＦＮ−サブタイプ、少なくとも３０個のＩＦＮ−サブタイプ、もしくはそれ以上、またはこの間のあらゆる整数のサブタイプに対して特異的なプライマーセットを提供してもよい。特定の実施態様において、組成物は、マルチプレックス反応における使用のための複数のＩＦＮ−サブタイプに対するプライマーセットを包含する。

プライマーは、ヒトＩＦＮ−サブタイプをコードする配列に特異的であってもよい。他の実施態様において、プライマーはＩＦＮ−サブタイプを発現するあらゆる種由来のＩＦＮ−サブタイプをコードする配列に特異的であってもよい。いくつかの実施態様において、種は、アカゲザルまたはカニクイザルであってもよい。

いくつかの実施態様において、プライマーは少なくとも１０ヌクレオチドであって、２５０ヌクレオチド以下である。いくつかの実施態様において、プライマーは、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０ヌクレオチド、約２１ヌクレオチド、約２２ヌクレオチド、約２３ヌクレオチド、約２４ヌクレオチド、約２５ヌクレオチド、約２６ヌクレオチド、約２７ヌクレオチド、約２８ヌクレオチド、約２９ヌクレオチド、約３０ヌクレオチド；または約４０ヌクレオチド、約５０ヌクレオチド、約６０ヌクレオチド、約７０ヌクレオチド、約７５ヌクレオチド、約８０ヌクレオチド、約９０ヌクレオチド、約１００ヌクレオチド、約１１０ヌクレオチド、約１１５ヌクレオチド、約１２０ヌクレオチド、約１３０ヌクレオチド、約１４０ヌクレオチド、約１５０ヌクレオチド、約１７５ヌクレオチド、約１８７ヌクレオチド、約２００ヌクレオチド、約２２５ヌクレオチド、および約２５０ヌクレオチド、またはこの間のあらゆる整数を包含する。

非特異的結合が生じるいくつかの実施態様において、誤って増幅されたサブタイプコーディング配列にアニールするプライマーを阻止するオリゴマー阻害剤と共にプライマーを使用することによって、プライマー特異性が増強され得る。１つの実施態様において、阻害剤は、１つまたは両方のプライマーに組み込まれるＬＮＡを含む。阻害剤は、非標的サブタイプにおける類似性に対するプライマーまたはプローブ配列を検査することによって設計されてもよい。類似性が同定された場合、ＬＮＡ（ロックド核酸）オリゴは、類似性配列にマッチするように設計されてもよい。ＬＮＡは、それらがプライマーの結合親和性を増加し、より短いオリゴヌクレオチドプローブを可能とするために（ａｌｌｏｗ ｆｏｒ）Ｔ_ｍを増加し、そしてオリゴを「硬化し（ｓｔｉｆｆｅｎ）」、それによって塩基ミスマッチ識別能力を向上するため、有利である。ＬＮＡオリゴは、約２〜約５０ヌクレオチド、約４〜約３０ヌクレオチド、好ましくは約８〜約１５ヌクレオチド、そしてより好ましくは約８〜約１２ヌクレオチドであってもよい。

本発明の他の側面において、プローブは、唯一のＩＦＮサブタイプのコーディング配列に特異的に結合するように提供される。本発明のプローブは、本発明のプライマーと共に使用されてもよい。いくつかの実施態様において、前記プローブが特異的なＩＦＮ−アルファサブタイプをコードする配列は、ＩＦＮ−アルファ１ｂ、ＩＦＮ−アルファ１ａ、ＩＦＮ−アルファ２ａ、ＩＦＮ−アルファ２ｂ、ＩＦＮ−アルファ４ａ、ＩＦＮ−アルファ４ｂ、ＩＦＮ−アルファ５、ＩＦＮ−アルファ６、ＩＦＮ−アルファ７、ＩＦＮ−アルファ８、ＩＦＮ−アルファ１０、ＩＦＮ−アルファ１４、ＩＦＮ−アルファ１６、ＩＦＮ−アルファ１７およびＩＦＮ−アルファ２１をコードする配列からなる群より選択される。プローブは、例えば、リーダー配列の一部を包含する未成熟ペプチドをコードする配列の一部にハイブリダイズし得る。他の実施態様において、プローブは、成熟ペプチドをコードする配列の一部にハイブリダイズしてもよい。いくつかの実施態様において、プローブは、少なくとも１０塩基を含み、２５０塩基以下である。プローブは、公的に利用可能なソフトウェアを使用して設計され得る。プローブ設計の基準は、長さ、ＧＣ含量、Ｔ_ｍ（溶融温度）を包含するが、これらに限定されない。

本発明の１つの実施態様において、プローブは、ＩＦＮ−アルファ１ａ、ＩＦＮ−アルファ１ｂ、ＩＦＮ−アルファ２ａ、ＩＦＮ−アルファ２ｂ、ＩＦＮ−アルファ４ａまたはＩＦＮ−アルファ４ｂ等であるがこれらに限定されない、ＩＦＮサブタイプの単一対立遺伝子変異型をコードする配列を認識してハイブリダイズするために特異的であってもよい。当業者は、本発明の組成物、キットおよび方法は、現在公知のまたは今後発見されるあらゆるＩＦＮサブタイプ対立遺伝子変異型に適用してもよいことを認識するであろう。

プライマーは、ヒトＩＦＮ−サブタイプに特異的であってもよい。他の実施態様において、プライマーは、ＩＦＮ−サブタイプを発現するあらゆる種由来のＩＦＮ−サブタイプに特異的であってもよい。いくつかの実施態様において、種はアカゲザルまたはカニクイザルであってもよい。

いくつかの実施態様において、プローブは、ＩＦＮサブタイプをコードする標的核酸のセンス鎖に結合するように設計されてもよく、他の実施態様において、プローブはＩＦＮサブタイプの標的核酸のアンチセンス鎖に結合するように設計されてもよい。いくつかの実施態様において、センスまたはアンチセンス鎖にハイブリダイズする優先性が存在し、他の実施態様においては、ＩＦＮサブタイプをコードする標的核酸のセンス鎖またはアンチセンス鎖に対する優先性はなく、いずれもが同様の結果を使用し得る。

いくつかの実施態様において、プライマーまたはプローブは検出可能な標識を含んでもよい。特定の好ましい実施態様において、プローブは検出可能な標識を含む。検出可能な標識は、フルオロフォア（例えば、Ｔｅｘａｓ−Ｒｅｄ（登録商標）、フルオレセインイソチオシアネート等）およびハプテン（例えば、ビオチン）を包含するが、これらに限定されない。他の検出可能な標識は、ＦＡＭ、ＴＡＭＲＡ、シアニン染料、サイバーグリーンおよびＡｌｅｘａ ｆｌｕｏｒを包含する。検出可能な標識は、例えば、プローブの５’末端またはプローブの３’末端に位置して、プローブオリゴヌクレオチドに直接的に、共有結合的に付着されてもよい。あるいは、検出可能な標識は、リンカーまたは他の成分を介してプローブに付着されてもよい。また、フルオロフォアを含むプローブは、クエンチャーをさらに含んでもよい。限定的ではなく、クエンチャーの例は、Ｂｌａｃｋ Ｈｏｌｅ Ｑｕｅｎｃｈｅｒ（商標）およびＩｏｗａ Ｂｌａｃｋ（商標）を包含する。いくつかの実施態様において、プローブの検出可能な標識およびクエンチャーは、１以上の分子標識またはスコーピオン（ｓｃｏｒｐｉｏｎｓ）を含む。いくつかの実施態様において、プローブは、例えば触手プローブ（ｔｅｎｔａｃｌｅ ｐｒｏｂｅｓ）について記載されるように（Ｓａｔｔｅｒｆｉｅｌｄら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２００７，Ｖｏｌ．３５，Ｎｏ．１０ｅ７６）、捕捉領域および検出領域を含んでもよい。

いくつかの実施態様において、プローブは、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０ヌクレオチド、または約２５ヌクレオチド、約３０ヌクレオチド、約４０ヌクレオチド、約５０ヌクレオチド、約６０ヌクレオチド、約７０ヌクレオチド、約７５ヌクレオチド、約８０ヌクレオチド、約９０ヌクレオチド、約１００ヌクレオチド、約１１０ヌクレオチド、約１１５ヌクレオチド、約１２０ヌクレオチド、約１３０ヌクレオチド、約１４０ヌクレオチド、約１５０ヌクレオチド、約１７５ヌクレオチド、約１８７ヌクレオチド、約２００ヌクレオチド、約２２５ヌクレオチド、および約２５０ヌクレオチド、またはこの間のあらゆる整数を包含する。特定の好ましい実施態様において、直線（非ヘアピン）プローブは、約３０ヌクレオチド、より好ましくは約２０〜約２５ヌクレオチドを包含する。他の好ましい実施態様において、ヘアピン型分子標識プローブは、約４０〜５０ヌクレオチド、より好ましくは約２５〜約４０ヌクレオチドを包含する。

いくつかの実施態様において、プライマーおよび／またはプローブは、ＬＮＡである１以上の残基を含む。上述のように、ＬＮＡは増加された安定性および特異性を提供する。いくつかの実施態様において、プライマーおよび／またはプローブは、１以上のＬＮＡおよび１以上の分子標識の両方を含んでもよい。プライマーおよび／またはプローブがより高感度および特異的であるかどうかは、それが１以上の分子標識および／または１以上のＬＮＡを有する場合、各プライマーおよび／またはプローブを合成し、それらのそれぞれのＩＦＮ−アルファサブタイプを検出する能力についてそれらを試験することによって決定されてもよい。

本発明のプライマーおよびプローブの両方は、コンピューターで実行される方法を用いて設計され、その後商業的に入手可能な合成装置および試薬を用いて合成されてもよい。

いくつかの実施態様において、プライマーおよびプローブの複数のセットが提供される。例えば、２以上のＩＦＮサブタイプをコードする配列を増幅および検出するためのプライマーおよびプローブが提供されてもよい。１つの実施態様において、全てのＩＦＮ−アルファサブタイプ、またはその組み合わせをコードする配列を増幅および検出するためのプライマーおよびプローブが提供される。

本発明の他の側面において、プライマーは、二本鎖ＤＮＡに結合する薬剤（本明細書において「ＤＳ剤」と呼ぶ）と共に使用されてもよい。いくつかの実施態様において、ＤＳ剤は染料である。いくつかの実施態様において、プローブは、前記薬剤が二本鎖ＤＮＡを検出するであろうことからプローブを採用しなくてもよく、増幅産物はサイズによって分離され得る。従って、ＤＳ剤の組み合わせおよび特定のサイズの増幅産物は各ＩＦＮサブタイプを同定することが可能である。例えば、ＩＦＮ−アルファ１ｂに対する増幅産物は、約１０７塩基対、または約６９，５５０ダルトンのサイズを有する可能性があり；ＩＦＮ−アルファ５に対する増幅産物は、約１１３塩基対または約７３，４５０ダルトンのサイズを有する可能性があり；ＩＦＮ−アルファ１０に対する増幅産物は、約８９塩基対または約５７，８５０ダルトンのサイズを有する可能性があり；ＩＦＮ−アルファ１６の増幅産物は、約７９塩基対または約５１，３５０ダルトンのサイズを有する可能性があり；そして、ＩＦＮ−アルファ２１の増幅産物は、約１２５塩基対または約８１，２５０ダルトンのサイズを有する可能性がある。また、サイバーグリーンを包含するＤＳ剤は、検出プローブの代わりに定量的ＰＣＲアッセイにおいて使用されてもよく、直線増幅は次にｄｓＤＮＡ増幅標的に結合する染料の活性化によって測定される。

ＩＦＮ−アルファサブタイプに対するプライマー、プローブおよび阻害剤に対する配列の代表的な実施態様は、下図１に示される。例えば、フォワードおよびリバースプライマー対は、配列番号３０〜４３および配列番号４５〜５８からなる群より選択され得る。プローブは、配列番号５９〜７２からなる群より選択され得る。阻害剤は、配列番号４４、配列番号８８および配列番号８９からなる群より選択され得る。例えば、ＩＦＮ−アルファ５に対して、プライマーは、フォワードプライマー配列番号３５およびリバースプライマー配列番号５０を含んでもよく、プローブは配列番号６４を含んでもよい。他の例として、ＩＦＮ−アルファ２１に対して、プライマーはフォワード配列番号４３および配列番号５８を含んでもよく、プローブは配列番号７２を含んでもよい。さらに、ＩＦＮ−アルファ４ａ／ｂに対して、プライマーは、フォワードプライマー配列番号３２およびリバースプライマー配列番号４７を含んでもよく、プローブは配列番号６１を含んでもよく、阻害剤は配列番号４４を含んでもよい。

本発明の１つの側面において、プライマーおよび／またはプローブの様々なパラメーターを、ＩＦＮサブタイプをコードする配列の特異的増幅および検出におけるプライマーおよび／またはプローブの操作を増強するために調整してもよい。例えば、特に複数のＩＦＮサブタイプを伴う試料において、シグナルを増強するために、プローブ濃度に対するプライマーの比率を最適化してもよい。１つの実施態様において、３つの基準、すなわち感度、効率および特異性を、プライマー／プローブセットの質を決定するために使用してもよい。

感度は、単に検出され得る標的の最小分子数を指す。感度は、当業界に周知の技術、例えば、標準曲線を用いて試験反応を標準反応と比較したあらゆる技術によって測定されてもよい。

効率は、ＰＣＲの各サイクルのテンプレートに対する産物の実際の比率を指す。効率２．０が申し分ない。３０サイクルにおける効率１．９５対２．００間の相違は、反応の開始時に１コピーで、５×１０^８コピー対１．０７×１０^９コピーであり、すなわち、理想の５０％の感度である。いくつかの実施態様において、許容できる効率は少なくとも約１．８５である。いくつかの実施態様において、許容できる効率は少なくとも約１．９、少なくとも約１．９５、少なくとも約１．９８、約２．０、またはこの間のあらゆる効率である。下表１は、１開始コピーの目的のヌクレオチド配列（テンプレート）による反応と仮定した、２０および４０サイクルにおける代表的な効率を示す。

特異性は、いかなる他の類似の配列でもない、目的の配列のみの検出である。いくつかの実施態様において、許容できる特異性は、特異的および非特異的テンプレートを増幅するプライマー間における少なくとも９サイクル相違、または５１２倍の相違である。他の実施態様において、許容できる特異性は、特異的および非特異的テンプレート間の少なくとも８サイクル相違、少なくとも７サイクル相違、少なくとも６サイクル相違または少なくとも５サイクル相違である。特異性計測は、試料中の各ＩＦＮ−サブタイプの濃度に依存して変化し得る。例えば、特定のプライマーセットに対する特異性は、試料中のＩＦＮ−サブタイプ濃度が同等でない場合（例えば、臨床環境において）、増加または減少し得る。

いくつかの実施態様において、感度および特異性は、逆転写酵素反応の温度またはプライマー／プローブＴ_ｍに依存して変更され得る。一般に、温度は、特異性を高めるために上昇され、感度を高めるために下降される。加えて、塩濃度を、結合を最適化するために上昇または下降してもよく、感度を高めるために検出容量を減少させ、フィルターセットを最適化してもよい。

感度および特異性間の均衡が望ましい。いくつかの実施態様において、この均衡は、約４５℃〜約６０℃、より好ましくは約５０℃の温度で逆転写酵素反応を行うことによって達成される。また、他の実施態様において、均衡は、少なくとも５０℃〜６０℃、より好ましくは５５℃〜６０℃、そして最も好ましくは５８℃〜６０℃のプライマー伸長温度を有するプライマーを選択することによっても達成される。また、他の実施態様において、均衡は、異なる濃度のプライマーおよびプローブを使用することによっても達成される。いくつかの実施態様において、プライマー濃度は、約５０〜１０００ｎＭ、より好ましくは１００〜５００ｎＭの範囲に亘る。いくつかの実施態様において、プローブ濃度は、３５〜５００ｎＭ、より好ましくは５０〜２５０ｎＭの範囲に亘る。

本発明の他の側面において、ＩＦＮサブタイプをコードする配列を検出するためのアッセイキットが提供される。いくつかの実施態様において、キットは、共に、複数のＩＦＮサブタイプテンプレートを含む組成物からＩＦＮサブタイプをコードする少なくとも１つの配列の増幅を可能とするフォワードおよびリバースプライマーを提供する。いくつかの実施態様において、ＩＦＮサブタイプは、ＩＦＮ−アルファ１ｂ、ＩＦＮ−アルファ１ａ、ＩＦＮ−アルファ２ａ、ＩＦＮ−アルファ２ｂ、ＩＦＮ−アルファ４ａ、ＩＦＮ−アルファ４ｂ、ＩＦＮ−アルファ５、ＩＦＮ−アルファ６、ＩＦＮ−アルファ７、ＩＦＮ−アルファ８、ＩＦＮ−アルファ１０、ＩＦＮ−アルファ１４、ＩＦＮ−アルファ１６、ＩＦＮ−アルファ１７およびＩＦＮ−アルファ２１からなる群より選択されるＩＦＮ−アルファサブタイプである。他の実施態様において、アッセイキットは、これらの各ＩＦＮ−サブタイプに対するフォワードおよびリバースプライマーを提供し得る。

さらなる他の実施態様において、アッセイキットは、ＩＦＮサブタイプの様々な組み合わせに特異的な複数のプライマーセットを提供し得る。例えば、いくつかの実施態様において、アッセイキットは、少なくとも１個のＩＦＮ−サブタイプ、少なくとも２個のＩＦＮ−サブタイプ、少なくとも３個のＩＦＮ−サブタイプ、少なくとも４個のＩＦＮ−サブタイプ、少なくとも５個のＩＦＮ−サブタイプ、少なくとも６個のＩＦＮ−サブタイプ、少なくとも７個のＩＦＮ−サブタイプ、少なくとも８個のＩＦＮ−サブタイプ、少なくとも９個のＩＦＮ−サブタイプ、少なくとも１０個のＩＦＮ−サブタイプ、少なくとも１１個のＩＦＮ−サブタイプ、少なくとも１２個のＩＦＮ−サブタイプ、少なくとも１３個のＩＦＮ−サブタイプ、少なくとも１４個のＩＦＮ−サブタイプ、少なくとも１５個のＩＦＮ−サブタイプ、少なくとも１６個のＩＦＮ−サブタイプ、少なくとも１７個のＩＦＮ−サブタイプ、少なくとも２０個のＩＦＮ−サブタイプ、少なくとも３０個のＩＦＮ−サブタイプ、もしくはそれ以上、またはこの間のあらゆる整数に対して特異的なプライマーセットを提供してもよい。１つの実施態様において、アッセイキットは、ＩＦＮ−アルファ１ａ、ＩＦＮ−アルファ１ｂ、ＩＦＮ−アルファ２ａ、ＩＦＮ−アルファ２ｂ、ＩＦＮ−アルファ４ａまたはＩＦＮ−アルファ４ｂ等であるが、これらに限定されない、ＩＦＮサブタイプの単一対立遺伝子変異型をコードする配列に対して特異的なプライマーを提供し得る。当業者は、本発明の組成物、キットおよび方法は、現在公知または今後発見される、あらゆるＩＦＮサブタイプ対立遺伝子変異型に適用され得ることを認識するであろう。

さらなる他の実施態様において、アッセイキットは、マルチプレックス反応における使用のための複数のＩＦＮ−サブタイプに対するプライマーセットを包含する。そのようなキットは、単一の反応容器における１より多いＩＦＮ−サブタイプの特異的増幅を可能とし得る。いくつかの実施態様において、異なるＩＦＮ−サブタイプの増幅産物は、異なる染料もしくは標識、または異なる染料で標識化されたプローブもしくはＤＳ剤によって同定され得る。

特定の好ましい実施態様において、ＩＦＮサブタイプの組み合わせまたは全てのＩＦＮサブタイプに対する増幅反応試薬（すなわち、フォワードおよびリバースプライマー）を伴うアッセイキットは、感度、特異性および効率を保持しながら、全てのＩＦＮサブタイプ増幅に対するものと同一の反応条件を使用する。特定の好ましい実施態様において、キットは、全てのＩＦＮ−アルファサブタイプに対する同一の反応条件下において良好にはたらく増幅反応試薬を含んでもよい。

異なるプライマーセットの組み合わせは、特定の疾患タイプに関する検出、診断または処置に基づいて設計されてもよい。そのようなプライマーセットを含むアッセイキットは、例えば、癌、ウイルス感染または自己免疫疾患を有する被験者における疾患または障害の検出のために使用されてもよい。また、アッセイキットは、例えば、組織試料、細胞試料、体液、尿、血液、血清、血漿、白血球、単球、末梢白血球（ＰＢＬ）、リンパ液、唾液、脳脊髄液（ＣＳＦ）、関節液、気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬ）、心膜液、脊髄液、胸膜液、胸膜滲出液、粘液、母乳、羊水、膣液、精液、前立腺液、腹水（ａｓｃｉｔｅｓ）、腹水（ａｓｃｉｔｉｃ ｆｌｕｉｄ）、腹腔液、眼房水、硝子体液、涙、カタル性分泌液、汗、嚢胞液、胃酸および腫瘍組織試料における疾患または障害を検出するために使用されてもよい。

いくつかの実施態様において、アッセイキットは、１以上の阻害剤、プローブおよび／またはキットに提供されるＩＦＮサブタイププライマーに対応するＤＳ剤をさらに含んでもよい。

いくつかの実施態様において、アッセイキットは、１以上のコントロールを含んでもよい。コントロールは、公知の各ＩＦＮサブタイプの量の希釈を包含し得る。他の実施態様において、ネガティブコントロールは、プライマー／プローブに対応するＩＦＮサブタイプテンプレート配列を有さないプライマー／プローブ、ＩＦＮを発現しない種、またはあらゆるテンプレート配列とも顕著に異なる配列を有するＩＦＮを発現する種由来の細胞からのｃＤＮＡ、サーモン精子ＤＮＡ等を含んでもよい。他の実施態様において、ポジティブコントロールは、目的のＩＦＮサブタイプ、または複数もしくは全てのＩＦＮサブタイプを産生するために過剰に刺激されたヒト細胞由来のｃＤＮＡを含んでもよい。

いくつかの実施態様において、アッセイキットは、ＰＣＲ反応を通して作製されたＩＦＮサブタイプのコピー数の定量のための各ＩＦＮサブタイプに対するｃＤＮＡを用い、標準曲線を作製するための１以上の試薬を含んでもよい。この標準曲線の型は、作製される分子数が定量されることを可能にする。他の実施態様において、アッセイキットは、使用される場合、標準曲線の自動計算のためのスプレッドシートテンプレート等、ならびにｃＤＮＡテンプレートの濃縮物およびハウスキーピング遺伝子（ＨＫＧ）を包含してもよい。

いくつかの実施態様において、フォワードまたはリバースプライマーの各セットまたは組み合わせは、コンテナーに包装される。コンテナーは、様々な形状、材料および配置を包含し得る。例えば、マルチウェルプレート、またはいくつかのスピンチューブが利用され得る。他の実施態様において、チップ上のラボ等の複数のウェルまたはマイクロフルイディックス装置を有するカートリッジを採用してもよい。複数のウェルまたは反応領域を有する他のコンテナーは、当業者に公知であり、本明細書に記載される本発明と共に容易に採用され得る。

いくつかの実施態様において、アッセイキットは、試料中の１以上のサブタイプをコードする配列を検出するための方法を実行するための指示書をさらに包含する。前記方法の代表的な工程は以下に記載される。指示書は、試料からの核酸の単離および精製の説明をさらに包含してもよい。キットは、標準曲線を用いた試料中のサブタイプの量を定量するための指示書をさらに包含してもよい。

１つの実施態様において、キットは、ＩＦＮ−アルファの全１３サブタイプの包括的、高感度および特異的解析を可能とするように提供される。このアッセイキット（他のＩＦＮサブタイプに対する類似のキットと同様）について多くの可能性のある適用が存在し、それは、感染性および自己免疫疾患、ならびに癌免疫における具体的なサブタイプに対する病原性または保護の役割を明らかにすることを包含する。最も重要なことには、このキットに対する可能性のある臨床適用は、慢性感染症、自己免疫疾患もしくは癌の臨床的な進行または緩和をモニターすること、またはこれらの疾患の治療に対する反応を測定するため、臨床治験におけるワクチン有効性の代理マーカーとしてのその使用を包含する。また、キットは、これらの疾患のいずれかを伴うどの患者が、それらを改善するために用いられる治療的手段に対して難治性であり得るかを明らかにし得る。

従って、本発明の他の側面において、１以上のＩＦＮサブタイプをコードする配列を検出する方法が提供される。前記方法は、本明細書に開示されるプライマーまたはキットを使用してもよい。１つの実施態様において、前記方法は、ＩＦＮサブタイプのＤＮＡまたはＲＮＡを含有する試料を、増幅に好適な条件下でフォワードおよびリバースプライマーセットと接触させ、増幅産物を検出することを含む。増幅産物の存在は、試料が目的のＩＦＮサブタイプをコードする配列を含有した事を示す。

本発明の方法およびアッセイキットは、例えば、ＩＦＮ−アルファまたはＩＦＮ−ラムダ２もしくは−ラムダ３等のあらゆるＩＦＮサブタイプをコードする配列を検出するために使用され得る。特定の好ましい実施態様において、前記方法は、ＩＦＮ−アルファサブタイプの選択を検出するために使用される。他の実施態様において、サブタイプの組み合わせは、ＩＦＮ−アルファ、ＩＦＮ−ラムダ（すなわち、ＩＦＮ−ラムダ２および−ラムダ３）、およびこれらの組み合わせ等の様々なＩＦＮから検出され得る。多くのＩＦＮサブタイプに対する核酸配列が公知であり、ＩＦＮ−ベータ（アクセッション番号：ＮＭ＿００２１７６．２）、ＩＦＮ−ガンマ（アクセッション番号：ＮＭ＿０００６１９．２）、ＩＦＮ−ラムダ１（ＩＬ−２９（アクセッション番号：ＢＣ０７４９８５）、ＩＦＮ−ラムダ２（ＩＬ−２８Ａアクセッション番号：ＮＭ＿１７２１３８．１）およびＩＦＮ−ラムダ３（ＩＬ−２８Ｂアクセッション番号：ＮＭ＿１７２１３９．２）等がある。例えば、Ｄｏｎｎｅｌｌｙら，Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃ．Ｂｉｏｌ．７６：３１４−３２１（２００４）およびＰｅｓｔｋａら，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．２０２：８−３２（２００４）を参照。

ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、対立遺伝子特異的ＰＣＲ、ネステッドＰＣＲ、細胞クローニングまたは当業者に公知の他のタイプの増幅を包含する、あらゆるタイプの増幅反応を使用してもよい。いくつかの実施態様において、試料がＲＮＡを含む場合等、ＲＴ−ＰＣＲは以下の２工程、すなわち逆転写（ＲＴ）反応および増幅反応（ＰＣＲ）を含む。他の実施態様において、試料がＤＮＡを含有する場合等、増幅工程（ＰＣＲ）のみが必要とされる。いくつかの実施態様において、増幅サイクルの数は、少なくとも１０サイクル、少なくとも１５サイクル、少なくとも２０サイクル、少なくとも２５サイクル、少なくとも３０サイクル、少なくとも３５サイクル、少なくとも４０サイクル、少なくとも４５サイクル、またはこの間のあらゆる整数である。

また、本発明の方法は、目的のＩＦＮサブタイプの存在を同定するため、任意に、試料または増幅産物と目的のＩＦＮサブタイプに対応するプローブおよび／またはＤＳ剤とを接触させることを含んでもよい。いくつかの実施態様において、増幅産物の検出は、採用された検出可能な標識のタイプ、およびプローブが採用されるかどうかに依存する。プローブが採用される場合、検出は、分子標識技術、またはビオチンまたはアプタマー等の親和性に基づく分子の結合に基づいてもよい。また、蛍光染料等の染料は、標準的な光学方法を用いて検出され得る。他の実施態様において、増幅産物は、ゲル上で分離され、異なるサイズの産物が検出され得る。

試料中に発現されるＩＦＮサブタイプの量は、公知のＩＦＮサブタイプの量により標準曲線を用いて測定され得る。また、ゲルのデンシトメトリートレーシング（ｄｅｎｓｉｔｏｍｅｔｒｙ ｔｒａｃｉｎｇ）を使用してもよい。また、いくつかの実施態様において、ＩＦＮサブタイプの量は、試験される試料に共通の標準的なハウスキーピング遺伝子（ＨＫＧ）を用いて測定されてもよい。特定の好ましい実施態様において、ＩＦＮサブタイプ発現は、ｃＤＮＡテンプレートの標準曲線の機能として定量されてもよい。この「絶対的濃度」は、相対量を示すよりも、目的のテンプレートの実際の分子数が測定されるのを可能とすることから、ＩＦＮ−アルファサブタイプの定量性のより意味のある解釈を生じる。

いくつかの実施態様において、アッセイキットの使用における精度向上のためにロボット工学を使用してもよい。当業者は、自動的に試薬を分配する液体ハンドラー等のロボット工学を熟知しており、従って、ヒューマンエラーの可能性を低減する。１つの実施態様において、そのような方法は、例えば感度における顕著な喪失を伴うことなくわずか５μｌまで全体的な反応用量を低減させることも可能である。

１つの実施態様において、前記方法は、症状の診断、または被験者における症状もしくは症状に対する易罹患性を検出するために有用な可能性がある。症状は、例えば、癌、ウイルス感染、炎症および自己免疫症状を包含する。ウイルス感染は、Ａ型、Ｂ型およびＣ型肝炎、エボラ、デング熱、ＨＩＶ、ＨＰＶ、ヘルペス等を包含し得る。自己免疫症状は、全身性紅斑性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、関節リウマチ、シェーグレン、乾癬、多発性硬化症等を包含する。炎症性症状は、潰瘍性大腸炎等の過敏性大腸症状、および癌、ウイルス感染または自己免疫疾患を伴うクローン病を包含する。これらの方法は、試料に対するＩＦＮサブタイプの遺伝子発現プロファイルを作製し、試料の遺伝子発現プロファイルと、疾患と関連する１以上の公知のＩＦＮサブタイプの遺伝子発現プロファイルとを比較することをさらに包含してもよい。試料の発現プロファイルは、試料中の疾患の存在を示すために、公知の発現プロファイルと相互に関連づけてもよい。

関連する実施態様において、前記方法は、罹患した組織または罹患した細胞の領域を、それらのＩＦＮサブタイプ発現パターンによって同定するために有用な可能性がある。そのような実施態様において、前記方法は、各試料由来の発現パターンが比較され、罹患した領域が同定され得るように、細胞または組織の異なる領域を含む複数の試料により行われてもよい。これは、全身性でない症状の処置に有益であり、むしろ組織の具体的な領域に影響するであろう。そのような症状の例は、皮膚ループスおよび皮膚筋炎であり、それぞれ、上皮および筋肉組織の領域に影響する。いくつかの実施態様において、前記方法は、組織または細胞中の病原体感染部位を決定するために使用されてもよい。病原体は、影響を受けた領域におけるＩＦＮサブタイプの発現レベルを上昇させる可能性があり、または、条件によっては、病原体がＩＦＮ発現を阻害する可能性がある。

他の実施態様において、前記方法は、局所的なＩＦＮサブタイプ発現パターンが表現形において役割を果たす条件の存在を検出または確認するために有用な可能性がある。

他の実施態様において、前記方法は、異なるＩＦＮサブタイプの遺伝子発現プロファイルによって特徴づけられる症状に対する治療効果をモニターするために有用な可能性がある。より具体的な実施態様は、免疫調節薬の効果を評価するための方法を提供する。有効性は、疾患進行の異なる段階または治療における公知のＩＦＮ発現パターンとの相互関係によって評価され得る。従って、標準的な治療インデックスを作製してもよく、薬剤または治療の有効性をモニターまたは評価するために、試料結果をインデックスと相互に関連づけてもよい。これらの方法により使用され得る疾患は、例えば、癌、ウイルス感染、炎症および自己免疫症状を包含する。ウイルス感染は、Ａ型、Ｂ型およびＣ型肝炎、エボラ、デング熱、ＨＩＶ、ＨＰＶ、ヘルペス等を包含する。自己免疫疾患は、ＳＬＥ、関節リウマチ、シェーグレン、乾癬、多発性硬化症等を包含する。炎症性症状は、例えば、潰瘍性大腸炎およびクローン病等の過敏性大腸症状を包含する。１つの実施態様において、試料を、一連の治療の間にＩＦＮサブタイププロファイルが変化するかどうかを測定するために処置の間定期的に患者から採取してもよい。

他の実施態様において、前記方法は、ワクチン、特にウイルス感染に対するワクチンの有効性をモニターするために有用な可能性がある。ウイルス感染は、Ａ型、Ｂ型およびＣ型肝炎、エボラ、デング熱、ＨＩＶ、ＨＰＶ、ヘルペス等を包含する。一連の免疫反応の進展の間にＩＦＮサブタイププロファイルが変化するかどうかを測定するためにワクチン接種後に患者から定期的に試料を採取してもよい。

被験者由来の試料は、例えば、組織試料、細胞試料、体液、尿、血液、血清、血漿、白血球、単球、末梢白血球（ＰＢＬ）、リンパ液、唾液、脳脊髄液（ＣＳＦ）、関節液、気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬ）、心膜液、脊髄液、胸膜液、胸膜滲出液、粘液、母乳、羊水、膣液、精液、前立腺液、腹水（ａｓｃｉｔｅｓ）、腹水（ａｓｃｉｔｉｃ ｆｌｕｉｄ）、腹腔液、眼房水、硝子体液、涙、カタル性分泌液、汗、嚢胞液、胃酸および腫瘍組織試料を包含し得る。いくつかの実施態様において、標準的な方法を用いて増幅用に核酸を抽出および精製するため、試料を本発明のプライマーと接触させる前に処理してもよい。

本発明の他の側面において、ＩＦＮサブタイプに対するプライマーを設計する方法が提供される。ＩＦＮ−アルファサブタイププライマー設計を代表的な実施態様として使用し、各ＩＦＮ−アルファサブタイプの第１コーディング配列を決定するために整列してもよく、各サブタイプのその部分はそのサブタイプに独特であって、他のいかなるサブタイプにも見出されない。ＩＦＮサブタイプの特異配列を同定し、可能性のあるプライマー対を作製することを援助するためにコンピューターソフトウェアを使用してもよいが、一方で、プライマー対が実際に実験的に機能するかどうかは予測できない。特に、ｉｎ ｓｉｌｉｃｏでのプライマー設計は、適切なプライマー感度および特異性を選択することができない。従って、本発明の実施態様は、プライマーセットが機能的であることを実験的に確認することを包含する。さらなる実施態様は、実験を通してプライマーセットを最適化することを包含する。これらの工程のいずれもが、ｉｎ ｓｉｌｉｃｏで正確に行われてもよい。

１つの実施態様において、可能性のあるプライマー対は、標的ＩＦＮサブタイプ（目的のＩＦＮサブタイプ）をコードする少量の配列への感度について最初に試験されてもよい。特定の好ましい実施態様において、１反応あたり少なくとも約１〜１０コピーの目的のＩＦＮサブタイプの逆転写されたｃＤＮＡを検出するために十分な感度を有するプライマー対が、さらなる試験のために選択される。

満足な感度を有するプライマー対は、その後、（類似の配列を有する他のＩＦＮサブタイプに対立する）具体的な標的ＩＦＮサブタイプ配列への特異性に関して試験されてもよい。いくつかの実施態様において、プライマー配列は、特異性を増強するため、特異配列に関して５’または３’へシフトされてもよい。他の実施態様において、ＬＮＡプローブは、標的ＩＦＮサブタイプ配列に対する特異性を増強するために使用されてもよい。ＬＮＡプローブは、競合するＩＦＮサブタイプｃＤＮＡを選択的に阻止するように設計されてもよい。このブロッキングＬＮＡオリゴを具体的なＩＦＮサブタイプに対する反応混合物へ組み込むことは、望ましくないｃＤＮＡへのＬＮＡの選択的な結合を結果として生じ、従って、効率的にプライマー対によって増幅されるその能力を阻止する一方、目的のＩＦＮサブタイプに対する望ましい特異性を可能とする。いくつかの実施態様において、特異的および非特異的テンプレートの増幅間の少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７または少なくとも８サイクルの相違の特異性を有するプライマー対がさらなる試験のために選択される。特定の好ましい実施態様において、特異的および非特異的増幅間の少なくとも約９増幅サイクル以上の相違の特異性（これは、増幅されるオンターゲット（ｏｎ−ｔａｒｇｅｔ）およびオフターゲット（ｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔ）テンプレート間の約５００倍の相違に対応する）を有するプライマー対が、さらなる試験のために選択される。いくつかの実施態様において、二次的な実験は、選択されたプライマー対の感度および特異性プロファイルを最適化するために行われてもよい。特異的および非特異的テンプレートを増幅するプライマー間の少なくとも９サイクルの相違。

次に、満足な感度および特異性を有するプライマー対は、その後、効率について試験されてもよい。特定の好ましい実施態様において、少なくとも約１．９０、より好ましくは少なくとも約１．９５の効率を有するプライマー対が選択される。１つの実施態様において、プライマー対の効率は、もともと選択されたプライマー対と同様に、分子標識および／またはＬＮＡを含有するように修飾されたプライマー対を並行比較（ｓｉｄｅ ｂｙ ｓｉｄｅ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ）において試験することにより試験され得る。そのような実験は、標的サブタイプに対するプライマー対の感度を最適化するために標的ＩＦＮサブタイプ配列、オリゴおよび反応成分の広範な滴定（ｔｉｔｒａｔｉｏｎ）を包含し得る一方、最適な特異性を生じるために、他のサブタイプから最も大規模な分離（すなわち、Ｃｔ値）を同時につくりだしてもよい。

他の実施態様において、さらなるプライマー設計は、融点、ＧＣ含量および長さ等の基準について最適化することを包含する。プライマーは、改善された安定性および二本鎖形成のために提供される修飾された塩基を組み込んでもよい。いくつかの実施態様において、５０℃〜６０℃、より好ましくは５５℃〜６０℃、そして最も好ましくは５８℃〜６０℃の範囲のプライマー伸長温度を有するプライマーが設計され、選択される。当業者は、本発明の範囲および精神内にある限り、様々な成分の追加またはシフト、プライマーがハイブリダイズするＩＦＮサブタイプの長さの伸長または短縮等の様々な修飾をプライマーに施してもよいことを認識するであろう。

特定の好ましい実施態様において、プライマー対は、同一ＰＣＲ反応条件下でそれらの所望の特徴を維持する各ＩＦＮサブタイプをコードする配列に対するプライマー対を得るために、さらに試験され、最適化されてもよい。同一反応条件下で一貫して良好にはたらくプライマーの選択は、様々なＩＦＮサブタイプをコードする配列の増幅用のプライマーパネルを、全てのＩＦＮ−アルファサブタイプを含むパネルアッセイ等の１つのＩＦＮサブタイプパネルアッセイにおいて同時に使用されることを可能とする。特定の好ましい実施態様において、ＰＣＲ反応条件は、ステージ１：５０℃で２分間；ステージ２：９５℃で３分間；ステージ３：９５℃で１５秒間の後５９℃で１分間を、４０反復であってもよい。

本発明の他の側面において、プライマー設計、プローブ、アッセイキットおよびそれらの使用方法のために採用される主要（ｐｒｉｎｃｉｐａｌｓ）は、体内で生じる、異なった、高度に関連するサブタイプに対する他の生物学的分子に適用されてもよい。当業者は、そのような分子は、対立遺伝子変異型（ＭＨＣクラスＩおよびＩＩ変異体）または高い配列同一性を有するウイルス株を包含するが、これらに限定されないことを理解するであろう。

実施例１：ＩＦＮサブタイプに対するプライマーの設計および試験
ＩＦＮ−アルファ配列
ＩＦＮアルファ遺伝子型の配列、および２つのアロタイプ変異体を、国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）Ｅｎｔｒｅｚヌクレオチドデータベースのウェブサイト（ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｓｉｔｅｓ）から得た。上記に説明したように、ＩＦＮ−アルファ遺伝子型に対する２組の命名法が存在し、いずれも体系的または直観的でない。表２は、ＩＦＮ−アルファ遺伝子型の命名法と共に、ＤＮＡおよび未成熟タンパク質に対するアクセッション番号およびＧＩ番号を示す。表２は、さらに、通常使用される２組の命名法（「名称１」および「名称２」）、ならびに本明細書で使用されるセット（「名称３」）を、遺伝子型のアクセッション番号と共に示す。

表３は、ＩＦＮ−アルファサブタイプに関する配列アラインメントおよびヌクレオチド配列を示す。表に示されるように、成熟ＩＦＮ−アルファサブタイプタンパク質に対する配列をコードする遺伝子は、配列相同性に対する識別子（すなわち、コンセンサスに対して通常のフォント；特異な非コンセンサスコドンに対して小さい大文字；共有される非コンセンサスコドンに対して太字および下線；ならびに１つのサブタイプに特異なコドングループに対して太字およびイタリック体）を伴うコドンによって整列された。加えて、太字のヌクレオチドは、複数のＩＦＮアルファサブタイプに特異的な可能性のあるフォワードプライマーと同定され、イタリック体ヌクレオチドは複数のＩＦＮアルファサブタイプに対する可能性のあるプローブと同定された。表４において、成熟タンパク質配列は、表３の遺伝子コーディング配列に対して提示される。

下表４は、ＩＦＮ−アルファサブタイプに対する成熟タンパク質配列を示す。

ＩＦＮ−ラムダ配列
下表５は、ＩＦＮ−ラムダサブタイプに対するヌクレオチド配列および配列アラインメントを示す。太字および下線配列は、特異な非コンセンサスコドンを表わす。

プライマー／プローブセットの設計および合成
遺伝子型およびアロタイプ変異体に対する配列は、ビーコンデザイナー（Ｂｅａｃｏｎ
Ｄｓｉｇｎｅｒ）（バージョン５−７．２，Ｐｒｅｍｉｅｒ Ｂｉｏｓｏｆｔ，パロアルト，カリフォルニア州）に搭載され、各サブタイプにおける特異配列を標的とするためにＭＢおよびＬＮＡプライマー／プローブセットを照会した。各サブタイプはＬＮＡおよび／またはＭＢプライマー／プローブセットを作製した。両方の型のセットが作製された場合、両方ともが合成され、いずれがより良好な成果を呈したかを測定するために試験された。これらの初期スクリーニングの後、標的サブタイプに対する選択性を測定するために二次的な実験を行った。オリゴ配列を、その後、それらの感度／選択性プロファイルを最適化するために編集した。また、オリゴ配列を、ＰＣＲ条件を説明する（ａｃｃｏｕｎｔ ｆｏｒ）ため、そして同一のＰＣＲ条件下で良好に実行することが可能な各ＩＦＮ−アルファサブタイプに対するプライマーを特異的に得て、従ってＩＦＮ−アルファサブタイプパネルアッセイにおいて使用されるように編集した。場合によって、プライマーまたはプローブ配列は、特異性を増強するために特異なコドン配列へ５’から３’へシフトされた。１つのセットについて（ここで、非特異的結合が生じる）、プライマー／プローブ特異性は、誤って増幅されたサブタイプへのプライマーまたはプローブのアニーリングを阻止するためのＬＮＡオリゴマー阻害剤によって増強された。この特異的なサブタイプに対するこのブロッキングオリゴの反応混合物への組み込みは、望ましくないｃＤＮＡへのＬＮＡの選択的結合を結果として生じ、オリゴセットによって増幅されるその能力を効果的に阻害した。これは、標的サブタイプに対する望ましい選択性を結果として生じた。

望ましい標的配列が同定された後、並行比較における分子標識およびＬＮＡオリゴの設計および試験によってそれらの全体的な効率を比較するさらなる研究が行われた。これは、標的サブタイプへの選択性を最適化するための標的配列、オリゴおよび反応構成成分の滴定を含む一方、最適な選択性を結果として生じるための他のサブタイプからの最大分離（サイクルカウント値）をつくりだした。プライマー、プローブおよびＩＦＮ−アルファサブタイプＬＮＡ阻害剤に対する配列は、図１に示される。

プライマーは、ＭｅｒＭａｄｅ６（Ｂｉｏａｕｔｏｍａｔｉｏｎ Ｃｏｒｐ，プラノ テキサス州）合成装置上で合成された。ＭＢプローブは、３９４ＤＮＡ／ＲＮＡ合成装置（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，フォスターシティー，カリフォルニア州）上で合成され、５’レポーターにおいて６−カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）で標識され、３’クエンチャーにおいて６−カルボキシテトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）で標識された。プライマーおよびＦＡＭ／ＴＡＭＲＡ改変ＭＢは、米国食品医薬品局における生物学的製剤評価センターのバイオテクノロジー研究機関において合成された。ＬＮＡプローブおよび阻害剤オリゴマーは、Ｓｉｇｍａ Ｐｒｏｌｉｇｏ（セントルイス，ミズーリ州）またはＥｕｒｏｇｅｎｔｅｃ Ｎｏｒｔｈ Ａｍｅｒｉｃａ（サンディエゴ，カリフォルニア州）のいずれかによって合成された。

プライマー／プローブセットの試験用テンプレート
各ＩＦＮ−アルファ遺伝子テンプレートの微生物プラスミド発現ベクターから切り取られた各ＩＦＮ−アルファ遺伝子テンプレートに対するＤＮＡは、Ｐｅｓｔｋａ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．（ピスカタウェイ，ニュージャージー州）によって精製され、Ｑｕａｎｔ−ＩＴ Ｐｉｃｏ Ｇｒｅｅｎ ｄｓＤＮＡアッセイキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，カールスバッド，カリフォルニア州）を用いて定量された。

各アルファサブタイプに対してｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて合成されたＲＮＡは、Ｐｅｓｔｋａ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．によって提供された。４つの細胞株は、２．５マイクログラムのコントロール空プラスミドまたは発現プラスミドのいずれかによって形質移入され、各々はＩＦＮ−アルファサブタイプに対するコーディング配列を含有する。全細胞ＲＮＡは、ＲＮＡｅａｓｙスピンカラム（Ｑｉａｇｅｎ，ジャーマンタウン，メリーランド州）を用いて単離され、染色体ＤＮＡはＲＮＡの逆転写の前にＤＮＡｓｅにより消化された。

１本鎖ｃＤＮＡの作製
１本鎖ｃＤＮＡは、最終反応容量２０マイクロリットル（μｌ）について、製造者の指示書に従ってＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてｉｎ ｖｉｔｒｏ転写ＲＮＡまたは形質移入された細胞からの全ＲＮＡのいずれかから作製された。

リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）
精製されたＤＮＡテンプレートを、プライマー／プローブセットの感度を試験するために使用した。ＴａｑＭａｎ Ｆａｓｔ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を、最終反応容量２０μｌを達成するために使用した。プローブ濃度を１００ｎＭで一定にして、フォワードおよびリバースプライマー濃度を１００ｎＭ〜５００ｎＭに変化させ、５×５チェッカーボードアッセイによって最適プライマー濃度を決定した。次に、最適プローブ濃度を、固定化された最適プライマー濃度のもと、２５０ｎＭ〜１５．６ｎＭに亘って滴定することによって決定した。

ＲＴ−ＰＣＲを、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ７９００ＨＴ Ｆａｓｔ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍを用いて行った。ＰＣＲプロトコルは、５０℃で２分間を１サイクルで開始し、９５℃で１０分間を１サイクル、その後４０サイクルの増幅（各々は１５秒の変性（９５℃）からなる）および１分間の伸長からなった。各プライマー／プローブセットの伸長温度は、全てのプライマー／プローブセットが同時に使用され得る共通の温度に関する試験の前に、Ｂｅａｃｏｎ Ｄｓｉｇｎｅｒによって最初に手引きされた。

結果
プライマー／プローブ配列設計および試験
ＭＢプライマー／プローブセットは、全てのサブタイプについて作製され、ＬＮＡプライマー／プローブセットはＩＦＮ−アルファ７およびＩＦＮ−アルファ２１以外の全てについて作製された。最適なプライマー／プローブ濃度を決定した後、各セットを、開始濃度１０．０ｐＭテンプレートにより、精製された連続的な１０倍ＩＦＮアルファサブタイプテンプレート希釈系列に対して３回（ｉｎ ｔｒｉｐｌｉｃａｔｅ）試験した（図２）。Ｃｔ値（標的配列の蛍光シグナルが閾値を超えて上昇するＰＣＲサイクルカウント）に対するテンプレート濃度をプロットした後、ＰＣＲ感度は、バックグラウンドに対して信頼できるシグナルを与えた開始反応におけるテンプレートの分子数を計算することによって決定された。場合によって、定量的感度（すなわち、開始反応において存在する分子数）は、定性的感度（すなわち、テンプレートの存在または非存在）の１または２希釈未満であった。ＩＦＮ−アルファプライマーに対するＰＣＲ感度は、典型的に、１反応あたりテンプレートの１〜１０分子の間であった（図２）。

ＰＣＲ効率（完全効率＝２．０増幅産物／テンプレート／サイクル）を、下記一般式によって決定した：
効率＝［１０^{（−１／ｓｌｏｐｅ）}］
図２は、各ＩＦＮ−アルファサブタイプのＰＣＲ反応に対する効率計算を示す。一般に、ＬＮＡセットは、ＭＢセットよりもより感度が高く効率的であった。

特異性は、１．０ｐＭの各ＩＦＮ−アルファサブタイプｃＤＮＡでプライマー／プローブセットを試験することにより決定された（図３）。プライマー／プローブセットは、少なくとも９サイクル（すなわち、シグナルにおいて５１２倍の相違）によって標的配列および非特異的配列が分離された場合、特異的とみなされた。特異性が不適切であった場合、プライマー／プローブセットは再設計されるか、または非特異的標的配列に相補的なＬＮＡオリゴマー阻害剤が設計された。プライマー／プローブセットに特異的なテンプレートは、一貫して最も早く増幅した。ＩＦＮ−アルファサブタイプのＰＣＲ反応は、典型的に、標的および非標的アイソフォーム間の約１０サイクル（１，０００倍）の識別を有した（図３）。

感度、特異性および効率は、ＩＦＮ−アルファサブタイププライマーセットについて上記されたように、ＩＦＮ−ラムダサブタイププライマーセットについて決定された。各ＩＦＮ−ラムダプライマー／プローブセットの効率は、図４の最上段のグラフの左下隅に示される。特異性は、図４の下段に示される。特異性は、図４のグラフの下段に示される。各グラフにおいて、左への曲線は、プライマー／プローブセットに対して特異的なＩＦＮ−ラムダテンプレートの増幅を表わし、バーおよび数は最も非特異的に増幅されたテンプレートのサイクル数を示す。これらの実験において試験されたＩＦＮ−アルファ４テンプレートは、対立遺伝子変異型ＩＦＮ−アルファ４ｂであった。図４に示されるように、ＩＦＮ−ラムダプライマー／プローブセットは、この実験における他の試験されたいずれのテンプレートよりもＩＦＮ−アルファ４ｂに対して特異性が低かった。しかしながら、その後の実験は、ＩＦＮ−アルファ４ｂテンプレートが存在しても、ＩＦＮラムダ１に対して高い特異性を呈した（データ非表示）。両方のテンプレートは、各テンプレートに対して１０ｆＭの開始濃度でＩＦＮ−ラムダ１を検出するためのプライマー／プローブセットを用いて増幅された。図５は、ＩＦＮ−ラムダ１の増幅を左への曲線において示す。バーおよび数は、非特異的に増幅されたＩＦＮ−アルファ４ｂテンプレートと、特異的に増幅されたＩＦＮ−ラムダ１間の分離を示す。

各プライマー／プローブセットの感度および特異性は、Ｂｅａｃｏｎ Ｄｅｓｉｇｎｅｒソフトウェアによって決定される、その「最適」温度において測定された。全てのセットの特異性および感度は、サブタイプの完全なセットが１つのプレート上で同時に計測され得る単一の温度を同定するため、５２℃〜５９．５℃の範囲の一連のＰＣＲ伸長温度において試験された。表６は、「最適」温度における感度および特異性を５８．５℃と比較し、ソフトウェアによって決定された「最適」温度と比較し、５８．５℃のＰＣＲ伸長温度において感度および特異性が典型的に向上したことを立証する。従って、５８．５℃は、全てのアルファプライマー／プローブセットの同時試験用の共通温度として指定された。

ＩＦＮ−アルファおよびラムダのサブタイプの解析用の３８４ウェル反応プレートの代表的なレイアウトが、図６に示される。

ＭＢプライマー／プローブセットが設計され、ＩＦＮ−アルファ４のアロタイプ変異体間を識別するために試験された（図７）。ＩＦＮ−アルファ４ａプライマー／プローブセットは、ＩＦＮ−アルファ４ａｃＤＮＡを増幅したが、ＩＦＮ−アルファ４ｂｃＤＮＡを増幅しなかった。逆に、ＩＦＮ−ａ４ｂプライマー／プローブセットは、ＩＦＮ−アルファ４ｂｃＤＮＡを増幅したが、ＩＦＮ−アルファ４ａｃＤＮＡを増幅しなかった。ＩＦＮ−アルファ４の対立遺伝子変異型に対するプローブはＭＢであり、一方、ＩＦＮ−アルファ４ａのいずれかの変異型を検出するプローブはＬＮＡである。従って、ＩＦＮ−アルファ４ａセットは、首尾よくＩＦＮ−アルファ４ａを検出したが、ＩＦＮ−アルファ４ｂを検出せず、ＩＦＮ−アルファ４ｂセットは逆にＩＦＮ−アルファ４ｂを検出したが、ＩＦＮ−アルファ４ａを検出しなかった。

ｉｎ ｖｉｔｒｏで転写されたＲＮＡ、および全細胞ＲＮＡからのｃＤＮＡの合成
ＩＦＮ−アルファメッセンジャーＲＮＡ転写物の３’非翻訳領域における二次構造が逆転写を障害し得ることから、逆転写反応は、インプットとして形質移入された細胞株ＲＮＡを用いて５０℃または５５℃のいずれかにおいて行われた。より高い反応温度は二次構造を解明すると期待されたが、そのＩＦＮ−アルファプライマー／プローブセットを用いた、結果として生じたｃＤＮＡの照合は、ＩＦＮ−アルファサブタイプのＲＴ−ＰＣＲ増幅はわずかに早く、逆転写反応が５０℃であった場合により一貫性があったことを示した（データ非表示）。従って、５０℃の温度は、逆転写インキュベーション温度として指定された。

最後に、ＩＦＮ−アルファプライマー／プローブセットの特異性は、形質移入細胞株ＲＮＡ試料について試験された。４つの細胞株（図の上を横切って示される）を、単一のＩＦＮ−アルファサブタイプ（左の垂直軸を横切って示される）をコードするプラスミドによって形質移入した。従って、対応するＩＦＮ−アルファプライマー／プローブセットはシグナルを生じるはずであり、一方で他のセットは生じないはずである。全ＲＮＡを細胞株から抽出した。ＩＦＮ−アルファプローブ／プライマーセットに対応するｃＤＮＡを発現する細胞試料は、一貫して最も早く増幅した。特異的なテンプレートの増幅と最も高い非特異的シグナル間の間隔（サイクルにおける）は、水平バーの下に示される。従って、図８は、形質移入された細胞由来の逆転写ｍＲＮＡに対するプライマー／プローブセットを試験する場合、特異性が維持されたことを示す。

実施例２．初代（ｐｒｉｍａｒｙ）単球、Ｂ細胞、樹状細胞（ＤＣ）ならびにＤＣ由来単球（ＭＤＤＣ）およびマクロファージ（ＭＤＭ）によるＩＦＮの示差発現
ＩＦＮサブタイプの発現が異なる細胞型間で変化するかどうかを試験するため、本発明のプライマーを、ＴＬＲ３のリガンド（ｐｏｌｙＩ：Ｃ）、４（ＬＰＳ）、７（イミキモド）および９（ＣｐＧ）に反応するＩＦＮ−アルファ、ＩＦＮ−ラムダ、ＩＦＮ−ベータおよびＩＦＮ−ガンマの発現パターンを決定するために使用した。ＬＰＳ（Ｅ．ｃｏｌｉ
Ｏ１１１：Ｂ４）、イミキモドおよびｐｏｌｙ Ｉ：Ｃは、ＥＭＤ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（ギブスタウン，ニュージャージー州）から入手した。ＣｐＧ型Ｄ３５、ＫおよびＣ、ならびにコントロールＤ３５ ＧｐＣオリゴヌクレオチドは、米国食品医薬品局における生物学的製剤評価センターのバイオテクノロジー研究機関により合成された。Ｄ３５ ＣｐＧおよびコントロールＧｐＣの両方について、５’および３’末端における２塩基は、ヌクレアーゼ耐性ホスホロチオエート結合を有した。

ヒト末梢血単球、骨髄ＤＣ（ｍＤＣ）、形質細胞様ＤＣ（ｐＤＣ）およびＢ細胞を単離した。浄化された単球およびリンパ球を、ＮＩＨ臨床センター輸血医学部門（ベセスダ，メリーランド州）から得て、その製剤をＦｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，セントルイス，ミズーリ州）密度遠心分離に供した。単球、ｍＤＣおよびｐＤＣを、ＡｕｔｏＭＡＣＳ磁気セルソーター（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ，オーバーン，カリフォルニア州）を用いて、それぞれ、ＣＤ１４、ＣＤ１ｃおよびＣＤ３０３に特異的な磁気ビーズによって精製した。Ｂ細胞を、二機能性抗体（ＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐ，Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｉｅｓ，バンクーバー，ブリティッシュコロンビア州）およびＦｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ密度遠心分離を用いたネガティブセレクションによって浄化されたリンパ球から精製した。初代細胞の精製度を、フローサイトメトリーによって確認した。

単球を、１００ｎｇ／ｍＬのＭ−ＣＳＦ（ｅＢｉｏｃｓｉｅｎｃｅ，サンディエゴ，カリフォルニア州）中で７日間培養し、単球由来マクロファージ（ＭＤＭ）を作製し、１００Ｕ／ｍＬのＩＬ−４（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ，ロッキーヒル，ニュージャージー州）、８００Ｕ／ｍＬのＧＭ−ＣＳＦ（Ａｍｇｅｎ，サウザンドオークス，カリフォルニア州）および０．０５ｍＭ β−メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）中で培養して、単球由来樹状細胞（ＭＤＤＣ）を作製した。細胞を、ＲＰＭＩ１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ，カールスバッド，カリフォルニア州）、１０％ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ，ローガン，ユタ州）および２０μｇ／ｍＬゲンタマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，カールスバッド，カリフォルニア州）中で培養した。

初代および由来細胞を１×１０^６細胞／ｍＬで培養し、以下の濃度でＴＬＲリガンドにより刺激した：２５ｕｇ／ｍＬ ＰｏｌｙＩ：Ｃ、１０ｎｇ／ｍＬ ＬＰＳ；６．５ｕｇ／ｍＬ ＣｐＧＡ；および１０ｕＭイミキモド。刺激を１、４または２４時間継続し、上清を分泌産物の計測用に回収し、細胞をＲＮＡ精製そしてｃＤＮＡ合成用に溶解した。ＰＣＲ反応条件は次の通りであった：ステージ１：５０℃で２分間；ステージ２：９５℃で３分間；ステージ３：９５℃で１５秒間の後５９℃で１分間を、４０反復。

単球、ＭＤＭおよびＭＤＤＭによる発現パターンは類似したが、質的には同一ではなく、ただし定量的に異なっていた（ＭＤＤＣ＞単球＝ＭＤＭ）（図９Ａ〜Ｃ）。ｐｏｌｙＩ：Ｃ（ＴＬＲ３）およびＬＰＳ（ＴＬＲ４）に反応して、これら３つの細胞型は、高レベルのＩＦＮ−ｂ、ＩＦＮ−ｇ、ＩＦＮ−ｌ１を発現し、より少ない範囲でＩＦＮ−１２およびＩＦＮ−ａ１を発現した。加えて、ｍＤＣは、ＴＬＲ７およびＴＬＲ９リガンド（それぞれ、イミキモドおよびＣｐＧ）に反応して最多のＩＦＮ−ａサブタイプを発現したが、ｍＤＣによるこれらのリガンドへの反応はドナーによって変化した（図９Ｅ）。また、ｐＤＣは、イミキモドおよびＣｐＧに反応して最多のＩＦＮ（ドナー間における変化を伴う）発現したが、ｍＤＣよりも極めて高いレベルであった（図９Ｅ）。

Ｂ細胞のプロファイルは、他の細胞におけるものとは異なり、すなわち、Ｂ細胞は低レベルのＩＦＮ−アルファ４、ならびに、ＩＦＮ−アルファ５、−アルファ７、−アルファ１０、−アルファ１４および−ラムダ１をも発現した（図９Ｆ）。１つのグループとして、これらのＩＦＮサブタイプの発現は一貫していたが、ドナー間で発現パターンは異なった。

これらのデータは、タイプＩ、ＩＩおよびＩＩＩ ＩＦＮの発現パターンは刺激（例えば、リガンド）および細胞型特異的の両方であることを示した。より具体的には、試験された細胞型のうち、ＩＦＮの発現パターンは、リガンド依存性であると考えられる一方、発現レベルは細胞依存性であると考えられる。ＩＦＮ−ａまたは−ｌサブタイプは、いずれも優勢（ｄｏｍｉｎａｎｔ）ではないと考えられる。これらの結果は、個々のサブタイプおよび／またはサブタイプの組み合わせが、生得的な免疫反応において独特の役割を有することを示唆する。

実施例３．：ヒト扁桃におけるＩＦＮサブタイプのｉｎ ｓｉｔｕ発現プロファイル
ＩＦＮサブタイプが同一器官内の異なる位置において異なる（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ）かどうかを調査するため、図１に示されるプライマー／プローブ／阻害剤セットおよび図３に示されるプレートを用いて、ＩＦＮサブタイプ発現についてヒト扁桃の異なる解剖学的位置を評価した。ＰＣＲ反応条件は次の通りであった：ステージ１：５０℃で２分間；ステージ２：９５℃で３分間；ステージ３：９５℃で１５秒間の後５９℃で１分間を、４０反復。

扁桃は、口および鼻を通る口腔への通路を有する生物からのチャレンジ（ｃｈａｌｌｅｎｇｅ）に対する進行中の生得的かつ適応性の反応を伴う、すぐに入手可能な粘膜免疫器官である。レーザー捕集顕微解剖（ＬＣＭ）を使用して、１０μｍ厚のヒト扁桃切片から３つの解剖学的領域（すなわち、胚中心ならびにｐＤＣ中に豊富なＴ細胞ゾーン（ｐＤＣ富）およびｐＤＣ中に乏しいＴ細胞ゾーン（ｐＤＣ貧））を除去した。ｐＤＣは最も高レベルのＩＦＮ−アルファを発現することが知られているため、ほとんどのＩＦＮ発現はｐＤＣ富領域内であろうと予測された。しかしながら、そうではなかった（図１０）。最も高レベルのＩＦＮ−ガンマおよびＩＦＮ−ラムダ１がｐＤＣ富領域にあったが、ＩＦＮ−アルファ１および−アルファ１７はｐＤＣ貧領域において最も高レベルで発現され、ＩＦＮ−アルファ１０は胚中心Ｂ細胞（ＧＣＢ）において最も高く発現された。マイクロアレイデータがｐＤＣ貧領域がＴ細胞機能の調整と関連することを示唆することから、これらのデータは、ＩＦＮ−アルファ１およびアルファ１７に対する類似の機能を示唆する。加えて、これらのデータは、ＩＦＮサブタイプ発現パターンにおいて組織および領域的な相違が存在することを示唆する。

本明細書中の全ての出版物および特許出願は、当業者のレベルを表示するものであり、それら全体において本明細書中に参照により組み込まれる。

上記多様な実施態様は、実例としてのみ提供され、本発明を制限するためのものと解釈されるべきではない。当業者は、本明細書中に説明され、記載される例示の実施態様および適応に従わず、また、本明細書中に説明され、記載される例示の実施態様および適応に従わずに、下記請求項に記載される、本発明の真の精神および範囲から解離することなく、そして本発明の真の精神および範囲から解離することなく、本発明に対して様々な改良および変化が行われてもよいことを容易に認識するであろう。

Claims (1)

1. 本願明細書に記載の発明。

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