JP2001342199A - 精製インターフェロンの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 組換えバキュロウイルスをカイコ等の昆虫に
感染させることによりインターフェロン（ＩＦＮ）を生
産する方法において、宿主昆虫由来の夾雑蛋白質を簡単
な手段でほぼ完全に除去し、効率よく精製ＩＦＮを得る
手段を提供すること。 【解決手段】 ＩＦＮ蛋白質をコードする遺伝子を組み
込んだ組換えバキュロウイルスをその宿主に感染させる
ことにより生産したＩＦＮ含有液を、（１）シリカゲル
カラムクロマトグラフィー、陰イオン交換カラムクロマ
トグラフィーおよび金属キレートカラムクロマトグラフ
ィーを含む処理に付すか、あるいは、（２）酸性化処理
した後、陰イオン交換カラムクロマトグラフィーおよび
金属キレートカラムクロマトグラフィーを含む処理に付
すことを特徴とする精製ＩＦＮの製造方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、組換えバキュロウ
イルスを用いて生産した哺乳動物由来インターフェロン
含有原料を精製し、哺乳動物由来精製インターフェロン
を製造する方法に関し、更に詳細には、昆虫細胞または
虫体由来の夾雑物を効率的に除去し、より経済的に哺乳
動物由来精製インターフェロンを製造する方法に関す
る。

【０００２】

【従来の技術】インターフェロン（以下、「ＩＦＮ」と
略す）は、抗ウイルス作用を示す蛋白質を主成分とする
生理活性物質で、抗ウイルス剤、抗腫瘍剤等の医薬の有
効成分として用いられているものである。このＩＦＮの
製造には遺伝子操作の手法が採用されており、動物細胞
を用いる方法、組換え大腸菌、組換え酵母菌、あるいは
組換えバキュロウイルスを用いて製造する方法等が知ら
れている。

【０００３】これまで、ＩＦＮには三種類の異なるタイ
プ（ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ）が存在する
が、抗ウイルス作用が類似するＩＦＮ−αとＩＦＮ−β
をＩ型ＩＦＮと呼び、ＩＦＮ−γはＩＩ型ＩＦＮと呼ば
れている。更にＩ型ＩＦＮには、ＩＦＮ−αと相同性の
高いＩＦＮ−ωが知られているが、最近になって、ウシ
受精卵移植による子牛の生産における早期胚死滅の原因
の一つとして、妊娠黄体の早期退行が考えられ、この黄
体退行阻止因子としてＩＦＮ−αと相同性の高いＩＦＮ
−τ（タウ）の存在が明らかになった（ Biology of re
production 32(1985), 681-693 ）。

【０００４】このＩＦＮ−τは、妊娠黄体の退行阻止因
子としての利用が期待されるとともに、他のＩＦＮと同
様に抗ウイルス活性も強く、しかも毒性が少ないとの報
告もされている。また、羊のＩＦＮ−τがＦＩＶ（ネコ
免疫不全ウイルス）およびＨＩＶ（ヒト後天性免疫不全
ウイルス）に対する強い抑制効果を示したとの報告もな
され（ The Journal of Immunology 1997, 158:4351-43
57 ）、感染症に対する治療薬としても期待されてい
る。

【０００５】ところで、ＩＦＮの医薬品としての実用化
に当たっては、大量生産手段の開発も重要であるが、こ
れと並び効率的な精製手段の開発が求められる。 すな
わち、遺伝子操作の手段により得られるＩＦＮには、利
用する宿主細胞由来の夾雑蛋白質が存在する可能性があ
り、この夾雑蛋白質を完全に除去することができる精製
手段が求められている。

【０００６】しかし、実際には製造手段により異なる利
用細胞の種類毎に夾雑蛋白質の種類も異なり、また、Ｉ
ＦＮと近似した性質を有する夾雑蛋白質が多く、複雑な
精製方法を組み合わせて精製を行っても、高純度の精製
物を得ることは困難であった。

【０００７】例えば、ヒト胎盤トロホブラスト細胞培養
液からのＩＦＮの精製に関して、アフィニティーカラ
ム、透析・濃縮、逆相高性能液体クロマトグラフィーを
用いる方法（特表平７−５０４１６１号公報）、羊の胎
児培養液からのＩＦＮの精製に関して、透析および陰イ
オン交換カラムを組み合わせる方法（特表平４−５００
８００号公報）が知られている。

【０００８】また、例えばヒトＩＦＮ−αの精製に関し
て、ナマルバ細胞より得られた天然型ヒトＩＦＮをＣＰ
Ｇ（ガラスビーズ）ゲル濾過、フェニルアガロース（疎
水性カラム）を使用する方法（J.E.Whitman et al., J.
Interferon Res., 1, 305,1981）や、天然型マウスＩ
ＦＮ−βについてエールリッヒ腹水からの精製に関し
て、ＣＰＧ（ガラスビーズ）、陽イオン交換カラム（Ｃ
Ｍ−セファデックス）を使用する方法（Taira et al.,
Science, 207.528,1980）等が報告されている。しか
し、本発明者等はこれらの報告どおりの方法を用いてバ
キュロウイルスの発現系からの精製を試みたが、純度の
高いＩＦＮの精製物を得ることはできなかった。

【０００９】さらに、組換えバキュロウイルスを感染さ
せた昆虫虫体を用いてＩＮＦを製造する場合には、昆虫
細胞培養法に比べ、高レベルの組換え蛋白質が分泌され
るものの、昆虫虫体由来の夾雑物が多いため、夾雑物と
組換え蛋白質の分離は極めて困難であった。

【００１０】

【発明が解決しようとする課題】従って、本発明の課題
は、簡単な手段でほぼ完全に昆虫虫体または昆虫細胞由
来の夾雑蛋白質を除去する方法を開発し、効率よく精製
ＩＦＮを得る手段を提供することである。

【００１１】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、昆虫ある
いは昆虫細胞を宿主とし、組換えバキュロウイルスを用
いる遺伝子操作の手法で経済的に哺乳動物由来のＩＦＮ
を得る方法の研究を行っていたところ、ＩＦＮはこれを
含む原料を必要により塩析した後、シリカゲルカラム、
陰イオン交換カラムおよび金属キレートカラムを組み合
わせ利用することにより、あるいは、酸性化処理後、陰
イオン交換カラムおよび金属キレートカラムを組み合わ
せ利用することにより、容易に昆虫細胞由来の夾雑蛋白
質等と分離できることを知り、本発明を完成した。

【００１２】すなわち、本発明はＩＦＮ蛋白質をコード
する遺伝子を組み込んだ組換えバキュロウイルスをその
宿主に感染させることにより生産したＩＦＮ含有原料
を、シリカゲルカラムクロマトグラフィー、陰イオン交
換カラムクロマトグラフィーおよび金属キレートカラム
クロマトグラフィーを含む処理に付すことを特徴とする
精製ＩＦＮの製造方法である。

【００１３】また、本発明はＩＦＮ蛋白質をコードする
遺伝子を組み込んだ組換えバキュロウイルスをその宿主
に感染させることにより生産したＩＦＮ含有原料を、酸
性化処理した後、陰イオン交換カラムクロマトグラフィ
ーおよび金属キレートカラムクロマトグラフィーを含む
処理に付すことを特徴とする精製ＩＦＮの製造方法であ
る。

【００１４】

【発明の実施の形態】本発明により、哺乳動物由来精製
ＩＦＮ（以下、「精製ＩＦＮ」という）を得るには、昆
虫あるいは昆虫細胞を宿主とし、組換えバキュロウイル
スを利用して得た哺乳動物由来のＩＦＮを含む原料（以
下、「ＩＦＮ原料」という）を後記する第一または第二
のいずれかの方法で処理することが必要である。

【００１５】本発明において使用されるＩＦＮ原料の例
としては、哺乳動物由来のＩＦＮ遺伝子、例えばヒト、
ウシ、ウマ、ネコまたはイヌ由来のＩＦＮ遺伝子を組み
込んだ組換えバキュロウイルスを感染させたカイコ細胞
（ＢｍＮ細胞、ＢｏＭｏ細胞等）、鱗翅目ヤガ科の昆虫
細胞［Ｓｆ９細胞、Ｓｆ２１細胞（ハスモンヨトウガ；
Spodoptera frugiperda 由来）、Ｔｎ−５細胞（イラク
サキンウワバ；Trichoplusia ni 由来）］の培養上清
や、これを適当な緩衝液で希釈したものが挙げられる。
また、別の例としては同じ組換えバキュロウイルスを
カイコ虫体または鱗翅目ヤガ科の昆虫（キンウワバ；Au
tographa californica、Spodoptera frugiperda 、Tric
hoplusia ni 等）の虫体に感染させ、飼育した後の虫体
から得た体液や虫体の摩砕液もしくはこれらを適当な緩
衝液で希釈したもの等が挙げられる。

【００１６】本発明の第一の方法は、上記ＩＦＮ原料
を、塩析した後、シリカゲルカラムクロマトグラフィ
ー、陰イオン交換カラムクロマトグラフィーおよび金属
キレートカラムクロマトグラフィーを含む処理に付し、
精製ＩＦＮを得る方法である。この第一の方法は、ＩＦ
Ｎの中でも特にＩＦＮ−τの精製に適している。

【００１７】前処理としての塩析は、例えば、硫酸アン
モニウム、硫酸ナトリウム、リン酸カリウム等を用い、
常法に従い行うことができるが、ＩＮＦ−τの精製を目
的とする場合は、以下に例示される硫酸アンモニウムを
用いた二段階の塩析を行うことが好ましい。

【００１８】すなわち、まず第一次の塩析として、ＩＦ
Ｎ原料を必要に応じて１０倍程度に希釈した後、３０〜
４０％の硫酸アンモニウムを添加し１時間程度撹拌す
る。撹拌後、遠心分離（１０ｋＧ、３０分間程度）を行
い上清と沈殿を分離する。この段階で疎水性の強い蛋白
質など夾雑蛋白質が沈殿として除去される。

【００１９】次に、第二次の塩析として、第一次の塩析
で得た上清に、６５〜７５％の硫酸アンモニウムを添加
し、ＩＮＦ−τ等の目的蛋白質を濃縮・沈殿させる。得
られた沈殿は、遠心分離（１０ｋＧ、３０分間程度）に
よって上清と分離され、以後の処理に移される。

【００２０】塩析処理によって得られたＩＮＦを含む沈
殿は、適切な緩衝液［例えばトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ
８.０）］に溶解した後、シリカゲルカラムクロマトグ
ラフィー、陰イオン交換カラムクロマトグラフィーおよ
び金属キレートカラムクロマトグラフィーを含む処理に
付される。

【００２１】本方法において使用されるシリカゲルカラ
ムとしては、カセイゲル ３００−７５（東京化成工業
社製）、ＰＧ ２４０−２００（シグマ社製）等のシリ
カゲルを利用することができる。この処理では、あらか
じめ開始緩衝液で湿潤させた上記シリカゲルカラムに塩
析後のＩＦＮ溶解液をアプライして吸着させた後、洗浄
緩衝液によりＵＶモニターによる吸収（２８０ｎｍ）が
安定するまで洗浄し、次いで溶出緩衝液を用いて溶出す
ることにより、一次精製ＩＦＮ原料が得られる。

【００２２】本工程で使用する緩衝液としては、以下に
例示されるものを用いることが好ましい。 開始緩衝液：５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８.０）
等 洗浄緩衝液：５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８.０）
等 溶出緩衝液：３０％エチレングリコールを含む５０ｍＭ
トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８.０）等

【００２３】また、二次精製に用いられる陰イオン交換
カラムとしては、Ｑ−セファロースＦＦ（ファルマシア
社製）、フラクトゲル ＥＭＤ ＴＭＡＥ（シグマ社
製）、ＴＳＫスーパーＱ−トヨパール６５０（東ソー社
製）等が例示される。この工程では、開始緩衝液で陰イ
オン交換カラムを予め平衡化しておき、シリカゲルカラ
ムから溶出された分画をアプライした後、ＵＶモニター
による吸収（２８０ｎｍ）が安定するまで開始緩衝液を
流しつづけ、吸収が安定した時点で洗浄緩衝液に切り替
え、しばらく洗浄をおこなう。吸収ピーク（２８０ｎ
ｍ）がゼロになった時点で溶出緩衝液に切り替えてＩＮ
Ｆを溶出させる。

【００２４】本工程で使用する緩衝液としては、以下に
例示されるものを用いることが好ましい。 開始緩衝液：５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８.０）
等 洗浄緩衝液：５０ｍＭＮａＣｌを含む５０ｍＭトリス塩
酸緩衝液 （ｐＨ８.０）等 溶出緩衝液：３００ｍＭＮａＣｌを含む５０ｍＭトリス
塩酸緩衝液（ｐＨ８.０）等

【００２５】さらに、最終精製に用いられる金属キレー
トカラムは、ニッケル、銅、亜鉛イオン等の金属を結合
したカラムであり、担体としては例えばキレーティング
セファロースＦＦ（ファルマシア社製）、キレートセル
ロファイン（生化学工業社製）、フラクトゲル ＥＭＤ
キレート６５０（シグマ社製）等が利用できる。この処
理では、前記担体を詰めたカラムに硫酸銅水溶液を流し
て７０％程度吸着させる。蒸留水でカラムを洗浄した
後、開始緩衝液に切り替え、十分に平衡化を行う。平衡
化後、陰イオン交換カラムから溶出された分画をアプラ
イした後、再度開始緩衝液を流してよく洗浄した後、洗
浄緩衝液に切り替え、しばらく洗浄をおこなう。洗浄
後、溶出緩衝液に切り替えて溶出を行うことにより、夾
雑蛋白質が除去された精製ＩＦＮが得られる。

【００２６】本処理で使用する緩衝液としては、以下に
例示されるものを用いることが好ましい。 開始緩衝液：５００ｍＭＮａＣｌを含む５０ｍＭトリス
塩酸緩衝液（ｐＨ８.０）等 洗浄緩衝液：５００ｍＭＮａＣｌを含む酢酸緩衝液（ｐ
Ｈ５.０）等 溶出緩衝液：５００ｍＭＮａＣｌを含む酢酸緩衝液（ｐ
Ｈ４.２〜３.８）等

【００２７】本発明の第二の方法は、上記ＩＦＮ原料
を、酸およびアルカリで処理（以下、「酸性化処理」と
いう）した後、陰イオン交換カラムクロマトグラフィー
および金属キレートカラムクロマトグラフィーを含む処
理に付し、精製ＩＦＮを得る方法である。この第二の方
法も、第一の方法と同様に、ＩＦＮの中でも特にＩＦＮ
−τの精製に適している。

【００２８】第二の方法における酸性化処理は、濃硫
酸、濃塩酸などを用い、また中性にもどすには水酸化ナ
トリウム液、水酸化カリウム液を用いることがよいが、
以下に例示する手順に従って行うことができる。すなわ
ち、ＩＦＮ原料がカイコの体液や磨砕液である場合は、
１０倍程度に希釈した上で、撹拌しながら例えば濃塩酸
を用いてｐＨを下げていく。ｐＨが２.０前後に下がる
まで添加を続け、その状態で３０分〜１時間程度撹拌を
行う。その後、例えば５Ｎの水酸化ナトリウム等を用
い、ｐＨを８.０付近まで調整し、遠心分離（１０ｋ
Ｇ、３０分間）によって得られた上清を以後の処理に用
いる。

【００２９】この酸性化処理は、ＩＦＮ原料のｐＨを一
旦酸性領域（好ましくはｐＨ２.０付近）まで下げた
後、ｐＨ調整を行って溶液のｐＨを酸性状態から再度中
性付近（好ましくはｐＨ８.０付近）へと上昇させるこ
とにより、ＩＦＮ原料中の夾雑蛋白質を変性せしめ、遠
心分離によって容易に除去できるようにするための操作
である。この酸性化処理は、ＩＦＮ原料がカイコの体液
や磨砕液など、夾雑蛋白質を多量に含んでいる場合に特
に有効である。

【００３０】酸性化処理によって得られた上清は、陰イ
オン交換カラムクロマトグラフィーおよび金属キレート
カラムクロマトグラフィーを含む処理に付される。陰イ
オン交換カラムクロマトグラフィー以降の処理における
操作および条件は、第一の方法と同様に行うことができ
る。

【００３１】なお、第二の方法では、酸性化処理後の上
清をそのまま陰イオン交換カラムにアプライするが、第
一の方法に準じ、シリカゲルカラムによる処理を追加
し、酸性化処理後の上清をシリカゲルカラムクロマトグ
ラフィーに付した後、陰イオン交換カラムクロマトグラ
フィーに付してもよいことは言うまでもない。

【００３２】また、酸性化処理と組み合わせて、第一の
方法で示した塩析処理を実施し、前処理とすることも可
能である。

【００３３】上記の第一の方法あるいは第二の方法で得
られた精製ＩＦＮ原料は、必要により例えば凍結乾燥等
の手段により乾燥粉末とすることもできる。

【００３４】得られた精製ＩＦＮは、後記実施例で示す
ごとく、いずれも蛋白質１ｍｇ当たりのＩＦＮ活性（比
活性）が高くなり、高度に精製されていることがわか
る。特に、カイコ虫体を用いる場合には、活性の低いＩ
ＦＮ原料から極めて精製度の高いＩＦＮが得られてお
り、カイコ虫体を利用したＩＦＮの発現とあわせ、本発
明は経済的に有利なＩＦＮの生産方法を提供するもので
ある。また、カイコ等の虫体を利用すると、精製ＩＦＮ
は糖鎖の付加したものが得られるため、大腸菌等の発現
系を使用して製造されたＩＦＮに比べ、より有効な生理
活性を持つなど優れている。

【００３５】また、昆虫細胞を含め樹立細胞を利用した
蛋白質発現系では、得られる蛋白質はＣ末端のアミド化
が一般に起こりにくいが、カイコなどの幼虫を用いて発
現させた場合には、虫体内にアミド化酵素など関連する
酵素類があるため、アミド化されたものが得られる。

【００３６】さらにカイコ虫体を利用した場合は、バキ
ュロウイルスとその宿主の培養細胞を利用した発現系よ
り著しく有利である。例えば、ヤガ科昆虫Ｔｎ−５細胞
培養細胞を利用した発現系（Cerutti M. et al., Bioch
emical biophysical research communications., Vol.1
81, No.1, 443-448.1991）に比べても約２０倍という高
濃度のＩＦＮ含有原料が得られる。

【００３７】

【実施例】次に実施例を挙げ、本発明をさらに詳しく説
明するが、本発明はこれら実施例等に何ら制約されるも
のではない。

【００３８】なお、得られたＩＦＮ−τの活性は、ウシ
腎由来細胞（ＭＤＢＫ細胞）と、シンドビスウイルス
（Ｓｉｎｄｂｉｓ ｖｉｒｕｓ）を用い、一般に知られ
ている抗ウイルス活性の測定法［日本化学会編 新生化
学実験講座、第１２巻、３７２−３７８（１９８９）東
京化学同人］に従って測定した。

【００３９】すなわち、まず最初に継代中のＭＤＢＫ細
胞を１.５×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍｌになるようにＭＥ
Ｍ（Ｅａｇｌｅ必須培地）＋５％ＦＢＳ（牛胎児血清）
培地で調整し、この細胞浮遊液を各ウェル１００μｌづ
つ９６穴プレートに分注する。３７℃で２４時間、５％
炭酸ガスインキュベータで培養した後、各ウエルに２倍
段階希釈した被検ウシ由来ＩＦＮ−τ（以下「ＢｏＩＦ
Ｎ−τ」という）と標準ＢｏＩＦＮ−γ（比活性５.１
×１０^６Ｕｎｉｔｓ／ｍｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ；ＣＨＩＢ
Ａ-ＧＥＩＧＹ社製）を５０μｌづつ添加する。

【００４０】次いで、３７℃で６〜２４時間、５％炭酸
ガスインキュベータで培養した後、培地を捨て、ＭＥＭ
培地で約１×１０^５ｐｆｕ／ｍｌに調整したシンドビス
ウイルス液を添加して更に５％炭酸ガスインキュベータ
中、３７℃で培養を続ける。５〜６日後、細胞変性効果
（ＣＰＥ）が観測されたところで培地を捨て、紫外線照
射してウイルスの不活化を行った後、ホルマリンにて細
胞の固定化を行う。

【００４１】最後に、ナフトールブルーブラック等にて
生細胞の染色を行い、ＯＤ_６５５値等の測定によりＩＣ
_５０等を求める。被検ＩＦＮのＩＣ_５０等を標準ＩＦＮ
の測定値等と比較し、その活性値を求めることにより、
被検液のＩＦＮ濃度を測定することができる。

【００４２】実 施 例 １ ＢｏＩＦＮ−τ遺伝子組換えバキュロウイルスの調製
（１）： （１）ＢｏＩＦＮ−τ ｃＤＮＡのクローニング； まず、フィコール法により、ヨーネ菌実験感染牛の末梢
血単球を分離した。次いで、ＩＦＮ−τのｍＲＮＡ転写
を促進するため、ヨーネ菌またはその分泌抗原であるヨ
ーニンＰＰＤで４時間刺激した後、塩酸グアニジン法に
よりＲＮＡを抽出した。

【００４３】後記の２種類のプライマーを用いたＲＴ−
ＰＣＲ法［Ｔａｋａｒａ ＬＡ ＰＣＲ ｋｉｔ（タカ
ラ社製）を使用］で分泌シグナルコード領域を含む６０
０ｂｐのＢｏＩＦＮ−τ ｃＤＮＡを増幅した。得られ
たＢｏＩＦＮ−τ ｃＤＮＡの塩基配列を決定し、既に
報告されているＢｏＩＦＮ−τ ｃＤＮＡの塩基配列
（データベース名：ジーンバンク、アクセッション番
号：ＡＦ２３８６１２、配列番号９）と比較することに
より、同一のｃＤＮＡであることを確認した。 ５’ａｃｃｃａｇａｃｃｃｃａｔｃｔｃａｇｃｃａｇ
３’ ５’ｇｔｇａｇｔｇｔａｃｇａａｇｇｔｇａｔｇ ３’

【００４４】得られたＢｏＩＦＮ−τ ｃＤＮＡを、Ｔ
４ＤＮＡ リガーゼ［ＤＮＡ ｌｉｇａｔｉｏｎ ｋｉｔ
Ｖｅｒ.２（タカラ社製）使用］を用い、クローニング
ベクター ｐＣＲＩＩ（インビトロゲン社製）のクロー
ニング部位に連結した。更にこれをコンピテントセルＪ
Ｍ１０９［ＣＯＭＰＥＴＥＮＴ ｈｉｇｈ（タカラ社
製）］へ形質転換し、常法に従ってクローニングした。

【００４５】（２）ＢｏＩＦＮ−τ組換えＢｍバキュロ
ウイルス（ＢｏＩＦＮ−τ・ＢｍＮＰＶ）の作製； ＢｏＩＦＮ−τ ｃＤＮＡがクローニングされたプラス
ミド（ｐＣＲ／ＢｏＩＦＮ−τ）を鋳型にし、下記の２
種類のプライマーを利用して、ＰＣＲ法によりＢｏＩＦ
Ｎ−τ ｃＤＮＡの増幅とともにｃＤＮＡの５’末端に
制限酵素ＢａｍＨＩを、３’末端に制限酵素ＥｃｏＲＩ
の認識配列を導入した。ＰＣＲ法には、ＥＸ Ｔａｑポ
リメラーゼ（タカラ社製）を使用した。 ５’ａｃａｇｇａｔｃｃｃｃａｔｇｇｃｃｔｔｃｇｔ
３’ ５’ｇｃｇａａｔｔｃｔｔａｇｔｃａｇｃｇａｇａｇ
３’

【００４６】得られたＢｏＩＦＮ−τ ｃＤＮＡ／Ｂａ
ｍＨＩ−ＥｃｏＲＩを制限酵素ＢａｍＨＩおよびＥｃｏ
ＲＩで処理した後、カイコ（Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ）
バキュロウイルス（ＢｍＮＰＶ；カイコ核多角体病ウイ
ルス）用のトランスファーベクターｐＢＭ０５０（Maed
a, S. "In Insect Cell Biochemistry", P.1-31）のマ
ルチクローニングサイトの制限酵素切断部位ＢｇＩＩＩ
およびＥｃｏＲＩに、Ｔ４ＤＮＡ リガーゼ［ＤＮＡ ｌ
ｉｇａｔｉｏｎ ｋｉｔ Ｖｅｒ.２（タカラ社製）を使
用］を用いて連結した。

【００４７】このベクターでコンピテントセルＪＭ１０
９（ＣＯＭＰＥＴＥＮＴ ｈｉｇｈ：タカラ社製）を形
質転換し、常法によりクローニングしてＢｏＩＦＮ−τ
遺伝子組換えトランスファープラスミドｐＢＭ０５０／
ＢｏＩＦＮ−τを得た。

【００４８】最後にトランスファープラスミドｐＢＭ０
５０／ＢｏＩＦＮ−τとバキュロウイルスＢｍＮＰＶＣ
Ｐｄ株（システィンプロテアーゼ欠損株）ＤＮＡをカイ
コＢｍＮ細胞に同時に導入することによって相同組換え
を行い、ＢｏＩＦＮ−τ遺伝子組換えバキュロウイルス
（ＣＰｄ／ＢｏＩＦＮ−τ・ＢｍＮＰＶ）を得た。

【００４９】実 施 例 ２ ＢｏＩＦＮ−τ遺伝子組換えバキュロウイルスの調製
（２）： （１）ＢｏＩＦＮ−τ ｃＤＮＡのクローニング； プライマリーのウシ胎盤トロホブラストから抽出したｍ
ＲＮＡを用いて、ＲＴ−ＰＣＲ法によってＢｏＩＦＮ−
τのｃＤＮＡをクローニングした。

【００５０】ＩＦＮ−τ遺伝子の塩基配列はＩＦＮ−α
の塩基配列と非常にホモロジーが高いため、Ｆｌｉｎｔ
ら( J. Reprod. Fert. Suppl. 43(1991), 13-25 )、お
よびＲｏｂｅｒｔｓら( J. Reprod. Fert. Suppl. 43(1
991), 3-12 )によって報告されているＢｏＩＦＮ−τの
塩基配列、およびＢｏＩＦＮ−αの塩基配列を比較し、
翻訳領域の外側で、ＩＦＮ−τの遺伝子は増幅するが、
ＩＦＮ−αは増幅しない後記の２種類のプライマーを設
計した。 ５’ｃｔｇａａｇｇｔｔｃａｃｃｃａｇａｃｃｃｃａ
３’ ５’ｇａａａｔｇａａｃａｃａｇｇｔｇａｇｔｇｔａｃ
ｃ ３’

【００５１】前記の２種類のプライマーを用いたＲＴ−
ＰＣＲ法で増幅してきたフラグメントをｐＣＲＩＩベク
ター（インビトロゲン社製）に組み込んだ。翻訳領域の
内にあり、ＩＦＮ−τの遺伝子は増幅するがＩＦＮ−α
は増幅しないプライマーを設計してＰＣＲを行い、クロ
ーンを選択した。得られたクローンの塩基配列を決定
し、既に報告されているＢｏＩＦＮ−τ ｃＤＮＡの塩
基配列（データベース名：ジーンバンク、アクセッショ
ン番号：ＡＦ２３８６１２、配列番号９）と比較するこ
とにより、同一のｃＤＮＡであることを確認した。

【００５２】得られたＢｏＩＦＮ−τ ｃＤＮＡを、Ｔ
_４ＤＮＡ リガーゼ［ＤＮＡ ｌｉｇａｔｉｏｎ ｋｉｔ
Ｖｅｒ.２（タカラ社製）使用］を用い、クローニング
ベクター ｐＣＲＩＩ（インビトロゲン社製）のクロー
ニング部位に連結した。更にこれをコンピテントセルＪ
Ｍ１０９［ＣＯＭＰＥＴＥＮＴ ｈｉｇｈ（タカラ社
製）］へ形質転換し、常法に従ってクローニングした。

【００５３】（２）ＢｏＩＦＮ−τ組換えＢｍバキュロ
ウイルス（ＢｏＩＦＮ−τ・ＢｍＮＰＶ）の作製； ＢｏＩＦＮ−τ ｃＤＮＡがクローニングされたプラス
ミド（ｐＣＲ／ＢｏＩＦＮ−τ）を鋳型にし、下記の２
種類のプライマーを利用して、ＰＣＲ法によりＢｏＩＦ
Ｎ−τ ｃＤＮＡの増幅とともにｃＤＮＡの５’末端に
制限酵素ＢａｍＨＩを、３’末端に制限酵素ＥｃｏＲＩ
の認識配列を導入した。ＰＣＲ法には、ＥＸ Ｔａｑポ
リメラーゼ（タカラ社製）を使用した。 ５’ａｃａｇｇａｔｃｃｃｃａｔｇｇｃｃｔｔｃｇｔ
３’ ５’ｇｃｇａａｔｔｃｔｔａｇｔｃａｇｃｇａｇａｇ
３’

【００５４】得られたＢｏＩＦＮ−τ ｃＤＮＡ／Ｂａ
ｍＨＩ−ＥｃｏＲＩを制限酵素ＢａｍＨＩおよびＥｃｏ
ＲＩで処理した後、カイコ（Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ）
バキュロウイルス（ＢｍＮＰＶ；カイコ核多角体病ウイ
ルス）用のトランスファーベクターｐＢＭ０５０（Maed
a, S. "In Insect Cell Biochemistry", P.1-31）のマ
ルチクローニングサイトの制限酵素切断部位ＢｇＩＩＩ
およびＥｃｏＲＩに、Ｔ_４ＤＮＡ リガーゼ［ＤＮＡ ｌ
ｉｇａｔｉｏｎ ｋｉｔ Ｖｅｒ.２（タカラ社製）を使
用］を用いて連結した。

【００５５】このベクターでコンピテントセルＪＭ１０
９（ＣＯＭＰＥＴＥＮＴ ｈｉｇｈ：タカラ社製）を形
質転換し、常法によりクローニングしてＢｏＩＦＮ−τ
遺伝子組換えトランスファープラスミドｐＢＭ０５０／
ＢｏＩＦＮ−τを得た。

【００５６】最後にトランスファープラスミドｐＢＭ０
５０／ＢｏＩＦＮ−τとバキュロウイルスＢｍＮＰＶＣ
Ｐｄ株（システィンプロテアーゼ欠損株）ＤＮＡをカイ
コＢｍＮ細胞に同時に導入することによって相同組換え
を行い、ＢｏＩＦＮ−τ遺伝子組換えバキュロウイルス
（ＣＰｄ／ＢｏＩＦＮ−τ・ＢｍＮＰＶ）を得た。

【００５７】実 施 例 ３ ＢｍＮＰＶとカイコ虫体を用いた発現系より得られたＢ
ｏＩＦＮ−τ（ＢｍＢｏＩＦＮ−τ）の精製（１）： （１）カイコ体液の取得； カイコを宿主とし、組換え体ウイルスであるＢｏＩＦＮ
−τ・ＢｍＮＰＶを用い、下記方法でＢｏＩＦＮ−τを
発現させた。すなわち、５齢１日のカイコに実施例２で
得られたＢｏＩＦＮ−τ・ＢｍＮＰＶを接種し、人工飼
料を用いて飼育した。 カイコ体液は、感染後４日目
に、病虫の足をシリンジで刺して回収した。回収した体
液に、最終濃度５ｍＭとなる量のジチオスレイトール
（ＤＴＴ）を添加し、−８０℃で保存した。この体液
（粗ＢｏＩＦＮ−τ体液）の抗ウイルス活性は、１.２
６×１０⁸ Ｕｎｉｔｓ／ｍｌで、比活性は３.８９×１
０^６ Ｕｎｉｔｓ／ｍｇであった。

【００５８】（２）カイコ体液より得られたＢｏＩＦＮ
−τの精製； カイコ３０頭分の粗ＢｏＩＦＮ−τ体液約２３ｍｌを、
５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８.０）にて１０倍に
希釈した。この希釈液２３０ｍｌを３５％硫酸アンモニ
ウム液条件で塩析し、１２０００ｒｐｍにて１５分間遠
心分離した。得られた上清を７０％硫酸アンモニウム液
条件で再度塩析し、１２０００ｒｐｍにて１５分間遠心
分離して沈殿を得た。得られた沈殿を５０ｍＭトリス塩
酸緩衝液（ｐＨ８.０）２３０ｍｌに溶解し、粗ＢｏＩ
ＦＮ−τ液とした。この希釈液２３０ｍｌをシリカゲル
カラム（ゲル：カセイゲル３００−７５；東京化成工業
社製）にアプライした。このカラムを５０ｍＭ トリス
塩酸緩衝液（ｐＨ８.０）にて洗浄した後、３０％エチ
レングリコールを含む５０ｍＭ トリス塩酸緩衝液（ｐ
Ｈ８.０）にて溶出して一次精製液２００ｍｌを得た。

【００５９】次いでこの溶出液を、陰イオン交換カラム
［ＱセファロースＦＦ（ファルマシア社製）］にアプラ
イした。５０ｍＭのＮａＣｌを含む５０ｍＭトリス塩酸
緩衝液（ｐＨ８.０）で洗浄後、３００ｍＭのＮａＣｌ
を含む５０ｍＭトリス塩酸緩衝液で溶出させて二次精製
液を得た。

【００６０】この溶出液を銅イオンを結合させた金属キ
レートカラム［キレーティング・セファロースＦＦ（Ｃ
ｈｅｌａｔｉｎｇ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ；ファルマ
シア社製］にアプライした。次いで、このカラムを５０
０ｍＭＮａＣｌを含む５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５.
０）で洗浄後、５００ｍＭＮａＣｌを含む５０ｍＭ酢酸
緩衝液（ｐＨ４.０）で溶出し、精製ＢｏＩＦＮ−τ溶
液５０ｍｌを得た。得られた精製ＢｏＩＦＮ−τ溶液の
抗ウイルス活性は、３.１２×１０^７Ｕｎｉｔｓ／ｍｌ
で、比活性は１.３２×１０^９Ｕｎｉｔｓ／ｍｇであっ
た。この結果を表１に示す。

【００６１】

【表１】

【００６２】また、粗ＢｏＩＦＮ−τ体液のＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥでのＣＢＢ（クマシーブリリアントブルー）染色
像は多数の濃厚な染色バンドが広域分子量に認められた
が、精製ＢｏＩＦＮ−τは分子量（約２０ｋＤａ）相当
領域に１本のバンドが認められ、それは抗ＢｏＩＦＮ−
τ抗体を用いたウエスタンブロッティングの染色反応に
より、ＢｏＩＦＮ−τであることが確認された（図
１）。

【００６３】更に、得られた精製ＢｏＩＦＮ−τのＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥでのＣＢＢ染色結果（レーン１１）を画像
解析ソフトのＮＩＨイメージで解析したところ、図２に
示すように純度は９０.２３％であった。

【００６４】以上の結果から、本精製法によりカイコ体
液中の夾雑物が効率よく除去され、高純度、高活性のＢ
ｏＩＦＮ−τが製造できることが明らかとなった。

【００６５】実 施 例 ４ ＢｍＮＰＶとカイコ虫体を用いた発現系より得られたＢ
ｏＩＦＮ−τ（ＢｍＢｏＩＦＮ−τ）の精製（２）： （１）カイコ体液の取得； カイコを宿主とし、組換え体ウイルスであるＢｏＩＦＮ
−τ・ＢｍＮＰＶを用い、下記方法でＢｏＩＦＮ−τを
発現させた。すなわち、５齢１日のカイコに実施例２で
得られたＢｏＩＦＮ−τ・ＢｍＮＰＶを接種し、人工飼
料を用いて飼育した。 カイコ体液は、感染後４日目
に、病虫の足をシリンジで刺して回収した。回収した体
液に、最終濃度５ｍＭとなる量のジチオスレイトール
（ＤＴＴ）を添加し、−８０℃で保存した。この体液
（粗ＢｏＩＦＮ−τ体液）の抗ウイルス活性は、１.０
６×１０⁸ Ｕｎｉｔｓ／ｍｌで、比活性は３.０６×１
０^６Ｕｎｉｔｓ／ｍｇあった。

【００６６】カイコ２０頭分の粗ＢｏＩＦＮ−τ体液約
１５ｍｌを、５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８.０）
にて１０倍に希釈した。この希釈液１５０ｍｌに濃塩酸
（和光純薬社製）を、液のｐＨが２.０付近になるまで
添加した。その状態で３０分〜１時間程度撹拌（４℃以
下）した後、５規定の水酸化ナトリウムを用いｐＨを
８.０付近まで上昇させた。この溶液を１２０００ｒｐ
ｍ、３０分間遠心分離して上清を得た。

【００６７】（２）カイコ体液より得られたＢｏＩＦＮ
−τの精製； 上記（１）で得た上清１５０ｍｌを、陰イオン交換カラ
ム［ＱセファロースＦＦ（ファルマシア社製）］にアプ
ライした。５０ｍＭのＮａＣｌを含む５０ｍＭトリス塩
酸緩衝液（ｐＨ８.０）で洗浄後、３００ｍＭのＮａＣ
ｌを含む５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（５０ｍｌ）で溶出
させて一次精製液を得た。

【００６８】この溶出液を銅イオンを結合させた金属キ
レートカラム［キレーティング・セファロースＦＦ（Ｃ
ｈｅｌａｔｉｎｇ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ；ファルマ
シア社製）］にアプライした。次いで、このカラムを５
００ｍＭＮａＣｌを含む５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５.
０）で洗浄後、５００ｍＭＮａＣｌを含む５０ｍＭ酢酸
緩衝液（ｐＨ４.０）で溶出し、精製ＢｏＩＦＮ−τ溶
液４５ｍｌを得た。得られた精製ＢｏＩＦＮ−τ溶液
は、１.３７×１０^７Ｕｎｉｔｓ／ｍｌの抗ウイルス活
性で、比活性は６.０１×１０^８Ｕｎｉｔｓ／ｍｇであ
った。この結果を表２に示す。

【００６９】

【表２】

【００７０】粗ＢｏＩＦＮ−τ体液のＳＤＳ−ＰＡＧＥ
でのＣＢＢ染色像は多数の濃厚な染色バンドが広域分子
量に認められたが、精製ＢｏＩＦＮ−τは分子量（約２
０ｋＤａ）相当領域に１本のバンドが認められ、それは
抗ＢｏＩＦＮ−τ抗体を用いたウエスタンブロッティン
グの染色反応により、ＢｏＩＦＮ−τであることが確認
された。

【００７１】以上の結果から、本精製法によりカイコ体
液中の夾雑物が効率よく除去され、高純度、高活性のＢ
ｏＩＦＮ−τが製造できることが明らかとなった。

【００７２】

【発明の効果】本発明方法によれば、組換えバキュロウ
イルスにより産生される哺乳動物由来ＩＦＮを効率的か
つ経済的に精製し、精製哺乳動物由来精製ＩＦＮを得る
ことができる。

【００７３】従って本発明方法は、ヒトの他、ウシ、ウ
マ、ネコ、イヌ等のＩＦＮを医薬品として開発するため
に極めて有利なものである。

【００７４】

【配列表】 <110> Director of National Institute of Animal Health Daiichi Pharmaceutical Co., Ltd. KATAKURA INDUSTRIES CO., LTD. <120> A process for preparing purified interferon <130> 0010129 <140> <141> <150> JP P2000-93383 <151> 2000-03-30 <160> 10 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Oligonucleotide to act as a primer for PCR <400> 1 acccagaccc catctcagcc ag 22 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Oligonucleotide to act as a primer for PCR <400> 2 gtgagtgtac gaaggtgatg 20 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Oligonucleotide to act as a primer for PCR <400> 3 acaggatccc catggccttc gt 22 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Oligonucleotide to act as a primer for PCR <400> 4 gcgaattctt agtcagcgag ag 22 <210> 5 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Oligonucleotide to act as a primer for PCR <400> 5 ctgaaggttc acccagaccc ca 22 <210> 6 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Oligonucleotide to act as a primer for PCR <400> 6 gaaatgaaca caggtgagtg tacc 24 <210> 7 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Oligonucleotide to act as a primer for PCR <400> 7 acaggatccc catggccttc gt 22 <210> 8 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Oligonucleotide to act as a primer for PCR <400> 8 gcgaattctt agtcagcgag ag 22 <210> 9 <211> 585 <212> DNA <213> Bos taurus Interferon-tau <220> <221> CDS <222> (1)..(585) <300> <308> genbank AF238612 <400> 9 atg gcc ttc gtg ctc tct cta ctg atg gcc ctg gtg ctg gtc agc tac 48 Met Ala Phe Val Leu Ser Leu Leu Met Ala Leu Val Leu Val Ser Tyr 1 5 10 15 ggc ccg gga cga tct ctg ggt tgt tac ctg tct gag gac cac atg cta 96 Gly Pro Gly Arg Ser Leu Gly Cys Tyr Leu Ser Glu Asp His Met Leu 20 25 30 ggt gcc agg gag aac ctc agg ctc ctg gcc cga atg aac aga ctc tct 144 Gly Ala Arg Glu Asn Leu Arg Leu Leu Ala Arg Met Asn Arg Leu Ser 35 40 45 cct cat ccc tgt ctg cag gac aga aaa gac ttt ggt ctt cct cag gag 192 Pro His Pro Cys Leu Gln Asp Arg Lys Asp Phe Gly Leu Pro Gln Glu 50 55 60 atg gtg gag ggc aac cag ctc cag aag gat cag gct atc tct gtg ctc 240 Met Val Glu Gly Asn Gln Leu Gln Lys Asp Gln Ala Ile Ser Val Leu 65 70 75 80 cat gag atg ctc cag cag tgc ttc aac ctc ttc tac aca gag cac tcg 288 His Glu Met Leu Gln Gln Cys Phe Asn Leu Phe Tyr Thr Glu His Ser 85 90 95 tct gct gcc tgg aac acc acc ctc ctg gag cag ctc tgc act ggg ctc 336 Ser Ala Ala Trp Asn Thr Thr Leu Leu Glu Gln Leu Cys Thr Gly Leu 100 105 110 caa cag cag ctg gag gac ctg gac gcc tgc ctg ggc cca gtg atg gga 384 Gln Gln Gln Leu Glu Asp Leu Asp Ala Cys Leu Gly Pro Val Met Gly 115 120 125 gag aaa gac tct gac atg gga agg atg ggc ccc att ctg act gtg aag 432 Glu Lys Asp Ser Asp Met Gly Arg Met Gly Pro Ile Leu Thr Val Lys 130 135 140 aag tac ttc cag ggc atc cat gtc tac ctg aaa gaa aaa gaa tac agt 480 Lys Tyr Phe Gln Gly Ile His Val Tyr Leu Lys Glu Lys Glu Tyr Ser 145 150 155 160 gac tgc gcc tgg gaa atc atc aga atg gag atg atg aga gcc ctc tct 528 Asp Cys Ala Trp Glu Ile Ile Arg Met Glu Met Met Arg Ala Leu Ser 165 170 175 tca tca acc acc ttg caa aaa agg tta aga aag atg ggt gga gat ctg 576 Ser Ser Thr Thr Leu Gln Lys Arg Leu Arg Lys Met Gly Gly Asp Leu 180 185 190 aac tca ctt 585 Asn Ser Leu 195 <210> 10 <211> 195 <212> PRT <213> Bos taurus Interferon-tau <400> 10 Met Ala Phe Val Leu Ser Leu Leu Met Ala Leu Val Leu Val Ser Tyr 1 5 10 15 Gly Pro Gly Arg Ser Leu Gly Cys Tyr Leu Ser Glu Asp His Met Leu 20 25 30 Gly Ala Arg Glu Asn Leu Arg Leu Leu Ala Arg Met Asn Arg Leu Ser 35 40 45 Pro His Pro Cys Leu Gln Asp Arg Lys Asp Phe Gly Leu Pro Gln Glu 50 55 60 Met Val Glu Gly Asn Gln Leu Gln Lys Asp Gln Ala Ile Ser Val Leu 65 70 75 80 His Glu Met Leu Gln Gln Cys Phe Asn Leu Phe Tyr Thr Glu His Ser 85 90 95 Ser Ala Ala Trp Asn Thr Thr Leu Leu Glu Gln Leu Cys Thr Gly Leu 100 105 110 Gln Gln Gln Leu Glu Asp Leu Asp Ala Cys Leu Gly Pro Val Met Gly 115 120 125 Glu Lys Asp Ser Asp Met Gly Arg Met Gly Pro Ile Leu Thr Val Lys 130 135 140 Lys Tyr Phe Gln Gly Ile His Val Tyr Leu Lys Glu Lys Glu Tyr Ser 145 150 155 160 Asp Cys Ala Trp Glu Ile Ile Arg Met Glu Met Met Arg Ala Leu Ser 165 170 175 Ser Ser Thr Thr Leu Gln Lys Arg Leu Arg Lys Met Gly Gly Asp Leu 180 185 190 Asn Ser Leu 195

【図面の簡単な説明】

【図１】 実施例３で得たＢｏＩＦＮ−τの精製前後の
ＳＤＳ−ＰＡＧＥのＣＢＢ染色の結果（図中、Ａ）およ
び抗ＢｏＩＦＮ−τ抗体を用いたウエスタンブロッティ
ングの染色反応の結果（図中、Ｂ）を示す写真。図中、
各レーンは次のものを示す。 １ マーカー ２ カイコ体液（粗ＢｏＩＦＮ−τ体液） ３ カイコ体液の１０倍希釈液 ４ 塩析後の液（シリカゲルカラム原料液） ５ シリカゲルカラム通過画分 ６ シリカゲルカラム溶出画分 ７ 陰イオン交換カラム通過画分 ８ 陰イオン交換カラム溶出画分 ９ キレートカラム通過画分 １０ キレートカラム洗浄画分 １１ キレートカラム溶出画分 １２ キレートカラム溶出処理後のイミダゾールを含む
緩衝液による洗浄画分

【図２】 実施例３で得た精製ＢｏＩＦＮ−τのＳＤＳ
−ＰＡＧＥ／ＣＢＢ染色を画像解析ソフトのＮＩＨイメ
ージで解析した結果を示す図面。 以 上

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ０７Ｋ 1/22 Ｃ０７Ｋ 14/555 14/555 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｆ Ｃ１２Ｎ 15/02 ＺＮＡ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｆ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） //(Ｃ１２Ｐ 21/02 Ａ６１Ｋ 37/66 Ｄ Ｃ１２Ｒ 1:91） Ａ Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＤ (72)発明者 横溝 祐一 茨城県つくば市並木４−919−103 (72)発明者 森 康行 茨城県つくば市吾妻２−809−101 (72)発明者 犬丸 茂樹 茨城県つくば市並木４−10−908−201 (72)発明者 内山 明彦 東京都江戸川区北葛西１−16−13 第一製 薬株式会社東京研究開発センター内

Claims (11)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 インターフェロン蛋白質をコードする遺
   伝子を組み込んだ組換えバキュロウイルスをその宿主に
   感染させることにより生産したインターフェロン含有原
   料を、シリカゲルカラムクロマトグラフィー、陰イオン
   交換カラムクロマトグラフィーおよび金属キレートカラ
   ムクロマトグラフィーを含む処理に付すことを特徴とす
   る精製インターフェロンの製造方法。
2. 【請求項２】 インターフェロン蛋白質をコードする遺
   伝子を組み込んだ組換えバキュロウイルスをその宿主に
   感染させることにより生産したインターフェロン含有原
   料を、酸性化処理した後、陰イオン交換カラムクロマト
   グラフィーおよび金属キレートカラムクロマトグラフィ
   ーを含む処理に付すことを特徴とする精製インターフェ
   ロンの製造方法。
3. 【請求項３】 インターフェロン含有原料が、組換えバ
   キュロウイルスの感染した宿主昆虫虫体から得られた昆
   虫体液又は当該昆虫磨砕液である請求項１または２に記
   載の製造方法。
4. 【請求項４】 インターフェロン含有原料が、哺乳動物
   由来のヒトインターフェロン、ウシインターフェロン、
   ウマインターフェロン、ネコインターフェロンまたはイ
   ヌインターフェロンの各々の含有原料である請求項１乃
   至３のいずれか１項に記載の製造方法。
5. 【請求項５】 インターフェロン含有原料が、インター
   フェロン−τ含有原料である請求項１乃至４のいずれか
   １項に記載の製造方法。
6. 【請求項６】 金属キレートカラムクロマトグラフィー
   が、銅イオンを結合させた金属キレートカラムを用いる
   ものである請求項１乃至５のいずれか１項に記載の製造
   方法。
7. 【請求項７】 組換えバキュロウイルスが、組換えカイ
   コ核多角体病ウイルス（Bombyx mori Nuclear Polyhedr
   osis Virus）または組換えオートグラファ・カリフォル
   ニカ核多角体病ウイルス（Autografa californica Nucl
   ear Polyhedrosis Virus）である請求項１乃至６のいず
   れか１項に記載の製造方法。
8. 【請求項８】 組換えバキュロウイルスの宿主が、昆虫
   の虫体である請求項１乃至７のいずれか１項に記載の製
   造方法。
9. 【請求項９】 組換えバキュロウイルスの宿主が、当該
   ウイルスの宿主昆虫の培養細胞である請求項１乃至７の
   いずれか１項に記載の製造方法。
10. 【請求項１０】 哺乳動物由来インターフェロンτ蛋白
    質をコードする遺伝子を組み込んだ組換えバキュウロウ
    イルスをその宿主に感染させることにより生産した哺乳
    動物由来インターフェロンτ含有原料を、次の何れかの
    処理を含む処理工程に付されたことを特徴とする哺乳動
    物由来精製インターフェロンτ。 （１）シリカゲルカラムクロマトグラフィー、陰イオン
    交換カラムクロマトグラフィーおよび金属キレートカラ
    ムクロマトグラフィーを含む処理。 （２）酸性化処理した後、陰イオン交換カラムクロマト
    グラフィーおよび金属キレートカラムクロマトグラフィ
    ーを含む処理。
11. 【請求項１１】 哺乳動物由来インターフェロンτが、
    ウシインターフェロンτである請求項１０記載の哺乳動
    物由来精製インターフェロンτ。