FR2825716A1 - Nouveaux polynucleotides et polypeptides de l'ifn alpha 7 - Google Patents

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Abstract

Polynucléotide isolé comprenant :a) une séquence nucléotidique ayant au moins 80 % d'identité avec la séquence ID SEQ Ndegre 1 ou le cas échéant sa séquence codante, étant entendu que cette séquence nucléotidique comporte au moins l'un des polymorphismes de type SNP suivants : a559c, g580a, c667t, c682t, t779c, g1033a, c1084a, g1125a, g1135t, g1161a, t1166c, g1181a, a1212g, a1294c; oub) une séquence nucléotidique complémentaire à une séquence nucléotidique sous a).

Description

<Desc/Clms Page number 1>
La présente invention concerne de nouveaux polynucléotides comportant des polymorphismes de type SNP dans la séquence nucléotidique du gène FNa-7, de nouveaux polypeptides dérivés de la protéine IFNa-7 naturelle ainsi que leurs utilisations thérapeutiques.
ART ANTERIEUR
Le gène interféron alpha 7, appelé ci après FNa-7, est décrit dans les publications suivantes :
Figure img00010001

- Olopade, O. 1. ; Bohlander, S. K. ; Pomykala, H. ; Maltepe, E. ; Van Melle, E. ; Le Beau, M. M. ; Diaz, M. O. :"Mapping of the shortest region of overlap of deletions of the short arm of chromosome 9 associated with human neoplasia." ; Genomics 14 : 437-443,1992.
- Henco K, Brosius J, Fujisawa A, Fujisawa JI, Haynes JR, Hochstadt J, Kovacic T, Pasek M, Schambock A, Schmid J, et a/. :"Structural relationship of human interferon alpha genes and pseudogenes." ; J Mol Biol 1985 Sep 20 ; 185 (2) : 227-60.
Ut ! rich A, Gray A, Goeddel DV, Dull TJ :"Nucleotide sequence of a portion of human chromosome 9 containing a leukocyte interferon gene cluster."; J Mol.
Biol. 1982 Apr 15 ; 156 (3) : 467-86.
La séquence nucléotidique de ce gène est accessible sous le numéro d'accès X02960 dans la base de données GenBank.
Les interférons alpha humains (IFNa) sont connus pour leurs effets anti-prolifératifs cellulaires et leurs implications dans les réponses antivirales et anti-parasitaires.
Les IFNa sont aussi connus pour inhiber l'expression de plusieurs autres cytokines au niveau des cellules hématopoïétiques souches, ainsi que pour inhiber la prolifération cellulaire de certaines tumeurs.
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Les IFNa sont également connus pour réduire l'expression des récepteurs de l'EGF dans les carcinomes rénaux, pour inhiber l'expression de certains gènes mitochondriaux, pour inhiber la prolifération des fibroblastes, des monocytes et des lymphocytes B et pour bloquer la synthèse des anticorps par les lymphocytes B.
Les IFNa sont également connus pour induire l'expression d'antigènes spécifiques de tumeurs à la surface de cellules tumorales et également pour induire la transcription des gènes placés sous le contrôle de régions promotrices de type ISRE (Interferon-Stimulated Response Element) en agissant sur les facteurs de transcription spécifiques de ces ISRE.
Il a été observé par ailleurs une immunisation dirigée contre les INFa chez des patients atteints de certaines formes de pathologies autoimmunes ou d'infections virales généralisées ainsi que dans certains cancers.
Il est connu que les IFNa sont impliqués dans différents dérèglements et/ou maladies humaines, tels que les différents cancers comme, par exemple, les carcinomes, les mélanomes, les lymphomes, les myélomes, les tumeurs cancéreuses ou non, les leucémies et les cancers du foie, du cou, de la tête et des reins, les maladies cardiovasculaires, les maladies métaboliques telles que celles qui ne sont pas liées au système immunitaire comme, par exemple, l'obésité, les maladies infectieuses en particulier les infections virales comme les hépatites B et C et le SIDA, les pneumonies, les colites ulcératives, les maladies du système nerveux central comme, par exemple, la maladie d'Alzheimer, la schizophrénie et la dépression, le rejet de greffe de tissus ou d'organes, la cicatrisation de blessures, l'anémie en particulier chez les patients dialysés, les allergies, l'asthme, les scléroses multiples, l'ostéoporose, le psoriasis, l'arthrite rhumatoïde, la maladie de Crohn, les maladies et les désordres auto-immuns, les désordres gastro-intestinaux ou encore les désordres liés aux traitements par chimiothérapie.
Les IFNa sont particulièrement utilisés pour le traitement des hépatites chroniques B et C, des leucémies telles que la leucémie à tricholeucocytes et la leucémie myéloïde chronique, des myélomes multiples,
<Desc/Clms Page number 3>
des lymphomes folliculaires, de tumeurs carcinoïdes, de mélanomes malins, de carcinomes rénaux métastasés ainsi que des tumeurs qui apparaissent à la suite d'un déficit immunitaire, tel que le sarcome de Kaposi dans le cas du SIDA.
Les IFNa sont reconnus par la FDA (Food and Drug Administration) pour le traitement des verrues génitales ou vénériennes.
Toutefois, les interférons alpha (IFNU) présentent de nombreux effets secondaires lorsqu'ils sont employés dans des compositions pharmaceutiques, tels que des réactions d'hypersensibilité aiguë (urticaire, broncho-constriction, choc anaphylactique, etc. ), des arythmies cardiaques, des hypotensions artérielles, des crises d'épilepsie, des troubles des fonctions thyroïdiennes ou des syndromes pseudo-grippaux (fièvres, sueurs, myalgies).
La demanderesse a trouvé de nouveaux polypeptides et nouveaux polynucléotides analogues à FNa-7, pouvant avoir une fonctionnalité différente de la protéine IFNa-7 naturelle.
Ces nouveaux polypeptides et polynucléotides peuvent notamment être utilisés pour traiter ou prévenir les dérèglements ou maladies mentionnés précédemment et éviter tout ou partie des inconvénients qui leurs sont liés.
L'INVENTION
L'invention a pour premier objet de nouveaux polynucléotides qui diffèrent de la séquence nucléotidique du gène sauvage de référence de l'IFNa- 7, en ce qu'ils comportent un ou plusieurs polymorphismes de type SNP (Single Nucleotide Polymorphism) fonctionnels.
La séquence nucléotidique ID SEQ N01 du gène IFNa-7 humain sauvage de référence est composée de 1983 nucléotides et comporte une séquence codante de 570 nucléotides, du nucléotide 751 (codon start) au nucléotide 1320 (codon stop).
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La demanderesse a identifié 14 polymorphismes de type SNP fonctionnels dans la séquence nucléotidique du gène sauvage de référence de l'IFNa-7.
Ces 14 polymorphismes de type SNP sont les suivants : a559c,
Figure img00040001

g580a, c667t, c682t, t779c, g1033a, c1084a, g1125a, g1135t, g1161a, t1166c, g1181a, a1212g, a1294c.
Il est entendu, au sens de la présente invention, que la numérotation correspondant au positionnement des polymorphismes de type SNP définis précédemment est relative à la numérotation de la séquence nucléotidique ID SEQ ? 1.
Les lettres a, t, c et g correspondent respectivement aux bases azotées adénine, thymine, cytosine et guanine.
La première lettre correspond au nucléotide sauvage, alors que la dernière lettre correspond au nucléotide muté.
Ainsi, par exemple, le polymorphisme de type SNP g1033a correspond à une mutation du nucléotide guanine (g) en position 1033 de la séquence nucléotidique ID SEQ N01 du gène de l'lFNa-7 sauvage de référence, en adénine (a).
Ces polymorphismes de type SNP fonctionnels (au sens de la présente invention) ont été chacun identifiés par la demanderesse sur la base du procédé de détermination décrit dans sa demande de brevet FR 00 22894, intitulée "Procédé de détermination d'un ou plusieurs polymorphisme (s) fonctionnel (s) dans la séquence nucléotidique d'un gène candidat fonctionnel présélectionné et ses applications" et déposée le 6 décembre 2000, citée ici à titre de référence.
Le procédé décrit dans cette demande de brevet permet l'identification d'un (ou plusieurs) polymorphisme (s) de type SNP fonctionnel (s) préexistant (s) dans au moins un individu constitutif d'une population aléatoire d'individus.
Dans le cadre de la présente invention, un fragment de la séquence nucléotidique du gène IFNa-7, comprenant, par exemple, la
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séquence codante, a été isolé chez des individus dans une population d'individus choisis de manière aléatoire.
Un séquençage de ces fragments a ensuite été réalisé sur certains de ces échantillons présentant un profil hétéroduplex (c'est à dire un profil différent de celui de la séquence nucléotidique du gène sauvage de référence de FNa-7) après analyse par DHPLC ("Denaturing-High Performance Liquid Chromatography" ; Chromatographie liquide haute performance en condition dénaturante).
On a alors comparé le fragment ainsi séquencé à la séquence nucléotidique du fragment du gène IFNa-7 sauvage de référence et identifier les polymorphismes de type SNP fonctionnels conformes à l'invention.
Ainsi ces polymorphismes de type SNP fonctionnels sont naturels et chacun d'entre eux est présent chez certains individus de la population mondiale.
Le gène IFNa-7 sauvage de référence code pour une protéine immature de 189 acides aminés, correspondant à la séquence d'acides aminés ID SEQ N 2, qui sera convertit en protéine mature de 166 acides aminés, par clivage du peptide signal qui comprend les 23 premiers acides aminés.
Chacun des polymorphismes de type SNP codants de l'invention, à savoir : t779c, g1033a, c1084a, g1135t, t1166c, g1181a et a1294c, entraînent des modifications de la protéine codée par la séquence nucléotidique du gène IFNa-7 au niveau de la séquence d'acides aminés.
Ces modifications dans la séquence d'acides aminés sont les suivantes :
Le polymorphisme de type SNP t779c entraîne une mutation de l'acide aminé valine (V) en position 10 dans la protéine immature du gène IFNa- 7, correspondant à la séquence d'acides aminés ID SEQ N 2, en alanine (A). Cette mutation est localisé dans le peptide signal qui sera clivé lors de la maturation de la protéine. Dans la description de la présente invention, on appellera V10A la mutation codée par ce polymorphisme de type SNP dans la protéine immature.
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Le polymorphisme de type SNP g1033a entraîne une mutation de l'acide aminé acide aspartique (D) en position 95 dans la protéine immature du gène IFNa-7, correspondant à la séquence d'acides aminés ID SEQ N'2, en asparagine (N) et en position 72 de la protéine mature. Dans la description de la présente invention, on appellera indifféremment D72N et D95N la mutation codée par ce polymorphisme de type SNP selon que l'on se réfère respectivement à la protéine mature ou à la protéine immature.
Le polymorphisme de type SNP c1084a entraîne une mutation de l'acide aminé leucine (L) en position 112 dans la protéine immature du gène IFNa-7, correspondant à la séquence d'acides aminés ID SEQ N'2, en isoleucine (1) et en position 89 de la protéine mature. Dans la description de la présente invention, on appellera indifféremment L891 et L1121 la mutation codée par ce polymorphisme de type SNP selon que l'on se réfère respectivement à la protéine mature ou à la protéine immature.
Le polymorphisme de type SNP g1135t entraîne une mutation de l'acide aminé VALINE (V) en position 129 dans la protéine immature du gène IFNa-7, correspondant à la séquence d'acides aminés ID SEQ N'2, en leucine (L) et en position 106 de la protéine mature. Dans la description de la présente invention, on appellera indifféremment V106L et V129L la mutation codée par ce polymorphisme de type SNP selon que l'on se réfère respectivement à la protéine mature ou à la protéine immature.
Le polymorphisme de type SNP t1166c entraîne une mutation de l'acide aminé phénylalanine (F) en position 139 dans la protéine immature du gène IFNa-7, correspondant à la séquence d'acides aminés ID SEQ N'2, en sérine (S) et en position 116 de la protéine mature. Dans la description de la présente invention, on appellera indifféremment F116S et F139S la mutation codée par ce polymorphisme de type SNP selon que l'on se réfère respectivement à la protéine mature ou à la protéine immature.
Le polymorphisme de type SNP g1181a entraîne une mutation de l'acide aminé arginine (R) en position 144 dans la protéine immature du gène IFNa-7, correspondant à la séquence d'acides aminés ID SEQ N'2, en lysine
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(K) et en position 121 de la protéine mature. Dans la description de la présente invention, on appellera indifféremment R121K et R144K la mutation codée par ce polymorphisme de type SNP selon que l'on se réfère respectivement à la protéine mature ou à la protéine immature.
Le polymorphisme de type SNP a1294c entraîne une mutation de l'acide aminé lysine (K) en position 182 dans la protéine immature du gène IFNa-7, correspondant à la séquence d'acides aminés ID SEQ N'2, en glutamin (Q) et en position 159 de la protéine mature. Dans la description de la présente invention, on appellera indifféremment K159Q et K182Q la mutation codée par ce polymorphisme de type SNP selon que l'on se réfère respectivement à la protéine mature ou à la protéine immature.
Les polymorphismes de type SNP D95N, F139S, R144K et K182Q entraînent des modifications significatives de la conformation spatiale des polypeptides conformes à l'invention par rapport au polypeptide codé par la séquence nucléotidique du gène sauvage de référence IFNa-7.
Ces modifications peuvent être observées par modélisation moléculaire bio-informatique, selon des méthodes bien connues de l'homme du métier mettant en oeuvre, par exemple, les outils de modélisation de novo (par exemple, SEQFOLD/MSI), d'homologie (par exemple, MODELER/MSI), de minimisation des champs de force (par exemple, DISCOVER, DELPHI/MSI) et/ou de dynamique moléculaire (par exemple, CFF/MSI).
Des exemples de telles modélisations sont donnés ci-après dans la partie expérimentale.
La modélisation bio-informatique permet d'observer que la mutation D72N sur la protéine mutée mature entraîne une modification structurale de la courte hélice (T70-A75) dans laquelle se trouve l'acide aminé acide aspartique 72. La boucle entre les hélices D et E avec le résidu Tyr136 en face de l'acide aspartique 72 est également modifiée.
Ainsi, la protéine mutée possède une conformation tridimensionnelle différente de la protéine IFNa-7 naturelle.
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De plus, la mutation D7 ? N entraîne également la perte de la charge négative portée par l'acide aspartique. Enfin, la mutation du résidu acide aspartique 72, proche de la zone de liaison de FNa-7 avec son récepteur, en asparagine en position 72 doit entraîner une altération de la fonctionnalité de la protéine.
La modélisation bio-informatique permet ainsi de prévoir que la présence de l'acide aminé asparagine en position 72 entraîne une modification significative de la structure et de la fonction de la protéine IFNa-7 naturelle.
La modélisation bio-informatique permet d'observer que la mutation F116S sur la protéine mutée mature entraîne une légère perturbation de l'hélice D, mais surtout une modification structurale de la boucle AB au niveau de la courte hélice (E40-D44). Dans cette dernière hélice, l'orientation du glutamate 42 est modifiée.
L'effet le plus important du à la mutation F116S est un affaiblissement de l'effet de"pi-staking" ("empilement pi") crée par le réseau de phénylalanines interne à la structure de l'IFNa-7, ce qui entraîne vraisemblablement une flexibilité structurale accrue de la protéine.
Le pont hydrogène entre l'atome d'azote du squelette peptidique de la phénylalanine 116 avec l'atome d'oxygène du groupement carbonyle du glutamate 114 est conservé.
La modélisation bio-informatique permet ainsi de prévoir que la présence de l'acide aminé sérine en position 116 entraîne une modification significative de la structure et de la fonction de la protéine IFNa-7 naturelle.
La modélisation bio-informatique permet d'observer que la mutation R121K sur la protéine mutée mature entraîne une légère perturbation dans la conformation de l'hélice D.
L'orientation des chaînes latérales des acides aminés LU18, K122, Q125 et F124 est modifiée.
De plus, Il a été montré dans l'IFNa-2 que le résidu R121 (équivalent au R120 dans la séquence de l'IFN-a7) aurait une importance dans l'activité antivirale des interférons (Voir Weber H, Valenzuela D, Lujber G,
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Gubler M, Weissmann C. ;"Single amino acid changes that render human IFN alpha 2 biologically active on mouse cells". (1987) EMBO J. 6 : 591-598.).
La modélisation bio-informatique permet ainsi de prévoir que la présence de l'acide aminé lysine en position 121 entraîne une modification significative de la structure et de la fonction de la protéine IFNa-7 naturelle.
La modélisation bio-informatique permet d'observer que la mutation K 1590 sur la protéine mutée mature entraîne une perturbation de la boucle située après l'hélice E, vraisemblablement jusqu'à l'extrémité Cterminale.
La boucle située juste avant l'hélice B est également modifiée au niveau du résidu Q149.
Le pont hydrogène entre l'atome d'azote de la lysine 159 et l'atome d'oxygène du groupement carbonyle de la thréonine 156 (fin de l'hélice E avec boucle C-terminale) est supprimé.
Il est suspecté que lysine (K) en position 159 puisse affecter la fonction antivirale de la partie C-terminale des interférons (Voir Chang NT, Kung HF, Pestka S. ;"Synthesis of a human leukocyte interferon with a modified carboxy terminus in Escherichia coli. n Arch. Biochem. Biophys. (1983) 221 : 585-589).
La modélisation bio-informatique permet ainsi de prévoir que la présence de l'acide aminé glutamine (Q) en position 159 entraîne une modification significative de la structure et de la fonction de la protéine IFNa-7 naturelle.
Les polymorphismes de type SNP a559c, g580a, c667t, c682t, g1125a, g1161a et a1212g n'entraînent pas de modification de la protéine codée par la séquence nucléotidique du gène IFNa-7 au niveau de la séquence d'acides aminés ! D SEQ ? 2.
Les polymorphismes de type SNP a559c, g580a, c667t et c682t sont dits non codants.
Les polymorphismes de type SNP g1125a, g1161a et a1212g sont dits silencieux.
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Ainsi, le polymorphisme de type SNP silencieux g1125a ne modifie pas l'acide aminé glutamine (Q) en position 125 sur la séquence d'acides aminés ! D SEQ ? 2.
Le polymorphisme de type SNP silencieux g1161a ne modifie pas
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l'acide aminé acide glutamique (E) en position 137 sur la séquence d'acides aminés ID SEQ ? 2.
De même, le polymorphisme de type SNP silencieux a1212g ne modifie pas l'acide aminé leucine (L) en position 159 sur la séquence d'acides aminés ID SEQ N02.
Un génotypage des polynucléotides conformes à l'invention peut être effectué de façon à déterminer la fréquence allélique de ces polynucléotides dans une population. Un exemple de génotypage est donné, ciaprès, dans la partie expérimentale.
La détermination de la fonctionnalité des polypeptides de l'invention peut également être effectuée par un test de leur activité biologique.
A cet égard, on peut mesurer, par exemple, l'effet anti-prolifératif sur la lignée cellulaire de Daudi de polypeptides conformes à l'invention en comparaison avec la protéine IFNa-7 naturelle. Des exemples de tests fonctionnels sont donnés ci-après dans la partie expérimentale.
L'invention a aussi pour objet l'utilisation de polynucléotides et de polypeptides conformes à l'invention ainsi que de molécules thérapeutiques obtenues et/ou identifiées à partir de ces polynucléotides et polypeptides, notamment pour la prévention et le traitement de certains dérèglements et/ou maladies humaines.
La Figure 1 représente la modélisation de la protéine codée conforme à l'invention comportant le polymorphisme de type SNP g1033a et de la protéine IFNa-7 naturelle.
La Figure 2 représente la modélisation de la partie inférieure de chacune des protéines représentées sur la Figure 1.
Le ruban noir des Figures 1 et 2 représente la structure de la protéine IFNa-7 naturelle.
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Le ruban blanc des Figures 1 et 2 représente la structure de la protéine IFNa-7 mutée (D72N).
La Figure 3 représente la modélisation de la protéine codée conforme à l'invention comportant le polymorphisme de type SNP t1166c et de la protéine IFNa-7 naturelle.
La Figure 4 représente la modélisation de la partie supérieure de chacune des protéines représentées sur la Figure 3.
Le ruban noir des Figures 3 et 4 représente la structure de la protéine IFNa-7 naturelle.
Le ruban blanc des Figures 3 et 4 représente la structure de la protéine IFNa-7 mutée (F116S).
La Figure 5 représente la modélisation de la protéine codée conforme à l'invention comportant le polymorphisme de type SNP g1181 a et de la protéine IFNa-7 naturelle.
La Figure 6 représente la modélisation de la partie centrale de chacune des protéines représentées sur la Figure 5.
Le ruban noir des Figures 5 et 6 représente la structure de la protéine IFNa-7 naturelle.
Le ruban blanc des Figures 5 et 6 représente la structure de la protéine IFNa-7 mutée (R121K).
La Figure 7 représente la modélisation de la protéine codée conforme à l'invention comportant le polymorphisme de type SNP a1294c et de la protéine IFNa-7 naturelle.
La Figure 8 représente la modélisation de la partie supérieure gauche de chacune des protéines représentées sur la Figure 7.
Le ruban noir des Figures 7 et 8 représente la structure de la protéine IFNa-7 naturelle.
Le ruban blanc des Figures 7 et 8 représente la structure de la protéine IFNa-7 mutée (K159Q).
La Figure 9 représente le résultat du génotypage du polymorphisme de type SNP g1033a dans une population d'individus.
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Sur cette figure, les abscisses représentent la valeur mp du filtre Tamra (ddTTP) et les ordonnées représentent la valeur mp du filtre R-110 (ddCTP).
En haut à droite, le groupe hétérozygote CT contient 2 individus.
En haut à gauche, le groupe homozygote CC contient 230 individus.
En bas à gauche, le groupe d'individus contient 7 blancs et 7 individus non génotypés.
La Figure 10 représente le résultat du génotypage du polymorphisme de type SNP t1166c dans une population d'individus.
Sur cette figure, les abscisses représentent la valeur mp du filtre Tamra (ddATP) et les ordonnées représentent la valeur mp du filtre R-110 (ddGTP).
En haut à droite, le groupe hétérozygote AG contient 1 individu.
En bas à droite, le groupe homozygote AA contient 238 individus.
En bas à gauche, le groupe d'individus contient 7 blancs.
La Figure 11 représente le résultat du génotypage du polymorphisme de type SNP g1181a dans une population d'individus.
Sur cette figure, les abscisses représentent la valeur mp du filtre Tamra (ddGTP) et les ordonnées représentent la valeur mp du filtre R-110 (ddATP).
En haut à droite, le groupe hétérozygote GA contient 1 individu.
En bas à droite, le groupe homozygote GG contient 232 individu.
En bas à gauche, le groupe d'individus contient 7 blancs et 6 individus non génotypés.
La Figure 12 représente le résultat du génotypage du polymorphisme de type SNP a1294c dans une population d'individus.
Sur cette figure, les abscisses représentent la valeur mp du filtre Tamra (ddATP) et les ordonnées représentent la valeur mp du filtre R-110 (ddCTP).
En haut à droite, le groupe hétérozygote AC contient 2 individus.
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En bas à droite, le groupe homozygote AA contient 236 individus.
En bas à gauche, le groupe d'individus contient 7 blancs et 1 individu non génotypé.
DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION Définitions
Figure img00130001

On entend par"séquence nucléotidique du gène sauvage de référence", la séquence nucléotidique ID SEQ ? 1 du gène IFNa-7 humain.
Cette séquence est accessible dans la GenBank sous le numéro d'accès X02960 et décrite dans les publications suivantes : - Olopade, O. 1. ; Bohlander, S. K. ; Pomykala, H. ; Maltepe, E. ; Van Melle, E. ; Le Beau, M. M. ; Diaz, M. O. :"Mapping of the shortest region of overlap of deletions of the short arm of chromosome 9 associated with human neoplasia." ; Genomics 14 : 437-443,1992.
- Henco K, Brosius J, Fujisawa A, Fujisawa JI, Haynes JR, Hochstadt J, Kovacic T, Pasek M, Schambock A, Schmid J, et al. :"Structural relationship of human interferon alpha genes and pseudogenes." ; J Mol Biol 1985 Sep 20 ; 185 (2) : 227-60.
- Ullrich A, Gray A, Goeddel DV, Dull TJ :"Nucleotide sequence of a portion of human chromosome 9 containing a leukocyte interferon gene cluster."; J Mol.
Biol. 1982 Apr 15 ; 156 (3) : 467-86.
On entend par "protéine IFNa-7 naturelle" la protéine mature
Figure img00130002

codée par la séquence nucléotidique du gène sauvage de référence de FNa- 7. La protéine immature de l'IFNa-7 naturelle correspond à la séquence peptidique ID SEQ ? 2.
On entend par "polynucléotide", un polyribonucléotide ou un polydésoxyribonucléotide qui peut être un ADN ou un ARN modifié ou non.
Le terme polynucléotide inclut, par exemple, un ADN simple brin ou double brin, un ADN composé d'un mélange d'une ou plusieurs région (s) simple brin et d'une ou plusieurs région (s) double brins, un ARN simple brin ou double brin et un ARN composé d'un mélange d'une ou plusieurs région (s)
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simple brin et d'une ou plusieurs région (s) double brins. Le terme polynucléotide peut aussi comprendre un ARN et/ou un ADN comprenant une ou plusieurs régions triple brins. On entend également par polynucléotide les ADNs et ARNs contenant une ou plusieurs bases modifiées de façon à avoir un squelette modifié pour la stabilité ou pour d'autres raisons. On entend par base modifiée, par exemple, les bases inhabituelles telles que l'inosine.
On entend par"polypeptide", un peptide, un oligopeptid, un oligomère ou une protéine comprenant au moins deux acides aminés joints l'un à l'autre par une liaison peptidique normale ou modifiée, comme dans le cas des peptides isostères, par exemple.
Un polypeptide peut être composé d'autres acides aminés que les 20 acides aminés codés par les gènes humains. Un polypeptide peut également être composé d'acides aminés modifiés par des processus naturels, tel que le processus de maturation post-traductionnel ou par des procédés chimiques, qui sont bien connus de l'homme du métier. De telles modifications sont bien détaillées dans la littérature. Ces modifications peuvent apparaître n'importe où dans le polypeptide : dans le squelette peptidique, dans la chaîne d'acides aminés ou encore aux extrémités carboxy-ou amino-terminales.
Un polypeptide peut être ramifié suite à une ubiquitination ou être cyclique avec ou sans ramification. Ce type de modifications peut être le résultat de processus de post-translation naturel ou synthétique, qui sont bien connus de l'homme du métier.
On entend, par exemple, par modifications d'un polypeptide, l'acétylation, l'acylation, l'ADP-ribosylation, l'amidation, la fixation covalente de flavine, la fixation covalente d'un hème, la fixation covalente d'un nucléotide ou d'un dérivé nucléotidique, la fixation covalente d'un lipide ou d'un dérivé lipidique, la fixation covalente d'un phosphatidylinositol, la réticulation covalente ou non-covalente, la cyclisation, la formation de pont disulfure, la
Figure img00140001

déméthylation, la formation de cystéine, la formation de pyroglutamate, la formylation, la gamma-carboxylation, la glycosylation, la formation d'ancre au GPI, l'hydroxylation, l'iodisation, la méthylation, la myristoylation, l'oxydation, le
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processus protéolytique, la phosphorylation, la prénylation, la racémisation, la sénéloylation, la sulfatation, l'addition d'acides aminés telle que l'arginylation ou l'ubiquitination. De telles modifications sont bien détaillées dans la littérature : PROTEINS-STRUCTURE AND MOLECULAR PROPERTIES, 2nd Ed., T. E.
Creighton, New York, 1993, POST-TRANSLATIONAL COVALENT MODIFICATION OF PROTEINS, B. C. Johnson, Ed., Academic Press, New York, 1983, Seifter et al."Analysis for protein modifications and nonprotein cofactors", Meth. Enzymol. (1990) 182 : 626-646 et Rattan et al."Protein Synthesis : Post-translational Modifications and Aging", Ann NY Acad Sci (1992) 663 : 48-62.
On entend par"polynucléotide isolé"ou"polypeptide isolé"un polynucléotide ou un polypeptide tel que défini précédemment qui est isolé du corps humain ou autrement produit par un procédé technique.
On entend par "identité", la mesure d'identité d'une séquence nucléotidique ou polypeptidique.
L'identité est un terme bien connu de l'homme du métier et de la littérature. Voir COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY, Lesk, A. M., Ed., Oxford University Press, New York, 1998 ; BIOCOMPUTING INFORMATICS AND GENOME PROJECT, Smith, D. W., Ed., Academic Press, New York, 1993 ; COMPUTER ANALYSIS OF SEQUENCE DATA, PART t, Griffin, A. M. and Griffin H. G., Ed, Humana Press, New Jersey, 1994 ; et SEQUENCE ANALYSIS IN MOLECULAR BIOLOGY, von Heinje, G., Academic Press, 1987.
Les méthodes communément employées pour déterminer l'identité et la similarité entre deux séquences sont également bien décrites dans la littérature. Voir GUIDE TO HUGE COMPUTER, Martin J. Bishop, Ed, Academic Press, San Diego, 1994, et Carillo H. and Lipton D., Siam J Applied Math (1988) 48 : 1073.
Un polynucléotide ayant, par exemple, une identité d'au moins 95 % avec la séquence nucléotidique ID SEQ ? 1 est un polynucléotide qui comporte au plus 5 points de mutation sur 100 nucléotides, par rapport à ladite séquence.
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Ces points de mutation peuvent être une (ou plusieurs) substitution (s), addition (s) et/ou délétion (s) d'un (ou plusieurs) nucléotide (s).
De même, un polypeptide ayant, par exemple, une identité d'au moins 95 % avec la séquence d'acides aminés ID SEQ NO 2 est un polypeptide qui comporte au plus 5 points de mutation sur 100 acides aminés, par rapport à ladite séquence.
Ces points de mutation peuvent être une (ou plusieurs) substitution (s), addition (s) et/ou délétion (s) d'un (ou plusieurs) acide (s) aminé (s).
Les polynucléotides et les polypeptides conformes à l'invention qui ne sont pas totalement identique avec respectivement la séquence nucléotidique ID SEQ N01 ou la séquence d'acides aminés ID SEQ N'2, étant entendu que ces séquences comportent au moins l'un des polymorphismes de type SNP de l'invention, sont considérés comme des variants de ces séquences.
Habituellement un polynucléotide conforme à l'invention possède la même, ou pratiquement la même activité biologique que la séquence nucléotidique ID SEQ N01 comportant au moins l'un des polymorphismes de type SNP de l'invention.
De même, habituellement un polypeptide conforme à l'invention possède la même, ou pratiquement la même activité biologique que la séquence d'acides aminés ID SEQ N02 comportant au moins l'un des polymorphismes de type SNP codants de l'invention.
Un variant, selon l'invention, peut être obtenu, par exemple, par mutagenèse dirigée ou par synthèse directe.
On entend par "polymorphisme de type SNP", toute variation naturelle d'une base dans une séquence nucléotidique. Un polymorphisme de type SNP, sur une séquence nucléotidique, peut être codant, silencieux, ou non codant.
Un polymorphisme de type SNP codant est un polymorphisme compris dans la séquence codante d'une séquence nucléotidique qui entraîne
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une modification d'un acide aminé dans la séquence d'acides aminés codée par cette séquence nucléotidique. Dans ce cas, le terme polymorphisme de type SNP s'applique également, par extension, à une mutation dans une séquence d'acides aminés.
Un polymorphisme de type SNP silencieux est un polymorphisme compris dans la séquence codante d'une séquence nucléotidique qui n'entraîne pas une modification d'un acide aminé dans la séquence d'acides aminés codée par cette séquence nucléotidique.
Un polymorphisme de type SNP non codant est un polymorphisme compris dans la séquence non codante d'une séquence nucléotidique. Ce polymorphisme peut notamment se trouver dans un intron, une zone d'épissage, une séquence promotrice de transcription ou un site enhancer.
On entend par "polymorphisme de type SNP fonctionnel", un polymorphisme de type SNP, tel que défini précédemment, qui est compris dans une séquence nucléotidique ou une séquence d'acides aminés, ayant une fonctionnalité.
On entend par "fonctionnalité", l'activité biologique d'un polypeptide ou d'un polynucléotide.
La fonctionnalité d'un polypeptide ou d'un polynucléotide conforme à l'invention peut consister en une conservation, une augmentation, une diminution ou une suppression de l'activité biologique du polypeptide codé par la séquence nucléotidique du gène sauvage de référence ou de cette dernière séquence nucléotidique.
La fonctionnalité d'un polypeptide ou d'un polynucléotide conforme à l'invention peut également consister en un changement de la nature de l'activité biologique du polypeptide codé par la séquence nucléotidique du gène sauvage de référence ou de cette dernière séquence nucléotidique.
L'activité biologique peut, notamment, être liée à l'affinité ou à l'absence d'affinité d'un polypeptide conforme à l'invention vis-à-vis d'un récepteur.
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Polynucléotide
La présente invention a pour premier objet un polynucléotide isolé comprenant : a) une séquence nucléotidique ayant au moins 80 % d'identité, préférentiellement au moins 90 % d'identité, plus préférentiellement au moins 95 % d'identité et encore plus préférentiellement au moins 99 % d'identité avec la séquence ID SEQ ? 1 ou sa séquence codante (du nucléotide 751 au nucléotide 1320), étant entendu que cette séquence nucléotidique comporte au moins l'un des polymorphismes de type SNP codants suivants : t779c, g1033a, c1084a, g1135t, t1166c, g1181a, a1294c ; ou b) une séquence nucléotidique complémentaire à une séquence nucléotidique sous a).
La présente invention concerne également un polynucléotide isolé comprenant : a) la séquence nucléotidique ID SEQ ? 1 ou sa séquence codante, étant entendu que chacune de ces séquences comporte au moins l'un des polymorphismes de type SNP codants suivants : t779c, g1033a, c1084a, g1135t, t1166c, g1181a, a1294c ; ou b) une séquence nucléotidique complémentaire à une séquence nucléotidique sous a).
Préférentiellement, le polynucléotide de l'invention consiste en la séquence ID SEQ ? 1 ou sa séquence codante, étant entendu que chacune de ces séquences comporte au moins l'un des polymorphismes de type SNP codants suivants : t779c, g1033a, c1084a, g1135t, t1166c, g1181a, a1294c.
Selon l'invention, le polynucléotide défini précédemment comporte préférentiellement un seul polymorphisme de type SNP codant choisi dans le groupe constitué par : t779c, g1033a, c1084a, g1135t, t1166c, g1181a et a1294.
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Un polynucléotide tel que défini précédemment peut également comprendre au moins l'un des polymorphismes de type SNP non codants et/ou silencieux suivants : a559c, g580a, c667t, c682t, g1125a, g1161a, a1212g.
La présente invention a également pour objet un polynucléotide isolé comprenant ou consistant en : a) la séquence nucléotidique ID SEQ ? 1 ou le cas échéant sa séquence codante, étant entendu que chacune de ces séquences comporte au moins l'un des polymorphismes de type SNP non codants et/ou silencieux suivants : a559c, g580a, c667t, c682t, g1125a, g1161a, a1212g ; ou b) une séquence nucléotidique complémentaire à une séquence nucléotidique sous a).
Bien entendu, seul les polymorphismes de type SNP silencieux suivants g1125a, g1161 a, a1212g sont localisés dans la séquence codante de
Figure img00190001

là séquence nucléotidique ID SEQ NO 1.
La présente invention a aussi pour objet un polynucléotide isolé codant pour un polypeptide comprenant : a) la séquence d'acides aminés ID SEQ NO 2, ou b) la séquence d'acides aminés comprenant les acides aminés compris entre
24 et 189 de la séquence d'acides aminés ID SEQ NO 2, étant entendu que chacune des séquences d'acides aminés sous a) et b) comporte au moins l'un des polymorphismes de type SNP codants suivants : V10A, D95N, L 1121, V129L, F139S, R144K, K1820.
Il est entendu, au sens de la présente invention, que la numérotation correspondant au positionnement des polymorphismes de type SNP V1 OA, D95N,
Figure img00190002

L 1121, V129L, F139S, R144K et K182Q. est relative à la numérotation de la séquence d'acides aminés ID SEQ ? 2.
Selon un objet préféré de l'invention, le polypeptide défini précédemment comporte un seul polymorphisme de type SNP codant choisi parmi V10A, D95N, L 1121, V129L, F139S, R144K et K182Q.
Préférentiellement un polynucléotide conforme à l'invention est composé d'une molécule d'ADN ou d'ARN.
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Un polynucléotide conforme à l'invention peut être obtenu par les méthodes standards de synthèse d'ADN ou d'ARN.
Un polynucléotide conforme à l'invention peut également être obtenu par mutagenèse dirigée à partir de la séquence nucléotidique du gène IFNa-7 en modifiant le nucléotide sauvage par le nucléotide muté pour chaque polymorphisme de type SNP sur la séquence nucléotidique ID SEQ No 1.
Par exemple, un polynucléotide conforme à l'invention, comportant un polymorphisme de type SNP g1033a peut être obtenu par mutagenèse dirigée à partir de la séquence nucléotidique du gène IFNoc-7 en modifiant le nucléotide guanine (g) par le nucléotide adénine en position 1033 sur la séquence nucléotidique ID SEQ N'l.
Les procédés de mutagenèse dirigée qui peuvent ainsi être mis en oeuvre sont bien connus de l'homme du métier. On peut notamment évoquer la publication de TA Kunkel en 1985 dans"Proc. Natt. Acad. Sci. USA"82 : 488.
Un polynucléotide isolé peut également comprendre, par exemple, des séquences nucléotidiques codant pour des séquences d'acides aminés pre-, pro-ou pre-pro-protéine ou des séquences d'acides aminés marqueurs, comme l'hexa-histidine peptide.
Un polynucléotide de l'invention peut également être associé à des séquences nucléotidiques codant pour d'autres protéines ou fragments de protéines en vue d'obtenir des protéines de fusion ou à des fins de purification.
Un polynucléotide conforme à l'invention peut également comprendre des séquences nucléotidiques comme les séquences 5'et/ou 3' non-codantes, telles que, par exemple, des séquences transcrites ou non, des séquences traduites ou non, des séquences signal d'épissage, des séquences polyadénylées, des séquences de liaison avec des ribosomes ou encore des séquences qui stabilisent l'ARNm.
On définit comme séquence nucléotidique complémentaire à la séquence nucléotidique un polynucléotide qui peut être hybridé avec cette séquence nucléotidique, dans des conditions stringentes.
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On entend généralement, mais pas nécessairement, par "conditions stringentes d'hybridation" les conditions chimiques qui permettent une hybridation lorsque les séquences nucléotidiques ont une identité d'au moins 80 %, de préférence supérieure ou égale à 90 %, encore plus préférentiellement supérieure ou égale à 95 % et tout particulièrement supérieure ou égale à 97 %.
Les conditions stringentes peuvent être obtenues selon les méthodes bien connues de l'homme du métier et, par exemple, par une incubation des polynucléotides, à 420 C, dans une solution comprenant 50 % de formamide, 5xSSC (150 Mm de NaCI, 15 mM de trisodium citrate), 50 Mm de sodium phosphate (pH = 7,6), 5x Solution Denhardt, 10 % de dextran sulfate et 20). tg d'ADN de sperme de saumon dénaturé, suivi d'un lavage des filtres à 0, 1x SSC, à 650 C.
Dans le cadre de l'invention, lorsque les conditions stringentes d'hybridation permettent une hybridation des séquences nucléotidiques ayant une identité égale à 100 %, on considère que la séquence nucléotidique est strictement complémentaire à la séquence nucléotidique sous a), telle que décrite plus haut.
Il est bien entendu au sens de la présente invention que la séquence nucléotidique complémentaire d'une séquence nucléotidique comportant l'un au moins des polymorphismes de type SNP conforme à l'invention en anti-sens.
Ainsi, par exemple, si la séquence nucléotidique comporte le polymorphisme de type SNP g1033a, sa séquence nucléotidique complémentaire comporte toujours le nucléotide thymine (t) en position 1033.
Identification, hybridation et/ou amplification d'un polynucléotide comportant un polymorphisme de type SNP
La présente invention a aussi pour objet l'utilisation de tout ou partie d'un polynucléotide défini précédemment, pour identifier, hybrider et/ou amplifier tout ou partie d'un polynucléotide consistant en la séquence
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nucléotidique ID SEQ ? 1 ou le cas échéant sa séquence codante (du nucléotide 751 au nucléotide 1320), étant entendu que chacune de ces séquences comporte au moins l'un des polymorphismes de type SNP suivants : a559c, g580a, c667t, c682t, t779c, g1033a, c1084a, g1125a, g1135t, g1161a, t1166c, g1181a, a1212g, a1294c.
Génotvpage et détermination de la fréquence d'un polymorphisme de type SNP
La présente invention a également pour objet l'utilisation de tout ou partie d'un polynucléotide conforme à l'invention comme outil de génotypage.
La présente invention a aussi pour objet un procédé de détermination de la fréquence d'un polymorphisme de type SNP d'un polynucléotide conforme à l'invention dans lequel on procède à un génotypage chez un individu ou dans une population d'individus.
Au sens de l'invention, on définit le génotypage comme un procédé de détermination du génotype d'un individu ou d'une population d'individus.
On entend par"population d'individus", un groupe d'individus déterminés de façon aléatoire ou non. Ces individus peuvent être des humains, des animaux, des micro-organismes ou des plantes.
Les individus peuvent être choisis selon leur ethnie ou selon leur phénotype, notamment ceux qui sont atteints par les dérèglements et/ou maladies suivantes : les différents cancers comme, par exemple, les carcinomes, les mélanomes, les lymphomes, les myélomes, les tumeurs cancéreuses ou non, les leucémies et les cancers du foie, du cou, de la tête et des reins, les maladies cardiovasculaires, les maladies métaboliques telles que celles qui ne sont pas liées au système immunitaire comme, par exemple,
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l'obésité, les maladies infectieuses comme les hépatites B et C et le SIDA, les pneumonies, les colites ulcératives, les maladies du système nerveux central comme, par exemple, la maladie d'Alzheimer, la schizophrénie et la dépression, le rejet de greffe de tissus ou d'organes, la cicatrisation de blessures, l'anémie
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chez les patients dialysés, les allergies, l'asthme, les scléroses multiples, )'osteoporose, le psoriasis, l'arthrite rhumatoïde, la maladie de Crohn, les maladies et les désordres auto-immuns, les verrues génitales ou vénériennes, les désordres gastro-intestinaux ou encore les désordres liés aux traitements par chimiothérapie.
Un polymorphisme de type SNP fonctionnel conforme à l'invention est préférentiellement génotypé dans une population d'individus.
Il existe de multiples technologies de pouvant être mises en oeuvre pour génotyper des polymorphismes de type SNP génotypage (voir notamment Kwok Pharmacogenomics, 2000, vol 1, pp 95-100."High- throughput genotyping assay approaches"). Ces technologies sont basées sur l'un des quatre principes suivants : hybridation d'oligonucléotides spécifiques d'allèles, élongation d'un oligonucléotide par des didésoxynucléotides en présence ou non de désoxynucléotides, ligation d'oligonucléotides spécifiques d'allèles ou clivage d'oligonucléotides spécifiques d'allèles. Chacune de ces technologies peut être couplé à un système de détection tel que la mesure de la fluorescence directe ou polarisée, ou la spectrométrie de masse.
Le génotypage peut notamment être effectué par un miniséquençage avec des ddNTPs chauds (2 ddNTPs différents marqués par des fluorophores différents) et froids (2 ddNTPs non marqués), en liaison avec un lecteur de fluorescence polarisé. Le protocole de miniséquençage avec lecture de fluorescence polarisée (Technologie FP-TDI ou Fluorescence Polarization Template-direct Dye-Terminator Incorporation) est bien connu de l'homme du métier.
Il peut être réalisé sur un produit obtenu après amplification par réaction de polymérisation en chaîne (PCR) de l'ADN de chaque individu. Ce produit PCR est choisi pour couvrir la région génique du polynucléotide contenant le polymorphisme de type SNP étudié. Après la dernière étape dans le thermocycleur de la PCR, la plaque est alors placée sur un lecteur de fluorescence polarisée pour la lecture des bases marquées en utilisant les filtres d'excitation et d'émission spécifique des fluorophores. Les valeurs
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d'intensité des bases marquées sont reportées sur un graphe.
Les amorces respectivement sens et antisens pour l'amplification PCR, dans le cas d'un polymorphisme de type SNP de l'invention, peuvent facilement être choisis par l'homme du métier selon la position des polymorphismes de type SNP conforme à l'invention.
Par exemple, les séquences nucléotidiques sens et antisens pour l'amplification PCR peuvent être respectivement ID SEQ No 3 et ID SEQ No 4.
Ces séquences nucléotidiques permettent d'amplifier un fragment d'une longueur de 669 nucléotides, du nucléotide 711 au nucléotide 1379 dans la séquence nucléotidique ID SEQ No 1.
Une analyse statistique de la fréquence de chaque allèle (fréquence allélique) codé par le gène comportant le SNP dans la population d'individus est alors effectuée, ce qui permet de déterminer l'importance de leur impact et leur répartition dans les différents sous-groupes et notamment, le cas échéant, les diverses ethnies qui constituent cette population d'individus.
Les données de génotypage sont analysées pour estimer les fréquences de distributions des différents allèles observés dans les populations étudiées. Les calculs de fréquences alléliques peuvent être réalisés à l'aide de logiciels tels SAS-suite&commat; (SAS) ou PLUS&commat; (MathSoft). La comparaison des distributions alléliques d'un polymorphisme de type SNP de l'invention au travers des différentes ethnies de la population d'individus peut être réalisée au moyen des logiciels ARLEQUIN&commat; et SAS-suite&commat;.
La présente invention a également pour objet l'utilisation d'un polynucléotide conforme à l'invention pour la recherche d'une variation dans la séquence nucléotidique du gène IFNa-7 chez un individu.
Vecteur d'expression et cellule hôte
La présente invention a aussi pour objet un vecteur recombinant comprenant au moins un polynucléotide conforme à l'invention.
De nombreux systèmes d'expression peuvent être utilisés, comme, par exemple, les chromosomes, les épisomes, les virus dérivés. Plus
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particulièrement, les vecteurs recombinants utilisés peuvent être dérivés de plasmides bactériens, de transposons, d'épisome de levure, d'éléments d'insertion, d'éléments chromosomiques de levures, de virus tels que les baculovirus, les papillonna virus comme SV40, les vaccinia virus, les adénovirus, les fox pox virus, les pseudorabies virus, les rétrovirus.
Ces vecteurs recombinants peuvent également être des dérivés de cosmides ou de phagemides. La séquence nucléotidique peut être insérée dans le vecteur recombinant d'expression par les méthodes bien connues de l'homme du métier, telles que, par exemple, celles qui sont décrites dans MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL (supra) Sambrook et al..
Le vecteur recombinant peut comprendre des séquences nucléotidiques de contrôle de la régulation de l'expression du polynucléotide ainsi que des séquences nucléotidiques permettant l'expression et la transcription d'un polynucléotide de l'invention et la traduction d'un polypeptide de l'invention, ces séquences étant choisies en fonction des cellules hôtes mises en oeuvre.
Ainsi, par exemple, un signal de sécrétion approprié peut être intégré dans le vecteur recombinant pour que le polypeptide, codé par le polynucléotide de l'invention, soit dirigé vers la lumière du réticulum endoplasmique, vers l'espace périplasmique, sur la membrane ou vers l'environnement extracellulaire.
La présente invention a aussi pour objet une cellule hôte comprenant un vecteur recombinant conforme à l'invention.
L'introduction du vecteur recombinant dans une cellule hôte peut être effectuée selon les méthodes bien connues de l'homme du métier telles que celles décrites dans BASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, Davis et al., 1986 et MOLECULAR CLONING : A LABORATORY MANUAL, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y., 1989, telles que la transfection par calcium phosphate, le transfection par DEAE dextran, la transvection, la microinjection, la transfection par lipides cationiques, l'électroporation, la transduction ou l'infection.
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Les cellules hôtes peuvent être, par exemple, des cellules bactériennes telles que les cellules de streptocoque, de staphylocoque, d'E. coli ou de Bacillus subtilis, des cellules de champignons telles que les cellules de levure et les cellules d'Aspergillus, de Streptomyces, des cellules d'insectes telles que les cellules de Drosophilia S2 et de Spodoptera Sf9, des cellules animales, telles que les cellules CHO, COS, HeLa, C127, BHK, HEK 293 et des cellules humaines du sujet à traiter ou encore des cellules végétales.
Les cellules hôtes peuvent être utilisées, par exemple, pour exprimer un polypeptide de l'invention ou en tant que produit actif dans des compositions pharmaceutiques, comme on le verra ci-après.
Polypeptide
La présente invention a aussi pour objet un polypeptide isolé comprenant une séquence d'acides aminés ayant au moins 80 % d'identité, préférentiellement au moins 90 % d'identité, plus préférentiellement au moins 95 % d'identité et encore plus préférentiellement au moins 99 % d'identité avec : a) la séquence d'acides aminés ID SEQ ? 2 ou avec b) la séquence d'acides aminés comportant les acides aminés compris entre
24 et 189 de la séquence d'acides aminés ID SEQ NO 2, étant entendu que chacune des séquences d'acides aminés sous a) et b) comporte au moins l'un des polymorphismes de type SNP codants suivants : V10A, D95N, L 1121, V129L, F139S, R144K, K182Q.
Le polypeptide de l'invention peut également comprendre : a) la séquence d'acides aminés ID SEQ NO 2, ou b) la séquence d'acides aminés comportant les acides aminés compris entre
24 et 189 de la séquence d'acides aminés ID SEQ NO 2, étant entendu que chacune des séquences d'acides aminés sous a) et b) comporte au moins l'un des polymorphismes de type SNP codants suivants : V10A, D95N, L 1121, V129L, F139S, R144K, K182Q.
Le polypeptide de l'invention peut tout particulièrement consister en :
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a) la séquence d'acides aminés ID SEQ NO 2, ou b) la séquence d'acides aminés comportant les acides aminés compris entre
24 et 189 de la séquence d'acides aminés ID SEQ NO 2, étant entendu que chacune des séquences d'acides aminés sous a) et b) comporte au moins l'un des polymorphismes de type SNP codants suivants : V10A, D95N, L1121, V129L, F139S, R144K, K182Q..
Préférentiellement, un polypeptide conforme à l'invention comporte un seul polymorphisme de type SNP codant choisi dans le groupe constitué par : V10A, D95N, L 1121, V129L, F139S, R144K et K182Q.
La présente invention a également pour objet un procédé de préparation d'un polypeptide ci-dessus décrit, dans lequel une cellule hôte définie précédemment est cultivée et ledit polypeptide est isolé du milieu de culture.
Le polypeptide peut être purifié à partir des cellules hôtes, selon les méthodes bien connues de l'homme du métier telles que la précipitation à l'aide d'agents chaotropiques comme les sels, en particulier le sulfate d'ammonium, l'éthanol l'acétone ou l'acide trichloroacétique, l'extraction à l'acide ; la chromatographie échangeuse d'ions ; la chromatographie par phosphocellulose ; la chromatographie par interaction hydrophobe ; la chromatographie d'affinité ; la chromatographie hydroxylapatite ou les chromatographies d'exclusion.
On entend par"milieu de culture", le milieu dans lequel on isole ou purifie le polypeptide de l'invention. Ce milieu peut être constitué par le milieu extracellulaire et/ou le Iysat cellulaire. Des techniques biens connues de l'homme du métier permettent également à ce dernier de redonner la conformation active au polypeptide, si la conformation dudit polypeptide a été altérée lors de l'isolation ou de la purification.
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Anticorps
La présente invention a aussi pour objet un procédé d'obtention d'un anticorps immunospécifique.
On entend par "anticorps", les anticorps monoclonaux, polyclonaux, chimériques, simple chaîne, humanisés ainsi que les fragments Fab, incluant les produits d'un Fab ou d'une banque d'expression d'immunoglobulines.
Un anticorps immunospécifique peut être obtenu par immunisation d'un animal avec un polypeptide conforme à l'invention.
L'invention concerne aussi un anticorps immunospécifique pour un polypeptide conforme à l'invention, tel que défini précédemment.
Un polypeptide selon l'invention, un de ses fragments, un analogue, un de ses variants ou une cellule exprimant ce polypeptide peuvent aussi être utilisés pour produire des anticorps immunospécifiques.
Le terme"immunospécifique"signifie que l'anticorps possède une meilleure affinité pour le polypeptide de l'invention que pour d'autres polypeptides connus de l'art antérieur.
Les anticorps immunospécifiques peuvent être obtenus par administration d'un polypeptide de l'invention, d'un de ses fragments, d'un analogue ou d'un fragment épitopique ou d'une cellule exprimant ce polynucléotide chez un mammifère, de préférence non humain, selon les méthodes bien connues de l'homme du métier.
Pour la préparation d'anticorps monoclonaux, on peut utiliser des méthodes usuelles de production d'anticorps, à partir de lignées cellulaires, telles que la technique des hybridomes (Kohler et al., Nature (1975) 256 : 495- 497), la technique des trimes, la technique des hybridomes de cellules B humaines (Kozbor et al., Immunology Today (1983) 4 : 72) et la technique des hybridomes EBV (Cole et al., MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, pp. 77-96, Alan R. Liss, 1985).
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Les techniques de production d'anticorps simple-chaîne telles que décrites, par exemple, dans le brevet US No 4,946, 778 peuvent être également utilisées.
Des animaux transgéniques comme les souris, par exemple, peuvent être également utilisés pour produire des anticorps humanisés.
Agents interagissant avec le polypeptide de l'invention
La présente invention a également pour objet un procédé d'identification d'un agent activateur ou inhibiteur d'un polypeptide conforme à l'invention, comprenant : a) la préparation d'un vecteur recombinant comprenant un polynucléotide conforme à l'invention comportant au moins un polymorphisme de type SNP codant selon l'invention, b) la préparation de cellules hôtes comprenant un vecteur recombinant selon a), c) la mise en présence de cellules hôtes selon b) avec un agent à tester, et b) la détermination de l'effet activateur ou inhibiteur généré par l'agent à tester.
Un polypeptide conforme à l'invention peut ainsi être employé pour un procédé de criblage de composés qui rentrent en interaction avec celuici.
Ces composés peuvent être des agents activateurs (agonistes) ou inhibiteurs (antagonistes) de l'activité intrinsèque d'un polypeptide selon l'invention. Ces composés peuvent également être des ligands ou des substrats d'un polypeptide de l'invention. Voir Coligan et al., Current Protocols in Immunology 1 (2), Chapter 5 (1991).
En général, pour mettre en place un tel procédé, il est d'abord souhaitable de produire des cellules hôtes appropriées qui expriment un polypeptide conforme à l'invention. De telles cellules peuvent être, par exemple, des cellules de mammifères, de levures, d'insectes comme Drosophilia ou de bactéries comme E. coli.
Ces cellules ou des extraits de membrane de ces cellules, sont alors mises en présence des composés à tester.
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On peut ainsi observer la capacité de liaison des composés à tester avec le polypeptide de l'invention, mais également l'inhibition ou l'activation de la réponse fonctionnelle.
L'étape d) du procédé ci-dessus peut être mise en oeuvre en utilisant un agent à tester marqué directement ou indirectement. Elle peut aussi comprendre un test de compétition, en utilisant un agent marqué ou non et un agent compétiteur marqué.
On peut également déterminer si un agent à tester conduit à la génération d'un signal d'activation ou d'inhibition sur des cellules exprimant le polypeptide de l'invention, en utilisant des moyens de détection appropriés, suivant le signal à détecter.
De tels agents activateurs ou inhibiteurs peuvent être des polynucléotides, et dans certains cas des oligonucléotides ou des polypeptides, comme des protéines ou des anticorps, par exemple.
La présente invention a aussi pour objet une méthode pour l'identification d'un agent activé ou inhibé par un polypeptide conforme à l'invention, comprenant : a) la préparation d'un vecteur recombinant comprenant un polynucléotide conforme à l'invention comportant au moins un polymorphisme de type SNP codant selon l'invention, b) la préparation de cellules hôtes comprenant un vecteur recombinant selon a), c) la mise en présence de cellules hôtes selon b) avec un agent à tester, et b) la détermination de l'effet activateur ou inhibiteur généré par l'agent à tester.
Un agent activé ou inhibé par le polypeptide de l'invention est un agent qui répond, respectivement, par une activation ou une inhibition en présence de ce polypeptide. Les agents activés ou inhibés, directement ou indirectement, par le polypeptide de l'invention peuvent consister en des polypeptides comme, par exemple, des récepteurs membranaires ou nucléaires, des kinases et plus préférentiellement des tyrosines kinases, des facteurs de transcription ou des polynucléotides.
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Détection de maladies
La présente invention a aussi pour objet un procédé de détection de l'expression d'un polypeptide de séquence d'acides aminés ID SEQ ? 2 (ou un polypeptide comportant les acides aminés compris entre 24 et 189 de la séquence d'acides aminés ID SEQ N'2) codé par un polynucléotide conforme à l'invention et/ou d'un polypeptide conforme à l'invention, comprenant : a) la détection de la présence ou de l'absence d'un polynucléotide selon l'invention dans le génome du sujet, et/ou b) la détermination de la concentration d'un polypeptide selon l'invention chez un sujet.
La détection d'un polynucléotide et/ou la détermination de la concentration d'un polypeptide selon l'invention peut permettre de savoir si un sujet est atteint ou risque d'être atteint ou, au contraire, présente une résistance partielle au développement d'une maladie, d'une indisposition ou d'un dérèglement tels que définis précédemment, relatifs à l'expression d'un polypeptide de l'invention.
Préférentiellement, dans l'étape a) du procédé de détection mentionné ci-dessus, on va détecter la présence ou l'absence d'un polynucléotide comportant au moins un polymorphisme de type SNP codant tel que défini précédemment.
La détection du polynucléotide peut être réalisé à partir d'échantillons biologiques du sujet à étudier, tels que des cellules, du sang, de l'urine, de la salive, ou à partir d'une biopsie ou d'une autopsie du sujet à étudier. L'ADN génomique peut être utilisé directement pour la détection ou après à une amplification par PCR, par exemple. L'ARN ou l'ADNc peuvent également être utilisés de façon similaire.
Il est ensuite possible de comparer la séquence nucléotidique d'un polynucléotide conforme à l'invention avec la séquence nucléotidique détectée dans le génome du sujet.
La comparaison des séquences nucléotidiques peut être effectuée par séquençage par des méthodes d'hybridation de l'ADN, par différence de
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mobilité des fragments d'ADN sur gel d'électrophorèse avec ou sans agents dénaturants ou par différence de températures de fusion. Voir Myers et aL, Science (1985) 230 : 1242. De telles modifications dans la structure de la séquence nucléotidique en un point précis peuvent également être révélées par des essais de protection aux nucléases, telles que l'ARNase et la nucléase Sl ou encore par des agents chimiques de clivage. Voir Cotton et al., Proc. Nat.
Acad. Sci. USA (1985) 85 : 4397-4401. Des sondes oligonucléotidiques comprenant un fragment d'un polynucléotide de l'invention peuvent également être utilisées pour conduire le criblage.
De nombreuses méthodes bien connues de l'homme du métier peuvent être utilisées pour déterminer l'expression d'un polynucléotide de l'invention et pour identifier la variabilité génétique de ce polynucléotide. Voir Chee et aL, Science (1996), Vol 274, pp 610-613.
La présente invention a également pour objet l'utilisation d'un polynucléotide conforme à l'invention pour effectuer un diagnostic génétique d'une maladie ou d'une résistance à une maladie liée à la présence, chez un ou plusieurs individus de la population humaine, de l'allèle mutant codé par un polymorphisme de type SNP fonctionnel conforme à l'invention.
Ces maladies peuvent être des dérèglements et/ou des maladies humaines, tels que les différents cancers comme, par exemple, les carcinomes, les mélanomes, les lymphomes, les myélomes, les tumeurs cancéreuses ou non, les leucémies et les cancers du foie, du cou, de la tête et des reins, les maladies cardiovasculaires, les maladies métaboliques telles que celles qui ne sont pas liées au système immunitaire comme, par exemple, l'obésité, les maladies infectieuses en particulier virales comme les hépatites B et C et le SIDA, les pneumonies, les colites ulcératives, les maladies du système nerveux central comme, par exemple, la maladie d'Alzheimer, la schizophrénie et la dépression, le rejet de greffe de tissus ou d'organes, la cicatrisation de blessures, l'anémie en particulier chez les patients dialysés, les allergies, l'asthme, les scléroses multiples, l'ostéoporose, le psoriasis, l'arthrite rhumatoïde, la maladie de Crohn, les maladies et les désordres auto-immuns,
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les verrues génitales ou vénériennes, les désordres gastro-intestinaux ou encore les désordres liés aux traitements par chimiothérapie.
La détermination de la concentration d'un polypeptide selon l'invention, dans l'étape b), peut également aider au diagnostic d'une maladie, d'une indisposition ou un dérèglement ou, au contraire, la résistance à une maladie, une indisposition ou un dérèglement chez un sujet en prélevant un échantillon dérivé de ce sujet.
L'augmentation ou la diminution de l'expression du polypeptide peut être mesurée en quantifiant le niveau d'ARN codant pour ce polypeptide, suivant les méthodes bien connues de l'homme du métier, par exemple, par PCR, RT-PCR, protection à l'ARNase, Northern blot, et autres méthodes d'hybridation.
Il est également possible de déterminer la concentration en polypeptides de l'invention présents dans un échantillon biologique du sujet par des méthodes bien connues, par exemple, par radioimmunoessai, tests de liaisons compétitives, Western blot et tests ELISA.
Consécutivement à l'étape b), on peut comparer la concentration déterminée en polypeptide conforme à l'invention avec la concentration en protéine IFNoe-7 naturelle habituellement rencontrée chez un sujet.
L'homme du métier peut identifier le seuil au-dessus ou en dessous duquel apparaît la sensibilité ou, au contraire, la résistance à la maladie, l'indisposition ou le dérèglement évoqué ci-dessus, à l'aide des publications de l'art antérieur ou par des tests ou des essais conventionnels, comme ceux qui sont mentionnés précédemment.
Médicaments et traitements des maladies
La présente invention a aussi pour objet un médicament renfermant, à titre de principe actif, un polypeptide conforme à l'invention.
L'invention concerne encore l'utilisation d'un polypeptide conforme à l'invention, pour la fabrication d'un médicament destinée à la prévention ou au traitement de différents dérèglements et/ou maladies humaines, tels que les
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différents cancers comme, par exemple, les carcinomes, les mélanomes, les lymphomes, les myélomes, les tumeurs cancéreuses ou non, les leucémies et les cancers du foie, du cou, de la tête et des reins, les maladies cardiovasculaires, les maladies métaboliques telles que celles qui ne sont pas liées au système immunitaire comme, par exemple, l'obésité, les maladies infectieuses en particulier virales comme les hépatites B et C et le SIDA, les pneumonies, les colites ulcératives, les maladies du système nerveux central comme, par exemple, la maladie d'Alzheimer, la schizophrénie et la dépression, le rejet de greffe de tissus ou d'organes, la cicatrisation de blessures, l'anémie en particulier chez les patients dialysés, les allergies, l'asthme, les scléroses multiples, l'ostéoporose, le psoriasis, l'arthrite rhumatoïde, la maladie de Crohn, les maladies et les désordres auto-immuns, les verrues génitales ou vénériennes, les désordres gastro-intestinaux ou encore les désordres liés aux traitements par chimiothérapie.
Préférentiellement, un polypeptide conforme à l'invention peut être utilisé pour la fabrication d'un médicament destinée à la prévention ou au traitement de différents dérèglements et/ou maladies humaines, tels que les hépatites chroniques B et C, les leucémies telles que la leucémie à tricholeucocytes et la leucémie myéloïde chronique, les myélomes multiples, des lymphomes folliculaires, les tumeurs carcinoïdes, les mélanomes malins, les carcinomes rénaux métastasés, la maladie d'Alzheimer, la maladie de Parkinson ainsi que les tumeurs qui apparaissent à la suite d'un déficit immunitaire, tel que le sarcome de Kaposi dans le cas du SIDA.
Certains des composés permettant d'obtenir le polypeptide conforme à l'invention ainsi que les composés obtenus ou identifiés par ou à partir de ce polypeptide peuvent également être utilisés pour le traitement thérapeutique du corps humain, c'est-à-dire à titre de médicament.
C'est pourquoi la présente invention a aussi pour objet un médicament contenant, à titre de principe actif un polynucléotide conforme à l'invention comportant au moins un polymorphisme de type SNP codant défini précédemment, un vecteur recombinant défini précédemment, une cellule hôte
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définie précédemment, un anticorps défini précédemment et/ou un agent activateur et/ou inhibiteur d'un polypeptide conforme à l'invention.
L'invention concerne encore l'utilisation d'un polynucléotide conforme à l'invention comportant au moins un polymorphisme de type SNP
5 codant défini précédemment, d'un vecteur recombinant défini précédemment, d'une cellule hôte définie précédemment, d'un anticorps défini précédemment et/ou un agent activateur et/ou inhibiteur d'un polypeptide conforme à l'invention, pour la fabrication d'un médicament destinée à la prévention ou au traitement de différents dérèglements et/ou maladies humaines, tels que les 10 différents cancers comme, par exemple, les carcinomes, les mélanomes, les lymphomes, les myélomes, les tumeurs cancéreuses ou non, les leucémies et les cancers du foie, du cou, de la tête et des reins, les maladies cardiovasculaires, les maladies métaboliques telles que celles qui ne sont pas liées au système immunitaire comme, par exemple, l'obésité, les maladies 15 infectieuses en particulier virales comme les hépatites B et C et le SIDA, les pneumonies, les colites ulcératives, les maladies du système nerveux central comme, par exemple, la maladie d'Alzheimer, la schizophrénie et la dépression, le rejet de greffe de tissus ou d'organes, la cicatrisation de blessures, l'anémie en particulier chez les patients dialysés, les allergies, l'asthme, les scléroses 20 multiples, l'ostéoporose, le psoriasis, l'arthrite rhumatoïde, la maladie de Crohn, les maladies et les désordres auto-immuns, les verrues génitales ou vénériennes, les désordres gastro-intestinaux ou encore les désordres liés aux traitements par chimiothérapie.
Préférentiellement, un polynucléotide conforme à l'invention 25 comportant au moins un polymorphisme de type SNP codant défini précédemment, un vecteur recombinant défini précédemment, une cellule hôte définie précédemment, un anticorps défini précédemment et/ou un agent activateur et/ou inhibiteur d'un polypeptide conforme à l'invention peuvent être utilisés pour la fabrication d'un médicament destinée à la prévention ou au 30 traitement de différents dérèglements et/ou maladies humaines, tels que les hépatites chroniques B et C, les leucémies telles que la leucémie à
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tricholeucocytes et la leucémie myéloïde chronique, les myélomes multiples, des lymphomes folliculaires, les tumeurs carcinoïdes, les mélanomes malins, les carcinomes rénaux métastasés, la maladie d'Alzheimer, la maladie de Parkinson ainsi que les tumeurs qui apparaissent à la suite d'un déficit immunitaire, tel que le sarcome de Kaposi dans le cas du SIDA.
* Le dosage d'un polypeptide et des autres composés de l'invention, utiles en tant que principe actif, dépend du choix du composé, de l'indication thérapeutique, du mode d'administration, de la nature de la formulation, de la nature du sujet et du jugement du médecin.
Lorsqu'il est utilisé comme principe actif, un polypeptide conforme à l'invention est généralement administré à des doses comprises entre 1 et 1 00 g/kg du sujet, par jour et selon le mode d'administration.
L'invention a aussi pour objet une composition pharmaceutique qui renferment au moins un composé précité, tel qu'un polypeptide conforme à l'invention, un polynucléotide conforme à l'invention comportant au moins un polymorphisme de type SNP codant défini précédemment, un vecteur recombinant défini précédemment, une cellule hôte définie précédemment, un anticorps défini précédemment et/ou un agent activateur et/ou inhibiteur d'un polypeptide conforme à l'invention, à titre de principe actif, ainsi qu'un excipient pharmaceutiquement acceptable.
Dans ces compositions pharmaceutiques, le principe actif est avantageusement présent à des doses physiologiquement efficaces.
Ces compositions pharmaceutiques peuvent être, par exemple, solides ou liquides et se présenter sous les formes pharmaceutiques couramment utilisées en médecine humaine, comme par exemple les comprimés simples ou dragéifiés, les gélules, les granulés, les caramels, les suppositoires et de préférence les préparations injectables et les poudres pour injectables. Ces formes pharmaceutiques peuvent être préparées selon les méthodes usuelles.
Le ou les principes actifs peuvent y être incorporés à des excipients habituellement employés dans ces compositions pharmaceutiques,
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tels que le talc, la gomme arabique, le lactose, l'amidon, le dextrose, le glycérol, l'éthanol, le stéarate de magnésium, le beurre de cacao, les véhicules aqueux ou non, les corps gras d'origine animale ou végétale, les dérivés paraffiniques, les glycols, les divers agents mouillants, dispersants ou émulsifiants, les conservateurs.
Le ou les principes actifs conforme à l'invention peuvent être employés seul ou en combinaison avec d'autres composés, tels que des composés thérapeutiques tels que d'autres IFNsa, voire d'autres cytokines comme l'interleukine, par exemple.
Les différentes formulations des compositions pharmaceutiques sont adaptées suivant le mode d'administration.
Les compositions pharmaceutiques peuvent être administrées par les différentes voies d'administration connues de l'homme du métier.
L'invention a également pour objet une composition de diagnostic qui renferment au moins un composé précité, tel qu'un polypeptide conforme à l'invention, un polynucléotide conforme à l'invention, un vecteur recombinant défini précédemment, une cellule hôte définie précédemment, un anticorps défini précédemment et/ou un agent activateur et/ou inhibiteur d'un polypeptide conforme à l'invention, à titre de principe actif, ainsi qu'un excipient approprié pharmaceutiquement acceptable.
Les excipients appropriés utilisés dans la composition de diagnostic sont généralement des tampons et des conservateurs.
La présente invention a également pour objet l'utilisation : a) d'une quantité thérapeutiquement efficace d'un agent activateur défini précédemment et/ou b) d'une quantité thérapeutiquement efficace d'un polypeptide selon l'invention, et/ou c) d'un polynucléotide selon l'invention, et/ou d) d'une cellule hôte du sujet à traiter, définie précédemment, pour préparer un médicament destiné à augmenter l'expression ou l'activité chez un sujet, d'un polypeptide conforme à l'invention.
<Desc/Clms Page number 38>
Ainsi, pour traiter un sujet qui a besoin d'une augmentation de l'expression ou de l'activité d'un polypeptide de l'invention, plusieurs méthodes sont possibles.
Il est possible d'administrer au sujet une quantité thérapeutiquement efficace d'un polypeptide de l'invention et/ou d'un agent activateur et/ou activé tels que définis précédemment, éventuellement en combinaison, avec un excipient pharmaceutiquement acceptable.
Il est également possible d'augmenter la production endogène d'un polypeptide de l'invention par administration au sujet d'un polynucléotide selon l'invention. Par exemple, ce polynucléotide peut être inséré dans un vecteur rétroviral d'expression. Un tel vecteur peut être isolé à partir de cellules ayant été infectées par un vecteur de plasmide rétroviral contenant de l'ARN codant pour le polypeptide de l'invention, de telle façon pour que les cellules transduites produisent des particules virales infectieuses contenant le gène d'intérêt. Voir Gene Therapy and other Molecular Genetic-based Therapeutic Approaches, Chapter 20, in Human Molecular Genetics, Strachan and Read, BITOS Scientifics Publishers Ltd (1996).
Conformément à l'invention, on va préférentiellement utiliser un polynucléotide comportant au moins un polymorphisme de type SNP codant tel que défini précédemment.
Il est également possible d'administrer au sujet des cellules hôtes lui appartenant, ces cellules hôtes ayant été prélevées et modifiées, au préalable, de façon à exprimer le polypeptide de l'invention, comme décrit précédemment.
La présente invention concerne également l'utilisation : a) d'une quantité thérapeutiquement efficace d'un agent inhibiteur défini précédemment, et/ou b) d'une quantité thérapeutiquement efficace d'un anticorps immunospécifique défini précédemment, et/ou c) d'un polynucléotide permettant d'inhiber l'expression d'un polynucléotide conforme à l'invention,
<Desc/Clms Page number 39>
pour préparer un médicament destiné à diminuer l'expression ou l'activité, chez un sujet, d'un polypeptide conforme à l'invention.
Ainsi, il est possible d'administrer au sujet une quantité thérapeutiquement efficace d'un agent inhibiteur et/ou d'un anticorps tels que définis précédemment, éventuellement en combinaison, avec un excipient pharmaceutiquement acceptable.
Il est également possible de diminuer la production endogène d'un polypeptide de l'invention par administration au sujet d'un polynucléotide complémentaire conforme à l'invention permettant d'inhiber l'expression d'un polynucléotide de l'invention.
Préférentiellement, on peut utiliser un polynucléotide complémentaire comportant au moins un polymorphisme de type SNP codant tel que défini précédemment.
PARTIE EXPERIMENTAL Exemple 1 : Modélisation d'une protéine codée par un polynucléotide de séquence nucléotidique comportant un polymorphisme de type SNP q1033a.
Figure img00390001

t1166c, q1181a ou a1294c et de la protéine codée par la séquence nucléotidique du qène sauvage de référence
Dans une première étape la structure tridimensionnelle de IFNa-7 a été construite à partir de celle de IFNa-2 dont la structure est disponible dans la base de données PDB (code DTF) et ce en utilisant le logiciel Modeler (MSI, San Diego, CA).
Le fragment polypeptidique mature a ensuite été modifié de façon à reproduire la mutation V10A, D95N, L 1121, V129L, F139S, R144K ou K182Q.
Un millier d'étapes de minimisations moléculaires ont été conduites sur ce fragment muté en utilisant les programmes AMBER et DISCOVER (MSI : Molecular Simulations Inc.).
Deux suites de calculs de dynamiques moléculaires ont ensuite été effectuées avec le même programme et les mêmes champs de forces.
Dans chaque cas, 50000 étapes ont été calculées à 300 K,
<Desc/Clms Page number 40>
terminées par 300 étapes d'équilibration.
Le résultat de cette modélisation est visualisé sur les Figures 1,2, 3,4, 5, 6,7 et 8.
Exemple 2 : Génotypaqe des polymorphismes de type SNP q1033a, t1166c. q1181a ou a1294c dans une population d'individus
Le génotypage de SNPs est basé sur le principe du miniséquençage dont le produit est détecté par une lecture de fluorescence polarisée. La technique consiste en un miniséquençage fluorescent (Technologie FP-TDI ou Fluorescence Polarization Template-direct Dyeterminator Incorporation).
Le miniséquençage consiste à allonger un oligonucléotide amorce, placé juste en amont du site du polymorphisme de type SNP, par des didéoxynucléotides fluoromarqués à l'aide d'une enzyme polymérase. Le produit résultant de cet allongement est directement analysé par une lecture de fluorescence polarisée.
Le génotypage requiert 5 étapes : 1) Amplification par PCR 2) Purification du produit de PCR par digestion enzymatique 3) Elongation de l'oligonucléotide amorce 4) Lecture 5) Interprétation de la lecture
Les étapes de génotypage 1 et 2 sont réalisées de manière identique pour chacun des polymorphismes de type SNP g1033a, t1166c, g1181a et a1294c
Les étapes 3,4 et 5 sont spécifiques a chacun de ces polymorphismes.
1) L'amplification PCR de la séquence nucléotidique du gène IFNa-7 est effectuée à partir d'ADN génomique provenant de 239 d'individus
<Desc/Clms Page number 41>
d'origine ethniques diverses
Ces ADNs génomiques ont été fournis par l'Institut Coriell aux Etats-Unis.
Les 239 individus se répartissent comme suit :
Figure img00410001
<tb>
<tb> POPULATION <SEP> DESCRIPTION <SEP> NOMBRE <SEP> D'INDIVIDUS
<tb> 1 <SEP> Afro <SEP> Américain <SEP> 50
<tb> 2 <SEP> Amérindien <SEP> du <SEP> Sud <SEP> Ouest <SEP> 5
<tb> 3 <SEP> Sud <SEP> Américain <SEP> (Andes) <SEP> 10
<tb> 4 <SEP> Caribéen <SEP> 10
<tb> 5 <SEP> Caucasien <SEP> 50
<tb> 6 <SEP> Chinois <SEP> 10
<tb> 7 <SEP> Grec <SEP> 8
<tb> 8 <SEP> Ibérien <SEP> 10
<tb> 9 <SEP> Italien <SEP> 10
<tb> 10 <SEP> Japonais <SEP> 10
<tb> 11 <SEP> Mexicain <SEP> 10
<tb> 12 <SEP> Moyen-Orient <SEP> 20
<tb> 13 <SEP> Individus <SEP> du <SEP> Pacifique <SEP> 7
<tb> 14 <SEP> Indo-Pakistanais <SEP> 9
<tb> 15 <SEP> Sud <SEP> Américain <SEP> 10
<tb> 16 <SEP> Asie <SEP> du <SEP> Sud <SEP> 10
<tb>
L'ADN génomique issu de chacun des individus constitue un échantillon.
L'amplification PCR est réalisée à partir des amorces suivantes : ID SEQ NO 3 et ID SEQ NO 4.
Ces séquences nucléotidiques permettent d'amplifier un fragment d'une longueur de 669 nucléotides, du nucléotide 711 au nucléotide 1379 dans la séquence nucléotidique ID SEQ N 1.
<Desc/Clms Page number 42>
Le volume réactionnel total mis en oeuvre pour l'amplification PCR est de 5 ul par échantillon.
Ce volume réactionnel est composé par les réactifs indiqués dans le tableau suivant :
Figure img00420001
<tb>
<tb> Fournisseur <SEP> Référence <SEP> Réactif <SEP> Conc. <SEP> Vol. <SEP> par <SEP> Conc.
<tb> initiale <SEP> tube <SEP> ( l) <SEP> finale
<tb> Life <SEP> Technologie <SEP> Livré <SEP> avec <SEP> Taq <SEP> Tampon <SEP> (X) <SEP> 10 <SEP> 0, <SEP> 5 <SEP> 1
<tb> Life <SEP> Technologie <SEP> Livré <SEP> avec <SEP> Taq <SEP> aq <SEP> MgS04 <SEP> (mM) <SEP> 50 <SEP> 0,2 <SEP> 2
<tb> AP <SEP> Biotech <SEP> 27-2035-03 <SEP> dNTPs <SEP> (mM) <SEP> 10 <SEP> 0, <SEP> 1 <SEP> 0, <SEP> 2
<tb> Sur <SEP> demande <SEP> Amorce <SEP> F <SEP> ( M) <SEP> 10 <SEP> 0, <SEP> 1 <SEP> 0,2
<tb> # <SEP> D <SEP> SEQ <SEP> NO <SEP> 3
<tb> Sur <SEP> demande <SEP> Amorce <SEP> R <SEP> ( M) <SEP> 10 <SEP> 0, <SEP> 1 <SEP> 0,2
<tb> ID <SEP> SEQ <SEP> NO <SEP> 4
<tb> Life <SEP> Technologie <SEP> ogie <SEP> 11304-029 <SEP> Taq <SEP> platinium <SEP> 5U/ <SEP> l <SEP> 0,02 <SEP> 0 <SEP> 1 <SEP> U/
<tb> réaction
<tb> H20 <SEP> Qsp <SEP> 5 <SEP> u <SEP> !, <SEP> 98
<tb> ADN <SEP> 2, <SEP> 5 <SEP> ng/ <SEP> <SEP> ! <SEP> 25ng/
<tb> (échantillon) <SEP> réaction
<tb> Volume <SEP> total <SEP> 5 <SEP> ul
<tb>
Ces réactifs sont distribués dans une plaque PCR noire à 384 puits fournie par ABGene (ref : TF-0384-k). La plaque est scellée, centrifugée puis placée dans un thermocycleur pour plaque 384 (Tetrad de MJ Research) et subit l'incubation suivante : Cycles de PCR : 1 min à 94 C, suivi de 36 cycles composés de 3 étapes (15 sec. à 94 C, 30 sec. à 560 C, 1 min. à 68 C).
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2) L'amplifiat PCR est ensuite purifié à l'aide de deux enzymes : la phosphatase alcaline de crevette (ou Shrimp Alkaline Phosphatase SAP) et l'exonucléase 1 (Exo 1). La première de ces enzymes permet la déphosphorylation des dNTPs non incorporés au cours de l'amplification PCR, tandis que la seconde élimine les résidus simple brin d'ADN, en particulier les amorces non utilisées au cours de la PCR.
Cette digestion se fait par addition dans chaque puits de la plaque PCR d'un mélange réactionnel de 5 1-11 par échantillon.
Ce mélange réactionnel est composé des réactifs suivants :
Figure img00430001
<tb>
<tb> Fournisseur <SEP> Référence <SEP> Réactif <SEP> Conc. <SEP> Vol. <SEP> par <SEP> Conc.
<tb> initiale <SEP> tube <SEP> ( l) <SEP> finale
<tb> 0,5/
<tb> AP <SEP> Biotech <SEP> E70092X <SEP> SAP <SEP> 1 <SEP> U/ <SEP> l <SEP> 0,5
<tb> réaction
<tb> 1/
<tb> AP <SEP> Biotech <SEP> 070072Z <SEP> Exol <SEP> 10 <SEP> U/ <SEP> l <SEP> 0,1
<tb> réaction
<tb> réaction
<tb> AP <SEP> Biotech <SEP> Fourni <SEP> Tampon <SEP> 10 <SEP> 0, <SEP> 5 <SEP> 1
<tb> avec <SEP> SAP <SEP> SAP <SEP> (X)
<tb> H20 <SEP> Qsp <SEP> 5 <SEP> ul <SEP> 3,9
<tb> PCR
<tb> 5 L
<tb> amplifiat
<tb> Vol <SEP> total <SEP> 10 <SEP> 1-11
<tb>
Une fois remplie, la plaque est scellée, centrifugée puis placée dans un thermocycleur pour plaque 384 puits (Tetrad de MJ Research) et subit l'incubation suivante : Digestion SAP-EXO : 45 min à 37 C, 15 min à 800 C.
L'étape d'élongation ou de miniséquençage est ensuite réalisée sur ce produit de PCR digéré, par addition d'un mélange réactionnel de 5 uL par échantillon préparé.
Le miniséquençage 3) et les étapes de lecture 4) et d'interprétation de lecture 5) sont spécifique à chaque polymorphisme de type SNP g1033a, t1166c, g1181a et a1294c
Toutes ces étapes sont décrites ci-après pour chacun de ces polymorphismes.
<Desc/Clms Page number 44>
3.1) Polymorphisme de type SNP g1033a
L'étape d'élongation ou de miniséquençage est ensuite réalisée comme indiqué dans le tableau suivant :
Figure img00440001
<tb>
<tb> Fournisseur <SEP> Référence <SEP> Réactif <SEP> Conc. <SEP> Conc.
<tb> initiale <SEP> ( l) <SEP> finale
<tb> Propre <SEP> Tampon <SEP> Elongation <SEP> l <SEP> 5 <SEP> 1 <SEP> 1
<tb> préparation <SEP> (X)
<tb> Life <SEP> Amorce <SEP> Miniseq
<tb> Life <SEP> 10 <SEP> 0,5 <SEP> 1
<tb> Sur <SEP> demande <SEP> ( M)
<tb> Technologies <SEP> A <SEP> ou <SEP> B
<tb> AP <SEP> Biotech <SEP> 27-2051 <SEP> ddNTPs2 <SEP> ( M) <SEP> 2,5 <SEP> 025 <SEP> 0,125
<tb> (61,71, <SEP> 81)-01 <SEP> 2 <SEP> non <SEP> marqués <SEP> de <SEP> chaque <SEP> de <SEP> chaque
<tb> ddNTPs2 <SEP> ( M)
<tb> Nel <SEP> 472/5 <SEP> 2,5 <SEP> 0,125
<tb> NEN <SEP> 2 <SEP> marqués <SEP> 0,25
<tb> et <SEP> Nel <SEP> 492/5 <SEP> de <SEP> chaque <SEP> de <SEP> chaque
<tb> 0,4 <SEP> U/
<tb> AP <SEP> Biotech <SEP> E79000Z <SEP> Thermo-sequenase <SEP> 3,2 <SEP> U/ <SEP> l <SEP> 0,125
<tb> réaction
<tb> H2O <SEP> Qsp <SEP> 5 <SEP> l <SEP> 3,125
<tb> PCR <SEP> digérée <SEP> 10 <SEP> ut
<tb> Vol <SEP> total <SEP> 15 <SEP> ul
<tb>
Le tampon élongation : Le tampon élongation 5X est composé de Tris-HCI pH 9 à 250 mM, de KCI à 250 mM, de NaCI à 25 mM, de MgCI2 à 10 mM et de glycérol à 40 %.
2 ddNTPs : Pour les ddNTPs, un mélange des 4 bases est réalisé en fonction du polymorphisme étudié. Seulement les 2 bases d'intérêts (C/T) composant le polymorphisme de type SNP fonctionnel portent un marquage, soit en Tamra, soit en R110. Le mélange de ddNTPs est composé de : - 2, 5 uM de ddATP non marqué, - 2, 5 uM de ddGTP non marqué,
Figure img00440002

- 2, 5 pM de ddTTP (1, 875 uM de ddTTP non marqué et 0, 625 uM ddTTP marqué au Tamra), - 2, 5 pM de ddCTP (1, 875 uM de ddCTP non marqué et 0, 625 pM de ddCTP marqué au R110).
Une fois remplie, la plaque est scellée, centrifugée puis placée dans un thermocycleur pour plaque 384 puits (Tetrad de MJ Research) et subit l'incubation suivante : Cycles d'élongation : 1 min. à 93 C, suivi de 35 cycles composés de 2 étapes (10 sec. à 93 C, 30 sec. à 55 C).
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Après la dernière étape dans le thermocycleur, la plaque est directement placée sur un lecteur de fluorescence polarisée de type Analyste HT de LJL Biosystems Inc.. La plaque est lue à l'aide du logiciel Criterion Host&commat; en utilisant deux méthodes. La première permet de lire la base marquée en Tamra en utilisant les filtres d'excitation et d'émission spécifiques de ce fluorophore (excitation 550-10 nm, émission 580-10 nm) et la seconde permet de lire la base marquée en R110 en utilisant les filtres d'excitation et d'émission spécifiques de ce fluorophore (excitation 490-10 nm, émission 520- 10 nm). Dans les deux cas, un miroir double dichroïque (R1O/Tamra) est utilisé et les autres paramètres de lecture sont : Z-height : 1,5 mm Attenuator : out Temps d'intégration : 100, 000 usée.
Raw data units : counts/sec Switch polarization : by well Plate settling time : 0 msec PMT setup : Smart Read (+), sensitivity 2 Dynamic polarizer : emission Static polarizer : S
Un fichier résultat est alors obtenu contenant les valeurs calculées de mP (milliPolarization) pour le filtre Tamra et celle pour le filtre RHO. Ces valeurs de mP sont calculées à partir des valeurs d'intensité obtenues sur le plan parallèle (//) et sur le plan perpendiculaire (. 1) d'après la formule suivante : mP=1000 (//-g)/ (//+gl).
Dans ce calcul, la valeur 1. est pondérée d'un facteur g. Celui-ci est un paramètre machine qui doit être déterminé préalablement expérimentalement.
4.1) et 5. 1) Interprétation de la lecture et détermination des génotypes.
Les valeurs de mP sont reportées sur un graphe à l'aide du
<Desc/Clms Page number 46>
logiciel Excel de Microsoft Inc., et/ou du logiciel Allele Caller développé par LJL Biosystems Inc..
En abscisse est indiquée la valeur de mP de la base marquée au Tamra, en ordonnée est indiquée la valeur de mP de la base marquée au R110. Une forte valeur de mP indique que la base marquée avec ce fluorophore est incorporée et, inversement, une faible valeur de mP révèle l'absence d'incorporation de cette base.
On obtient jusqu'à trois groupes homogènes de séquences nucléotidiques ayant des génotypes différents, comme indiqué dans la Figure 9.
L'utilisation du logiciel Allele Caller&commat; permet, une fois le repérage des différents groupes réalisé, d'extraire directement le génotype défini pour chaque individu sous forme d'un tableau.
Les séquences des deux amorces de miniséquençage nécessaires pour le génotypage ont été déterminées de façon a être placées en amont du site d'un polymorphisme de type SNP conforme à l'invention. Le produit de PCR qui comporte le polymorphisme de type SNP étant un produit d'ADN double brin, le génotypage peut donc se faire soit sur le brin sens soit sur le brin antisens. Les amorces sélectionnées sont fabriquées par Life Technologies Inc.
Les amorces du miniséquençage sont les suivantes : Amorce sens : (A) : tcaatctcttcagcacagag Amorce antisens : (B) : ttcccaagcagcagatgagt
Le miniséquençage du polymorphisme de type SNP g1033a a d'abord été validé sur 16 échantillons, puis génotypé sur l'ensemble de la population d'individus composée de 239 individus et 7 blancs.
Conditions de miniséquençage testées : Condition No 1 : Amorce sens + ddGTP-R110 + ddATP-Tamra Condition ? 2 : Amorce sens + ddATP-R110 + ddGTP-Tamra Condition No 3 :
<Desc/Clms Page number 47>
Amorce antisens + ddCTP-R110 + ddTTP-Tamra Condition ? 4 : Amorce antisens + ddTTP-RHO + ddCTP-Tamra
Ces 4 conditions ont été testées et la condition N 3 a été retenue pour le génotypage.
Résultats du miniséquençage pour le polymorphisme de type SNP Q1 033a
Après la réalisation complète du processus de génotypage, la détermination des génotypes des individus de la population d'individus pour le polymorphisme de type SNP fonctionnel étudié ici a été réalisée à l'aide du graphe représenté à la Figure 9.
Ce génotype est en théorie soit homozygote CC, soit hétérozygote CT, soit homozygote TT chez les individus testés. En réalité et comme montré ci-dessous, le génotype homozygote TC n'est pas détecté dans la population d'individus.
Les résultats des contrôles, de la répartition des génotypes déterminés dans la population d'individus et le calcul des différentes fréquences alléliques pour ce polymorphisme de type SNP fonctionnel sont présentés dans les tableaux suivants :
Figure img00470001
<tb>
<tb> Nombre <SEP> d'individus <SEP> Nombre <SEP> de <SEP> blanc <SEP> Pourcentage <SEP> de
<tb> testés <SEP> génotypés <SEP> testés <SEP> validés <SEP> réussite
<tb> 239 <SEP> 232 <SEP> 7 <SEP> 7 <SEP> 97, <SEP> 2
<tb>
<Desc/Clms Page number 48>
Figure img00480001
<tb>
<tb> POPULATION <SEP> Fréquence <SEP> allélique <SEP> Génotype <SEP> TT <SEP> Génotype <SEP> TC <SEP> Génotype <SEP> CC
<tb> N <SEP> % <SEP> % <SEP> 95 <SEP> % <SEP> IC <SEP> N <SEP> % <SEP> N <SEP> % <SEP> N <SEP> %
<tb> Afro <SEP> Américain <SEP> 50 <SEP> 20,9 <SEP> 2,1 <SEP> 0, <SEP> 0 <SEP> 5,0 <SEP> 0 <SEP> 0, <SEP> 0 <SEP> 2 <SEP> 4,3 <SEP> 45 <SEP> 95, <SEP> 7
<tb> Améridien <SEP> du <SEP> Sud <SEP> Ouest <SEP> 5 <SEP> 2,1 <SEP> 0, <SEP> 0 <SEP> - <SEP> - <SEP> 0 <SEP> 0,0 <SEP> 0 <SEP> 0, <SEP> 0 <SEP> 5 <SEP> 100,0
<tb> Sud <SEP> Américain <SEP> (Andes) <SEP> 10 <SEP> 4,2 <SEP> 0, <SEP> 0--0 <SEP> 0, <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0,0 <SEP> 10 <SEP> 100,0
<tb> Caribéen <SEP> 10 <SEP> 4,2 <SEP> 0, <SEP> 0--0 <SEP> 0, <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0, <SEP> 0 <SEP> 10 <SEP> 100,0
<tb> Caucasien <SEP> 50 <SEP> 20,9 <SEP> 0, <SEP> 0 <SEP> - <SEP> - <SEP> 0 <SEP> 0,0 <SEP> 0 <SEP> 0, <SEP> 0 <SEP> 50 <SEP> 100,0
<tb> Chinois <SEP> 10 <SEP> 4,2 <SEP> 0, <SEP> 0--0 <SEP> 0, <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0, <SEP> 0 <SEP> 10 <SEP> 100,0
<tb> Grec <SEP> 8 <SEP> 3,3 <SEP> 0, <SEP> 0--0 <SEP> 0, <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0, <SEP> 0 <SEP> 8 <SEP> 100, <SEP> 0
<tb> Ibérien <SEP> 10 <SEP> 4,2 <SEP> 0, <SEP> 0 <SEP> - <SEP> - <SEP> 0 <SEP> 0,0 <SEP> 0 <SEP> 0,0 <SEP> 10 <SEP> 100,0
<tb> Italien <SEP> 10 <SEP> 4,2 <SEP> 0, <SEP> 0--0 <SEP> 0, <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0, <SEP> 0 <SEP> 10 <SEP> 100,0
<tb> Japonais <SEP> 10 <SEP> 4,2 <SEP> 0, <SEP> 0 <SEP> - <SEP> - <SEP> 0 <SEP> 0,0 <SEP> 0 <SEP> 0, <SEP> 0 <SEP> 10 <SEP> 100,0
<tb> Méxicain <SEP> 10 <SEP> 4,2 <SEP> 0, <SEP> 0--0 <SEP> 0, <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0,0 <SEP> 6 <SEP> 100,0
<tb> Moyen-Orient <SEP> 20 <SEP> 8,4 <SEP> 0, <SEP> 0 <SEP> - <SEP> - <SEP> 0 <SEP> 0,0 <SEP> 0 <SEP> 0,0 <SEP> 20 <SEP> 100,0
<tb> Individus <SEP> du <SEP> Pacifique <SEP> 7 <SEP> 2,9 <SEP> 0, <SEP> 0--0 <SEP> 0, <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0, <SEP> 0 <SEP> 7 <SEP> 100,0
<tb> Indo-Pakistanais <SEP> 9 <SEP> 3,8 <SEP> 0, <SEP> 0 <SEP> - <SEP> - <SEP> 0 <SEP> 0,0 <SEP> 0 <SEP> 0,0 <SEP> 9 <SEP> 100, <SEP> 0
<tb> Sud <SEP> Américain <SEP> 10 <SEP> 4,2 <SEP> 0, <SEP> 0 <SEP> - <SEP> - <SEP> 0 <SEP> 0,0 <SEP> 0 <SEP> 0, <SEP> 0 <SEP> 10 <SEP> 100,0
<tb> Asie <SEP> du <SEP> Sud <SEP> 10 <SEP> 4,2 <SEP> 0, <SEP> 0--0 <SEP> 0, <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0, <SEP> 0 <SEP> 10 <SEP> 100,0
<tb> Total <SEP> 239 <SEP> 0,4 <SEP> 0, <SEP> 0 <SEP> 1, <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0, <SEP> 0 <SEP> 2 <SEP> 0,9 <SEP> 230 <SEP> 99,1
<tb>
<Desc/Clms Page number 49>
Dans le tableau ci-dessus, N représente le nombre d'individus, - % représente le pourcentage d'individus dans la sous-population spécifique,
Figure img00490001

la fréquence allélique représente le pourcentage de l'allèle muté dans la sous- population spécifique, 95 % IC représente l'intervalle minimal et maximal de confiance à 95 %.
Il faut préciser que l'allèle c lu en antisens correspond à l'allèle g
Figure img00490002

lu en sens, soit à la présence d'un D en position 95 de la séquence de la protéine IFNa-7 et donc que l'allèle t lu en antisens correspond à l'allèle a lu en sens correspondant à un N pour cette position dans la séquence de la protéine correspondante.
En examinant ces résultats par population, on constate que les 2 individus hétérozygotes CT sont issus de la sous-population afro-américaine de la population d'individus.
3.2) Polymorphisme de type SNP t1166c
L'étape d'élongation ou de miniséquençage est réalisée comme indiqué dans le tableau suivant :
<Desc/Clms Page number 50>
Figure img00500001
<tb>
<tb> Vol.par
<tb> Conc. <SEP> Conc.
<tb>
Fournisseur <SEP> Référence <SEP> Réactif
<tb> tube <SEP> finale
<tb> initiale
<tb> ( l)
<tb> Propre <SEP> Tampon <SEP> Elongation <SEP> 5 <SEP> 1 <SEP> 1
<tb> préparation <SEP> (X)
<tb> Amorce <SEP> Miniseq
<tb> Life <SEP> 10 <SEP> 0,5 <SEP> 1
<tb> Sur <SEP> demande <SEP> ( M)
<tb> Technologies
<tb> C <SEP> ou <SEP> D
<tb> ddNTPs2 <SEP> ( M)
<tb> 27-2051 <SEP> 2,5 <SEP> 025 <SEP> 0,125
<tb> AP <SEP> Biotech
<tb> 2 <SEP> non <SEP> marqués
<tb> (61, <SEP> 71, <SEP> 81)-01 <SEP> de <SEP> chaque <SEP> de <SEP> chaque
<tb> ddNTPs2 <SEP> ( M)
<tb> Nel <SEP> 472/5 <SEP> 2,5 <SEP> 0,125
<tb> NEN <SEP> 0,25
<tb> 2 <SEP> marqués
<tb> et <SEP> Nel <SEP> 492/5 <SEP> de <SEP> chaque <SEP> de <SEP> chaque
<tb> Tamra <SEP> et <SEP> R110
<tb> 0,4 <SEP> U/
<tb> AP <SEP> Biotech <SEP> E79000Z <SEP> Thermo-sequenase <SEP> 3,2 <SEP> U/ <SEP> l <SEP> 0,125
<tb> réaction
<tb> H2O <SEP> Qsp <SEP> 5 <SEP> l <SEP> 3,125
<tb> PCR <SEP> digérée <SEP> 10 <SEP> l
<tb> Vol <SEP> total <SEP> 15 <SEP> l
<tb>
Le tampon élongation : Le tampon élongation 5X est composé de Tris-HCI pH 9 à 250 mM, de
KCI à 250 mM, de NaCi à 25 mM, de MGCl2 à 10 mM et de glycérol à 40 %.
2 ddNTPs : Pour les ddNTPs, un mélange des 4 bases est réalisé en fonction du polymorphisme étudié Seulement les 2 bases d'intérêts (A/G) composant le polymorphisme de type SNP fonctionnel portent un marquage, soit en Tamra, soit en R110. Le mélange de ddNTPs est composé de : - 2, 5 uM de ddTTP non marqué, - 2, 5 uM de ddCTP non marqué,
Figure img00500002

- 2, 5 uM de ddATP (1, 875 uM de ddATP non marqué et 0, 625 uM de ddATP marqué au Tamra), - 2, 5 uM de ddGTP (1, 875 uM de ddGTP non marqué et 0, 625 uM de ddGTP marqué au R110
Une fois remplie, la plaque est scellée, centrifugée puis placée dans un thermocycleur pour plaque 384 puits (Tetrad de MJ Research) et subit l'incubation suivante : Cycles d'élongation : 1 min. à 93 C, suivi de 35 cycles composés de 2 étapes (10 sec. à 93 C, 30 sec. à 55 C).
Après la dernière étape dans le thermocycleur, la plaque est directement placée sur un lecteur de fluorescence polarisée de type Analyst&commat; HT de LJL Biosystems Inc.. La plaque est lue à l'aide du logiciel Criterion Host&commat; en utilisant deux méthodes. La première permet de lire la base marquée en Tamra en utilisant les filtres d'excitation et d'émission spécifiques
<Desc/Clms Page number 51>
de ce fluorophore (excitation 550-10 nm, émission 580-10 nm) et la seconde permet de lire la base marquée en RHO en utilisant les filtres d'excitation et d'émission spécifiques de ce fluorophore (excitation 490-10 nm, émission 520- 10 nm). Dans les deux cas, un miroir double dichroïque (R110/Tamra) est utilisé et les autres paramètres de lecture sont : Z-height : 1,5 mm Attenuator : out Temps d'intégration : 1 00, 000 usée.
Raw data units : counts/sec Switch polarization : by well Plate settling time : 0 msec PMT setup : Smart Read (+), sensitivity 2 Dynamic polarizer : emission Static polarizer : S
Un fichier résultat est alors obtenu contenant les valeurs calculées de mP pour le filtre Tamra et celle pour le filtre R110. Ces valeurs de mP sont calculées à partir des valeurs d'intensité obtenues sur le plan parallèle (//) et sur le plan perpendiculaire (. 1) d'après la formule suivante : mP = 1000(// - g#)/(// + g#).
Dans ce calcul, la valeur. 1 est pondérée d'un facteur g. Celui-ci est un paramètre machine qui doit être déterminé préalablement expérimentalement.
4.2) et 5.2) Interprétation de la lecture et détermination des génotypes.
Les valeurs de mP sont reportées sur un graphe à l'aide du logiciel Excel de Microsoft Inc., et/ou du logiciel Allele Caller&commat; développé par LJL Biosystems Inc..
En abscisse est indiquée la valeur de mP de la base marquée au Tamra, en ordonnée est indiquée la valeur de mP de la base marquée au R110 Une forte valeur de mP indique que la base marquée avec ce fluorophore est
<Desc/Clms Page number 52>
incorporée et, inversement, une faible valeur de mP révèle l'absence d'incorporation de cette base.
On obtient jusqu'à trois groupes homogènes de séquences nucléotidiques ayant des génotypes différents, comme indiqué dans la Figure 10.
L'utilisation du logiciel Allele Caller permet, une fois le repérage des différents groupes réalisé, d'extraire directement le génotype défini pour chaque individu sous forme d'un tableau.
Les séquences des deux amorces de miniséquençage nécessaires pour le génotypage ont été déterminées de façon a être placées en amont du site du polymorphisme de type SNP. Le produit de PCR qui comporte le polymorphisme de type SNP étant un produit d'ADN double brin, le génotypage peut donc se faire soit sur le brin sens soit sur le brin antisens. Les amorces sélectionnées sont fabriquées par Life Technologies Inc.
Les amorces du miniséquençage sont les suivantes : Amorce sens : (C) : tcccctgatgaatgaggact Amorce antisens : (D) : atttcctcacagccaggatg
Le miniséquençage du polymorphisme de type t1166c a d'abord été validé sur 16 échantillons, puis génotypé sur l'ensemble de la population d'individus composée de 239 individus et 7 blancs.
Conditions de miniséquençage testées : Condition No 1 : Amorce sens + ddTTP-R110 + ddCTP-Tamra Condition No 2 : Amorce sens + dd C TP-R110 + ddTTP-Tamra Condition No 3 : Amorce antisens + ddATP-R110 + ddGTP-Tamra Condition No 4 : Amorce antisens + ddGTP-R110 + ddATP-Tamra
Ces 4 conditions ont été testées et la condition No 4 a été retenue pour le génotypage.
<Desc/Clms Page number 53>
Résultats du miniséquençaqe pour le polymorphisme de type SNP t1166c
Après la réalisation complète du processus de génotypage, la détermination des génotypes des individus de la population d'individus pour le polymorphisme de type SNP fonctionnel étudié ici a été réalisée à l'aide du graphe représenté à la Figure 10.
Ce génotype est en théorie soit homozygote AA, soit hétérozygote AG, soit homozygote GG chez les individus testés. En réalité et comme montré ci-dessous, le génotype homozygote GG n'est pas détecté dans la population d'individus.
Les résultats des contrôles, de la répartition des génotypes déterminés dans la population d'individus et le calcul des différentes fréquences alléliques pour ce polymorphisme de type SNP fonctionnel sont présentés dans les tableaux suivants :
Figure img00530001
<tb>
<tb> Nombre <SEP> d'individus <SEP> Nombre <SEP> de <SEP> blanc <SEP> Pourcentage <SEP> de
<tb> testés <SEP> génotypes <SEP> testés <SEP> validés <SEP> réussite
<tb> 239 <SEP> 239 <SEP> 7 <SEP> 7 <SEP> 100
<tb>
<Desc/Clms Page number 54>
Figure img00540001
<tb>
<tb> POPULATION <SEP> Fréquence <SEP> allélique <SEP> Génotype <SEP> GG <SEP> Génotype <SEP> GA <SEP> Génotype <SEP> AA
<tb> N <SEP> % <SEP> % <SEP> 95% <SEP> IC <SEP> N <SEP> % <SEP> N <SEP> % <SEP> N <SEP> %
<tb> Afro <SEP> Américain <SEP> 50 <SEP> 20,9 <SEP> 0, <SEP> 0--0 <SEP> 0, <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0, <SEP> 0 <SEP> 50 <SEP> 100,0
<tb> Améridien <SEP> du <SEP> Sud <SEP> Ouest <SEP> 5 <SEP> 2,1 <SEP> 0, <SEP> 0--0 <SEP> 0, <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0,0 <SEP> 5 <SEP> 100,0
<tb> Sud <SEP> Américain <SEP> (Andes) <SEP> 10 <SEP> 4,2 <SEP> 0, <SEP> 0--0 <SEP> 0, <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0, <SEP> 0 <SEP> 10 <SEP> 100,0
<tb> Caribéen <SEP> 10 <SEP> 4,2 <SEP> 0,0 <SEP> - <SEP> - <SEP> 0 <SEP> 0,0 <SEP> 0 <SEP> 0, <SEP> 0 <SEP> 10 <SEP> 100,0
<tb> Caucasien <SEP> 50 <SEP> 20,9 <SEP> 0, <SEP> 0--0 <SEP> 0, <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0,0 <SEP> 50 <SEP> 100,0
<tb> Chinois <SEP> 10 <SEP> 4,2 <SEP> 0, <SEP> 0 <SEP> - <SEP> - <SEP> 0 <SEP> 0,0 <SEP> 0 <SEP> 0, <SEP> 0 <SEP> 10 <SEP> 100,0
<tb> Grec <SEP> 8 <SEP> 3,3 <SEP> 0, <SEP> 0--0 <SEP> 0, <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0,0 <SEP> 8 <SEP> 100,0
<tb> lbérien <SEP> 10 <SEP> 4,2 <SEP> 0, <SEP> 0--0 <SEP> 0, <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0, <SEP> 0 <SEP> 10 <SEP> 100,0
<tb> Italien <SEP> 10 <SEP> 4,2 <SEP> 0, <SEP> 0--0 <SEP> 0, <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0, <SEP> 0 <SEP> 10 <SEP> 100,0
<tb> Japonais <SEP> 10 <SEP> 4,2 <SEP> 0, <SEP> 0--0 <SEP> 0, <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0, <SEP> 0 <SEP> 10 <SEP> 100,0
<tb> Méxicain <SEP> 10 <SEP> 4,2 <SEP> 0, <SEP> 0--0 <SEP> 0, <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0, <SEP> 0 <SEP> 10 <SEP> 100,0
<tb> Moyen-Orient <SEP> 20 <SEP> 8,4 <SEP> 0, <SEP> 0 <SEP> - <SEP> - <SEP> 0 <SEP> 0,0 <SEP> 0 <SEP> 0,0 <SEP> 20 <SEP> 100,0
<tb> Individus <SEP> du <SEP> Pacifique <SEP> 7 <SEP> 2,9 <SEP> 7,1 <SEP> 0, <SEP> 0 <SEP> 20,6 <SEP> 0 <SEP> 0,0 <SEP> 1 <SEP> 14,3 <SEP> 6 <SEP> 85,7
<tb> Indo-Pakistanais <SEP> 9 <SEP> 3,8 <SEP> 0, <SEP> 0 <SEP> - <SEP> - <SEP> 0 <SEP> 0,0 <SEP> 0 <SEP> 0,0 <SEP> 9 <SEP> 100, <SEP> 0
<tb> Sud <SEP> Américain <SEP> 10 <SEP> 4,2 <SEP> 0, <SEP> 0--0 <SEP> 0, <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0, <SEP> 0 <SEP> 10 <SEP> 100,0
<tb> Asie <SEP> du <SEP> Sud <SEP> 10 <SEP> 4,2 <SEP> 0, <SEP> 0--0 <SEP> 0, <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0,0 <SEP> 10 <SEP> 100,0
<tb> Total <SEP> 239 <SEP> 0,2 <SEP> 0, <SEP> 0 <SEP> 0,6 <SEP> 0 <SEP> 0,0 <SEP> 1 <SEP> 0,4 <SEP> 238 <SEP> 99,6
<tb>
<Desc/Clms Page number 55>
Dans le tableau ci-dessus,
N représente le nombre d'individus, - % représente le pourcentage d'individus dans la sous-population spécifique, la fréquence allélique représente le pourcentage de l'allèle muté dans la sous- population spécifique,
95 % IC représente l'intervalle minimal et maximal de confiance à 95 %.
Il faut préciser que l'allèle a lu en antisens correspond à l'allèle t lu en sens, soit à la présence d'un F en position 139 de la séquence de la protéine IFNa-7 et donc que l'allèle g lu en antisens correspond à l'allèle c lu en sens correspondant à un S pour cette position dans la séquence de la protéine correspondante.
En examinant ces résultats par population, on constate que le seul individu hétérozygote AG est issu de la sous-population provenant du Pacifique de la population d'individus.
3.3) Polymorphisme de type SNP g1181 a
L'étape d'élongation ou de miniséquençage est réalisée comme indiqué dans le tableau suivant :
<Desc/Clms Page number 56>
Figure img00560001
<tb>
<tb> Vol.par
<tb> Conc. <SEP> Conc.
<tb>
Fournisseur <SEP> Référence <SEP> Réactif
<tb> tube <SEP> finale
<tb> intiale
<tb> ( l)
<tb> Propre <SEP> Tampon <SEP> Elong <SEP> 5 <SEP> 1 <SEP> 1
<tb> préparation <SEP> (X)
<tb> Amorce <SEP> Miniseq
<tb> Life <SEP> 10 <SEP> 0,5 <SEP> 1
<tb> Sur <SEP> demande <SEP> ( M)
<tb> Technologies
<tb> E <SEP> ou <SEP> F
<tb> ddNTPS2 <SEP> ( M)
<tb> 27-2051 <SEP> 2,5 <SEP> 0,125
<tb> AP <SEP> Biotech
<tb> (61,71,81)-01 <SEP> 2 <SEP> non <SEP> marqués <SEP> de <SEP> chaque <SEP> de <SEP> chaque
<tb> ddNTPs2 <SEP> ( M)
<tb> Nel <SEP> 472/5 <SEP> 2,5 <SEP> 0,25 <SEP> 0,125
<tb> NEN <SEP> 2 <SEP> marqués <SEP> 0,25
<tb> et <SEP> Nel <SEP> 492/5 <SEP> de <SEP> chaque <SEP> de <SEP> chaque
<tb> Tamra <SEP> et <SEP> R110
<tb> 0,4 <SEP> U/
<tb> AP <SEP> Biotech <SEP> E79000Z <SEP> Thermo-sequenase <SEP> 3,2 <SEP> U/ l <SEP> 0,125
<tb> réaction
<tb> H2O <SEP> Qsp <SEP> 5 <SEP> l <SEP> 3,125
<tb> PCR <SEP> digérée <SEP> 10 <SEP> l
<tb> Vol <SEP> total <SEP> 15 <SEP> l
<tb>
1 Le tampon élongation : Le tampon élongation 5X est composé de Tris-HCI pH 9 à 250 mM, de
KCI à 250 mM, de NaCI à 25 mM, de MgCI2 à 10 mM et de glycérol à 40 %.
2 ddNTPs : Pour les ddNTPs, un mélange des 4 bases est réalisé en fonction du polymorphisme étudié. Seulement les 2 bases d'intérêts (G/A) composant le polymorphisme de type SNP fonctionnel portent un marquage, soit en Tamra, soit en R110. Le mélange de ddNTPs est composé de :
Figure img00560002

- 2, 5 pM de ddCTP non marqué, - 2, 5 uM de ddTTP non marqué, - 2, 5 pM de ddGTP (1, 875 uM de ddGTP non marqué et 0, 625 uM de ddGTP marqué au Tamra), - 2, 5 uM de ddATP (1, 875 jJM de ddATP non marqué et 0, 625 uM de ddATP marqué au R110).
Une fois remplie, la plaque est scellée, centrifugée puis placée dans un thermocycleur pour plaque 384 puits (Tetrad de MJ Research) et subit l'incubation suivante : Cycles d'élongation : 1 min. à 93 C, suivi de 35 cycles composés de 2 étapes (10 sec. à 930 C, 30 sec. à 55 C).
Après la dernière étape dans le thermocycleur, la plaque est directement placée sur un lecteur de fluorescence polarisée de type Analyst&commat; HT de LJL Biosystems Inc.. La plaque est lue à l'aide du logiciel Criterion Host# en utilisant deux méthodes. La première permet de lire la base
<Desc/Clms Page number 57>
marquée en Tamra en utilisant les filtres d'excitation et d'émission spécifiques de ce fluorophore (excitation 550-10 nm, émission 580-10 nm) et la seconde permet de lire la base marquée en R110 en utilisant les filtres d'excitation et d'émission spécifiques de ce fluorophore (excitation 490-10 nm, émission 520- 10 nm). Dans les deux cas, un miroir double dichroïque (R110/Tamra) est utilisé et les autres paramètres de lecture sont : Z-height : 1, 5 mm Attenuator : out Temps d'intégration : 100, 000 usée.
Raw data units : counts/sec Switch polarization : by weil Plate settling time : 0 msec PMT setup : Smart Read (+), sensitivity 2 Dynamic polarizer : emission Static polarizer : S
Un fichier résultat est alors obtenu contenant les valeurs calculées de mP pour le filtre Tamra et celle pour le filtre Ri 10. Ces valeurs de mP sont calculées à partir des valeurs d'intensité obtenues sur le plan parallèle (//) et sur le plan perpendiculaire (1.) d'après la formule suivante : mP =1000 (//-gl)/ (// + gl).
Dans ce calcul, la valeur 1. est pondérée d'un facteur g. Celui-ci est un paramètre machine qui doit être déterminé préalablement expérimentalement.
4.3) et 5. 3) Interprétation de la lecture et détermination des génotypes.
Les valeurs de mP sont reportées sur un graphe à l'aide du logiciel Excel de Microsoft Inc., et/ou du logiciel Allele Caftera développé par LJL Biosystems Inc..
En abscisse est indiquée la valeur de mP de la base marquée au Tamra, en ordonnée est indiquée la valeur de mP de la base marquée au Ri 10.
<Desc/Clms Page number 58>
Une forte valeur de mP indique que la base marquée avec ce fluorophore est incorporée et, inversement, une faible valeur de mP révèle l'absence d'incorporation de cette base.
On obtient jusqu'à trois groupes homogènes de séquences nucléotidiques ayant des génotypes différents, comme indiqué dans la Figure
Figure img00580001

11.
L'utilisation du logiciel Allele Caller&commat; permet, une fois le repérage des différents groupes réalisé, d'extraire directement le génotype défini pour chaque individu sous forme d'un tableau.
Les séquences des deux amorces de miniséquençage nécessaires pour le génotypage ont été déterminées de façon a être placées en amont du site du polymorphisme de type SNP. Le produit de PCR qui comporte le polymorphisme de type SNP étant un produit d'ADN double brin, le génotypage peut donc se faire soit sur le brin sens soit sur le brin antisens. Les amorces sélectionnées sont fabriquées par Life Technologies Inc.
Les amorces du miniséquençage sont les suivantes : Amorce sens : (E) : ggacttcatcctggctgtga Amorce antisens : (F) : tgattctttggaagtatttc
Le miniséquençage du polymorphisme de type SNP g1181a a d'abord été validé sur 16 échantillons, puis génotypé sur l'ensemble de la population d'individus composée de 239 individus et 7 blancs.
Conditions de miniséquençage testées : Condition No 1 : Amorce sens + ddGTP-R110 + ddATP-Tamra Condition No 2 : Amorce sens + ddATP-R110 + ddGTP-Tamra Condition No 3 : Amorce antisens + ddCTP-R110 + ddTTP-Tamra Condition No 4 : Amorce antisens + ddTTP-R110 + ddCTP-Tamra
Ces 4 conditions ont été testées et la condition N 2 a été retenue
<Desc/Clms Page number 59>
pour le génotypage.
Résultats du miniséquençage pour le polymorphisme de type SNP q1181a
Après la réalisation complète du processus de génotypage, la détermination des génotypes des individus de la population d'individus pour le polymorphisme de type SNP fonctionnel étudié ici a été réalisée à l'aide du graphe représenté à la Figure 11.
Ce génotype est en théorie soit homozygote GG, soit hétérozygote GA, soit homozygote AA chez les individus testés. En réalité et comme montré ci-dessous, le génotype homozygote AA n'est pas détecté dans la population d'individus.
Les résultats des contrôles, de la répartition des génotypes déterminés dans la population d'individus et le calcul des différentes fréquences alléliques pour ce polymorphisme de type SNP fonctionnel sont présentés dans les tableaux suivants :
Figure img00590001
<tb>
<tb> Nombre <SEP> d'individus <SEP> Nombre <SEP> de <SEP> blanc <SEP> Pourcentage <SEP> de
<tb> testés <SEP> génotypés <SEP> testés <SEP> validés <SEP> réussite
<tb> 239 <SEP> 233 <SEP> 7 <SEP> 7 <SEP> 97, <SEP> 6
<tb>
<Desc/Clms Page number 60>
Figure img00600001
<tb>
<tb> POPULATION <SEP> Fréquence <SEP> allélique <SEP> Génotype <SEP> AA <SEP> Génotype <SEP> AG <SEP> Génotype <SEP> GG
<tb> N <SEP> % <SEP> % <SEP> 95% <SEP> N <SEP> % <SEP> N <SEP> % <SEP> N <SEP> %
<tb> Afro <SEP> Américain <SEP> 50 <SEP> 20,9 <SEP> 0, <SEP> 0--0 <SEP> 0, <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0, <SEP> 0 <SEP> 47 <SEP> 100,0
<tb> Améridien <SEP> du <SEP> Sud <SEP> Ouest <SEP> 5 <SEP> 2, <SEP> 1 <SEP> 0, <SEP> 0--0 <SEP> 0, <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0, <SEP> 0 <SEP> 5 <SEP> 100,0
<tb> Sud <SEP> Américain <SEP> (Andes) <SEP> 10 <SEP> 4,2 <SEP> 0, <SEP> 0--0 <SEP> 0, <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0, <SEP> 0 <SEP> 10 <SEP> 100,0
<tb> Caribéen <SEP> 10 <SEP> 4,2 <SEP> 0, <SEP> 0 <SEP> - <SEP> - <SEP> 0 <SEP> 0,0 <SEP> 0 <SEP> 0,0 <SEP> 10 <SEP> 100,0
<tb> Caucasien <SEP> 50 <SEP> 20,9 <SEP> 0, <SEP> 0--0 <SEP> 0, <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0, <SEP> 0 <SEP> 50 <SEP> 100,0
<tb> Chinois <SEP> 10 <SEP> 4,2 <SEP> 0, <SEP> 0--0 <SEP> 0, <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0,0 <SEP> 10 <SEP> 100,0
<tb> Grec <SEP> 8 <SEP> 3,3 <SEP> 0, <SEP> 0--0 <SEP> 0, <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0,0 <SEP> 8 <SEP> 100,0
<tb> Ibérien <SEP> 10 <SEP> 4,2 <SEP> 0, <SEP> 0--0 <SEP> 0, <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0, <SEP> 0 <SEP> 10 <SEP> 100,0
<tb> Italien <SEP> 10 <SEP> 4,2 <SEP> 0, <SEP> 0 <SEP> - <SEP> - <SEP> 0 <SEP> 0,0 <SEP> 0 <SEP> 0, <SEP> 0 <SEP> 10 <SEP> 100,0
<tb> Japonais <SEP> 10 <SEP> 4,2 <SEP> 0, <SEP> 0--0 <SEP> 0, <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0, <SEP> 0 <SEP> 10 <SEP> 100,0
<tb> Méxicain <SEP> 10 <SEP> 4,2 <SEP> 0, <SEP> 0--0 <SEP> 0, <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0, <SEP> 0 <SEP> 7 <SEP> 100,0
<tb> Moyen-Orient <SEP> 20 <SEP> 8,4 <SEP> 0, <SEP> 0--0 <SEP> 0, <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0, <SEP> 0 <SEP> 20 <SEP> 100,0
<tb> Individus <SEP> du <SEP> Pacifique <SEP> 7 <SEP> 2,9 <SEP> 7,1 <SEP> 0,0 <SEP> 20,6 <SEP> 0 <SEP> 0,0 <SEP> 1 <SEP> 14,3 <SEP> 6 <SEP> 85,7
<tb> Indo-Pakistanais <SEP> 9 <SEP> 3,8 <SEP> 0,0 <SEP> - <SEP> - <SEP> 0 <SEP> 0,0 <SEP> 0 <SEP> 0,0 <SEP> 9 <SEP> 100,0
<tb> Sud <SEP> Américain <SEP> 10 <SEP> 4,2 <SEP> 0,0 <SEP> - <SEP> - <SEP> 0 <SEP> 0,0 <SEP> 0 <SEP> 0,0 <SEP> 10 <SEP> 100,0
<tb> Asie <SEP> du <SEP> Sud <SEP> 10 <SEP> 4,2 <SEP> 0, <SEP> 0--0 <SEP> 0, <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0, <SEP> 0 <SEP> 10 <SEP> 100,0
<tb> Total <SEP> 239 <SEP> 0, <SEP> 2 <SEP> 0, <SEP> 0 <SEP> 0,6 <SEP> 0 <SEP> 0, <SEP> 0 <SEP> 1 <SEP> 0,4 <SEP> 232 <SEP> 99, <SEP> 6
<tb>
<Desc/Clms Page number 61>
Dans le tableau ci-dessus, - N représente le nombre d'individus, % représente le pourcentage d'individus dans la sous-population spécifique, ta fréquence allélique représente le pourcentage de l'allèle muté dans la sous- population spécifique,
95 % l IC représente l'intervalle minimal et maximal de confiance à 95 %.
En examinant ces résultats par population, on constate que le seul individu hétérozygote GA est issu de la sous-population provenant du Pacifique de la population d'individus.
4.4) Polymorphisme de type SNP a1294c
L'étape d'élongation ou de miniséquençage est réalisée comme indiqué dans le tableau suivant :
Figure img00610001
<tb>
<tb> Vol.par
<tb> Conc. <SEP> Conc.
<tb>
Fournisseur <SEP> Référence <SEP> Réactif
<tb> tube <SEP> finale
<tb> initiale
<tb> ( l)
<tb> Propre <SEP> Tampon <SEP> Elongation <SEP> 5 <SEP> 1 <SEP> 1
<tb> préparation <SEP> (X)
<tb> Amorce <SEP> Miniseq
<tb> Life <SEP> 10 <SEP> 0,5 <SEP> 1
<tb> Sur <SEP> demande <SEP> ( M)
<tb> Technologies
<tb> G <SEP> ou <SEP> H
<tb> ddNTPs2 <SEP> ( M)
<tb> 27-2051 <SEP> 2,5 <SEP> 0,125
<tb> AP <SEP> Biotech <SEP> 0,25
<tb> 2 <SEP> non <SEP> marqués
<tb> (61,71,81)-01 <SEP> de <SEP> chaque <SEP> de <SEP> chaque
<tb> ddNTPs <SEP> ( M)
<tb> Nel <SEP> 472/5 <SEP> 2,5 <SEP> 0,125
<tb> NEN <SEP> 2 <SEP> marqués <SEP> 0,25
<tb> et <SEP> Nel <SEP> 492/5 <SEP> de <SEP> chaque <SEP> de <SEP> chaque
<tb> Tamra <SEP> et <SEP> R110
<tb> 0,4 <SEP> U/
<tb> AP <SEP> Biotech <SEP> E79000Z <SEP> THermo-sequenase <SEP> 3,2 <SEP> U/ l <SEP> 0,125
<tb> réaction
<tb> H2O <SEP> Qsp <SEP> 5 <SEP> l <SEP> 3,125
<tb> PCR <SEP> digérée <SEP> 10 <SEP> l
<tb> Vol <SEP> total <SEP> 15 <SEP> l
<tb>
1 Le tampon élongation : Le tampon élongation 5X est composé de Tris-HCI pH 9 à 250 mM, de
KCI à 250 mM, de NaCl à 25 mM, de MgCl2 à 10 mM et de glycérol à 40 %.
2 ddNTPs : Pour les ddNTPs, un mélange des 4 bases est réalisé en fonction du polymorphisme étudié. Seulement les 2 bases d'intérêts (A/C) composant le polymorphisme de type SNP fonctionnel portent un marquage, soit en Tamra, soit en R110. Le mélange de ddNTPs est
<Desc/Clms Page number 62>
Figure img00620001

composé de - 2, 5 uM de ddGTP non marqué, - 2, 5 uM de ddTTP non marqué, - 2, 5 uM de ddATP (1, 875 pM de ddATP non marqué et 0, 625 uM de ddATP marqué au Tamra), - 2, 5 uM de ddCTP (1, 875 uM de ddCTP non marqué et 0, 625 IJM de ddCTP marqué au R110) Une fois remplie, la plaque est scellée, centrifugée puis placée dans un thermocycleur pour plaque 384 puits (Tetrad de MJ Research) et subit l'incubation suivante : Cycles d'élongation : 1 min. à 93 C, suivi de 35 cycles composés de 2 étapes (10 sec. à 93 C, 30 sec. à 55 C).
Après la dernière étape dans le thermocycleur, la plaque est directement placée sur un lecteur de fluorescence polarisée de type Analyste HT de LJL Biosystems Inc.. La plaque est lue à l'aide du logiciel Criterion Hosto en utilisant deux méthodes. La première permet de lire la base marquée en Tamra en utilisant les filtres d'excitation et d'émission spécifiques de ce fluorophore (excitation 550-10 nm, émission 580-10 nm) et la seconde permet de lire la base marquée en R110 en utilisant les filtres d'excitation et d'émission spécifiques de ce fluorophore (excitation 490-10 nm, émission 520- 10 nm). Dans les deux cas, un miroir double dichroïque (R110/Tamra) est utilisé et les autres paramètres de lecture sont : Z-height : 1,5 mm Attenuator : out Temps d'intégration : 100,000 psec.
Raw data units : counts/sec Switch polarization : by well Plate settling time : 0 msec PMT setup : Smart Read (+), sensitivity 2 Dynamic polarizer : emission Static polarizer : S
Un fichier résultat est alors obtenu contenant les valeurs calculées de mP pour le filtre Tamra et celle pour le filtre RI 10. Ces valeurs de mP sont calculées à partir des valeurs d'intensité obtenues sur le plan parallèle (/ et sur
<Desc/Clms Page number 63>
le plan perpendiculaire Cl) d'après la formule suivante : mP=1000 (//-g)/ (//+g).
Dans ce calcul, la valeur 1. est pondérée d'un facteur g. Celui-ci est un paramètre machine qui doit être déterminé préalablement expérimentalement.
4.4) et 5.4) Interprétation de la lecture et détermination des génotypes.
Les valeurs de mP sont reportées sur un graphe à l'aide du logiciel Excel de Microsoft Inc., et/ou du logiciel Allele Caller&commat; développé par LJL Biosystems Inc..
En abscisse est indiquée la valeur de mP de la base marquée au Tamra, en ordonnée est indiquée la valeur de mP de la base marquée au R110.
Une forte valeur de mP indique que la base marquée avec ce fluorophore est incorporée et, inversement, une faible valeur de mP révèle l'absence d'incorporation de cette base.
On obtient jusqu'à trois groupes homogènes de séquences nucléotidiques ayant des génotypes différents, comme indiqué dans la Figure 12.
L'utilisation du logiciel Allele Caller&commat; permet, une fois le repérage des différents groupes réalisé, d'extraire directement le génotype défini pour chaque individu sous forme d'un tableau.
Les séquences des deux amorces de miniséquençage nécessaires pour le génotypage ont été déterminées de façon a être placées en amont du site du polymorphisme de type SNP. Le produit de PCR qui comporte le polymorphisme de type SNP étant un produit d'ADN double brin, le génotypage peut donc se faire soit sur le brin sens soit sur le brin antisens. Les amorces sélectionnées sont fabriquées par Life Technologies Inc.
Les amorces du miniséquençage sont les suivantes : Amorce sens : (G) : tctctttttcaacaaacttg Amorce antisens : (H) : cttcctccttaatccttttt
<Desc/Clms Page number 64>
Le miniséquençage du polymorphisme de type SNP a1294c a d'abord été validé sur 16 échantillons, puis génotypé sur l'ensemble de la population d'individus composée de 239 individus et 7 blancs.
Conditions de miniséquençage testées : Condition No 1 : Amorce sens + ddATP-R110 + ddCTP-Tamra Condition N 2 : Amorce sens + ddCTP-R110 + ddATP-Tamra Condition No 3 : Amorce antisens + ddTTP-R110 + ddCTP-Tamra Condition N 4 : Amorce antisens + ddCTP-R110 + ddTTP-Tamra
Ces 4 conditions ont été testées et la condition No 2 a été retenue pour le génotypage.
Résultats du miniséquençaqe pour le polymorphisme de type SNP a1294c
Après la réalisation complète du processus de génotypage, la détermination des génotypes des individus de la population d'individus pour le polymorphisme de type SNP fonctionnel étudié ici a été réalisée à l'aide du graphe représenté à la Figure 12.
Ce génotype est en théorie soit homozygote AA, soit hétérozygote AC soit homozygote CC chez les individus testés. En réalité et comme montré ci-dessous, le génotype homozygote CC n'est pas détecté dans la population d'individus.
Les résultats des contrôles, de la répartition des génotypes déterminés dans la population d'individus et le calcul des différentes fréquences alléliques pour ce polymorphisme de type SNP fonctionnel sont présentés dans les tableaux suivants :
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Figure img00650001
<tb>
<tb> Nombre <SEP> d'individus <SEP> Nombre <SEP> de <SEP> blanc <SEP> Pourcentage <SEP> de
<tb> testés <SEP> génotypes <SEP> testés <SEP> validés <SEP> réussite
<tb> 239 <SEP> 238 <SEP> 7 <SEP> 7 <SEP> 99, <SEP> 6
<tb>
<Desc/Clms Page number 66>
Figure img00660001
<tb>
<tb> POPULATION <SEP> Fréquence <SEP> allélique <SEP> Génotype <SEP> CC <SEP> Génotype <SEP> CA <SEP> Génotype <SEP> AA
<tb> N <SEP> % <SEP> 95 <SEP> % <SEP> IC <SEP> N <SEP> % <SEP> N <SEP> % <SEP> N <SEP> %
<tb> Afro <SEP> Américain <SEP> 50 <SEP> 20,9 <SEP> 2,0 <SEP> 0,0 <SEP> 4,7 <SEP> 0 <SEP> 0, <SEP> 0 <SEP> 2 <SEP> 4,0 <SEP> 48 <SEP> 96,0
<tb> Améridien <SEP> du <SEP> Sud <SEP> Ouest <SEP> 5 <SEP> 2,1 <SEP> 0,0 <SEP> - <SEP> - <SEP> 0 <SEP> 0,0 <SEP> 0 <SEP> 0,0 <SEP> 5 <SEP> 100,0
<tb> Sud <SEP> Américain <SEP> (Andes) <SEP> 10 <SEP> 4,2 <SEP> 0, <SEP> 0--0 <SEP> 0, <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0, <SEP> 0 <SEP> 10 <SEP> 100,0
<tb> Caribéen <SEP> 10 <SEP> 4,2 <SEP> 0, <SEP> 0--0 <SEP> 0, <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0, <SEP> 0 <SEP> 10 <SEP> 100,0
<tb> Caucasien <SEP> 50 <SEP> 20,9 <SEP> 0, <SEP> 0--0 <SEP> 0, <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0,0 <SEP> 50 <SEP> 100,0
<tb> Chinois <SEP> 10 <SEP> 4,2 <SEP> 0, <SEP> 0--0 <SEP> 0, <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0, <SEP> 0 <SEP> 10 <SEP> 100,0
<tb> Grec <SEP> 8 <SEP> 3,3 <SEP> 0, <SEP> 0--0 <SEP> 0, <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0, <SEP> 0 <SEP> 8 <SEP> 100,0
<tb> Ibérien <SEP> 10 <SEP> 4,2 <SEP> 0, <SEP> 0 <SEP> - <SEP> - <SEP> 0 <SEP> 0,0 <SEP> 0 <SEP> 0, <SEP> 0 <SEP> 9 <SEP> 100,0
<tb> Italien <SEP> 10 <SEP> 4,2 <SEP> 0, <SEP> 0--0 <SEP> 0, <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0, <SEP> 0 <SEP> 10 <SEP> 100,0
<tb> Japonais <SEP> 10 <SEP> 4,2 <SEP> 0, <SEP> 0 <SEP> - <SEP> - <SEP> 0 <SEP> 0,0 <SEP> 0 <SEP> 0,0 <SEP> 10 <SEP> 100,0
<tb> Méxicain <SEP> 10 <SEP> 4,2 <SEP> 0, <SEP> 0--0 <SEP> 0, <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0, <SEP> 0 <SEP> 10 <SEP> 100,0
<tb> Moyen-Orient <SEP> 20 <SEP> 8,4 <SEP> 0, <SEP> 0--0 <SEP> 0, <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0,0 <SEP> 20 <SEP> 100,0
<tb> Individus <SEP> du <SEP> Pacifique <SEP> 7 <SEP> 2,9 <SEP> 0, <SEP> 0--0 <SEP> 0, <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0, <SEP> 0 <SEP> 7 <SEP> 100,0
<tb> Indo-Pakistanais <SEP> 9 <SEP> 3,8 <SEP> 0, <SEP> 0 <SEP> - <SEP> - <SEP> 0 <SEP> 0,0 <SEP> 0 <SEP> 0,0 <SEP> 9 <SEP> 100, <SEP> 0
<tb> Sud <SEP> Américain <SEP> 10 <SEP> 4,2 <SEP> 0, <SEP> 0--0 <SEP> 0, <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0,0 <SEP> 10 <SEP> 100,0
<tb> Asie <SEP> du <SEP> Sud <SEP> 10 <SEP> 4,2 <SEP> 0, <SEP> 0--0 <SEP> 0, <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0, <SEP> 0 <SEP> 10 <SEP> 100,0
<tb> Total <SEP> 239 <SEP> 0,4 <SEP> 0,0 <SEP> 1, <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0, <SEP> 0 <SEP> 2 <SEP> 0,8 <SEP> 236 <SEP> 99,2
<tb>
<Desc/Clms Page number 67>
Dans le tableau ci-dessus, - N représente le nombre d'individus, - % représente le pourcentage d'individus dans la sous-population spécifique, la fréquence allélique représente le pourcentage de l'allèle muté dans la sous- population spécifique, 95 % IC représente l'intervalle minimal et maximal de confiance à 95 %.
En examinant ces résultats par population, on constate que les 2 individus hétérozygotes AC sont issus de la sous-population afro-américaine de la population d'individus.
Exemple 3 : Etude de la fonction bioloqique de l'IFNa-7 V106L (V129L) comparée à celle de l'IFNa-7 naturelle a) Clonaqe des IFNa-7 matures naturelle et mutée (V106L) dans le vecteur d'expression eukarvote pPicZa-topo :
Les séquences nucléotidiques codant pour la protéine IFNa-7, naturelle et mutée matures sont amplifiées par PCR.
Les amorces PCR permettant une telle amplification sont : - Amorce sens : 5'TGTGATCTGCCTCAGACCCAC 3' - Amorce antisens : 5'TCAATCCTTCCTCCTTAATCCTTTTT 3'
Les produits PCR sont insérés dans le vecteur d'expression eukaryote pPicZa-TOPO sous le contrôle du promoteur hybride AOX1 inductible par le méthanol (TOPOTM-cloning ; Invitrogen Corp. ).
Ce vecteur permet l'expression hétérologue de protéines eucaryotes dans la levure Pichia pastoris.
Après vérification de la séquence nucléotidique de la région du vecteur codant pour les protéines recombinantes, le vecteur est linéarisé par l'enzyme de restriction Pme1, la souche de levure P. pastors (Invitrogen) est transformée avec ces vecteurs d'expression recombinants.
<Desc/Clms Page number 68>
b) Expression hétérologue chez P. pastoris et purification des protéines 1 FNa-7 naturelle et mutée V106L :
Deux pré-cultures saturantes de 50 ml de milieu BMGY (2% Peptone, 1% extrait de levure, 1,34% YNB, 1% Gtycérot, 100 mM phosphate de Potassium, 0,4 mg/Litre biotine pH 6,8) contenant un clone codant pour l'IFNa-7 naturelle ou celui codant pour l'IFNa-7 V106L ont été réalisées pendant 24 heures à 30 C à une agitation de 200 rotations par minute (rpm).
Lorsque la culture atteint une densité cellulaire correspondant à une densité optique de 5,0 mesurer a une longueur d'onde de 600 nm, celle-ci est utilisée pour ensemencer, au 1/5,200 ml de milieu BMMY (2% Peptone, 1% extraite de levure, 1,34% YNB, 0,5% Méthanol, 100 mM phosphate de Potassium, 0,4 mg/Litre biotine pH 6,8).
L'expression de la protéine est alors induite par le méthanol à une concentration finale de 0,5%, pendant 2 à 5 jours à 30 C, avec une agitation de la culture à 200 rpm.
Grâce à la présence de la séquence peptide signal"facteur alpha" (alpha factor), en amont de la séquence codante, les protéines sont secrétées par les levures dans le milieu de culture. Le facteur alpha est naturellement clivé lors de l'adressage.
La suspension est centrifugé et le surnageant renfermant la protéine est purifiée par HPLC.
Dans la première étape de purification, une gel filtration permet de récupérer la protéine dans un tampon de 50 mM Tris-NaCI pH 8,0.
La présence de la protéine dans les fractions collectées est vérifiée, d'une part par électrophorèse de type SDS PAGE et d'autre part par immuno-détection par un anticorps spécifique dirigé contre la protéine IFNa-7.
A ce stade, la protéine d'intérêt est pure à hauteur de 80%.
La dernière étape de la purification consiste en une séparation des protéines sur colonne de chromatographie d'échange d'ions.
Les fractions contenant la protéine de fusion sont injectées sur une colonne échangeuse d'anions (ResourceQ 6,0 mL, Pharmacia)
<Desc/Clms Page number 69>
préalablement équilibrée en tampon Tris 50 mM pH 8. L'élution des protéines est réalisée par le passage d'un gradient entre 0 et 1 M NaCI dans le tampon Tris 50 mM pH 8.
La pureté de la protéine d'intérêt est estimée sur gel SDS/PAGE et les concentrations en protéine ont été mesurées par dosage BCA (acide bicinchoninique et sulfate de cuivre, Sigma).
Les protéines IFNa-7 naturelle et IFNa-7 mutée purifiées sont utilisés lors des tests fonctionnels qui consistent en une mesure de l'activité anti-proliférative de ces deux formes de l'IFNa-7 sur la croissance de la lignée cellulaire de type Daudi. c) Evaluation de la capacité de l'IFNa-7 naturelle et mutée V106L à induire l'anti-prolifération des cellules de lymphoblastes humains de la liqnée cellulaire Daudi Burkitt's
Figure img00690001

Ces tests sont effectués sur deux types d'IFNa-7 différents, à savoir : l'IFNa-7 naturelle et l'IFNa-7 V106L. Oes cellules (lymphoblastes humains de la lignée cellulaire Daudi Burkitt's, ci-après appelé"cellules de Daudi") préalablement cultivées dans du milieu RPMI 1640 (supplémenté avec 10% de Sérum de Veau Foetal et 2 mM de L-Glutamine) sont ensemencées en plaque 96 puits à la densité cellulaire de 2. 105 cellules/puits.
Dans chaque puits, on met les cellules de Daudi en contact avec des concentrations croissante de : soit de l'IFNa-7 naturelle soit del'IFNa-7 mutée.
Les concentrations en IFNa-7 étudiés (naturelle ou mutée) sont comprises entre 0,003 pM et 600 nM (concentrations finales dans le puits).
Pour chaque concentration en chacun des I FNa-7 testés (naturelle ou mutée), on met en oeuvre 4 puits.
Les cellules Daudi sont ensuite cultivées pendant 66 heures à 37 C sous une atmosphère d'air comprenant 5% de COs
Après les 66 heures de croissance, l'effet anti-prolifératif de chaque IFNa-7 est estimé par le nombre de cellules vivantes présentant encore
<Desc/Clms Page number 70>
une activité déshydrogénase mitochondriale. L'activité de la déshydrogénase peut être détectée en présence de 12 mM de MTT (sel de tétrazolium), incubé 4 heures à 37 C, par le suivi de la densité optique à 550 nm correspondant à la formation de cristaux de formazan issus du clivage du MTT.
L'activité d'anti-proliférative de l'IFNa-7 naturelle ou mutée V106L est basée sur les mesures de l'IC 50, correspondant à la concentration en IFNa-7, en picomolaires (pm), inhibant 50 % de la croissance cellulaire.
Deux expériences similaires ont été effectuées à quelques jours d'intervalle.
Les IC 50, pour chaque expérience, sont mentionnés dans le tableau suivant :
Figure img00700001
<tb>
<tb> Expérience <SEP> IC <SEP> 50 <SEP> Rapport <SEP> Rapport
<tb> Sauvage <SEP> Mutée <SEP> Standardisé
<tb> 1 <SEP> 1, <SEP> 47 <SEP> 0, <SEP> 92 <SEP> 0, <SEP> 625 <SEP> 0, <SEP> 7
<tb> 2 <SEP> 3, <SEP> 9 <SEP> 3, <SEP> 8 <SEP> 0, <SEP> 974
<tb>
Le Rapport correspond à la valeur de l'IC50 de la protéine mutée sur la valeur de la protéine naturelle.
Le Rapport Standardisé correspond à la moyenne des rapports de chaque expérience en tenant compte des écarts type et des erreurs d'expérimentation.
Ainsi, l'activité anti-proliférative cellulaire de l'lFNa-7 mutée V106L est légèrement plus forte que celle de l'IFNa-7 naturelle tout en restant dans le même ordre de grandeur.
Exemple 4 : Etude de la fonction biologique de l'IFNa-7 K159Q (K182Q) comparée à celle de FNa-7 naturelle a) Clonage des IFNa-7 matures naturelle et mutée (K159Q) dans le vecteur d'expression eukarvote pPicZa-topo :
Les séquences nucléotidiques codant pour la protéine IFNa-7,
<Desc/Clms Page number 71>
naturelle et mutée matures sont amplifiées par PCR.
Les amorces PCR permettant une telle amplification sont : - Amorce sens : 5'TGTGATCTGCCTCAGACCCAC 3' - Amorce antisens : 5'TCAATCCTTCCTCCTTAATCCTTTTT 3'
Les produits PCR sont insérés dans le vecteur d'expression eukaryote pPicZa-TOPO sous le contrôle du promoteur hybride AOX1
Figure img00710001

poTM~ inductible par le méthanol (TOPO-cloning ; Invitrogen Corp.).
Ce vecteur permet l'expression hétérologue de protéines eucaryotes dans la levure Pichia pastors.
Après vérification de la séquence nucléotidique de la région du vecteur codant pour les protéines recombinantes, le vecteur est linéarisé par l'enzyme de restriction Pme1, la souche de levure P. pastors (Invitrogen) est transformée avec ces vecteurs d'expression recombinants. b) Expression hétérologue chez P. pastors et purification des protéines
IFNa-7 naturelle et mutée K159Q :
Deux pré-cultures saturantes de 50 ml de milieu BMGY (2% Peptone, 1% extrait de levure, 1,34% YNB, 1 % Glycérol, 100 mM phosphate de Potassium, 0,4 mg/Litre biotine pH 6,8) contenant un clone codant pour l'IFNa-7 naturelle ou celui codant pour l'IFNa-7 K159Q, ont été réalisées pendant 24 heures à 30 C à une agitation de 200 rotations par minute (rpm).
Lorsque la culture atteint une densité cellulaire correspondant à une densité optique de 5,0 mesurer a une longueur d'onde de 600 nm, celle-ci est utilisée pour ensemencer, au 1/5,200 ml de milieu BMMY (2% Peptone, 1% extraite de levure, 1,34% YNB, 0,5% Méthanol, 100 mM phosphate de Potassium, 0,4 mg/Litre biotine pH 6,8).
L'expression de la protéine est alors induite par le méthanol à une concentration finale de 0,5%, pendant 2 à 5 jours à 30 C, avec une agitation de la culture à 200 rpm.
Grâce à la présence de la séquence peptide signal"facteur alpha" (alpha factor), en amont de la séquence codante, les protéines sont secrétées
<Desc/Clms Page number 72>
par les levures dans le milieu de culture. Le facteur alpha est naturellement clivé lors de l'adressage.
La suspension est centrifugé et le surnageant renfermant la protéine est purifiée par HPLC.
Dans la première étape de purification, une gel filtration permet de récupérer la protéine dans un tampon de 50 mM Tris-NaCI pH 8,0.
La présence de la protéine dans les fractions collectées est vérifiée, d'une part par électrophorèse de type SDS PAGE et d'autre part par immuno-détection par un anticorps spécifique dirigé contre la protéine IFNa-7.
A ce stade, la protéine d'intérêt est pure à hauteur de 80%.
La dernière étape de la purification consiste en une séparation des protéines sur colonne de chromatographie d'échange d'ions.
Les fractions contenant la protéine de fusion sont injectées sur une colonne échangeuse d'anions (ResourceQ 6,0 mL, Pharmacia) préalablement équilibrée en tampon Tris 50 mM pH 8. L'élution des protéines est réalisée par le passage d'un gradient entre 0 et 1 M NaCI dans le tampon Tris 50 mM pH 8.
La pureté de la protéine d'intérêt est estimée sur gel SDS/PAGE et les concentrations en protéine ont été mesurées par dosage BCA (acide bicinchoninique et sulfate de cuivre, Sigma).
Les protéines IFNa-7 naturelle et IFNa-7 mutée purifiées sont utilisés lors des tests fonctionnels qui consistent en une mesure de l'activité anti-proliférative de ces deux formes de l'lFNa-7 sur la croissance de la lignée cellulaire de type Daudi. c) Evaluation de la capacité de l'IFNa-7 naturelle et mutée k159Q à induire l'anti-prolifération des cellules de lymphoblastes humains de la lignée cellulaire Daudi Burkitt's
Ces tests sont effectués sur deux types d'IFNa-7 différents, à savoir : l'IFNa-7 naturelle et l'IFNa-7 K159Q. Des cellules (lymphoblastes humains de la lignée cellulaire Daudi Burkitt's, ci-après appelé"cellules de
<Desc/Clms Page number 73>
Daudi") préalablement cultivées dans du milieu RPMI 1640 (supplémenté avec 10% de Sérum de Veau Foetal et 2 mM de L-Glutamine) sont ensemencées en plaque 96 puits à la densité cellulaire de 2. 105 cellules ! puits.
Dans chaque puits, on met les cellules de Daudi en contact avec des concentrations croissante de : soit de l'IFNa-7 naturelle soit de l'IFNa-7 mutée.
Les concentrations en IFNa-7 étudiés (naturelle ou mutée) sont comprises entre 0,003 pM et 600 nM (concentrations finales dans le puits).
Pour chaque concentration en chacun des IFNa-7 testés (naturelle ou mutée), on met en oeuvre 4 puits.
Les cellules Daudi sont ensuite cultivées pendant 66 heures à 37 C sous une atmosphère d'air comprenant 5% de COz
Après les 66 heures de croissance, l'effet anti-prolifératif de chaque IFNa-7 est estimé par le nombre de cellules vivantes présentant encore une activité déshydrogénase mitochondriale. L'activité de la déshydrogénase peut être détectée en présence de 12 mM de MTT (sel de tétrazolium), incubé 4 heures à 37 C, par le suivi de la densité optique à 550 nm correspondant à la formation de cristaux de formazan issus du clivage du MTT.
L'activité d'anti-proliférative de l'IFNa-7 naturelle ou mutée
Figure img00730001

(K159Q) est basée sur les mesures de l'IC 50, correspondant à la concentration en IFNa-7, en picomolaires (pm), inhibant 50 % de la croissance cellulaire.
Les IC 50, pour chaque expérience, sont mentionnés dans le tableau suivant :
Figure img00730002
<tb>
<tb> IC <SEP> 50 <SEP> Rapport <SEP> Rapport <SEP> Standardisé
<tb> Sauvage <SEP> Mutée
<tb> 5, <SEP> 63 <SEP> 4, <SEP> 4 <SEP> 0, <SEP> 78 <SEP> 0, <SEP> 8
<tb>
Figure img00730003

Le Rapport correspond à la valeur de l'IC50 de la protéine mutée sur la valeur de la protéine naturelle.
Le Rapport Standardisé correspond au rapport de l'IC50 en tenant
<Desc/Clms Page number 74>
compte des écarts type et des erreurs d'expérimentation.
Ainsi, l'activité anti-proliférative cellulaire de l'IFN&alpha;-7 mutée K159Q est légèrement plus forte que celle de l'IFN&alpha;-7 naturelle tout en restant dans le même ordre de grandeur.

Claims (36)

REVENDICATIONS
1. Polynucléotide isolé comprenant : a) une séquence nucléotidique ayant au moins 80 % d'identité avec la séquence ID SEQ ? 1 ou sa séquence codante, étant entendu que cette séquence nucléotidique comporte au moins l'un des polymorphismes de type SNP
Figure img00750001
codants suivants : t779c, g1033a, c1084a, g1135t, t1166c, g1181a, a1294c ; ou b) une séquence nucléotidique complémentaire à une séquence nucléotidique sous a).
2. Polynucléotide isolé comprenant : a) la séquence nucléotidique ID SEQ ? 1 ou sa séquence codante, étant entendu que chacune de ces séquences comporte au moins l'un des polymorphismes de type SNP codants suivants : t779c, g1033a, c1084a,
Figure img00750002
- ou g1135t, t1166c, g1181a, a1294c ; ou b) une séquence nucléotidique complémentaire à une séquence nucléotidique sous a).
3. Polynucléotide selon l'une quelconque des revendications 1 à 2, caractérisé en ce qu'il consiste en la séquence ID SEQ ? 1 ou sa séquence codante, étant entendu que chacune des séquences comporte au moins l'un des polymorphismes de type SNP codants suivants : t779c, g1033a, c1084a, g1135t, t1166c, g1181a, a1294c.
4. Polynucléotide selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que la séquence nucléotidique a) comporte un seul polymorphisme de type SNP codant choisi dans le groupe constitué par : t779c, g1033a, c1084a, g1135t, t1166c, g1181a et a1294c.
5. Polynucléotide isolé comprenant : a) la séquence nucléotidique ID SEQ ? 1 ou le cas échéant sa séquence codante, étant entendu que chacune de ces séquences comporte au moins l'un des polymorphismes de type SNP suivants : a559c, g580a, c667t, c682t, g1125a, g1161a, a1212g ; ou
<Desc/Clms Page number 76>
b) une séquence nucléotidique complémentaire à une séquence nucléotidique sous a).
6. Polynucléotide isolé, caractérisé en ce qu'il code pour un polypeptide comprenant : a) la séquence d'acides aminés ID SEQ No 2, ou b) la séquence d'acides aminés comprenant les acides aminés compris entre
24 et 189 de la séquence d'acides aminés ID SEQ NO 2, étant entendu que chacune des séquences d'acides aminés sous a) et b) comporte au moins l'un des polymorphismes de type SNP codants suivants : V10A, D95N, L 1121, V129L, F139S, R144K, K182Q.
7. Polynucléotide selon la revendication 6, caractérisé en ce qu'il code pour un polypeptide comportant un seul polymorphisme de type SNP codant choisi dans le groupe constitué par : V10A, D95N, L 1121, V129L, F139S, R144K et K182Q.
8. Polynucléotide selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisé en ce qu'il est composé d'une molécule d'ADN ou d'ARN.
9. Utilisation de tout ou partie d'un polynucléotide selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, pour identifier, hybrider et/ou amplifier
Figure img00760001
tout ou partie d'un polynucléotide consistant en la séquence ID SEQ ? 1 ou le cas échéant sa séquence codante, étant entendu que chacune de ces séquences comporte au moins l'un des polymorphismes de type SNP suivants : a559c, g580a, c667t, c682t, t779c, g1033a, c1084a, g1125a, g1135t, g1161a, t1166c, g1181a, a1212g, a1294c.
10. Utilisation de tout ou partie d'un polynucléotide selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, comme outil de génotypage.
11. Procédé de détermination de la fréquence du polymorphisme de type SNP d'un polynucléotide selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, dans lequel on procède à un génotypage chez un individu ou dans une population d'individus.
12. Procédé de détermination selon la revendication 11, dans lequel le génotypage est effectué par miniséquençage.
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13. Procédé de détermination selon la revendication 12, dans lequel le miniséquençage est réalisé avec les amorces sens et antisens
Figure img00770001
correspondant respectivement aux séquences nucléotidique ID SEQ No 3 et ID SEO NO 4.
14. Utilisation d'un polynucléotide selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, pour la recherche d'une variation de séquence dans la séquence nucléotidique du gène IFNa-7 chez un individu.
15. Vecteur recombinant comprenant un polynucléotide selon l'une quelconque des revendications 1 à 8.
16. Cellule hôte comprenant un vecteur recombinant selon la revendication 15.
17. Procédé de préparation d'un polypeptide, caractérisé en ce qu'une cellule hôte selon la revendication 16 est cultivée et ledit polypeptide est isolé du milieu de culture.
18. Polypeptide isolé comprenant une séquence d'acides aminés ayant au moins 80 % d'identité avec : a) la séquence d'acides aminés ID SEQ N 2 ou b) la séquence d'acides aminés comportant les acides aminés compris entre
24 et 189 de la séquence d'acides aminés ID SEQ ? 2, étant entendu que chacune des séquences d'acides aminés sous a) et b) comporte au moins l'un des polymorphismes de type SNP codants suivants : V10A, D95N, L 1121, V129L, F139S, R144K, K182Q.
19. Polypeptide selon la revendication 18, caractérisé en ce qu'il comprend : a) la séquence d'acides aminés ID SEQ ? 2, ou b) la séquence d'acides aminés comportant les acides aminés compris entre
24 et 189 de la séquence d'acides aminés ID SEQ No 2, étant entendu que chacune des séquences d'acides aminés sous a) et b) comporte au moins l'un des polymorphismes de type SNP codants suivants : V10A, D95N, L1121, V129L, F139S, R144K, K182Q.
<Desc/Clms Page number 78>
20. Polypeptide selon l'une quelconque des revendications 18 à 19, caractérisé en ce qu'il consiste en : a) la séquence d'acides aminés ID SEQ NO 2, ou b) la séquence d'acides aminés comportant les acides aminés compris entre
24 et 189 de la séquence d'acides aminés ID SEQ NO 2, étant entendu que chacune des séquences d'acides aminés sous a) et b) comporte au moins l'un des polymorphismes de type SNP codants suivants : V10A, D95N, L1121, V129L, F139S, R144K, K182Q.
21. Polypeptide selon l'une quelconque des revendications 18 à 20, caractérisé en ce que chacune des séquences d'acides aminés sous a) et b) comporte un seul polymorphisme de type SNP codant choisi dans le groupe constitué par : V10A, D95N, L 1121, V129L, F139S, R144K et K182Q.
22. Procédé d'obtention d'un anticorps immunospécifique, caractérisé en ce qu'il est obtenu par immunisation d'un animal avec un polypeptide selon l'une quelconque des revendications 18 à 21.
23. Anticorps immunospécifique pour un polypeptide selon l'une quelconque des revendications 18 à 21.
24. Procédé d'identification d'un agent activateur ou inhibiteur d'un polypeptide selon l'une quelconque des revendications 18 à 21, comprenant : a) la préparation d'un vecteur recombinant comprenant un polynucléotide selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 et 6 à 8, b) la préparation de cellules hôtes comprenant un vecteur recombinant selon a), c) la mise en présence de cellules hôtes selon b) avec un agent à tester, et b) la détermination de l'effet activateur ou inhibiteur généré par l'agent à tester.
25. Méthode pour l'identification d'un agent activé ou inhibé par un polypeptide selon l'une quelconque des revendications 18 à 21, comprenant : a) la préparation d'un vecteur recombinant comprenant un polynucléotide selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 et 6 à 8, b) la préparation de cellules hôtes comprenant un vecteur recombinant selon a), c) la mise en présence de cellules hôtes selon b) avec un agent à tester, et b) la détermination de l'effet activateur ou inhibiteur généré par l'agent à tester.
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26. Procédé de détection de l'expression et/ou de l'activité d'un polypeptide de séquence d'acides aminés ID SEQ ? 2 (ou un polypeptide comportant les acides aminés compris entre 24 et 189 de la séquence d'acides aminés ID SEQ N'2) codé par un polynucléotide conforme à l'invention et/ou d'un polypeptide selon l'une quelconque des revendications 18 à 21, comprenant : a) la détection de la présence ou de l'absence d'un polynucléotide selon l'une quelconque des revendications 1 à 8 dans le génome du sujet, et/ou b) la détermination de la concentration d'un polypeptide selon l'une quelconque des revendications 18 à 21, dans un échantillon biologique du sujet.
27. Médicament comprenant à titre de principe actif au moins un polypeptide selon l'une quelconque des revendications 18 à 21.
28. Utilisation d'un polypeptide selon l'une quelconque des revendications 18 à 21, pour la préparation d'un médicament destiné à la prévention ou le traitement de l'une des maladies choisies dans le groupe constitué par les différents cancers comme les carcinomes, les mélanomes, les lymphomes, les myélomes, les tumeurs cancéreuses ou non, les leucémies et les cancers du foie, du cou, de la tête et des reins, les maladies cardiovasculaires, les maladies métaboliques telles que celles qui ne sont pas liées au système immunitaire comme l'obésité, les maladies infectieuses en particulier virales comme les hépatites B et C et le SIDA, les pneumonies, les colites ulcératives, les maladies du système nerveux central comme la maladie d'Alzheimer, la schizophrénie et la dépression, le rejet de greffe de tissus ou d'organes, la cicatrisation de blessures, l'anémie en particulier chez les patients dialysés, les allergies, l'asthme, les scléroses multiples, l'ostéoporose, le psoriasis, l'arthrite rhumatoïde, la maladie de Crohn, les maladies et les désordres auto-immuns, les verrues génitales ou vénériennes, les désordres gastro-intestinaux ou encore les désordres liés aux traitements par chimiothérapie.
29. Utilisation d'un polypeptide selon la revendication 28, pour la préparation d'un médicament destiné à la prévention ou le traitement de l'une
<Desc/Clms Page number 80>
des maladies choisies dans le groupe constitué par les hépatites chroniques B et C, les leucémies telles que la leucémie à tricholeucocytes et la leucémie myéloïde chronique, les myélomes multiples, des lymphomes folliculaires, les tumeurs carcinoïdes, les mélanomes malins, les carcinomes rénaux métastasés, la maladie d'Alzheimer, la maladie de Parkinson ainsi que les tumeurs qui apparaissent à la suite d'un déficit immunitaire, tel que le sarcome de Kaposi dans le cas du SIDA.
30. Médicament comprenant à titre de principe actif au moins un polynucléotide selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 et 6 à 8, un vecteur recombinant selon la revendication 15, une cellule hôte selon la revendication 16 et/ou un anticorps selon la revendication 23.
31. Utilisation d'un polynucléotide selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 et 6 à 8, d'un vecteur recombinant selon la revendication 15, d'une cellule hôte selon la revendication 16 et/ou d'un anticorps selon la revendication 23, pour la préparation d'un médicament destiné à la prévention ou le traitement de l'une des maladies choisies dans le groupe constitué par les différents cancers comme les carcinomes, les mélanomes, les lymphomes, les myélomes, les tumeurs cancéreuses ou non, les leucémies et les cancers du foie, du cou, de la tête et des reins, les maladies cardiovasculaires, les maladies métaboliques telles que celles qui ne sont pas liées au système immunitaire comme l'obésité, les maladies infectieuses en particulier virales comme les hépatites B et C et le SIDA, les pneumonies, les colites ulcératives, les maladies du système nerveux central comme la maladie d'Alzheimer, la schizophrénie et la dépression, le rejet de greffe de tissus ou d'organes, la cicatrisation de blessures, l'anémie en particulier chez les patients dialysés, les allergies, l'asthme, les scléroses multiples, l'ostéoporose, le psoriasis, l'arthrite rhumatoïde, la maladie de Crohn, les maladies et les désordres auto-immuns, les verrues génitales ou vénériennes, les désordres gastro-intestinaux ou encore les désordres liés aux traitements par chimiothérapie.
32. Utilisation d'un polynucléotide selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 et 6 à 8, d'un vecteur recombinant selon la revendication
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15, d'une cellule hôte selon la revendication 16 et/ou d'un anticorps selon la revendication 23, pour la préparation d'un médicament destiné à la prévention ou le traitement de l'une des maladies choisies dans le groupe constitué par les hépatites chroniques B et C, les leucémies telles que la leucémie à tricholeucocytes et la leucémie myéloïde chronique, les myélomes multiples, des lymphomes folliculaires, les tumeurs carcinoïdes, les mélanomes malins, les carcinomes rénaux métastasés, la maladie d'Alzheimer, la maladie de Parkinson ainsi que les tumeurs qui apparaissent à la suite d'un déficit immunitaire, tel que le sarcome de Kaposi dans le cas du SIDA.
33. Composition pharmaceutique renfermant à titre de principe actif au moins un polypeptide selon l'une quelconque des revendications 18 à 21, un polynucléotide selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 et 6 à 8, un vecteur recombinant selon la revendication 15, une cellule hôte selon la revendication 16 et/ou un anticorps selon la revendication 23, ainsi qu'un excipient pharmaceutiquement acceptable.
34. Composition de diagnostic renfermant à titre de principe actif au moins un polypeptide selon l'une quelconque des revendications 18 à 21, un polynucléotide selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, un vecteur recombinant selon la revendication 15, une cellule hôte selon la revendication 16 et/ou un anticorps selon la revendication 23, ainsi qu'un excipient approprié pharmaceutiquement acceptable.
35. Utilisation : a) d'une quantité thérapeutiquement efficace d'un polypeptide selon l'une quelconque des revendications 18 à 21, et/ou b) d'un polynucléotide selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, et/ou c) d'une cellule hôte selon la revendication 16, cette cellule provenant du sujet à traiter, pour préparer un médicament destiné à augmenter l'expression ou l'activité chez un sujet, d'un polypeptide selon l'une quelconque des revendications 18 à 21.
36. Utilisation :
<Desc/Clms Page number 82>
a) d'une quantité thérapeutiquement efficace d'un anticorps selon la revendication 23, et/ou b) d'un polynucléotide permettant d'inhiber l'expression d'un polynucléotide selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, pour préparer un médicament destiné à diminuer l'expression ou l'activité chez un sujet d'un polypeptide selon l'une quelconque des revendications 18 à 21.
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