KR20120103801A - 성인성질환?유발 미생물 동시 검출방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 서열목록 제1서열 및 제2서열의 프라이머쌍, 서열목록 제3서열 및 제4서열의 프라이머쌍, 서열목록 제5서열 및 제6서열의 프라이머쌍, 서열목록 제7서열 및 제8서열의 프라이머쌍, 서열목록 제9서열 및 제10서열의 프라이머쌍, 서열목록 제11서열 및 제12서열의 프라이머쌍, 서열목록 제13서열 및 제14서열의 프라이머쌍, 서열목록 제15서열 및 제16서열의 프라이머쌍, 서열목록 제17서열 및 제18서열의 프라이머쌍, 서열목록 제19서열 및 제20서열의 프라이머쌍, 서열목록 제21서열 및 제22서열의 프라이머쌍, 및 서열목록 제23서열 및 제24서열의 프라이머쌍으로 구성된 군으로부터 선택되는 최소 2종의 프라이머쌍을 포함하는 성인성질환(sexually transmitted disease, STD)-유발 미생물 동시 검출방법 및 성인성질환의 진단키트에 관한 것이다. 본 발명은 최소 2종의 상기 프라이머쌍을 이용한 멀티플렉스 PCR(polymerase chain reaction)을 통해 다수의 성인성질환-유발 미생물을 동시에 검출할 수 있으며, 본 발명의 진단키트는 시료 내 타겟 유전자를 멀티플렉스 PCR을 통해 간편하고 효율적으로 검출할 수 있다. 따라서, 본 발명의 방법 및 키트는 성인성질환의 정확한 진단 뿐 아니라 감염 원인균을 검출할 수 있으며, 이를 기반으로 보다 정확하게 질환의 예후를 예측하고 치료에 적용될 수 있다.
Description
본 발명은 성인성질환을 유발하는 다양한 미생물을 동시에 검출하는 방법 및 이를 이용한 성인성질환 진단키트에 관한 것이다.
성인성질환(sexually transmitted diseases, STDs)은 성-매개된 질환(sexually transmitted infection, STI) 또는 성병(venereal disease, VD)으로도 알려져 있으며, 성교, 구강 섹스 및 항문 섹스 같은 인간의 성적 행위로 인해 전파되는 질병을 통틀어 포함한다. STD는 (a) 성-매개된 질환, (b) 질염, (c) 성기궤양 및 (d) 비임균성 요도염(nongonorrheal urethritis, NGU)의 원인균들에 의해 주로 발병한다. 과거에는 성인성 질환은 대부분 STD 또는 VD로 간주되었으나, 최근에는 STI로 언급되고 있는데, 이는 개인은 누구나 감염될 수 있고 특정 질환의 사인 없이 다른 사람을 잠재적으로 감염시킬 수 있다는 것을 포괄하는 의미이다. 또한, 몇몇 STD는 출산 또는 모유수유 뿐 아니라, 감염된 사람에 의해 이용된 주사바늘을 통해 전달될 수 있다. 일반적으로, 성인성질환은 박테리아, 곰팡이, 바이러스, 기생충 또는 원생생물에 의해 발병된다.
비임균성 요도염이란 남성에서 요도염이 발생하였으나 나이세리아 고노레아(Neisseria gonorrhoeae, 임균)이 확인되지 않는 질환을 나타내며 비임균성 요도염의 가장 흔한 원인균은 클라미디아 트라코마티스(Chlamydia trachomatis)이며, 그 외에 유레아플라즈마 유레아라이티쿰(Ureaplasma urealyticum)과 마이코플라즈마 제니탈리움(Mycoplasma genitalium)도 중요 원인균으로 알려져 있다. 이들 세균은 모두 공통적으로 남성에서 요도염(anterior urethritis)의 중요 원인이 되며 부고환염 및 전립선염을 합병할 수 있으며, 불임의 중요한 원인이 된다. 또한, 여성에서는 자궁경부염(cervicitis)과 골반염증성질환(pelvic inflammatory diseases)의 주된 원인이며, 나팔관 폐쇄(fallopian tube occlusion)를 일으킴으로써 불임과 이소성 임신(ectopic pregnancy) 등의 합병증을 유발할 수 있다.
미국의 경우 오늘날 클라미디아 감염이 가장 흔하며, 국내에서도 최근에는 임질은 줄어드는 대신 클라미디아 감염과 비임균성 요도염이 늘어나는 추세이다.
STD는 다른 질환과 달리 무증상으로 잠복되어 증세가 악화되는 경우가 많고, 재감염이 용이하므로 상기 STD의 원인균을 조기에 검출하여 무증상의 보균자도 효과적으로 진단할 수 있는 방법의 개발이 중요하다. 만약 어떤 환자에서 일단 요도염이 발견되면 그것이 임균성인지 비임균성인지를 먼저 감별해야 하는데 그 이유는 치료 방법과 경과가 서로 다르기 때문이다. 그러나, 근래에는 항균제의 오남용에 따른 세균의 변이와 혼합감염의 증가로 인해 양자간의 구별이 애매한 경향이 많고, 정확한 진단을 위해서는 보다 효율적인 분자유전자적 검사법이 요구된다.
예를 들어, 임균성 요도염을 일으키는 나이세리아 고노레아의 진단은 일차적으로 그람 염색(Gram staining) 방법을 이용한다. 그람 염색 방법에 따라, 특징적인 세포내 그람음성 세균의 존재를 확인하는 것은 간편하고 정확도가 비교적 높아서 널리 사용되는 방법이만, 무증상이거나 증상이 미미한 임균성 요도염에서는 그람 염색으로 판단이 애매하거나 거짓 음성(false negative)으로 나오는 경우가 많은 단점이 있다. 또한, 임균 배양그람 염색법을 보완하기 위한 임균배양 방법이 있는데, 매우 유용하고 정확한 검사 방법이지만 검사 결과를 알기까지 많은 시간과 비용이 소모되는 단점이 있다. 이 외에도, 효소면역 검사법(enzyme immunoassay: EIA)과 면역형광검사법(immunofluorescence technique)은 나이세리아 고노레아-감염 질환 진단에 있어 새로운 항원 확인방법으로 이용되고 있는데 배양검사에 비해 더 신속하고, 높은 민감성(sensitivity) 및 특이성(specificity)을 가지나 고비용의 단점이 있다.
비임균성 요도염은 최근 임균성요도염이 감소하는데 대해 역으로 발병율이 증가하고 있다. 비임균성요도염은 단일 질환이 아니라, 여러 가지 미생물에 의해 일어날 수 있는 일종의 증후군(syndrome)이다. 비임균성 요도염의 원인 미생물로서 가장 중요한 것이 클라미디아 트라코마티스이다. 클라마이디아 트라코마티스는 세포내 기생성(intracellular parasitism)의 생존 주기(life cycle)를 가지는 미생물로 지놈에 DNA와 RNA를 모두 갖고 있으며 모두 15가지의 혈청형이 있는데 비임균성 요도염을 일으키는 것은 D-K형이다. 이에 의해 발병할 수 있는 인체 질환으로는 트라코마와 호흡기감염, 요도염과 자궁경부염, 부고환염, 골반염증성질환을 포함하는 STD가 있다. 최근에는, 클라마이디아가 심근염을 일으킨다는 보고도 있다.
종래의 클라마이디아 트라코마티스의 확인 방법은 (a) 감염부위에서 채취된 가검물을 배양/분리를 통해 확인하는 방법; (b) 감염부위의 상피세포를 직접 도말하고 염색하여 균을 확인하는 방법; (c) 환자의 혈청에서 항체를 분리, 확인하는 방법; 및 (d) PCR(polymerase chain reaction) 및 혼성화(hybridization) 등의 분자 유전학적 기법을 이용하는 방법을 포함하지만, 상기 (a)의 방법은 장시간이 소요되고, 진단 민감성이 낮다는 단점이 있으며, 상기 (b)의 방법은 간편하지만 역시 진단 민감도이 낮다. 또한, 상기 (c)의 방법은 민감성은 비교적 높으나 고비용과 전용 장비가 필요하다는 단점이 있다. 따라서, PCR-기반된 분자유전학적 방법이 주로 사용되는 추세이다.
PCR-기반된 분자유전학적 방법은 세균 지놈의 유전자형, 즉 DNA 및 RNA의 염기서열을 분석한다. 예를 들어, 나이세리아 고노레아 감염 또는 클라미디아 감염만을 검사하는 진단키트는 이미 상업화되어 이용되고 있다. 궁극적으로, 검사의 방법은 용이하고 간편해야 하며, 신속하게 정확한 결과를 얻어야 할 뿐 아니라, 비용이 저렴하기 위해 다수의 미생물을 동시에 검사할 필요가 있다. 따라서, 여러 STD 원인균을 동시에 분석하고 나아가 항균제 내성 등의 정보도 함께 알 수 있는 멀티플렉스 PCR 기술의 개발 필요성이 당업계에서 시급히 요구되고 있는 실정이다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
본 발명자들은 성인성질환을 보다 빠르고 효율적으로 진단할 수 있는 방법을 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 본 발명자들은 성인성질환-유발 미생물에 특이적인 프라이머들을 제작하고 이를 이용한 멀티플렉스 PCR(multiplex polymerase chain reaction)을 실시하여 다양한 미생물들을 동시에 검출할 수 있는 최적의 방법을 확립함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적은 성인성질환(sexually transmitted disease, STD)-유발 미생물 동시 검출방법을 제공한다.
본 발명의 다른 목적은 성인성질환 진단키트를 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 서열목록 제1서열 및 제2서열의 프라이머쌍, 서열목록 제3서열 및 제4서열의 프라이머쌍, 서열목록 제5서열 및 제6서열의 프라이머쌍, 서열목록 제7서열 및 제8서열의 프라이머쌍, 서열목록 제9서열 및 제10서열의 프라이머쌍, 서열목록 제11서열 및 제12서열의 프라이머쌍, 서열목록 제13서열 및 제14서열의 프라이머쌍, 서열목록 제15서열 및 제16서열의 프라이머쌍, 서열목록 제17서열 및 제18서열의 프라이머쌍, 서열목록 제19서열 및 제20서열의 프라이머쌍, 서열목록 제21서열 및 제22서열의 프라이머쌍, 및 서열목록 제23서열 및 제24서열의 프라이머쌍으로 구성된 군으로부터 선택되는 최소 2종의 프라이머쌍을 포함하는 성인성질환(sexually transmitted disease, STD)-유발 미생물 동시 검출방법을 제공한다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 서열목록 제1서열 및 제2서열의 프라이머쌍, 서열목록 제3서열 및 제4서열의 프라이머쌍, 서열목록 제5서열 및 제6서열의 프라이머쌍, 서열목록 제7서열 및 제8서열의 프라이머쌍, 서열목록 제9서열 및 제10서열의 프라이머쌍, 서열목록 제11서열 및 제12서열의 프라이머쌍, 서열목록 제13서열 및 제14서열의 프라이머쌍, 서열목록 제15서열 및 제16서열의 프라이머쌍, 서열목록 제17서열 및 제18서열의 프라이머쌍, 서열목록 제19서열 및 제20서열의 프라이머쌍, 서열목록 제21서열 및 제22서열의 프라이머쌍, 및 서열목록 제23서열 및 제24서열의 프라이머쌍으로 구성된 군으로부터 선택되는 최소 2종의 프라이머쌍을 유효성분으로 포함하는 성인성질환(sexually transmitted disease, STD) 진단키트를 제공한다.
본 발명자들은 성인성질환을 보다 빠르고 효율적으로 진단할 수 있는 방법을 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 본 발명자들은 성인성질환-유발 미생물에 특이적인 프라이머들을 제작하고 이를 이용한 멀티플렉스 PCR(multiplex polymerase chain reaction)을 실시하여 다양한 미생물들을 동시에 검출할 수 있는 최적의 방법을 확립하였다.
본 발명에 따르면, 본 발명은 성인성질환을 유발시키는 다양한 미생물을 동시에 효과적이고 간편하게 검출할 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 증폭은 PCR(polymerase chain reaction)에 따라 실시된다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 프라이머는 유전자 증폭 반응(amplification reactions)에 이용된다.
본 명세서에 기재된 용어“증폭 반응”은 핵산 분자를 증폭하는 반응을 의미한다. 다양한 증폭 반응들이 당업계에 보고 되어 있으며, 이는 중합효소 연쇄반응(PCR)(미국 특허 제4,683,195, 4,683,202, 및 4,800,159호), 역전사-중합효소 연쇄반응(RT-PCR)(Sambrook 등, Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)), Miller, H. I.(WO 89/06700) 및 Davey, C. 등(EP 329,822)의 방법, 멀티플렉스 PCR(McPherson and Moller, 2000), 리가아제 연쇄 반응(ligase chain reaction; LCR)(17, 18), Gap-LCR(WO 90/01069), 복구 연쇄 반응(repair chain reaction; EP 439,182), 전사-중재 증폭(transcription-mediated amplification; TMA)(19) (WO 88/10315), 자가 유지 염기서열 복제(self sustained sequence replication)(20)(WO 90/06995), 타깃 폴리뉴클레오티드 염기서열의 선택적 증폭(selective amplification of target polynucleotide sequences)(미국 특허 제6,410,276호), 컨센서스 서열 프라이밍 중합효소 연쇄 반응(consensus sequence primed polymerase chain reaction; CP-PCR)(미국 특허 제4,437,975호), 임의적 프라이밍 중합효소 연쇄 반응(arbitrarily primed polymerase chain reaction; AP-PCR)(미국 특허 제5,413,909호 및 제5,861,245호), 핵산 염기서열 기반 증폭(nucleic acid sequence based amplification; NASBA)(미국 특허 제5,130,238호, 제5,409,818호, 제5,554,517호, 및 제6,063,603호), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification)(21, 22) 및 고리-중재 항온성 증폭(loop-mediated isothermal amplification; LAMP)(23)를 포함하나, 이에 한정되지는 않는다. 사용 가능한 다른 증폭 방법들은 미국특허 제5,242,794, 5,494,810, 4,988,617호 및 미국 특허 제09/854,317호에 기술되어 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 “프라이머”는 올리고뉴클레오타이드를 의미하는 것으로, 핵산쇄(주형)에 상보적인 프라이머 연장 산물의 합성이 유도되는 조건, 즉, 뉴클레오타이드와 DNA 중합효소와 같은 중합제의 존재, 그리고 적합한 온도와 pH의 조건에서 합성의 개시점으로 작용할 수 있다. 바람직하게는, 프라이머는 디옥시리보뉴클레오타이드이며 단일쇄이다. 본 발명에서 이용되는 프라이머는 자연(naturally occurring) dNMP(즉, dAMP, dGMP, dCMP 및 dTMP), 변형 뉴클레오타이드 또는 비-자연 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 또한, 프라이머는 리보뉴클레오타이드도 포함할 수 있다.
프라이머는, 중합제의 존재 하에서 연장 산물의 합성을 프라이밍시킬 수 있을 정도로 충분히 길어야 한다. 프라이머의 적합한 길이는 다수의 요소, 예컨대, 온도, 응용분야 및 프라이머의 소스(source)에 따라 결정된다. 용어 “어닐링” 또는 “프라이밍”은 주형 핵산에 올리고디옥시뉴클레오타이드 또는 핵산이 병치(apposition)되는 것을 의미하며, 상기 병치는 중합효소가 뉴클레오타이드를 중합시켜 주형 핵산 또는 그의 일부분에 상보적인 핵산 분자를 형성하게 한다.
PCR은 가장 잘 알려진 핵산 증폭 방법으로, 그의 많은 변형과 응용들이 개발되어 있다. 예를 들어, PCR의 특이성 또는 민감성을 증진시키기 위해 전통적인 PCR 절차를 변형시켜 터치다운(touchdown) PCR, 핫 스타트(hot start) PCR, 네스티드(nested) PCR 및 부스터(booster) PCR이 개발되었다. 또한, 멀티플렉스 PCR, 실시간(real-time) PCR, 분별 디스플레이 PCR(differential display PCR: DD-PCR), cDNA 말단의 신속 증폭(rapid amplification of cDNA ends: RACE), 인버스 중합효소 연쇄반응(inverse polymerase chain reaction: IPCR), 벡토레트(vectorette) PCR 및 TAIL-PCR(thermal asymmetric interlaced PCR)이 특정한 응용을 위해 개발되었다. PCR에 대한 자세한 내용은 McPherson, M.J., 및 Moller, S.G. PCR. BIOS Scientific Publishers, Springer-Verlag New York Berlin Heidelberg, N.Y. (2000)에 기재되어 있으며, 그의 교시사항은 본 명세서에 참조로 삽입된다.
본 발명의 방법을 프라이머를 이용하여 실시하는 경우에는, 유전자 증폭 반응을 실시하여 분석 대상(예컨대, 다양한 미생물을 포함하는 시료)에서 타겟 유전자를 검출할 수 있다. 따라서, 본 발명은 시료 내의 mRNA로부터 합성된 cDNA에 결합하는 프라이머를 이용하여 유전자 증폭 반응을 실시한다.
mRNA를 얻기 위하여, 시료에서 총 RNA를 분리한다. 총 RNA를 분리하는 것은 당업계에 공지된 통상의 방법에 따라 실시될 수 있다(참조: Sambrook, J. et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001); Tesniere, C. et al., Plant Mol. Biol. Rep., 9:242(1991); Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Willey & Sons(1987); 및 Chomczynski, P. et al., Anal. Biochem. 162:156(1987)). 예컨대, Trizol을 이용하여 용이하게 세포내의 총 RNA를 분리할 수 있다. 이어, 분리된 mRNA로부터 cDNA를 합성하고, 이 cDNA를 증폭한다. 본 발명의 총 RNA는 인간의 시료로부터 분리되는 경우에, mRNA의 말단에는 폴리-A 테일을 갖고 있으며, 이러한 서열 특성을 이용한 올리고 dT 프라이머 및 역전사 효소를 이용하여 cDNA을 용이하게 합성할 수 있다(참조: PNAS USA, 85:8998(1988); Libert F, et al., Science, 244:569(1989); 및 Sambrook, J. et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)). 이어, 유전자 증폭 반응을 통하여 합성된 cDNA를 증폭한다.
본 발명에 이용되는 프라이머는 주형의 한 부위에 혼성화 또는 어닐링되어, 이중쇄 구조를 형성한다. 이러한 이중쇄 구조를 형성하는 데 적합한 핵산 혼성화의 조건은 Joseph Sambrook, 등, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001) 및 Haymes, B. D., 등, Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, IRL Press, Washington, D.C. (1985)에 개시되어 있다.
다양한 DNA 중합효소가 본 발명의 증폭에 이용될 수 있으며, E. coli DNA 중합효소 I의 “클레나우” 단편, 열안정성 DNA 중합효소 및 박테리오파아지 T7 DNA 중합효소를 포함한다. 바람직하게는, 중합효소는 다양한 박테리아 종으로부터 얻을 수 있는 열안정성 DNA 중합효소이고, 이는 Thermus aquaticus(Taq), Thermus thermophilus(Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis, 및 Pyrococcus furiosus(Pfu)를 포함한다.
중합 반응을 실시할 때, 반응 용기에 반응에 필요한 성분들을 과량으로 제공하는 것이 바람직하다. 증폭 반응에 필요한 성분들의 과량은, 증폭반응이 성분의 농도에 실질적으로 제한되지 않는 정도의 양을 의미한다. Mg2+와 같은 조인자, dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP를 소망하는 증폭 정도가 달성될 수 있을 정도로 반응 혼합물에 제공하는 것이 소망된다. 증폭 반응에 이용되는 모든 효소들은 동일한 반응 조건에서 활성 상태일 수 있다. 사실, 완충액은 모든 효소들이 최적의 반응 조건에 근접하도록 한다. 따라서, 본 발명의 증폭 과정은 반응물의 첨가와 같은 조건의 변화 없이 단일 반응물에서 실시될 수 있다.
본 발명에 있어서 어닐링은 타겟 뉴클레오타이드 서열과 프라이머 사이에 특이적 결합을 가능하게 하는 엄격조건 하에서 실시된다. 어닐링을 위한 엄격조건은 서열-의존적이며 주위 환경적 변수에 따라 다양하다. 이렇게 증폭된 타겟 유전자를 적합한 방법으로 분석하여 성인성질환-유발 미생물을 검출하는 것이다. 예를 들어, 상술한 증폭 반응 결과물을 젤 전기영동을 하고, 그 결과 형성되는 밴드를 관찰 및 분석함으로써 타겟 유전자를 검출할 수 있다.
본 명세서 용어 “혼성화(hybridization)" 는 2개의 단일 가닥 핵산이 상보적인 염기 서열들의 페어링(pairing)에 의하여 이합체 구조(duplex structure)를 형성하는 것을 의미한다. 혼성화는 단일 가닥 핵산 서열 간의 상보성이 완전할 경우(perfect match) 일어나거나 일부 미스매치(mismatch) 염기가 존재하여도 일어날 수 있다. 혼성화에 필요한 상보성의 정도는 혼성화 반응 조건에 따라 달라질 수 있으며, 특히 온도에 의하여 조절될 수 있다. 용어“어닐링”과 “혼성화”는 차이가 없으며, 본 명세서에서 혼용된다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 방법 및 키트는 성인성질환을 유발하는 12종의 미생물에 대해서 멀티플렉스 PCR을 통해 검출할 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 방법 및 키트에 의해 검출되는 미생물은 해모필러스 듀크레이(Haemophilus ducreyi), 마이코플라즈마 제니탈리움(Mycoplasma genitalium), 마이코플라즈마 호미니스(Mycoplasma hominis), 나이세리아 고노레아(Neisseria gonorrhoeae), 트레포네마 팔리둠(Treponema pallidum), 유레아플라즈마 유레아라이티쿰(Ureaplasma urealyticum), 칸디다 알비칸스(Candida albicans), 클라미디아 트라코마티스(Chlamydia trachomatis), 가드네렐라 바지날리스(Gardnerella vaginalis), 인간 헤르페스 심플렉스 바이러스 제1형(Human Herpes simplex virus type 1), 헤르페스 바이러스 제2형(Herpes simplex virus type 2) 및 트리코모나스 바지날리스(Trichomonas vaginalis)을 포함한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 방법 및 키트에 의해 검출되는 성인성질환은 가려움증, 불쾌감, 냉대하증, 매독, 임질, 연성하감, 서혜부 육아종, 성병성임파육아종, 비임균성요도염, 음부포진, 첨규 콘딜롬, 사면발이증, 트리코모나스증 및 칸디다증을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 방법 및 키트는 서열목록 제1서열 및 제2서열의 프라이머쌍, 서열목록 제3서열 및 제4서열의 프라이머쌍, 서열목록 제5서열 및 제6서열의 프라이머쌍, 서열목록 제7서열 및 제8서열의 프라이머쌍, 서열목록 제9서열 및 제10서열의 프라이머쌍, 서열목록 제11서열 및 제12서열의 프라이머쌍, 서열목록 제13서열 및 제14서열의 프라이머쌍, 서열목록 제15서열 및 제16서열의 프라이머쌍, 서열목록 제17서열 및 제18서열의 프라이머쌍, 서열목록 제19서열 및 제20서열의 프라이머쌍, 서열목록 제21서열 및 제22서열의 프라이머쌍, 및 서열목록 제23서열 및 제24서열의 프라이머쌍으로 구성된 군으로부터 선택되는 최소 2종의 프라이머쌍을 이용하며, 보다 더 바람직하게는 최소 4종의 프라이머쌍을 이용하고, 보다 더욱 더 바람직하게는 최소 5종의 프라이머쌍을 이용하며, 가장 바람직하게는 최소 6종의 프라이머쌍을 이용한다.
본 발명의 보다 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 방법 및 키트에서 이용되는 타겟 유전자는 상기 서열목록 제1서열 및 제2서열의 프라이머쌍에 의해 검출되는 해모필러스 듀크레이의 글루코오스-억제된 분열 단백질 A(GidA) 유전자이고; 상기 서열목록 제3서열 및 제4서열의 프라이머쌍에 의해 검출되는 마이코플라즈마 제니탈리움의 DNA GyrA(gyrase subunit A) 유전자이며; 상기 서열목록 제5서열 및 제6서열의 프라이머쌍에 의해 검출되는 마이코플라즈마 호미니스의 18S 리보좀 RNA 유전자이고; 상기 서열목록 제7서열 및 제8서열의 프라이머쌍에 의해 검출되는 나이세리아 고노레아의 DNA GyrA 유전자이며; 상기 서열목록 제9서열 및 제10서열의 프라이머쌍에 의해 검출되는 트레포네마 팔리둠의 막 단백질 유전자이고; 상기 서열목록 제11서열 및 제12서열의 프라이머쌍에 의해 검출되는 유레아플라즈마 유레아라이티쿰의 16S 리보좀 RNA 유전자이며; 상기 서열목록 제13서열 및 제14서열의 프라이머쌍에 의해 검출되는 칸디다 알비칸스의 18S 리보좀 RNA 유전자이고; 상기 서열목록 제15서열 및 제16서열의 프라이머쌍에 의해 검출되는 클라미디아 트라코마티스의 ompA 유전자이며; 상기 서열목록 제17서열 및 제18서열의 프라이머쌍에 의해 검출되는 가드네렐라 바지날리스의 16S 리보좀 RNA 유전자이고; 상기 서열목록 제19서열 및 제20서열의 프라이머쌍에 의해 검출되는 인간 헤르페스 바이러스 1의 당단백질 C 유전자이며; 상기 서열목록 제21서열 및 제22서열의 프라이머쌍에 의해 검출되는 헤르페스 바이러스 제2형의 캡시드 단백질 유전자이고; 및 상기 서열목록 제23서열 및 제24서열의 프라이머쌍에 의해 검출되는 트리코모나스 바지날리스의 베타-튜블린 유전자를 포함한다.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(a) 본 발명은 성인성질환을 유발하는 다양한 미생물을 동시에 검출하는 방법 및 이를 이용한 성인성질환 진단키트에 관한 것이다.
(b) 본 발명은 서열목록 제1서열 내지 제24서열로 구성된 군으로부터 선택된 최소 2종의 프라이머쌍을 이용한 멀티플렉스 PCR(polymerase chain reaction)을 통해 다수의 성인성질환-유발 미생물을 동시에 검출할 수 있다.
(c) 또한, 본 발명의 진단키트는 시료 내 타겟 유전자를 멀티플렉스 PCR을 통해 간편하고 효율적으로 검출할 수 있다.
(d) 따라서, 본 발명의 방법 및 키트는 성인성질환의 정확한 진단 뿐 아니라 감염 원인균을 검출할 수 있으며, 이를 기반으로 보다 정확하게 질환의 예후를 예측하고 치료에 적용될 수 있다.
도 1은 본 발명에서 제조된 내적 대조군 프라이머 및 타겟 유전자 검출용 프라이머를 이용하여 PCR을 실시한 결과이다. 얻어진 PCR 산물들을 10 ㎕씩 로딩하여 아가로오스 젤에 전기영동하였다. 약어: M, 100 bp 래더; 레인 1, 해모필러스 듀크레이(Haemophilus ducreyi); 레인 2, 마이코플라즈마 제니탈리움(Mycoplasma genitalium); 레인 3, 마이코플라즈마 호미니스(Mycoplasma hominis); 레인 4, 나이세리아 고노레아(Neisseria gonorrhoeae); 레인 5, 트레포네마 팔리둠(Treponema pallidum); 레인 6, 유레아플라즈마 유레알리티쿰(Ureaplasma urealyticum); 레인 7, 칸디다 알비칸스(Candida albicans); 레인 8, 클라미디아 트라코마티스(Chlamydia trachomatis); 레인 9, 가드네렐라 바지날리스(Gardnerella vaginalis); 레인 10, 인간 헤르페스바이러스 1(Human herpesvirus 1); 레인 11, 헤르페스 심플렉스 바이러스 제2형(Herpes simplex virus type 2); 레인 12, 트리코모나스 바지날리스(Trichomonas vaginalis); 및 C, 내적 대조군.
도 2는 본 발명에서 이용된 프라이머의 조합을 이용하여 멀티플렉스 PCR을 실시한 결과이다. 얻어진 PCR 산물들을 10 ㎕씩 로딩하여 아가로오스 젤에 전기영동하였다. 약어: M, 100 bp 래더; 레인 SetA, 위쪽 밴드부터 유레아플라즈마 유레알리티쿰, 트레포네마 팔리둠, 나이세리아 고노레아, 마이코플라즈마 호미니스, 마이코플라즈마 제니탈리움, 해모필러스 듀크레이 및 내적 대조군를 의미하고; 레인 SetB, 위쪽 밴드부터 트리코모나스 바지날리스, 헤르페스 바이러스 제2형, 인간 헤르페스 바이러스 1, 가드네렐라 바지날리스, 클라미디아 트라코마티스, 칸디다 알비칸스 및 내적 대조군을 의미한다.
도 2는 본 발명에서 이용된 프라이머의 조합을 이용하여 멀티플렉스 PCR을 실시한 결과이다. 얻어진 PCR 산물들을 10 ㎕씩 로딩하여 아가로오스 젤에 전기영동하였다. 약어: M, 100 bp 래더; 레인 SetA, 위쪽 밴드부터 유레아플라즈마 유레알리티쿰, 트레포네마 팔리둠, 나이세리아 고노레아, 마이코플라즈마 호미니스, 마이코플라즈마 제니탈리움, 해모필러스 듀크레이 및 내적 대조군를 의미하고; 레인 SetB, 위쪽 밴드부터 트리코모나스 바지날리스, 헤르페스 바이러스 제2형, 인간 헤르페스 바이러스 1, 가드네렐라 바지날리스, 클라미디아 트라코마티스, 칸디다 알비칸스 및 내적 대조군을 의미한다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
실험재료 및 실험방법
유전자 및 균주
열두 종의 STD(Sexually Transmitted Disease) 관련 유전자 및 균주를 ATCC(American Type Culture Collection)로부터 구입하였다: 해모필러스 듀크레이(Haemophilus ducreyi; ATCC 700724D-5 genomic DNA), 마이코플라즈마 제니탈리움(Mycoplasma genitalium; ATCC 33530D genomic DNA), 마이코플라즈마 호미니스(Mycoplasma hominis; ATCC 23114D genomic DNA), 나이세리아 고노레아(Neisseria gonorrhoeae; ATCC 53420D genomic DNA), 트레포네마 팔리둠(Treponema pallidum; ATCC 27087), 유레아플라즈마 유레아라이티쿰(Ureaplasma urealyticum; ATCC 27618), 칸디다 알비칸스(Candida albicans; ATCC 14503D genomic DNA), 클라미디아 트라코마티스(Chlamydia trachomatis; ATCC VR-1500), 가드네렐라 바지날리스(Gardnerella vaginalis; ATCC 49145D), 인간 헤르페스 심플렉스 바이러스 제1형(Human herpes simplex virus type 1; ATCC VR-1545), 헤르페스 바이러스 제2형(Herpes simplex virus type 2; ATCC VR-540) 및 트리코모나스 바지날리스(Trichomonas vaginalis; ATCC 30001D genomic DNA).
클로닝
상술한 프라이머쌍을 이용하여 해당 유전자 및 균주로부터 유전자 산물을 증폭하여 클로닝한 후, 내적 대조군(internal control)을 포함하는 13종의 클론을 제조하였다.
멀티플렉스 PCR(multiplex polymerase chain reaction) 조건의 최적화
미국국립생명공학정보센터(NCBI)로부터 얻어진 프라이머 세트를 이용하여 멀티플렉스 PCR을 실시하였다. PCR 증폭은 10 pmol의 내적 대조군 프라이머, 10 pmol의 SetA 또는 SetB 프라이머, 1 ㎕의 템플레이트 DNA(10 pg/㎕) 및 10 ㎕의 PCR Master Mix(썬제네틱스사, 대한민국)를 포함하는 20 ㎕의 반응 용액에서 실시하였다. 상기 프라이머의 조합은 10 pmol의 내적 대조군 프라이머 및 10 pmol의 Set A 프라이머, 또는 10 pmol의 내적 대조군 프라이머 및 10 pmol의 Set B 프라이머의 조합을 이용하였다. PCR 반응 조건은 95℃에서 5분 동안 초기 변성한 후, 94℃에서 20초 동안 변성하는 단계, 62℃에서 30초 동안 어닐링하는 단계 및 72℃에서 1분 동안 연장하는 단계를 포함하는 35 사이클을 수행하고 72℃에서 7분 동안 추가 연장하였다. PCR 증폭은 PTC-220 DNA 엔진 다이아드 PCR 기계(MJ Research Inc., Waltham, MA, USA)에서 실시하였다. 앰플리콘들을 1.5% SeaKem LE 아가로오스 젤(FMC Bioproducts, Philadelphia, PA, USA)에서 전기영동한 후 EtBr(Ethidium bromide; Sigma) 염색으로 시각화하였다.
실험결과
실시예 1: 멀티플렉스 PCR을 위한 프라이머의 설계 및 확인
미국국립생명공학정보센터(NCBI)의 데이터베이스에서 13종[해모필러스 듀크레이의 글루코오스-억제된 분열 단백질 A(GidA) 유전자, 마이코플라즈마 제니탈리움의 DNA GyrA(gyrase subunit A) 유전자, 마이코플라즈마 호미니스의 16S 리보좀 RNA 유전자, 나이세리아 고노레아의 GyrA 유전자, 트레포네마 팔리둠의 트레포네말 막 단백질 유전자, 유레아플라즈마 유레아라이티쿰의 16S 리보좀 RNA 유전자, 칸디다 알비칸스의 18S 리보좀 RNA 유전자, 클라미디아 트라코마티스의 주요 외막 단백질(ompA) 유전자, 가드네렐라 바지날리스의 16S 리보좀 RNA 유전자, 인간 헤르페스바이러스 1의 당단백질 C(UL44) 유전자, 헤르페스 심플렉스 바이러스 제2형의 캡시드 단백질(ICP32/VP19c) 유전자, 트리코모나스 바지날리스의 베타-튜블린 유전자, 호모 사피엔스의 베타 글로빈 유전자]의 DNA 염기서열을 얻었다. 상기 DNA 염기 서열을 이용하여 Primer3 프로그램으로 프라이머를 디자인한 후 NCBI의 블라스트(Basic Local Alignment Search Tool)에서 특이적 서열을 선별하였다. 상기 프라이머에 의한 PCR 증폭을 확인하기 위해, 이용된 프라이머의 서열은 하기 표 1에 기재되어 있으며, PCR 증폭 결과를 도 1 및 도 2에 아가로오스 젤 전기영동 사진으로 나타냈다.
|
프라이머
세트 |
생물체 | 타겟 유전자 | 프라이머 서열(5’->3’) |
증폭
크기 (bp) |
|
| 내적 대조군 |
호모 사피엔스 |
베타 글로빈 유전자 |
정방향 | aatctctttctttcagggcaataatgatac | 91 |
| 역방향 | gccttaacccagaaattatcactgttattc | ||||
| Set A | 해모필러스 듀크레이 | 글루코오스-억제된 분열 단백질 A(GidA) | 정방향 | agatgcacgtaccattaattttgaggtatt | 155 |
| 역방향 | taatatcgtgtgtctgatgatttgtatggg | ||||
| 마이코플라즈마 제니탈리움 | GyrA | 정방향 | atgtcaacatctattccttcccataatctc | 201 | |
| 역방향 | agaacgaattactacattgcctttacctgt | ||||
| 마이코플라즈마 호미니스 | 18S rRNA | 정방향 | tttagattggaatacccattggaaacaa | 305 | |
| 역방향 | actttacaatccgaagaccttcatcgtg | ||||
| 나이세리아 고노레아 | GyrA | 정방향 | gtttcgtcttcgaggtcgtctgaaatct | 446 | |
| 역방향 | catgactatttgatgtgttttaccaacctc | ||||
| 트레포네마 팔리둠 | 막 단백질 | 정방향 | aaaatcctcggtctacatcaaggaaactat | 554 | |
| 역방향 | acgtagtcaccttgtattgcgcaggtag | ||||
| 유레아플라즈마 유레아라이티쿰 | 16S rRNA | 정방향 | actatgggagctggtaatatctaaaaccg | 654 | |
| 역방향 | gttttcttttcctctggctactgagatgtt | ||||
| Set B | 칸디다 알비칸스 |
18S rRNA | 정방향 | ttaattgcaccacatgtgtttttctttgaa | 204 |
| 역방향 | aattcatattacgtatcgcatttcgctg | ||||
| 클라미디아 트라코마티스 |
omp A | 정방향 | tggatatcttaaaggaaattcagcatcttt | 246 | |
| 역방향 | aattcttcgattttaggtttagattgagca | ||||
| 가드네렐라 바지날리스 | 16S rRNA | 정방향 | agagttaagcgataggcttttactggtgta | 298 | |
| 역방향 | gttatcacacgtactcggtttagcctgat | ||||
| 인간 헤르페스 심플렉스 바이러스 제1형 | 당단백질 C | 정방향 | gacctagaggaggtcctgacgaacat | 396 | |
| 역방향 | gtcgtcctcgaaccagacaaactcc | ||||
| 헤르페스 심플렉스 바이러스 제2형 | 캡시드 단백질 | 정방향 | ccttgtgtcgtttaactttctggtgg | 523 | |
| 역방향 | gtgaatcgtgttggttatccggagg | ||||
| 트리코모나스 바지날리스 | 베타-튜블린 | 정방향 | gttcgtgaaatcgttcacatccaag | 645 | |
| 역방향 | gagtgtacggaagcagatatcgtaaagag | ||||
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명 의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> Fammed, Co., Ltd.
<120> Methods for Simultaneously Detecting Sexually Transmitted
Disease-Inducible Microorganisms
<130> PN110123
<160> 24
<170> KopatentIn 1.71
<210> 1
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GidA Forward primer
<400> 1
agatgcacgt accattaatt ttgaggtatt 30
<210> 2
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GidA Reverse primer
<400> 2
taatatcgtg tgtctgatga tttgtatggg 30
<210> 3
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Mg_GyrA Forward primer
<400> 3
atgtcaacat ctattccttc ccataatctc 30
<210> 4
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Mg_GyrA Reverse primer
<400> 4
agaacgaatt actacattgc ctttacctgt 30
<210> 5
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Mh_18S rRNA Forward primer
<400> 5
tttagattgg aatacccatt ggaaacaa 28
<210> 6
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Mh_18S rRNA Reverse primer
<400> 6
actttacaat ccgaagacct tcatcgtg 28
<210> 7
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Ng-GyrA Forward primer
<400> 7
gtttcgtctt cgaggtcgtc tgaaatct 28
<210> 8
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Ng_GyrA Reverse primer
<400> 8
catgactatt tgatgtgttt taccaacctc 30
<210> 9
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Tp_membrane protein Forward primer
<400> 9
aaaatcctcg gtctacatca aggaaactat 30
<210> 10
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Tp_membrane protein Reverse primer
<400> 10
acgtagtcac cttgtattgc gcaggtag 28
<210> 11
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Uu_16S rRNA Forward primer
<400> 11
actatgggag ctggtaatat ctaaaaccg 29
<210> 12
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Uu_16S rRNA Reverse primer
<400> 12
gttttctttt cctctggcta ctgagatgtt 30
<210> 13
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Ca_18S rRNA Forward primer
<400> 13
ttaattgcac cacatgtgtt tttctttgaa 30
<210> 14
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Ca_18S rRNA Reverse primer
<400> 14
aattcatatt acgtatcgca tttcgctg 28
<210> 15
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Ct_ompA Forward primer
<400> 15
tggatatctt aaaggaaatt cagcatcttt 30
<210> 16
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Ct_ompA Reverse primer
<400> 16
aattcttcga ttttaggttt agattgagca 30
<210> 17
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Gv_16S rRNA Forward primer
<400> 17
agagttaagc gataggcttt tactggtgta 30
<210> 18
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Gv_16S rRNA Reverse primer
<400> 18
gttatcacac gtactcggtt tagcctgat 29
<210> 19
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HSV1_Gly C Forward primer
<400> 19
gacctagagg aggtcctgac gaacat 26
<210> 20
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HSV 1_Gly C Reverse primer
<400> 20
gtcgtcctcg aaccagacaa actcc 25
<210> 21
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HSV 2_capsid Forward primer
<400> 21
ccttgtgtcg tttaactttc tggtgg 26
<210> 22
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HSV 2_capsid Reverse primer
<400> 22
gtgaatcgtg ttggttatcc ggagg 25
<210> 23
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Tv_btub Forward primer
<400> 23
gttcgtgaaa tcgttcacat ccaag 25
<210> 24
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Tv_btub Reverse primer
<400> 24
gagtgtacgg aagcagatat cgtaaagag 29
Claims (10)
- 서열목록 제1서열 및 제2서열의 프라이머쌍, 서열목록 제3서열 및 제4서열의 프라이머쌍, 서열목록 제5서열 및 제6서열의 프라이머쌍, 서열목록 제7서열 및 제8서열의 프라이머쌍, 서열목록 제9서열 및 제10서열의 프라이머쌍, 서열목록 제11서열 및 제12서열의 프라이머쌍, 서열목록 제13서열 및 제14서열의 프라이머쌍, 서열목록 제15서열 및 제16서열의 프라이머쌍, 서열목록 제17서열 및 제18서열의 프라이머쌍, 서열목록 제19서열 및 제20서열의 프라이머쌍, 서열목록 제21서열 및 제22서열의 프라이머쌍, 및 서열목록 제23서열 및 제24서열의 프라이머쌍으로 구성된 군으로부터 선택되는 최소 2종의 프라이머쌍을 포함하는 성인성질환(sexually transmitted disease, STD)-유발 미생물 동시 검출방법.
- 제 1 항에 있어서, 상기 방법은 유전자 증폭에 의해 실시되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항에 있어서, 상기 방법은 최소 4종의 프라이머쌍을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 3 항에 있어서, 상기 방법은 최소 6종의 프라이머쌍을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항에 있어서, 상기 미생물은 해모필러스 듀크레이(Haemophilus ducreyi), 마이코플라즈마 제니탈리움(Mycoplasma genitalium), 마이코플라즈마 호미니스(Mycoplasma hominis), 나이세리아 고노레아(Neisseria gonorrhoeae), 트레포네마 팔리둠(Treponema pallidum), 유레아플라즈마 유레아라이티쿰(Ureaplasma urealyticum), 칸디다 알비칸스(Candida albicans), 클라미디아 트라코마티스(Chlamydia trachomatis), 가드네렐라 바지날리스(Gardnerella vaginalis), 인간 헤르페스 심플렉스 바이러스 제1형(Human Herpes simplex virus type 1), 헤르페스 바이러스 제2형(Herpes simplex virus type 2) 또는 트리코모나스 바지날리스(Trichomonas vaginalis)을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 서열목록 제1서열 및 제2서열의 프라이머쌍, 서열목록 제3서열 및 제4서열의 프라이머쌍, 서열목록 제5서열 및 제6서열의 프라이머쌍, 서열목록 제7서열 및 제8서열의 프라이머쌍, 서열목록 제9서열 및 제10서열의 프라이머쌍, 서열목록 제11서열 및 제12서열의 프라이머쌍, 서열목록 제13서열 및 제14서열의 프라이머쌍, 서열목록 제15서열 및 제16서열의 프라이머쌍, 서열목록 제17서열 및 제18서열의 프라이머쌍, 서열목록 제19서열 및 제20서열의 프라이머쌍, 서열목록 제21서열 및 제22서열의 프라이머쌍, 및 서열목록 제23서열 및 제24서열의 프라이머쌍으로 구성된 군으로부터 선택되는 최소 2종의 프라이머쌍을 포함하는 성인성질환(sexually transmitted disease, STD) 진단키트.
- 제 6 항에 있어서, 상기 키트는 유전자 증폭에 의해 실시되는 것을 특징으로 하는 키트.
- 제 6 항에 있어서, 상기 키트는 최소 4종의 프라이머쌍을 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
- 제 8 항에 있어서, 상기 키트는 최소 6종의 프라이머쌍을 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
- 제 6 항에 있어서, 상기 성인성질환은 해모필러스 듀크레이, 마이코플라즈마 제니탈리움, 마이코플라즈마 호미니스, 나이세리아 고노레아, 트레포네마 팔리둠, 유레아플라즈마 유레아라이티쿰, 칸디다 알비칸스, 클라미디아 트라코마티스, 가드네렐라 바지날리스, 인간 헤르페스 심플렉스 바이러스 제1형, 헤르페스 심플렉스 바이러스 제2형 또는 트리코모나스 바지날리스에 유발되는 질환인 것을 특징으로 하는 키트.
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