JPH09501827A

JPH09501827A - インターフェロンおよびインターロイキンを含む超タンパク質

Info

Publication number: JPH09501827A
Application number: JP7502180A
Authority: JP
Inventors: シドニーペストカ
Original assignee: ペストカバイオメディカルラボラトリーズインコーポレイテッド
Priority date: 1993-06-11
Filing date: 1994-06-10
Publication date: 1997-02-25
Also published as: CA2164811A1; EP0751955A4; US5789551A; WO1994029344A1; US6300474B1; US5869293A; EP0751955A1

Abstract

(57)【要約】新規な一群のポリペプチドが、かかるポリペプチドの同定並びに生産方法と共に開示され、該ポリペプチドは疾患状態、特に腫瘍および血液一媒介悪性疾患に固有の特性をもつ。これらの新規なポリペプチドは活性であり、かつ治療の目的にとって有用であると考えられる。

Description

【発明の詳細な説明】インターフェロンおよびインターロイキンを含む超タンパク質関連出願との相互引照本特許出願は、1993年６月11日付けで出願された、継続中の米国特許出願第08 /076,231号の一部継続出願である。発明の技術分野本発明はバイオテクノロジーの分野に関連し、より詳細には抗腫瘍、抗ウイルス、免疫調節およびその他の活性を有するポリペプチド、かかるポリペプチドをコードするDNA 、このようなDNA を含有する組み換えベクター、該ポリペプチドを生産する該組み換えベクターで形質転換した宿主生物並びに該ポリペプチドの治療における利用に関する。本発明の背景を明確にし、特定の場合においては本発明の実施に関連する付随的な詳細を与えるのに使用する、刊行物およびそのための他の資料は、本明細書における参考文献として組み入れられ、また便宜上以下の説明では番号により参照され、それぞれ添付の文献目録にまとめられている。背景技術ヒト白血球インターフェロンは、最初極めて純度の低い画分として、イサークス＆リンデンマン(Isaacs and Lindenmann)(1，2) によって発見され、かつ調製された。この物質を精製し、かつ特徴付けしようとの試みは、正常なまたは白血病 (慢性骨髄性白血病または“CML”)のドナー白血球由来の、比較的均質な白血球インターフェロンの調製へと導いた。これらのインターフェロンは、そのターゲット細胞中にウイルス−耐性状態を付与する高い能力によって特徴付けられる、一群のタンパク質である。更に、インターフェロンは細胞増殖を阻害し、免疫応答を調節し、かつタンパク質の発現を変更することができる。これら諸特性は、ウイルス感染および悪性疾患の治療用の治療薬としての、白血球インターフェロンの臨床的利用を促した。組み換えDNA 技術の出現と共に、莫大な数の有用なポリペプチドの制御された微生物による生産が可能となってきた。組み換えDNA 技術の非常に便利な道具はプラスミド、即ちバクテリアおよび他の微生物中に、しばしば細胞当たり多重複製状態で見出される二本鎖DNA の非−染色体環状体である。該プラスミドDNA 中でコードされる情報に含まれるものは、該プラスミド (即ち、ori 領域 (複製開始点))を再生し、かつ通常、バクテリアの場合には、識別され、かつ選択培地中で選択的に成育する、対象となる該プラスミドを含む宿主細胞のクローニングを可能とする、抗生物質耐性等の１種以上の選択的特徴を再生するのに必要とされるものである。プラスミドの有用性は、これらが１種または他の制限エンドヌクレアーゼあるいは「制限酵素」によって特異的に開裂されるという事実にある。該制限酵素各々は該DNA 中の特定のサイトを識別する。異種遺伝子または遺伝子フラグメントを該開裂サイトにおいて、該プラスミド内に装入できる。特異的な装入配列をもつベクターを構築するために、DNA の組み換えを細胞外で実施し、かつ生成する「組み換えプラスミド」を、形質転換法等の公知の方法によって細胞内に組み込み、該異種遺伝子−含有組み換えプラスミドを、該形質転換体の育成によって大量に得ることができる。更に、該コードされたDNA メッセージの転写を支配するプロモータが、コード配列または遺伝子の上流(5')の適当な位置に配置された場合、この得られる発現ベクターを、該装入された配列または遺伝子がコードする該ポリペプチド配列を生成する（発現と呼ばれるプロセス）に利用できる。発現はプロモータとして知られる領域において開始され、該プロモータはRNA ポリメラーゼによって識別され、結合される。多くの場合において、プロモータ領域は、バクテリアのオペレータのように、「制御」領域と重複している。オペレータはDNA 配列であり、該配列は所謂リプレッサータンパクにより識別され、該リプレッサータンパクは特定のプロモータにおける転写開始の頻度を調節するように作用する。該ポリメラーゼは該DNA に沿って移動して、5'末端から3'末端までの該コードストランド中に含まれる情報を伝令RNA (mRNA)に転写し、該伝令 RNA は、次いで該DNA がコードするアミノ酸配列をもつポリペプチドに翻訳される。各アミノ酸は、該コード配列内のヌクレオチドトリプレットあるいは「コドン」、即ち該発現された生成物のアミノ酸配列をコードする部分によってコードされる。バクテリア（例えば、大腸菌(Escherichia coli)）において、該mRNAはリボソーム結合サイト、翻訳開始または「開始」シグナル（通常該DNA 中のATG であり、これは生成するmRNA中ではAUG となる）、該コード配列自体内のヌクレオチドコドン、１以上の停止コドンおよび伝令RNA の付随的配列、即ち3'未翻訳領域を含む。リボソームは、バクテリアにおいては通常伝令RNA が形成される際に、該mRNA上に与えられる結合サイトに結合し、かつ該コード化されたポリペプチドを生成するが、該生成は該翻訳開始シグナルから始まり、該停止シグナルで終結する。該所定の生成物は、該リボソーム結合サイトをコードする配列が該AU G 開始コドンに関して適当に配置されており、かつ全ての残りのコドンが一致して該開始コドンに追随する場合に生成される。この得られる生成物は、宿主細胞から得られ、かつ適当な精製により回収できる。他の系において、タンパク質は宿主細胞から分泌されることもある。極めて多種の発現ベクターおよび宿主系が存在し、従ってRNA およびタンパク質が、真核および原核細胞並びに完全な動物および植物内で発現できる。過去数十年間に、多数のヒトおよび動物インターフェロンが製造され、同定され、精製されかつクローニングされている（参考文献１〜72を参照）。該インターフェロン製剤の幾つかは、粗製状態（新開発のインターフェロン製剤の幾つかについて）および精製された状態の両者として、臨床的試みのために調製されている。個々の組み換えインターフェロン−α群の幾つかはクローニングされ、かつ発現されている。次いで、該タンパク質は種々の手順で精製され、また臨床的使用の目的で、種々の調剤に処方されている(73)。世界的規模で種々の規制当局によって認可されている、臨床的利用状態にある殆どのインターフェロンは、ヒトαインターフェロン(Hu-IFN-α) の個々の種またはその混合物である。幾つかの国においては、Hu-IFN- βおよびαも臨床的利用が認可されており、また幾つかの場合には治療上の使用も認可されている(56，74)。これらインターフェロンの臨床的利用の根拠となる主な論旨は、これらが正常な個体によって生成された天然分子であることであった。事実、特定の論旨は、臨床的利用のために調製されたインターフェロンの全てが、正常な人々によって生産されたインターフェロンに代表される、天然または組み換え体の生成した生成物であるということであった。このことは、生産されている多数のインターフェロン並びに特定の成長因子類、リンホカイン類、サイトカイン類、ホルモン類、凝血因子類および他のタンパク質についてあてはまる（17，21，22，25-27，29-34，39，40，45-51，53- 57，62-64，68-72）。種々の報告が、Hu-IFN- αA(Hu-IFN- α2Aとも呼ばれ、かつ商品名ロフェロン (Roferon) Ａとも呼ばれる）は正常な個体群によって生産されるインターフェロンを代表しないことを示唆した(75-79) 。幾つかのインターフェロン（あるいはより包括的に、幾つかのポリペプチド）が疾患をもつ細胞内に特有に見出されるものと考えて、本発明者は、極めて特異的に特徴付けられるインターフェロンの同定に着手した。便宜的に、本発明者は公知のインターフェロン、特に既に記載されているHu-IFN- α2 の幾つかの変異型の源をスクリーニングすることから始めた。以下により詳細に論ずるであろうように、Hu-IFN- α2 の変異型のうちの２種、即ちHu-IFN- α2aおよびHu-IFN- α2cの源は正常な個体には存在しないことを見出した。Hu-IFN- α2bのみが正常な個体中に見出された(79)。図面の簡単な説明第１図はHu-IFN- α001 のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を示す図である。 AlwNI サイトの位置には下線を施してある。シグナルペプチドは-1〜-23 で表示した23アミノ酸として示した。第２図は、Hu-IFN- α001 のタンパク配列と、Hu-IFN- αJ のタンパク配列とを比較した図である。シグナルペプチドは、アミノ末端における最初の23アミノ酸を表す。第３図は、Hu-IFN- α001 に対する発現ベクターを示す図である。該プラスミドpHu-IFN-α001 の構造が図示されている。NsiIサイトはヌクレオチド位置#1を表す。P _R.プロモータがHu-IFN- α001 の発現を推進する。第４図は、精製されたHu-IFN- α001 のSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果を示す図である。Hu-IFN- α001 は、それぞれ３μｇ、1.5 μgおよび 0.75μｇの量で、レーン１、２および３に配置された。Ｍと題した欄は、各分子量マーカーの左側に与えられたキロダルトンで表された値をもつ分子量マーカーを表す。発明の開示種々の民族的並びに人種的背景の正常な個体並びに２種の腫瘍細胞系の広範囲に渡る分析は、幾つかのインターフェロンが、疾患に罹患した、特に造血系の悪性疾患に罹患した患者由来の２種の細胞系から得られることを示している(79)。これらの結果から、本発明者は、疾患に罹患した状態、特に腫瘍および血液媒介悪性疾患において存在する新たな一群のインターフェロン分子があるものと結論付けた。この新たな一群のインターフェロンの発見は、臨床的並びに治療上の利用にとって潜在的な種々の新規インターフェロンを与える。これらのインターフェロンはHu-IFN- α種のみならず、Hu-IFN- β種、Hu-IFN- γ種およびHu-IFN- ω種、並びに他の動物および種内の他の新規に記載されたインターフェロンをも包含する。これらの観測は、成長因子、サイトカイン、リンホカイン、血液凝固因子、ペプチドおよびポリペプチドホルモン、接着因子および多くの他の分子も、これらの疾患過程において改変されることを示唆している。従って、これらサイトカイン、リンホカイン、成長因子、接着因子、酵素、血液凝固因子、ペプチドおよびポリペプチドホルモン等全ての改変された形状が、腫瘍および他の諸疾患においても、生ずるであろう。この群の現時点において同定された２種の構成員（それ自体以前には認識されていなかった）に基いて、これらインターフェロンが活性であり、標準的分子程度に活性であり、また事実治療上の目的に対して有効に利用されている。本発明者が共著者であり、以下に参考文献79として掲載される文献は、特に本発明に関連しており、本発明の完全な理解のために必要とされる限りにおいて、この文献を本発明の参考文献とする。この論文は、同時に提出されたインフォーメーションディスクロージャーステートメントの添付資料に、より一層十分に記載されており、また該添付資料として提出された。発明を実施するための最良の形態４つの異なる群のインターフェロン(IFNs)がヒトの中に存在することが知られている。IFN-α群はIFNsの主要な群を表し、剌激された末梢血白血球(10-15，17 -27，29，50，51，57-59，61，63，64，68，70) 、並びにリンパ芽球様および骨髄芽球様細胞株(28，30，60)により生産されている。これら細胞由来のIFN-α遺伝子のクローニングは、IFN-αが約15の機能性遺伝子と４種の偽遺伝子からなる多重遺伝子族によってコードされることを明らかにした(17，26，27，29，31，5 0，51，53，54，57，61，63，64，65) 。クローニングされたヒトIFN-α遺伝子および数個のヌクレオチドの違いをもつcDNAの幾つか、例えばHu-IFN- αA 、Hu -IFN- α2 およびHu-IFN- α2(Arg)が対立遺伝子の変異型であるか否か、または別々の遺伝子を表すか否かは、明らかになっていない。これらの配列が実際に別々の遺伝子を表すかどうか、あるいは単一の遺伝子の多形変異型であるか否かを決定するために、Hu-IFN- αA 、Hu-IFN- α2 および Hu-IFN- α2(Arg)遺伝子のみを表す配列を、健康な承諾を得た個体のヒトゲノム DNA から、ネステッド(nested)複製連鎖反応(PCR) により増幅した。次いで、これらの配列をサブクローニングし、個々のクローンの配列決定により調べた。更に、それぞれHu-IFN- αA およびHu-IFN- α2(Arg)のcDNAをクローニングしたKG -1(80)およびナマルワ(Namalwa)(81) 細胞株由来のDNA を調べた。発明を実施するための形態３種のオリゴデオキシヌクレオチドを、ホスホルアミダイト法によって調製し (82，83)、精製した(84)。5'末端におけるヌクレオチド125 〜142 に対して相補的なプライマーＩ(5'-TGGGCTGTGATCTGCCTC-3')を、3'末端におけるヌクレオチド 552 〜573 に対して相補的なプライマーII(5'-CATGATTTCTGCTCTGACAACC-3')と共に使用して、所定のヌクレオチド配列を増幅した。このプライマー対によって該複製連鎖反応(PCR) で増幅されたDNA は、殆どの該IFN-α遺伝子族由来の配列を表すものと予想された(79)。次いで、この保存されたPCR 生成物を、同一の3'オリゴヌクレオチドおよびヒトIFN-αA 、IFN-α2 およびIFN-α2(Arg)遺伝子に対してのみ特異的な5'オリゴヌクレオチドを使用した第二の増幅反応における鋳型として使用した(79)。この第二の反応は、該プライマーＩの代わりに、ヌクレオチド144 〜161 に対して相補的なプライマーIII(5'-AACCCACAGCCTGGGTAG-3') を使用した場合に、430 bpの生成物を生産した。この430 bpのDNA を精製し、かつ (79，85，86)に記載されたように、pBluescript-SK⁺（CA 州、ラホイヤのストラタジーン(Stratagene)）のSmaIサイトにクローニングした。このプラスミドのDNA は、100 μg/mlのアンピシリンを含むLB培地中で一夜成育させた培養物１mlから、アルカリ溶解ミニプレプ法(alkaline lysis miniprep procedure)(86，87) によって調製した。得られたDNA ペレットをチェインターミネータ法(79，88，89)によって配列決定した。これらの反応は、6%ポリアクリルアミドゲル上で実施し、該ゲルを次に乾燥し、強調スクリーンを使用して、室温にて一夜、X-線フィルムに暴露した。逆転写酵素PCR(RT-PCR) を使用して、KG-1およびナマルワ(Namalwa) 細胞株(9 0)中のIFN-αのサブタイプαA 、α2 およびα2(Arg)の発現を解析した。誘発の６時間後に仙台ウイルス−誘発KG-1細胞(60)から、および誘発後８時間において NDV-剌激ナマルワ細胞(91，92)から、RNA を単離した。 DNA が、ペリサー(Pellicer)等の方法(93)の改良法によって、該ヒト骨髄芽球様細胞株KG-1およびリンパ芽球様細胞株から抽出された。インフォームドコンセントを得た後に、ヒトゲノムDNA を、正常で健康な個体から採取した全血サンプルから、(79，94)に記載されているような、酢酸アンモニウム沈殿法により調製した。発明の方法的基礎 11名の正常な個体由来のDNA を、上記の如くネステッドPCR 法により増幅し、次いでクローニングし、かつ配列決定した。これら種々のヒトIFN-α種に対応する配列の数を以下の第１表に示した。αA 遺伝子およびα2(Arg)遺伝子に対する配列の何れも、本研究で調べた全ての正常な個体中に検出されなかったことが理解できよう。しかしながら、第２表に示したように、該αA 配列は該KG-1細胞株由来のDNA 中には検出されたが、ナマルワ細胞株由来のDNA には検出されなかった。また、該α2(Arg)配列はナマルワ細胞株由来のDNA 中には検出されたが、該 KG-1細胞株由来のDNA 中には検出されなかった。 IFN-αA 遺伝子を検出するための制限エンドヌクレアーゼ分析をも、クローンを配列決定した５名の個体由来のDNA およびDNA 配列決定により検査されていない７名の追加の人々由来のDNA につき実施した。これら全ての個体由来の増幅されたDNA の該制限エンドヌクレアーゼ分析が、IFN-αA 遺伝子の存在を示さないことが分かった（参考文献79の第２図を参照のこと）。発明の好ましい態様上記の分析から、広範囲のヒト由来のヒトDNA 中には、IFN-α2 のみが存在するものと結論できる。11名の正常な個体のDNA 中には存在しない種、IFN-αA およびIFN-α2(Arg)は、見掛け上疾患の発病中および／または培養物における細胞株の馴化の際に現れた。これらHu-IFN- α2 の対立遺伝子の発現が広範囲のアッセイにおいて高い活性をもつIFN-α種を与えることは注目に値する(63，68，69 ，101-115)。これら３種のIFN-α種全ての特異的活性は遜色がない。更に、Hu-I FN- αA で治療した患者が、Hu-IFN- α2 またはHu-IFN- αn(ウェルフェロン(W elferon): 誘発されたナマルワ細胞によって生産される混合Hu-IFN- αの調剤) で治療した患者よりも高濃度で抗−インターフェロン抗体を生産することが報告されている(116-124) 。ここに記載される発明によって生産される新規なインターフェロンの幾つかは、一般的に使用されているIFN-α調剤で治療した患者中に生産される抗体による中和をバイパスすることを可能とする。このような新規な IFN-α種は、投与されたIFN-α種の中和のために、病気を再発した患者を治療するのに使用し得るはずである。本発明者は、便宜的に、一群の超または腫瘍インターフェロンの存在に関する仮説を立証するために、Hu-IFN- α2 またはその公知の変異型を使用したが、当業者は、この結果がこのようなインターフェロンの全群並びに他のポリペプチドにまで拡張し得ることを理解するであろう。この結論の例証となるのは、第２表の「その他」と題する欄に示したように、実験誤差により説明し得るレベルを越えた異常に高い、KG-1細胞中の該IFN-α2 およびαA の変異型の割合、即ち39% (16/41)である。 Hu-IFN- α2 について上記した如く、本発明の方法は任意のタンパク質に適用可能であることが理解されよう。一般的な場合において、プライマー対は、腫瘍細胞または培養細胞由来のDNA をPCR 用の鋳型として使用して、該ヌクレオチドコード配列の一部または全てを包含するように選択される。次いで、このPCR 生成物をクローニングし、かつ配列決定する。このようにして得た該ヌクレオチド配列により予想されるアミノ酸配列を、正常な個体中の該タンパク質の配列と比較する。これらの正常な個体中のタンパク質と異なるアミノ酸配列をもつタンパク質を、次に適当な発現ベクター中でクローニングし(11，12，14，17，45，53 ，54，57，63，69，86，103) 、生成し、精製しかつ特徴付けする。次いで、所定の活性をもつものを治療上の利用のために発現させる。該腫瘍インターフェロンまたは超インターフェロンの源は未知である。それにも拘らず、これらが病理的過程中に発現されることは明白である。これらのインターフェロンを生産する細胞は成育中におよび該疾患の進行中に選別されるものと考えられる。 KG-1およびナマルワ細胞中におけるIFN-α2 の対立遺伝子の存在は、最も注目に値する。正常な個体からの白血球由来のDNA は、これら変異型を含んでいなかった。該KG-1およびナマルワ細胞両者が白血病またはリンパ腫に罹患した患者に由来するので、この変質はこれら疾患の進行中の初期変化であると考えられる。事実、急性白血病における該IFN-α遺伝子に関する、制限エンドヌクレアーゼ消化パターンに著しい総体的変化が見られることが報告されている(125，126)。悪性疾患細胞の発生に関与する疾患メカニズムおよびこれら細胞の選択は、得られる腫瘍細胞中に広範囲の遺伝的変化を生成する。癌細胞が自由に成育し、正規の制御を回避し、かつ転移するために、インターフェロン、成長因子およびホルモン等の成長阻害物質を包含する免疫系の通常の調節網が変性される可能性がある。細胞の成育および非悪性挙動の調節は多くの調節因子の微妙なバランスにあり、正規の機能から外れてしまった該因子の幾つかが、該正常な成育パターンを変えてしまう可能性がある。癌細胞のDNA 中に変化が生ずることが報告されているが、該変化としては悪性の表現型に導く癌遺伝子および腫瘍サプレッサー遺伝子に関心が集中されていた。本発明者は、癌遺伝子および腫瘍サプレッサーに集中されたこれら変化のみでなく、該変化が予想される以上に広範囲に渡るというデータを提示した。その上、遺伝的変化(DNAにおける変異) および攻撃性についての腫瘍細胞の選択によって、多くの改変が最終的な腫瘍細胞集団中に含まれることとなろう。生成される新規なタンパク質は、正規のタンパク質の活性よりも低い、これと同一のまたはこれよりも高い活性をもつであろう。活性における変化に関連するこれら変性タンパクを同定することにより、これらの新規なおよび／または増強された活性を有するタンパクを同定することが可能となるであろう。 KG-1細胞株(53，54，63)から得られた初期のクローンの分析から、数個の異常なインターフェロンがこの細胞株中に存在することが示された（IFN-α種のリストについては参考文献61をも参照のこと）。このことは、特にαB(以前には、異常なインターフェロンとして認識されていなかった) が、正常な同等物、即ちHu -IFN- α8 とは異なる異常なタンパクを形成する挿入および代償性欠失をもつ点で明白である。正常なサイズの分子を生成する挿入および代償的欠失の存在は、これらインターフェロンの生成への幾つかの莫大な選択的強制力の存在を示唆する。外的な強制力なしに、単なるランダムな確率的過程によって、挿入および欠失が分子内に組み込まれるであろうという事実は、殆どありそうにないことである。即ち、これらの変性されたインターフェロンは、これら種を選択すべく備えられた莫大な外力の存在の下で、発現された完全に新規な一群の分子を表すものと理解される。該疾患過程を増強または攻撃するメカニズムによって生成されるインターフェロンに関連して、その幾つかは、実際に異常な特性をもつ可能性があり、また正常な細胞によって生成されるインターフェロンの幾つかよりも活性が高い可能性がある。例えば、インターフェロンは成長阻害分子であるので、細胞内のインターフェロンに対するレセプターをダウンレギュレーションし、かつインターフェロンレセプター無しにあるいは低濃度のインターフェロンレセプターの存在下で細胞の選別を助けることを可能とする新規なインターフェロンの生産は、該疾患過程を増強する可能性がある。このようなインターフェロンは、また改変されたシグナル導入メカニズムを有するが、正常なレセプター数をもつ細胞の選別を助けることを可能とした。かくして、あるインターフェロンを自発的に生産する細胞は、ダウンレギュレーションのために、最初は低濃度のレセプターをもつものと予想され、またその成長は多分減じられるであろう。それにも拘らず、このような細胞の増殖中に、低濃度のレセプターを有し、結果として内因性のインターフェロンによる阻害を回避し得る細胞が選別されるであろう。同様なことが、広範囲の他の分子、例えばサイトカイン類、リンホカイン類、腫瘍サプレッサー類、成長因子類、成長阻害因子類、マトリックス分子類、ホルモン類、血管形成誘導因子類、血液凝固因子類等、ある様式または他の様式で成長および／または転移を制御できるあらゆる分子についても成り立つであろう。本明細書に記載された改変タンパク質は、腫瘍細胞または腫瘍から得た培養細胞中に見出される。更に、培養物中の細胞株の選別も、インビボでの選別の結果としての幾つかの変異型を生成することができる。 Hu-IFN- α001 のクローニング新規なインターフェロンを、前に概説した戦略に基いて、かつ本明細書およびその他(79)に記載された手順により、KG-1細胞のゲノムDNA(ATCC CCL 246) から増幅した。これら遺伝子を増幅するのに使用したプライマーを第３表に示す。該 5'プライマーはApalサイトを含み、また該3'プライマーはクローニング用のXbaI サイトを含む。100 ngのKG-1鋳型DNA 、100 ngの各プライマー(6431 及び6432) 、0.2 mMの各dNTPおよび2.5 単位のTaq DNA ポリメラーゼを含む50μｌ中で、パーキンエルマーモデル9600サーモサイクラー(Perkin Elmer model 9600 thermoc ycler)中で、94℃にて30秒、50℃にて30秒、72℃にて30秒の30サイクルに渡り、 PCR 反応を実施した。このPCR 増幅の生成物をプラスミドpBluescript II KS+（ストラタジーン(Stratagene)）のApalおよびXbaIサイトにクローニングし、次いで感応E.コリ株DH5 α細胞内で形質転換した。感応細胞は、(127) に記載されているように、ダイジーン(Digene)(シルバースプリング(Silver Spring)，MD 209 04，カタログNo．3500-1002)から入手したルリアーベルタニ(Luria-Bertani) 培地（L-ブロス培地、10 gのトリプトン、5gの酵母抽出物、10 gのNaCl、pH7.3)中の12%PEGおよび36% グリセロール溶液中で調製した。プラスミドDNA は、(128) に報告されているように、改良したアルカリ溶解法によって、37℃にて育成した一夜培養物2.0 mlから単離した。ベクターpBluescript 中の該クローニングサイトに隣接するインサートのサイズは、制限エンドヌクレアーゼKpnlおよびSaclで消化することにより決定した。全体で10個の独立したコロニーが同定され、これらは700 塩基対のインサートを含んでいた。該プライマーの配列は、5'から3'の方向で与えられている。“Y” はピリミジン(TまたはC)を表す。該クローンの一種（プラスミドpBS001）からのDNA は両方向に配列決定した。以前に報告された方法(86，88，89)によって、第４表に示したプラスミドを使用して、自動化DNA 配列決定を、ジェネシス2000オートメーテッドDNA シーケンサー(Genesis 2000 Automated DNA Sequencer)（デュポン(DuPont)，ウイルミントン、DE）によって実施した。全ての配列決定は両ストランドについて実施した。自動化配列決定を実施し、その結果を共通配列を形成するようにまとめた。該T3 プラスミドから決定された配列は、該インサートの5'末端を表し、該T7−由来の配列は3'末端を表す。このようにして決定した配列をHu-IFN- α001 と命名し、第１図に示した。該 Hu-IFN- α001 インサートを発現ベクターTGATG(129)にスプライシングするのに使用したAlwNI 制限エンドヌクレアーゼ認識サイト(5' CAGNNNCTG 3') の位置は該図に下線を施して示した。シグナルペプチドは-1〜-23 で表示した23個のアミノ酸を含むものとして示されている。第１図から分かるように、成熟タンパク質は166 個のアミノ酸を含む。全てのプライマーは、5'から3'の方向で与えられている。「方向」と題した欄はHu-IFN -αの配列に対する配列の方向を表す。“F”は順方向を、また“R”は逆方向を表す。オリゴデオキシヌクレオチドは、ホスホルアミダイト法(83，130 ) によって、アプライドバイオシステム(Applied Biosystem) DNA 合成装置モデル380Bにより合成した。このタンパク質配列と、他のヒトインターフェロンα種(HU-IFN-α) との比較は、Hu-IFN- α001 がHu-IFN- αJ と最も密接に関連していることを立証している。この比較は第２図にグラフとして示した。公知のHu-IFN- α配列の概説は以前に報告されている(61)。Hu-IFN- αJ と比較して、全体で６個のアミノ酸の変更が見られる。このデータは、この腫瘍由来のHu-IFN- α種が以前に報告された如何なる公知の他のHu-IFN- α種とも異なることを明確に立証している。更に、この特定の配列を予測することは不可能であったはずである。というのは、これら６つの位置における改変をもつ可能なタンパク質の数は20⁶ 、即ち64,000,000 個であるからである。アミノ酸変化の一つは、シグナルペプチド配列におけるものであり、残りの５個の改変は成熟タンパク質中にある。同様に、ここに提示される誘導されたHu-IFN- α種が、腫瘍細胞由来の天然インターフェロンであることも強調すべきである。これは、６つの位置の単なる変異により調製した合成構築物ではない。 Hu-IFN- α001 遺伝子の発現を２段階で達成した。該プラスミドpBS001を制限エンドヌクレアーゼKpnlで消化した(Hu-IFN-α001 配列の5'末端）。このKpnI切断末端を、以下の反応混合物中でT4 DNAポリメラーゼと共にインキュベートすることにより平滑化した。即ち、１μｇのDNA;33mMのトリス(Tris)アセテ一ト、pH 7.9; 66mMの酢酸カリウム；10mMの酢酸マグネシウム；0.5 mMのジチオスレイトール; 100 μg/mlのBSA(ウシ血清アルブミン);各２mMの４種のdNTP; ５単位のT4 DNAポリメラーゼ（ユナイテッドステーツバイオケミカル社(United States Bio chemical Corp.)); 全体積18μｌ。インキュベーションを５分間37℃にて実施して、該平滑末端を調製した。次いで、このプラスミドDNA をXbaI(Hu-IFN-α001 配列の3'末端）で消化して、該Hu-IFN- α001 配列を含むインサートを遊離させた。次に、これらのDNA フラグメントを文献(86)に記載の如く精製した。TGATG ベクターを、制限エンドヌクレアーゼSacIで消化し、次いで上記のようにT4 DNA ポリメラーゼによって平滑末端を調製し、更に制限エンドヌクレアーゼXbaIで消化することにより調製した。次いで、該Hu-IFN- α001 インサートを含む該フラグメントを該pTGATG発現ベクターに結合した(129) 。結合後、該DNA を感応E.コリDH5 α細胞内に形質転換した。上記のように該細胞を育成してコロニーを分析し、プラスミドDNA を単離した。次いで、このプラスミドを制限エンドヌクレアーゼEcoRI およびXbaIで消化して、インサートのサイズを決定した。Hu-IFN- α J に対する発現ベクターを、以前にHu-IFN- αB2およびHu-IFN- αA/D の発現プラスミドに関連して記載されたように(131) して調製した。 Hu-IFN- αJ およびHu-IFN- α001 をコードするヌクレオチド配列は、該配列（第３図）の同一の位置にAlwNI サイトを含み、またHu-IFN- α001 に対する発現ベクターを含むプラスミドpHu-IFN-α001 の構造を示す第３図に示した如く、第二のAlwNI サイトが、該ベクター自体内に存在する。更に、このAlwNI 認識サイト(CAGNNN^CTG)が３つの未だ特定されていないヌクレオチド(NNN)を3'オーバーハング内に有するので、レリゲーション(religations )は特異的かつ非対称である。従って、Hu-IFN- αJ およびHu-IFN- α001 をコードするpTGATGベクター(129) を制限エンドヌクレアーゼAlwNI によって消化して、それぞれ大きなベクターおよびHu-IFN- α001(3'末端) フラグメントを単離した。次いで、このHu-IFN- α001 フラグメントを、プラスミドpHu-IFN-αJ からのベクターフラグメントと結合して、第３図に示すように、E.コリ発現ベクターpHu- IFN-α001 を生成し、これを感応E.コリ(DH5α) 細胞(86)にトランスフェクションした。プラスミドpHu-IFN-α001 は、MD 20852、ロックビル、12301 パークローンドライブのアメリカンタイプカルチャーコレクション(American Type Culture Col lection(ATCC))に、寄託番号の下で、1994年６月７日付けで寄託されており、プラスミドpHu-IFN-α001(宿主ベクター系として、E.コリDH5 α/pHu-IFN - α001)と命名されている。この発現ベクターpHu-IFN-α001 を含むE.コリ(DH5α) 細胞を、ロータリー振盪器を備えた２ｌフラスコ中の、875 mlの培地Ａ中で、30℃にて一夜育成した。この培地ＡはKH₂PO₄(4.5g/l)、Na₂HPO₄ ・7H₂O(18.9g/l)、NH₄Cl(1.5 g/l)、NaCl (0.75 g/l)、グルコース(15 g/l)、カザミノ酸(7.5g/l)、MgSO₄ ・7H₂O(0.369 g/ l)、チアミン塩酸塩(0.0015 g/l)、ロイシン(0.04 g/l)、プロリン(0.04 g/l)およびアンピシリン(0.05 g/l)からなり、pH 7.4に調節されている。この一夜培養物を、醗酵器内の22.5ｌの培地Ａに接種するのに使用した。該発現ベクターを含むE.コリを30℃にて、A₅₅₀が7.0 に達するまで（この時点で温度は42℃まで上昇する）育成した。42℃での温度誘導後３時間において、該細胞を遠心分離によって収穫し、得られた細胞ペレットを、-80 ℃にて凍結する前に、50ｇづつに分割した。これらの細胞を-80 ℃にて、インターフェロンを調製する目的で使用するまで保存した。 Hu-IFN- α001 の精製 Hu-IFN- α001 の精製のために、凍結したE.コリ細胞ペーストを、10容のバッファーＡ(50 mMのTris・ HCl，pH 8.0; 50 mMのNaCl; 10mMのEDTA; 0.1 mMのPMSF (フェニルメチルスルホニルフルオライド))中に懸濁することにより解凍した。卵白リゾチーム(0.2mg/ml)の添加後、氷浴中に保持しつつ、30秒のバースト４回に渡り超音波処理し、次いで激しく攪拌しつつ23℃にて一夜インキュベートし、 DNA に起因する粘性を排除した。この懸濁液を４℃にて12000rpmで20分間遠心処理した。得られたペレットを、1%トライトン(Triton)X-100 、50mMのEDTA、0.5M のNaClを含有する10容のバッファーＡに再懸濁し、振盪しつつ室温にて少なくとも２時間(2〜16時間) インキュベートし、次いで４℃にて12000rpmで20分間遠心処理した。もう一度該ペレットを0.5MのNaClを含有する５容のバッファーＡに再懸濁し、振盪しつつ室温にて60分間インキュベートし、次いで４℃にて12000rpm で20分間遠心処理して、上澄を捨てた。このペレットを、酸化型／還元型グルタチオン混合物(0.2mM/2.0mM) の存在下で、２容のバッファーＡ中に分散し、固体グアニジン・ HCl(バクテリア重量の2.5 倍）を添加し、この溶液を室温にて７時間攪拌した。この攪拌の後、該混合物をバッファーＡで10倍に希釈し、一夜放置した。該インターフェロンの復元は、7Mのグアニジン・HCl を0.7Mまで、極めてゆっくりと添加することにより実施した。溶液中でのHu-IFN- α001 の再生は15 時間以上必要とされる。Hu-IFN- α001 は２個のジスルフィド結合を含むので、この工程はグアニジン−含有溶液からの希釈中に、該タンパク質の緩慢な酸化を含む。次いで、この懸濁液を遠心処理して、デブリを除去した。固体(NH₄)₂SO₄ を、該上澄に、最終濃度が1Mとなるまで添加し、遠心処理による清浄化後に、この溶液を、予め３〜４カラム体積のバッファーＢ(50 mMのTris・ HCl，pH 7.4;0. 5 M のグアニジン・ HCl および1Mの(NH₄)₂SO₄)で平衡化した吸着剤フェニル−トヨパール(Phenyl-Toyopearl) 650 S(20-50μm) (スペルコ(Spelco)，#8-14477: 100 g)100 mlを充填したカラム（ファルマーシア(Pharmacia) XK 26/20 #18-100 0-72）上で5ml/分で投入した。カラム流出液を280 nmにて監視した。該投入後、該カラムをバッファーＢで、該流出液のA₂₈₀が殆どベースラインレベルに戻るまで洗浄し、次いでカラム体積の２〜３倍容のバッファーＣ(50 mMのTris・ HCl; 0 .5M のグアニジン・ HCl; 0.6M の(NH₄)₂SO₄)で溶出させた。これによってHu-IFN - α001 は溶出された。SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動においてHu-IFN- α001 の最大バンドを与えるピーク画分をプールした。該フェニルートヨパールカラムを、その場で100 mlの0.5MNaOHおよび1MNaCl溶液で再生し、0.01% ナトリウムアジド中で保存した。抗ウイルス活性および／またはゲル電気泳動による測定によって、Hu-IFN-001を含む画分をプールし、アミコンセントリプレプ(Amico n Centriprep) 10濃縮器で10倍に濃縮した。次いで、この溶液をバッファーＤ(2 0 mMのTris・ HCl，pH 8.0;5%グリセロール) で３倍に希釈し、バッファーＤで平衡化したFPLCモノQ HR 10/10イオン交換カラム（ファルマーシア(Pharmac ia）# 17-0556-01）に投入した。このカラムをA₂₈₀がベースラインに達するまで、約10mlのバッファーＤで洗浄した。Hu-IFN- α001 の溶出は、バッファーＤとバッファーＥ (バッファーＤ＋1M NaCl)の線形勾配を利用して、即ちバッファーＥ０〜100%にて1.5ml/分の流量で３時間に渡り溶出することにより達成された。該Hu-IFN- α001 は0.15M NaClにて単一のピークとして溶出された。これらの画分をプールし、ドデシル硫酸ナトリウム(SDS) ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析し、かつ抗ウイルス活性につきアッセイした。6g（湿潤重量）のバクテリアペレットから、約8-10mgのHu-IFN- α001 が得られた。この精製したタンパク質を15μｌSDS（0.5 MのTris・ HCl，pH 6.8; 1%(v/v)の β−メルカプトエタノール; 1%(w/v)のドデシル硫酸ナトリウム(SDS); 12%(v/v) のグリセロール; 2 mMのエチレンジアミンテトラ酢酸(EDTA); ブロムフェノールブルー）と混合して、全体積を35μｌとした。この溶液を２分間沸騰させ、その後その25μｌを、4%のポリアクリルアミド濃縮用ゲルをもつ12.5% のポリアクリルアミドゲル上に載せた。この分離用ゲルを0.3MのTris・ HCl; 0.08%のSDS; 2mM のEDTA、pH 8.8 によって緩衝させた。該濃縮用ゲルは、0.065MのTris・ HCl，pH 6.8および0.05% のSDS 中に配置された。チャンバーバッファーは25mMTris・ HC l，0.1% SDS，0.2M グリシンであった。電気泳動は、バイオラドミニプロテイアン(BioRad miniproteian) II装置(132) 内で、150V、20mAにて１時間実施した。このゲルをクーマシーブルー(Coomassie Blue) R-250(45%メタノール中の 2.4% (w/v) クーマシーブルー、9%(v/v) 酢酸）で、室温にて１時間染色し、8%酢酸中で脱色した。SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動から、第４図に示した如く、この精製されたHu-IFN- α001 がMr 20,000 において移動することが明らかとなった。この図に示された如く、Hu-IFN- α001 は、それぞれレーン１、２および３に３μｇ、1.5 μｇおよび0.75μｇの量で配置された。Ｍと題した欄は、各分子量マーカーの左側に与えられた、キロダルトンで表された値をもつ分子量マーカーを表す。理解されるように、該Hu-IFN- α001 は、SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE 参考文献132)において、Hu-IFN- αJ よりも僅かに遅い易動度を示した。 Hu-IFN- α001 の抗ウイルス活性は、以前に記載された(133) ように、水庖性口内炎ウイルス(VSV) を含むウシMDBKおよびヒトFS-7細胞についてアッセイした（第５表）。抗ウイルス単位は、ヒトIFN-αA 国際標準、即ちGxa01-901-535に対して決定した。多くのHu-IFN- α種に見られるように(17，27，30，100，103 ，134）、ヒトおよびウシ細胞についてほぼ等しい抗ウイルス活性が見られた。インターフェロン力価は文献記載(10-12，99，100，133，135)の如く、ナショナルインスティチューツオブヘルス(National Institutes of Health) からのヒトインターフェロンαＡに対する国際標準Gxa01-901-535 に対する単位／mgで与えた。水庖性口内炎ウイルス(VSV) はヒトFS-7およびウシMDBK細胞に関するチャレンジウイルスとして使用した。FS-7に対する該インターフェロンの抗ウイルス活性対MDBK細胞に対する該抗ウイルス活性の比を最後の欄に与えた。Hu-IFN- α 001 のサンプルは本文に記載のように調製した。タンパク質はブラッドフォード (Bradford)の方法(136) によって決定した。以上、正常な細胞には存在しないが、ウイルス疾患状態にある細胞中には存在するタンパク質である、超タンパク質と称される全く新規な一群の分子、およびかかる分子を同定し、生産し、かつ発現する方法について説明した。本発明の態様を詳細に説明したが、添付の請求の範囲に規定したような、本発明の精神並びに範囲を逸脱することなく、ここに種々の変更、改変並びに置換をなし得るものと理解すべきである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＣ０７Ｋ 14/56 ＺＮＡ 8517−4ＨＣ０７Ｋ 14/57 14/565 7804−4ＢＣ１２Ｎ 1/21 14/57 9637−4ＢＣ１２Ｐ 21/02 ＦＣ１２Ｎ 1/21 9453−4ＢＣ１２Ｑ 1/68 Ａ 5/10 9281−4ＢＣ１２Ｎ 5/00 ＢＣ１２Ｐ 21/02 9051−4ＣＡ６１Ｋ 37/66 ＡＤＵＢＣ１２Ｑ 1/68 9051−4ＣＦ //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19）

Claims

【特許請求の範囲】１．特定のヌクレオチド配列を得ることのできる、疾患をもつ細胞を選択する工程と、ヌクレオチド配列の少なくとも一部を包含するように、適当なプライマー対を決定して、該ヌクレオチド配列を増幅する工程と、該疾患をもつ細胞から得られる、クローニングしたヌクレオチド配列を、変性配列につきスクリーニングして、変性ポリペプチドをコードする配列を同定する工程と、該変性ポリペプチドを発現させる工程と、該変性ポリペプチドを、疾患をもたない細胞から得られるタンパク質についてのアミノ酸配列と比較して、該疾患をもたないタンパク質とは異なる特性をもつポリペプチドを決定する工程、を含むことを特徴とする、変性ポリペプチドを同定し、かつ生産する方法。２．該選択された疾患をもつ細胞が造血細胞由来のものである、請求の範囲第１項に記載の方法。３．該選択された疾患をもつ細胞が白血病性白血球由来のものである、請求の範囲第１項に記載の方法。４．該選択された疾患をもつ細胞がヒト悪性疾患由来のものである、請求の範囲第１項に記載の方法。５．上記の変性ポリペプチドを発現させる工程が、該変性ポリペプチドをコードするDNA 配列を、宿主細胞中で発現させることにより実現する、請求の範囲第１項に記載の方法。６．該スクリーニング工程が、更に適当なプラスミド内に挿入することにより、該ヌクレオチド配列をクローニングし、該プラスミドをその後適当な宿主内で形質転換する工程をも含む、請求の範囲第１項に記載の方法。７．インターフェロン活性を有し、独自に疾患をもつ細胞を由来とし、かつ天然のIFN α種の変種であることを特徴とする、組み換えにより生成されるポリペプチド。８．該疾患をもつ細胞が造血細胞由来のものである、請求の範囲第７項に記載の組み換えにより生成されるポリペプチド。９．該疾患をもつ細胞が白血病性白血球由来のものである、請求の範囲第７項に記載の組み換えにより生成されるポリペプチド。 10．該疾患をもつ細胞がヒト悪性疾患由来のものである、請求の範囲第７項に記載の組み換えにより生成されるポリペプチド。 11．インターフェロン活性を有し、独自に疾患をもつ細胞を由来とし、かつ天然のIFN β種の変種であることを特徴とする、組み換えにより生成されるポリペプチド。 12．該疾患をもつ細胞が造血細胞由来のものである、請求の範囲第11項に記載の組み換えにより生成されるポリペプチド。 13．該疾患をもつ細胞が白血病性白血球由来のものである、請求の範囲第11項に記載の組み換えにより生成されるポリペプチド。 14．該疾患をもつ細胞がヒト悪性疾患由来のものである、請求の範囲第11項に記載の組み換えにより生成されるポリペプチド。 15．インターフェロン活性を有し、独自に疾患をもつ細胞を由来とし、かつ天然のIFN γ種の変種であることを特徴とする、組み換えにより生成されるポリペプチド。 16．該疾患をもつ細胞が白血病性白血球由来のものである、請求の範囲第15項に記載の組み換えにより生成されるポリペプチド。 17．該疾患をもつ細胞がヒト悪性疾患由来のものである、請求の範囲第15項に記載の組み換えにより生成されるポリペプチド。 18．インターロイキン-2活性を有し、独自に疾患をもつ細胞を由来とし、かつ天然のインターロイキン-2種の変種であることを特徴とする、組み換えにより生成されるポリペプチド。 19．該疾患をもつ細胞が白血病性白血球由来のものである、請求の範囲第18項に記載の組み換えにより生成されるポリペプチド。 20．該疾患をもつ細胞がヒト悪性疾患由来のものである、請求の範囲第18項に記載の組み換えにより生成されるポリペプチド。 21．第１図に、Hu-IFN- α001 について記載したような、位置１〜位置166 までのアミノ酸配列を有することを特徴とする、ヒト白血球インターフェロン。 22．インターフェロン活性を有し、かつ以下に示すHu-IFN- α001 のアミノ酸配列を含むことを特徴とする組み換えにより生成されるポリペプチド： 23．該ポリペプチドが独自に疾患をもつ細胞由来のものである、請求の範囲第22 項に記載のポリペプチド。 24．該疾患をもつ細胞が造血細胞由来のものである、請求の範囲第22項に記載のポリペプチド。 25．該疾患をもつ細胞が白血病性白血球由来のものである、請求の範囲第23項に記載の組み換えにより生成されるポリペプチド。 26．該疾患をもつ細胞がヒト悪性疾患由来のものである、請求の範囲第23項に記載の組み換えにより生成されるポリペプチド。 27．製薬上許容される賦形剤または担体と混合した、有効量の請求の範囲第22項に記載のポリペプチドを含む、ヒトにインターフェロン療法を施すための薬理粗製物。 28．ヒトIFN-α001 のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする配列を含有するDNA 配列。 29．該ポリペプチドの微生物発現の実施を可能とするDNA 配列と、機能的に結合された請求の範囲第28項に記載のDNA 配列。 30．該ポリペプチドの哺乳動物発現の実施を可能とするDNA 配列と、機能的に結合された請求の範囲第28項に記載のDNA 配列。 31．該ポリペプチドの真核生物発現の実施を可能とするDNA 配列と、機能的に結合された請求の範囲第28項に記載のDNA 配列。 32．成熟ヒト白血球インターフェロンとしての、ヒトHu-IFN- α001 のアミノ酸配列を含むポリペプチドを発現し得る、複製可能な発現ベクター。 33．微生物である、請求の範囲第32項に記載の発現ベクター。 34．哺乳動物である、請求の範囲第32項に記載の発現ベクター。 35．真核生物である、請求の範囲第32項に記載の発現ベクター。 36．承認番号の下で、アメリカンタイプカルチャーコレクションに寄託されている、プラスミドpHu-IFN-α001。