WO2007080942A1 - インターフェロンαを含む口腔組成物 - Google Patents

Abstract

　インターフェロンα(IFNα)を有効成分とする、歯周病の予防および／または治療のための口腔組成物が提供された。本発明の組成物を口腔に投与することにより、歯周病の原因微生物の数を抑制することができる。本発明におけるIFNαは、微量の投与によって十分な効果を得ることができる。またエサに配合することによって、本発明の組成物をイヌなどの動物に対しても容易に投与することができる。

Description

明 細 書

インターフェロン OLを含む口腔組成物

技術分野

[0001] 本発明は、インターフェロンひを含む、歯周病の予防および治療の、いずれか、ま たは両方のための方法、並びに,袓成物に関する。

背景技術

[0002] 高齢化の進行にともない、 口腔衛生の重要性が高まっている。たとえば、う蝕（虫歯 )や歯周病の予防や治療は、 口腔衛生における重要な課題である。高齢化は、ヒトの みならずィヌゃネコなどのペット動物においても同様の課題を生んでいる。すなわち ペット動物においても、歯周病の予防あるいは治療技術の実現は重要な課題となつ ている。一般に、歯のブラッシングによって清潔を保つことは、歯周病やう蝕を予防す るための大切な生活習慣と位置づけられている。し力し動物の歯のブラッシングは、 必ずしも容易でない。したがって、動物の歯周病の予防あるいは治療技術は、ヒト以 上に重要な課題であると言うこともできる。

[0003] 歯肉炎と歯周炎は代表的な口腔疾患であり、総称して歯周病と呼ばれている。歯 肉炎は、歯の表面や歯周組織に蓄積したプラーク（歯垢）中の細菌によって引き起こ される疾患である。歯肉に腫れや出血が見られ、歯槽骨の吸収は伴わない。多くの 歯肉炎は、治療可能な疾患である。

一方、歯周炎においては、炎症は歯根膜や歯槽骨まで及ぶ。歯周炎は、歯周組織 (歯根膜や歯槽骨）が破壊される病変である。現在のところ、破壊された歯周組織を 治療によって回復させることは難しい。最終的には歯が脱落してしまう重度の炎症性 疾患が、歯周炎である。歯周炎を起こすとその程度により口臭がひどくなり、出血が 見られたり、歯を触られることを嫌がるようになる。著しい歯周疾患の場合は、 口腔内 の病原性細菌が血流によって体内を循環し、心臓や腎臓などに影響が見られること もある。歯周病の原因には複数の因子が指摘されている。し力しプラーク中の病原菌 による感染症という点では、ヒトと動物の歯周病は共通の疾患である。

[0004] 最も一般的な歯周病の原因細菌は、黒色集落形成性グラム陰性嫌気性の細菌で ある。一群の細菌は、かっては Bacteroides菌属に分類されていたが、現在では Poro hyromonas菌属と Prevotella菌属に分類されている。歯周病の原因となる細菌は、多 少の菌種の違いはあるものの、いずれもヒト、ィヌ、ネコ、ヒッジ、ラットなどに歯周疾患 の原因となる。ィヌゃネコでは歯垢中の細菌叢で Porohyromonas菌属の割合が 80^Q/o に及ぶこともある。分離される菌種としては、 P. gingivalisの頻度が最も高い。その他 ^P. endodontalis, P. circum entaria, P. canoris, P. salivosa どもしばしは分離 れ る。今後はさらに新菌種が加わると予測される。

[0005] 一般家庭で飼育される犬の約 8割が歯周病を有すると言われている。歯周病を放 置すると、歯の痛みや抜歯によって、ペットの生活の質 (quality of life;QOL)は著しく 低下してしまう。ここ数年、 口腔衛生を改善するための成分を含むチュー（ペット用の ガム）、トリーツ（おやつ）、ペットフードなどが相次いで商品化されている。飼い主の ペットの歯周病に対する関心が高まってきていることが伺える。

このような飼い主の意識を反映して、歯周病の予防を意図した商品が実際に販売さ れている。たとえば食物繊維を配合したペットフードは、咀嚼による物理的な除去作 用を利用して歯垢や歯石の付着を抑制し、歯周病の予防効果があるとされている。「 ヒルズの特別療法食 t/d」（商品名）は、食物繊維を配合したペットフードである。また プラークコントロールを目的とした酵素配合の犬用ハミガキ等も開発されている。さら にはバイオファーメンテイクス、ビタミン C、力キエキス、キシリトーノレ、サンフエノン、力 テキン等の有効成分による相乗効果により総合的な口腔内ケアを目的としたサブリメ ント（商品名「キシリトール C」）、あるいはペット用飲料水も存在する。

[0006] 現在、獣医診療現場においては、歯周病に対して次のような治療が行われている。

1)主病因であるプラークの除去

2)スケーリング (歯石の除去）

3)抜歯など

つまり、歯周病の治療後のケア、あるいは発症予防法としては、歯石の付着防止と プラークコントロールが重要である。そのために、物理的な歯石除去作用を有する特 定のドライタイプペットフードの処方は、現在のところ、有効な対策の一つである。また 、ペット用の歯磨き粉を利用したブラッシングにも治療や予防効果が期待できる。 特許文献 1：特開 2002-34590

特許文献 2：特開 2002-34577

特許文献 3：特開 2001-342199

特許文献 4 :特開平 11-239498

特許文献 5：特開 2005-89301

非特許文献 1 : Cummins, M.J., Arthritis Rheum., 2003; 49(4): p585_593

非特許文献 2 : Shiozawa, S. , J Interferon Cytokine Res. , 1998; 18(4): p255-262 非特許文献 3 : Ship, J.A., J Interferon Cytokine Res., 1999; 19(8): p943- 951 非特許文献 4 : Gilger, B.C. , J Interferon Cytokine Res. , 1999; 19(8): p901_905 非特許文献 5 : Satoh, Υ·, J Interferon Cytokine Res., 1999; 19(8): p887- 894 非特許文献 6 : Palomba, M., Clin Ter., 2000; 151(1 Suppl 1): p59- 61

非特許文献 7 : Lecciones， J.A. , J Interferon Cytokine Res. , 1998; 18(9): p647- 652 非特許文献 8 : Lecce， J.G., Mol Biother. , 1990; 2(4): p211- 216

非特許文献 9 : Young, A.S. , Parasitology., 1990; 101(2): p201_209

非特許文献 10 : Tompkins, W. A., J Interferon Cytokine Res., 1999; 19: p817- 828 非特許文献 l l : Ohtsuka， Η·， J Vet. Med. ScL, 2006; 68(10): pl063- 1067 発明の開示

発明が解決しょうとする課題

[0007] 歯垢や歯石が、歯周病の原因であることは事実である。したがってそれを除去する ことは、歯周病の治療や予防における重要な課題である。歯垢や歯石の除去には、 歯周病の予防効果は期待できる。しかし、歯周病の治療効果については、不十分な 点もある。たとえば、既に進行している炎症に対する歯垢の除去の治療効果は間接 的である。したがって、より効果的な歯周病の治療方法が実現できれば有用である。

[0008] また、歯垢を除去しても、口腔内の歯周病の病原菌を除去できるわけではなレ、。つ まり、歯垢や歯石の除去によって、病原菌の"巣" (nest)は取り除かれる。確かに歯垢 や歯石は歯周病の大きな原因である。し力 病原菌は、 "巣"以外の口腔中にも存在 している。つまり歯垢を除去しても、病原菌そのものの抑制にはつながらなレ、。歯周 病の病原菌に直接作用する方法が提供されれば、より高度な予防効果を期待できる 更に、動物においては、個体によっては、歯垢や歯石の除去に有効なブラッシング が困難な場合もある。したがって、ブラッシングを伴わなくても歯周病の予防や治療を 実現することができれば有用である。本発明は、歯周病を予防および Zまたは治療 するための、新たな技術の提供を課題とする。

課題を解決するための手段

[0009] 本発明者らは、歯周病の治療あるいは予防に、インターフェロン（以下 IFNと省略す ることもある）が有効なのではなレ、かと考えた。 IFNは、抗ウィルス作用、細胞増殖抑 制作用、免疫応答調節作用など、多彩な生物活性を有するサイト力インである。臨床 的には、既に抗ウィルス剤として C型慢性肝炎の治療に応用されている。その他、抗 腫瘍剤として慢性骨髄性白血病ゃ腎細胞癌などの治療にも IFN-ひが使用されてき た。

[0010] これらの治療方法においては、 IFN aの高用量投与が標準的な投与方法である。

たとえば、ヒトにおいては、 6〜： 10MIU/日を最初の 2〜3週間毎日注射、その後週 3 回の注射を 22週間続ける誘導療法が採用されている。獣医領域でも注射型のインタ 一フエロン製剤が商品化されている。また、ネコインターフェロン _ω (オメガ）の注射用 製剤「インターキャット」（東レ製、商品名）は、猫力リシウィルス感染症の治療薬である 。更に、最近産業動物用の新薬として牛のロタウィルス感染症に対する経口投与型 のインターフェロン製剤「ビムロン/ BIMURON」（バイオベット社製、登録商標)も実用 化された（特開 2005-89301)。 「ピムロン/ BIMURON」は、天然型のヒト IFNひを配合し た粉末製剤である。飼料などに配合して、体重 lkgあたり 0. 5IU/日程度の微量投与 によって、牛のロタウィルス感染症に伴う下痢症状やウィルスの排泄に対する抑制効 果が確認されている。

[0011] し力しこれらの IFN a製剤の歯周病に対する効果は未知である。本発明者らは、特 に IFN aを口腔内に投与することによって、歯周病の予防、並びに治療しうることを明 らかにして本発明を完成した。すなわち、本発明は、以下の組成物並びに方法を提 供する。

〔1〕インターフェロン αを有効成分として含む、歯周病の予防および治療の、いずれ か、または両方のための口腔投与用の組成物。

〔2〕歯周病が哺乳動物の歯周病である〔1〕に記載の組成物。

〔3〕哺乳動物が、ィヌまたはネコである〔2〕に記載の組成物。

〔4〕哺乳動物がヒトである〔2〕に記載の組成物。

〔5〕 インターフェロンのと、咀嚼性の担体を含む〔1〕に記載の組成物。

〔6〕 咀嚼性の担体が食品である〔5〕に記載の組成物。

[7] 咀嚼錠またはチュ一/ fンガムである〔6〕に記載の,袓成物。

〔8〕インターフェロンひと、ペースト状の担体を含む〔1〕に記載の糸且成物。

〔9〕 体重 lkgあたり 0. 05〜2500LU/日のインターフェロン αが配合されている〔1〕 に記載の組成物。

〔10〕 体重 lkgあたり 0. 1〜： 1500LU/日のインターフェロン αが配合されている〔8〕 に記載の組成物。

〔11〕 インターフェロン αを口腔に投与する工程を含む、哺乳動物の歯周病の予防 および治療のいずれか、または両方のための方法。

〔12〕インターフェロンひと、咀嚼性の担体を含む組成物を口腔に投与する工程を含 む、〔11〕に記載の方法。

〔13〕インターフェロン αと、ペースト状の担体を含む組成物を口腔内組織に塗布す る工程を含む、 〔11〕に記載の方法。

〔14〕 哺乳動物が非ヒト哺乳動物である〔11〕に記載の方法。

[15] 哺乳動物が、ィヌまたはネコである〔14〕に記載の方法。

〔16〕 体重 lkgあたり 0. 05〜2500LU/日のインターフェロンひが投与される、〔11〕 に記載の方法。

[17] 体重 lkgあたり 0. ：!〜 1500LU/日のインターフェロンひが投与される、〔16〕に 記載の方法。

〔18〕 インターフェロンひと薬学的に許容される担体を含む、哺乳動物の歯周病の予 防および治療のいずれか、または両方のための、 口腔投与用医薬組成物。

〔19〕薬学的に許容される担体が、咀嚼性の担体である〔18〕に記載の医薬組成物 〔20〕薬学的に許容される担体が、ペースト状の担体である〔18〕に記載の医薬組成 物。

〔21〕 体重 lkgあたり 0. 05〜2500LU/日のインターフェロンひが配合されている〔1 8〕に記載の医薬組成物。

[22] 体重 lkgあたり 0. 1〜： 1500LU/日のインターフェロンひが配合されている〔21 〕に記載の医薬組成物。

〔23〕体重 lkgあたり 0. 05〜2500LU/日のインターフェロンひが配合されてレ、る食 品組成物。

〔24〕 体重 lkgあたり 0· 1〜： 1500LU/日のインターフェロン αが配合されている〔23 〕に記載の食品組成物。

〔25〕体重 lkgあたり 0. 05〜2500LU/日のインターフェロン αが配合されてレ、る飼 料組成物。

〔26〕 体重 lkgあたり 0· 1〜： 1500LU/日のインターフェロン αが配合されている〔25 〕に記載の飼料組成物。

発明の効果

[0012] 本発明による歯周病の予防あるいは治療のための口腔組成物を、 口腔内へ投与 することによって、歯周病を予防並びに治療することができる。具体的には、本発明 の口腔組成物の投与によって、歯周病の原因となっている微生物の顕著な抑制効果 が確認された。一般に歯周病の予防に有効とされている、歯垢や歯石の除去は、歯 周病の原因となる微生物の巣の除去を目的としている。つまり、予防あるいは治療の いずれにおいても、歯垢や歯石の除去の効果は間接的である。本発明では、歯周病 の原因となっている微生物の数を抑制することによって、歯周病の予防並びに治療 効果が達成される。したがって、本発明に基づく予防効果あるいは治療効果は、歯 周病の原因に直接作用していると言うことができる。

実際、本発明の歯周病の治療剤を投与された歯周病モデル動物における、歯周 病症状の改善が実施例でも確認された。この結果は、本発明によって、歯周病の積 極的な治療方法が実現したことを裏付けてレ、る。

[0013] 以上のように本発明の歯周病の予防あるいは治療のための方法は、ブラッシングと は異なり、歯周病の病原菌を抑制する。したがって、ブラッシングによる歯垢や歯石 の除去と、本発明に基づく予防あるいは治療方法を組み合わせることによって、歯周 病を、より確実に予防あるいは治療することができる。

[0014] また本発明による歯周病の予防あるいは治療のための組成物は、動物に対しても、 容易に投与することができる。たとえば、エサに混入された IFNひは、摂食行動を通じ て、容易に動物の口腔に投与することができる。歯や歯肉のブラッシングが、個体に よっては困難であるのに対して、本発明の組成物の投与はきわめて容易である。した がって、本発明は、動物の歯周病の予防や治療においても有用である。

[0015] 更に本発明の口腔組成物は、ごく低用量の IFN ctの配合によって、高度な歯周病 の予防'治療効果を実現することができる。 IFN aの使用量を少なくできるので、 IFN αの過剰な投与による副作用の危険を避けることができる。また、最終製品のコスト の大部分を占めると考えられる IFN αの使用量が少ないということは、安価な製品を 提供するために有利な特徴である。

[0016] 更に、たとえば抗生物質を投与することによって口腔中の病原菌の数を抑制するこ とは可能力もしれなレ、。しかし、歯周病は動物あるいはヒトが生存する限り、常に予防 が必要な疾患である。このような疾患の予防や治療を目的として、ヒト、あるいは産業 用の動物に対して、あるいはペット動物においても、抗生物質を恒常的に投与するこ とは現実的でない。抗生物質では、まず安全性の問題が懸念される。一方本発明に よれば、わずかな量の IFNひを口腔内に投与することによって予防並びに治療効果 を実現できる。微量の IFNひは、たとえば先に実用化されたゥシのロタウィルスの治療 剤においても安全性が認められた投与方法である。このように、安全性の面でも、本 発明の治療剤あるいは予防剤は、有利な特徴を備えている。

図面の簡単な説明

[0017] [図 1]実施例 1においてプラスミド pAcYMlに挿入した cDNA断片の塩基配列と、それ によってコードされるアミノ酸配列を示した図である。実線で囲んだ部分は CalFN α 4 のシグナルペプチド領域、二重下線は糖鎖付加部位、点線で囲んだ部分は CalFN a 4に付加したヒスチジンタグを示す。

[図 2]A ;精製した BacCaIFN a 4タンパク質を CBB染色およびウェスタンブロッテイング により検出した写真を示す。 B ;精製した BacCalFNひ 4タンパク質の抗ウィルス活性を CPE抑制法により評価した結果を示す図である。図中、縦軸は 570nmにおける吸光 度を、横軸は IFN aの抗ウィルス活性（LU/mL)を示す。

[図 3]投与試験（1 )における、ィヌの黒色集落形成細菌（BPB)数を示す図である。図 中、縦軸は唾液中の BPB数（X 10⁵/mL)を、横軸は本発明の治療剤または対照の投 与日数を示す。たとえば図中の IFN-2は IFNひ投与後 2日目の結果、 PREは 0日の結 果、そして Ma卜 8は対照（マルトース）投与後 8日目の結果を示す。各プロットは、 5匹 の被検ィヌの結果に対応してレ、る。

[図 4]投与試験（1 )における、ィヌの唾液中の潜血反応を示す図である。図中、縦軸 は潜血反応が検出されたィヌの割合を、横軸は IFN aの投与期間（2〜： 12日）を示す 。 Mai投与の結果は、 IFN a投与に先立ち、 Maiを投与したときに潜血反応が検出さ れたィヌの割合を示す。

発明を実施するための最良の形態

本発明は、 IFNひを有効成分として含む、歯周病の予防および治療の、いずれか、 または両方のための口腔投与用の組成物に関する。本発明の口腔組成物は、インタ ーフヱロンひと生物学的に許容される担体を配合することによって製造することがで きる。

インターフェロン (Interferon)は、ウィルス感染などにともなって動物の生体内で分泌 される分子量約 20kDaの蛋白質である。哺乳動物においては、 ひ、 /3、および γの 3 種類の IFNがある。このうちひと /3は構造上の類似性を有している。たとえばヒトゃマ ウスでは、 α— βの間で、塩基配列で 40%程度、アミノ酸配列で 35%程度の相同性 がある。これらの IFNは総称して I型 IFNと呼ばれる。 I型 IFNは、抗ウィルス作用の他に 、次のような作用を有することが明らかにされている。

細胞増殖抑制効果、

抗腫瘍作用、

マクロファージ等の免疫細胞の活性化作用、

免疫応答調節作用、

ヒトゃマウスなどの哺乳動物の IFN aには多型が見られる。たとえばヒトにおいては、 15以上の相同性の高い（85%以上）遺伝子群が見出されている。 IFNひの遺伝子に はイントロンが無く、ゲノム中にこれらの多型を含む複数の遺伝子が存在してレ、るの が大きな特徴である。

[0019] 本発明における IFN aには、これらの多型によってもたらされるサブタイプの全てが 含まれる。更に、これらのサブタイプを構成するアミノ酸配列において、 1あるいは複 数のアミノ酸配列力 付加、欠失、置換、あるいは揷入されたアミノ酸配列を含み、か つ IFNひと同等、あるいはそれ以上の生物学的活性を有する蛋白質も、本発明にお ける IFN aとして利用することができる。本発明における IFN aとして、任意の動物種 に由来する IFN aを利用することができる。好ましくは、投与される動物種に応じて、 同じ動物種由来の IFN αを用いることができる。

[0020] あるいは、歯周病に対する予防あるいは治療効果を有する限り、他の生物種に由 来する IFN aを利用することもできる。たとえば、以下の生物種に由来する IFN aのサ ブタイプが公知である。これらの天然の IFN aの各サブタイプについては、いずれも 以下に記載の GenBankァクセッションナンバーで、その塩基配列およびアミノ酸配列 を参照することができる。いずれの生物種においても、これらのサブタイプに加え、新 たなサブタイプが新たに見出される可能性がある。今後新たに見出されるサブタイプ も、必要な活性を有している限り、本発明における IFN aとして利用することができる。 なお通常これらのァクセッションナンバーによって特定されるアミノ酸配列は、シグ ナル配列を含んでいる。アミノ酸配列がシグナル配列を含む場合、通常は、当該シグ ナル配列が除かれた成熟蛋白質力 本発明における IFNひとして利用される。シグナ ル配列の全て、あるいは一部を伴ったアミノ酸配列からなる前駆蛋白質力 IFNひの 生物学的活性を有する場合には、前駆蛋白質を IFNひとして用いることもできる。更 に、投与後に、シグナル配列の全て、あるいは一部が除かれることで、 IFNひの生物 学的活性を獲得することができる前駆蛋白質も、本発明の IFNひとして利用すること ができる。

[0021] ィヌ IFNひ（8種のサブタイプ）

CaIFN-al : M28624 CaIFN-a2： M28625 CaIFN-a3： 097945

CaIFN-a4 : AB102731 CaIFN-a5： AB125934 CaIFN_a6： AB125935 CalFN- a7 : AB125936 CaIFN-a8 : AB125937

[0022] ネコ IFNひ（14種のサブタイプ）

FeIFN-w:E02521 FeIFN-al :AY117395 FeIFN-a2 :AY117394 FeIFN-a3:AYl 17393 FeIFN-a5 :AY117392 FeIFN-a6 : AY117391 FeIFN-a7： AB094996 FeIFN-a8： AB094997 FeIFN_a9： AB094998 FeIFN-alO:AB094999 FelFN-all : AB095000 FeIFN-al2 : AB095001 FelFN- al3： AB095002 FeIFN-al4： AB095003

[0023] げっ歯類 IFN a (8種のサブタイプ）

D00460, M13660, M13710, X01969, X01971, X01972, X01973, X01974 ゥシ IFN a (8種のサブタイプ）

M10952, M10953, M10954, M10955, M11001, X93087, X93088, X93089

[0024] ブタ IFN a

IFN-al:X57191.1

[0025] ヒト IFN α (21種のサブタイプ）

HuIFN-al:DQ185447 HuIFN_a2： NM000605 HuIFN_a3： E00176 HuIFN-a4:NM021068 HuIFN-a5： NM002169 HuIFN-a6： NM021002 HuIFN-a7:NM021057 HuIFN-a8： NM002170 HuIFN-alO : NM002171 HuIFN-al3:NM006900 HuIFN-al4 : NM002172 HuIFN-al6 : NM002173 HuIFN-al7:NM021268 HuIFN-a21 : NM002175 HuIFN-a2a: AAS92248 HuIFN-a2b:AAP20099 HuIFN-alb : AAL35223 HuIFN- a4b : CAA26701 HuIFN-al' : AAA52725 ( = HuIFN-al7subtype)

HuIFN-all： CAAO 1748 ( = HuIFN-a 17subtype)

HuIFN-a-j:CAA23792 HuIFN— aT: 179343 HuIFN-aO : 179344

HuIFN-aN： 158999 HuIFN- aB： 0902162A

[0026] たとえば次のようなヒト由来 IFN製剤が実用化されている。これらはいずれも天然型 の IFN αで、いずれも本発明における好適な IFN αに含まれる。

ォーアイエフ（大塚製薬製、 BALL-1)

スミフエロン（住友製薬製、 NAMALWA) Wellferon (Glaxo- Wellcome、 ひ- nl)

Alferon (Purdue Frederick Co.、 ひ- n3)

なお、上記の天然型 IFNひの由来として併記した、 BALL- 1、 NAMALWA、 ひ- nl、 およびひ - n3は、レ、ずれも各 IFNひが由来する細胞株の名前である。

天然型とは、遺伝子組み換えによらず、生体から樹立された細胞株が産生する IFN ひを言う。天然型の IFN aは、たとえば由来として記載した上記の細胞株を培養する ことによって、その培養物から回収することができる。これらの細胞株の培養と、培養 物からの IFN aの回収のための方法は公知である。

[0027] これに対してリコンビナン HFN aも同様に、本発明における好ましい IFN aに含ま れる。リコンビナント IFN aとは、 IFN aのアミノ酸配列をコードする DNAを人為的に発 現させることによって得られた IFN aである。更に、本発明における IFN aには、これら 天然に存在する IFN aのアミノ酸配列を含む蛋白質に加え、当該アミノ酸配列が改変 された蛋白質を利用することができる。具体的には、たとえば以下のような蛋白質を、 本発明における IFN aとして示すことができる。

(a)前記天然の IFN aのアミノ酸配列を含む蛋白質；

(b)前記天然の IFN αのアミノ酸配列において、 1もしくは複数のアミノ酸残基力 置 換、欠失、付カロ、または挿入されたアミノ酸配列を含み、天然の IFN aと同等の生物 学的活性を有する蛋白質；

(c)前記天然の IFN aをコードする塩基配列からなる DNAとストリンジヱントな条件に おいてハイブリダィズする DNAによってコードされ、天然の IFNひと同等の生物学的 活性を有する蛋白質;および

(d)前記天然の IFN aのアミノ酸配列と 90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含 み、天然の IFNひと同等の生物学的活性を有する蛋白質；

[0028] 本発明において、天然の IFNひの生物学的活性とは、当該蛋白質の口腔への投与 によって、口腔内の歯周病の病原菌の菌数が抑制されることを言う。ある蛋白質がこ のような活性を有することは、実際に、被験動物の口腔内に蛋白質を投与することに よって確認すること力 Sできる。具体的には唾液を 7%馬脱繊維素血液カ卩ブルセラ HK 寒天培地に接種し、嫌気培養（70%N 、 15%H 、 15%CO )すれば、歯周病原細菌を 黒色コロニー形成細菌（BPB)として計数することができる。蛋白質の投与によって BP Bが減少すれば、その蛋白質が天然の IFNひと生物学的に同等であることが確認でき る。 BPBの減少は対照と比較することによって確認することができる。たとえば、活性 を確認すべきタンパク質を溶解した媒体のみを投与した群における BPBの計数結果 を対照とすることができる。病原菌の細菌数は、計数すべき細菌に特異的なプライマ 一を利用した PCRによって確認することもできる。

[0029] あるいは IFN aの抗ウィルス活性を指標として、生物学的活性を比較することもでき る。一般に、 IFN αの抗ウィルス活性は、ウィルスによるウィルス感受性細胞の変性を 指標として定量的に評価されている。このような評価方法として、たとえば実施例 2に 示した CPE抑制法を利用することができる。すなわち、被験タンパク質によるウィルス 感受性細胞の変性抑制作用を定量的に評価することで、被験タンパク質の抗ウィル ス活性が決定される。こうして決定された抗ウィルス活性は、たとえば、細胞変性率を 50%防ぐことができる IFN試料の希釈倍数の逆数などで表すことができる。

[0030] 本明細書においては、実施例 2に記載の方法に基づいて決定した抗ウィルス活性 を単位" LLTで表した。天然の IFN aと比較して、たとえば 50%以上、好ましくは 70% 以上、より好ましくは 80%以上、あるいは 90%以上の抗ウィルス活性を有するタンパ ク質は、本発明における生物学的に同等な蛋白質に含まれる。本発明において、天 然の IFN αと生物学的に同等なタンパク質は、天然の IFN aの抗ウィルス活性の 80 〜150^ο/ο、より好ましく ίま 90〜： 120^ο/ο、更に好ましく ίま 95〜： 100^ο/οの抗ゥイノレス活十生 を有するタンパク質と定義することもできる。

[0031] このようなアミノ酸配列が改変された IFN aは、 IFN aの「バリアント」（改変体）と呼ぶ こと力 Sできる。与えられたアミノ酸配列を改変するためのさまざまな手法が公知である 。たとえば、 IFNひをコードするポリヌクレオチドの塩基配列に変異を導入し、それによ つてコードされるアミノ酸配列を改変することができる。アミノ酸配列の改変によって、 その生物学的な活性を調節することができる。たとえば、 IFNひの生物学的な活性を 増強したり、生体中における安定性を改善することができる。あるいは、 IFNひの抗原 性を改変することもできる。具体的には、異種由来の IFNひのアミノ酸配列を改変する ことによって、異種動物に対する抗原性を小さくすることができる。 [0032] アミノ酸配列を改変するための多くの手法が公知である。例えば、「モレキュラークロ ' ~ニンク：実験マニュノノレ (Molecularし loning : A Laboratory Manual)」、 J. Sambrook, et al., eds.， Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Har bor, New York, 1989、「分子生物学における最新プロトコール（Current Protocols in Molecular Biology)」、 .M. Ausubel, et al, eds.， John Wiley & Sons, Inc. , New ork などに記載された方法を利用することができる。

[0033] アミノ酸配列の改変は、アミノ酸残基の置換、欠失、付加、および揷入によってもた らされる。アミノ酸残基の置換、欠失、付加、および挿入は、それぞれ単独で施すこと もできるし、 2つ、 3つ、あるいは全ての修飾を与えることもできる。更に、天然の IFN a のアミノ酸配列の中の、 1または複数の位置において、アミノ酸残基の置換、欠失、付 カロ、および挿入からなる群から選択される任意の修飾を施すことができる。このような 改変体には、 IFN aアミノ酸配列の全体または部分を含む融合タンパク質も含まれる 。アミノ酸配列の変化がタンパク質の構造に与える影響を予測するための方法が知ら れている。したがって、既知の方法に従って、 IFN aの改変体を設計することができる 。このような方法の一例は、 Dahiyat and Mayoによって Science 278 : 8287, 1997に記 載されている。 Dahiyat and Mayoの方法を適用することにより、 IFN αのアミノ酸酉己歹 IJ を改変したときに、活性の維持に必要な構造を保っているか否力を解析することがで きる。

[0034] また、生物学的活性を維持したまま、アミノ酸配列のみを改変することもできる。たと えば、望ましくないジスルフイド結合を防ぐために、システィン残基を置換または除去 すること力 Sできる。同様に、アミノ酸配列の改変によって IFNひのプロテアーゼ感受性 を調節することもできる。プロテアーゼ耐性を付与すれば、発現系におけるプロテア ーゼによるタンパク質分解を防ぐことによって IFN αの発現を増強することもできる。

[0035] IFNひのアミノ酸配列の改変において、性質が似ているアミノ酸残基への置換が、 蛋白質の構造や活性の維持に有用であることが知られている。性質が似ているアミノ 酸残基の置換は、保存的置換と呼ばれる。「保存的置換」とは、蛋白質の三次構造 および/または活性を大きく変化させないアミノ酸置換を言う。たとえば次に示したグ ループに含まれるアミノ酸の、グループ内の他のアミノ酸残基への置換は、保存的置 換に含まれる。

(1)中性疎水性側鎖 (ァラニン、トリプトファン、バリン、フエ二ルァラニン、プロリン、メチ ォニン、ロイシン）；

(2)中性極性側鎖 (ァスパラギン、グリシン、グノレタミン、システィン、セリン、チロシン、ト レ才ニン）；

(3)塩基性側鎖（アルギニン、ヒスチジン、リシン）；

(4)酸性側鎖 (ァスパラギン酸、グノレタミン酸)；

(5)脂肪族側鎖 (ァラニン、イソロイシン、グリシン、ノくリン、ロイシン)；

(6)脂肪族水酸基側鎖 (セリン、トレオニン）；

(7)ァミン含有側鎖 (ァスパラギン、アルギニン、グルタミン、ヒスチジン、リシン)；

(8)芳香族側鎖 (チロシン、トリブトファン、フエ二ルァラニン)；および

(9)硫黄含有側鎖 (システィン、メチォニン）

[0036] アミノ酸の置換には、当業者に知られたさまざまな方法を利用することができる。具 体的には、 Kunkelらの部位特異的変異誘発法（Kunkel, Pro Nat. Acad. Sci. U.S.A . 82: 488-492， 1985)を、アミノ酸の置換に利用することができる。あるいは想定され たアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチドを化学的に合成するこ とちできる。

[0037] 本発明において、置換、欠失、付加、または揷入されるアミノ酸残基の数は、得られ る改変体が必要な IFN aの生物学的な活性を維持する限り制限されない。先に述べ たとおり、ここで言う生物学的な活性の維持には、生物学的活性の増強が含まれる。 本発明における IFNひの改変体を得るための、置換、欠失、付加、または揷入される アミノ酸残基の数は、通常 50残基以内、たとえば 30残基以内、好ましくは 20残基以 内、より好ましくは 10残基以内、特に好ましくは 5以内、更に好ましくは 1〜3残基であ る。

[0038] 更に、アミノ酸配列の改変によって IFN αの生物学的な活性を増強することができる 。生物学的な活性を増強された IFNひも、本発明における IFNひに含まれる。生物学 的な活性の増強には、重量当たりの IFNひの活性の増強と、生体内における滞留時 間の延長、あるいは生理的な分解の抑制が含まれる。たとえば、 IFN aのアミノ酸配 列を、レ、くつかのサブタイプの間で保存されたアミノ酸配列に改変することによって、 I FNひの生物学的な活性を増強できることが明らかにされている（US4695623, US489 7471 , US5985265)₀このような改変体を本発明における IFNひとして利用することもで きる。

[0039] IFN aの改変体をコードするポリヌクレオチドを、ハイブリダィゼーシヨンによって得る こともできる。たとえば前記の天然の IFN aをコードする DNAのコード領域からなる DN Aとストリンジヱントな条件下でハイブリダィズするポリヌクレオチドは、 IFNひと同様の 生物学的活性を有する蛋白質をコードしている可能性が高い。本発明において、「ス トリンジェントな条件下」とは、当技術分野で周知のパラメーターによって特定される。 具体的には、 DNAのハイブリダィゼーシヨン条件は、低イオン強度、および DNAハイ ブリツド複合体の融解温度 (Tm)をわずかに下回る温度において、一般にストリンジェ ントであると言われる。具体的には、 Tmよりも約 3°C低い条件は、ストリンジヱントな条 件に含まれる。ストリンジエンシーが高いほど、プローブ配列と標的配列との間の同一 性は高い。

このような条件は、この種の方法をまとめた参考文献で参照することができる。具体 的には、例えば、先に示した「モレキュラークローニング：実験マニュアル」や「分子生 物学における最新プロトコ一ノレ (Current Protocols in Molecular Biology)」などに記 載されている。これらの方法によって、前記天然の IFNひの DNAをプローブとして、未 だ IFN αが単離されていない生物の cDNAライブラリーをスクリーニングすれば、当該 生物の IFN αをコードする cDNAを得ることができる。あるいは既に IFN αが単離され ている生物種の cDNAライブラリーからは、更に新たなサブタイプを単離できる可能性 力 ^sある。

[0040] たとえば、 65°Cの、 6 X SSC中でのハイブリダィゼーシヨンをストリンジヱントな条件と して例示することができる。あるいは、 65°Cの、 3.5 X SSC, 0.02% Ficoll、 0.02%ポリビ ニルピロリドン、 0.02%ゥシ血清アルブミン、 2.5mM NaH PO [pH7]

2 4 、 0.5% SDS、 2m

M EDTAからなるハイブリダィゼーシヨン緩衝液中でのハイブリダィゼーシヨンを、スト リンジヱントな条件として示すこともできる。なお SSCは、 pH7の 0.15M塩化ナトリウム /0 .15Mクェン酸ナトリウムである。ストリンジェントな条件においては、ハイブリダィゼー シヨンの後に、 DNAを転写したメンブレンを 2 X SSCにて室温で洗浄し、その後に 0.1 X SSC/0.1 X SDSにて最高 68°Cまでの温度で洗浄する。

[0041] あるいは、水性ハイブリダィゼーシヨン溶液に代えて、ホルムアミドハイブリダィゼー シヨン溶液を用いることもできる。すなわち、ストリンジヱントなハイブリダィゼーシヨン 条件を、例えば、 42°Cの 50%ホルムアミド溶液を用いることによって得ることができる。 当業者は、同程度のストリンジエンシーを得るために、他の条件や、試薬類を利用す ることができる。また、改変体の発現のために細胞およびライブラリーをスクリーニング し、それらを単離し、更に目的とする DNAをクローニングおよびシークェンシングする ための方法も周知である。たとえば、単離すべき DNAの塩基配列に基づいて、当該 D NAを増幅するためのプライマーをデザインすることができる。プライマーを利用して、 PCR法などの遺伝子増幅法によって、 目的とする DNAが増幅される。

[0042] 本発明において IFN aの改変体のアミノ酸配列と天然のアミノ酸配列との同一性は 、一般に、少なくとも 65%、通常 75%、好ましくは 90%、より好ましくは 95%以上、更に 好ましくは 99%以上である。アミノ酸配列の相同性は、 NCBI (Bethesda, Maryland)に よって開発された、さまざまな公開ソフトウェアツールによって算出することができる。 塩基配列やアミノ酸配列の解析ツールには、 Altschul SF, et al.，のヒューリスティック アルゴリズム（J Mol Biol, 1990， 215: 403-410)が含まれる。このツールは、 BLASTとし て知られている。

[0043] 本発明において、 IFN aは、その生物学的活性を維持する限り、他の分子によって 修飾することもできる。具体的には、 IFNひと他のタンパク質との融合タンパク質を、本 発明における IFNひとして利用することができる。その他、非蛋白性の高分子化合物 による IFNひの修飾も許容される。たとえば、ポリエチレングリコール等の高分子化合 物で修飾された IFNひが血中への投与用製剤として利用されている (US5382657, US 5559213, US6177074, US5951974, US5981709)_o高分子化合物による修飾によって、 IFN aは血液中での滞留性が改善される。

[0044] 本発明に用いる IFNひは、そのアミノ酸配列にしたがって、化学的に、あるいは遺伝 子工学的に合成することができる。あるいは天然の IFNひを本発明に利用することも できる。天然の IFN aは、生体や生体材料から抽出することができる。あるいは IFN a を産生する細胞を培養し、その培養物から天然の IFNひを回収することもできる。中 でも遺伝子工学的な合成方法は、均質な IFNひを容易に、かつ大量に得るための方 法として好ましい。合成すべきアミノ酸配列が明らかであれば、当業者はそれをコード する塩基配列を予測し、合成すること力 Sできる。あるいは天然の cDNAやその改変体 を調製し、蛋白質に翻訳させることができる。アミノ酸配列をコードする DNAをもとに、 i n vivoで、あるいは iiudimで蛋白質に翻訳するための多くの手法が公知である。たと えば iiudxeにおいて蛋白質に翻訳するためには、一般的には、必要に応じて、それ ぞれ転写および翻訳の開始にかかわる 5'非転写配列および 5'非翻訳配列などを組 み合わせることができる。より具体的には、 5'非転写調節配列として、遺伝子の転写 制御のためのプロモーター配列を遺伝子に連結することができる。転写調節配列とし て、ェンハンサーを付加することもできる。

[0045] 発現のために必要な要素のすべてを含む発現ベクターが市販されている。公知の ベクターは、たとえば、 Sambrook et al" 「分子クローニング：実験マニュアル（Molecul ar Cloning : A Laboratory Manual)」、 Secona Edition, し old bprmg Harbor Laboratory Press, 1989等にも記載されている。一般にこれらの市販のベクターには、アミノ酸酉己 列をコードする DNAを挿入するためのマルチクローニングサイトが用意されている。 発現させるべき DNAは、適当な制限酵素で切断し、当該クローニングサイトに挿入す ることで、発現ベクターとすることができる。必要な制限酵素サイトは、合成オリゴヌク レオチドとしてライゲーシヨンすることもできる。融合タンパク質発現用ベクターを利用 すれば、 IFNひを融合タンパク質として発現させることもできる。たとえば、 mycタグや H isタグなどを付加することができるベクターも公知である。

[0046] こうして作製された発現ベクターは、当該ベクターを導入し、 目的とするタンパク質 への翻訳が可能な宿主細胞に形質転換される。宿主細胞としては、たとえば次のよう な細胞を利用することができる。

原核細胞 (例えば、大腸菌）

真核細胞（例えば、 CHO細胞、 COS細胞、酵母発現システム、および昆虫細胞） 本発明に利用する IFN aが糖鎖付加部位を含むと予測される場合には、真核細胞 を宿主として利用するのが好ましい。たとえば配列番号: 4に示したィヌ IFN aのァミノ 酸配列には、少なくとも 3箇所の糖化部位が予測される（図 1)。したがって、配列番 号: 4に示すィヌ IFN αの発現には、真核細胞を利用することができる。

真核細胞発現系として、たとえば昆虫細胞を利用することができる。バキュロウィノレ ス発現系を利用して、昆虫細胞において外来性の DNAを発現させるための方法が公 知である。たとえば、実施例に記載したような手法により、昆虫細胞で外来性の DNA を発現させること力 Sできる。

[0047] 天然の IFN αは、分泌タンパク質である。したがって IFN αをコードする生体由来の c DNAには、通常シグナル配列もエンコードされている。たとえば配列番号： 3に示すィ ヌ IFN aは、その N末端 23残基はシグナル配列である。このことは、たとえば昆虫細 胞における発現産物が、成熟蛋白質に相当する分子量のタンパク質を含むことから も裏付けられる。

上記のような遺伝子工学的な手法によって本発明に用いる IFN _αを合成する場合、 シグナル配列として、外来性のシグナル配列を利用することもできる。たとえば、ヒ HF N etをヒト以外の細胞で発現させるとき、実際の発現に用いる細胞が由来する生物種 において機能するシグナル配列を利用することができる。この場合、ヒ HFN aの成熟 タンパク質のアミノ酸配列に、ヒト以外の種において機能するシグナル配列が付加さ れた、キメラタンパク質が発現する。発現した組み換えタンパク質は、細胞外への分 泌の過程でシグナル配列が除去される。その結果、ヒトの成熟タンパク質が分泌され る。あるいは、細胞外への分泌を必要としないのであれば、成熟タンパク質のアミノ酸 配列をコードする DNAを発現させることもできる。シグナル配列の欠損によって開始コ ドンを失う場合には、 5'末端に人為的に開始コドン (atg)を付加することもできる。

[0048] シグナル配列を含むアミノ酸配列を発現させた場合には、培養上清中に IFN aが 蓄積される。あるいはシグナル配列を持たないアミノ酸配列として発現させた場合に は、細胞内に IFNひの成熟タンパク質が蓄積する。これらの遺伝子組み換えによって 発現した IFNひは、培養物から回収し精製して本発明の組成物に利用することができ る。培養物から IFNひを回収し、精製するための手法は公知である。あるいは、発現 産物を含む培養物そのもの、あるいは粗精製物を本発明の組成物に利用することも できる。たとえば、酵母を宿主として発現させた IFN aを、酵母菌体を含んだまま凍結 乾燥し、本発明の組成物に配合することができる。

[0049] 更に、本発明の口腔組成物に配合するための IFNひとして、植物を宿主として発現 させた IFNひを利用することもできる。この場合、 IFNひを発現する形質転換植物の植 物体あるいは植物細胞を本発明の口腔組成物の原料として利用することができる。 すなわち、本発明は、 IFNひをコードする遺伝子を発現可能に保持する形質転換植 物を含む、歯周病の予防および治療の、いずれか、または両方のための口腔投与用 の組成物を提供する。あるいは本発明は、 IFNひをコードする遺伝子を発現可能に 保持する形質転換植物に由来する IFN a含有分画を含む、歯周病の予防および治 療の、いずれか、または両方のための口腔投与用の組成物に関する。

[0050] たとえば、形質転換植物の IFN aを含む組織を、破砕して、本発明の口腔組成物に 配合することができる。植物組織を乾燥させた後に粉砕することもできる。あるいは破 砕した植物組織を乾燥させることもできる。また、形質転換植物の IFN aを含む組織 をホモジェナイズし、必要に応じてろ過して得られた IFN a含有溶液をそのまま、ある いは更に乾燥した後に、本発明の口腔組成物に配合することもできる。これらの形質 転換植物に由来する IFN aを含む分画は、いずれも本発明における「形質転換植物 」に含まれる。

形質転換植物として、現在、飼料やペットフードの原料とされている植物を利用す れば、現行の製造工程を大きく変えることなぐ本発明の口腔組成物を製造すること ができる。

このような植物として、具体的には、ジャガイモ、トマト、豆類、穀類、イチゴ等の果実 類ならびに牧草類などが挙げられる。豆類としては、ダイズおよび小豆等を利用する ことができる。穀類としては、イネ、コムギおよびトウモロコシ等を示すことができる。

[0051] 本発明に用いる形質転換植物細胞は、 IFNひ（あるいは IFNひと同等な生物学的活 性を有するタンパク質）をコードする遺伝子を含むベクターを植物細胞に導入し、発 現させることで作製できる。植物細胞における IFN aの発現にあたり、 IFN aの C末端 に、 ,Jヽ胞体イ禾持シグナノレ (endoplasmic reticulum retention signal)を付カ卩 T こともで きる。小胞体保持シグナルとは、たとえば次のようなアミノ酸配列からなる。小胞体保 持シグナルを有する分泌タンパク質は、発現後、小胞体内に留まり安定に保持される KDEL (Lys- Asp_Glu-Leu)Z配列番号： 7

RDEL (Arg-Asp_Glu- Leu)Z配列番号： 8

すなわち本発明は、 C末端に小胞体保持シグナルを付加された IFN aをコードする 遺伝子を発現可能に保持する形質転換植物を含む、歯周病の予防および治療の、 いずれか、または両方のための口腔投与用の組成物を提供する。あるいは本発明は 、 C末端に小胞体保持シグナルを付加された IFN aをコードする遺伝子を発現可能 に保持する形質転換植物に由来する IFN a含有分画を含む、歯周病の予防および 治療の、いずれか、または両方のための口腔投与用の組成物に関する。

植物細胞における遺伝子発現に用いるベクターとしては、植物細胞で転写可能な プロモーターと転写産物の安定化に必要なポリアデニレーシヨン部位を含むターミネ 一ター配列を含んでいれば特に制限されない。利用可能なベクターとしては、例え ば、プラスミド「pBI121」、「pBI221」、「pBI101」 (いずれも Clontech社製）などが挙げら れる。植物細胞で転写可能なプロモーターとしては、例えば、植物細胞内での恒常 的な遺伝子発現を行うためのプロモーターや外的な刺激により誘導的に活性化され るプロモーターを用いることができる。恒常的に発現させるためのプロモーターとして は、次のようなプロモーターが公知である。

カリフラワーモザイクウィルスの 35Sプロモーター（Odell et al. 1985 Nature 313:810) イネのァクチンプロモーター（Zhang et al.1991 Plant Cell 3: 1155)；

トウモロコシのュビキチンプロモーター（Cornejo et al. 1993 Plant Mol.Biol. 23:567

)

これらプロモーターに機能的に結合した IFN aをコードする遺伝子を含むベクター を植物細胞に導入することにより、植物細胞内で IFNひを発現させることができる。こ こで「機能的に結合」とは、植物細胞内で IFNひが発現するように、プロモーターと IFN aをコードする遺伝子とが結合していることを意味する。形質転換される「植物細胞」 には、種々の形態の植物細胞が含まれる。例えば、懸濁培養細胞、プロトプラスト、 葉の切片、カルスなどにベクターを導入し形質転換体とすることができる。 [0053] ベクターをこれらの植物細胞に導入するための方法は公知である。具体的には、了 グロバタテリゥムを介する方法、ポリエチレングリコール法、電気穿孔法（エレクトロボ レーシヨン法）、パーティクルガン法など当業者に公知の種々の方法を用いることがで きる。

[0054] 形質転換された植物細胞を再分化させることにより、植物体を再生させることができ る。植物種に応じた再分化の方法が確立されている。以下に各植物種の再分化のた めの方法を列挙する。

ジャガイモ：

Visserらの方法（Theor.Appl.Genet 78:594 (1989))；

チューバ一ディスク法

イネ等の単子葉穀類：

Hieiらの方法 (Hiei Y, Komari T, Kubo T： Transformation of rice mediated by Agro bacterium tumefaciens. Plant Mol Biol 1997 35: 1-2 205-18)；

Ishidaらの方法 (Ishida Y, Saito H, Ohta S, Hiei Y, Komari T, Kumashiro T： High ef ficiency transformation of maize (Zea mays L.) mediated by Agrobacterium tumefacie ns. Nat Biotechnol 1996 Jun 14:6 745-50)；

エレクト口ポレーシヨン法 ( himamoto'K. , Terada, R.， Izawa, T.et al. ： Fertile transg enic rice plants regenerated from transformed protoplasts. Nature 338,274-276(198 9))など

イチゴ：

Asaoらの方法 (Asao,H. ,Y.Nishizawa,S.Arai,T.Sato,M.Hirai,K.yoshida,A.Shinmyo a nd .Ηίοι. ： Ennanced resistance against a fungal pathogen sphaerotheca humuli m tr ansgenic strawberry expressing a rice chitinase gene. Plant Biotechnology.14(3): 145 -149(1997))

[0055] 一旦、ゲノム（染色体）内に IFN aをコードする遺伝子が導入された形質転換植物 体が得られれば、該植物体から有性生殖または無性生殖により子孫を得ることができ る。また、該植物体やその子孫あるいはクローンから繁殖材料を得て、それらを基に 該植物体を量産することもできる。例えば、種子、果実、切穂、塊茎、塊根、株、カル ス、プロトプラスト等を繁殖材料とすることができる。

[0056] 更に、植物ウィルスベクターによって、植物において、 目的のタンパク質を発現させ る技術も公知である。ゲノムに組み込まれなレ、植物ウィルスベクターを用いた場合、 通常、外来性遺伝子は子孫には伝達されない。し力 現在のところ、植物ウィルスべ クタ一を用いた外来性遺伝子の植物における発現レベルは、ァグロバタテリゥム法等 に代表される染色体組換え法よりも高いことが知られている。植物ウィルスベクターと してはタバコモザイクウィルスベクターが実用可能なウィルスベクターとして公知であ る。具体的には、植物体を育成し、接種可能時期に構築した発現遺伝子から転写さ せた感染性 RNAを植物体に接種することにより、 目的物質を植物体内で生産させる こと力 Sできる。

[0057] 本発明の組成物は、哺乳動物の歯周病の、予防および治療の、いずれか、または 両方のために有用である。本発明において、予防とは、歯周病症状の進行を抑制す ることを言う。症状が出ていない状態においては、症状の発生を遅らせることが予防 である。また歯周病の治療とは、歯周病の症状の少なくとも一つを軽減することを言う 。本発明において、予防あるいは治療すべき歯周病の症状には、歯肉の腫れや痛 み、歯肉からの出血が含まれる。これらの症状は、歯肉の炎症に起因している。した がって、歯肉の炎症も、歯周病の症状に含まれる。

[0058] 更に、歯周病の原因が特定の口腔細菌によってもたらされていることから、これらの 病原菌の菌数を抑制することも、治療あるいは予防に含まれる。本発明における歯周 病の病原菌には、黒色集落形成性グラム陰性嫌気性の細菌が含まれる。このような 微生物は、たとえば馬脱繊維素血液加ブルセラ HK寒天培地において、嫌気培養に よって、黒色コロニーを形成する細菌として確認することができる。具体的には、 Pom hyromonas属ゃ Prevotella属の微生物が歯周病の病原菌として公知である。実際に 分離される菌種としては、 P. gingivalisの頻度が最も高い。その他に P. endodontalis, P. circumdentaria, P. canoris, P. salivosaなど しはしば分离 g れる。

[0059] 本発明の組成物を投与するための好ましい哺乳動物は、ヒトである。その他、ィヌゃ ネコなどのペット動物、あるいは動物園で飼育されている哺乳動物も、本発明におけ る哺乳動物として好ましい。このような哺乳動物には、ブタ、イノシシ、ャギ、ヒッジ、ゥ マ、ゥシ、シカ、ロバ、トナカイ、ゥサギ、サル、ゴリラ、オランウータン、チンパンジー、 ナマケモノ、ゾゥ、キリン、サイ、カノく、バタ、ォォカミ、ハイエナ、クマ、パンダ、レッサ 一パンダ、ハクビシン、キツネ、タヌキ、アライダマ、トラ、ライオン、ヒヨウ、チータ、カヮ ゥソ、ァザラシ、オットセィ、トド、ァシ力、ィルカ、シャチ、およびクジラなどが含まれる

[0060] 本発明において、口腔組成物は、哺乳動物の口腔に投与するための組成物を言う 。本発明の口腔組成物は、インターフェロンひと生物学的に許容される担体を配合 することによって製造することができる。生物学的に許容される担体とは、配合される インターフェロン _α、および当該組成物が投与される生物に対して、不活性な担体が 含まれる。生物に対して不活性な担体とは、担体が正常な生物の機能に干渉しない ことを言う。正常な生物の機能には、代謝機能、生殖機能、運動機能、神経作用など が含まれる。たとえば、生物の正常な代謝機能によって代謝される成分は、生物学的 に許容される担体に含まれる。あるいは消化や代謝が行われない成分や、行われに くい成分であって、生物の機能に干渉しない成分は、いずれも生物学的に許容され る担体に含まれる。

たとえば、 IFN aが配合された食品は、本発明の口腔組成物の好ましい態様を構成 する。本発明の組成物は、食品以外に、 口腔組織への塗布や噴霧によって口腔に 投与することもできる。本発明の組成物は、歯周病の予防あるいは治療を目的とする 医薬組成物として投与することもできる。

[0061] すなわち本発明は、インターフェロンひを有効成分として含有する、歯周病の治療 、および予防の、いずれか、または両方のための医薬組成物に関する。あるいは本 発明は、インターフェロンひと薬学的に許容される担体を含む、歯周病の治療、およ び予防の、いずれか、または両方のための医薬組成物に関する。更に本発明は、ィ ンターフェロンひの歯周病の治療、および予防の、いずれか、または両方のための医 薬組成物の製造における使用に関する。また本発明は、インターフェロンひの歯周 病の治療、および予防の、いずれか、または両方のための方法における使用に関す る。

[0062] 特に、従来の技術においては歯周病に対する積極的な治療方法は知られていな かった。本発明においては、実施例でも確認されたとおり、本発明の歯周病の治療 剤を投与することによって、既に進行している歯周病の治療効果が確認された。すな わち本発明は、インターフェロンひを有効成分として含有する、歯周病の治療剤を提 供した。あるいは本発明は、インターフヱロンひと薬学的に許容される担体を含む、 歯周病の治療用医薬組成物に関する。更に本発明は、インターフェロンひの歯周病 の治療のための医薬組成物の製造における使用に関する。また本発明は、インター フエロンひの歯周病の治療における使用に関する。

[0063] 続レ、て本発明におけるインターフェロン _αを含有する口腔用組成物の具体的な態 様について説明する。

インターフェロン αを含む食品組成物：

通常、哺乳動物の食品 (food)あるいは飼料 (feed)として摂取される成分にインターフ ェロン αを配合することによって、本発明の組成物とすることができる。飼料が特にべ ット動物に与えられる場合には、ペットフードと呼ばれる。ペットフードは、本発明にお ける食料あるいは飼料に含まれる。なおペット動物とは、鑑賞や愛玩を目的として飼 育されている非ヒト動物を言う。したがって、たとえば、食肉、卵、毛、乳汁などの出荷 や使役を目的として飼育されている動物は、通常家畜に含まれ、ペットとは区別され る。ただし、警察犬や盲導犬などの、使役を目的として飼育される動物 (使役動物; w orking animal)に対して、愛玩動物と同じ飼料が与えられる場合もある。飼育の目的 が使役であっても、ペットと同じ動物種に対してペットと同じ飼料が与えられる場合に は、当該飼料は本発明でいうペットフードに含まれる。

[0064] 一般に、食品あるいは飼料は、炭水化物、タンパク質、ミネラル、脂肪、水分、ある いは繊維などを含む。その原料の多くは、動物や植物の組織、微生物菌体、ならび にそれらの加工品である。加工品とは、これらの素材を原料として、加熱、乾燥、凍結 乾燥、あるいは抽出などによって得られた製品を言う。一連の加工品を得るためのェ 程には、複数の異なる工程を組み合わせることもできる。

食品あるいは飼料には、保存剤、防腐剤、酸化防止剤、色素、香料、保湿剤、調味 料などを配合することもできる。また食品の形態に合わせて、増量剤、結合剤、あるい は粘度調整剤等の成分が添加されることもある。これらの成分には、天然由来の成分 や、合成された成分が利用されている。したがって、これらの、一般の食品あるいは 飼料素材に、 IFNひを配合することによって、本発明に基づく食品組成物とすることが できる。更に、一般の IFNひを含まない食品あるいは飼料の摂取時に、 IFNひを混入 することによって、本発明の口腔組成物とすることもできる。続いて、本発明の口腔投 与用組成物の具体的な例を示す。

[0065] 本発明の食品組成物、あるいは飼料組成物は、一般に食品あるいは飼料として利 用される素材に、インターフェロンひを添加することによって得ることができる。本発明 による食品組成物あるいは飼料組成物に添加されるインターフェロン αの量は、通常 体重 lkgあたり 0. 1〜： 1500LU/曰、好ましく ίま体重 lkgあたり 0. 05〜2500LU /曰で ある。つまり、 1日の標準的な食品あるいは飼料の摂取量に対して、体重 lkg当たり、 0. 1〜： 1500LU、好ましくは 0. 05〜2500LU/のインターフェロン αを酉己合すること ができる。食品組成物が、チューインガム (chewing gum)などの嗜好性食品 (nonessent ial food)の場合には、インターフェロン αの配合量に応じて、 1日当たりの当該食品の 摂取量を表示することで、インターフェロンの投与量を制御することもできる。たとえば 、チューインガム 1枚に 1日分の投与量を配合したときには、 1日当たりのチューイン ガムの摂取量が 1枚であることが推奨される。

[0066] インターフェロン αを含む咀嚼性組成物 (chewable composition)：

本発明における IFNひを含む組成物は、咀嚼性の担体と配合して、咀嚼性の口腔 組成物とすることができる。すなわち本発明は、 IFNひと咀嚼性の担体 (chewable carri er)を含む、 口腔組成物を提供する。本発明において、咀嚼性の担体とは、動物の口 腔に投与したときに、咀嚼される成分を言う。咀嚼性の担体は、嚙み砕かれる素材で あることもできるし、咀嚼によって小さな破片に砕かれにくい素材であることもできる。 具体的には、たとえば、グルコース、シュクロース、マルトース、ソルビトール、キシリ トーノレ、トレハロース、でんぷん、ゼラチン、アルギン酸、アルギン酸塩、セルロース、 ェチノレセノレロース、カノレボキシメチノレセノレロース、ヒドロキシプロピノレセノレロース、ヒド ロキシプロピルメチルセルロース、グァガム (guar gum ;ポリガラタトマンナン）、ダルコ マンナン、キサンタンガム、カーボポール等を示すことができる。

[0067] あるいは、各種のガムベースも本発明における咀嚼性の担体に含まれる。一般にガ ムベースには、 口の中で長時間咀嚼しても、なお一定の体積が維持される担体が利 用される。ガムベースとしては、たとえば、植物性樹脂、チクル、酢酸ビュル樹脂、ェ ステルガム、ポリイソブチレン、炭酸カルシウム、あるいはジエルトン（ポンチアナック） 等を利用することができる。ガムベースは、本発明における咀嚼性組成物を、特にヒト 口腔への投与用に加工する場合に好適な咀嚼性担体である。

[0068] 本発明における咀嚼性組成物が、医薬品として利用される場合には、咀嚼性の医 薬組成物であり、食品として供される場合には、咀嚼性食品である。あるいは、本発 明の組成物を咀嚼性の飼料とする場合には、咀嚼性の飼料組成物となる。なお、非 ヒト動物においては、咀嚼行動を誘導するために、咀嚼性組成物の大きさを調節する こと力 Sできる。すなわち、一口で飲み込まれない程度の大きさに加工することによって 、非ヒト動物において咀嚼行動を誘導することができる。更に、硬さを動物に合わせ て高めることにより、より多くの咀嚼行動を誘導することもできる。

[0069] インターフェロン αを含むペースト状の組成物 (paste type composition)：

本発明における IFN aを含む組成物は、ペースト状の担体と配合して、ペースト状 の口腔組成物とすることもできる。すなわち本発明は、 IFN aとペースト状の担体 (past e carrier)を含む、 口腔組成物を提供する。本発明において、ペースト状の担体とは、 半固形状 (semi-solid consistency)を有する担体と言うこともできる。あるいはペースト 状の担体には、ゲル状の担体が含まれる。

[0070] ペースト状の組成物は、たとえば水溶性の多糖類あるいは高分子化合物に、水な どの溶媒を加えることで調製することができる。水溶性の多糖類あるいは高分子化合 物には、グルコース、シュクロース、マルトース、ソルビトール、キシリトール、でんぷん 、ゼラチン、ぺクチン、アルギン酸、アルギン酸塩、セルロース、ェチルセルロース、力 ノレボキシメチノレセノレロース、ヒドロキシプロピノレセノレロース、ヒドロキシプロピノレメチノレ セルロース、グァガム (guar gum ;ポリガラタトマンナン）、ダルコマンナン、カラギーナ ン、キサンタンガム、タマリンドガム、カーボポール、ァガロース、寒天等が含まれる。 このほか、ポリエチレングリコール、ポリビュルピロリドンなどの高分子化合物も、ゲル 状の担体として本発明の組成物に配合することができる。

[0071] ペースト状あるいはゲル状の本発明の組成物は、たとえば口腔内の組織に塗布す ることによって投与することができる。 口腔内の組織とは、歯肉、歯牙、舌下、頰側ロ 腔 (buccal cavity),あるいは頰側粘膜 (buccal mucosa)等を含む。たとえば歯肉への塗 布は、歯周病の病巣に直接投与することができるので好ましい。あるいは、頰側口腔 への塗布も、好ましい投与方法である。 口腔内組織へのペースト状組成物の塗布は 、非ヒト動物においても応用可能な投与方法である。あるいは主にヒトに対する投与 方法として、本発明の組成物を歯磨き剤 (tooth paste)として投与することもできる。す なわち、 IFNひを配合した歯磨き剤を本発明の組成物として利用するのである。もち ろん、歯磨きを受け入れる個体であれば、非ヒト動物に対しても歯磨き剤として本発 明の組成物を投与することができることは言うまでもない。

[0072] 本発明の組成物は、固形状、ゲル状、液状など任意の形状を選択することができる 。 IFN aの活性を維持するためには、乾燥された状態で流通させるのが望ましい。あ るいは、組成物の摂取時に水などの適当な溶媒をカ卩えることによって、乾燥した組成 物をゲル状や液状にすることもできる。更に、本発明の組成物を凍結状態で流通さ せることちできる。

[0073] また本発明の組成物は、香料、色素、矯味剤、甘味料、調味料などの成分を付カロ 的に含むことができる。また、歯周病の治療効果や予防効果が知られている公知の 成分を本発明の組成物に組み合わせることができる。更に咀嚼性担体を配合した組 成物においては、更に植物繊維などを配合して、歯牙のブラッシング効果を期待す ることあでさる。

[0074] 本発明の口腔組成物において、 IFNひの含有量は、体重 lkgあたり通常 0. 05〜2 500LU/曰、たとえば体重 lkgあたり 0. 1〜： 1500LU/曰、より具体的には 0. 2〜500 LU/日、通常 0. 2〜50LU/曰、好ましくは 0. 2〜： 1LU/曰程度となるように酉己合するこ とができる。血液中に抗ウィルス効果を期待して投与される IFNひの投与量力 数 Ml U〜10MIU (1MIU= 1000IU)ときわめて高用量であるのに対して、本発明において は低用量で課題を達成することができる。 IFN αの使用量を低く抑えることによって、 本発明における IFNひ投与による副作用の危険は無視しうるほどに小さい。本発明の 組成物における IFNひの配合割合は、当該組成物の摂取量に基づいて決定すること ができる。たとえば飼料に配合する場合には、本発明の組成物を投与すべき動物の 体重と、 1日当たりの飼料の摂取量に基づいて、飼料に配合すべき IFNひの量を決定 すること力 Sできる。

[0075] なお、本発明における 1LUは、ヒト天然型 IFNひの 1IUに相当する。一般に、抗ウイ ルス効果の決定のためには、被験タンパク質の IFNひ様作用に応答性を有する細胞 が利用される。そのため実施例 2ではィヌの細胞が利用された。一方ヒ HFNひの抗ゥ ィルス効果の決定には、一般にヒトの細胞が利用される。したがって、両者の活性を 直接比較することは困難である。し力 抗ウィルス活性を測定した原理は両者で共通 であることから、 1LUは 1IUに相当するということができる。

[0076] あるいは、本発明の口腔組成物に含まれる IFN aの含有量に基づいて、当該組成 物を体重 lkg当たり、一日に何 gを摂取すればよいのかを、指示書において説明する こともできる。すなわち本発明は、（1)インターフェロン αと生物学的に許容される担体 とを含む口腔組成物と、（2)当該組成物の歯周病の予防および治療のいずれか、また は両方のために有効な投与量を記載した指示書を含む、歯周病の予防および治療 のいずれか、または両方のためのキットを提供する。

[0077] 本発明におレ、て、 IFN aの力価 (LU)は、次のようにして決定される。

力価を決定すべきタンパク質の希釈系列を作製する。各希釈段階の抗ウィルス活 性を、たとえば CPE抑制法 (J Vet Med Sci. 1996, 58(1), 23-27)などによって評価す る。具体的には、実施例 2で用いたような、水疱性口炎ウィルス (VSV)をウィルスとし て、そしてィヌ由来 A-72細胞（ATCC CRL-1542)をウィルス感受性細胞として利用す ること力 Sできる。 A-72細胞の細胞変性は、クリスタルバイオレット染色によって定量的 に評価することができる。 VSVによる A-72細胞の細胞変性率を 50%防ぐことができる I FN試料の希釈倍数の逆数を抗ウィルス活性 (LU)とした。

[0078] 本発明の口腔組成物は、動物の口腔に投与することによって、歯周病の予防、およ び治療のいずれか、または両方の効果を実現することができる。すなわち本発明は、 インターフェロンひを口腔に投与する工程を含む、哺乳動物の歯周病の予防および 治療のいずれか、または両方のための方法を提供する。特に、インターフェロンひを ヒトあるいは非ヒト動物の口腔内に投与する工程を含む歯周病の治療方法は、本発 明における好ましい態様である。 本発明の組成物は、固形状、ペースト状、ゲル状、液状などの任意の形状として、 哺乳動物の口腔に投与することができる。固形製剤は、咀嚼あるいは嚥下行為を介 して、投与することができる。あるいは、 口中錠（いわゆるトローチ剤）として固形製剤 を口腔内に投与することもできる。ペースト状あるいはゲル状製剤は、咀嚼ゃ嚥下行 為に加え、 口腔組織への塗布によって投与することができる。液状製剤は、嚥下行 為に加え、 口腔内への噴霧、 口内洗浄やうがい行為を介して投与することができる。

[0079] 本発明の口腔組成物を、医療行為として投与する場合には、 口腔組成物は、医薬 組成物として利用される。すなわち本発明は、インターフェロン αと薬学的に許容さ れる担体を含む、哺乳動物の歯周病の予防および治療のいずれか、または両方の ための、口腔投与用医薬組成物を提供する。本発明において、薬学的に許容される 担体とは、通常、薬剤の製剤に利用されている不活性な担体を利用することができる 以下、実施例に基づレ、て本発明をさらに具体的に説明する。

なお本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に 組み入れられる。

実施例

[0080] 〔実施例 1〕バキュロウィルス発現ィヌ IFN a 4 (BacCalFN a 4)の調製

CalFNひ遺伝子は、ィヌ細胞由来の cDNAライブラリーから、次の塩基配列からなる プライマーを用いる PCR法によって増幅した。 cDNAライブラリ一は、紫外線で不活化 したニューカッスル病ウィルス B 1株で刺激した MDCK細胞の mRNAを铸型として作製 した。

センスプライマー（配列番号： 5)：

5'-gcaggatccacgATGGCCCTGC-3' (小文字部分の ggatccは ^ i HI配列） アンチセンスプライマー（配列番号： 6)：

5 -gctggatccgtca[atgatgatgatgatgatgatgj ι，Τし C i，Cし rCし Ί ι Αし Γし ΓΤし _3 (小文字部分の ggatccは HI配列、 []内は His-Tagをコードする塩基配列）

[0081] PCR法により得られた増幅断片を pCR2.1ベクターへ TAクローユングし、大腸菌に形 質転換した。形質転換体を増殖し、菌体から調製したプラスミドを用いて挿入された c DNAの塩基配列を確認した。このとき確認された揷入断片の塩基配列と、それによつ てコードされるアミノ酸配列を図 1に示した。塩基配列を確認後、プラスミドの Bam HI 断片をバキュロウィルストランスファーベクター pAcYMl (J.Gen.Virol. 1987, 68， pl233 -1250)にリクローニングし、コトランスフエクシヨンにより組換えウィルスを作製した。得 られた組換えウィルスを昆虫細胞 Sf9に接種した。発現産物を回収し、 Niカラム法によ り精製して約 0.2 mg/mlの BacCalFNひ 4を得た。

[0082] 精製 BacCalFN α 4を SDS-PAGEにより分離し CBB染色した結果、約 27、 25、 23kDa の 3つのバンドが検出された（図 2A)。精製 BacCalFN a 4を免疫して得られた抗 BacC alFN a 4ゥサギ血清（第 1抗体）、およびホースラディッシュペルォキシダーゼ (HRP)標 識した抗ゥサギ IgGャギ血清 (第 2抗体)を用いてウェスタンブロッテイングを行った結 果、 CBB染色で検出された 3つのバンドのサイズと一致するバンドが検出された。塩 基配列から計算した推定分子量は Pre BacCalFN α 4が 22.2kDa、シグナルペプチド 領域（図 1、アミノ酸配列中二重線で囲んだ部分）を欠いた Mature BacCaIFN ct 4が 1 9.8kDaである。バキュロウィルス発現系で発現、精製した IFNタンパク質中には、 Pre 型と Mature型との違い、及び糖鎖の付加（糖鎖付加部位は図 1、アミノ酸配列中二重 下線部分、 3箇所)数の違いによって数パターンの目的 IFNタンパク質が存在すること が知られている。現在のところ具体的な検討は行っていないが、 BacCalFN α 4につ レ、ても上記のような現象が起きているために CBB染色像やウェスタンブロッテイング 像で 3本のメジャーバンドが検出されたと推定される。

[0083] 〔実施例 2〕 BacCalFN α 4の生理活性評価

〔実施例 1〕で調製した精製 BacCalFNひ 4試料を段階希釈し、 CPE抑制法 (J Vet M ed Sci. 1996， 58(1)， 23-27)により抗ウィルス活性を測定した（図 2B)。ウィルスには水 疱性口炎ウィルス（VSV)、感受性細胞としてィヌ由来 A-72細胞（ATCC CRL-1542) を用いた。具体的には、 A72細胞を増殖培地に浮遊させ、 96穴プレートに l X 10⁴/wel 1となるように撒き、 COインキュベーターで 37°C、 2日間培養した。実施例に用いた培 地の組成は次のとおりである。

維持培地： L-グルタミン、 NaHCOを添加したイーグル MEM培地

増殖培地：最終濃度 5%の FCSを加えた維持培地 [0084] 2日後、サンプノレゥエルには、維持培地で 16000倍から 4倍階段希釈した IFN α希釈 液を 100 z L/wellとなるように添加した。また、ウィルスコントロールゥエルには維持培 地のみを添加した。 COインキュベーターで 37°C、 1日間培養した。サンプルゥエル、 ウィルスコントロールゥエルに 100TCID /mLに調製した VSVを 10 μ L/well接種した。 非感染コントロールゥエルには維持培地のみ 10 x L/well添加した。 COインキュベー ターで 37°C、 3日間培養した。 IFN αを添加後 3日目に 0.5%クリスタルバイオレット染 色液を 80 z L/well添カ卩し、 UV照射下に 30分間静置した。流水洗浄、風乾後、プレー トリーダーにより各ゥエルの吸光度値（570nm)を測定した。 VSVによる A-72細胞の細 胞変性率を 50%防ぐことができる IFN試料の希釈倍数の逆数を抗ウィルス活性とした 。細胞変性率を 50%防ぐことができる IFN試料の希釈倍数については以下のように求 めた。

[0085] ウィルスコントロールゥエル、あるいは非感染コントロールゥエルにおける 570nmにお ける吸光度をそれぞれ A、 Bとした時に (A+B) /2で求められる値を 50%細胞変性の状 態における 570nmにおける吸光度とし、グラフからその吸光度に対応する希釈倍率を 求めた。ウィルスコントロールゥエル、非感染コントロールゥエルの吸光度値はそれぞ れ 0.21、 1.168だったことから、（0.21+1.168) /2 = 0.689を 50%細胞変性の状態におけ る吸光度とした。グラフから、測定した8&(^&1?^ ひ4試料の抗ゥィルス活性は1024 1 0⁴LU/mL (比活性は 5 X 10⁴LU/ μ g)だった。

[0086] 〔実施例 3〕投与試験（1 )

BacCalFN a 4をビーグル犬に微量経口投与した。実験用のィヌとしてはビーグル犬 (8-9ヶ月齢、雌、体重 9-10 kg) 5頭を用いた。一頭あたりの投与量は 2.5LUとした。投 与剤はパテ状マルトースとして、舌下に塗布した。投与剤は、マルトース 1 gに滅菌蒸 留水 390 をカロえ、 BacCalFN α 4 (2,500LU/mL) 10 μ Lを加えて調製した。投与は 5日間の連続投与とした。投与後日数としては 2、 5、および 8日まで調べた。 BacCalF Nひ 4を投与前にマルトース 1 gに滅菌蒸留水 400 μ Lを加えて調製したものを投与し た実験群を対照群とした。投与後日数としては 2、 5、 8、 12日とした。潜在的な炎症が 進行していることを示す所見として、潜血反応を調べた。潜血反応は採取した唾液を 用いて唾液検査用試験紙サリバスター（昭和薬品化工株式会社、商品名）により調 ベた。

[0087] 唾液 10 μ Lを採取し、 BHI液体培地で希釈系列を作成した。ここ力 、 10 μ Lを 7% 馬脱繊維素血液加ブルセラ ΗΚ寒天培地に接種し、嫌気培養（70%Ν 、 15%Η 、 15

2 2

%CO )を 5日間行った。歯周病原細菌である黒色集落形成細菌（BPB)数および総

2

嫌気性細菌数を調べた。すべてのィヌにおいて、実験開始前 (Pre)、マルトース投与 群（Mai)、 IFN投与群（IFN)における歯肉の炎症所見は認められなかった。図 3に示 したように IFN投与群では BPB数は有意に減少した。一方、 Mai群では変わらないか、 増えるかであった。

図 4に示したように唾液中の潜血は Mai群のィヌ 4/5 (80%)に認められた。 IFN投 与後 2日目ではこれらのィヌで唾液中の潜血は同率同レベルで認められた力 IFN投 与後 5日目では 1/5 (20%)に減少した。 IFN投与後 8および 12日目ではすべてのィ ヌで唾液中の潜血は検出できなかった。以上の結果から、 BacCalFN α 4の微量経口 投与は歯周病原細菌の抑制効果を示し、初期段階での歯肉の炎症を抑えると考え られた。

[0088] 〔実施例 4〕投与試験 (2)

BacCaIFN ct 4を歯肉炎を発症しているビーグル犬（雌、 15ヶ月齢、体重 9〜13 Kg) に微量経口投与した。投与量は体重 1 Kg当たり 0.25LUとした。 BacCaIFN a 4を当該 量含むように調製したパテ状マルトースを、 1日 1回、 7日間連続で食後にィヌ口腔内 、特に頰側の歯肉を中心に塗布した。投与剤は、マルトース 2 gに滅菌蒸留水 790 μ Lをカロえ、 BacCalFN α 4 (5,000LU/mL) 10 μ Lを加えて調製した。パテ状マルトース 1 4 mg中に 0.25LUの BacCalFNひ 4が含まれる。よって一頭のィヌへの投与量は、体重 ( kg) X 14 mg BacCalFN a 4含パテ状マルトースとなる。

[0089] IFN投与群、および対照群のィヌ、それぞれ 6頭に、次のスケジュールにしたがって 、 BacCalFNひ 4を含むパテ状マルトース、または BacCalFNひ 4を含まないパテ状マル トースをそれぞれ投与した。

IFN投与群の投与スケジュール：

(1) BacCalFNひ 4を含まないパテ状マルトースを 1日 1回食後に投与（7日間連続）；

(2) 7日間のインターバル； (3)BacCaIFNひ 4を含むパテ状マルトースを 1日 1回食後に投与（7日間連続） 対照群の投与スケジュール：

(1) BacCalFNひ 4を含まないパテ状マルトースを 1日 1回食後に投与（7日間連続）；

(2) 7日間のインターバル；

(3) BacCaIFNひ 4を含まないパテ状マルトースを 1日 1回食後に投与（7日間連続） 前記スケジュール (1)-(3)を通じて歯肉炎指数として Gingival Index (GI)をそれぞれ のィヌについて測定し、歯肉の炎症の経時的変化を調べた。結果は表 1に示す。

[表 1]

投与試験 (2) GI

MAL投与期間 MAL+IFNa投与期間 (^b)

IFNa投与群 対照群 IFNa投与群 対照群

(a)

投与前 0.470土 0.126 0.518±0.115 0.621 ±0.042 0.683 ±0.116 投与 7日後 0.510±0.091 0.563±0.111 0.452±0.078 0.744±0.113

0.040 ±0.076 0.046±0.077 -0.169±0.062 0.062±0.067

* n=6, (a)平均値土 S.D.，（b)対照群については IFNaは加えず Maltoseのみ，（c)投与前と 投与 7日後の差を表す， *：数値間の差が統計的に有意であることを示す P< 0.01, MAL:マルトース， IFN a： BacCalFN a 4

[0091] 一般的に知られているじ oeと Sillnessの方法（Acta Odont. Scand. 1963， 21 : 533-55 1)に改良点をカ卩えた以下の方法によって炎症の程度を評価した。炎症の程度は以 下の 4段階に分類し点数をつけた。

0：炎症のみられなレ、健康な歯肉；

0.5：歯肉溝に沿ってわずかな炎症がみられる歯肉；

1：歯肉溝に沿って帯状の炎症がみられる歯肉；

2 :歯肉溝全体に沿って帯状の炎症、あるいは歯肉の広範囲に炎症がみられ、且つ プロ一ビング時に出血がみられる歯肉。

[0092] 全ての歯について頰側の歯肉部分のみを検定対象とし、その合計値を検定した歯 数で割った値を GIとした。 IFN a投与群では IFN a投与開始前に 0.621 ± 0.042だった GIが投与開始後 7日後までに 0.452 ± 0.078まで減少した。 GIの減少は歯肉の炎症の 軽減を意味する。同期間の対照群の GI変化量と比較して、この減少は有意だった。 また、マルトースのみを投与した場合と比較して IFN aを投与した時の GIの減少は有 意 7こった。

したがって、 BacCalFNひ 4の微量経口投与により歯肉の炎症の程度が改善された とレ、える。この結果から、ある程度歯肉炎が進行した対象 (ィヌ）に対しても BacCalFN a 4の微量経口投与は歯肉炎を抑制するのに有効であると考えられる。微量経口投 与の期間をさらに延長することによって長期間にわたって歯肉炎の進行を予防するこ とが可能であると考えられる。

[0093] 〔実施例 5〕投与試験 (3)

BacCaIFN ct 4を歯肉炎を発症しているビーグル犬（雌、 17ヶ月齢、体重 9〜13 Kg) に微量経口投与した。投与量は体重 lKg当たり 0LU (対照群）、 0.25LU (IFN0.25群） 、 25LU (IFN25群）とした。 BacCalFN α 4を当該量含むように調製したパテ状マルトー スを、 1日 1回、 30日間連続で食後にィヌ口腔内、特に頰側の歯肉を中心に塗布した 。 IFN25群に投与する投与剤の調製はマルトース 1 gに滅菌蒸留水 395 μ Lを加え、 Β acCalFN α 4 (5 X 10⁵LU/mL) 5 μ Lをカ卩えた。パテ状マルトース 14 mg中に 25LUの Ba cCalFNひ 4が含まれる。よって一頭のィヌへの投与量は、体重 (kg) X 14 mg BacCalF N a 4含パテ状マルトースとなる。 IFN0.25群に投与する投与剤は同様に BacCalFN a 4 (5 X 10³LU/mL) 5 μ Lを加えて調製した。対照群には BacCalFN α 4を含まなレ、パテ 状マルトースを 1日 1回食後に、 30日間連続で投与した。全ての群について、 IFN投 与開始後 30日目まで、歯肉炎指数として GIを測定して、歯肉の炎症の経時的変化を 調べた。結果を表 2に示した。

[0094] [表 2] 投与試験（3) GI

一 IFNa 0.25群 IFNa 25群 対照群 投与前 0.851 ±0.088(^a) 0.802±0.111 0.813±0.090

投与 7日後

0.601 ±0.138 0.516±0.137 0.738±0.083 投与 20日後 （-0.250± 0.057) ("0.286 ±0.102) (-0.075 ±0.025)

I '

I * 1

0.548±0.143 0.500±0.167 0.722 ±0.099 投与 30日後 （- 0.304±0.062) (-0.302 ±0.079) (-0.091 ±0.036)

¹ * ¹ ' ¹ n=6, (a)平均値土 S.D.， (b)括弧内の数値は投与前との差を表す，

*:数値間の差が統計的に有意であることを示す P< 0.01, **:P< 0.05,

IFN a :BacCaIFN « 4

[0095] 〔実施例 4〕の投与試験と同様、投与期間中は暫時 GI値が減少し、対照群と比較し て有意に低い値を示した。投与量 0.25LU/Kgと 25LU/Kgでは炎症の改善に顕著な 差はみられなかった。この結果から、 BacCaIFN ct 4の微量経口投与は歯肉炎の抑制 に有効であり、微量経口投与の期間を延長することによって長期間にわたって歯肉 炎の進行を予防することが可能であるとレ、える。

産業上の利用可能性

[0096] 本発明は、動物の歯周病の予防あるいは治療に有用である。ヒトにおいては高齢 化社会の進行に伴って、歯周病の予防や治療は重要な課題となっている。ィヌゃネ コなどのペット動物、あるいは動物園で飼育されている観賞用の動物においても、飼 育環境の改善などによってヒトと同じように高齢化が進んでいる。その結果、歯周病 の予防や治療は、動物においても重要な課題となりつつある。本発明に基づく歯周 病の予防あるいは治療のための技術は、ヒトのみならず、動物においても有効である 。特に、本発明に基づく口腔組成物は、 口腔に投与することで、その効果を得ること ができる。本発明の口腔組成物は、エサなどに配合することによって、動物へも容易 に投与することができる。

Claims

請求の範囲

[I] インターフェロン αを有効成分として含む、歯周病の予防および治療の、いずれか、 または両方のための口腔投与用の,組成物。

[2] 歯周病が哺乳動物の歯周病である請求項 1に記載の組成物。

[3] 哺乳動物が、ィヌまたはネコである請求項 2に記載の組成物。

[4] 哺乳動物がヒトである請求項 2に記載の組成物。

[5] インターフェロン _αと、咀嚼性の担体を含む請求項 1に記載の組成物。

[6] 咀嚼性の担体が食品である請求項 5に記載の組成物。

[7] 咀嚼錠またはチューインガムである請求項 6に記載の組成物。

[8] インターフェロン _αと、ペースト状の担体を含む請求項 1に記載の糸且成物。

[9] 体重 lkgあたり 0. 05〜2500LU/日のインターフェロンひが配合されている請求項 1 に記載の組成物。

[10] 体重 lkgあたり 0. 1〜： 1500LU/日のインターフェロンひが配合されている請求項 8に 記載の組成物。

[I I] インターフェロンひを口腔に投与する工程を含む、哺乳動物の歯周病の予防および 治療のいずれか、または両方のための方法。

[12] インターフェロンひと、咀嚼性の担体を含む組成物を口腔に投与する工程を含む、 請求項 11に記載の方法。

[13] インターフェロンひと、ペースト状の担体を含む組成物を口腔内組織に塗布する工程 を含む、請求項 11に記載の方法。

[14] 哺乳動物が非ヒト哺乳動物である請求項 11に記載の方法。

[15] 哺乳動物が、ィヌまたはネコである請求項 14に記載の方法。

[16] 体重 lkgあたり 0. 05〜2500LU/日のインターフェロン αが投与される、請求項 11に 記載の方法。

[17] 体重 lkgあたり 0. 1〜： 1500LU/日のインターフェロン αが投与される、請求項 16に 記載の方法。

[18] インターフェロン _αと薬学的に許容される担体を含む、哺乳動物の歯周病の予防お よび治療のいずれか、または両方のための、 口腔投与用医薬組成物。 薬学的に許容される担体が、咀嚼性の担体である請求項 18に記載の医薬組成物。 薬学的に許容される担体が、ペースト状の担体である請求項 18に記載の医薬組成 物。

体重 lkgあたり 0. 05〜2500LU/日のインターフェロンひが配合されている請求項 1 8に記載の医薬組成物。

体重 lkgあたり 0. 1〜： 1500LU/日のインターフェロンひが配合されている請求項 21 に記載の医薬組成物。

体重 lkgあたり 0. 05〜2500LU/日のインターフェロン αが配合されている食品組成 物。

体重 lkgあたり 0. 1〜： 1500LU/日のインターフェロン αが配合されている請求項 23 に記載の食品組成物。

体重 lkgあたり 0. 05〜2500LU/日のインターフェロン αが配合されている飼料組成 物。

体重 lkgあたり 0. 1〜： 1500LU/日のインターフェロン αが配合されている請求項 25 に記載の飼料組成物。