KR20070086065A - 항균성을 가진 폴리펩티드 및 그것을 코딩하는폴리뉴클레오티드 - Google Patents

Abstract

본 발명은 항균성을 가진 분리된 폴리펩티드 및 그 폴리펩티드를 코딩하는 분리된 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 본 발명은 또한 폴리뉴클레오티드를 포함한 핵산 구성체, 벡터, 및 숙주 세포뿐만 아니라 그 폴리펩티드의 생산 및 사용방법에 관한 것이다.

항균성, 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 핵산 구성체.

Description

항균성을 가진 폴리펩티드 및 그것을 코딩하는 폴리뉴클레오티드{POLYPEPTIDES HAVING ANTIMICROBIAL ACTIVITY AND POLYNUCLEOTIDES ENCODING SAME}

본 발명은 항균성을 가진 분리된 폴리펩티드 및 폴리펩티드를 코딩하는 분리된 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 본 발명은 또한 폴리뉴클레오티드를 포함한 핵산 구성체, 벡터, 및 숙주 세포뿐만 아니라 폴리펩티드의 생성 및 사용 방법에 관한 것이다.

항균성을 가진 폴리펩티드 및 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공하는 것이 본 발명의 목적이다.

발명의 개요

본 발명은 다음으로 구성된 군 중에서 선택된 항균성을 가진 분리된 폴리펩티드에 관한 것이다:

(a) SEQ ID NO:2의 아미노산 1 내지 42와 적어도 60% 동일성을 가진 아미노산 서열을 가진 폴리펩티드;

(b) (i) SEQ ID NO:1의 뉴클레오티드 145 내지 270, (ii) SEQ ID NO:1의 뉴클레오티드 1 내지 270에 함유된 cDNA 서열, 또는 (iii) (i) 또는 (ii)의 상보적 서열과 적어도 중간의 엄격성 조건 하에서 혼성화하는 뉴클레오티드 서열에 의하여 코딩되는 폴리펩티드; 및

(c) SEQ ID NO:2의 아미노산 1 내지 42 중 하나 이상의 아미노산의 보존적 치환, 결실 및/또는 삽입을 포함한 변이체.

본 발명은 또한 다음으로 구성된 군 중에서 선택된 항균성을 가진 분리된 폴리펩티드를 코딩하는 분리된 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다:

(a) SEQ ID NO:2의 아미노산 1 내지 42와 적어도 60%의 동일성을 가진 아미노산 서열을 가진 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드;

(b) SEQ ID NO:1의 뉴클레오티드 145 내지 270과 적어도 60%의 동일성을 가진 폴리뉴클레오티드; 및

(c) (i) SEQ ID NO:1의 뉴클레오티드 145 내지 270, (ii) SEQ ID NO:1의 뉴클레오티드 1 내지 270에 함유된 cDNA 서열, 또는 (iii) (i) 또는 (ii)의 상보적 가닥과 적어도 중간의 엄격성 조건 하에서 혼성화하는 폴리뉴클레오티드.

본 발명은 또한 폴리뉴클레오티드를 포함한 핵산 구성체, 재조합 발현 벡터, 및 재조합 숙주 세포에 관한 것이다.

본 발명은 또한 폴리펩티드의 생성을 유도하는 조건 하에서 폴리펩티드를 코딩하는 폴리펩티드를 포함한 핵산 구성체를 포함한 재조합 숙주세포를 배양하는 단계; 및 (b) 폴리펩티드를 회수하는 단계를 포함하는 항균성을 가진 이러한 폴리펩티드를 생성하는 방법에 관한 것이다.

본 발명은 또한 본 발명의 폴리펩티드 및 폴리뉴클레오티드의 사용방법에 관한 것이다.

정의

항균성: 용어 "항균성"은 미생물 세포를 죽이거나 그 성장을 억제할 수 있는 활성으로 본원에 정의된다. 본 발명의 문맥에서, 용어 "항균"은 살균 및/또는 정균 및/또는 살진균 및/또는 정진균 효과 및/또는 바이러스살균 효과가 있다는 것을 의미하도록 의도되며, 여기서 용어 "살균"은 박테리아 세포를 죽일 수 있는 것으로 이해된다. 용어 "정균"은 박테리아의 성장을 억제, 즉 박테리아 세포의 성장을 억제할 수 있는 것으로 이해된다. 용어 "살진균"은 진균 세포를 죽일 수 있는 것으로 이해된다. 용어 "정진균"은 진균 성장을 억제, 즉 진균 세포의 성장을 억제할 수 있는 것으로 이해된다. 용어 "바이러스 살균"은 바이러스를 비활성화할 수 있는 것으로 이해된다. 용어 "미생물 세포"는 박테리아 또는 진균 세포(효모 포함)를 나타낸다.

본 발명의 문맥에서, 용어 "미생물 세포의 성장의 억제"는 세포가 비-성장 상태에 있고, 즉 그것이 증식할 수 없다는 것을 의미하도록 의도된다.

본 발명의 목적을 위해서, 항균성은 문헌(Lehrer et al., Journal of Immunological Methods, Vol. 137 (2) pp. 167-174 (1991))에 설명된 과정에 따라서 결정될 수 있다. 대안적으로, 항균성은 CLSI (이전에 National Committee for Clinical and Laboratory Standards으로 알려진 Clinical and Laboratory Standards Institute)의 NCCLS 지침서에 따라서 결정될 수 있다.

항균성을 가진 폴리펩티드는 항균성을 가진 폴리펩티드의 25%(w/w)의 수용액에서, 바람직하게는 10%(w/w)의 수용액에서, 더 바람직하게는 5%(w/w)의 수용액에서, 보다 더 바람직하게는 1%(w/w)의 수용액에서, 가장 바람직하게는 0.5%(w/w)의 수용액에서, 그리고 특히 0.1%(w/w)의 수용액에서 20℃에서 인큐베이션한 지 8시간 후(바람직하게는 4 시간 후, 더 바람직하게는 2 시간 후, 가장 바람직하게는 1 시간 후, 그리고 특히 30분 후) 대장균(Escherichia coli(DSM 1576))의 살아있는 세포의 수를 1/100로 감소시킬 수 있다.

항균성을 가진 폴리펩티드는 또한 1000 ppm의 농도로 첨가될 때, 바람직하게는 500 ppm의 농도로 첨가될 때, 더 바람직하게는 250 ppm의 농도로 첨가될 때, 보다 더 바람직하게는 100 ppm의 농도로 첨가될 때, 가장 바람직하게는 50 ppm의 농도로 첨가될 때, 그리고 특히 25 ppm의 농도로 첨가될 때 미생물 성장 기질에서 25℃에 24 시간 동안 대장균(DSM 1576)의 생성물을 억제할 수 있다.

항균성을 가진 폴리펩티드는 항균성을 가진 폴리펩티드의 25%(w/w)의 수용액에서, 바람직하게는 10%(w/w)의 수용액에서, 더 바람직하게는 5%(w/w)의 수용액에서, 보다 더 바람직하게는 1%(w/w)의 수용액에서, 가장 바람직하게는 0.5%(w/w)의 수용액에서, 그리고 특히 0.1%(w/w)의 수용액에서 20℃에서 인큐베이션한 지 8시간 후(바람직하게는 4 시간 후, 더 바람직하게는 2 시간 후, 가장 바람직하게는 1 시간 후, 그리고 특히 30분 후) 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis(ATCC 6633))의 살아있는 세포의 수를 1/100로 감소시킬 수 있다.

항균성을 가진 폴리펩티드는 또한 1000 ppm의 농도로 첨가될 때, 바람직하게는 500 ppm의 농도로 첨가될 때, 더 바람직하게는 250 ppm의 농도로 첨가될 때, 보다 더 바람직하게는 100 ppm의 농도로 첨가될 때, 가장 바람직하게는 50 ppm의 농도로 첨가될 때, 그리고 특히 25 ppm의 농도로 첨가될 때 미생물 성장 기질에서 25℃에 24 시간 동안 바실러스 서브틸리스(ATCC 6633)의 생성물을 억제할 수 있다.

본 발명의 폴리펩티드는 SEQ ID NO:2의 아미노산 1 내지 42로 나타낸 아미노산 서열로 구성된 폴리펩티드의 항균성의 적어도 20%, 바람직하게는 적어도 40%, 더 바람직하게는 적어도 50%, 더 바람직하게는 적어도 60%, 더 바람직하게는 적어도 70%, 더 바람직하게는 적어도 80%, 보다 더 바람직하게는 적어도 90%, 가장 바람직하게는 적어도 95%, 그리고 보다 가장 바람직하게는 적어도 100%를 가진다.

방어소: 본원에 사용된 용어 "방어소"는 항미생물 펩티드의 방어소 부류에 속하는 당업자에 의하여 인식된 폴리펩티드를 말한다. 폴리펩티드가 본 발명에 따른 방어소인지를 결정하기 위하여, 아미노산 서열은 바람직하게는 자유롭게 사용가능한 HMMER 소프트웨어 패키지를 사용함으로써 PFAM 데이터베이스의 숨겨진 마르코프 모델 프로파일(HMM 프로파일)과 비교된다(실시예 6 참조).

PFAM 방어소 패밀리는 방어소_1 또는 "포유동물 방어소"(승인번호 PF00323), 방어소_2 또는 "절지동물 방어소"(승인번호 PF01097), 방어소_베타 또는 "베타 방어소"(승인번호 PF00711), 방어소_프로프렙 또는 "방어소 프로펩티드"(승인번호 PF00879) 및 감마-티오닌 또는 "감마-티오닌 패밀리"(승인번호 PF00304)를 포함한다.

방어소는 알파-방어소 부류, 베타-방어소 부류, 세타-방어소 부류, 곤충(절지동물) 방어소 부류, 식물 방어소 부류, 홍합 방어소 부류, 또는 아미노산 서열이 6 또는 8 시스테인을 포함하고 앞서 언급한 방어소 부류 중 어떤 것과 구조적으로 유사한 다른 방어소 부류에 속할 수 있다. 방어소는 또한 방어소 부류 중 어떤 것의 특징적인 특성을 공유하는 합성 방어소일 수 있다.

이러한 방어소의 예는, 한정하는 것은 아니지만, α-방어소 HNP-1(사람 중성구 펩티드) HNP-2 및 HNP-3; β-방어소-12, 드로소미신, 헬리오미신, γ1-퓨로티오닌, 곤충 방어소 A, 및 PCT 출원 WO 99/53053, WO 02/085934 및 WO 03/044049에 개시된 방어소를 포함한다.

분리된 폴리펩티드: 본원에 사용된 용어 "분리된 폴리펩티드"는 SDS-PAGE로 결정할 때, 적어도 20% 순수한, 바람직하게는 40% 순수한, 더 바람직하게는 적어도 60% 순수한, 보다 더 바람직하게는 적어도 80% 순수한, 가장 바람직하게는 적어도 90% 순수한, 그리고 보다 가장 바람직하게는 적어도 95% 순수한 폴리펩티드를 말한다.

실질적으로 순수한 폴리펩티드: 용어 "실질적으로 순수한 폴리펩티드"는 본원에서 그것이 본래 결합한 다른 폴리펩티드 물질의 최대 10 중량%, 바람직하게는 최대 8 중량%, 더 바람직하게는 최대 6 중량%, 더 바람직하게는 최대 5 중량%, 더 바람직하게는 최대 4 중량%, 최대 3 중량%, 보다 더 바람직하게는 최대 2 중량%, 가장 바람직하게는 최대 1 중량% 그리고 보다 가장 바람직하게는 최대 0.5 중량%를 함유한 폴리펩티드 제제를 나타낸다. 따라서, 실질적으로 순수한 폴리펩티드는 제제에 존재하는 전체 폴리펩티드 물질의 적어도 92 중량% 순수한, 바람직하게는 적어도 94 중량% 순수한, 더 바람직하게는 적어도 96 중량% 순수한, 더 바람직하게는 적어도 97 중량% 순수한, 더 바람직하게는 적어도 98 중량% 순수한, 보다 더 바람직하게는 적어도 99 중량% 순수한, 가장 바람직하게는 적어도 99.5 중량% 순수한 그리고 가장 바람직하게는 100 중량% 순수한 것이 바람직하다.

본 발명의 폴리펩티드는 실질적으로 순수한 형태인 것이 바람직하다. 특히, 폴리펩티드는 "실질적으로 순수한 형태", 즉 폴리펩티드 제제는 그것이 본래 결합하는 다른 폴리펩티드가 실질적으로 제거되는 것이 바람직하다. 이것은 예를 들면 잘 알려진 재조합 방법 또는 고전적인 정제 방법에 의하여 폴리펩티드를 제조함으로써 이루어질 수 있다.

본원에서, 용어 "실질적으로 순수한 폴리펩티드"는 용어 "분리된 폴리펩티드" 및 "분리된 형태의 폴리펩티드"와 동의어이다.

동일성: 두 아미노산 서열 간 또는 두 뉴클레오티드 서열 간의 연관성은 매개변수 "동일성"으로 설명된다.

본 발명의 목적을 위해서, 두 아미노산 서열 간의 동일성의 정도는 FASTA 프로그램 패키지의 2.0x 버전에 포함된 프로그램 FASTA를 사용하여 결정할 수 있다(W. R. Pearson and D. J. Lipman (1988), "Improved Tools for Biological Sequence Analysis", PNAS 85:2444-2448; 및 W. R. Pearson (1990) "Rapid and Sensitive Sequnece Comparison with FASTP and FASTA", Methods in Enzymology 183:63-98 참조). 사용된 기록 매트릭스는 BLOSUM50이고, 갭 벌점은 -12이며, 갭 연장 벌점은 -2였다.

두 뉴클레오티드 서열 간의 동일성의 정도는 전술한 바와 같이 동일한 알고리즘 및 소프트웨어 패키지를 사용하여 결정된다. 사용된 기록 매트릭스는 동일성 매트릭스이고, 갭 벌점은 -16이며, 갭 연장 벌점은 -4였다.

대안적으로, 두 아미노산 서열의 정렬은 EMBOSS 패키지 (http://emboss.org) 버전 2.8.0의 니들 프로그램을 사용하여 결정된다. 니들 프로그램은 문헌(Needleman, S. B. and Wunsch, C. D. (1970) J. MoI. Biol. 48, 443-453)에 설명된 글로벌 정렬 알고리즘을 실행한다. 사용된 치환 매트릭스는 BLOSUM62이고, 갭 오프닝 벌점은 10이며, 갭 연장 벌점은 0.5이다.

본 발명의 아미노산 서열("발명 서열"; 예를 들면 SEQ ID NO:2의 아미노산 1 내지 42)과 다른 아미노산 서열("외래 서열") 간의 동일성의 정도는 두 서열의 정렬에서 정확하게 일치된 것의 수를 가장 짧은 것이 어떤 것이든지 "발명 서열"의 길이 또는 "왜래 서열"의 길이로 나누어 계산한다. 결과는 동일성 퍼센트로 표현된다.

정확한 일치는 "발명 서열"과 "외래 서열"이 오버랩의 동일한 위치에서 동일한 아미노산 잔기를 가질 때 발생한다(하기 정렬 예에서 이것은 "｜"로 나타낸다). 서열의 길이는 서열의 아미노산 잔기의 수이다(예를 들면, SEQ ID NO:2의 아미노산 1 내지 42의 길이는 42이다).

하기 정렬 예에서, 오버랩은 서열 1의 아미노산 서열 "HTWGER-NL"; 또는 서열 2의 아미노산 서열 "HGWGEDANL"이다. 예에서, 갭은 "-"로 표시된다.

정렬 예

폴리펩티드 단편: 용어 "폴리펩티드 단편"은 SEQ ID NO:2의 아미노 및/또는 카르복시 말단 또는 그것의 상동 서열에서 결실된 하나 이상의 아미노산을 가진 폴리펩티드로 본원에 정의되며, 이 단편은 항균성을 가진다. 바람직하게는, 본 발명의 폴리펩티드 단편은 모두 시스테인 잔기 및 시스테인 잔기 사이의 아미노산 잔기를 보유한다.

서브서열: 용어 "서브서열"은 SEQ ID NO:1의 5' 및/또는 3' 말단에서 결실된 하나 이상의 뉴클레오티드를 가진 뉴클레오티드 서열로 본원에 정의되며, 그 서브서열은 항균성을 가진 폴리펩티드 단편을 코딩한다.

대립유전자 변이체: 용어 "대립유전자 변이체"는 본원에서 동일한 염색체의 유전자좌를 차지하는 유전자의 두 개 이상의 대안 형태 중 어떤 것을 나타낸다. 대립유전자 변이는 돌연변이를 통하여 자연적으로 발생하며, 집단 내에 다형성을 야기할 수 있다. 유전자 변이는 침묵할 수 있거나(코딩된 폴리펩티드에 변화 없음) 변경된 아미노산 서열을 가진 폴리펩티드를 코딩할 수 있다. 폴리펩티드의 대립유전자 변이체는 유전자의 대립유전자 변이체에 의하여 코딩된 폴리펩티드이다.

실질적으로 순수한 폴리뉴클레오티드: 본원에 사용된 용어 "실질적으로 순수한 폴리뉴클레오티드"는 다른 외래의 또는 원하지 않는 뉴클레오티드가 없고 유전학적으로 조작된 단백질 생산 시스템에서 사용하기에 적합한 형태인 폴리뉴클레오티드 제제를 말한다. 따라서, 실질적으로 순수한 폴리뉴클레오티드는 그것이 본래 결합하는 다른 폴리펩티드 물질의 최대 10 중량%, 바람직하게는 최대 8 중량%, 더 바람직하게는 최대 6 중량%, 더 바람직하게는 최대 5 중량%, 더 바람직하게는 최대 4 중량%, 더 바람직하게는 최대 3 중량%, 보다 더 바람직하게는 최대 2 중량%, 가장 바람직하게는 최대 1 중량% 그리고 보다 가장 바람직하게는 최대 0.5 중량%를 함유한다. 그러나, 실질적으로 순수한 폴리뉴클레오티드는 자연적으로 발생하는 5' 및 3' 미번역 영역, 예를 들면 프로모터 및 종결자를 포함할 수 있다. 실질적으로 순수한 폴리뉴클레오티드는 적어도 90% 순수한, 바람직하게는 적어도 92 중량% 순수한, 더 바람직하게는 적어도 94 중량% 순수한, 더 바람직하게는 적어도 96 중량% 순수한, 더 바람직하게는 적어도 97 중량% 순수한, 보다 더 바람직하게는 적어도 98 중량% 순수한, 가장 바람직하게는 적어도 99 중량% 순수한 그리고 보다 가장 바람직하게는 적어도 99.5 중량% 순수한 것이 바람직하다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 바람직하게는 실질적으로 순수한 형태이다. 특히, 본원에 개시된 폴리뉴클레오티드는 "실질적으로 순수한 형태", 즉, 폴리뉴클레오티드 제제는 그것이 본래 결합하는 다른 폴리뉴클레오티드 물질이 실질적으로 제거되는 것이 바람직하다. 본원에서, 용어 "실질적으로 순수한 폴리뉴클레오티드"는 용어 "분리된 폴리뉴클레오티드" 및 "분리된 형태의 폴리뉴클레오티드"와 동의어이다. 폴리뉴클레오티드는 유전체, cDNA, RNA, 반합성, 합성 기원, 또는 그것들의 어떤 조합일 수 있다.

cDNA: 용어 "cDNA"는 진핵세포로부터 얻어진 성숙한 스플라이싱된 mRNA 분자로부터 역전사에 의하여 제조될 수 있다. cDNA는 대응되는 유전체 DNA에 대개 존재하는 인트론 서열이 결핍되어 있다. 초기, 1차 RNA 전사체는 성숙한 스플라이싱된 mRNA로 나타나기 전에 일련의 단계를 거쳐 가공된 mRNA의 전구체이다. 이들 단계는 스플라이싱이라 불리는 과정에 의하여 인트론 서열의 제거를 포함한다. 따라서, mRNA에서 유래된 cDNA는 어떤 인트론 서열이 결핍되어 있다.

핵산 구성체: 본원에 사용된 용어 "핵산 구성체"는 자연적으로 발생하는 유전자로부터 분리되거나 그렇지 않으면 자연 상태에 존재하지 않는 방식으로 핵산의 부분을 함유하도록 변형된 단일- 또는 이중-가닥의 핵산 분자를 말한다. 용어 핵산 구성체는 핵산 구성체가 본 발명의 코딩 서열의 발현에 필요한 조절 서열을 함유할 때 용어 "발현 카세트"와 동의어이다.

조절 서열: 용어 "조절 서열"은 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 발현에 필요하거나 이로운 모든 성분을 포함하는 것으로 본원에서 정의된다. 각 조절 서열은 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 대하여 천연 또는 외래일 수 있다. 이러한 조절 서열은, 한정하는 것은 아니지만, 리더, 폴리아데닐화 서열, 프로펩티드 서열, 프로모터, 신호 펩티드 서열, 및 전사 종결자를 포함한다. 최소한, 조절 서열은 프로모터 및 전사와 번역의 종결 신호를 포함한다. 조절 서열은 조절 서열과 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 코딩 영역의 리게이션을 촉진하는 특정 제한효소 부위를 도입하는 목적을 위하여 링커로 제공될 수 있다.

작동가능하게 연결된: 용어 "작동가능하게 연결된"이라는 것은 본원에서 조절 서열이 폴리펩티드의 코딩 서열의 발현을 유도하도록 조절 서열이 폴리뉴클레오티드 서열의 코딩 서열에 대해서 적합한 위치에 배치된 형상을 나타낸다.

코딩 서열: 본원에 사용된 용어 "코딩 서열"은 그것의 단백질 산물의 아미노산 서열을 직접적으로 특정하는 뉴클레오티드 서열을 의미한다. 코딩 서열의 경계는 일반적으로 오픈 리딩 프레임으로 결정되며, 대개 ATG 개시 코돈 또는 GTG 및 TTG와 같은 대안적 개시 코돈으로 시작한다. 코딩 서열은 DNA, cDNA, 또는 재조합 뉴클레오티드 서열일 수 있다.

발현: 용어 "발현"은, 한정하는 것은 아니지만, 전사, 전사후 변형, 번역, 번역후 변형 및 분비를 포함한 폴리펩티드의 생성과 관련된 어떤 단계를 포함한다.

발현 벡터: 용어 "발현 벡터"는 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고 그것의 발현을 제공하는 추가 뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된 선형 또는 고리형 DNA 분자로 본원에 정의된다.

숙주 세포: 본원에 사용된 용어 "숙주 세포"는 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함한 핵산 구성체로 형질전환, 트랜스팩션, 형질도입하기에 적합한 어떤 세포 유형을 포함한다.

변형: 용어 "변형"은 본원에서 폴리펩티드를 코딩하는 DNA의 유전적 조작뿐만 아니라 SEQ ID NO:2의 아미노산 1 내지 42로 구성된 폴리펩티드의 어떤 화학적 변형을 의미한다. 변형(들)은 아미노산 측쇄(들)의 대체(들)뿐만 아니라 아미노산(들)의 치환(들), 결실(들) 및/또는 삽입(들)이거나 아미노산 서열에서 유사한 특성을 가진 비자연적 핵산의 사용일 수 있다. 특히, 변형(들)은 C-말단의 아미드화와 같은 아미드화일 수 있다.

인공 변이체: 본원에 사용된 용어 "인공 변이체"는 SEQ ID NO:1의 변형된 뉴클레오티드 서열을 발현하는 개체에 의하여 생성된 항균성을 가진 폴리펩티드를 의미한다. 변형된 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO:1에 개시된 뉴클레오티드 서열의 변형에 의하여 사람 개입을 통하여 얻어진다.

발명의 상세한 설명

항균성을 가진 폴리펩티드

첫 번째 양태에서, 본 발명은 항균성을 가진 적어도 60%, 바람직하게는 적어도 65%, 더 바람직하게는 적어도 70%, 더 바람직하게는 적어도 75%, 더 바람직하게는 적어도 80%, 더 바람직하게는 적어도 85%, 보다 더 바람직하게는 적어도 90%, 가장 바람직하게는 적어도 95%, 그리고 보다 가장 바람직하게는 적어도 97%의 SEQ ID NO:2의 아미노산 1 내지 42에 대한 동일성의 정도를 가진 아미노산 서열을 가진 분리된 폴리펩티드(즉, 성숙한 폴리펩티드)에 관한 것이다(이후부터 "상동 폴리펩티드"). 바람직한 양태에서, 상동 폴리펩티드는 SEQ ID NO:2의 아미노산 1 내지 42와 10 아미노산, 바람직하게는 5 아미노산, 더 바람직하게는 4 아미노산, 보다 더 바람직하게는 3 아미노산, 가장 바람직하게는 2 아미노산, 그리고 보다 가장 바람직하게는 1 아미노산의 차이가 있는 아미노산 서열을 가진다.

본 발명의 폴리펩티드는 바람직하게는 SEQ ID NO:2의 아미노산 서열 또는 그것의 대립유전자 변이체, 또는 항균성을 가진 그것의 단편을 포함한다. 바람직한 양태에서, 폴리펩티드는 SEQ ID NO:2의 아미노산 서열을 포함한다. 다른 바람직한 양태에서, 폴리펩티드는 SEQ ID NO:2의 아미노산 1 내지 42, 또는 그것의 대립유전자 변이체, 또는 항균성을 가진 그것의 단편을 포함한다. 다른 바람직한 양태에서, 폴리펩티드는 SEQ ID NO:2의 아미노산 1 내지 42를 포함한다. 다른 바람직한 양태에서, 폴리펩티드는 SEQ ID NO:2의 아미노산 서열 또는 그것의 대립유전자 변이체, 또는 항균성을 가진 그것의 단편으로 구성된다. 다른 바람직한 양태에서, 폴리펩티드는 SEQ ID NO:2의 아미노산 서열로 구성된다. 다른 바람직한 양태에서, 폴리펩티드는 SEQ ID NO:2의 아미노산 1 내지 42 또는 그것의 대립유전자 변이체, 또는 항균성을 가진 그것의 단편으로 구성된다. 다른 바람직한 구체예에서, 폴리펩티드는 SEQ ID NO:2의 아미노산 1 내지 42로 구성된다.

두 번째 양태에서, 본 발명은 매우 낮은 엄격성 조건, 바람직하게는 낮은 엄격성 조건, 더 바람직하게는 중간 엄격성 조건, 더 바람직하게는 중간-높은 엄격성 조건, 보다 더 바람직하게는 높은 엄격성 조건, 그리고 가장 바람직하게는 매우 높은 엄격성 조건 하에서 (i) SEQ ID NO:1의 뉴클레오티드 145 내지 270, (ii) SEQ ID NO:1의 뉴클레오티드 1 내지 270에 함유된 cDNA 서열, (iii) (i) 또는 (ii)의 서브서열, 또는 (i), (ii) 또는 (iii)의 상보적 가닥과 혼성화하는 폴리뉴클레오티드에 의하여 코딩되는 항균성을 가진 분리된 폴리펩티드에 관한 것이다(J. Sambrook, E.F. Fritsch, 및 T. Maniatus, 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2판, Cold Spring Harbor, New York). SEQ ID NO:1의 서브서열은 적어도 100 인접 뉴클레오티드 또는 바람직하게는 적어도 200 인접 뉴클레오티드를 함유한다. 더욱이, 서브서열은 항균성을 가진 폴리펩티드 단편을 코딩할 수 있다.

SEQ ID NO:1의 뉴클레오티드 서열 또는 그것의 서브서열뿐만 아니라 SEQ ID NO:2의 아미노산 서열 또는 그것의 단편은 당업계에 주지된 방법에 따라서 다른 속과 종의 균주로부터 항균성을 가진 폴리펩티드를 코딩하는 DNA를 동정하고 클로닝하는 핵산 프로브를 설계하는 데 사용될 수 있다. 특히, 이러한 프로브는 거기에 대응되는 유전자를 동정하고 분리하기 위하여 관심있는 속과 종의 유전체 또는 cDNA와의 혼성화와 이어서 표준 서던 블롯팅 과정에 사용될 수 있다. 이러한 프로브는 전체 서열보다 상당히 더 짧을 수 있지만, 길이가 적어도 14, 바람직하게는 적어도 25, 더 바람직하게는 적어도 35, 그리고 가장 바람직하게는 적어도 70 뉴클레오티드이어야 한다. 그러나, 핵산 프로브는 길이가 적어도 100 뉴클레오티드인 것이 바람직하다. 예를 들면 핵산 프로브는 적어도 200 뉴클레오티드, 바람직하게는 적어도 270 뉴클레오티드일 수 있다. DNA와 RNA 프로브 모두 사용될 수 있다. 프로브는 전형적으로 대응되는 유전자를 검출하기 위하여 표지된다(예를 들면, ³²P, ³H, ³⁵S, 비오틴, 또는 아비딘으로). 이러한 프로브는 본 발명에 포함된다.

따라서, 이러한 다른 생물로부터 제조된 유전체 DNA 또는 cDNA 라이브러리를 전술한 프로브와 혼성화하고 항균성을 가진 폴리펩티드를 코딩하는 DNA에 대하여 스크린할 수 있다. 이러한 다른 생물의 유전체 또는 다른 DNA는 아가로스 또는 폴리아크릴아미드 겔 전기영동, 또는 다른 분리 기술에 의하여 분리될 수 있다. 라이브러리의 DNA 또는 분리된 DNA를 니트로셀룰로스 또는 다른 적합한 담체 물질에 옮겨 고정할 수 있다. SEQ ID NO:1 또는 그것의 서브서열과 상동인 클론 또는 DNA를 동정하기 위하여, 담체 물질을 서던 블롯에 사용한다.

본 발명의 목적을 위하여, 혼성화란 뉴클레오티드 서열이 매우 낮은 엄격성 조건 내지 매우 높은 엄격성 조건 하에서 SEQ ID NO:1에 나타난 뉴클레오티드 서열, 그것의 상보적 가닥, 또는 그것의 서브서열에 대응되는 표지된 핵산 프로브에 혼성화한다는 것을 나타낸다. 이들 조건 하에서 핵산 프로브가 혼성화하는 분자는 X선 필름을 사용하여 검출될 수 있다.

바람직한 양태에서, 핵산 프로브는 SEQ ID NO:2 또는 그것의 서브서열의 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열이다. 다른 바람직한 양태에서, 핵산 프로브는 SEQ ID NO:1이다. 다른 바람직한 양태에서, 핵산 프로브는 SEQ ID NO:1의 성숙한 폴리펩티드 코딩 영역이다.

길이가 적어도 100 뉴클레오티드의 긴 프로브의 경우, 매우 낮은 내지 매우 높은 엄격성 조건은 42℃ 5X SSPE, 0.3% SDS, 200 ug/ml 절단되고 변성된 연어 정자 DNA, 그리고 매우 낮은 및 낮은 엄격성의 경우 25% 포름아미드, 중간 및 중간-높은 엄격성의 경우 35% 포름아미드, 또는 높은 및 매우 높은 엄격성의 경우 50% 포름아미드에서 예비혼성화 및 혼성화와 이어서 선택적으로 12 내지 24 시간 동안 표준 서던 블롯팅 과정으로 정의된다.

길이가 적어도 100 뉴클레오티드의 긴 프로브의 경우, 담체 물질은 바람직하게는 적어도 45℃(매우 낮은 엄격성), 더 바람직하게는 적어도 50℃(낮은 엄격성), 더 바람직하게는 적어도 55℃(중간 엄격성), 더 바람직하게는 적어도 60℃(중간-높은 엄격성), 보다 더 바람직하게는 적어도 65℃(높은 엄격성), 그리고 가장 바람직하게는 적어도 70℃(매우 높은 엄격성)에서 2X SSC, 0.2% SDS를 사용하여 각각 15분 동안 3회 마지막으로 세척된다.

길이가 약 15 뉴클레오티드 내지 약 70 뉴클레오티드인 짧은 프로브의 경우, 엄격성 조건은 0.9 M NaCl, 0.09 M Tris-HCl pH 7.6, 6 mM EDTA, 0.5% NP-40, 1X 덴하트 용액, 1 mM 피로인산나트륨, 1 mM 모노염기인산나트륨, 0.1 mM ATP, 및 ml 당 0.2 mg의 효모 RNA에서 Bolton 및 McCarthy(1962, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 48:1390)에 따른 계산법을 사용하여 계산된 T_m 이하의 약 5℃ 내지 약 10℃에서 예비혼성화, 혼성화, 및 혼성화 후 세척과 이어서 표준 서던 블롯 과정으로 정의된다.

길이가 약 15 뉴클레오티드 내지 약 70 뉴클레오티드인 짧은 프로브의 경우, 담체 물질을 계산된 T_m 이하의 5℃ 내지 10℃에서 6X SCC + 0.1% SDS에서 15분 동안 1 회 그리고 6X SSC를 사용하여 15분 동안 각각 2회 세척한다.

세 번째 양태에서, 본 발명은 SEQ ID NO:2 또는 그것의 성숙한 폴리펩티드 중 하나 이상의 아미노산의 보존적 치환, 결실, 및/또는 삽입을 포함한 인공 변이체에 관한 것이다. 바람직하게는, 아미노산 변화, 즉 단백질의 접힘 및/또는 활성에 현저하게 영향을 주지 않는 보존적 아미노산 치환 또는 삽입; 전형적으로 1 내지 약 30 아미노산의 작은 결실; 아미노-말단 메티오닌 잔기와 같은 작은 아미노- 또는 카르복실-말단 연장; 약 20-25 잔기의 작은 링커 펩티드; 또는 폴리-히스티딘계, 항원성 에피토프 또는 결합 도메인과 같은 전체 전하 또는 다른 기능을 변화시킴으로써 정제를 촉진하는 작은 연장은 부수적인 성질이다.

보존적 치환의 예는 염기성 아미노산(아르기닌, 리신 및 히스티딘), 산성 아미노산(글루탐산 및 아스파르트산), 극성 아미노산(글루타민 및 아스파라긴), 소수성 아미노산(류신, 이소류신 및 발린), 방향성 아미노산(페닐알라닌, 트립토판 및 티로신), 및 작은 아미노산(글리신, 알라닌, 세린, 트레오닌 및 메티오닌)의 그룹 내에 있다. 일반적으로 특정 활성을 변경하지 않는 아미노산 치환은 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들면 문헌(H. Neurath and R.L. Hill, 1979, In , The Proteins, Academic Press, New York)에 설명된다. 가장 흔하게 발생하는 변환은 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, 및 Asp/Gly이다.

20 표준 아미노산뿐만 아니라, 비-표준 아미노산(예를 들면, 4-히드록시프롤린, 6-N-메틸 리신, 2-아미노이소부틸산, 이소발린, 및 알파-메틸 세린)도 야생형 폴리펩티드의 아미노산 잔기를 치환할 수 있다. 제한된 수의 비-보존적 아미노산, 유전암호로 코딩되지 않는 아미노산, 및 비자연적 아미노산은 아미노산 잔기를 치환할 수 있다. "비자연적 아미노산"은 단백질 합성 후 변형되었고/거나 표준 아미노산의 측쇄와 상이한 그것들의 측쇄(들)에 화학 구조를 가진다. 비자연적 아미노산은 화학적으로 합성되고, 바람직하게는 상업적으로 구입가능하며, 피페콜린산, 티아졸리딘 카르복시산, 디히드로프롤린, 3- 및 4-메틸프롤린, 및 3,3-디메틸프롤린을 포함한다.

대안적으로, 아미노산 변화는 매우 자연적이어서 폴리펩티드의 물리화학적 특성이 변경된다. 예를 들면, 아미노산 변화는 폴리펩티드의 열 안정성을 개선하고, 기질 특이성을 변경하고, 최적 pH 등을 변화시킬 수 있다.

모 폴리펩티드에서의 필수 아미노산은 위치지정 돌연변이유발 또는 알라닌-스캐닝 돌연변이유발(Cunningham and Wells, 1989, Science 244: 1081-1085)과 같은 당업계에 공지된 과정에 따라서 확인될 수 있다. 후자의 기술의 경우, 단일 알라닌 돌연변이를 분자의 모든 잔기에 도입하되, 결과로 생성된 돌연변이 분자를 분자의 활성에 결정적인 아미노산 잔기를 확인하기 위하여 생물학적 활성(즉, 항균성)에 대하여 시험한다. 또한, 문헌(Hilton et al., 1996, J. Biol. Chem. 271: 4699-4708)을 참조하라. 또한, 효소의 활성 부위 또는 다른 생물학적 상호작용은 후보 접촉 부위 아미노산의 돌연변이와 연계하여 핵자기공명, 결정학, 전자회절, 또는 광친화성 표지와 같은 기술로 결정된 구조의 물리적 분석에 의하여 결정될 수 있다. 예를 들면, 문헌(de Vos et al., 1992, Science 255: 306-312; Smith et al., 1992, J. MoI. Biol. 224: 899-904; Wlodaver et al., 1992, FEBS Lett. 309:59-64)을 참조하라. 또한, 필수아미노산의 동일성은 본 발명에 따른 폴리펩티드와 관련된 폴리펩티드와의 동일성 분석으로부터 추측될 수 있다.

돌연변이유발, 재조합, 및/또는 셔플링과 이어서 문헌(Reidhaar-Olson and Sauer, 1988, Science 241: 53-57; Bowie and Sauer, 1989, Proc. Natl. Acad. ScL USA 86: 2152-2156; WO 95/17413; 또는 WO 95/22625)에 개시된 것들과 같은 관련 스크리닝 과정의 공지된 방법을 사용하여 단일 또는 다중 아미노산 치환을 이루고 시험할 수 있다. 사용될 수 있는 다른 방법은 오류-취약 PCR, 파지 디스플레이(예를 들면, Lowman et al., 1991 , Biochem. 30:10832-10837; U.S. Patent No. 5,223,409; WO 92/06204), 및 영역지정 돌연변이(Derbyshire et al., 1986, Gene 46:145; Ner et al., 1988, DNA 7:127)을 포함한다.

돌연변이유발/셔플링 방법은 숙주세포에 의하여 발현된 클로닝된, 돌연변이가 일어난 폴리펩티드의 활성을 검출하기 위하여 고처리율, 자동화 스크리닝 방법과 조합될 수 있다. 활성 폴리펩티드를 코딩하는 돌연변이가 일어난 DNA 분자는 숙주세포로부터 회수될 수 있고 당업계의 표준 방법을 사용하여 신속하게 시퀀싱될 수 있다. 이들 방법은 관심있는 폴리펩티드에서 각각의 아미노산 잔기의 중요성을 신속하게 결정하게 해주며, 미지의 구조의 폴리펩티드에 적용될 수 있다.

SEQ ID NO:2의 아미노산 1 내지 42의 아미노산 치환, 결실 및/또는 삽입의 전체수는 10, 바람직하게는 9, 더 바람직하게는 7, 더 바람직하게는 최대 6, 더 바람직하게는 최대 5, 더 바람직하게는 4, 보다 더 바람직하게는 3, 가장 바람직하게는 2, 그리고 보다 가장 바람직하게는 1이다.

바람직한 구체예에서, 본 발명의 폴리펩티드는 방어소 폴리펩티드이다. 다른 구체예에서, 본 발명의 폴리펩티드는 세 개의 디-시스테인 결합을 포함한다.

N-말단 연장

본 발명의 폴리펩티드의 N-말단 연장은 적합하게는 1 내지 50 아미노산, 바람직하게는 2-20 아미노산, 특히 3-15 아미노산으로 구성될 수 있다. 한 구체예에서, N-말단 펩티드 연장은 Arg(R)을 함유하지 않는다. 다른 구체예에서, N-말단 연장은 아래에서 더 설명되겠지만 kex2 또는 kex2-유사 분열 부위를 포함한다. 바람직한 구체예에서, N-말단 연장은 서열: EAE, EE, DE 및 DD 중 하나를 포함한 N-말단 연장과 같은 적어도 두 Glu(E) 및/또는 Asp(D) 아미노산 잔기를 포함한 펩티드이다.

Kex2 부위

Kex2 부위(예를 들면, Methods in Enzymology Vol 185, ed. D. Goeddel, Academic Press Inc. (1990), San Diego, CA, "Gene Expression Technology" 참조) 및 kex2-유사 부위는 일부 단백질의 프로펩티드 코딩 영역과 성숙한 영역 사이에 발견되는 2 염기 인식 부위(즉, 분열 부위)이다.

kex2 부위 또는 kex2-유사 부위의 삽입은 어떤 경우에 프로-펩티드 분열 부위에서의 정확한 엔도펩티다제 가공을 향상시켜 증가된 단백질 분비 수준을 야기하는 것으로 나타났다.

본 발명의 문맥에서, kex2 또는 kex2-유사 부위의 삽입은 SEQ ID NO:2의 아미노산 1 내지 42로 나타낸 성숙한 폴리펩티드와 비교하여 연장된 항균 폴리펩티드를 산출하는 N-말단 연장에 있는 어떤 위치에 분열 가능성을 야기한다.

융합 폴리펩티드

본 발명의 폴리펩티드는 또한 다른 폴리펩티드가 본 발명의 폴리펩티드 또는 그것의 단편의 N-말단 또는 C-말단에 융합된 융합 폴리펩티드 또는 분열가능한 융합 폴리펩티드를 포함한다. 융합 폴리펩티드는 다른 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열(또는 그것의 부분)을 본 발명의 뉴클레오티드 서열(또는 그것의 부분)에 융합함으로써 생성된다. 융합 폴리펩티드를 생성하는 기술은 당업계에 공지되어 있으며, 그것들이 인프레임되고 융합된 폴리펩티드의 발현이 동일한 프로모터(들)와 종결자의 조절하에 있도록 폴리펩티드를 코딩하는 코딩 서열을 리게이션하는 것을 포함한다.

항균성을 가진 폴리펩티드의 공급원

본 발명의 폴리펩티드는 어떤 종의 미생물에서 얻을 수 있다. 본 발명의 목적을 위하여, 주어진 공급원과 연계하여 본원에 사용된 용어 "에서 얻어진"은 뉴클레오티드 서열에 의하여 코딩된 폴리펩티드가 공급원의 뉴클레오티드 서열이 삽입된 공급원 또는 균주에 의하여 생성된다는 것을 의미한다. 바람직한 양태에서, 주어진 공급원에서 얻어진 폴리펩티드는 세포외로 분비된다.

본 발명의 폴리펩티드는 박테리아의 폴리펩티드일 수 있다. 예를 들면, 폴리펩티드는 바실러스 폴리펩티드와 같은 그람 양성 박테리아의 폴리펩티드, 예를 들면 바실러스 알칼로필루스(Bacillus alkalophilus), 바실러스 아밀로리퀴파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens), 바실러스 브레비스(Bacillus brevis), 바실러스 서큘란스(Bacillus circulans), 바실러스 코아굴란스(Bacillus coagulans), 바실러스 라우투스(Bacillus lautus), 바실러스 렌투스(Bacillus lentus), 바실러스 리체니포미스(Bacillus licheniformis), 바실러스 메가테리움(Bacillus megaterium), 바실러스 스테아로터모필루스(Bacillus stearothermophilus), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 또는 바실러스 투린지엔시스(Bacillus thuringiensis) 폴리펩티드; 또는 스트렙토미세스 폴리펩티드, 예를 들면 스트렙토미세스 리비단스(Streptomyces lividans) 또는 스트렙토미세스 뮤리누스(Streptomyces murinus) 폴리펩티드; 또는 그람 음성 박테리아의 폴리펩티드, 예를 들면 대장균(E. coli) 또는 슈도모나스 sp.(Pseudomonas sp.) 폴리펩티드일 수 있다.

본 발명의 폴리펩티드는 또한 진균 폴리펩티드, 및 더 바람직하게는 효모 폴리펩티드, 예를 들면 캔디다(Candida), 클루이베로미세스(Kluyveromyces), 피키아(Pichia), 사카로미세스(Saccharomyces), 스키조사카로미세스(Schizosaccharomyces), 또는 야로이야(Yarrowia) 폴리펩티드; 또는 더 바람직하게는 사상균 폴리펩티드, 예를 들면 아크레모늄(Acremonium), 아스페길루스(Aspergillus), 오레오바시디움(Aureobasidium), 크립토코쿠스(Cryptococcus), 필리바시디움(Filibasidium), 푸사리움(Fusarium), 후미콜라(Humicola), 마그나포르테(Magnaporthe), 무코(Mucor), 미셀리오프토라(Myceliophthora), 네오칼리마스틱스(Neocallimastix), 뉴로스포라(Neurospora), 파에실로미세스(Paecilomyces), 펜니실리움(Penicillium), 피로미세스(Piromyces), 스키조필룸(Schizophyllum), 탈라로미세스(Talaromyces), 테르모아스커스(Thermoascus), 티엘라비아(Thielavia), 톨리포클라디움(Tolypocladium), 또는 트리코더마(Trichoderma) 폴리펩티드일 수 있다.

바람직한 양태에서, 폴리펩티드는 항균성을 가진 사카로미세스 칼스버겐시스(Saccharomyces carlsbergensis), 사카로미세스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae), 사카로미세스 디아스타티쿠스(Saccharomyces diastaticus), 사카로미세스 두글라시(Saccharomyces douglasii), 사카로미세스 클루이베리(Saccharomyces kluyveri), 사카로미세스 노르벤시스(Saccharomyces norbensis), 또는 사카로미세스 오비포미스(Saccharomyces oviformis) 폴리펩티드이다.

다른 바람직한 구체예에서, 폴리펩티드는 아스퍼길루스 아큘레아투스(Aspergillus aculeatus), 아스페르길루스 아와모리(Aspergillus awamori), 아스페르길루스 푸미가투스(Aspergillus fumigatus), 아스페르길루스 포에티두스(Aspergillus foetidus), 아스페르길루스 자포니쿠스(Aspergillus japonicus), 아스페르길루스 니둘란스(Aspergillus nidulans), 아스페르길루스 니게르(Aspergillus niger), 아스페르길루스 오리자(Aspergillus oryzae), 푸사리움 박트리디오이데스(Fusarium bactridioides), 푸사리움 세레알리스(Fusarium cerealis), 푸사리움 크룩웰렌스(Fusarium crookwellense), 푸사리움 쿨모룸(Fusarium culmorum), 푸사리움 그라미네아룸(Fusarium graminearum), 푸사리움 그라미눔(Fusarium graminum), 푸사리움 헤테로스포룸(Fusarium heterosporum), 푸사리움 네군디(Fusarium negundi), 푸사리움 옥시스포룸(Fusarium oxysporum), 푸사리움 레티쿨라툼(Fusarium reticulatum), 푸사리움 로세움(Fusarium roseum), 푸사리움 삼부시눔(Fusarium sambucinum), 푸사리움 사코크로움(Fusarium sarcochroum), 푸사리움 스포로트리키오이데스(Fusarium sporotrichioides), 푸사리움 술푸레움(Fusarium sulphureum), 푸사리움 토룰로숨(Fusarium torulosum), 푸사리움 트리코테시오이데스(Fusarium trichothecioides), 푸사리움 베네나툼(Fusarium venenatum), 후미콜라 인솔렌스(Humicola insolens), 후미콜라 라누기노사(Humicola lanuginosa), 무코 미에헤이(Mucor miehei), 미셀리오프토라 터모필라(Myceliophthora thermophila), 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa), 페니실리움 푸르푸로게눔(Penicillium purpurogenum), 트리코데르마 하지아눔(Trichoderma harzianum), 트리코데르마 코닌기(Trichoderma koningii), 트리코데르마 롱기브라키아툼(Trichoderma longibrachiatum), 트리코데르마 리세이(Trichoderma reesei), 또는 트리코데르마 비리데(Trichoderma viride) 폴리펩티드이다.

다른 바람직한 양태에서, 폴리펩티드는 유로티움 암스텔로다미(Eurotium amstelodami), 아스페르길루스 암스텔로다미(Aspergillus amstelodami), 아스페르길루스 몬데비덴시스(Aspergillus montevidensis) 또는 아스페르길루스 비티스( Aspergillus vitis) 폴리펩티드이다.

더 바람직한 양태에서, 폴리펩티드는 유로티움 암스텔로다미(Eurotium amstelodami) 폴리펩티드, 예를 들면 SEQ ID NO:2의 폴리펩티드이다.

전술한 종의 경우, 본 발명은 그것들이 알려진 종 이름에 관계없이 완전 및 불완전 상태 모두, 그리고 분류학상 동등체, 예를 들면 아나몰프를 포함하는 것으로 이해될 것이다. 당업자는 적합한 동등체의 동일성을 쉽게 인식할 것이다

이들 종들의 균주는 많은 배양 보관소, 예를 들면 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(American Type Culture Collection; ATCC), 도이체 잠믈룽 폰 미크로오가니즘멘 운트 젤쿨투어렌 GmbH(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH; DSM), 센트라알부레우 포르 쉼멜쿨투레스(Centraalbureau Voor Schimmelcultures; CBS), 및 농업 연구소 특허 배양 보관소(Agricultural Research Service Patent Culture Collection), 북부지역 연구센터(Northern Regional Research Center; NRRL)에서 공중이 용이하게 얻을 수 있다.

더욱이, 이러한 폴리펩티드는 전술한 프로브를 사용하여 자연(예를 들면, 토양, 퇴비, 물 등)에서 불리한 미생물을 포함한 다른 공급원에서 동정하고 얻을 수 있다. 자연 서식지에서 미생물을 불리하는 기술은 당업자에게 잘 알려져 있다. 그 다음 다른 미생물의 유전체 또는 cDNA 라이브러리를 유사하게 스크리닝함으로써 폴리뉴클레오티드를 얻을 수 있다. 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 프로브(들)로 검출하면, 당업자에게 잘 알려진 기술을 이용하여 폴리뉴클레오티드를 분리하거나 클로닝할 수 있다(예를 들면, Sambrook et al., 1989, 상기 참조).

본 발명의 폴리펩티드는 또한 다른 폴리펩티드가 폴리펩티드의 N-말단 또는 C-말단 또는 그것의 단편에 융합되는 융합 폴리펩티드 또는 분열가능한 융합 폴리펩티드를 포함한다. 융합 폴리펩티드는 뉴클레오티드 서열(또는 그것의 부분)을 본 발명의 뉴클레오티드 서열(또는 그것의 부분)에 융합함으로써 생성된다. 융합 폴리펩티드를 생성하는 기술은 당업계에 공지되어 있으며, 그것들이 인프레임되고 융합 폴리펩티드의 발현이 동일한 프로모터(들)와 종결자의 조절 하에 있도록 폴리펩티드를 코딩하는 코딩 서열을 리게이션하는 것을 포함한다.

폴리뉴클레오티드

본 발명은 또한 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 가진 분리된 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 바람직한 양태에서, 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO:1에 나타난다. 다른 바람직한 양태에서, 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO:1의 성숙한 폴리뉴클레오티드 코딩 영역이다. 본 발명은 또한 유전암호의 퇴화 때문에 SEQ ID NO:1와 다른 SEQ ID NO:2의 아미노산 서열을 가진 폴리펩티드 또는 그것의 성숙한 폴리펩티드를 포함한다. 본 발명은 또한 항균성을 가진 SEQ ID NO:2의 단편을 코딩하는 SEQ ID NO:1의 서브서열에 관한 것이다.

본 발명은 또한 SEQ ID NO:1의 성숙한 폴리펩티드 코딩 서열에 적어도 하나의 돌연변이를 포함한 돌연변이체 폴리뉴클레오티드에 관한 것이며, 여기서 돌연변이체 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO:2의 아미노산 1 내지 42로 구성된 폴리펩티드를 코딩한다.

폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 분리하거나 클로닝하는 데 사용되는 기술은 당업계에 공지되어 있으며, 유전체 DNA로부터의 분리, cDNA로부터의 제조, 또는 그것의 조합을 포함한다. 이러한 유전체 DNA로부터 본 발명의 폴리뉴클레오티드의 클로닝은 예를 들면 공유하는 구조적 특징을 가진 클로닝된 DNA 단편을 검출하기 위하여 잘 알려진 중합효소 연쇄반응(PCR) 또는 발현 라이브러리의 항체 스크리닝을 사용함으로써 영향을 받을 수 있다. 예를 들면, 문헌(Innis et al., 1990, PCR: A Guide to Methods and Application, Academic Press, New York)을 참조하라. 리가제 연쇄반응(LCR), 리게이션된 활성화된 전사(LAT) 및 뉴클레오티드 서열-기재 증폭(NASBA)과 같은 다른 핵산 증폭 과정도 사용할 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 유로티움(Eurotium), 또는 다른 또는 연관된 생물의 균주로부터 클로닝될 수 있으며, 따라서, 예를 들면 뉴클레오티드 서열의 폴리펩티드 코딩 영역의 대립유전자 또는 종 변이체일 수 있다.

본 발명은 또한 활성 폴리펩티드를 코딩하는 적어도 60%, 바람직하게는 적어도 65%, 더 바람직하게는 적어도 70%, 더 바람직하게는 적어도 75%, 더 바람직하게는 적어도 80%, 더 바람직하게는 적어도 85%, 더 바람직하게는 적어도 90%, 보다 더 바람직하게는 적어도 95%, 그리고 가장 바람직하게는 적어도 97% 동일성의 SEQ ID NO:1(즉, 뉴클레오티드 145 내지 270)의 성숙한 폴리펩티드 코딩 서열에 대한 동일성 정도를 가진 뉴클레오티드 서열을 가진 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다.

본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 변형은 폴리펩티드와 실질적으로 유사한 폴리펩티드의 합성에 필요할 수 있다. 용어 폴리펩티드에 "실질적으로 유사한"은 폴리펩티드의 비자연적으로 발생하는 형태를 말한다. 이들 폴리펩티드, 예를 들면 특이적 활성, 열안정성, 최적의 pH 등이 다른 인공 변이체는 일부 조작된 방식에서 그것의 천연 공급원에서 분리된 폴리펩티드와 다를 수 있다. 변이체 서열은 SEQ ID NO:1의 폴리펩티드 코딩 영역으로 존재하는 뉴클레오티드 서열, 예를 들면 그것의 서브서열에 기초하여, 그리고/또는 뉴클레오티드 서열에 의하여 코딩되는 폴리펩티드의 다른 아미노산 서열을 발생시키지 않지만, 효소의 생산을 위하여 의도된 숙주 생물의 코돈 사용에 상응하는 뉴클레오티드 치환의 도입에 의하여, 또는 다른 아미노산 서열을 발생시킬 수 있는 뉴클레오티드 치환의 도입에 의하여 구성될 수 있다. 뉴클레오티드 치환의 일반적 설명을 위하여, 예를 들면 문헌(Ford et al., 1991, Protein Expression and Purification 2: 95-107)을 참조하라.

이러한 치환은 분자의 기능에 결정적인 영역 밖에서 이루어질 수 있고 여전히 활성 폴리펩티드를 야기한다는 것은 당업자에게 명백할 것이다. 본 발명의 분리된 폴리뉴클레오티드에 의하여 코딩되고, 따라서 바람직하게는 치환되지 않는 폴리펩티드의 활성에 필수적인 아미노산 잔기는 부위지정 돌연변이유발 또는 알라닌-스캐닝 돌연변이유발과 같은 당업계에 공지된 과정에 따라서 확인될 수 있다(예를 들면, Cunningham and Wells, 1989, Science 244: 1081-1085 참조). 후자의 기술에서, 돌연변이는 분자 내에 모든 양전하 잔기에 도입되고, 결과로 생성된 돌연변이체 분자는 분자의 활성에 결정적인 아미노산 잔기를 확인하기 위하여 항균성에 대하여 시험된다. 기질-효소 상호작용의 부위는 또한 핵자기공명 분석, 결정학 또는 포토친화성 표지와 같은 기술에 의하여 결정된 3차원적 구조의 분석에 의하여 결정될 수 있다(예를 들면, de Vos et al., 1992, Science 255: 306-312; Smith et al., 1992, Journal of Molecular Biology 224: 899-904; Wlodaver et al., 1992, FEBS Letters 309: 59-64 참조).

본 발명은 또한 낮은 엄격성 조건, 바람직하게는 중간 엄격성 조건, 더 바람직하게는 중간-높은 엄격성 조건, 보다 더 바람직하게는 높은 엄격성 조건, 그리고 가장 바람직하게는 매우 높은 엄격성 조건 하에서 (i) SEQ ID NO:1의 뉴클레오티드 145 내지 270, (ii) SEQ ID NO:1의 뉴클레오티드 1 내지 270에 함유된 cDNA 서열, 또는 (iii) (i) 또는 (ii)의 상보적 가닥, 또는 본원에 정의된 대립유전자 변이체 및 그것의 서브서열(Sambrook et al., 1989, 상기참조)과 혼성화하는 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 분리된 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다.

본 발명은 또한 (a) DNA의 집단을 낮은, 중간, 중간-높은, 높은, 또는 매우 높은 엄격성 조건 하에서 (i) SEQ ID NO:1의 뉴클레오티드 145 내지 270, (ii) SEQ ID NO:1의 뉴클레오티드 1 내지 270에 함유된 cDNA 서열, 또는 (iii) (i) 또는 (ii)의 상보적 가닥과 혼성화하는 단계, 및 (b) 항균성을 가진 폴리펩티드를 코딩하는 혼성화 폴리뉴클레오티드를 분리하는 단계에 의하여 얻어진 분리된 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다.

핵산 구성체

본 발명은 또한 조절 서열과 양립가능한 조건 하에서 적합한 숙주세포에서 코딩 서열의 발현을 유도하는 하나 이상의 조절 서열에 작동가능하게 연결된 본 발명의 분리된 폴리뉴클레오티드를 포함한 핵산 구성체에 관한 것이다.

본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 분리된 폴리뉴클레오티드는 폴리펩티드의 발현을 제공하는 다양한 방식으로 조작될 수 있다. 그것을 벡터에 삽입하기 전에 폴리뉴클레오티드 서열을 조작하는 것이 발현 벡터에 따라서 바람직하거나 필요할 수 있다. 재조합 DNA 방법을 이용하여 폴리뉴클레오티드 서열을 변형하는 기술은 당업계에 잘 알려져 있다.

조절 서열은 적합한 프로모터 서열, 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 발현을 위하여 숙주세포에 의하여 인식되는 뉴클레오티드 서열일 수 있다. 프로모터 서열은 폴리펩티드의 발현을 매개하는 전사 조절 서열을 함유한다. 프로모터는 돌연변이체의 절단된 하이브리드 프로모터를 포함한 선택한 숙주세포에서 전사 활성을 나타내는 어떤 뉴클레오티드 서열일 수 있으며, 숙주세포에 상동 또는 이종인 세포외 또는 세포내 폴리펩티드를 코딩하는 유전자에서 얻을 수 있다.

특히 박테리아 숙주세포에서 본 발명의 핵산 구성체의 전사를 유도하기 위하여 적합한 프로모터의 예는 대장균 lac 오페론, 스트렙토마세스 코엘리콜러(Streptomyces coelicolor) 아가라제 유전자(dagA), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 레반수크라제 유전자(sacB), 바실러스 리첸니포르미스(Bacillus licheniformis) 알파-아밀라제 유전자(amyL), 바실러스 스테아로터모필루스(Bacillus stearothermophilus) 말토스 아밀라제 유전자(amyM), 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 알파-아밀라제 유전자(amyQ), 바실러스 리체니포미스(Bacillus licheniformis) 페니실리나제 유전자(penP), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) xylA 및 xylB 유전자, 및 원핵 베타-락타마제 유전자(Villa-Kamaroff et al., 1978, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75: 3727-3731)에서 얻은 프로모터, 뿐만 아니라 tac 프로모터(DeBoer et al., 1983, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 80: 21-25)이다. 다른 프로머터는 문헌("Useful proteins from recombinant bacteria" in Scientific American, 1980, 242: 74-94; 및 Sambrook et al., 1989, 상기참조)에 설명된다.

사상균 숙주세포에서 본 발명의 핵산 구성체의 전사를 유도하기 위한 적합한 프로모터의 예는 아스페르길루스 오리자(Aspergillus oryzae) TAKA 아밀라제, 리조무코 미에헤이(Rhizomucor miehei) 아스파르성 단백질분해효소, 아스페르길루스 니게르(Aspergillus niger) 중성 알파-아밀라제, 아스페르길루스 니게르(Aspergillus niger) 산 안정 알파-아밀라제, 아스페르길루스 니게르(Aspergillus niger) 또는 아스페르길루스 아와모리(Aspergillus awamori) 글루코아밀라제(glaA), 리조무코 미에헤이(Rhizomucor miehei) 리파제, 아스페르길루스 오리자(Aspergillus oryzae) 알칼린 프로테아제, 아스페르길루스 오리자(Aspergillus oryzae) 트리오스 포스페이트 이소머라제, 아스페르길루스 니둘란스(Aspergillus nidulans) 아세타미다제, 푸사리움 베네나툼(Fusarium venenatum) 아밀로글루코시다제(WO 00/56900), 푸사리움 베네나툼(Fusarium venenatum) 다리아(Daria)(WO 00/56900), 푸사리움 베네나툼 퀸(Quinn) (WO 00/56900), 푸사리움 옥시스포룸(Fusarium oxysporum) 트립신-유사 프로테아제(WO 96/00787), 트리코더마 리세이(Trichoderma reesei) 베타-글루코시다제, 트리코더마 리세이 셀로비오히드롤라제 I, 트리코더마 리세이 엔도글루카나제 I, 트리코더마 리세이 엔도글루카나제 II, 트리코더마 리세이 엔도글루카나제 III, 트리코더마 리세이 엔도글루카나제 IV, 트리코더마 리세이 엔도글루카나제 V, 트리코더마 리세이 자일라나제 I, 트리코더마 리세이 자일라나제 II, 트리코더마 리세이 베타-자일로시다제의 유전자에서 얻은 프로모터, 뿐만 아니라 NA2-tpi 프로모터(아스페르길루스 니게르 중성 알파-아밀라제와 아스페르길루스 오리자 트리오스 포스페이트 이소머라제의 유전자의 프로모터의 하이브리드); 및 그것의 돌연변이체의 절단된 하이브리드 프로모터이다.

효모 숙주에서, 유용한 프로모터는 사카로미세스 세르비시아 에놀라제(ENO-1), 사카로미세스 세르비시아 갈락토키나제(GAL1), 사카로미세스 세르비시아 알코올 탈수소효소/글리세르알데히드-3-포스페이트 탈수소효소(ADH1,ADH2/GAP), 사카로미세스 세르비시아 트리오스 포스페이트 이소머라제(TPI), 사카로미세스 세르비시아 메탈로티오닌(CUP1), 및 사카로미세스 세르비시아 3-포스포글리서레이트 키나제의 유전자에서 얻는다. 효모 숙주세포의 다른 유용한 프로모터는 문헌(Romanos et al., 1992, Yeast 8: 423-488)에 설명된다.

조절 서열은 또한 적합한 전사 종결자 서열, 즉 전사를 종결하기 위하여 숙주세포에 의하여 인식된 서열일 수 있다. 종결자 서열은 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 3' 말단에 작동가능하게 연결된다. 선택한 숙주세포에서 기능성이 있는 어떤 종결자는 본 발명에서 사용될 수 있다.

사상균 숙주세포의 바람직한 종결자는 아스페르길루스 오리자(Aspergillus oryzae) TAKA 아밀라제, 아스페르길루스 니게르(Aspergillus niger) 글루코아밀라제, 아스페르길루스 니둘란스(Aspergillus nidulans) 안트라닐레이트 합성효소, 아스페르길루스 니게르 알파-글루코시다제, 및 푸사리움 옥시스포룸(Fusarium oxysporum) 트립신-유사 프로테아제의 유전자에서 얻는다.

효모 숙주세포의 바람직한 종결자는 사카로미세스 세리비시아 에놀라제, 사카로미세스 세리비시아 시토크롬 C(CYC1), 및 사카로미세스 세리비시아 글리세르알데히드-3-포스페이트 탈수소효소의 유전자에서 얻은 것이다. 효모 숙주세포의 다른 유용한 종결자는 문헌(Romanos et al., 1992, 상기참조)에 설명된다.

조절 서열은 또한 적합한 리더 서열, 즉 숙주세포에 의한 번역에 중요한 mRNA의 비번역 영역일 수 있다. 리더 서열은 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 5' 말단에 작동가능하게 연결된다. 선택한 숙주세포에서 기능성이 있는 어떤 리더 서열은 본 발명에서 사용될 수 있다.

사상균 숙주세포의 바람직한 리더는 아스페르길루스 오리자 TAKA 아밀라제 및 아스페르길루스 니둘란스 트리오스 포스페이트 이소머라제의 유전자에서 얻는다.

효모 숙주세포의 적합한 리더는 사카로미세스 세레비시아 에놀라제(ENO-1), 사카로미세스 세레비시아 3-포스포글리서레이트 키나제, 사카로미세스 세레비시아 알파-인자, 및 사카로미세스 세레비시아 알코올 탈수소효소/글리세르알데히드-3-포스페이트 탈수소효소(ADH2/GAP)에서 얻는다.

조절 서열은 또한 폴리아데닐화 서열, 뉴클레오티드 서열의 3' 말단에 작동가능하게 연결되고, 전사될 때 전사된 mRNA에 폴리아데노신 잔기를 첨가하는 신호로서 숙주세포에 의하여 인식되는 서열이다. 선택한 숙주세포에서 기능성이 있는 어떤 폴리아데닐화 서열은 본 발명에서 사용될 수 있다.

사상균 숙주세포의 바람직한 폴리아데닐화 서열은 아스페르길루스 오리자 TAKA 아밀라제, 아스페르길루스 니둘란스 안트라닐레이트 합성효소, 푸사리움 옥시스포룸 트립신-유사 프로테아제, 및 아스페르길루스 니게르 알파-글루코시다제의 유전자에서 얻는다.

효모 숙주세포의 유용한 폴리아데닐화 서열은 문헌(Guo and Sherman, 1995, Molecular Cellular Biology 15: 5983-5990)에 설명된다.

조절 서열은 또한 코딩된 폴리펩티드를 세포의 분비 경로로 유도하는 폴리펩티드의 아미노 말단에 연결된 아미노산 서열을 코딩하는 신호 펩티드 코딩 영역일 수 있다. 뉴클레오티드 서열의 코딩 서열의 5' 말단은 분비된 폴리펩티드를 코딩하는 코딩 영역의 부분을 가진 번역 리딩 프레임에 자연적으로 연결된 신호 펩티드 코딩 영역을 본래부터 함유할 수 있다. 대안적으로, 코딩 서열의 5' 말단은 코딩 서열과 이질적인 신호 펩티드 코딩 영역을 함유할 수 있다. 외래 신호 펩티드 코딩 영역은 코딩 서열이 신호 펩티드 코딩 영역을 자연적으로 함유하지 않는 경우에 필요할 수 있다. 대안적으로, 외래 신호 펩티드 코딩 영역은 폴리펩티드의 분비를 증대시키기 위하여 자연적 신호 펩티드 코딩 영역을 간단히 대체할 수 있다. 그러나, 발현된 폴리펩티드를 선택된 숙주세포의 분비 경로로 유도하는 신호 펩티드 코딩 영역은 본 발명에서 사용될 수 있다.

박테리아 숙주세포의 효과적인 신호 펩티드 코딩 영역은 바실러스(Bacillus) NCIB 11837 말토스 아밀라제, 바실러스 스테아로터모필루스(Bacillus stearothermophilus) 알파-아밀라제, 바실러스 리체니포미스(Bacillus licheniformis) 서브틸리신, 바실러스 리체니포미스(Bacillus licheniformis) 베타-락타마제, 바실러스 스테아로터모필루스(Bacillus stearothermophilus) 중성 프로테아제(nprT , nprS , nprM), 및 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) prsA의 유전자에서 얻은 신호 펩티드 코딩 영역이다. 다른 신호 펩티드는 문헌(Simonen and Palva, 1993, Microbiological Reviews 57: 109-137)에 설명된다.

사상균 숙주세포의 효과적인 신호 펩티드 코딩 영역은 아스페르길루스 오리자 TAKA 아밀라제, 아스페르길루스 니게르 중성 아밀라제, 아스페르길루스 니게르 글로쿠아밀라제, 리조무코 미에헤이 아스파르트 프로테이나제, 후미콜라 인솔렌스 셀룰라제, 및 후미콜라 라누기노사 리파제의 유전자에서 얻은 신호 펩티드 코딩 영역이다.

바람직한 양태에서, 신호 펩티드 코딩 영역은 SEQ ID NO:2의 아미노산 -48 내지 -29를 코딩하는 SEQ ID NO:1의 뉴클레오티드 1 내지 60이다.

효모 숙주세포의 유용한 신호 펩티드는 사카로미세스 세레비시아 알파-인자 및 사카로미세스 세레비시아 전화효소의 유전자에서 얻는다. 다른 유용한 신호 펩티드 코딩 영역은 문헌(Romanos et al., 1992, 상기참조)에 설명된다.

조절 서열은 또한 폴리펩티드의 아미노 말단에 위치한 아미노산 서열을 코딩하는 프로펩티드 코딩 영역일 수 있다. 결과로 얻어진 폴리펩티드는 프로효소 또는 프로폴리펩티드(또는 일부 경우에는 자이모겐)로 알려져 있다. 프로폴리펩티드는 일반적으로 비활성이고 프로폴리펩티드로부터 프로펩티드의 촉매성 또는 자기촉매성 분열에 의하여 성숙한 활성 폴리펩티드로 전환될 수 있다. 프로펩티드 코딩 영역은 바실루스 서브틸리스 알칼린 프로테아제(aprE), 바실러스 서브틸리스 중성 프로테아제(nprT), 사카로미세스 세레비시아 알파-인자, 리조무코 미에헤이 아스파르트 프로테이나제, 및 미셀리오프토라 터모필라 락카제(WO 95/33836)의 유전자에서 얻을 수 있다.

바람직한 양태에서, 프로펩티드 코딩 영역은 SEQ ID NO:2의 아미노산 -28 내지 -1을 코딩하는 SEQ ID NO:1의 뉴클레오티드 61 내지 144이다.

신호 펩티드와 프로펩티드 영역이 모두 폴리펩티드의 아미노 말단에 존재하는 경우, 프로펩티드 영역은 폴리펩티드의 아미노 말단에 가까이 위치하고, 신호 펩티드 영역은 프로펩티드 영역의 아미노 말단에 가까이 위치한다.

또한 숙주세포의 성장에 비해서 폴리펩티드의 발현을 조절하는 조절 서열을 첨가하는 것이 바람직할 수 있다. 조절 시스템의 예는 조절 화합물의 존재를 포함한, 화학적 또는 물리적 자극에 반응하여 유전자의 발현이 턴 온 또는 턴 오프되도록 야기하는 것들이다. 원핵계에서의 조절 시스템은 lac, tac, 및 trp 작동자 시스템을 포함한다. 효모에서는, ADH2 시스템 또는 GAL1 시스템이 사용될 수 있다. 사상균에서는, TAKA 알파-아밀라제 프로모터, 아스페르길루스 니게르 글루코아밀라제 프로모터, 및 아스페르길루스 오리자 글로코아밀라제 프로모터가 조절 서열로 사용될 수 있다. 조절 서열의 다른 예는 유전자 증폭에 관여하는 것들이다. 진핵계에서, 이들은 메토트렉세이트의 존재 하에 증폭된 디히드로폴레이트 환원효소 유전자 및 중금속으로 증폭되는 메탈로티오네인 유전자를 포함한다. 이들의 경우에, 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 조절 서열과 작동가능하게 연결된다.

발현 벡터

본 발명은 본 발명의 폴리뉴클레오티드, 프로모터, 및 전사와 번역의 종결 신호를 포함한 재조합 발현 벡터에 관한 것이다. 전술한 다양한 핵산 및 조절 서열은 이러한 부위에 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 삽입 또는 치환을 허용하는 하나 이상의 편리한 제한효소부위를 포함할 수 있는 재조합 발현 벡터를 생성하도록 결합될 수 있다. 대안적으로, 본 발명의 뉴클레오티드 서열은 뉴클레오티드 서열 또는 그 서열을 포함한 핵산 구성체를 발현에 적합한 벡터에 삽입함으로써 발현될 수 있다. 발현 벡터의 제조시, 코딩 서열은 코딩 서열이 발현에 적합한 조절 서열과 작동가능하게 연결되도록 위치한다.

재조합 발현 벡터는 편리하게 재조합 DNA 과정을 따를 수 있으며 뉴클레오티드 서열의 발현을 야기할 수 있는 어떤 벡터(예를 들면, 플라스미드 또는 바이러스)일 수 있다. 벡터의 선택은 전형적으로 벡터와 벡터가 도입되는 숙주세포의 양립가능성에 의존할 것이다. 벡터는 선형 또는 폐쇄 고리형 플라스미드일 수 있다.

벡터는 자가복제 벡터, 즉 그 복제가 염색체의 복제와는 독립적인 염색체외 실재로 존재하는 벡터, 예를 들면 플라스미드, 염색체외 성분, 미니염색체, 또는 인공 염색체일 수 있다. 대안적으로, 벡터는 숙주세포에 도입될 때 유전체에 통합되고 통합된 염색체(들)와 함께 복제되는 것일 수 있다. 더욱이, 단일 벡터 또는 플라스미드 또는 숙주세포의 유전체에 도입될 전체 DNA를 모두 함유한 2개 이상의 벡터 또는 플라스미드, 또는 트랜스포존이 사용될 수 있다.

본 발명의 벡터는 바람직하게는 형질전환된 세포를 용이하게 선택할 수 있는 하나 이상의 선택가능한 마커를 함유한다. 선택가능한 마커는 그 유전자의 생성물이 살생물제 또는 바이러스 내성, 중금속 내성, 독립영양 또는 영양요구 등을 제공하는 유전자이다.

박테리아의 선택가능한 마커의 예는 바실러스 서브틸리스 또는 바실러스 리체니포미스의 dal 유전자, 또는 앰피실린, 카나마이신, 콜로람페니콜, 또는 테트라사이클린 내성과 같은 항생제 내성을 제공하는 마커이다. 효모 숙주세포의 적합한 마커는 ADE2, HIS3, LEU2, LYS2, MET3, TRP1, 및 URA3일 수 있다. 사상균 숙주세포에 사용하기 위한 선택가능한 마커는, 한정하는 것은 아니지만, amdS (아세타미다제), argB (오르니틴 카바모일전이효소), bar (포스피노트리신 아세틸전이효소), hph (히그로마이신 인전이효소), niaD (질산염 환원효소), pyrG (오로티딘-5'-포스페이트 탈탄산효소), sC (황산염 아데닐전이효소), 및 trpC (안트라닐레이트 합성효소), 뿐만 아니라 그것의 등가물을 포함한다. 아스페르길루스 니둘란스 또는 아스페르길루스 오리자의 amdS와 pyrG 유전자 및 스트렙토미세스 히그로스코피쿠스의 bar 유전자가 아스페르길루스 세포에서 사용하기에 바람직할 수 있다.

본 발명의 벡터는 바람직하게는 벡터를 숙주세포의 유전체에 통합하거나 유전체와 독립적인 세포에서 벡터를 자가복제시키는 성분(들)을 함유한다.

숙주세포 유전체에 통합하기 위하여, 벡터는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열 또는 상동 또는 비-상동 재조합에 의하여 유전체에 통합하기 위한 벡터의 어떤 다른 성분에 의존할 수 있다. 대안적으로, 벡터는 염색체(들)에 정확한 위치(들)에 숙주세포의 유전체에 상동 재조합에 의한 통합을 유도하기 위한 추가 뉴클레오티드 서열을 함유할 수 있다. 정확한 위치에 통합 가능성을 증가시키기 위하여, 통합 성분은 바람직하게는 상동 재조합의 가능성을 향상시키는 대응되는 표적 서열과 높은 정도의 동일성을 가진 충분한 수의 핵산, 예를 들면 100 내지 10,000 염기쌍, 바람직하게는 400 내지 10,000 염기쌍, 그리고 가장 바람직하게는 800 내지 10,000 염기쌍을 함유하여야 한다. 통합성분은 숙주세포의 유전체의 표적 서열과 상동인 어떤 서열일 수 있다. 더욱이, 통합성분은 비-암호화 또는 암호화 뉴클레오티드 서열일 수 있다. 한편, 벡터는 비-상동 재조합에 의하여 숙주세포의 유전체에 통합될 수 있다.

자가복제를 위하여, 벡터는 문제의 숙주세포에서 벡터가 자가복제하도록 복제기점을 더 포함할 수 있다. 복제기점은 세포에서 기능하는 자가복제를 매개하는 어떤 플라스미드 복제자일 수 있다. 용어 "복제기점" 또는 "플라스미드 복제자"는 본원에서 플라스미드 또는 벡터가 생체내에서 복제할 수 있게 하는 뉴클레오티드 서열로 정의된다.

박테리아의 복제기점의 예는 대장균에서 복제를 허용하는 플라스미드 pBR322, pUC19, pACYC177, 및 pACYC184 및 바실러스에서 복제를 허용하는 pUB110, pE194, pTA1060, 및 pAMβ1의 복제기점이다.

효모 숙주세포에서 사용하기 위한 복제기점의 예는 2 마이크론의 복제기점, ARS1, ARS4, ARS1과 CEN3의 조합, 및 ARS4와 CEN6의 조합이다.

사상균 세포에서 유용한 복제기점의 예는 AMA1 및 ANS1이다(Gems et al., 1991, Gene 98:61-67; Cullen et al., 1987, Nucleic Acids Research 15:9163- 9175; WO 00/24883). AMA1 유전자의 분리 및 유전자를 포함한 플라스미드 또는 벡터의 구성은 WO 00/24883에 개시된 방법에 따라서 수행될 수 있다.

유전자 산물의 생산을 증가시키기 위하여 본 발명의 폴리뉴클레오티드의 하나 이상의 사본을 숙주세포에 삽입할 수 있다. 폴리뉴클레오티드의 사본 수의 증가는 서열의 적어도 하나의 추가 사본을 숙주세포 유전체에 통합함으로써 또는 세포가 선택가능한 마커 유전자의 증폭된 사본을 함유한 폴리뉴클레오티드를 가진 증폭가능한 선택가능한 마커 유전자를 포함시킴으로써 얻어질 수 있고, 그럼으로써 폴리뉴클레오티드의 추가 사본은 적합한 선택가능한 제제의 존재에서 세포를 배양함으로써 선택될 수 있다.

본 발명의 재조합 발현벡터를 구성하기 위하여 전술한 성분을 리게이션하는 데 사용된 과정은 당업자에게 잘 알려져 있다(예를 들면, Sambrook et al., 1989, 상기 참조).

숙주세포

본 발명은 또한 폴리펩티드의 재조합 생산에 이롭게 사용되는 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함한 재조합 숙주세포에 관한 것이다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함한 벡터는 벡터가 전술한 바와 같이 염색체 통합체 또는 자가복제 염색체외 벡터로 유지되기 위하여 숙주세포에 도입된다. 용어 "숙주세포"는 복제하는 동안 발생하는 돌연변이 때문에 모 세포와 동일하지않는 모세포의 어떤 자손을 포함한다. 숙주세포의 선택은 크게는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자 및 그것의 공급원에 의존할 것이다.

숙주세포는 단일세포 미생물, 예를 들면 원핵세포, 또는 비-단일세포 미생물, 예를 들면 진핵세포일 수 있다.

유용한 단일세포 미생물은, 한정하는 것은 아니지만, 바실러스 세포, 예를 들면 바실러스 알칼로필루스(Bacillus alkalophilus), 바실러스 아밀로리퀴파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens), 바실러스 브레비스(Bacillus brevis), 바실러스 서쿨란스(Bacillus circulans), 바실러스 클라시(Bacillus clausii), 바실러스 코아굴란스(Bacillus coagulans), 바실러스 라우투스(Bacillus lautus), 바실러스 렌투스(Bacillus lentus), 바실러스 리체니포미스(Bacillus licheniformis), 바실러스 메가테리움(Bacillus megaterium), 바실러스 스테아로터모필루스(Bacillus stearothermophilus), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 및 바실러스 투린기엔시스(Bacillus thuringiensis); 또는 스트렙토미세스 세포, 예를 들면 스트렙토미세스 리비단스(Streptomyces lividans) 및 스트렙토미세스 뮤리누스(Streptomyces murinus)를 포함한 그람 양성 박테리아, 또는 그람 음성 박테리아, 예를 들면 대장균 및 슈도모나스 sp.(Pseudomonas sp.)와 같은 박테리아 세포이다. 바람직한 양태에서, 박테리아 세포는 바실러스 렌투스(Bacillus lentus), 바실러스 리체니포미스(Bacillus licheniformis), 바실러스 스테아로터모필루스(Bacillus stearothermophilus), 또는 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 세포이다. 다른 바람직한 양태에서, 바실러스 세포는 호알칼리성 바실러스이다.

벡터를 박테리아 숙주세포에 도입하는 것은 예를 들면 컴피턴트 세포(예를 들면, Young and Spizizin, 1961, Journal of Bacteriology 81: 823-829, 또는 Dubnau and Davidoff-Abelson, 1971, Journal of Molecular Biology 56: 209-221 참조), 전기천공법(예를 들면, Shigekawa and Dower, 1988, Biotech niques 6: 742-751), 또는 콘쥬게이션(예를 들면, Koehler and Thome, 1987, Journal of Bacteriology 169: 5771-5278)을 사용한 원형질체 형질전환(예를 들면, Chang and Cohen, 1979, Molecular General Genetics 168: 111-115 참조)에 의하여 영향을 받을 수 있다.

숙주세포는 또한 포유동물, 곤충, 식물, 또는 진균 세포와 같은 진핵세포일 수 있다.

바람직한 양태에서, 숙주세포는 진균 세포이다. 본원에 사용된 "진균"은 파일라 아스코미코타(phyla Ascomycota), 바시디오미코타(Basidiomycota), 키트리디오미코다(Chytridiomycota), 및 지고미코타(Zygomycota)(문헌(Hawksworth et al, In, Ainsworth and Bisby's Dictionary of The Fungi, 8판, 1995, CAB International, University Press, Cambridge, UK)에서 설명됨) 뿐만 아니라 우미코타(Oomycota)(문헌(Hawksworth et al, 1995, 상기참조, 페이지 171)에 인용됨) 및 모든 미토스포르 곰팡이(Hawksworth et al, 1995, 상기참조)를 포함한다.

더 바람직한 양태에서, 진균 숙주세포는 효모세포이다. 본원에 사용된 "효모"는 유포자 효모(자낭균효모), 담자포자 효모, 및 곰팡이 불완전균에 속한 효모(뜸불완전 곰팡이)를 포함한다. 효모의 분류는 향후에 바뀔 수 있기 때문에, 효모는 문헌(Biology and Activities of Yeast (Skinner, F.A., Passmore, S. M., 및 Davenport, R.R., eds, Soc. App. Bacteriol. Symposium Series No. 9, 1980))에 설명된 바와 같이 정의된다.

보다 더 바람직한 양태에서, 효모 숙주세포는 칸디다(Candida), 한세눌라(Hansenula), 클루베로미세스(Kluyveromyces), 피키아(Pichia), 사카로미세스(Saccharomyces), 스키조사카로미세스(Schizosaccharomyces), 또는 야로이야 세포이다.

가장 바람직한 양태에서, 효모 숙주세포는 사카로미세스 칼스베르겐시스(Saccharomyces carlsbergensis), 사카로미세스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae), 사카로미세스 디사스타티쿠스(Saccharomyces diastaticus), 사카로미세스 두글라시(Saccharomyces douglasii), 사카로미세스 쿨루이베리(Saccharomyces kluyveri), 사카로미세스 노르벤시스(Saccharomyces norbensis) 또는 사카로미세스 오비포미스(Saccharomyces oviformis) 세포이다. 다른 가장 바람직한 양태에서, 효모 숙주세포는 클루이베로미세스 락티스(Kluyveromyces lactis) 세포이다. 다른 가장 바람직한 양태에서, 효모 숙주세포는 야로위아 리포리티카(Yarrowia lipolytica) 세포이다.

다른 더 바람직한 양태에서, 진균 숙주세포는 사상균 세포이다. "사상균"은 하위부류 유미코타(Eumycota) 및 우미코타(Oomycota)(문헌(Hawksworth et al, 1995, 상기참조)에 설명됨)의 모든 실모양 형태를 포함한다. 사상균은 일반적으로 키틴, 셀룰로스, 글루칸, 키노산, 만난, 및 다른 복합다당류로 구성된 균사체 벽을 특징으로 한다. 식물의 성장은 균사벽 신장에 의하며 탄소 동화는 반드시 호기성이다. 반대로, 사카로모세스 세레비시아와 같은 효모에 의한 식물의 성장은 단세포 엽상체의 발아에 의하며 탄소 동화는 발효성일 수 있다.

보다 더 바람직한 양태에서, 사상균 숙주세포는 아크레모늄(Acremonium), 아스페르길루스(Aspergillus), 아우레오바시듐(Aureobasidium), 제르칸데라(Bjerkandera), 세리포리옵시스(Ceriporiopsis), 코프리너스(Coprinus), 코홀루스(Coholus), 크립토코쿠스(Cryptococcus), 필리바시듐(Filibasidium), 푸사륨(Fusarium), 후미콜라(Humicola), 마그나포르테(Magnaporthe), 무코(Mucor), 미셀리오프토라(Myceliophthora), 네오칼리마스틱스(Neocallimastix), 뉴로스포라(Neurospora), 파에실로미세스(Paecilomyces), 페니실륨(Penicillium), 파네로체이트(Phanerochaete), 플레비아(Phlebia), 피로미세스(Piromyces), 플레로투스(Pleurotus), 스키코필룸(Schizophyllum), 탈라로미세스(Talaromyces), 터모아스커스(Thermoascus), 티엘라비아(Thielavia), 톨리포클라듐(Tolypocladium), 트라메테스(Trametes), 또는 트리코데르마(Trichoderma) 세포이다.

가장 바람직한 양태에서, 사상균 숙주세포는 아스페르길루스 아와모리(Aspergillus awamori), 아스페르길루스 푸미가투스(Aspergillus fumigatus), 아스페르길루스 포에티두스(Aspergillus foetidus), 아스페르길루스 자포니쿠스(Aspergillus japonicus), 아스페르길루스 니둘란스(Aspergillus nidulans), 아스페르길루스 니게르(Aspergillus niger) 또는 아스페르길루스 오리자(Aspergillus oryzae) 세포이다. 다른 가장 바람직한 양태에서, 사상균 숙주세포는 푸사리움 박트리디오이데스(Fusarium bactridioides), 푸사리움 세레알리스(Fusarium cerealis), 푸사리움 크룩웰렌스(Fusarium crookwellense), 푸사리움 쿨모룸(Fusarium culmorum), 푸사리움 그라미네아룸(Fusarium graminearum), 푸사리움 그라미눔(Fusarium graminum), 푸사리움 헤테로스포룸(Fusarium heterosporum), 푸사리움 네군디(Fusarium negundi), 푸사리움 옥시스포룸(Fusarium oxysporum), 푸사리움 레티쿨라툼(Fusarium reticulatum), 푸사리움 로세움(Fusarium roseum), 푸사리움 삼부시눔(Fusarium sambucinum), 푸사리움 사코크로움(Fusarium sarcochroum), 푸사리움 스포로트리치오이데스(Fusarium sporotrichioides), 푸사리움 술푸레움(Fusarium sulphureum), 푸사리움 토룰로숨(Fusarium torulosum), 푸사리움 트리코테시오이데스(Fusarium trichothecioides), 또는 푸사리움 베네나툼(Fusarium venenatum) 세포이다. 다른 가장 바람직한 양태에서, 사상균 숙주세포는 제르칸데라 아두스타(Bjerkandera adusta), 세리포리옴시스 아네이리나(Ceriporiopsis aneirina), 세리포리옴시스 아네이리나(Ceriporiopsis aneirina), 세리포리옴시스 카레기아(Ceriporiopsis caregiea), 세리포리옴시스 길베센스(Ceriporiopsis gilvescens), 세리포리옴시스 판노신타(Ceriporiopsis pannocinta), 세리포리옴시스 리불로사(Ceriporiopsis rivulosa), 세리포리옴시스 수부루파(Ceriporiopsis subrufa), 또는 세리포리옴시스 수브베르미스포라(Ceriporiopsis subvermispora), 코프리누스 시네루스(Coprinus cinereus), 코리올루스 히르수투스(Coriolus hirsutus), 후미콜라 인솔렌스(Humicola insolens), 후미콜라 라누기노사(Humicola lanuginosa), 무코 미에헤이(Mucor miehei), 미셀리오프토라 터모필라(Myceliophthora thermophila), 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa), 페니실륨 푸르푸로게눔(Penicillium purpurogenum), 파네로카에테 크리소스포륨(Phanerochaete chrysosporium), 플레비아 라디아타(Phlebia radiata), 플루로투스 에린기(Pleurotus eryngii), 티엘라비아 테레스트리스(Thielavia terrestris), 트라메테스 빌로사(Trametes villosa), 트라메테스 베르시콜로(Trametes versicolor), 트리코데르마 하지아눔(Trichoderma harzianum), 트리코데르마 코닌기(Trichoderma koningii), 트리코데르마 론기부라키아툼(Trichoderma longibrachiatum), 트리코데르마 리세이(Trichoderma reesei), 또는 트리코데르마 비리데(Trichoderma viride) 균주 세포이다.

진균세포는 원형질체 형성, 원형질체의 형질전환, 및 원래 알려진 방식으로 세포벽의 재생과 관련된 과정에 의하여 형질전환될 수 있다. 아스페르길루스 및 트리코데르마 숙주세포의 형질전환을 위한 적합한 과정은 EP 238 023 및 문헌(Yelton et al., 1984, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 81:1470-1474)에 설명된다. 푸사리움 종을 형질전환하기 위한 적합한 방법은 문헌(Malardier et al, 1989, Gene 78:147-156) 및 WO 96/00787에 설명된다. 효모는 문헌(Becker and Guarente, In Abelson, J.N. and Simon, M.I., editors, Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Methods in Enzymology, Volume 194, pp 182-187, Academic Press, Inc., New York; Ito et al., 1983, Journal of Bacteriology 153: 163; 및 Hinnen et al., 1978, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75: 1920)에 설명된 과정을 사용하여 형질전환될 수 있다.

생산방법

본 발명은 또한 (a) 폴리펩티드의 생산을 유도하는 조건 하에서 그것의 야생형 형태로 폴리펩티드를 생성할 수 있는 세포를 배양하는 단계, 및 (b) 폴리펩티드를 회수하는 단계를 포함한 본 발명의 폴리펩티드를 생성하는 방법에 관한 것이다. 바람직하게는, 상기 세포는 유로티움(Eurotium), 및 더 바람직하게는 유리티움 암스텔로다미(Eurotium amstelodami) 속이다.

본 발명은 또한 (a) 폴리펩티드의 생성을 유도하는 조건 하에서 숙주세포를 배양하는 단계, 및 (b) 폴리펩티드를 회수하는 단계를 포함한 본 발명의 폴리펩티드를 생성하는 방법에 관한 것이다.

본 발명은 또한 (a) 숙주세포는 SEQ ID NO:1의 성숙한 폴리펩티드 코딩 영역에 적어도 하나의 돌연변이를 가진 돌연변이체 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 돌연변이체 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO:2의 아미노산 1 내지 42로 구성된 폴리펩티드를 코딩하는, 폴리펩티드의 생성을 유도하는 조건 하에서 숙주세포를 배양하는 단계, 및 (b) 폴리펩티드를 회수하는 단계를 포함한, 본 발명의 폴리펩티드를 생성하는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 생산방법에서, 세포는 당업계에 공지된 방법을 사용하여 폴리펩티드의 생성에 적합한 영양 배지에서 배양된다. 예를 들면, 세포는 적합한 배지에서 그리고 폴리펩티드가 발현 및/또는 분리될 수 있는 조건 하에서 수행된 실험용 또는 산업용 발효기에서 교반 플라스크 배양, 및 작은 규모 또는 큰 규모의 발효(연속, 배치, 급식-배치, 또는 고체 상태 발효)에 의하여 배양될 수 있다. 배양은 당업계에 공지된 과정을 이용하여, 탄소 및 질소 공급원 및 무기염을 포함한 적합한 영양 배지에서 행해질 수 있다. 적합한 배지는 상업적 공급처에서 구입할 수 있거나 출판된 조성(예를 들면, 아메리칸 타입 컬처 콜렉션(American Type Culture Collection)의 카탈로그에 있는)에 따라서 제조될 수 있다. 폴리펩티드가 영양 배지에 분비되면, 그 폴리펩티드는 배지에서 직접 회수될 수 있다. 폴리펩티드가 분비되지 않으면, 세포 용해물에서 회수될 수 있다.

폴리펩티드는 그 폴리펩티드에 특이적인 당업계에 공지된 방법을 사용하여 검출될 수 있다. 이들 검출 방법은 특정 항체의 사용을 포함할 수 있다. 예를 들면, 항균성 분석은 본원에 설명된 폴리펩티드의 활성을 결정하는 데 사용될 수 있다.

결과로 얻어진 폴리펩티드는 당업계에 공지된 방법을 사용하여 회수될 수 있다. 예를 들면, 폴리펩티드는, 한정하는 것은 아니지만, 원심분리, 여과, 추출, 분사-건조, 증발, 또는 침전을 포함한 종래 과정에 의하여 영양 배지에서 회수될 수 있다.

본 발명의 폴리펩티드는, 한정하는 것은 아니지만, 크로마토그래피(예를 들면, 이온교환, 친화성, 소수성, 크로마토초점, 및 크기 배제), 전기영동 과정(예를 들면, 예비 등전위 초점), 차별 용해도(예를 들면, 황상암모늄 침전), SDS-PAGE, 또는 추출 (예를 들면, Protein Purification, J.-C. Janson and Lars Ryden, editors, VCH Publishers, New York, 1989 참조)을 포함한 당업계에 공지된 다양한 방법에 의하여 정제될 수 있다.

식물

본 발명은 또한 회수가능한 양으로 폴리펩티드를 발현시키고 생성하기 위하여 본 발명의 항균성을 가진 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열로 형질전환된 트랜스제닉 식물, 식물부분, 또는 식물세포에 관한 것이다. 폴리펩티드는 식물 또는 식물 부분으로부터 회수될 수 있다. 대안적으로, 재조합 폴리펩티드를 함유한 식물 또는 식물 부분은 음식 또는 급식의 질을 향상, 예를 들면 영양분 수치, 기호성, 및 유동학 특성을 향상시키거나, 또는 반영양 인자를 파괴하는 것으로 사용될 수 있다.

트랜스제닉 식물은 쌍떡잎식물 또는 외떡잎식물일 수 있다. 외떡이식물의 예는 왕포아풀(새포아풀, 포아)과 같은 풀, 페스투카(Festuca)와 같은 마초, 롤륨(Lolium), 아그로스티스(Agrostis)와 같은 온대풀, 및 곡류, 예를 들면 밀, 귀리, 호밀, 보리, 쌀, 수수, 및 옥수수이다.

쌍떡잎식물의 예는 담배, 콩과, 예를 들면 루핀, 감자, 사탕무, 완두콩, 강낭콩 및 대두, 그리고 십자화과 식물(십자화과), 예를 들면 콜리플라워, 평지씨, 및 밀접하게 연관된 모델 생물 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana)이다.

식물 부분의 예는 줄기, 캘러스, 잎, 뿌리, 열매, 씨, 및 덩이줄기뿐만 아니라 이들의 부분, 예를 들면 표피, 엽육, 실질, 관조직, 분열조직을 포함한 개개의 조직이다. 특정 식물세포 부분, 예를 들면 엽록체, 아포플라스트, 미토콘드리아, 액포, 퍼옥시좀 및 세포질은 또한 식물 부분인 것으로 간주된다. 더욱이, 조직 기원이 무엇이든지 간에, 어떤 식물 세포는 식물 부분인 것으로 간주된다. 마찬가지로, 본 발명의 활용을 촉진하기 위하여 분리된 특정 조직 및 세포와 같은 식물 부분은 또한 식물 부분, 예를 들면 배, 배젖, 호분, 및 종피인 것으로 간주된다.

이러한 식물, 식물 부분, 및 식물 세포의 자손은 본 발명의 범주 내에 포함된다.

본 발명의 폴리펩티드를 발현하는 트랜스제닉 식물 또는 식물세포는 당업계에 공지된 방법에 따라서 구성될 수 있다. 요컨대, 식물 또는 식물세포는 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 하나 이상의 발현 구성체를 식물 숙주 유전체에 혼입시키고 결과로 얻어진 변형된 식물 또는 식물세포를 트랜스제닉 식물 또는 식물세포로 증식시킴으로써 구성된다.

발현 구성체는 선택된 식물 또는 식물 부분에 뉴클레오티드 서열의 발현에 필요한 적합한 조절 서열과 작동가능하게 연결된 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한 편리한 핵산 구성체이다. 더욱이, 핵산 구성체는 발현 구성체가 통합된 숙주세포를 확인하기에 유용한 선택가능한 마커 및 문제의 식물에 구성체를 도입하기에 필요한 DNA 서열을 포함할 수 있다(후자는 사용되는 DNA 도입 방법에 의존한다).

프로모터 및 종결자 서열과 같은 조절 서열의 선택은 예를 들면 폴리펩티드가 언제, 어디서 그리고 어떻게 발현되는 것이 바람직한지에 기초하여 결정된다. 예를 들면, 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 유전자의 발현은 상시적이거나 유도성일 수 있고, 또는 발생 단계 또는 조직 특이적일 수 있으며, 유전자 산물은 종자 또는 잎과 같은 특정 조직 또는 식물 부분으로 표적화될 수 있다. 조절 서열은 예를 들면 문헌(Tague et al., 1988, Plant Physiology 86: 506)에 설명된다.

상시 발현을 위하여, 35S-CaMV, 옥수수 유비퀴틴 1, 및 쌀 액틴 1 프로모터가 사용될 수 있다(Franck et al., 1980, Cell 21: 285-294, Christensen et al., 1992, Plant Mo. Biol. 18: 675-689; Zhang et al., 1991, Plant Cell 3: 1155-1165). 기관-특이적 프로모터는 예를 들면 종자, 감자 덩이줄기, 및 열매와 같은 저장 싱크 조직(Edwards & Coruzzi, 1990, Ann. Rev. Genet. 24: 275-303), 또는 분열조직과 같은 대사 싱크 조직(Ito et al., 1994, Plant Mol. Biol. 24: 863-878)의 프로모터, 글루텔린, 프로라민, 글로불린과 같은 종자 특이적 프로모터, 또는 쌀의 알부민 프로모터(Wu et al., 1998, Plant and Cell Physiology 39: 885-889), 레구민 B4의 비시아 파바(Vicia faba) 프로모터 및 비시아 파바의 미지의 종자 단백질 유전자(Conrad et al., 1998, Journal of Plant Physiology 152: 708-711), 종유 체단백질의 프로모터(Chen et al., 1998, Plant and Cell Physiology 39: 935-941), 브라시카 나푸스(Brassica napus)의 저장 단백질 napA 프로모터, 또는 예를 들면 WO 91/14772에 설명된 바와 같이 당업계에 공지된 어떤 다른 종자 특이적 프로모터일 수 있다. 더욱이, 프로모터는 잎 특이적 프로모터, 예를 들면 쌀 또는 토마토의 rbcs 프로모터(Kyozuka et al., 1993, Plant Physiology 102: 991-1000, the chlorella virus adenine methyltransferase gene promoter (Mitra and Higgins, 1994, Plant Molecular Biology 26: 85-93), 또는 쌀의 aldP 유전자 프로모터(Kagaya et al., 1995, Molecular and General Genetics 248: 668-674), 또는 감자 pin2 프로모터와 같은 상처 유도성 프로모터(Xu et al., 1993, Plant Molecular Biology 22: 573-588)일 수 있다. 또한, 프로모터는 온도, 결핍, 또는 염분의 변경과 같은 비생물적인 처리에 의하여 유도될 수 있고, 또는 프로모터를 활성화하는 외생적으로 가해지는 물질, 예를 들면 에탄올, 에스트로겐, 식물 호르몬, 예를 들면 에틸렌, 엡시스산, 및 지베렐린산, 그리고 중금속에 의하여 유도될 수 있다.

프로모터 인핸서 성분은 또한 식물에서 본 발명의 폴리펩티드의 더 높은 발현을 얻는 데 사용될 수 있다. 예를 들면, 프로모터 인핸서 성분은 프로모터와 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 위치한 인트론일 수 있다. 예를 들면, 문헌(Xu et al., 1993, 상기참조)은 발현을 증대시키기 위하여 쌀 액틴 1 유전자의 첫 번째 인트론의 사용을 개시한다.

선택가능한 마커 유전자 및 발현 구성체의 어떤 다른 부분은 당업계에서 구입가능한 것들 중에서 선택할 수 있다.

핵산 구성체는 아그로박테리아-매개된 형질전환, 바이러스-매개된 형질전환, 미세주사, 입자 발사, 비올리스틱 형질전환, 및 일렉트로포레이션(Gasser et al., 1990, Science 244: 1293; Potrykus, 1990, Bio/Technology 8: 535; Shimamoto et al., 1989, Nature 338: 274)을 포함한 당업계에 공지된 종래의 기술에 따라서 식물 유전체에 혼입된다.

다른 형질전환 방법들도 이들 식물에 종종 사용될 수 있지만, 현재 아그로박테리아 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)-매개된 유전자 전달은 트랜스제닉 쌍떡잎식물을 발생시키기 위하여 선택한 방법이다(검토를 위하여, 문헌(Hooykas and Schilperoort, 1992, Plant Molecular Biology 19: 15-38)을 참조하라). 현재, 트랜스제닉 외떡잎식물을 발생시키기 위하여 선택한 방법은 배 칼리(calli) 또는 발생중인 배의 입자 발사이다(형질전환 DNA로 코팅된 초소형 금 또는 텅스텐 입자)(Christou, 1992, Plant Journal 2: 275-281; Shimamoto, 1994, Current Opinion Biotechnology 5: 158-162; Vasil et al., 1992, Bio/Technology 10: 667-674). 외떡잎식물의 형질전환을 위한 대안적 방법은 문헌(Omirulleh et al., 1993, Plant Molecular Biology 21: 415-428)에 설명된 원형질체 형질전환에 기초한다.

형질전환 후, 발현 구성체를 혼입한 형질전환체는 당업계에 주지된 방법에 따라서 선택되고 전체 식물로 재생된다. 종종 형질전환 과정은 예를 들면 두 분리된 T-DNA 구성체와의 공동-형질전환 또는 특정 재조합효소에 의한 선택 유전자의 부위 특이적 절단을 사용함으로써 재생하는 동안 또는 그 다음 세대에서 선택 유전자를 선택적 제거하도록 설계된다.

본 발명은 또한 (a) 폴리펩티드의 생성을 유도하는 조건 하에서 본 발명의 항균성을 가진 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한 트랜스제닉 식물 또는 식물세포를 배양하는 단계, 및 (b) 폴리펩티드를 회수하는 단계를 포함한 본 발명의 폴리펩티드를 생성하는 방법에 관한 것이다.

조성물

본 발명은 또한 본 발명의 폴리펩티드를 포함한 조성물, 예를 들면 약학적 조성물에 관한 것이다. 바람직하게는, 조성물은 이러한 폴리펩티드로 농축된다. 용어 "농축된"은 조성물의 항균성이 예를 들면 1.1의 농축 인자로 증가되었다는 것을 나타낸다.

조성물은 다른 약학적 활성제, 예를 들면 추가 살균제, 예를 들면 앞에서 정의한 항균성을 나타내는 다른 항미생물 폴리펩티드를 더 포함할 수 있다. 살균제는 당업계에 공지된 바와 같이 항생제일 수 있다. 항생제의 부류는 페니실린, 예를 들면 페니실린 G, 페니실린 V, 메티실린, 옥사실린, 카베니실린, 나프실린, 앰피실린 등; 베타-락타마제 억제제와 조합된 페니실린, 세팔로스포린, 예를 들면, 세파클로, 세파졸린, 세푸록심, 목살락탐 등; 카바페넴; 모노박탐; 아미노글리코시드; 테트라사이클린; 마크롤리드; 린코마이신; 폴리믹신; 술포나미드; 퀴놀론; 클로람페니컬; 메트로니다졸; 스펙티노마이신; 트리메토프림; 반코마이신 등을 포함한다. 살균제는 또한 폴리엔, 예를 들면 암포테리신 B, 니스타틴; 5-플루코신; 및 아졸, 예를 들면 미코나졸, 케토코나졸, 이트라코나졸 및 플루코나졸을 포함한 항-진균제일 수 있다.

한 구체예에서, 살균제는 비-효소 화학적 제제이다. 다른 구체예에서, 살균제는 비-폴리펩티드 화학적 제제이다.

조성물은 적합한 담체 물질을 포함할 수 있다. 조성물은 또한 조성물이 의약으로 사용될 때 본 발명의 항미생물 폴리펩티드를 원하는 유전자좌에 전달할 수 있는 적합한 전달 비히클을 포함할 수 있다.

폴리펩티드 조성물은 당업계에 공지된 방법에 따라서 제조될 수 있으며 액체 또는 건조된 조성물의 형태일 수 있다. 예를 들면, 폴리펩티드 조성물은 과립 또는 미세과립의 형태일 수 있다. 조성물에 포함된 폴리펩티드는 당업계에 공지된 방법에 따라서 안정화될 수 있다.

본 발명의 폴리펩티드 조성물의 바람직한 사용의 예는 아래에 제공된다. 본 발명의 폴리펩티드 조성물의 투여량 및 그 조성물이 사용되는 다른 조건들은 당업계에 공지된 방법에 기초하여 결정될 수 있다.

방법 및 사용

본 발명은 또한 항균성을 가진 폴리펩티드를 사용하는 방법에 관한 것이다. 항균 폴리펩티드는 전형적으로 박테리아, 진균, 효모 또는 조류에 의하여 오염된 어떤 위치에 유용하다. 전형적으로, 위치는 미생물을 죽일 필요가 있거나 그것들의 성장을 제어할 필요가 있는 냉각수 시스템, 세탁물 헹군물, 절삭유, 윤활유, 유전 등과 같은 오일 시스템이다. 그러나, 본 발명은 나무, 라텍스, 접착제, 아교, 종이, 보드지, 직물, 가죽, 플라스틱, 코킹, 및 사료의 보호와 같은, 공지된 항균 조성물이 유용한 모든 응용분야에 사용될 수 있다.

다른 사용은 음식, 음료, 로션, 크림과 같은 화장품, 겔, 연고, 비누, 샴푸, 컨디셔너, 지한제, 방취제, 구강청결제, 컨택트 렌즈 제품, 또는 음식 성분의 보존을 포함한다.

따라서, 본 발명의 항균 폴리펩티드는 예를 들면 눈 또는 입의 감염, 피부 감염의 치료에 소독제로; 지한제 또는 방취제로; 컨텍트 렌즈 및 치아(구강 케어)의 세척 및 소독에 유용할 수 있다.

대체로, 본 발명의 항균 폴리펩티드는 세척하고, 소독하고, 또는 어떤 표면에서 미생물의 성장을 억제하는 데 유용하다. 본 발명의 항균 폴리펩티드와 유리하게 접촉될 수 있는 표면의 예는 사용된 가공 설비, 예를 들면 착유장, 화학적 또는 약학적 가공시설, 물 위생 시스템, 오일 가공시설, 종이 펄프 가공시설, 수질정화시설, 및 냉각 타워의 표면이다. 본 발명의 항균 폴리펩티드는 세척, 소독 또는 문제의 표면에서 미생물의 성장의 억제에 효과적인 양으로 사용되어야 한다.

본 발명의 항균 폴리펩티드는 추가로 식품가공설비 그리고 병원, 요양원, 및 레스토랑과 같은 음식이 준비되거나 공급되는 어떤 지역에서 표면 및 요리 도구를 세척하는 데 사용될 수 있다.

이것은 또한 수성페인트에서 보존제 또는 소독제로 사용될 수 있다.

본 발명은 또한 의약으로서 본 발명의 항균 폴리펩티드 또는 조성물의 사용에 관한 것이다. 나아가, 본 발명의 항균 폴리펩티드 또는 조성물은 진균 생물 또는 박테리아, 바람직하게는 그람 양성 박테리아와 같은 미생물을 제어하거나 그것들과 싸우기 위한 의약의 제조에 사용될 수 있다.

본 발명의 조성물 및 항균 폴리펩티드는 항균 수의사 또는 사람 치료제 또는 예방제로 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명의 조성물 및 항균 폴리펩티드는 미생물 감염, 예를 들면 박테리아 또는 곰팡이 감염, 바람직하게는 그람 양성 박테리아 감염의 치료를 위한 수의사 또는 사람 치료제 또는 예방제로 사용될 수 있다. 특히, 미생물 감염은, 한정하는 것은 아니지만, 결핵, 폐렴 및 낭포성 섬유증을 포함한 폐 질환; 한정하는 것은 아니지만, 임질 및 클라미디아를 포함한 성병과 연관될 수 있다.

본 발명의 조성물은 본 발명의 항균 폴리펩티드의 효과적인 양을 포함한다.

본원에 사용될 때 용어 "효과적인 양"은 문제의 미생물의 성장을 억제하기에 충분한 본 발명의 항균 폴리펩티드의 양을 의미하는 것으로 의도된다.

본 발명은 또한 붕대와 같은 상처치료 조성물 또는 제품, 예를 들면 카테터와 같은 의료장치 그리고 나아가 샴푸와 같은 비듬방지 모발 제품에 관한 것이다.

본 발명의 항균 폴리펩티드의 제제는 미생물 감염이 됐거나 감염이 될 가능성이 있는 숙주에 투여된다. 투여는 특정 미생물에 따라서 국부, 국소 또는 전신일 수 있으며, 바람직하게는 국소적일 것이다. 일반적으로, 본 발명의 항균 폴리펩티드의 투여량은 미생물 집단을 적어도 약 50%, 대개는 적어도 1 로그 감소시키기에 충분할 것이며, 2 로그 이상을 죽일 수 있다. 본 발명의 화합물은 어떤 부작용을 최소화하면서 미생물 집단을 감소시키는 투여량으로 투여된다. 조성물은 얻어져 생체내 사용을 위한 의사의 지침에 따라서 사용될 것으로 생각된다. 본 발명의 항균 폴리펩티드는 그람 음성 박테리아, 예를 들면 슈도모나스 에루기노사(Pseudomonas aeruginosa), 및 클라미디아 트라코마티스(Chlamydia trachomatis); 및 그람-양성 박테리아, 예를 들면 스트렘토코시(streptococci), 예를 들면 스트렙토코커스 뉴모니아(Streptococcus pneumonia), S. 우베리스(S. uberis), S. 효인테스티날리스(S. hyointestinalis), S. 표게네스(S. pyogenes) 또는 아갈락티아(agalactiae); 및 스타파일로코시(staphylococci), 예를 들면 스타파일로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), S. 에피데르미디스(S. epidermidis), S. 시물란스(S. simulans), S. 자일로서스(S. xylosus), S. 카노서스(S. carnosus)를 죽이는 데 특히 유용하다.

본 발명의 항균 폴리펩티드의 제제는 미생물 폐 감염, 예를 들면 폐렴 또는 미생물 상처 감염, 예를 들면 박테리아 상처 감염에 걸렸거나 걸리기 쉬운 숙주에 투여될 수 있다.

본 발명의 항균 폴리펩티드의 제제는 또한 피부 감염, 예를 들면 여드름, 아토피성 피부염 또는 지루성 피부염에 걸렸거나 걸리기 쉬운 숙주에 투여될 수 있으며, 바람직하게는 피부 감염은 예를 들면 스타파일로코커스 에피데르미디스(Staphylococcus epidermidis), 스타파일로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 프로피오니박테리움 아크네(Propionibactehum acne), 피티로스포룸 오발레(Pityrosporum ovale) 또는 말라세지아 푸르푸르(Malassezia furfur)에 의하여 야기된 박테리아의 피부 감염이다.

본 발명의 항균 폴리펩티드는 또한 특히 종래의 항생제의 양을 도입하는 것을 희망하지 않는 경우 미생물을 죽이는 시험관내 제조에 유용하다. 예를 들면, 본 발명의 항균 폴리펩티드는 동물 및/또는 사람 음식 제제에 첨가될 수 있거나, 조직 배양에서 미생물의 과성장을 방지하기 위하여 세포의 시험관내 배양을 위한 첨가제로 포함될 수 있다.

본 발명의 항균 폴리펩티드를 통한 살균에 대한 특정 미생물의 감수성은 실험 분야에서 상세하게 설명된 시험관내 테스트로 결정될 수 있다. 통상적으로, 미생물의 배양물을 단백질이 작용하기에 충분한 시간 동안, 대개 약 1 시간 내지 1일 동안 다양한 농도의 항균 폴리펩티드와 합한다. 그 다음, 살아있는 미생물을 계수하여, 죽은 것의 수준을 결정한다.

관심있는 미생물은, 한정하는 것은 아니지만, 그람-음성 박테리아, 예를 들면 시트로박터 sp.(Citrobacter sp .); 엔테로박터 sp.(Enterobacter sp .); 에스케리치아 sp.(Escherichia sp .), 예를 들면 대장균; 클렙시엘라 sp.(Klebsiella sp.); 모르가넬라 sp.(Morganella sp .); 프로테우스 sp.(Proteus sp .); 프로비덴시아 sp.(Providencia sp .); 살모넬라 sp.(Salmonella sp .), 예를 들면 S. 타이피(S. typhi), S. 타이피무리움(S. typhimurium); 세라티아 sp.(Serratia sp .); 시겔라 sp.(Shigella sp .); 슈도모나스 sp.(Pseudomonas sp .), 예를 들면 P. 에루기노사(P. aeruginosa); 예르시니아 sp.(Yersinia sp .), 예를 들면 Y. 페스티스(Y. pestis), Y. 슈도투베르쿨로시스(Y. pseudotuberculosis), Y. 엔테로콜리티카(Y. enterocolitica); 프란시셀라 sp.(Franciscella sp .); 파스투렐라 sp.(Pasturella sp.); 비브리오 sp.(Vibrio sp .), 예를 들면 V. 콜레라(V. cholerae), V. 파라헤모리티커스(V. parahemolyticus); 캄필로박터 sp.(Campylobacter sp .), 예를 드면 C. 제주니(C. jejuni); 헤모필루스(Haemophilus sp .), 예를 들면 H. 인플루엔자(H. influenzae), H. 두크레이(H. ducreyi); 보르데텔라 sp.(Bordetella sp .), 예를 들면 B. 페르투시스(B. pertussis), B. 브론치셉티카(B. bronchiseptica), B. 파라페르투시스(B. parapertussis); 부루셀라 sp.(Brucella sp .), 네이세리아 sp.(Neisseria sp .), 예를 들면, N. 고노로이(N. gonorrhoeae), N. 메닌기티디스(N. meningitidis) 등을 포함한다. 관심있는 다른 박테리아는 레지오넬라 sp.(Legionella sp .), 예를 들면 L. 뉴모필라(L. pneumophila); 리스테리아 sp.(Listeria sp .), 예를 들면 L. 모노시토게네스(L. monocytogenes); 미코플라스마 sp.(Mycoplasma sp .), 예를 들면 M. 호미니스(M. hominis), M. 뉴모니아(M. pneumoniae); 미코박테리움 sp.(Mycobacterium sp .), 예를 들면 M. 투베르쿨로시스(M. tuberculosis), M. 레프래(M. leprae); 트레포네마 sp.(Treponema sp .), 예를 들면 T. 팔리둠(T. pallidum); 보렐리아 sp.(Borrelia sp .), 예를 들면 B. 부르그도르페리(B. burgdorferi); 렙토스피래 sp.(Leptospirae sp .); 리케차 sp.(Rickettsia sp .), 예를 들면 R. 리케치(R. rickettsii), R. 타이피(R. typhi); 클라미디아 sp.(Chlamydia sp .), 예를 들면 C. 트라코마티스(C. trachomatis), C. 뉴모니아(C. pneumoniae), C. 시타시(C. psittaci); 헬리코막터 sp.(Helicobacter sp.), 예를 들면 H. 파일로리(H. pylori) 등을 포함한다.

관심있는 비-박테리아는 진균 및 원생동물 병원균, 예를 들면 플라스모디아 sp.(Plasmodia sp .), 예를 들면 P. 팔시파룸(P. falciparum), 트립파노소마 sp.(Trypanosoma sp .), 예를 들면 T. 브루세이(T. brucei); 시스토소메스(shistosomes); 엔테모바 sp.(Entaemoeba sp .), 크립토코커스 sp.(Cryptococcus sp.), 캔디다 sp.(Candida sp .), 예를 들면 C. 알비칸스(C. albicans) 등을 포함한다.

다양한 투여 방법이 사용될 수 있다. 폴리펩티드 제제는 경구로 제공될 수 있거나, 혈관내, 피하, 복막내, 에어로졸, 눈, 방광내, 국소 등으로 주입될 수 있다. 예를 들면, 흡입에 의한 투여 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 치료제의 투여량은 투여되는 특정 항균 폴리펩티드, 질환의 성질, 투여 빈도, 투여 방식, 숙주에서 제제의 제거율 등에 따라서 널리 다양할 것이다. 초기 투여량은 더 많을 수 있지만, 그 후에는 더 적은 유지 투여량일 수 있다. 투여량을 주마다, 또는 2주마다 드믈게 투여할 수 있지만, 효과적인 투여량 수준을 유지하기 위하여 더 적은 투여량으로 나누어 매일, 주2회 한 번 또는 몇 번 투여할 수 있다. 많은 경우에, 경구 투여는 정맥내로 투여되는 경우보다 더 높은 투여량을 요구할 것이다. 아미노 및 카르복시 말단뿐만 아니라 아미드 결합은 경구 투여에 대한 더 큰 안정성을 위하여 변형될 수 있다. 예를 들면, 카르복시 말단은 아미드화될 수 있다.

제형

본 발명의 화합물은 치료적 투여를 위한 다양한 제형으로 혼입될 수 있다. 더 구체적으로, 본 발명의 화합물은 적합한, 약학적으로 허용되는 담체 또는 희석제와 조합하여 약학적 조성물로 제조될 수 있으며, 고체, 반-고체, 액체 또는 기체 형태, 예를 들면 정제, 캡슐, 분말, 과립, 연고, 크림, 거품, 용액, 좌약, 주사, 흡입, 겔, 미소구체, 로션, 및 에어로졸의 제제로 제조될 수 있다. 따라서, 화합물의 투여는 경구, 구강, 직장, 비경구, 복막내, 진피내, 경피, 기관내 등의 투여를 포함한 다양한 방식으로 이루어질 수 있다. 본 발명의 항균 폴리펩티드는 투여 후 전신성일 수 있거나 주입 부위에 활성 투여량을 보유하도록 작용하는 임플란트 또는 다른 제제의 사용에 의하여 국부적일 수 있다.

한 구체예에서, 국부 사용을 위한 제제는 2가 양이온, 특히 칼슘 및 마그네슘의 효과적인 농도를 감소시키는 킬레이트 제제를 포함한다. 예를 들면, 시트르산염, EGTA 또는 EDTA와 같은 제제는 시트르산염이 바람직한 경우 포함될 수 있다. 시트르산염의 농도는 대개 약 1 내지 10 mM일 것이다.

본 발명의 화합물은 단독으로, 서로 조합하여 투여될 수 있거나, 또는 다른 공지된 화합물(예를 들면, 페르포린, 항-염증제, 항생제 등)과 조합하여 사용될 수 있다. 약학적 투여 형태에서, 화합물은 그것들의 약학적으로 허용되는 염의 형태로 투여될 수 있다. 다음 방법 및 첨가제는 단지 설명을 위한 것이지 결코 제한하려는 것이 아니다.

경구 제제의 경우, 화합물은 단독으로 또는 정제, 분말, 과립 또는 캡슐을 만들기 위한 적합한 첨가제, 예를 들면, 종래의 첨가제, 예를 들면 락토스, 만니톨, 옥수수 녹말 또는 감자 녹말; 바인더, 예를 들면 결정질 셀룰로스, 셀룰로스 유도체, 아카시아, 옥수수 녹말 또는 젤라틴; 분해제, 예를 들면 옥수수 녹말, 감자 녹말 또는 소듐 카르복시메틸셀룰로스; 윤활제, 예를 들면 탈크 또는 스테아르산마그네슘; 원하는 경우 희석제, 완충제, 습윤제, 보존제 및 향료와 조합하여 사용될 수 있다.

화합물은 그것들을 수용성 또는 비수용성 용매, 예를 들면 식물성 또는 다른 유사한 오일, 합성 지방산 글리세리드, 고지방산의 에스테르 또는 프로필렌 글리콜에 원하는 경우 종래의 첨가제, 예를 들면 가용화제, 등장제, 현탁제, 유화제, 안정제 및 보존제와 함께 그것들을 용해, 현탁 또는 유화시켜 제조될 수 있다.

화합물은 흡입을 통하여 투여되도록 에어로졸 형태로 이용될 수 있다. 본 발명의 화합물은 가압 허용가능한 추진제, 예를 들면 디클로로디플루오로메탄, 프로판, 질소 등으로 제조될 수 있다.

화합물은 예를 들면 종래의 첨가제, 예를 들면 용해제, 등장제, 현탁제, 유화제, 안정제 및 보존제를 가진 제형에 의하여, 예를 들면 화상의 감염을 방지하는 로션으로 사용될 수 있다.

또한, 화합물은 유화 염기 또는 수용성 염기와 같은 다양한 염기와 혼합하여 좌약으로 만들 수 있다. 본 발명의 화합물은 좌역을 통하여 직장으로 투여될 수 있다. 좌약은 체온에서는 녹지만 실온에서는 응고되는 코코아 버터, 카보왁스 및 폴리에틸렌 글리콜과 같은 비히클을 포함할 수 있다.

각 투여 단위, 예를 들면 티스푼, 테이블스푼의 정제 또는 좌약이 본 발명의 하나 이상의 화합물을 함유한 조성물의 사전결정된 양을 함유한 시럽, 엑릭시르, 및 현탁액과 같은 경구 또는 직장 투여를 위한 단위 투여 형태가 제공될 수 있다. 유사하게, 주사 또는 정맥내 투여를 위한 단위 투여 형태는 멸균수, 보통의 식염수, 또는 다른 약학적으로 허용되는 담체 중의 용액과 같은 조성물에 본 발명의 화합물을 포함할 수 있다.

지속적 분비 제형을 위한 임플란트는 당업계에 잘 알려져 있다. 임플란트는 생분해가능하거나 비-생분해가능한 폴리머를 가진 미소구체, 슬래브 등으로 제조된다. 예를 들면, 락트산 및/또는 글리콜산의 폴리머는 숙주에 의한 좋은 내성이 있는 분해성 폴리머를 형성한다. 본 발명의 항균 폴리펩티드를 함유한 임플란트는 활성제의 국부 농도가 몸의 나머지 부분에 비해서 증가하도록 감염의 부위에 인접하여 위치한다.

본원에 사용된 용어 "단위 투여 형태"는 사람 및 동물 피험체에 대하여 단일 투여로 적합한 물리적으로 분리된 단위를 말하는데, 본 발명의 화합물의 사전결정된 양을 함유한 각 단위는 약학적으로 허용된 희석제, 담체 또는 비히클과 연관하여 원하는 효과를 만들기에 충분한 양으로 계산된다. 본 발명의 단위 투여 형태의 상세사항은 사용되는 특정 화합물 및 달성되어야하는 효과, 및 숙주에서 화합물과 연관된 약동학에 의존한다.

비히클, 보조제, 담체 또는 희석제와 같은 약학적으로 허용되는 첨가제는 시중에서 용이하게 구입할 수 있다. 더욱이, 약학적으로 허용되는 보조물질, 예를 들면 pH 조절제 및 완충제, 삼투조절제, 안정제, 습윤제 등은 시중에서 용이하게 구입할 수 있다.

전신 투여를 위한 전형적인 투여량의 범위는 투여시 피험체의 체중 당 0.1 pg 내지 100 mg이다. 전형적인 투여량은 매일 2 내지 6회 한 개의 정제 투여, 또는 하루에 한 번 1회-분비 캡슐 또는 정제 투여일 수 있으며, 활성 성분의 비례적으로 더 높은 양을 함유할 수 있다. 시간-분비 효과는 다른 pH 값에서 용해하는 캡슐 물질에 의하여, 삼투압에 의하여 천천히 분비되는 캡슐에 의하여, 또는 제어된 분비의 어떤 다른 알려진 수단에 의하여 얻어질 수 있다.

당업자는 투여량 수준은 특정 화합물의 기능, 증상의 심각성 및 부작용에 대한 피험체의 감수성에 따라서 다양할 수 있음을 용이하게 이해할 것이다. 특정 화합물 중 일부는 다른 것들보다 더 효능이 있다. 주어진 화합물의 바람직한 투여량은 다양한 수단에 의하여 당업자가 용이하게 결정할 수 있다. 바람직한 수단은 주어진 화합물의 생리학적 효능을 측정하는 것이다.

전달 비히클로서 리포솜을 사용하는 것은 관심대상의 한 방법이다. 리포솜은 표적 부위의 세포와 융합하여 세포내로 루멘의 함유물을 전달한다. 리포솜은 분리, 결합제 등과 같은 접촉을 유지하는 다양한 수단을 사용하여 융합에 충분한 시간 동안 세포와 접촉하여 유지된다. 본 발명의 한 양태에서, 리포솜은 폐 투여를 위하여 에어로졸화되도록 설계된다. 리포솜은 센다이 바이러스 또는 인플루엔자 바이러스 등과 같이, 막의 융합을 매개하는 정제된 단백질 또는 펩티드로 제조될 수 있다. 지질은 포스파티딜콜린과 같은 양이온 또는 쌍성이온 지질을 포함한 공지된 리포솜 형성 지질의 어떤 유용한 조합일 수 있다. 나머지 지질은 보통 콜레스테롤, 포스파티딜 세린, 포스파티딜 글리세롤 등과 같이 중성 또는 산성 지질일 것이다.

리포솜을 제조하기 위하여, Kato et al. (1991) J. Biol. Chem. 266:3361에 설명된 과정이 사용될 수 있다. 간단히 말하면, 지질과 펩티드를 포함한 루멘은 적합한 수용성 매질, 간편하게는 전체 고체가 약 1-10 중량%의 범위인 식염수 매질에서 조합된다. 짧은 시간 동안, 약 5-60초 동안 강하게 교반한 후, 튜브를 약 25-40℃의 온수욕에 놓고 이 사이클을 약 5-10회 반복한다. 그 후 조성물을 편리한 시간 동안, 일반적으로는 약 1-10 초 동안 초음파분해하고, 와동하여 더 교반할 수 있다. 그 후 수용성 매질을 첨가, 일반적으로 약 1-2 배 부피를 증가시키고, 이어서 교반 및 냉각을 시킴으로써 부피를 증량한다. 이 방법은 고분자량 분자의 루멘으로 혼입하는 것을 고려한다.

다른 활성제를 가진 제형

피험체 방법에서 사용하기 위하여, 본 발명의 항균 폴리펩티드는 다른 약학적 활성제, 특히 다른 항균제로 제조될 수 있다. 관심 대상의 다른 제제는 당업계에 공지된 다양한 항생제를 포함한다. 항생제의 부류는 페니실린, 예를 들면 페니시린 G, 페니실린 V, 메티실린, 옥살실린, 카르베니실린, 나프실린, 앰피실린 등; 베타-락타마제 억제제, 세팔로스포린과 조합된 페니실린, 예를 들면 세파클로, 세파졸린, 세푸록심, 모살락탐 등; 카바페넴; 모노박탐; 아미노글리코시드; 테트라사이클린; 매크롤리드; 린코마이신; 폴리믹신; 술폰아미드; 퀴놀론; 클로람페니콜; 메토로니다졸; 스펙티노마이신; 트리메토프림; 반코마이신 등을 포함한다.

폴리엔, 예를 들면 암포테리신 B, 니스타틴; 5-플루코신; 및 아졸, 예를 들면 미노나졸, 케토코나졸, 이트라코나졸 및 플루코나졸을 포함한 항진균제가 또한 유용하다. 항결핵 약물은 이소니아지드, 에탐부톨, 스트렙토마이신 및 리팜핀을 포함한다. 사이토카인은 또한 본 발명의 항균 폴리펩티드의 제형, 예를 들면, 인터페론 감마, 종양 괴사 인자 알파, 인터류킨 12 등에 포함될 수 있다.

시험관내 합성

본 발명의 항균 폴리펩티드는 당업계에 공지된 종래 방법을 사용하여 시험관내 합성에 의하여 제조될 수 있다. 다양한 상업적 합성 장치, 예를 들면 Applied Biosystems Inc., Beckman 등과 같은 자동 합성기가 이용가능하다. 합성기를 사용하여, 자연적으로 발생하는 아미노산은 비자연적인 아미노산, 특히 D-이성질체(또는 D-형태) 예를 들면, D-알라닌 및 D-이소류신, 부분입체이성질체, 다른 길이 또는 기능성을 가진 측쇄 등으로 치환될 수 있다. 특정 서열 및 제조 방식은 편리성, 경제성, 필요한 순도 등에 의하여 결정될 것이다.

화학결합은 결합의 편리한 기능성, 예를 들면 아미드의 아민기 또는 치환된 아민 형성, 예를 들면 환원성 아민화, 티올에테르의 티올기 또는 이황화 형성, 아미드 형성의 카르복실기 등을 포함한 다양한 펩티드 또는 단백질에 제공될 수 있다.

원한다면, 다른 분자 또는 표면에 대한 결합에 관여하는 다양한 기는 합성하는 동안 또는 발현하는 동안 펩티드에 도입될 수 있다. 따라서, 시스테인은 금속이온 복합체에 연결하기 위한 티오에테르, 히스티딘, 아미드 또는 에스테르를 형성하기 위한 카르복실기, 아미드를 형성하기 위한 아미노기 등을 만드는 데 사용될 수 있다.

폴리펩티드는 또한 재조합 합성의 종래 방법에 따라서 분리되고 정제될 수 있다. 용해물은 발현 숙주에서 준비될 수 있으며, 용해물은 HPLC, 배제 크로마토그래피, 겔 전기영동, 친화성 크로마토그래피, 도는 다른 정제 기술을 사용하여 정제될 수 있다. 대부분의 경우, 사용되는 조성물은 원하는 생성물의 적어도 20 중량%, 더 통상적으로는 적어도 약 75 중량%, 바람직하게는 적어도 약 95 중량%, 그리고 치료 목적을 위하여는, 생성물의 제조 및 그것의 정제 방법과 관련된 오염물질과 관련하여 통상적으로 적어도 약 99.5 중량%를 포함할 것이다. 대개, 백분율은 전체 단백질에 기초할 것이다.

동물 급식

본 발명은 또한 조성물을 급식하고 본 발명의 항균 폴리펩티드를 포함한 첨가제를 급식하는 것뿐만 아니라 동물 급식에 항균성을 가진 폴리펩티드를 사용하기 위한 방법에 관한 것이다.

용어 동물은 사람을 포함한 모든 동물을 포함한다. 동물의 예는 비-반추 동물, 및 반추 동물, 예를 들면 소, 양 및 말이다. 어떤 구체예에서, 동물은 비-반추 동물이다. 비-반추 동물은 단위(mono-gastric) 동물, 예를 들면 돼지 또는 스와인(한정하는 것은 아니지만, 새끼돼지, 성장중인 돼지, 및 암퇘지를 포함); 가금, 예를 들면 칠면조 및 닭(한정하는 것은 아니지만, 브로일러, 알 낳는 닭); 어린 송아지; 및 물고기(한정하는 것은 아니지만, 연어 포함)를 포함한다.

용어 급식 또는 급식 조성물은 동물에 의한 섭취에 적합한, 또는 그것을 위해 의도된 어떤 화합물, 제제, 혼합물, 또는 조성물을 의미한다.

본 발명에 따른 사용에서, 항균 폴리펩티드는 규정식 전에, 후에, 또는 동시에 동물에 급식될 수 있다. 후자가 바람직하다.

어떤 구체예에서, 항균 폴리펩티드는 급식에 첨가되는 형태로, 또는 급식 첨가제에 포함될 때 정의가 명확하다. 정의가 명확한이란 항균 폴리펩티드 제제가 크기-배제 크로마토그래피에 의하여 결정할 때 적어도 50% 순수하다는 것을 의미한다(WO 01/58275의 실시예 12 참조). 다른 어떤 구체예에서, 항균 폴리펩티드 제제는 이 방법에 의하여 결정할 때 적어도 60, 70, 80, 85, 88, 90, 92, 94, 또는 적어도 95% 순수하다.

정의가 명확한 항균 폴리펩티드 제제가 이롭다. 예를 들어, 급식물에 필수적으로 다른 항균 폴리펩티드를 방해하거나 오염시키지 않는 항균 폴리펩티드를 정확하게 투여하는 것이 훨씬 더 용이하다. 용어 정확하게 투여한다는 것은 특히 일관되고 일정한 결과를 얻으려는 목적과 원하는 효과에 기초한 투여량을 최적화하는 능력을 말한다.

그러나, 동물 급식에 사용하기 위하여, 항균 폴리펩티드는 그렇게 순수할 필요는 없고, 예를 들면 다른 효소를 포함할 수 있으며, 이 경우에도 그것은 항균 폴리펩티드 제제라고 말할 수 있다.

항균 폴리펩티드 제제는 (a) 급식에 직접 첨가될 수 있거나(또는 식물단백질의 처리 과정에 직접 사용될 수 있다), 또는 (b) 연속적으로 급식에 첨가되는 급식 첨가제 또는 프리믹스와 같은 하나 이상의 중간 조성물의 생산에 사용될 수 있다(또는 처리 과정에 사용될 수 있다). 전술한 순도의 정도는 상기 (a) 또는 (b)에 따라서 사용되든지 간에 원래의 항균 폴리펩티드 제제의 순도를 말한다.

10배까지의 순도를 가진 항균 폴리펩티드 제제는 특히 재조합 생산방법을 사용하여 얻을 수 있지만, 항균 폴리펩티드가 전통적인 발효 방법에 의하여 생산될 때 그것들이 쉽게 얻어지지 않고 더 높은 배치(batch) 대 배치 변이를 따른다.

이러한 항균 폴리펩티드 제제는 물론 다른 효소와 혼합될 수 있다.

본원에 사용된 용어 식물 단백질은 변형된 단백질 및 단백질 유도체를 포함한 식물에서 유래된 또는 기원하는 적어도 하나의 단백질을 포함한 어떤 화합물, 조성물, 제제 또는 혼합물을 말한다. 어떤 구체예에서, 식물 단백질의 단백질 함량은 적어도 10. 20, 30, 40, 50, 또는 60%이다(w/w).

식물 단백질은 식물 단백질 공급원, 예를 들면 콩과 및 곡류, 예를 들면 파바시(Fabaceae)(레구미노사;Leguminosae), 쿠루시페라시(Cruciferaceae), 케노포디아시(Chenopodiaceae), 및 포아시(Poaceae) 과의 식물로부터의 물질, 예를 들면 콩식사, 루핀 식사 및 평지씨에서 유래할 수 있다.

어떤 구체예에서, 식물 단백질 공급원은 파바시과의 하나 이상의 식물, 예를 들면 대두, 루핀, 강낭콩, 또는 완두콩의 물질이다.

다른 어떤 구체예에서, 식물 단백질 공급원은 케노포디아시 과의 하나 이상의 단백질, 예를 들면 비트, 사탕무, 시금치 또는 퀴노아의 물질이다.

식물 단백질 공급원의 다른 예는 평지씨, 및 양배추이다.

대두는 바람직한 식물 단백질 공급원이다.

식물 단백질 공급원의 다른 예는 곡류, 예를 들면 보리, 밀, 호밀, 귀리, 옥수수, 쌀, 및 수수이다.

항균 폴리펩티드는 상대적으로 순수한 항균 폴리펩티드로서, 또는 동물 급식에 첨가하기 위하여 의도된 다른 성분과 혼합하여, 즉 소위 동물 급식을 위한 프리믹스와 같이 동물 급식 첨가제의 형태로 어떤 형태로든지 급식에 첨가될 수 있다.

다른 양태에서, 본 발명은 동물 급식, 및 동물 급식 첨가제, 예를 들면 프리믹스와 같은 동물 급식에 사용하기 위한 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 항균 폴리펩티드와 별개로, 본 발명의 동물 급식 첨가제는 적어도 하나의 지방 가용성 비타민, 및/또는 적어도 하나의 수용성 비타민 및/또는 적어도 하나의 미량미네랄, 및/또는 적어도 하나의 다량미네랄을 함유한다.

또한, 선택적, 급식-첨가제 성분은 착색제, 방향족 화합물, 안정제, 및/또는 피타제 EC 3.1.3.8 또는 3.1.3.26; 자일라나제 EC 3.2.1.8; 갈락타나제 EC 3.2.1.89; 및/또는 베타-글루카나제 EC 3.2.1.4 중에서 선택된 적어도 하나의 다른 효소이다.

어떤 구체예에서, 이들 다른 효소는 정의가 명확하다(항균 폴리펩티드 제제에 대하여 상기에서 정의한 바와 같이).

다른 항균 펩티드(AMP)의 예는 CAP18, 류코신 A, 트리트립티신, 프로테그린-1, 타나틴, 방어소, 노비스피린과 같은 오비스피린(Robert Lehrer, 2000) 및 항균 활성을 보유한 변이체, 또는 그것의 단편이다.

다른 항진균 폴리펩티드(AFP)의 예는 WO 94/01459 및 WO 02/090384에 개시된 바와 같이 아스페르길러스 기간테우스(Aspergillus giganteus), 및 아스페르길러스 니게르(Aspergillus niger) 펩티드뿐만 아니라 항진균 활성을 보유한 변이체 및 그것의 단편이다.

대개 지용성 및 수용성 비타민뿐만 아니라 미량미네랄은 급식에 첨가하기 위하여 의도된 소위 프리믹스의 부분을 형성하지만, 다량미네랄은 대개 급식에 별개로 첨가된다. 본 발명의 항균 폴리펩티드로 농축되면 이들 조성물 유형의 어떤 것이든지 본 발명의 동물 급식 첨가제이다.

어떤 구체예에서, 본 발명의 동물 급식 첨가제는 동물 규정식 또는 급식에 0.01 내지 10.0%; 더 특히 0.05 내지 5.0%; 또는 0.2 내지 1.0% (%는 100 g 급식 당 g 첨가제를 의미한다)의 수준으로 포함되도록 의도된다. 이것은 특히 프리믹스의 경우 그러하다.

다음은 이들 성분의 예의 추가적 목록이다:

지용성 비타민의 예는 비타민 A, 비타민 D3, 비타민 E, 및 비타민 K, 예를 들면 비타민 K3이다.

수용성 비타민의 예는 비타민 B12, 비오틴 및 콜린, 비타민 B1, 비타민 B2, 비타민 B6, 니아신, 폴산 및 판토텐산, 예를 들면 Ca-D-판토텐산이다.

미량미네랄의 예는 망간, 아연, 철, 구리, 요오드, 셀레늄, 및 코발트이다.

다량미네랄의 예는 칼슘, 인 및 나트륨이다.

이들 성분의 영양분 조건(가금 및 새끼 돼지/돼지로 예시된)은 WO 01/58275의 표 A에 열거된다. 영양분 조건이란 이들 성분이 지시된 농도의 규정식으로 제공되어야 한다는 것을 의미한다.

대안적으로, 본 발명의 동물 급식 첨가제는 WO 01/58275의 표 A에 열거된 각각의 성분 중 적어도 하나를 포함한다. 적어도 하나란 하나 또는 그 이상, 하나, 또는 둘, 또는 셋, 또는 넷 등 내지 모든 13개, 또는 모든 15개 각각의 성분 중 어떤 것을 의미한다. 더 구체적으로, 적어도 하나의 이 개별 성분은 표 A의 칼럼 4, 또는 칼럼 5, 또는 칼럼 6에 지시된 범위 내의 급식 농도를 제공하기 위한 양으로 본 발명의 첨가제에 포함된다.

본 발명은 또한 동물 급식 성분에 관한 것이다. 동물 급식 성분 또는 규정식은 상대적으로 높은 양의 단백질을 가진다. 가금 및 돼지 규정식은 WO 01/58275의 표 B, 종렬 2-3에 지시된 바와 같은 특징이 있을 수 있다. 물고기 규정식은 이 표 B의 종렬 4에 지시된 바와 같은 특징이 있을 수 있다. 또한, 이러한 물고기 규정식은 대개 200-310 g/kg의 조지방 양을 가진다.

본 발명에 따른 동물 급식 조성물은 50-800 g/kg의 조단백질을 가지고, 본원에 청구되는 적어도 하나의 항균 폴리펩티드를 포함한다.

더욱이, 또는 대안적으로(상기에 지시된 조단백질 양으로), 본 발명의 동물 급식 조성물은 10-30 MJ/kg의 대사가능 에너지의 양; 및/또는 0.1-200 g/kg의 칼슘의 양; 및/또는 0.1-200 g/kg의 이용가능한 인의 양; 및/또는 0.1-100 g/kg의 메티오닌의 양; 및/또는 0.1-150 g/kg의 메티오닌 + 시스테인의 양; 및/또는 0.5-50 g/kg의 리신의 양을 가진다.

어떤 구체예에서, 대사가능 에너지, 조단백질, 칼슘, 인, 메티오닌, 메티오닌 + 시스테인, 및/또는 리신의 양은 WO 01/58275 (R. 2-5)의 표 B의 2, 3, 4, 또는 5 중 어떤 하나의 범위 내에 있다.

조단백질은 질소(N) 곱하기 인자 6.25, 즉 조단백질 (g/kg) = N(g/kg) x 6.25로 계산된다. 질소 양은 Kjeldahl 방법 (A.O.A.C, 1984, Official Methods of Analysis 14판, Association of Official Analytical Chemists, Washington DC)에 의하여 결정된다.

대사가능 에너지는 문헌(NRC publication Nutrient requirements in swine, 개정9판 1988, subcommittee on swine nutrition, committee on animal nutrition, board of agriculture, national research council. National Academy Press, Washington, D.C., pp. 2-6, 및 the European Table of Energy Values for Poultry Feed-stuffs, Spelderholt centre for poultry research and extension, 7361 DA Beekbergen, The Netherlands. Grafisch bedrijf Ponsen & looijen bv, Wageningen. ISBN 90-71463-12-5)에 기초하여 계산될 수 있다.

완전한 동물 규정식에서 칼슘, 이용가능한 인 및 아미노산의 규정식 양은 문헌(Veevoedertabel 1997, gegevens over chemische samenstelling, verteerbaarheid en voederwaarde van voedermiddelen, Central Veevoederbureau, Runderweg 6, 8219 pk Lelystad. ISBN 90-72839-13-7)과 같은 급식표에 기초하여 계산된다.

어떤 구체예에서, 본 발명의 동물 급식 조성물은 전술한 적어도 하나의 식물 단백질 또는 단백질 공급원을 함유한다.

또 다른 어떤 구체예에서, 본 발명의 동물 급식 조성물은 0-80% 옥수수; 및/또는 0-80% 수수; 및/또는 0-70% 밀; 및/또는 0-70% 보리; 및/또는 0-30% 귀리; 및/또는 0-40% 대두 음식; 및/또는 0-10% 물고기 음식; 및/또는 0-20% 훼이를 함유한다. 동물 규정식을 예를 들면 으깬 급식(펠렛이 아닌) 또는 펠렛 급식으로 제조할 수 있다. 전형적으로, 가공된 급식 성분을 혼합하고 충분한 양의 필수 비타민과 미네랄을 문제의 종에 대한 설명서에 따라서 첨가한다. 효소를 고체 또는 액체 효소 제형으로 첨가할 수 있다. 예를 들면, 통상적으로 고체 효소 제형을 혼합 단계 전에 또는 그동안에 첨가하고, 통상적으로 액체 효소 제형을 펠렛팅 단계 후에 첨가한다. 효소를 또한 급식 첨가제 또는 프리믹스에 혼입할 수 있다.

규정식 중의 최종 효소 농도는 규정식 kg 당 효소 단백질 0.01-200 mg의 범위 내, 예를 들면 동물 규정식 kg 당 효소 단백질 5-30 mg의 범위이다.

항균 폴리펩티드는 다음 양(투여량 범위): 0.01-200; 또는 0.01-100; 또는 0.05-100; 또는 0.05-50; 또는 0.10-10 중 하나 이상으로 투여될 수 있으며, 이들 모든 범위는 급식 kg 당 항균 폴리펩티드 단백질 mg이다(ppm).

급식 kg 당 항균 폴리펩티드 단백질 mg을 결정하기 위하여, 항균 폴리펩티드는 급식 조성물로부터 정제되고, 정제된 항균 폴리펩티드의 특이적 활성은 관련 분석을 사용하여 결정된다(항균 활성, 기질, 및 분석 참조). 급식 조성물의 항균 활성은 또한 동일한 분석을 사용하여 결정되고, 이들 두 결정에 기초하여, 급식 kg 당 항균 폴리펩티드 단백질 mg의 투여량을 계산한다.

동일한 원리가 급식 첨가제에서 항균 폴리펩티드 단백질을 결정할 때 적용된다. 물론, 샘플이 급식 첨가제 또는 급식을 준비하는 데 사용된 항균 폴리펩티드에 이용가능하다면, 특이적 활성은 이 샘플로부터 결정된다(급식 조성물 또는 첨가제로부터 항균 폴리펩티드를 정제할 필요는 없다).

신호 펩티드 및 프로펩티드

본 발명은 또한 SEQ ID NO:2의 아미노산 -48 내지 -29로 구성된 신호 펩티드를 코딩하는 SEQ ID NO:1의 뉴클레오티드 1 내지 60으로 구성된 첫 번째 뉴클레오티드 서열과 SEQ ID NO:2의 아미노산 -28 내지 -1로 구성된 프로펩티드를 코딩하는 SEQ ID NO:1의 뉴클레오티드 61 내지 144로 구성된 두 번째 뉴클레오티드 서열 중 하나 또는 둘과 작동가능하게 연결된 단백질을 코딩하는 유전자를 포함한 핵산 구성체에 관한 것이며, 이 유전자는 첫 번째 및 두 번째 뉴클레오티드 서열에 대하여 이종이다.

본 발명은 또한 재조합 발현 벡터 및 이러한 핵산 구성체를 포함한 재조합 숙주세포에 관한 것이다.

본 발명은 또한 (a) 단백질의 생산에 적합한 조건 하에서 이러한 재조합 숙주세포를 배양하는 단계 및 (b) 단백질을 회수하는 단계를 포함한 단백질을 생산하는 방법에 관한 것이다.

첫 번째 및 두 번째 뉴클레오티드 서열은 개별적으로 다른 조절 서열을 가진 또는 다른 조절 서열과 조합된 외래 유전자에 작동가능하게 연결될 수 있다. 이러한 다른 조절 서열은 상기에 설명된다. 전술한 바와 같이, 두 신호 펩티드와 프로펩티드 영역이 단백질의 아미노 말단에 존재하는 경우, 프로펩티드 영역은 단백질의 아미노 말단 가까이에 위치하고 신호 펩티드 영역은 프로펩티드 영역의 아미노 말단 가까이에 위치한다.

단백질은 숙주세포에 천연이거나 이종일 수 있다. 용어 "단백질"은 본원에서 코딩된 생성물의 특정 길이를 말하는 것을 의미하는 것이 아니므로, 펩티드, 올리고펩티드, 및 단백질을 포함한다. 용어 "단백질"은 또한 코딩된 생성물을 형성하기 위하여 결합된 2개 이상의 폴리펩티드를 포함한다. 단백질은 또한 하나 이상이 숙주세포에 이종이거나 천연일 수 있는 적어도 두 개의 상이한 단백질에서 얻어진 부분적 또는 완전 폴리펩티드 서열의 조합을 포함하는 하이브리드 폴리펩티드를 포함한다. 단백질은 상기에 언급된 단백질 및 하이브리드 단백질의 자연적으로 발생하는 대립유전자 및 조작된 변이를 더 포함한다.

바람직하게는, 단백질은 호르몬 또는 그것의 변이체, 효소, 수용체 또는 그것의 부분, 항체 또는 그것의 부분, 또는 리포터이다. 더 바람직한 양태에서, 단백질은 산화환원효소, 전이효소, 가수분해효소, 리아제, 이성질화효소, 또는 리가제이다. 보다 더 바람직한 양태에서, 단백질은 아미노펩티다제, 아밀라제, 탄수화물분해효소, 카르복시펩티다제, 카탈라제, 셀룰라제, 키티나제, 큐티나제, 사이클로덱스트린 당전이효소, 디옥시리보뉴클리아제, 에스테라제, 알파-갈락토시다제, 베타-갈락토시다제, 글루코아밀라제, 알파-글루코시다제, 베타-글루코시다제, 인베르타제, 라카제, 리파제, 만노시다제, 무타나제, 옥시다제, 펙틴질분해효소, 페록시다제, 피타제, 폴리페놀옥시다제, 단백질가수분해효소, 리보뉴클레아제, 트랜스글루타미나제 또는 자일라나제이다.

유전자는 어떤 원핵생물, 진핵생물, 또는 다른 공급원에서 얻을 수 있다.

본 발명은 다음 실시예에 의하여 더 설명되는데, 이것은 본 발명의 범주를 제한하는 것으로 고려되어서는 안된다.

완충액 및 기질로 사용되는 화학물질은 적어도 시약 등급의 상업적 생성물이다. 하기 실시예에서, SEQ ID NO:2의 아미노산 1 내지 42로 나타낸 항균 폴리펩티드를 "유로신(Eurocin)"이라 지칭한다.

실시예 1

유로티움 암스텔로다미(Eurotium amstelodami)의 cDNA 라이브러리

cDNA 라이브러리를 포테이토 덱스트로스 아가(PDA)에 5일 동안 성장한 E. 암스텔로다미에서 준비하였다. 폴리A 농축된 RNA를 정제하고, cDNA를 합성하여, 라이브러리를 표준 분자생물학 과정에 따라서 만들었다. 일반 과정에 대한 상세한 프로토콜은 국제특허출원 WO 01/12794의 실시예에서 확인할 수 있다. 클로닝에 사용된 벡터는 pMhas5인데, SEQ ID NO:8에 나타내며, 다음 특징을 가진다:

벡터 pMhas5의 특징

특징	위치	특징
CDS	365-1156	카나마이신 내성
CDS	2232-2387	베타 갈락토시다제 알파 펩티드
-10 신호	2189-2192	샤인 달가노
프로모터	2101-2189	Lac 프로모터
미스크 특징	626-650	BACE 시스템을 위한 KanP1 프라이머

실시예 2

유로신의 아스페르길루스 발현 벡터의 구성

유로신 코딩 뉴클레오티드 서열은 다음 방식으로 cDNA 라이브러리에서 증폭되었다(실시예 1 참조): 프라이머 A와 프라이머 B의 PCR 반응에서 1 ul의 cDNA(DNA의 약 10 ng)를 주형으로 사용하였다.

프라이머 A: TCTTGGATCCACCATGCACTTCACCAAGGTCTCC (SEQ ID NO:4)

프라이머 B: TCTTCTCGAGTTAGAAAGAACAGGTGCAGGTAGG (SEQ ID NO:5)

10 pmole의 각 프라이머를 10 ㎕의 반응 부피에 사용하였다. 어닐링 온도는 55℃이었고 연장은 72℃에서 1분 동안이었다. 전체 35 순환을 반복했다. Expand High Fidelity PCR 시스템 (Roche)을 사용하였다.

PCR 반응물의 분취액을 4% 아가로스 겔에 분리하였다. 구별된 밴드가 약 300 bp의 크기로 나타났다. PCR 단편을 PCR 프라이머에 도입된 오버행에서 절단하는 BamH1과 Xho1으로 분해하였다. 분해된 단편을 분리하여 BamH1-Xho1으로 분해된 pMT2786, pCaHj527에 기초한 플라스미드 pMT2188에 기초한 아스페르길루스 발현 플라스미드에 클로닝하였다(국제특허출원 WO 02/12472의 실시예 7; 및 WO 00/70064 참조). 삽입체의 서열은 상기에서 확인된 유로신 서열을 코딩하는 것으로 증명되었다. PCR 단편의 서열은 SEQ ID NO:6에 나타난다.

PCR 생성물 삽입체를 가진 아스페르길루스 발현 플라스미드는 pMT2935로 명명되었고 SEQ ID NO:7에 나타난다.

실시예 3

아스페르길루스에 유로신의 발현

pMT2935(SEQ ID NO:7 참조)를 아스페르길루스 오리자 균주 BECXh2에 형질전환하였다(국제특허출원 WO 00/39322 참조). 30 형질전환체를 수크로스와 아세트아미드가 있는 코브 최소 플레이트에서 선택적 및 비-유도성 조건 하에 2회 재분리하였다. 유로신의 발현을 시험하기 위하여, 형질전환체를 10 ml YPM(2% 펩톤, 1% 효모 추출물, 2% 말토스)이 있는 튜브에 30℃에서 6일 동안 성장시켰다. 상청액을 낮은 Mw 범위에서 분리를 허용하는 MES 러닝 완충액으로 제조업자가 추천한 바와 같이 NuPage 10% Bis-Tris SDS 겔 (Invitrogen)에 러닝하였다. 아스페르길루스 오리자 형질전환체는 유로신의 발현에 대하여 유도할 때조차도 잘 성장하였다. 유로신으로 기대되는 크기의 구별된 밴드가 대부분의 형질전환체에서는 나타났지만, 형질전환되지 않은 숙주 균주 A. 오리자 BECh2에서는 밴드가 나타나지 않았다.

실시예 4

유로신의 정제

발효 액체배지를 0.22 μm 코닝 431118 여과기를 통하여 여과하였고, 포름산을 사용하여 pH를 4.0으로 조절하였다. pH를 조절한 후 추가 침전물을 제거하기 위하여 0.22 μm 여과기를 통한 여과를 반복하였다. 전도성을 측정하고 MQ-물 (Millipore)을 첨가하여 약 10 mS cm^-1로 조절하였다. 그 다음 여과물을 AKTA 익스폴로러 HPLC 기구를 사용하여 12 ml 소스 3OS (Amersham Biosciences 17-1273-01)칼럼 상에 로딩하였다. 로딩 완충액은 50 mM 포름산, pH 4 (완충액 A)이었다.

유로신을 20 칼럼 부피의 0-100 % 완충액 B의 농도 구배를 사용하여 용리하였다. 완충액 B는 50 mM 포름산, 2M 염화나트륨, pH 4.0이었다. 정제된 분획의 동일성을 MALDI-TOF MS (Voyager DE Pro instrument, Applied Biosystems)로 확인하고 순도를 SDS-PAGE (Invitrogen, NuPage 12 % Bis-Tris /MES, 겔 코드 블루 염색시약으로 염색, Pierce 24592)로 개략적으로 확인하였다.

관련 화합물을 함유한 분획(MALDI-TOF MS에 기반하여)의 풀을 만들고 Amicon Ultra 5000 Da MWCO 여과기(Millipore UFC900524)에 농축하였다. 약 30 분 동안 4000 g에서 원심분리를 수행하였다. 그 다음, 용액을 동일한 여과기 및 원심분리 조건을 사용하여 0.01% 산성 산으로 3회 세척하여 탈염하였다.

생성물을 아미노산 분석 및 MALDI-TOF MS에 의하여 정확한 서열 및 순도에 대하여 분석하였다. 유로신의 측정된 질량은 4339 Da이었다. 이론적 분자량은 SEQ ID NO:2의 아미노산 1 내지 42에 기초하여, 평균 433.8 Da이다.

원액을 -2O℃에 저장하였다.

실시예 5

항균성의 평가

마이크로희석분석에서 정제된 유로신을 항균성에 대하여 평가하였다. CLSI (임상 및 실험 표준 연구소)의 NCCLS/CLSI 지침서에 따라서 최소 억제 농도(MIC)를결정하였다.

유로신을 다음 농도: 32; 16; 8; 4; 2; 1; 0.50; 0.25; 0.13; 및 0.06 μg/ml에서 시험하였다.

표 2에 나타낸 바와 같이, 유로신은 다양한 ATCC 균주에 대하여 강한 항균성을 나타낸다.

유로신의 항균성

균주	MIC (ug/ml)
스타파일로고커스 아우레우스, ATCC 29213	16
스타파일로고커스 에피데르미디스, ATCC 12228	16
스타파일로고커스 카르로서스, ATCC 51365	8
스트렙토코커스 뉴모니아, ATCC 49619	0.25
스트렙토코커스 표게네스, ATCC 12344	0.13
엔테로코커스 페시움, ATCC 49624	16
마이크로코커스 루테우스, ATCC 9341	0.5

실시예 6

방어소를 확인하기 위한 PFAM 데이터베이스로부터의 HMM 파일의 사용

은닉 마르코프 모델 프로파일(HMM 프로파일)을 사용한 서열분석은 인터넷상의 온라인이나 잘 알려진 HMMER 자유이용 소프트웨어 패키지를 사용하여 자체적으로 컴퓨터상에서 수행될 수 있다. 현재 버전은 2003년 10월에 나온 HMMER 2.3.2이다.

HMM 프로파일은 잘 알려진 PFAM 데이터베이스에서 얻을 수 있다. 현재 버전은 2004년 11월에 나온 PFAM 16.0이다. HMMER와 PFAM은 모두 예를 들면 세인트루이스(미국)에 있는 워싱턴대 약학대의 모든 컴퓨터 플랫폼에서 사용가능하다(http://pfam.wustl.edu and http://hmmer.wustl.edu).

의문의 아미노산 서열, 또는 그것의 단편이 다음 5개의 PFAM 패밀리 중 하나에 속한다면, 그 아미노산 서열은 본 발명에 따른 방어소이다:

방어소_베타 또는 "베타 방어소", 승인번호: PF00711;

방어소_프로프렙 또는 "방어소 프로펩티드", 승인번호: PF00879;

방어소_1 또는 "포유동물 방어소", 승인번호: PF00323;

방어소_2 또는 "절지동물 방어소", 승인번호: PF01097;

감마-티오닌 또는 "감마-티오닌 패밀리", 승인번호: PF00304.

아미노산 서열은 PFAM 데이터베이스가 온라인에서 사용될 때, 또는 hmmpfam 프로그램(HMMER 소프트웨어 패키지)이 자체적으로 사용될 때 0.1 보다 큰 E-값 및 0 보다 더 크거나 그것과 동일한 점수를 발생시키는 경우 본 발명에 따라서 PFAM 패밀리에 속한다.

서열 분석이 hmmpfam 프로그램을 사용하여 자체적으로 수행될 때, PFAM 데이터베이스에서 HMM 프로파일을 얻을 필요가 있다. 각 패밀리에 대한 두 프로파일이 존재한다; 글로컬 검색의경우 xxx _ Is . hmm, 및 로컬 검색의 경우 xxx _ fs .hmm("xxx"는 패밀리의 이름이다). 그것은 앞에서 언급한 5개 패밀리의 10개의 프로파일 전체를 만든다.

이들 10개 프로파일은 개별적으로 사용되거나, 예를 들면 defensin.hmm으로 명명할 수 있는 단일 프로파일(텍스트 에디터를 사용하여 - 프로파일은 ASCII 파일이다)로 결합(추가)될 수 있다. 그 다음, 의문의 아미노산 서열은 다음 명령 라인을 사용하여 평가될 수 있다.

hmmpfam -E 0.1 defensin.hmm sequence_file

- "sequence_file"은 HMMER 소프트웨어 패키지에 의하여 인식된 포맷 중 어떤 것에 의문의 아미노산 서열을 가진 파일이다.

점수가 0.0 보다 크거나 같고, E-값이 0.1 보다 크다면, 의문의 아미노산 서열은 본 발명에 따른 방어소이다.

PFAM 데이터베이스는 문헌(Bateman et al. (2004) "The Pfam Protein Families Database", Nucleic Acids Research, Vol. 32 (Database Issue) pp. D138-D141)에 더 설명된다.

<110> NOVOZYMES A/S <120> POLYPEPTIDES HAVING ANTIMICROBIAL ACTIVITY AND POLYNUCLEOTIEDS ENCODING SAME <130> 10736.204-WO <150> PA 2004 01744 <151> 2004-11-12 <160> 8 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 273 <212> DNA <213> Eurotium amstelodami <220> <221> CDS <222> (1)..(270) <220> <221> sig_peptide <222> (1)..(60) <220> <221> mat_peptide <222> (145)..(270) <400> 1 atg cac ttc acc aag atc tcc acc att ctt ttt acc atc ttc gcc gcc 48 Met His Phe Thr Lys Val Ser Thr Ile Leu Phe Thr Ile Phe Ala Ala -45 -40 -35 ggc atc atg gct gct ccc acc gaa gga gtc cgt gag gaa gcc gcc cct 96 Gly Ile Met Ala Ala Pro Thr Glu Gly Val Arg Glu Glu Ala Ala Pro -30 -25 -20 ggc cag gag gtt tac ccc gac gaa cct cct gct tct ctg acc aag cgt 144 Gly Gln Glu Val Tyr Pro Asp Glu Pro Pro Ala Ser Leu Thr Lys Arg -15 -10 -5 -1 ggc ttc gga tgt cct ggt gat gcc tac cag tgc agt gaa cac tgc agg 192 Gly Phe Gly Cys Pro Gly Asp Ala Tyr Gln Cys Ser Glu His Cys Arg 1 5 10 15 gcc ctg ggc ggt gga cgc act gga gga tac tgt gct gga cct tgg tat 240 Ala Leu Gly Gly Gly Arg Thr Gly Gly Tyr Cys Ala Gly Pro Trp Tyr 20 25 30 ttg ggt cac cct acc tgc acc tgt tct ttc taa 273 Leu Gly His Pro Thr Cys Thr Cys Ser Phe 35 40 <210> 2 <211> 90 <212> PRT <213> Eurotium amstelodami <400> 2 Met His Phe Thr Lys Val Ser Thr Ile Leu Phe Thr Ile Phe Ala Ala -45 -40 -35 Gly Ile Met Ala Ala Pro Thr Glu Gly Val Arg Glu Glu Ala Ala Pro -30 -25 -20 Gly Gln Glu Val Tyr Pro Asp Glu Pro Pro Ala Ser Leu Thr Lys Arg -15 -10 -5 -1 Gly Phe Gly Cys Pro Gly Asp Ala Tyr Gln Cys Ser Glu His Cys Arg 1 5 10 15 Ala Leu Gly Gly Gly Arg Thr Gly Gly Tyr Cys Ala Gly Pro Trp Tyr 20 25 30 Leu Gly His Pro Thr Cys Thr Cys Ser Phe 35 40 <210> 3 <211> 90 <212> PRT <213> Eurotium amstelodami <220> <221> SIGNAL <222> (1)..(20) <220> <221> PROPEP <222> (21)..(48) <220> <221> mat_peptide <222> (49)..(90) <400> 3 Met His Phe Thr Lys Val Ser Thr Ile Leu Phe Thr Ile Phe Ala Ala -45 -40 -35 Gly Ile Met Ala Ala Pro Thr Glu Gly Val Arg Glu Glu Ala Ala Pro -30 -25 -20 Gly Gln Glu Val Tyr Pro Asp Glu Pro Pro Ala Ser Leu Thr Lys Arg -15 -10 -5 -1 Gly Phe Gly Cys Pro Gly Asp Ala Tyr Gln Cys Ser Glu His Cys Arg 1 5 10 15 Ala Leu Gly Gly Gly Arg Thr Gly Gly Tyr Cys Ala Gly Pro Trp Tyr 20 25 30 Leu Gly His Pro Thr Cys Thr Cys Ser Phe 35 40 <210> 4 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer A <400> 4 tcttggatcc accatgcact tcaccaaggt ctcc 34 <210> 5 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer B <400> 5 tcttctcgag ttagaaagaa caggtgcagg tagg 34 <210> 6 <211> 296 <212> DNA <213> Eurotium amstelodami <220> <221> misc_feature <222> (1)..(296) <223> PCR fragment <400> 6 tcttggatcc accatgcact tcaccaaggt ctccaccatt ctttttacca tcttcgccgc 60 cggcatcatg gctgctccca ccgaaggagt ccgtgaggaa gccgcccctg gccaggaggt 120 ttaccccgac gaacctcctg cttctctgac caagcgtggc ttcggatgtc ctggtgatgc 180 ctaccagtgc agtgaacact gcagggccct gggcggtgga cgcactggag gatactgtgc 240 tggaccttgg tatttgggtc accctacctg cacctgttct ttctaactcg agaaga 296 <210> 7 <211> 7218 <212> DNA <213> Plasmid pMT2935 <400> 7 tgtataagct agcttatggt gttttgatca ttttaaattt ttatatggcg ggtggtgggc 60 aactcgcttg cgcgggcaac tcgcttaccg attacgttag ggctgatatt tacgtaaaaa 120 tcgtcaaggg atgcaagacc aaaccgttaa atttccggag tcaacagcat ccaagcccaa 180 gtccttcacg gagaaacccc agcgtccaca tcacgagcga aggaccacct ctaggcatcg 240 gacgcaccat ccaattagaa gcagcaaagc gaaacagccc aagaaaaagg tcggcccgtc 300 ggccttttct gcaacgctga tcacgggcag cgatccaacc aacaccctcc agagtgacta 360 ggggcggaaa tttatcggga ttaatttcca ctcaaccaca aatcacagtc gtccccggta 420 atttaacggc tgcagacggc aatttaacgg cttctgcgaa tcgcttggat tccccgcccc 480 tggccgtaga gcttaaagta tgtcccttgt cgatgcgatg tatgaattca tggtgttttg 540 atcattttaa atttttatat ggcgggtggt gggcaactcg cttgcgcggg caactcgctt 600 accgattacg ttagggctga tatttacgta aaaatcgtca agggatgcaa gaccaaaccg 660 ttaaatttcc ggagtcaaca gcatccaagc ccaagtcctt cacggagaaa ccccagcgtc 720 cacatcacga gcgaaggacc acctctaggc atcggacgca ccatccaatt agaagcagca 780 aagcgaaaca gcccaagaaa aaggtcggcc cgtcggcctt ttctgcaacg ctgatcacgg 840 gcagcgatcc aaccaacacc ctccagagtg actaggggcg gaaatttatc gggattaatt 900 tccactcaac cacaaatcac agtcgtcccc ggtaatttaa cggctgcaga cggcaattta 960 acggcttctg cgaatcgctt ggattccccg cccctggccg tagagcttaa agtatgtccc 1020 ttgtcgatgc gatgtatcac aacatataaa tactggcaag ggatgccatg cttggagttt 1080 ccaactcaat ttacctctat ccacacttct cttccttcct caatcctcta tatacacaac 1140 tggggatcca ccatgcactt caccaaggtc tccaccattc tttttaccat cttcgccgcc 1200 ggcatcatgg ctgctcccac cgaaggagtc cgtgaggaag ccgcccctgg ccaggaggtt 1260 taccccgacg aacctcctgc ttctctgacc aagcgtggct tcggatgtcc tggtgatgcc 1320 taccagtgca gtgaacactg cagggccctg ggcggtggac gcactggagg atactgtgct 1380 ggaccttggt atttgggtca ccctacctgc acctgttctt tctaactcga gatctagagg 1440 gtgactgaca cctggcggta gacaatcaat ccatttcgct atagttaaag gatggggatg 1500 agggcaattg gttatatgat catgtatgta gtgggtgtgc ataatagtag tgaaatggaa 1560 gccaagtcat gtgattgtaa tcgaccgacg gaattgagga tatccggaaa tacagacacc 1620 gtgaaagcca tggtctttcc ttcgtgtaga agaccagaca gacagtccct gatttaccct 1680 tgcacaaagc actagaaaat tagcattcca tccttctctg cttgctctgc tgatatcact 1740 gtcattcaat gcatagccat gagctcatct tagatccaag cacgtaattc catagccgag 1800 gtccacagtg gagcagcaac attccccatc attgctttcc ccaggggcct cccaacgact 1860 aaatcaagag tatatctcta ccgtccaata gatcgtcttc gcttcaaaat ctttgacaat 1920 tccaagaggg tccccatcca tcaaacccag ttcaataata gccgagatgc atggtggagt 1980 caattaggca gtattgctgg aatgtcgggg ccagttggcc gggtggtcat tggccgcctg 2040 tgatgccatc tgccactaaa tccgatcatt gatccaccgc ccacgaggcg cgtctttgct 2100 ttttgcgcgg cgtccaggtt caactctctc ctctagactg gaaacgcaac cctgaaggga 2160 ttcttccttt gagagatgga agcgtgtcat atctcttcgg ttctacggca ggtttttttc 2220 tgctctttcg tagcatggca tggtcacttc agcgcttatt tacagttgct ggtattgatt 2280 tcttgtgcaa attgctatct gacacttatt agctatggag tcaccacatt tcccagcaac 2340 ttccccactt cctctgcaat cgccaacgtc ctctcttcac tgagtctccg tccgataacc 2400 tgcactgcaa ccggtgcccc atggtacgcc tccggatcat actcttcctg cacgagggca 2460 tcaagctcac taaccgcctt gaaactctca ttcttcttat cgatgttctt atccgcaaag 2520 gtaaccggaa caaccacgct cgtgaaatcc agcaggttga tcacagaggc atacccatag 2580 taccggaact ggtcatgccg taccgcagcg gtaggcgtaa tcggcgcgat gatggcgtcc 2640 agttccttcc cggccttttc ttcagcctcc cgccatttct caaggtactc catctggtaa 2700 ttccacttct ggagatgcgt gtcccagagc tcgttcatgt taacagcttt gatgttcggg 2760 ttcagtaggt ctttgatatt tggaatcgcc ggctcgccgg atgcactgat atcgcgcatt 2820 acgtcggcgc tgccgtcagc cgcgtagata tgggagatga gatcgtggcc gaaatcgtgc 2880 ttgtatggcg tccacggggt cacggtgtga ccggctttgg cgagtgcggc gacggtggtt 2940 tccacgccgc gcaggatagg agggtgtgga aggacattgc cgtcgaagtt gtagtagccg 3000 atattgagcc cgccgttctt gatcttggag gcaataatgt ccgactcgga ctggcgccag 3060 ggcatgggga tgaccttgga gtcgtatttc catggctcct gaccgaggac ggatttggtg 3120 aagaggcgga ggtctaacat acttcatcag tgactgccgg tctcgtatat agtataaaaa 3180 gcaagaaagg aggacagtgg aggcctggta tagagcagga aaagaaggaa gaggcgaagg 3240 actcaccctc aacagagtgc gtaatcggcc cgacaacgct gtgcaccgtc tcctgaccct 3300 ccatgctgtt cgccatcttt gcatacggca gccgcccatg actcggcctt agaccgtaca 3360 ggaagttgaa cgcggccggc actcgaatcg agccaccgat atccgttcct acaccgatga 3420 cgccaccacg aatcccaacg atcgcaccct caccaccaga actgccgccg cacgaccagt 3480 tcttgttgcg tgggttgacg gtgcgcccga tgatgttgtt gactgtctcg cagaccatca 3540 gggtctgcgg gacagaggtc ttgacgtaga agacggcacc ggctttgcgg agcatggttg 3600 tcagaaccga gtccccttcg tcgtacttgt ttagccatga gatgtagccc attgatgttt 3660 cgtagccctg gtggcatatg ttagctgaca aaaagggaca tctaacgact taggggcaac 3720 ggtgtacctt gactcgaagc tggtctttga gagagatggg gaggccatgg agtggaccaa 3780 cgggtctctt gtgctttgcg tagtattcat cgagttccct tgcctgcgcg agagcggcgt 3840 cagggaagaa ctcgtgggcg cagtttgtct gcacagaagc cagcgtcagc ttgatagtcc 3900 cataaggtgg cgttgttaca tctccctgag aggtagaggg gaccctacta actgctgggc 3960 gattgctgcc cgtttacaga atgctagcgt aacttccacc gaggtcaact ctccggccgc 4020 cagcttggac acaagatctg cagcggaggc ctctgtgatc ttcagttcgg cctctgaaag 4080 gatcaccgat ttctttggga aatcaataac gctgtcttcc gcaggcagcg tctggacttt 4140 ccattcatca gggatggttt ttgcgaggcg ggcgcgctta tcagcggcca gttcttccca 4200 ggattgaggc attctgtgtt agcttatagt caggatgttg gctcgacgag tgtaaactgg 4260 gagttggcat gagggttatg taggcttctt tagccccgca tccccctcat tctcctcatt 4320 gatcccgggg gagcggatgg tgttgataag agactaatta tagggtttag ctggtgccta 4380 gctggtgatt ggctggcttc gccgaatttt acgggccaag gaaagctgca gaaccgcggc 4440 actggtaaac ggtaattaag ctatcagccc catgctaacg agtttaaatt acgtgtattg 4500 ctgataaaca ccaacagagc tttactgaaa gatgggagtc acggtgtggc ttccccactg 4560 cgattattgc acaagcagcg agggcgaact tgactgtcgt cgctgagcag cctgcagtca 4620 aacatacata tatatcaacc gcgaagacgt ctggccttgt agaacacgac gctccctagc 4680 aacacctgcc gtgtcagcct ctacggttgt tacttgcatt caggatgctc tccagcgggc 4740 gagctattca aaatattcaa agcaggtatc tcgtattgcc aggattcagc tgaagcaaca 4800 ggtgccaagg aaatctgcgt cggttctcat ctgggcttgc tcggtcctgg cgtagatcta 4860 gagtcgacct gcaggcatgc ggcgtaatca tggtcatagc tgtttcctgt gtgaaattgt 4920 tatccgctca caattccaca caacatacga gccggaagca taaagtgtaa agcctggggt 4980 gcctaatgag tgagctaact cacattaatt gcgttgcgct cactgcccgc tttccagtcg 5040 ggaaacctgt cgtgccagct gcattaatga atcggccaac gcgcggggag aggcggtttg 5100 cgtattgggc gctcttccgc ttcctcgctc actgactcgc tgcgctcggt cgttcggctg 5160 cggcgagcgg tatcagctca ctcaaaggcg gtaatacggt tatccacaga atcaggggat 5220 aacgcaggaa agaacatgtg agcaaaaggc cagcaaaagg ccaggaaccg taaaaaggcc 5280 gcgttgctgg cgtttttcca taggctccgc ccccctgacg agcatcacaa aaatcgacgc 5340 tcaagtcaga ggtggcgaaa cccgacagga ctataaagat accaggcgtt tccccctgga 5400 agctccctcg tgcgctctcc tgttccgacc ctgccgctta ccggatacct gtccgccttt 5460 ctcccttcgg gaagcgtggc gctttctcat agctcacgct gtaggtatct cagttcggtg 5520 taggtcgttc gctccaagct gggctgtgtg cacgaacccc ccgttcagcc cgaccgctgc 5580 gccttatccg gtaactatcg tcttgagtcc aacccggtaa gacacgactt atcgccactg 5640 gcagcagcca ctggtaacag gattagcaga gcgaggtatg taggcggtgc tacagagttc 5700 ttgaagtggt ggcctaacta cggctacact agaagaacag tatttggtat ctgcgctctg 5760 ctgaagccag ttaccttcgg aaaaagagtt ggtagctctt gatccgacaa acaaaccacc 5820 gctggtagcg gtggtttttt tgtttgcaag cagcagatta cgcgcagaaa aaaaggatct 5880 caagaagatc ctttgatctt ttctacgggg tctgacgctc agtggaacga aaactcacgt 5940 taagggattt tggtcatgag attatcaaaa aggatcttca cctagatcct tttaaattaa 6000 aaatgaagtt ttaaatcaat ctaaagtata tatgagtaaa cttggtctga cagttaagca 6060 aggattttct taacttcttc ggcgacagca tcaccgactt cggtggtact gttggaacca 6120 cctaaatcac cagttctgat acctgcatcc aaaacctttt taactgcatc ttcaatggcc 6180 ttaccttctt caggcaagtt caatgacaat ttcaacatca ttgcagcaga caagatagtg 6240 gcgatagggt tgaccttatt ctttggcaaa tctggagcag aaccgtggca tggttcgtac 6300 aaaccaaatg cggtgttctt gtctggcaaa gaggccaagg acgcagatgg caacaaaccc 6360 aaggaacctg ggataacgga ggcttcatcg gagatgatat caccaaacat gttgctggtg 6420 attataatac catttaggtg ggttgggttc ttaactagga tcatggcggc agaatcaatc 6480 aattgatgtt gaaccttcaa tgtagggaat tcgttcttga tggtttcctc cacagttttt 6540 ctccataatc ttgaagaggc caaaacatta gctttatcca aggaccaaat aggcaatggt 6600 ggctcatgtt gtagggccat gaaagcggcc attcttgtga ttctttgcac ttctggaacg 6660 gtgtattgtt cactatccca agcgacacca tcaccatcgt cttcctttct cttaccaaag 6720 taaatacctc ccactaattc tctgacaaca acgaagtcag tacctttagc aaattgtggc 6780 ttgattggag ataagtctaa aagagagtcg gatgcaaagt tacatggtct taagttggcg 6840 tacaattgaa gttctttacg gatttttagt aaaccttgtt caggtctaac actgccggta 6900 ccccatttag gaccacccac agcacctaac aaaacggcat cagccttctt ggaggcttcc 6960 agcgcctcat ctggaagtgg aacacctgta gcatcgatag cagcaccacc aattaaatga 7020 ttttcgaaat cgaacttgac attggaacga acatcagaaa tagctttaag aaccttaatg 7080 gcttcggctg tgatttcttg accaacgtgg tcacctggca aaacgacgat cttcttaggg 7140 gcagacatac tcttcctttt tcaatattat tgaagcattt atcagggtta ttgtctcatg 7200 agcggataca tatttgaa 7218 <210> 8 <211> 2403 <212> DNA <213> Plamid pMhas5 <400> 8 cgataagcta gcttcacgct gccgcaagca ctcagggcgc aagggctgct aaaggaagcg 60 gaacacgtag aaagccagtc cgcagaaacg gtgctgaccc cggatgaatg tcagctactg 120 ggctatctgg acaagggaaa acgcaagcgc aaagagaaag caggtagctt gcagtgggct 180 tacatggcga tagctagact gggcggtttt atggacagca agcgaaccgg aattgccagc 240 tggggcgccc tctggtaagg ttgggaagcc ctgcaaagta aactggatgg ctttcttgcc 300 gccaaggatc tgatggcgca ggggatcaag atctgatcaa gagacaggat gaggatcgtt 360 tcgcatgatt gaacaagatg gattgcacgc aggttctccg gccgcttggg tggagaggct 420 attcggctat gactgggcac aacagacaat cggctgctct gatgccgccg tgttccggct 480 gtcagcgcag gggcgcccgg ttctttttgt caagaccgac ctgtccggtg ccctgaatga 540 actccaagac gaggcagcgc ggctatcgtg gctggccacg acgggcgttc cttgcgcagc 600 tgtgctcgac gttgtcactg aagcgggaag ggactggctg ctattgggcg aagtgccggg 660 gcaggatctc ctgtcatctc accttgctcc tgccgagaaa gtatccatca tggctgatgc 720 aatgcggcgg ctgcatacgc ttgatccggc tacctgccca ttcgaccacc aagcgaaaca 780 tcgcatcgag cgagcacgta ctcggatgga agccggtctt gtcgatcagg atgatctgga 840 cgaagagcat caggggctcg cgccagccga actgttcgcc aggctcaagg cgcggatgcc 900 cgacggcgag gatctcgtcg tgacccatgg cgatgcctgc ttgccgaata tcatggtgga 960 aaatggccgc ttttctggat tcatcgactg tggccggctg ggtgtggcgg accgctatca 1020 ggacatagcg ttggctaccc gtgatattgc tgaagagctt ggcggcgaat gggctgaccg 1080 cttcctcgtg ctttacggta tcgccgctcc cgattcgcag cgcatcgcct tctatcgcct 1140 tcttgacgag ttcttctgag cgggactctg gggttcgcga tgataagctg tcaaacatga 1200 gaattacaac ttatatcgta tggggctgac ttcaggtgct acatttgaag agataaattg 1260 cactgaaatc tagaaatatt ttatctgatt aataagatga tcttcttgag atcgttttgg 1320 tctgcgcgta atctcttgct ctgaaaacga aaaaaccgcc ttgcagggcg gtttttcgaa 1380 ggttctctga gctaccaact ctttgaaccg aggtaactgg cttggaggag cgcagtcacc 1440 aaaacttgtc ctttcagttt agccttaacc ggcgcatgac ttcaagacta actcctctaa 1500 atcaattacc agtggctgct gccagtggtg cttttgcatg tctttccggg ttggactcaa 1560 gacgatagtt accggataag gcgcagcggt cggactgaac ggggggttcg tgcatacagt 1620 ccagcttgga gcgaactgcc tacccggaac tgagtgtcag gcgtggaatg agacaaacgc 1680 ggccataaca gcggaatgac accggtaaac cgaaaggcag gaacaggaga gcgcacgagg 1740 gagccgccag gggaaacgcc tggtatcttt atagtcctgt cgggtttcgc caccactgat 1800 ttgagcgtca gatttcgtga tgcttgtcag gggggcggag cctatggaaa aacggctttg 1860 ccttctttcc tgcgttatcc cctgattctg tggataaccg tattaccgcc tttgagtgag 1920 ctgataccgc tcgccgcagc cgaacgaccg agcgcagcga gtcagtgagc gaggaagcgg 1980 aagagcgccc aatacgcaaa ccgcctctcc ccgcgcgttg gccgattcat taatgcagct 2040 ggcacgacag gtttcccgac tggaaagcgg gcagtgagcg caacgcaatt aatgtgagtt 2100 agctcactca ttaggcaccc caggctttac actttatgct tccggctcgt atgttgtgtg 2160 gaattgtgag cggataacaa tttcacacag gaattcacag ctatgctaga gcggccgctc 2220 gacctgcagg catgcaagct tggcactggc cgtcgtttta caacgtcgtg actgggaaaa 2280 ccctggcgtt acccaactta atcgccttgc agcacatccc cctttcgcca gctggcgtaa 2340 tagcgaagag gcccgcaccg atcgcccttc ccaacagttg cgcagcctga atggcgaatg 2400 gcg 2403

Claims (37)

1. (a) SEQ ID NO:2의 아미노산 1 내지 42와 적어도 60% 동일성을 가진 아미노산 서열을 포함한 폴리펩티드;

   (b) 적어도 중간 엄격성 조건 하에서 (i) SEQ ID NO:1의 뉴클레오티드 145 내지 270, (ii) SEQ ID NO:1의 뉴클레오티드 1 내지 270에 함유된 cDNA 서열, 또는 (iii) (i) 또는 (ii)의 상보적 가닥과 혼성화하는 폴리뉴클레오티드에 의하여 코딩되는 폴리펩티드; 및

   (c) SEQ ID NO:2의 아미노산 1 내지 42 중 하나 이상의 아미노산의 보존적 치환, 결실, 및/또는 삽입을 포함하는 변이체

   로 구성된 군 중에서 선택되는, 항균성을 가진 폴리펩티드.
2. 제 1 항에 있어서, SEQ ID NO:2의 아미노산 1 내지 42와 적어도 60% 동일성을 가진 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
3. 제 2 항에 있어서, SEQ ID NO:2의 아미노산 1 내지 42와 적어도 70% 동일성을 가진 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
4. 제 3 항에 있어서, SEQ ID NO:2의 아미노산 1 내지 42와 적어도 80% 동일성을 가진 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
5. 제 4 항에 있어서, SEQ ID NO:2의 아미노산 1 내지 42와 적어도 90% 동일성을 가진 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
6. 제 5 항에 있어서, SEQ ID NO:2의 아미노산 1 내지 42와 적어도 95% 동일성을 가진 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, SEQ ID NO:2의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
8. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서, 항균성을 가진 SEQ ID NO:2 또는 그것의 단편으로 구성되는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
9. 제 8 항에 있어서, SEQ ID NO:2로 구성되는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
10. 제 8 항에 있어서, SEQ ID NO:2의 아미노산 1 내지 42로 구성되는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
11. 제 1 항에 있어서, 적어도 중간 엄격성 조건 하에서 (i) SEQ ID NO:1의 뉴클레오티드 145 내지 270, (ii) SEQ ID NO:1의 뉴클레오티드 1 내지 270에 함유된 cDNA 서열, 또는 (iii) (i) 또는 (ii)의 상보적 가닥과 혼성화하는 폴리뉴클레오티드로 코딩되는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
12. 제 1 항에 있어서, 적어도 중간-높은 엄격성 조건 하에서 (i) SEQ ID NO:1의 뉴클레오티드 145 내지 270, (ii) SEQ ID NO:1의 뉴클레오티드 1 내지 270에 함유된 cDNA 서열, 또는 (iii) (i) 또는 (ii)의 상보적 가닥과 혼성화하는 폴리뉴클레오티드로 코딩되는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
13. 제 1 항에 있어서, 적어도 높은 엄격성 조건 하에서 (i) SEQ ID NO:1의 뉴클레오티드 145 내지 270, (ii) SEQ ID NO:1의 뉴클레오티드 1 내지 270에 함유된 cDNA 서열, 또는 (iii) (i) 또는 (ii)의 상보적 가닥과 혼성화하는 폴리뉴클레오티드로 코딩되는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
14. 제 1 항에 있어서, 폴리펩티드는 SEQ ID NO:2의 아미노산 1 내지 42 중 하나 이상의 아미노산의 보존적 치환, 결실, 및/또는 삽입을 포함한 변이체인 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
15. 제 1 항 내지 제 14 항 중 어떤 한 항의 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 분리된 폴리뉴클레오티드.
16. 제 15 항에 있어서, SEQ ID NO:1의 성숙한 폴리펩티드 코딩 서열에 적어도 하나의 돌연변이를 가지며, 돌연변이체 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO:2의 아미노산 1 내지 42로 구성된 폴리펩티드를 코딩하는 것을 특징으로 하는 분리된 폴리뉴클레오티드.
17. 발현 숙주에서 폴리펩티드의 생성을 유도하는 하나 이상의 조절 서열에 작동가능하게 연결된 제 15 항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산 구성체.
18. 제 17 항의 핵산 구성체를 포함하는 재조합 발현 벡터.
19. 제 17 항의 핵산 구성체를 포함하는 재조합 숙주 세포.
20. (a) 폴리펩티드의 생성을 유도하는 조건 하에서 그것의 야생형 형태로 폴리펩티드를 생성할 수 있는 세포를 배양하는 단계; 및 (b) 폴리펩티드를 회수하는 단계를 포함하는 제 1 항 내지 제 14항 중 어떤 한 항의 폴리펩티드를 생성하는 방법.
21. (a) 폴리펩티드의 생성을 유도하는 조건 하에서 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 구성체를 포함하는 숙주 세포를 배양하는 단계; 및 (b) 폴리펩티드를 회수하는 단계를 포함하는 제 1 항 내지 제 14항 중 어떤 한 항 의 폴리펩티드를 생성하는 방법.
22. (a) 한 집단의 DNA를 중간 엄격성 조건 하에서 (i) SEQ ID NO:1의 뉴클레오티드 145 내지 270, (ii) SEQ ID NO:1의 뉴클레오티드 1 내지 270에 함유된 cDNA 서열, 또는 (iii) (i) 또는 (ii)의 상보적 가닥과 혼성화하는 단계; 및 (b) 항균성을 가진 폴리펩티드를 코딩하는 혼성화 폴리뉴클레오티드를 분리하는 단계에 의하여 얻어지는 분리된 폴리뉴클레오티드.
23. 제 22 항에 있어서, (a) 한 집단의 DNA를 중간-높은 엄격성 조건 하에서 (i) SEQ ID NO:1의 뉴클레오티드 145 내지 270, (ii) SEQ ID NO:1의 뉴클레오티드 1 내지 270에 함유된 cDNA 서열, 또는 (iii) (i) 또는 (ii)의 상보적 가닥과 혼성화하는 단계; 및 (b) 항균성을 가진 폴리펩티드를 코딩하는 혼성화 폴리뉴클레오티드를 분리하는 단계에 의하여 얻어지는 것을 특징으로 하는 분리된 폴리뉴클레오티드.
24. 제 23 항에 있어서, (a) 한 집단의 DNA를 높은 엄격성 조건 하에서 (i) SEQ ID NO:1의 뉴클레오티드 145 내지 270, (ii) SEQ ID NO:1의 뉴클레오티드 1 내지 270에 함유된 cDNA 서열, 또는 (iii) (i) 또는 (ii)의 상보적 가닥과 혼성화하는 단계; 및 (b) 항균성을 가진 폴리펩티드를 코딩하는 혼성화 폴리뉴클레오티드를 분리하는 단계에 의하여 얻어지는 것을 특징으로 하는 분리된 폴리뉴클레오티드.
25. (a) 돌연변이체 뉴클레오티드 서열이 SEQ ID NO:2의 아미노산 1 내지 42로 구성된 폴리펩티드를 코딩하는, 적어도 하나의 돌연변이를 SEQ ID NO:1의 성숙한 폴리뉴클레오티드 코딩 서열에 도입하는 단계; 및 (b) 돌연변이체 뉴클레오티드 서열을 포함한 폴리뉴클레오티드를 회수하는 단계를 포함하는, 돌연변이체 뉴클레오티드 서열을 가진 폴리뉴클레오티드를 생성하는 방법.
26. 제 25 항의 방법에 의하여 생성된 돌연변이체 폴리뉴클레오티드.
27. (a) 폴리펩티드의 생성을 유도하는 조건 하에서 폴리펩티드를 코딩하는 제 26 항의 돌연변이체 폴리뉴클레오티드를 포함하는 세포를 배양하는 단계; 및 (b) 폴리펩티드를 회수하는 단계를 포함하는, 폴리펩티드를 생성하는 방법.
28. SEQ ID NO:1의 뉴클레오티드 1 내지 60으로 구성된 신호 펩티드를 코딩하는 첫 번째 뉴클레오티드 서열과 SEQ ID NO:1의 뉴클레오티드 61 내지 144로 구성된 프로펩티드를 코딩하는 두 번째 뉴클레오티드 서열 중 하나 또는 둘 다에 작동가능하게 연결된 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하며, 그 유전자는 첫 번째 및 두 번째 뉴클레오티드 서열과 이종인 핵산 구성체.
29. 제 28 항의 핵산 구성체를 포함하는 재조합 발현 벡터.
30. 제 28 항의 핵산 구성체를 포함하는 재조합 숙주 세포.
31. (a) 단백질의 생성을 유도하는 조건 하에서 제 30 항의 재조합 숙주 세포를 배양하는 단계; 및 (b) 단백질을 회수하는 단계를 포함하는 단백질을 생성하는 방법.
32. (a) 폴리펩티드의 생성을 유도하는 조건 하에서 본 발명의 항균성을 가진 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 트랜스제닉 식물 또는 식물세포를 배양하는 단계; 및 (b) 폴리펩티드를 회수하는 단계를 포함하는 제 1 항 내지 제 14 항 중 어떤 한 항의 폴리펩티드를 생성하는 방법.
33. 제 1 항 내지 제 14 항 중 어떤 한 항의 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드로 형질전환된 트랜스제닉 식물, 식물 부분 또는 식물세포.
34. 미생물 세포를 제 1 항 내지 제 14 항 중 어떤 한 항에 정의된 항균 폴리펩티드와 접촉하는 단계를 포함하는 미생물 세포를 죽이거나 그 성장을 억제하는 방법.
35. 의약, 또는 항균 수의사 또는 사람 치료제 또는 예방제로 사용하기 위한 제 1 항 내지 제 14 항 중 어떤 한 항에 정의된 항균 폴리펩티드.
36. 미생물 감염의 치료 또는 예방적 사용을 위한 수의사 또는 사람 치료제의 제조에 제 1 항 내지 제 14 항 중 어떤 한 항에 정의된 항균 폴리펩티드의 사용.
37. 동물 급식에서 제 1 항 내지 제 14 항 중 어떤 한 항에 정의된 적어도 하나의 항균 폴리펩티드의 사용.