CN101098964A - 具有抗微生物活性的多肽及编码该多肽的多核苷酸 - Google Patents

Abstract

本发明涉及具有抗微生物活性的分离的多肽与编码该多肽的分离的多核苷酸。本发明还涉及包括该多核苷酸的核酸构建体、载体和宿主细胞，以及产生和使用该多肽的方法。

Description

具有抗微生物活性的多肽及编码该多肽的多核苷酸

技术领域

本发明涉及具有抗微生物活性的分离的多肽与编码该多肽的分离的多核苷酸。本发明还涉及包含该多核苷酸的核酸构建体、载体、及宿主细胞，以及产生与使用该多肽的方法。

发明背景

本发明的一个目的是提供具有抗微生物活性的多肽与编码该多肽的多核苷酸。

发明概述

本发明涉及具有抗微生物活性的分离的多肽，其选自下组：

(a)多肽，其具有与SEQ ID NO：2的氨基酸1至42有至少60％同一性的氨基酸序列；

(b)由核苷酸序列编码的多肽，该核苷酸序列在至少中度严紧条件下与(i)SEQ ID NO：1的核苷酸145至270、(ii)SEQ ID NO：1的核苷酸1至270中包含的cDNA序列、或(iii)(i)或(ii)的互补链杂交；以及

(c)变体，其包含SEQ ID NO：2的氨基酸1至42的一或多个氨基酸的保守性取代、缺失、和/或插入。

本发明还涉及编码具有抗微生物活性的多肽的分离的多核苷酸，其选自下组：

(a)多核苷酸，其编码具有与SEQ ID NO：2的氨基酸1至42有至少60％同一性的氨基酸序列的多肽；

(b)多核苷酸，其与SEQ ID NO：1的核苷酸145至270具有至少60％同一性；以及

(c)多核苷酸，其在至少中度严紧条件下与(i)SEQ ID NO：1的核苷酸145至270、(ii)SEQ ID NO：1的核苷酸1至270所包含的cDNA序列、或(iii)(i)或(ii)的互补链杂交。

本发明还涉及包含该多核苷酸的核酸构建体、重组表达载体、和重组宿主细胞。

本发明还涉及产生这样的具有抗微生物活性的多肽的方法，其包括(a)在有益于产生该多肽的条件下，培养包括核酸构建体的重组宿主细胞，该核酸构建体包括编码该多肽的多核苷酸；以及(b)回收该多肽。

本发明还涉及使用本发明的多肽与多核苷酸的方法。

定义

抗微生物活性(antimicrobial activity)：术语“抗微生物活性”在此定义为能够杀死微生物细胞或抑制微生物细胞生长的活性。在本发明的背景中，术语“抗微生物的”意在表达这样的意思，即存在杀细菌的(bactericidal)和/或抑细菌的(bacteriostatic)效果，和/或杀真菌的(fungicidal)和/或抑真菌的(fungistatic)效果，和/或杀病毒(virucidal)的效果，其中术语“杀细菌的”应理解为能够杀死细菌细胞。术语“抑细菌的”应理解为能够抑制细菌的生长，即抑制生长中的细菌细胞。术语“杀真菌的”应理解为有杀死真菌细胞的能力。术语“抑真菌的”应理解为能够抑制真菌生长，即抑制生长中的真菌细胞。术语“杀病毒的”应理解为有灭活病毒的能力。术语“微生物细胞”指细菌或真菌细胞(包括酵母)。

在本发明的背景中，术语“抑制微生物细胞的生长”意在表达这样的意思，即细胞处于非生长状态，即它们无法增殖。

为了本发明的目的，抗微生物的活性可根据Lehrer等人，Journal ofImmunological methods，Vol.137(2)pp.167-174(1991)所述的程序测定。或者，抗微生物的活性可根据来自CLSI(临床与实验室标准学会(Clinical andLaboratory Standards Institute)；之前被称为国家临床与实验室标准委员会(National Committee of Clinical and Laboratory Standards))的NCCLS指南测定。

具有抗微生物活性的多肽可具有以下的能力：在20℃于具有抗微生物活性的多肽的25％(w/w)水溶液中；更优选10％(w/w)的水溶液中；更优选5％(w/w)的水溶液中；更优选1％(w/w)的水溶液中；最优选0.5％(w/w)的水溶液中；尤其是于0.1％(w/w)的水溶液中温育8小时后(优选4小时后，更优选2小时后，最优选1小时后，尤其是30分钟后)减少大肠杆菌(Escherichiacoli)(DSM 1576)活细胞数目至1/100。

具有抗微生物活性的多肽还可具有以下的能力：在25℃于微生物的生长底物中，当以1000ppm的浓度加入；较优选以500ppm的浓度加入；更优选以250ppm的浓度加入；更优选以100ppm的浓度加入；最优选以50ppm的浓度加入；尤其是以25ppm的浓度加入时，抑制大肠杆菌(DSM 1576)的生长晕(outgrowth)24小时。

具有抗微生物活性的多肽可具有以下的能力；在20℃于具有抗微生物活性的多肽的25％(w/w)水溶液中；优选于10％(w/w)的水溶液中；更优选于5％(w/w)的水溶液中；甚至更优选于1％(w/w)的水溶液中；最优选于0.5％(w/w)的水溶液中；尤其是于0.1％(w/w)的水溶液中温育8小时后(较优选4小时后，更优选2小时后，最优选1小时后，尤其是30分钟后)将枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)(ATCC 6633)活细胞减少至1/100。

具有抗微生物活性的多肽还可具有以下的能力：在25℃于微生物生长底物中，当以1000ppm的浓度加入；优选以500ppm的浓度加入；更优选以250ppm的浓度加入；甚至更优选以100ppm的浓度加入；最优选以50ppm的浓度加入；尤其是以25ppm的浓度加入时，抑制枯草芽孢杆菌(ATCC6633)的生长晕(outgrowth)24小时。

本发明的多肽具有由SEQ ID NO：2的氨基酸1至42所示的氨基酸序列组成的多肽的至少20％，优选至少40％，更优选至少50％，更优选至少60％，更优选至少70％，更优选至少80％，甚至更优选至少90％，最优选至少95％，或甚至最优选至少100％的抗微生物的活性。

防卫素(Defensin)：术语“防卫素”用于此处指本领域技术人员认为属于防卫素类抗微生物多肽的多肽。为确定某种多肽是否为本发明的防卫素，优选使用可免费获得的HMMER软件包将其氨基酸序列与PFAM数据库的隐蔽马尔科夫模型子集(hidden markov model profile)(HMM子集)比较(参见实施例6)。

PFAM防卫素家族包括防卫素_1或“哺乳类防卫素”(“Mammaliandefensin”)(登录号PF00323)、防卫素_2或“节肢动物防卫素”(登录号PF01097)、防卫素_β或“β防卫素”(登录号PF00711)、防卫素_propep或“防卫素前肽”(登录号PF00879)与γ-硫堇(γ-thionin)或“γ-硫堇家族”(登录号PF00304)。

防卫素可属于α-防卫素类、β-防卫素类、θ-防卫素类、昆虫(节肢动物)防卫素类、植物防卫素类、贝类(mussel)防卫素类、或其它防卫素类，其中氨基酸序列包括6或8个半胱氨酸且结构上类似于任何前述防卫素类。防卫素还可为与所述任何防卫素类型有共同的特征性质的合成性防卫素。

这样的防卫素的实例包括，但不限于，α-防卫素HNP-1(人类嗜中性粒细胞肽)、HNP-2与HNP-3；β-防卫素-12、Drosomycin、海利霉素(Heliomicin)、γ1-嘌呤硫堇(γ1-purothionin)、昆虫防卫素A、与PCT申请WO 99/53053、WO 02/085934与WO 03/044049所公开的防卫素。

分离的多肽：术语“分离的多肽”此处用来指这样的多肽，其至少是20％纯，较优选至少40％纯，更优选至少60％纯，更优选至少80％纯，最优选至少90％的，且甚至最优选至少95％纯的，其纯度以SDS-PAGE测定。

基本上纯的多肽：术语“基本上纯的多肽”在本文中指这样的多肽制备物，其包含最多10％，较优选最多8％，更优选最多6％，更优选最多5％，更优选最多4％，最多3％，甚至更优选最多2％，最优选最多1％，且甚至最优选最多0.5％以重量计的与该多肽天然伴随的其它多肽物质。因此，较优选地，所述基本上纯的多肽为至少92％纯，较优选至少94％纯，更优选至少95％纯，更优选至少96％纯，更优选至少96％纯，更优选至少97％纯，更优选至少98％纯，甚至更优选至少99％纯，最优选至少99.5％纯，且甚至最优选100％纯，以存在于该制备物中的总多肽物质的重量计。

本发明的多肽优选为基本上纯的形式。特别地，优选该多肽呈“实质上纯的形式”，即，该多肽制备物实质上不含其它与其天然伴随的多肽物质。这可以例如通过利用公知的重组方法或经典的纯化方法制备该多肽而实现。

这里，术语“基本上纯的多肽”与术语“分离的多肽”和“分离形式的多肽”同义。

同一性：两个氨基酸序列间或两个核苷酸序列间的相关性以参数“同一性”描述。

为了本发明的目的，两个氨基酸序列间的同一性程度可通过使用FASTA程序包2.0x版中包含的FASTA程序(参见W.R.Pearson与D.J.Lipman(1988)，″Improved Tools for Biological Sequence Analysis″，PNAS 85：2444-2448；以及W.R.Pearson(1990)″Rapid and Sensitive SequenceComparison with FASTP and FASTA″，Medhods in Enzymology 183：63-98)来测定。所使用的计分矩阵为BLOSUM50，缺口罚分(gap penalty)为-12，而缺口延伸罚分(gap extension penalty)为-2。

两个核苷酸序列间的同一性的程度使用与上述相同的算法与软件包测定。所使用的计分矩阵为同一性矩阵(identity matrix)，缺口罚分为-16，而缺口延伸罚分为-4。

或者，通过使用来自EMBOSS软件包(http://emboss.org)2.8.0版的Needle程序来确定两氨基酸序列的比对。Needle程序实现Needleman，S.B.与Wunsch，C.D.(1970)J.Mol.Biol.48，443-453中描述的总体比对算法。所使用的取代矩阵为BLOSUM62，缺口开放罚分(gap opening penalty)为10，而缺口延伸罚分为0.5。

一个本发明的氨基酸序列(“发明序列”；例如SEQ ID NO：2的氨基酸1至42)与一不同的氨基酸序列(“外来序列”)之间的同一性程度根据下述计算：用两序列的比对中完全匹配(exact matches)的数目，除以“发明序列”的长度或“外来序列”的长度(以其长度最短者)。结果以百分比同一性表示。

当“发明序列”与“外来序列”在重叠的相同位置上具有一致的氨基酸残基时，则发生完全匹配(在以下的比对实例将其以“|”表示)。序列的长度是该序列中氨基酸残基的数目(例如SEQ ID NO：2的氨基酸1至42的长度为42)。

在下面的比对实例中，重叠为序列1的氨基酸序列“HTWGER-NL”；或序列2的氨基酸序列“HGWGEDANL”。在该实例中，缺口以“-”表示。

比对实例

序列1：ACMSHTWGER-NL

           | ||| ||

序列2：HGWGEDANLAMNPS

多肽片段：术语“多肽片段”在此定义为从SEQ ID NO：2的氨基端和/或羧基端缺失了一个或多个氨基酸的多肽或其同源序列，其中该片段具有抗微生物活性。优选地，本发明的多肽片段保留所有的半胱氨酸残基，以及这些半胱氨酸残基之间的氨基酸残基。

子序列(subsequence)：术语“子序列”在此定义为从SEQ ID NO：1的5′和/或3′端缺失一个或多个核苷酸的核苷酸序列或其同源序列，其中该子序列编码具有抗微生物活性的多肽片段。

等位变体：术语“等位变体”在此指占据相同染色体座位的基因的两种或多种可选形式中的任何一种。等位变异通过突变天然地发生，且可能在群体中导致多态性。基因突变可为沉默的(在其编码的多肽中没有改变)或可编码具有改变的氨基酸序列的多肽。多肽的等位变体是由基因的等位变体所编码的多肽。

基本上纯的多核苷酸：术语“基本上纯的多核苷酸”在这里指这样的多核苷酸制备物，其不含其它无关的或不需要的核苷酸，并且呈适于在经基因工程处理的蛋白质产生系统中使用的形式。因此，基本上纯的多核苷酸包含最多10％，优选最多8％，更优选最多6％，更优选最多5％，更优选最多4％，更优选最多3％，甚至更优选最多2％，最优选最多1％，且甚至最优选最多0.5％以重量计的其它与其天然伴随的多核苷酸物质。然而，基本上纯的多核苷酸可包括天然存在的5’和3’非翻译区域，例如启动子与终止子。优选地，基本上纯的多核苷酸为至少90％纯，优选至少92％纯，更优选至少94％纯，更优选至少95％纯，更优选至少96％纯，更优选至少97％纯，甚至更优选至少98％纯，最优选至少99％，且甚至最优选至少99.5％纯，其以重量计。本发明的多核苷酸优选呈基本上纯的形式。特别是，优选地，这里公开的多核苷酸为“实质上纯的形式”，即，该多核苷酸制备物实质上不含其它与其天然相伴随的多核苷酸物质。这里，术语“基本上纯的多核苷酸”与术语“分离的多核苷酸”以及“分离形式的多核苷酸”同义。该多核苷酸可为基因组、cDNA、RNA、半合成、合成来源，或其任何组合。

cDNA：术语“cDNA”在此定义为这样的DNA分子，其可从成熟、经剪接的mRNA分子通过反转录而制备，其中所述mRNA分子获自真核细胞。cDNA缺少通常出现于相应的基因组DNA中的内含子序列。最先的初级RNA转录物是mRNA的前体，其经过一系列的步骤加工后，作为成熟的、经剪接的mRNA出现。这些步骤包括通过称为剪接的过程去除内含子序列。因此，衍生自mRNA的cDNA缺少任何内含子序列。

核酸构建体：术语“核酸构建体”此处指这样的核酸分子，其为单链或双链，分离自天然存在的基因，或其经过修饰而以原本不会天然存在的方式包含核酸片段。当核酸构建体包含表达本发明的编码序列所需的控制序列时，术语核酸构建体与术语“表达盒”同义。

控制序列：术语“控制序列”在此定义为包括对编码本发明多肽的多核苷酸的表达而言必需或有利的所有组分。每个控制序列对编码多肽的核苷酸序列而言可以是固有的或外来的。这些控制序列包括，但不限于，前导序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列、以及转录终止子。最少，控制序列包括启动子、以及转录终止信号与翻译终止信号。控制序列可具有接头，用来导入特定的限制性位点，以便于将控制序列与编码多肽的核苷酸序列的编码区域连接。

可操作地连接：术语“可操作地连接”在此指这样的构型，其中控制序列被置于相对多核苷酸序列的编码序列的适当位置，使得该控制序列指导多肽的编码序列的表达。

编码序列：在这里使用时，术语“编码序列”指这样的核苷酸序列，其直接规定其蛋白质产物的氨基酸序列。编码序列的边界一般由开放阅读框决定，而开放阅读框通常以ATG起始密码子或者备选起始密码子例如GTG与TTG开始。编码序列可为DNA、cDNA、或重组核苷酸序列。

表达：术语“表达”包括多肽的产生所涉及的任何步骤，其包括，但不限于，转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰、以及分泌。

表达载体：术语“表达载体”在此定义为线性或环状DNA分子，其包括编码本发明多肽的多核苷酸，且可操作地连接于用于其表达的额外核苷酸。

宿主细胞：术语“宿主细胞”，用于此处时，包括任何细胞类型，其易于被包含本发明多核苷酸的核酸构建体转化、转染、转导等等。

修饰：术语“修饰”在此处意味着对由SEQ ID NO：2的氨基酸1至42组成的多肽的任何化学修饰，以及对编码该多肽的DNA的基因操作。修饰可为在该氨基酸序列中发生一或多个氨基酸的取代、缺失和/或插入，以及氨基酸侧链的置换，或使用具有类似特征的非天然氨基酸。特别地，所述修饰可以是酰胺化，例如C端的酰胺化。

人工变体：当用于此处时，术语“人工变体”指具有抗微生物活性的多肽，其由表达经修饰的SEQ ID NO：1的核苷酸序列的生物产生。该修饰核苷酸序列是通过人力介入，对SEQ ID NO：1公开的核苷酸序列进行修饰而获得的。

发明详述

具有抗微生物活性的多肽

在第一个方面，本发明涉及分离的多肽，其具有这样的氨基酸序列，该序列与SEQ ID NO：2的氨基酸1至42(即成熟多肽)具有至少60％，优选至少65％，更优选至少70％，更优选至少75％，更优选至少80％，更优选至少85％，甚至更优选至少90％，最优选至少95％，且甚至最优选至少97％的同一性，并具有抗微生物活性(以下称“同源多肽”)。在一个优选的方面，同源多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO：2的氨基酸1至42有10个氨基酸，优选有5个氨基酸，更优选有4个氨基酸，甚至更优选有3个氨基酸，最优选有2个氨基酸，且甚至最优选有1个氨基酸不同。

本发明的多肽优选包括SEQ ID NO：2的氨基酸序列或其等位变体；或其具有抗微生物活性的片段。在一个优选的方面，多肽包括SEQ ID NO：2的氨基酸序列。在另一个优选的方面，多肽包括SEQ ID NO：2的氨基酸1至42，或其等位变体；或其具有抗微生物活性的片段。在另一个优选的方面，多肽包括SEQ ID NO：2的氨基酸1至42。在另一个优选的方面，多肽由SEQ ID NO：2的氨基酸序列或其等位变体；或其具有抗微生物活性的片段组成。在另一个优选的方面，多肽由SEQ ID NO：2的氨基酸序列组成。在另一个优选的方面，多肽由SEQ ID NO：2的氨基酸1至42或其等位变体；或其具有抗微生物活性的片段组成。在另一个优选的方面，多肽由SEQ IDNO：2的氨基酸1至42组成。

在第二个方面，本发明涉及具有抗微生物活性的分离多肽，它们由这样的多核苷酸所编码：所述多核苷酸在极低严紧条件下，优选在低度严紧条件下，更优选在中度严紧条件下，更优选在中度-高度严紧条件下，甚至更优选在高度严紧条件下，最优选在极高严紧条件下与下列者杂交：(i)SEQID NO：1的核苷酸145至270，(ii)SEQ ID NO：1的核苷酸1至270中包含的cDNA序列，(iii)(i)或(ii)的子序列，或(iv)(i)、(ii)、或(iii)的互补链(J.Sambrook，E.F.Fritsch，与T.Maniatus，1989，Molecular Cloning，A Labrotory Manual，2dedition，Cold Spring Harbor，New York)。SEQ ID NO：1的子序列包含至少100个连续的核苷酸或优选至少200个连续的核苷酸。此外，该子序列可编码具有抗微生物活性的多肽片段。

SEQ ID NO：1或其子序列的核苷酸序列，以及SEQ ID NO：2或其片段的氨基酸序列，可用于设计核酸探针，以从不同的属或种的株系中依照本领域熟知的技术鉴定并克隆编码具有抗微生物活性的多肽的DNA。特别地，可依照标准Southern印迹法程序，用这样的探针与目标属或种的基因组DNA或cDNA杂交，以鉴定并分离其中相应的基因。这样的探针可以显著地短于完整序列，但长度应该至少为14个，优选至少25个，更优选至少35个，最优选至少70个核苷酸。然而，优选该核酸探针的长度至少为100个核苷酸。例如，该核酸探针可为至少200个核苷酸，优选至少为270个核苷酸。DNA与RNA探针两者都可使用。该探针通常被标记以用来检测相应的基因(例如，以³²P、³H、³⁵S、生物素、或抗生物素蛋白标记)。这样的探针为本发明所涵盖。

因此，对于从这样的其它生物制备的基因组DNA或cDNA文库，可以从其中筛选可与上述探针杂交并编码具有抗微生物活性多肽的DNA。来自这样的其它生物的基因组或其它DNA可借助琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳或其它分离技术来分离。来自所述文库的DNA或经过分离的DNA可转移至并固定于硝酸纤维素或其它适合的载体材料上。为了鉴定与SEQ ID NO：1或其子序列同源的克隆或DNA，将该载体材料用于Southern印迹。

为了本发明的目的，“杂交”表明在极低至极高严紧条件下，该核苷酸序列与标记核酸探针发生杂交，其中所述探针对应于SEQ ID NO：1中所示核苷酸序列、其互补链、或其子序列。在此条件下与所述核酸探针发生杂交的分子可使用X光胶片检测。

在一个优选的方面，该核酸探针是编码SEQ ID NO：2的多肽的多核苷酸序列，或其子序列。在另一个优选的方面，该核酸探针是SEQ ID NO：1。在另一个优选的方面，该核酸探针是SEQ ID NO：1的成熟多肽编码区域。

对长度至少100个核苷酸的长探针而言，极低至极高严紧条件定义为：在42℃、于5X SSPE、0.3％SDS、200μg/ml经剪切并变性的鲑精DNA、及25％甲酰胺(用于极低及低严紧度)、35％甲酰胺(用于中及中-高严紧度)、或50％甲酰胺(用于高度和极高严紧度)中进行预杂交与杂交，其依照标准Southern印迹程序最优地进行12个至24个小时。

对长度至少100个核苷酸的长探针，将载体材料最终清洗三次，每次15分钟，其中洗涤使用2X SSC、0.2％SDS，优选在至少45℃(极低严紧度)，更优选至少50℃(低严紧度)，更优选至少55℃(中度严紧度)，更优选至少60℃(中-高严紧度)，更优选至少65℃(高严紧度)，最优选于至少70℃(极高严紧度)进行。

对长度为大约15个核苷酸至大约70个核苷酸的短探针，严紧条件定义为：根据标准Southern印迹程序，在比使用根据Bolton与McCarthy(1962，Proceedings of the National Academy of Sciences USA 48：1390)的计算法算得的T_m低大约5℃至大约10℃的温度，于0.9M NaCl、0.09M Tris-HCl pH7.6、6mM EDTA、0.5％NP-40、1X Denhardt溶液、1mM焦磷酸钠、1mM磷酸二氢钠(Sodium monobasic phosphate)、0.1mM ATP、与0.2mg/ml酵母RNA中进行预杂交、杂交和杂交后清洗。

对长度为大约15个核苷酸至大约70个核苷酸的短探针，在低于计算所得之T_m大约5℃至大约10℃条件下，在6X SCC加0.1％SDS中清洗载体材料一次15分钟，并使用6X SSC清洗两次各15分钟。

在第三个方面，本发明涉及人工变体，其包括SEQ ID NO：2或其成熟多肽的一个或多个氨基酸的保守性取代、缺失和/或插入。优选地，氨基酸改变从性质而言是次要的，即：不显著影响蛋白质的折叠和/或活性的保守性氨基酸置换或插入；小的缺失，通常为1到大约30个氨基酸；小的氨基或羧基末端延伸，例如氨基末端的甲硫氨酸残基；长达大约20-25个残基的小接头肽；或通过改变净电荷或其它功能从而促进纯化的小段延伸，诸如多组氨酸序列段(poly-histidine tract)、抗原性表位、或结合域。

保守性取代的例子在下面各组之内：碱性氨基酸(精氨酸、赖氨酸和组氨酸)、酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水性氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸)、芳香族氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)、和小氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸和甲硫氨酸)。一般不改变具体活性的氨基酸置换是本领域已知的，例如H.Neurath和R.L.Hill在The Proteins中所述(1979，Academic Press，New York)。最常发生的取代是Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu、和Asp/Gly。

除了20个标准氨基酸外，可使用非标准氨基酸(例如4-羟基脯氨酸、6-N-甲基赖氨酸、2-氨基异丁酸、异缬氨酸、与α-甲基丝氨酸)来取代野生型多肽的氨基酸残基。可以使用有限数目的非保守性氨基酸(不由基因密码编码的氨基酸)及非天然氨基酸来取代氨基酸残基。“非天然氨基酸”已在蛋白质合成后被修饰，并且/或者在其侧链中具有与标准氨基酸不同的化学结构。非天然氨基酸可被化学地合成，且优选是可以商购的，其包括2-哌啶酸(pipecolic acid)、噻唑啉羧酸、脱氢脯氨酸、3-和4-甲基脯氨酸、以及3，3-二甲基脯氨酸。

或者，所述氨基酸改变具有这样的性质，使得多肽的物理-化学特性被改变。例如，氨基酸改变可改善多肽的热稳定性、改变底物特异性、改变最适pH、等等。

亲本多肽中的关键氨基酸可根据本领域已知的方法，例如定点诱变或丙氨酸扫描诱变(Cunningham与Wells，1989，Science 244：1081-1085)来鉴定。在后一种技术中，将在分子中的每个残基中导入单个丙氨酸突变，并测试所得突变分子的生物活性(即抗微生物活性)，以鉴定对该分子的活性来说至关重要的氨基酸残基。另见Hilton等，1996，J.Biol.Chem.271：4699-4708。酶的活性位点或其它生物相互作用还可通过分析物理结构(通过例如核磁共振、结晶学、电子衍射、或光亲合标记来确定)，结合对推定的接触位置氨基酸的突变来测定。参见，例如，de Vos等，1992，Science 255：306-312；Smith等，1992，J.Mol.Biol.224：899-904；Wlodaver等，1992，FEBSLett.309：59-64。还可从分析与本发明多肽相关的多肽的特征出发来推定关键氨基酸的特征。

可使用已知的诱变、重组、或改组(shuffling)方法，随后进行相关的筛选程序，例如Reidhaar-Olson与Sauer，1988，Science 241：53-57；Bowie与Sauer，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：2152-2156；WO 95/17413；或WO 95/22625所公开的那些，来产生并测试单个或多个氨基酸取代。可使用的其它方法包括易错(error-prone)PCR、噬菌体展示(例如Lowman等，1991，Biochem.30：10832-10837；美国专利号5,223,409；WO 92/06204)、以及区域针对性(region-directed)诱变(Derbyshire等，1986，Gene 46：145；Ner等，1988，DNA 7：127)。

可以将诱变/改组方法和高通量、自动化筛选方法结合起来，检测由宿主细胞表达的经过克隆、诱变的多肽的活性。可以从宿主细胞中回收编码活性多肽的经诱变的DNA分子，并使用本领域的标准方法对其快速测序。这些方法使人们能够快速确定目标多肽中个别氨基酸残基的重要性，且可适用于结构未知的多肽。

SEQ ID NO：2的氨基酸1至42的氨基酸取代、缺失和/或插入的总数为10，优选9，更优选8，更优选7，更优选最多6，更优选最多5，更优选4，甚至更优选3，最优选2，且甚至最优选1。

在一个优选的实施方式中，本发明的多肽是防卫素多肽。在另一个实施方式中，本发明的多肽包括三个双-半胱氨酸键。

N-端延伸

本发明的多肽的N-端延伸可适合地由1至50个氨基酸，优选2-20个氨基酸，尤其是3-15个氨基酸组成。在一个实施方式中，N-末端多肽延伸不包含Arg(R)。在另一个实施方式中，该N-末端延伸包括kex2或类-kex2切割位点(下面将对其进一步定义)。在一个优选实施方式中，该N-末端延伸是包括至少两个Glu(E)和/或Asp(D)氨基酸残基的肽，例如包括下列序列中之一的N-末端延伸：EAE、EE、DE与DD。

Kex2位点

Kex2位点(参见，例如，Methods in Enzymology Vol 185，ed.D.Goeddel，Academic Press Inc.(1990)，San Diego，CA，“Gene Expression Technology”)与类-Kex2位点是在某些蛋白质的前肽编码区域与成熟区域之间存在的二元(di-basic)识别位点(即切割位点)。

已经证明，在某些情况下，插入Kex2位点或类-Kex2位点可促进前肽切割位点处的正确内肽酶加工，导致蛋白质分泌水平增加。

在本发明的背景中，插入kex2或类-Kex2位点使得在N-末端延伸中的某个位置获得切割成为可能，结果产生与SEQ ID NO：2的氨基酸1至42所示的成熟多肽相比得以延伸的抗微生物多肽。

融合多肽

本发明的多肽还包括融合多肽或可切割的融合多肽，其中另一多肽被融合到本发明的多肽或其片段的N-端或C-端。融合多肽是通过将编码另一多肽的核苷酸序列(或其部分)融合至本发明的核苷酸序列(或其部分)而产生的。用于产生融合多肽的技术是本领域已知的，包括将编码多肽的多个编码序列连接起来，使得它们处于同一阅读框中，并且融合多肽的表达在相同的启动子与终止子的控制下。

具有抗微生物活性的多肽的来源

本发明的多肽可获自任何属的微生物，为了本发明的目的，术语“获自”与所给定的来源联用时，应意指核苷酸序列所编码的多肽是由该来源产生的，或者是由这样的株系产生的：该株系中插入了来自该来源的所述核苷酸。在一个优选的方面，获自给定来源的多肽被分泌到细胞外。

本发明的多肽可为细菌多肽。例如，该多肽可为革兰氏阳性细菌的多肽，例如芽孢杆菌(Bacillus)的多肽，例如，嗜碱芽孢杆菌(Bacillusalkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、短芽孢杆菌(Bacillus brevis)、环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)、凝结芽孢杆菌(Bacilluscoagulans)、灿烂芽孢杆菌(Bacillus lautus)、迟缓孢芽杆菌(Bacillus lentus)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、脂肪嗜热芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)、枯草芽孢杆菌、或苏云金孢芽杆菌(Bacillus thuringiensis)的多肽；或链霉菌(Streptomyces)的多肽，例如，浅青紫链霉菌(Streptomyces lividans)或鼠灰链霉菌(Streptomyces murinus)的多肽；或革兰氏阴性细菌的多肽，例如，大肠杆菌或假单胞菌某个种(Pseudomonas sp.)的多肽。

本发明的多肽还可为真菌多肽，更优选为酵母多肽，例如假丝酵母属(Candida)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、毕赤酵母属(Pichia)、酵母属(Saccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)、或Yarrowia属的多肽；或更优选丝状真菌的多肽，例如枝顶孢属(Acremonium)、曲霉属(Aspergillus)、短梗霉属(Aureobasidium)、隐球菌属(Cryptococcus)、Filibasidium属、镰孢属(Fusarium)、腐质霉属(Humicola)、Magnaporthe属、毛霉属(Mucor)、毁丝霉属(Myceliophthora)、Neocallimastix属、脉孢菌属(Neurospora)、拟青霉属(Paecilomyces)、青霉属(Penicillium)、Piromyces属、裂褶菌属(Schizophyllum)、踝节菌属(Talaromyces)、嗜热子囊菌属(Thermoascus)、梭孢壳属(Thielavia)、Tolypocladium属、或木霉属(Trichoderma)的多肽。

在一个优选的方面，该多肽是卡尔酵母(Saccharomyces carlsbergensis)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、糖化酵母(Saccharomyces diastaticus)、Saccharomyces douglasii、克鲁弗酵母(Saccharomyces kluyveri)、诺地酵母(Saccharomyces norbensis)、或卵形酵母(Saccharomyces oviformis)的具有抗微生物活性的多肽。

在另一个优选的方面，多肽是棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)、泡盛曲霉(Aspergillus awamori)、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、臭曲霉(Aspergillusfoetidus)、日本曲霉(Aspergillus japonicus)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、杆孢状镰孢(Fusariumbactridioides)、Fusarium cerealis、Fusarium crookwellense、大刀镰孢(Fusariumculmorum)、禾本科镰孢(Fusarium graminearum)、禾赤镰孢(Fusariumgraminum)、异孢镰孢(Fusarium heterosporium)、合欢木镰孢(Fusariumnegundi)、尖镰孢(Fusarium oxysporum)、多枝镰孢(Fusarium reticulatum)、粉红镰孢(Fusarium roseum)、接骨木镰孢(Fusarium sambucinum)、肤色镰孢(Fusarium sarcochroum)、拟分枝孢镰孢(Fusarium sporotrichioides)、Fusariumsulphureum、Fusarium torulosum、Fusarium trichothecioides、Fusariumvenenatum、Humicola insolens、Humicola lanuginosa、曼赫毛霉(Mucormiehei)、Myceliophthora thermophila、粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)、产紫青霉(Penicillium purpurogenum)、哈茨木霉(Trichoderma harzianum)、康宁木霉(Trichoderma koningii)、Trichoderma longibrachiatum、Trichoderma reesei、或绿色木霉(Trichoderma viride)的多肽。

在另一个较优选的方面，该多肽是阿姆斯特丹散囊菌(Eurotiumamstelodami)、阿姆斯特丹曲霉(Aspergillus amstelodami)、蒙地曲霉(Aspergillus montevidensis)或Aspergillus vitis的多肽。

在一个优选的方面，该多肽系个阿姆斯特丹散囊菌的多肽，例如，SEQID NO：2的多肽。

应当理解，对于以上所提及的种，本发明涵盖完全的与不完全的状态(state)两者，以及其它分类上的等同物，例如无性型(anamorphs)，而不论其以什么种名为人所知。本领域技术人员将容易地识别合适的等同物的特征。

公众可以容易地从许多培养物保藏机构获得这些物种的株系，如美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)、德意志微生物和细胞培养物保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen undZellkulturen GmbH，DSM)、真菌菌种保藏中心(Centraalbureau VoorSchimmelcultures，CBS)、与农业研究服务专利培养物保藏中心，北方区域研究中心(Agricultural Research Service Patent Culture Collection，NorthernRegional Research Center，NRRL)。

此外，这样的多肽还可以从其它来源鉴定和获得，包括通过使用上述的探针从自然(例如，土壤、堆肥、水；等等)分离的微生物。用于从天然生境分离微生物的技术是本领域众所周知的。然后可通过类似地筛选其它微生物的基因组或cDNA文库而获得所述多核苷酸。一旦已用探针检测到编码多肽的多核苷酸序列，则可使用本领域一般技术人员熟知的技术来分离或克隆该多核苷酸(参见，例如，Sambrook等，1989，如上述)。

本发明的多肽还包括融合多肽或可切割的融合多肽，其中另一多肽被融合至该多肽或其片段的N-端或C-端。融合多肽是通过融合编码另一多肽的核苷酸序列(或其部分)至本发明的核苷酸序列(或其部分)而产生的。用于产生融合多肽的技术是本领域已知的，包括将编码所述多肽的编码序列连接，使它们处于同一阅读框中，并使得融合多肽的表达在相同的启动子与终止子的控制下。

多核苷酸

本发明还涉及分离的多核苷酸，其具有编码本发明多肽的核苷酸序列。在一个优选的方面，该核苷酸序列在SEQ ID NO：1中列出。在另一个优选的方面，该核苷酸序列为SEQ ID NO：1的成熟多肽编码区域。本发明还涵盖这样的核苷酸序列，其编码具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的多肽或其成熟多肽，这些序列由于遗传密码的简并性而不同于SEQ ID NO：1。本发明还涉及SEQ ID NO：1的子序列，其编码SEQ ID NO：2的具有抗微生物活性的片段。

本发明还涉及突变多核苷酸，其在SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列中包括至少一个突变，其中该突变核苷酸序列编码由SEQ ID NO：2的氨基酸1至42组成的多肽。

用于分离或克隆编码多肽的多核苷酸的技术在本领域是已知的，包括从基因组DNA分离，从cDNA制备，或者两者的组合。例如，通过利用众所周知的聚合酶链式反应(PCR)，或抗体筛选表达文库以检测出具有共同结构特征的克隆DNA片段，可以实现从这些基因组DNA克隆本发明的多核苷酸序列。例如参见Innis等人，1990，《PCR：A Guide to Methods andApplication》，Academic Press，New York。还可以使用其它核酸扩增程序，诸如连接酶链式反应(LCR)、连接激活转录(LAT)、和基于核苷酸序列的扩增(nucleotide sequence-based amplification，NASBA)。可从散囊菌属(Eurotium)菌株或者另外的或相关的生物体克隆多核苷酸，因此，例如，它可以是核苷酸序列中多肽编码区的等位变体或种间变体。

本发明还涉及多核苷酸，其具有与SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列(即核苷酸145至270)有至少60％，优选至少65％，更优选至少70％，更优选至少75％，更优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少95％，最优选至少97％的同一性的核苷酸序列，并编码活性多肽。

修饰编码本发明多肽的核苷酸序列，对于合成与本发明多肽基本上类似的多肽可能是必需的。术语与多肽“基本上类似”是指所述多肽的非天然存在的形式。这些多肽可能在某些经过工程改造的方面区别于从其天然来源分离的多肽，例如在比活、热稳定性、最佳pH等方面不同的人工变体。变体序列可以在SEQ ID NO：1的多肽编码区所示核苷酸序列的基础上构建，例如其子序列，和/或通过引入不会导致由该核苷酸序列编码的多肽具有另一种氨基酸序列、而是使之符合要用来生产酶的宿主生物体的密码子使用方式的核苷酸取代，或通过引入可导致不同氨基酸序列的核苷酸取代来构建。对于核苷酸取代的一般性描述可参见例如Ford等，1991，ProteinExpression and Purification 2：95-107。

对本领域技术人员而言显而易见的是，这样的取代可发生在对分子功能而言关键的区域之外，且仍然得到活性多肽。对于由本发明的分离多核苷酸所编码的多肽的活性来说至关重要的、因此优选不被取代的氨基酸残基，可根据本领域的已知程序诸如定点诱变或丙氨酸扫描诱变(例如参见Cunningham和Wells，1989，Science 244：1081-1085)来鉴定。在后一种技术中，在分子中每一带正电荷残基处引入突变，然后测试由此得到的突变分子的抗微生物活性以鉴定对分子活性至关重要的氨基酸残基。底物-酶相互作用位点也可通过三维结构分析来确定，其中三维结构由核磁共振分析、晶体学、或光亲和标记等技术来测定(例如参见de Vos等，1992，Science 255：306-312；Smith等，1992，Journal of Molecular Biology 224：899-904；Wlodaver等，1992，FEBS Letters 309：59-64)。

本发明还涉及编码本发明多肽的分离的多核苷酸，其在低度严紧条件，优选中度严紧条件，更优选中度-高度严紧条件，甚至更优选高度严紧条件，最优选极高严紧条件下与以下者杂交：(i)SEQ ID NO：1的核苷酸145至270、(ii)SEQ ID NO：1的核苷酸1至270所包含的cDNA序列、或(iii)(i)或(ii)的互补链；或其等位变体及其子序列(Sambrook等，1989，同上)，如此处所定义的。

本发明还涉及分离的多核苷酸，其通过以下方法获得：(a)在低度、中度、中度-高度、高度、或极高严紧条件下将DNA群体与(i)SEQ ID NO：1的核苷酸145至270、(ii)SEQ ID NO：1的核苷酸1至270中包含的cDNA序列、或(iii)(i)或(ii)的互补链杂交；以及(b)分离该杂交多核苷酸，其编码具有抗微生物活性的多肽。

核酸构建体

本发明还涉及包含与一种或多种控制序列可操作连接的本发明的分离多核苷酸的核酸构建体，所述控制序列在适当宿主细胞中于与控制序列相容的条件下指导编码序列的表达。

可以多种方式操作编码本发明多肽的分离多核苷酸，以便于多肽的表达。根据表达载体的不同，可能希望或必须在将多核苷酸的序列插入载体之前对其进行操作。利用重组DNA方法修饰多核苷酸序列的技术是本领域众所周知的。

控制序列可以是适当的启动子序列，即受到宿主细胞识别来表达编码本发明多肽的多核苷酸的核苷酸序列。启动子序列包含调节多肽表达的转录控制序列。启动子可以是在所选宿主细胞中表现出转录活性的任何核苷酸序列，包括突变的、截短的和杂合的启动子，而且可获自编码与宿主细胞同源或异源的细胞外或细胞内多肽的基因。

用于指导本发明核酸构建体转录(尤其是在细菌宿主细胞中转录)的适当启动子的实例，是从大肠杆菌lac操纵子、天蓝色链霉菌(Streptomycescoelicolor)琼脂酶基因(dagA)、枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶基因(sacB)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyL)、嗜热脂肪芽孢杆菌生麦芽糖淀粉酶基因(amyM)、解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢杆菌青霉素酶基因(penP)、枯草芽孢杆菌xylA和xylB基因和原核生物的β-内酰胺酶基因(Villa-Kamaroff等，1978，Proceedings of the National Academy of SciencesUSA 75：3727-3731)中获得的启动子，以及tac启动子(DeBoer等，1983，Proceedings of the National Academy of Sciences USA 80：21-25)。还有“Usefulproteins from recombinant bacteria”，Scientific American，1980，242：74-94及Sambrook等，1989，同上中描述的其它启动子。

用于在丝状真菌宿主细胞中指导本发明核酸构建体转录的适当启动子的实例是从米曲霉TAKA淀粉酶、Rhizomucor miehei天冬氨酸蛋白酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶(glaA)、Rhizomucor miehei脂肪酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸异构酶、构巢曲霉乙酰胺酶、Fusarium venenatum淀粉葡糖苷酶(WO00/56900)、Fusarium venenatum Daria(WO 00/56900)、Fusarium venenatumQuinn(WO 00/56900)、尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶(WO 96/00787)、Trichodermareesei β-葡糖苷酶、Trichoderma reesei纤维二糖水解酶I、Trichoderma reesei内切葡聚糖酶I、Trichoderma reesei内切葡聚糖酶II、Trichoderma reesei内切葡聚糖酶III、Trichoderma reesei内切葡聚糖酶IV、Trichoderma reesei内切葡聚糖酶V、Trichoderma reesei木聚糖酶I、Trichoderma reesei木聚糖酶II、Trichoderma reeseiβ-木糖苷酶基因中获得的启动子，以及NA2-tpi启动子(来自黑曲霉中性α-淀粉酶和米曲霉丙糖磷酸异构酶基因的杂合启动子)；及其突变的、截短的和杂合的启动子。

在酵母宿主中，有用的启动子获自酿酒酵母烯醇化酶(ENO-1)、酿酒酵母半乳糖激酶(GAL1)、酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH1、ADH2/GAP)、酿酒酵母丙糖磷酸异构酶(TPI)、酿酒酵母金属硫蛋白(CUP1)、和酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶基因。Romanos等，1992，Yeast 8：423-488中描述了用于酵母宿主细胞的其它有用启动子。

控制序列也可以是适当的转录终止子序列，即由宿主细胞识别来终止转录的序列。终止子序列可操作连接于编码多肽的核苷酸序列的3′端。在所选择的宿主细胞中起作用的任何终止子都可用于本发明。

对于丝状真菌宿主细胞优选的终止子获自米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉α-葡糖苷酶和尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶的基因。

对于酵母宿主细胞优选的终止子获自酿酒酵母烯醇化酶、酿酒酵母细胞色素C(CYC1)、和酿酒酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶的基因。还有Romanos等，1992，同上中描述的用于酵母宿主细胞的其它有用终止子。

控制序列还可以是适当的前导序列(leader sequence)，即对宿主细胞翻译重要的mRNA非翻译区。前导序列可操作地连接于编码多肽的核苷酸序列的5′端。在所选择的宿主细胞中起作用的任何前导序列都可用于本发明。

对于丝状真菌宿主细胞优选的前导序列获自米曲霉TAKA淀粉酶和构巢曲霉丙糖磷酸异构酶基因。

对于酵母宿主细胞合适的前导序列获自酿酒酵母烯醇化酶(ENO-1)、酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶、酿酒酵母α-因子和酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH2/GAP)的基因。

控制序列还可以是聚腺苷酸化序列，即可操作连接于核苷酸序列3′端，当转录时可由宿主细胞识别，作为将聚腺苷残基添加到转录的mRNA上的信号的序列。在所选择的宿主细胞中起作用的任何聚腺苷酸化序列都可用于本发明。

对于丝状真菌宿主细胞优选的聚腺苷酸化序列获自米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶、和黑曲霉α-葡糖苷酶的基因。

Guo和Sherman等，1995，Molecular Cellular Biology 15：5983-5990中描述了对酵母宿主细胞有用的聚腺苷酸化序列。

控制序列还可以是信号肽编码区，它编码连接于多肽的氨基末端并指导编码的多肽进入细胞分泌途径的氨基酸序列。核苷酸序列的编码序列的5′端可天然地包含信号肽编码区，它天然地以符合翻译阅读框的方式与编码分泌多肽的编码区段连接。或者，编码序列的5′端可以包含对编码序列是外来的信号肽编码区。如果编码序列天然不含信号肽编码区，则可能需要外来的信号肽编码区。或者，外来的信号肽编码区可仅仅替换天然信号肽编码区以便增强多肽的分泌。然而，指导表达的多肽进入所选择宿主细胞的分泌途径的任何信号肽编码区均可用于本发明。

对细菌宿主细胞有效的信号肽编码区是获自芽孢杆菌NCIB 11837生麦芽糖淀粉酶、嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶、地衣芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶、地衣芽孢杆菌β-内酰胺酶、嗜热脂肪芽孢杆菌中性蛋白酶类(nprT、nprS、nprM)、和枯草芽孢杆菌的prsA基因的信号肽编码区。Simonen和Palva，1993，Microbiological Reviews 57：109-137中描述了更多的信号肽。

对丝状真菌宿主细胞有效的信号肽编码区是获自米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、Rhizomucor miehei天冬氨酸蛋白酶、Humicola insolens纤维素酶、Humicola insolens内切葡聚糖酶V和Humicola lanuginosa脂肪酶的基因的信号肽编码区。

在一个优选的方面，信号肽编码区域是SEQ ID NO：1的核苷酸1至60，其编码SEQ ID NO：2的氨基酸-48至-29。

对于酵母宿主细胞有用的信号肽获自酿酒酵母α-因子和酿酒酵母转化酶的基因。Romanos等，1992，同上中描述了其它有用的信号肽编码区。

控制序列还可以是前肽(propeptide)编码区，它编码位于多肽氨基末端的氨基酸序列。所得的多肽称为酶原(proenzyme)或多肽原(propolypeptide)(或有时候称作酶原(zymogen))。多肽原一般是没有活性的，且可通过前肽的催化或自催化切割从多肽原转变成成熟有活性的多肽。前肽编码区可从枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprE)、枯草芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT)、酿酒酵母α-因子、Rhizomucor miehei天冬氨酸蛋白酶、和Myceliophthora thermophila漆酶(WO 95/33836)的基因获得。

在一个优选的方面，前肽编码区域是SEQ ID NO：1的核苷酸61至144，其编码SEQ ID NO：2的氨基酸-28至-1。

当信号肽和前肽区都存在于多肽的氨基末端时，前肽区位于与多肽氨基末端相邻的位置，而信号肽区位于与前肽区的氨基末端相邻的位置。

还可能需要加上调节序列以使多肽的表达可以相对于宿主细胞的生长进行调节。调节系统的实例是能响应化学或物理刺激(包括调节化合物的存在)而引起基因表达的开启或关闭。在原核系统中，调节系统包括lac、tac、和trp操纵子系统。在酵母中，可使用ADH2系统或GAL1系统。在丝状真菌中，可使用TAKAα-淀粉酶启动子、黑曲霉葡糖淀粉酶启动子和米曲霉葡糖淀粉酶启动子作为调节序列。调节序列的其它实例是用于基因扩增的那些序列。在真核系统中，这些包括在氨甲喋呤(methotrexate)存在时扩增的二氢叶酸还原酶基因，以及有重金属存在时扩增的金属硫蛋白基因。在这些情况下，编码多肽的核苷酸序列将与调节序列可操作地连接。

表达载体

本发明还涉及包含本发明的多核苷酸、启动子、及转录和翻译终止信号的重组表达载体。可以将本文所述的各种核酸和控制序列连接起来以产生重组表达载体，此重组表达载体可包括一个或多个适宜的限制性位点使得在这些位点可插入或替换编码多肽的核苷酸序列。或者，本发明的核苷酸序列可通过将核苷酸序列或含有该序列的核酸构建体插入适当的表达载体进行表达。构建表达载体时，将编码序列置于载体中以使编码序列与适当的表达控制序列可操作地连接。

重组表达载体可以是能方便地接受重组DNA操作并能引起核苷酸序列表达的任何载体(例如质粒或病毒)。载体的选择一般取决于载体与要引入此载体的宿主细胞之间的相容性。载体可以是线性的或闭合环状的质粒。

载体可以是自主复制载体，即可以染色体外实体的形式存在，其复制独立于染色体复制的载体，例如质粒、染色体外元件、微型染色体、或人工染色体。载体可包含任何用于确保自我复制的手段。或者，载体可以是这样的载体，它在导入宿主细胞后，整合到基因组中并与其整合进入的染色体一起复制。此外，可使用单一载体或质粒，或是一起含有待引入宿主细胞基因组的全部DNA的两种或多种载体或质粒，或者转座子。

本发明载体优选包含一种或多种选择标记，所述选择标记允许人们容易地选择转化的细胞。选择标记是这样的基因，它的产物有助于产生杀生物剂或病毒抗性、重金属抗性、原养型变成营养缺陷型等等。

细菌选择标记的实例是来自枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌的dal基因，或者赋予抗生素抗性诸如氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素或四环素抗性的标记。适于酵母宿主细胞的标记有ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1和URA3。在丝状真菌宿主细胞中使用的选择标记包括但不限于：amdS(乙酰胺酶)、argB(鸟氨酸氨甲酰基转移酶)、bar(膦丝菌素乙酰基转移酶)、hph(潮霉素磷酸转移酶)、niaD(硝酸还原酶)、pyrG(乳清苷-5′-磷酸脱羧酶)、sC(硫酸腺苷酰转移酶(sulfate adenyltransferase))、和trpC(邻氨基苯甲酸合酶)及其等价物。优选用于曲霉属细胞的是构巢曲霉或米曲霉的amdS和pyrG基因以及吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)的bar基因。

本发明的载体优选包含允许载体整合到宿主细胞基因组中或者允许载体在细胞中不依赖于基因组自主复制的元件。

为了整合进入宿主细胞基因组，载体可依赖编码多肽的多核苷酸序列或任何其它载体元件通过同源或非同源重组整合到基因组中。或者，载体可包含附加的核苷酸序列用于指导通过同源重组在染色体中的特定位置整合进入宿主细胞基因组中。为了提高在特定位置整合的可能性，整合元件应优选包含足够数目的与相应目标序列具有高度同一性的核酸，诸如100-10,000个碱基对、优选400-10,000个碱基对、且最优选800-10,000个碱基对，从而提高同源重组的几率。整合元件可以是与宿主细胞基因组中的目标序列同源的任何序列。此外，整合元件可以是非编码或编码的核苷酸序列。另一方面，载体可通过非同源重组整合到宿主细胞的基因组中。

为了自主复制，载体还可包含能使载体在所述宿主细胞中自主复制的复制起点。复制起点可以是在细胞中起作用的调节自主复制的任何质粒复制子(replicator)。术语“复制起点”或“质粒复制子”在本文中定义为能使质粒或载体在体内复制的核苷酸序列。

细菌复制起点的实例是允许在大肠杆菌中复制的质粒pBR322、pUC19、pACYC177和pACYC184的复制起点，以及允许在芽孢杆菌中复制的pUB110、pE194、pTA1060和pAMβ1的复制起点。

用于酵母宿主细胞的复制起点的实例是2μm复制起点、ARS1、ARS4、ARS1和CEN3的组合、及ARS4和CEN6的组合。

可用于丝状真菌细胞的复制起点的实例有AMA1和ANS1(Gems等，1991，Gene 98：61-67；Cullen等，1987，Nucleic Acids Research 15：9163-9175；WO 00/24883)。AMA1基因的分离和包含该基因的质粒或载体的构建可根据WO 00/24883中所公开的方法来完成。

可将本发明多核苷酸的一个以上的拷贝插入宿主细胞中以提高基因产物的产量。提高多核苷酸拷贝数可通过下面的手段实现：将序列的至少一个附加拷贝整合进宿主细胞基因组中；或使多核苷酸中包含可扩增的选择标记基因，并在合适的选择剂存在下培养此细胞，以筛选出包含所述选择标记基因的扩增拷贝-因此也包含所述多核苷酸的更多拷贝-的细胞。

用于连接上述元件以构建本发明重组表达载体的程序是本领域技术人员所熟知的(例如参见Sambrook等，1989，同上)。

宿主细胞

本发明还涉及包含本发明多核苷酸的重组宿主细胞，它们可有利地用于多肽的重组生产。可将包含本发明多核苷酸的载体引入宿主细胞以使载体保持为染色体的整合体或作为自主复制的染色体外载体，如前所述。术语“宿主细胞”包括所有那些由于在复制期间发生的突变而相异于亲本细胞的亲本细胞的后代。宿主细胞的选择在很大程度上依赖于编码多肽的基因和它的来源。

宿主细胞可以是单细胞微生物，例如原核生物，或非单细胞微生物，例如真核生物。

有用的单细胞微生物是细菌细胞，诸如革兰氏阳性细菌，包括但不限于芽孢杆菌属细胞，例如嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、Bacillus clausii、凝结芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、和苏云金芽孢杆菌；或链霉菌属细胞，例如浅青紫链霉菌和鼠灰链霉菌，或者革兰氏阴性细菌，诸如大肠杆菌和某种假单胞菌。在一个优选的方面，细菌宿主细胞是迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、或枯草杆菌细胞。在另一个优选的方面，芽孢杆菌属细胞是嗜碱的芽孢杆菌。

将载体导入细菌宿主细胞可通过例如原生质体转化(参见例如Chang和Cohen，1979，Molecular General Genetics 168：111-115)、使用感受态细胞(参见例如Young和Spizizen，1961，Journal of Bacteriology 81：823-829；或Dubnau和Davidoff-Abelson，1971，Journal of Molecular Biology 56：209-221)、电穿孔(参见例如Shigekawa和Dower，1988，Biotechniques 6：742-751)、或接合(参见例如Koehler和Thorne，1987，Journal of Bacteriology169：5771-5278)来实现。

宿主细胞还可以是真核细胞，如哺乳动物、昆虫、植物或真菌细胞。

在一个优选的方面，宿主细胞是真菌细胞。“真菌”在用于本文时包括子囊菌门(Acomycota)、担子菌门(Basidiomycota)、壶菌门(Chytridiomycota)、和接合菌门(Zygomycota)(如Hawksworth等，在《Ainsworth and Bisby’sDictionary of The Fungi》，第八版，1995，CAB International，University Press，Cambridge，UK中所定义的)，以及卵菌门(Oomycota)(如Hawksworth等，1995，同上第171页中所引用的)和所有有丝分裂孢子真菌(mitosporic fungi)(Hawksworth等，1995，同上)。

在一个更优选的方面，真菌宿主细胞是酵母细胞。“酵母”在用于本文时包括产子囊酵母(内孢霉目Endomycetales)、产担孢子酵母、和属于半知菌类的酵母(芽孢纲Blastomycetes)。由于酵母的分类今后还会变化，对于本发明来说，酵母应该是如在《Biology and Activities of Yeast》(Skinner，F.A.、Passmore，S.M.和Davenport，R.R.编，Soc.App.Bacteriol.Symposium SeriesNo.9，1980)中所定义的。

在一个更优选的方面，酵母宿主细胞是假丝酵母属、汉逊酵母属(Hansenula)、克鲁维酵母属、毕赤酵母属、酵母属、裂殖酵母属、或Yarrowia属细胞。

在一个最优选的方面，酵母宿主细胞是卡尔酵母、酿酒酵母、糖化酵母、Saccharomyces douglasii、克鲁弗酵母、诺地酵母、或卵形酵母细胞。在另一个最优选的方面，酵母宿主细胞是乳克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)细胞。在另一个最优选的方面，酵母宿主细胞是Yarrowia lipolytica细胞。

在另一个更优选的方面，真菌宿主细胞是丝状真菌细胞。“丝状真菌”包括真菌门(Eumycota)和卵菌门亚门的所有丝状体(如Hawksworth等人，1995，同上中所定义的)。丝状真菌通常是以由壳多糖、纤维素、葡聚糖、壳聚糖、甘露聚糖、及其他复合多糖组成的菌丝壁为特征。营养生长是通过菌丝伸长，碳代谢是专性需氧的。相反，酵母诸如酿酒酵母的营养生长是通过单细胞菌体的出芽，而碳代谢可以是发酵性的。

在一个更优选的方面，丝状真菌宿主细胞是枝顶孢属、曲霉属、短柄霉属、烟管菌属(Bjerkandera)、Ceriporiopsis属、鬼伞属(Coprinus)、革盖菌属(Coriolus)、隐球酵母属、Filibasidium属、镰孢属、腐质霉属、Magnaporthe属、毛霉属、毁丝霉属、Neocallimastix属、脉孢霉属、拟青霉属、青霉属、Phanerochaete属、射脉菌属(Phlebia)、Piromyces属、侧耳属(Pleurotus)、裂褶菌属、踝节菌属、嗜热子囊菌属、梭孢壳属、Tolypocladium属、栓菌属(Trametes)、或木霉属的细胞。

在一个最优选的方面，丝状真菌宿主细胞是泡盛曲霉、烟曲霉、臭曲霉、日本曲霉、构巢曲霉、黑曲霉、或米曲霉细胞。在另一个最优选的方面，丝状真菌宿主细胞是杆孢状镰孢、Fusarium cerealis、Fusariumcrookwellense、大刀镰孢、禾本科镰孢、禾赤镰孢、异孢镰孢、合欢木镰孢、尖镰孢、多枝镰孢、粉红镰孢、接骨木镰孢、肤色镰孢、拟分枝孢镰孢、Fusarium sulphureum、Fusarium torulosum、Fusarium trichothecioides、或Fusarium venenatum细胞。在另一个最优选的方面，丝状真菌宿主细胞是无烟管菌(Bjerkandera adusta)、Ceriporiopsis aneirina、Ceriporiopsis caregiea、Ceriporiopsis gilvescens、Ceriporiopsis pannocinta、Ceriporiopsis rivulosa、Ceriporiopsis subrufa、Ceriporiopsis subvermispora、灰色鬼伞、毛革盖菌(Coriolus hirsutus)、Humicola insolens、Humicola lanuginosa、曼赫毛霉、Myceliophthora thermophila、粗糙脉孢菌、产紫青霉、Phanerochaetechrysosporium、辐射射脉菌(Phlebia radiata)、Pleurotus eryngii、土生梭孢壳(Thilavia terrestris)、长绒毛栓菌(Trametes villosa)、Trametes versicolor、哈茨木霉、康宁木霉、Trichoderma longibrachiatum、Trichoderma reesei、或绿色木霉细胞。

真菌细胞可以本身已知的方式，通过涉及原生质体形成、原生质体转化、和细胞壁再生的过程进行转化。EP 238,023和Yelton等，1984，Proceedings of the National Academy of Sciences USA 81：1470-1474中描述了适合曲霉属和木霉属宿主细胞转化的方法。Malardier等，1989，Gene 78：147-159和WO96/00787中描述了适合转化镰孢属物种的方法。可利用Becker和Guarente在Abelson，J.N.和Simon，M.I.编的Guide to Yeast Geneticsand Molecular Biology，Methods in Enzymology，Vol.194，pp 182-187，Academic Press.Inc.，New York；Ito等，1983，Journal of Bacteriology 153：163；及Hinnen等，1978，Proceedings of the National Academy of Sciences USA75：1920中所描述的方法转化酵母。

产生方法

本发明还涉及产生本发明多肽的方法，包括：(a)在有助于产生所述多肽的条件下培养细胞，所述细胞的野生型形式能够产生多肽；并(b)回收所述多肽。优选地，该细胞为散囊菌属，且更优选为阿姆斯特丹散囊菌。

本发明还涉及产生本发明多肽的方法，包括：(a)在有助于产生所述多肽的条件下培养宿主细胞；并(b)回收所述多肽。

本发明还涉及产生本发明多肽的方法，其包括(a)在有助于产生该多肽的条件下培养宿主细胞，其中该宿主细胞包括突变核苷酸序列，其在SEQ IDNO：1的成熟多肽编码区域中至少具有一个突变，其中该突变核苷酸序列编码由SEQ ID NO：2的氨基酸1至42组成的多肽，以及(b)回收该多肽。

在本发明的产生方法中，利用本领域众所周知的方法在适于产生所述多肽的营养培养基中培养细胞。例如，细胞培养可在实验室或工业发酵罐中在适当的培养基中和允许所述多肽被表达和/或分离的条件下，通过摇瓶培养、小规模或大规模发酵(包括连续、分批的、补料-分批、或固态发酵)来进行。培养可使用本领域已知的程序在含有碳源、氮源以及无机盐的合适营养培养基中进行。适宜的培养基可从商业供应商获得，或者可根据已公开的配方来制备(例如美国典型培养物保藏中心的目录中公开的)。如果多肽分泌到营养培养基中，那么可直接从培养基回收多肽。如果多肽不分泌到培养基中，其可从细胞裂解物回收。

所述多肽可以通过本领域已知的对多肽特异性的方法来检测。这些检测方法可包括特异性抗体的使用。例如，可使用如本文所述的抗微生物活性测定来确定所述多肽的活性。

所得多肽可通过本领域已知的方法回收。例如，所述多肽可通过常规程序从营养培养基中回收，所述程序包括但不限于：离心、过滤、萃取、喷雾干燥、蒸发或沉淀。

本发明的多肽可通过本领域已知的多种程序纯化，包括但不限于下述程序：层析(例如离子交换、亲和、疏水、层析聚焦和大小排阻)、电泳(例如制备性等电聚焦)、差异溶解度(例如硫酸铵沉淀)、SDS-PAGE、或萃取(例如参见《Protein Purification》，J.-C.Janson和Lars Ryden编，VCH Publishers，New York，1989)，以获得基本上纯的多肽。

植物

本发明还涉及转基因植物、植物部分、或植物细胞，其已被编码本发明的具有抗微生物活性的多肽的核苷酸序列转化，从而表达与产生可回收的量的该多肽。所述多肽可从植物或植物部分回收。或者，将含有重组多肽的植物或植物部分本身用于改善食物或饲料的质量，例如提高营养价值、可口性(palatability)和流变性质、或破坏抗营养因子(antinutritive factor)。

转基因植物可以是双子叶的(双子叶植物)或单子叶的(单子叶植物)。单子叶植物的实例有禾草(grasses)，例如草地草(meadow grass)(蓝草(bluegrass)，早熟禾属(Poa))；草料草(forage grass)，诸如羊矛属(Festuca)、黑麦草属(Lolium)；温带草(temperate grass)，例如剪股颖属(Agrostis)；和谷类(cereals)，例如小麦(wheat)、燕麦(oat)、黑麦(rye)、大麦(barley)、稻(rice)、高粱(sorghum)、和玉蜀黍(maize)(玉米(corn))。

双子叶植物的例子有：烟草；豆类(legumes)，例如羽扇豆(lupins)；马铃薯；甜菜；豌豆；菜豆(bean)和大豆，和十字花科(Brassicaceae)植物，例如花椰菜(cauliflower)、油菜籽(rape seed)和与之亲缘关系紧密的模式生物拟南芥(Arabidopsis thaliana)。

植物部分的实例有茎、愈伤组织、叶、根、果实、种子、和块茎，以及构成这些部分的单独组织，例如表皮、叶肉、薄壁组织、维管组织、分生组织。特殊的植物细胞区室(compartments)，诸如叶绿体、质外体、线粒体、液泡、过氧化物酶体和细胞质也认为是植物部分。此外，任何植物细胞，无论什么组织来源，也认为是植物部分。类似的，植物部分，诸如被分离用来帮助本发明的应用的特定组织和细胞也认为是植物部分，例如胚、胚乳、糊粉和种皮。

这些植物、植物部分和植物细胞的后代也被包括在本发明的范围之内。

可根据本领域已知的方法构建表达本发明多肽的转基因植物或植物细胞。简而言之，植物或植物细胞的构建可通过：将一种或多种编码本发明多肽的表达构建体整合到植物宿主基因组或叶绿体基因组中，并使所得的修饰植物或植物细胞增殖形成转基因植物或植物细胞。

所述表达构建体合适地为核酸构建体，其包含编码本发明多肽、且可操作地与在所选植物或植物部分中表达该核苷酸序列所需的合适调控序列连接的多核苷酸。另外，该表达构建体还可以包括：可用于鉴定已整合所述表达构建体的宿主细胞的选择标记；以及将该构建体导入所述植物所需的DNA序列(后者取决于使用的DNA导入方法)。

调节序列(例如启动子和终止子序列，以及可选的信号或转运(transit)序列)的选择，是根据例如想要在何时、何处、怎样表达该多肽而决定的。例如，编码本发明多肽的基因的表达可以是组成型或诱导型的，或者可为发育特异性、阶段特异性或组织特异性的，而且基因产物可以被靶向于具体的组织或者植物部分例如种子或叶。对调节序列的描述有例如Tague等，1988，Plant Physiology 86：506。

为了组成性表达，可以使用35S-CaMV、玉米泛素1和水稻肌动蛋白启动子(Franck等.，1980.Cell 21：285-294，Christensen AH，Sharrock RA和Quail，1992，Plant Mo.Biol.18：675-689；Zhang W，McElroy D.和Wu R.，1991，PlantCell 3：1155-1165)。器官特异性的启动子可以是，例如，来自存储性贮藏组织(storage sink tissues)例如种子、马铃薯的块茎及果实的启动子(Edwards和Coruzzi，1990，Ann.Rev.Genet.24：275-303)，或者来自代谢性贮藏组织(metabolic sink tissues)，例如分生组织的启动子(Ito等，1994，Plant Mol.Biol.24：863-878)；或者是种子特异性的启动子，例如来自稻的谷蛋白、谷醇溶蛋白、球蛋白或白蛋白启动子(Wu等，1998，Plant and Cell Physiology 39：885-889)，来自蚕豆(Vicia faba)的豆球蛋白B4和未知的种子蛋白基因的蚕豆启动子(Conrad等，1998，Journal of Plant Physiology 152：708-711)，来自一种种子油体(seed oil body)蛋白的启动子(Chen等，1998，Plant and CellPhysiology 39：935-941)，来自欧洲油菜(Brassica napus)的贮存蛋白napA启动子，或任何其他本领域已知的种子特异性的启动子，例如WO 91/14772所描述的。另外，该启动子可以是叶特异性的启动子，例如来自稻或西红柿的rbcs启动子(Kyozuka等，1993，Plant Physiology 102：991-1000)；小球藻病毒腺嘌呤甲基转移酶基因启动子(Mitra和Higgins，1994，Plant MolecularBiology 26：85-93)，或来自稻的aldP基因启动子(Kagaya等，1995，Molecularand General Genetics 248：668-674)；或为创伤诱导性(wound inducible)的启动子，例如马铃薯pin2启动子(Xu等，1993，Plant Molecular Biology 22：573-588)。类似地，该启动子也可以被非生物性的处理例如温度、干旱或盐度变化所诱导，或者被外加的活化启动子的物质，例如乙醇、雌激素、植物激素如乙烯、脱落酸和赤霉酸、及重金属所诱导。

还可使用启动子增强子元件以实现本发明多肽在植物中的更高表达。例如，启动子增强子元件可以是位于启动子和编码本发明多肽的核苷酸序列之间的内含子。例如Xu等人，1993，同上中公开了利用水稻肌动蛋白1基因的第一个内含子来增强表达。

选择标记基因和表达构建体的任何其他部分都可以从本领域可用的那些进行选择。

根据本领域已知的常规技术将核酸构建体整合到植物基因组中，包括土壤杆菌(Agrobacterium)介导的转化、病毒介导的转化、显微注射、粒子轰击、生物射弹转化(biolistic transformation)、和电穿孔(Gasser等人，1990，Science 244：1293；Potrykus，1990，Bio/Technology 8：535；Shimamoto等人，1989，Nature 338：274)。

目前，根瘤土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导的基因转移是产生转基因双子叶植物的首选方法(其综述可参见Hooykas和Schilperoort，1992，Plant Molecular Biology 19：15-38)，而且也可用于转化单子叶植物，尽管这些植物常使用其它转化方法。目前，优选用于产生转基因单子叶植物的方法是粒子轰击(极小金或钨粒子，被用于转化的DNA所包被)胚愈伤组织或发育中的胚(Christou，1992，Plant Journal 2：275-281；Shimamoto，1994，Current Opinion Biotechnology 5：158-162；Vasil等人，1992，Bio/Technology10：667-674)。另外一种可选的转化单子叶植物的方法是基于原生质体转化，如Omirulleh等，1993，Plant Molecular Biology 21：415-428所述。

在转化后，根据本领域熟知的方法选出已整合入表达构建体的转化体，并使其再生成为完整植物。通常设计转化方法以在再生过程或后续的世代中选择性地除去选择基因，例如通过用两个单独的T-DNA构建体共转化，或通过特异性的重组酶位点特异性地切下选择基因。

本发明还涉及产生本发明的多肽的方法，其包括(a)在有益于该多肽产生的条件下培养转基因植物或植物细胞，所述植物或植物细胞包括编码本发明具有抗微生物活性的多肽的多核苷酸；以及(b)回收该多肽。

组合物

本发明还涉及包含本发明多肽的组合物，例如药物组合物。优选地，该组合物添加了这样的多肽。术语“富集”意指该组合物的抗微生物活性已被增加，例如，以富集系数(enrichment factor)1.1增加。

所述组合物还可以包含另一药学活性剂，例如附加的杀生物剂(biocidalagent)，例如另一种显示如上述定义的抗微生物活性的抗微生物多肽。所述杀生物剂可以是本领域所知的抗生素。抗生素的种类包括青霉素类(penicillins)，例如青霉素G，青霉素V，甲氧苯青霉素(methicillin)，苯唑青霉素(oxacillin)，羧苄青霉素(carbenicillin)，乙氧萘青霉素(nafcillin)，氨苄青霉素，等等；青霉素类结合β-内酰胺酶抑制剂，头孢菌素(cephalosporins)，例如头孢克洛，头孢唑啉，头孢呋辛，拉氧头孢等等；碳青霉烯类；单菌霉素(monobactams)；氨基糖苷类；四环素类；大环内酯类；林可霉素类；多粘菌素类；磺胺类；喹诺酮类；氯霉素(cloramphenical)；甲硝哒唑；壮观霉素；trimethoprim；万古霉素等。所述杀生物剂还可以是抗真菌剂(anti-mycotic agent)，包括多烯类化合物，例如两性霉素B，制霉菌素；5-flucosyn；以及唑类，例如咪康唑(miconazol)，酮康唑(ketoconazol)，伊曲康唑和氟康唑(fluconazol)。

在一个实施方式中，杀生物剂是非酶性化学剂。在另一个实施方式中，杀生物剂是非多肽化学剂。

组合物可包括合适的载体材料。组合物还可包括适合的递送媒介物(vehicle)，当该组合物用作药品时，该递送媒介物能够将本发明的抗微生物多肽递送至所需的位置。

多肽组合物可根据本领域已知的方法制备，并可为液体或干燥组合物的形式。例如，多肽组合物可为颗粒(granulate)或微颗粒的形式。要包含在组合物中的多肽可根据本领域已知的方法稳定化。

下面给出了本发明多肽组合物的优选用途的实例。本发明组合物的剂量与使用该组合物的其它条件可基于本领域已知的方法确定。

方法与用途

本发明还涉及使用本发明的具有抗微生物活性的多肽的方法。所述抗微生物多肽通常可以用于任何受到细菌、真菌、酵母或藻类污染的地方。通常，在水系统例如冷却水系统、洗衣漂洗用水，油系统例如切削油(cuttingoils)，润滑剂，油田(oil field)等中有需要杀死微生物或控制微生物生长的地方。但是，本发明还可以用于已知的抗微生物组合物有用的所有用途，例如木材、胶乳(latex)、胶粘剂(adhesive)、胶水类(glue)、纸、纸板、纺织品、皮革、塑料、敛缝材料(caulking)和饲料的保护。

其他的应用包括：食品，饮料，化妆品如洗液(lotions)，乳膏，凝胶(gels)，油膏，肥皂，香波，护发剂(conditiners)，止汗剂(antiperspirants)，除臭剂(deodorants)，漱口剂(mouth wash)，隐形眼镜(contact lens)产品，酶制剂，或食品成分的保存。

因此，本发明的抗微生物多肽可以用作消毒剂(disinfectant)，例如用于治疗眼或口腔中的感染及皮肤感染；用于止汗剂或除臭剂中；用于足浴盐(foot bath salts)中；及用于隐形眼镜和牙齿(口腔护理)的清洁和消毒。

一般认为本发明的抗微生物多肽可用于在任何表面上进行清洁、消毒和抑制微生物生长。可有利地与本发明的抗微生物多肽相接触的表面的实例有例如乳制品厂、化学或药品加工厂、水净化系统、油加工厂、纸浆加工厂、水处理厂和冷却塔中所用的加工设备的表面。本发明的抗微生物多肽的使用量应该能够有效地在所述的表面上进行清洁、消毒或抑制微生物生长。

本发明的抗微生物多肽还用于食品加工厂和任何制备或有食品供应的地方，例如医院，疗养院(nursing home)及餐馆，用来清洁表面和烹饪器皿。

本发明的抗微生物多肽还可在水基涂料中用作防腐剂(preservationagent)或消毒剂。

本发明还涉及本发明的抗微生物多肽或组合物作为药物的用途。另外本发明的抗微生物多肽或组合物还可以用来制造药物，用于控制或抗(combating)微生物，例如真菌类生物或细菌，尤其是革兰氏阳性细菌。

本发明的抗微生物多肽或组合物还可以用作人用或兽医用的抗微生物治疗剂或预防剂。因此，本发明的抗微生物多肽或组合物可以用于制备人用或兽医用的抗微生物治疗剂或预防剂，用于治疗微生物感染，例如细菌或真菌感染，优选革兰氏阳性细菌感染。具体地，所述微生物感染可以与肺病相关，所述肺病包括但不限于结核，肺炎和囊性纤维化病；还可与性转播疾病相关，所述性转播疾病包括但不限于淋病(gonorrhea)和衣原体感染(chlamydia)。

本发明的组合物包括有效量的本发明的抗微生物多肽。

术语“有效量”用于本文中时意在指足以抑制所述微生物生长的本发明抗微生物多肽的量。

本发明还涉及愈合伤口的组合物或产品，例如绷带(bandages)，医疗设备例如导管，还涉及抗头屑(anti-dandruff)的头发用品，例如香波。

本发明的抗微生物多肽的制剂被施用给受到或易受微生物感染的宿主。施用可以是表面、局部或全身性的，这取决于具体的微生物，优选局部施用(localized)。一般而言，本发明的抗微生物多肽的剂量足以使微生物群体减少至少约50％，通常为至少1个对数级，还可能是2个或更多对数级的杀灭。本发明的化合物的施用量可减小微生物群体而同时使任何副作用最小化。本发明人认为，该组合物将在内科医生的指导下获得并用于体内用途。本发明的抗微生物多肽特别有用于杀死革兰氏阴性细菌，包括铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)，和沙眼衣原体(Chlamydiatrachomatis)；及革兰氏阳性细菌，包括链球菌例如肺炎链球菌(S.pneumonia)，乳房链球菌(S.uberis)，猪肠链球菌(S.hyointestinalis)，酿脓链球菌(S.pyogenes)或无乳链球菌(S.agalactiae)；和葡萄球菌例如金黄色葡萄球菌(S.aureus)，表皮葡萄球菌(S.epidermidis)，模仿葡萄球菌(S.simulans)，木糖葡萄球菌(S，xylosus)和肉葡萄球菌(S.carnosus)。

本发明的抗微生物多肽的制剂可以施用给受到或易受微生物性肺感染，例如肺炎的宿主，或受到或易受微生物性伤口感染，例如伤口细菌感染的宿主。

本发明的抗微生物多肽的制剂还可以施用给受到或易受皮肤感染例如痤疮、特应性皮炎(atopic dermatitis)或脂溢性(seborrheic)皮炎的宿主；优选地，该皮肤感染是细菌性皮肤感染，例如由表皮葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、痤疮丙酸杆菌(Propionibacterium acnes)，卵圆糠秕马拉色菌(Pityrosporum ovale)或糠秕马拉色氏菌(Malassezia furfur)引起的感染。

本发明的抗微生物多肽还可以用于体外制剂来杀死微生物，特别是当人们不希望引入大量的常规抗生素的时候。例如，本发明的抗微生物多肽可以添加到动物和/或人的食物制品中；或者它们可以作为体外细胞培养的添加剂加入，用来防止和抑制组织培养物中微生物的过度生长(overgrowth)。

特定微生物对于本发明抗微生物多肽的杀灭作用的敏感性可以通过本文实验部分要详述的体外测试来确定。通常，使微生物培养物和不同浓度的抗微生物多肽结合经过足以使该蛋白起作用的时间，通常为大约1小时到1天。然后计算活微生物的数目并确定杀灭水平。

目标微生物包括但不限于，革兰氏阴性细菌，例如：柠檬酸杆菌属菌种(Citrobacter sp.)；肠杆菌属菌种(Enterobacter sp.)；埃希氏菌属菌种(Escherichia sp.)，例如大肠杆菌；克雷白氏杆菌属菌种(Klebsiella sp.)；摩根氏菌属菌种(Morganella sp.)；变形菌属菌种(Proteus sp.)；普罗威登斯菌属菌种(Providencia sp.)；沙门氏菌属菌种(Salmonella sp.)，例如伤寒沙门氏菌(S.typhi)，鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium)；沙雷氏菌属菌种(Serratia sp.)；志贺氏菌属菌种(Shigella sp.)；假单胞菌属菌种，例如铜绿假单胞菌；耶尔森氏菌属菌种(Yersinia sp.)，例如鼠疫耶尔森氏菌(Y.pestis)，假结核耶尔森氏菌(Y.pseudotuberculosis)，小肠结肠炎耶尔森氏菌(Y.enterocolitica)；弗朗西斯氏菌属菌种(Franciscella sp.)；巴斯德氏菌属菌种(Pasturella sp.)；弧菌属菌种(Vibrio sp.)，例如霍乱弧菌(V.cholerae)，副溶血性弧菌(V.parahemolyticus)；弯曲杆菌属菌种(Campylobacter sp.)，例如空肠弯曲杆菌(C.jejuni)；嗜血杆菌属菌种(Haemophilus sp.)，例如流感嗜血菌(H.influenzae)，杜克氏嗜血杆菌(H.ducreyi)；博德特氏菌属菌种(Bordetella sp.)，例如百日咳博德特氏菌(B.pertussis)，支气管炎博德特氏菌(B.bronchiseptica)，副百日咳博德特氏杆菌(B.parapertussis)；布鲁氏菌属菌种(Brucella sp.)，奈瑟氏球菌属菌种(Neisseria sp.)，例如淋病奈瑟氏球菌(N.gonorrhoeae)，脑膜炎奈瑟氏球菌(N.meningitidis)，等等。其他目标细菌包括Legionella sp.，例如L.pneumophila；利斯特氏菌属菌种(Listeria sp.)，例如单核细胞增生利斯特氏菌(L.monocytogenes)；枝原体属菌种(Mycoplasma sp.)，例如人型枝原体(M.hominis)，肺炎枝原体(M.pneumoniae)；分枝杆菌属菌种(Mycobacterium sp.)，例如结核分枝杆菌(M.tuberculosis)，麻疯分枝杆菌(M.leprae)；密螺旋体属菌种(Treponema sp.)，例如苍白密螺旋体(T.pallidum)；疏螺旋体属(Borreliasp.)，例如布氏疏螺旋体(B.burgdorferi)；Leptospirae sp.；立克次氏体属菌种(Rickettsia sp.)，例如立氏立克次氏体(R.rickettsii)，伤寒型立克次氏体(R.typhi)；衣原体属菌种(Chlamydia sp.)，例如沙眼衣原体，肺炎衣原体(C.pneumoniae)，鹦鹉热衣原体(C.psittaci)；螺杆菌属菌种(Helicobacter sp.)，例如幽门螺杆菌(H.pylori)，等等。

非细菌类的目标病原体包括真菌和原生动物病原体，例如疟原虫属的种(Plasmodia sp.)，例如恶性疟原虫(P.falciparum)；锥虫属的种(Trypanosomasp.)，例如布氏锥虫(T.brucei)；血吸虫(shistosomes)；内阿米巴属的种(Entaemoeba sp.)，隐球菌属的种，假丝酵母属的种，例如白色假丝酵母(C.albicans)；等等。

可以采取多种施用方法。所述多肽制剂可以口服给予，或者可以血管内、皮下和腹膜注射，通过气雾剂施用，眼施用，膀胱内施用，表面施用(topically)等等。例如，通过吸入施用的方法是本领域熟知的。所述治疗性制剂的剂量可以在宽的范围内变化，这取决于要施用的具体的抗微生物多肽、疾病的性质、施用频率、施用方式、宿主对该试剂的清除，等等。开始的剂量可以较大，然后以维持较小的剂量。剂量使用的频率可以低到每周或每两周，也可以分成较小的剂量，每天或每半周使用一次或数次等等，来维持有效的剂量水平。在很多情况下，口服施用比静脉内施用要求更高的剂量。可以修饰酰胺键以及氨基和羧基末端以增加口服时的稳定性。例如，可以将羧基末端酰胺化。

制剂

本发明的化合物可以掺入多种用于治疗性施用的制剂中。更具体地，本发明的化合物可通过与适当的药学上可接受的载体或稀释剂组合配制成药物组合物，还可以制成固体、半固体、液体或气体形式的制品，例如片剂、胶囊剂、粉剂、颗粒剂、软膏剂、乳膏、泡沫、溶液、栓剂、注射剂、吸入剂、凝胶、微球、洗剂和气雾剂(aerosols)。这些化合物本身可以通过多种途径施用，包括口服、含服(buccal)、直肠、胃肠外、腹膜内、皮内、透皮、气管内施用等等。本发明的抗微生物多肽可以在施用后作用于全身，也可以通过使用能在植入部位维持活性剂量的植入物(implant)或其他制剂而作用于局部。

在一个实施方式中，表面使用的制剂包含螯合剂，其可降低二价阳离子(特别是钙和镁)的有效浓度。例如，可以包含柠檬酸盐，EGTA或EDTA，其中优选柠檬酸盐。通常柠檬酸盐的浓度为大约1-10mM。

本发明的化合物可以单独施用，相互组合施用，或者与其它已知的化合物(例如穿孔蛋白，抗炎剂，抗生素等等)组合施用。在药物剂型中，这些化合物可以作为它们的药学上可接受的盐的形式施用。下面所述的方法和赋形剂都仅仅是示例性的而不是限制性的。

对于口服制剂，这些化合物可以单独使用或者与合适的添加剂组合制造片剂、粉剂、颗粒剂或胶囊剂，例如与常规的添加剂如乳糖、甘露醇、玉米淀粉或马铃薯淀粉组合；与粘合剂如结晶纤维素、纤维素衍生物、阿拉伯胶(acacia)、玉米淀粉或明胶组合；与崩解剂(disintegrators)例如玉米淀粉，马铃薯淀粉或羧甲基纤维素钠组合；与润滑剂如云母或硬脂酸镁组合；需要的话，还可以与稀释剂、缓冲剂、润湿剂、防腐剂和调味剂组合。

所述化合物可以通过下列手段制成注射制剂：将所述化合物溶解、悬浮或乳化在水性或非水性的溶剂中，例如植物油或其它类似的油，合成的脂肪族酸甘油酯，高碳脂肪酸(higher aliphatic acids)或丙二醇的酯中；希望的话，可加入常规的添加剂例如增溶剂、等渗剂(isotonic agents)、助悬剂、乳化剂、稳定剂和防腐剂。

所述化合物可以在供吸入给药的气雾制剂中使用。本发明的化合物可以配制到加压的可接受的推进剂(propellant)中，这些推进剂例如二氯二氟甲烷，丙烷，氮气，等等。

所述化合物通过与常规添加剂例如增溶剂、等渗剂、助悬剂、乳化剂、稳定剂和防腐剂配制，可用作洗液，例如用于防止烧伤感染的洗液。

另外，所述化合物可以通过与多种基质(bases)例如乳化基质或水溶性基质混合而制成栓剂。本发明的化合物可以通过栓剂直肠施用。所述栓剂可包含媒介物例如可可脂(cocoa butter)，碳蜡(carbowaxes)和聚乙二醇，它们在体温熔解，在室温固化。

可以提供糖浆、酏剂和混悬剂等口服或直肠施用的单位剂型，其中每个剂量单位(例如每茶匙量、每汤匙量、每片或每栓)含有预定量的组合物，其包含一种或多种本发明化合物。类似地，注射或静脉内施用的单位剂型可以包含组合物中的本发明化合物，其作为无菌水、生理盐水或另一药学上可接受的载体中的溶液。

用于缓释剂型的植入物是本领域熟知的。植入物与生物可降解的或非生物可降解的聚合物配制成微球、板(slab)等。例如，乳酸和/或乙醇酸的聚合物形成易蚀的、被宿主良好耐受的聚合物。含有本发明的抗微生物多肽的植入物被置于感染部位附近，使得活性剂的局部浓度相对于身体的其它部分升高。

本文中使用的术语“单位剂型”是指适合作用单位剂量用于人和动物受试者的物理上离散的单位，每个单位包含预定量的本发明的化合物，该化合物的量根据计算足以产生所希望的作用；还包含与该化合物结合的药学上可接受的稀释剂、载体和媒介物。本发明的单位剂型的规格取决于所用的具体化合物和要实现的作用，及该化合物在宿主中的相关药物动力学。

所述药学上可接受的赋形剂，例如媒介物、佐剂、载体或稀释剂，是公众容易获得的。另外，药学上可接受的辅助物质，例如pH调节和缓冲剂、渗透压调节剂、稳定剂、湿润剂等等，是公众容易获得的。

用于全身施用的通常剂量为每次施用0.1pg到100毫克每千克受试者体重。典型的剂量可以是每天2至6次，每次一片，或者每天一次，每次一颗/片缓释(time release)胶囊或片，其中该缓释胶囊或片含有按比例提高的活性成分。该缓释作用可以通过下列手段实现：在不同的pH值下溶解的胶囊材料，通过渗透压缓慢释放的胶囊，或者其他任何已知的控释手段。

技术人员容易理解，剂量水平可能作为特定化合物、症状的严重性、以及受试者对副作用的敏感性的函数而变化。一些特定的化合物比其他化合物效力更强。对于给定的化合物，本领域的技术人员可以容易地使用多种手段确定其优选剂量。一种优选的手段是测量给定的化合物的生理效能。

一种感兴趣的方法是用脂质体作递送媒介物。脂质体与目标部位的细胞融合并将内腔中的内容物递送到胞内。使用多种保持接触的手段，如分离，结合剂等等，使脂质体与细胞维持足以融合的时间的接触。在本发明的一个方面中，脂质体设计为供雾化(aerosolized)以便肺部施用。脂质体可以使用纯化的、可介导膜融合的蛋白或肽，例如仙台病毒(Sendai virus)或流感病毒(influenza)等来制备。所述脂类可以是已知形成脂质体的脂类(包括阳离子或两性离子脂类例如磷脂酰胆碱)的任何有用的组合。其余的脂类通常是中性或酸性的脂类，例如胆固醇，磷脂酰丝氨酸，磷脂酰甘油，等等。

可以用Kato等人，(1991)J.Biol.Chem .266：3361所述的方法来制备脂质体。简单地说，将脂类和含有肽的内腔(lumen)组合物在合适的水性介质(方便地为盐水介质)中合并，其中总固形物为大约1-10重量％。短时间(约5-60秒)剧烈搅拌后，将管置于约25-40℃的温水浴中，如此循环约5-10次。然后将该组合物超声处理适当的时间，一般为约1-10秒，还可以通过涡旋混合来进一步搅拌。然后加入水性介质来扩大体积，一般将体积增加至约1-2倍，再进行振荡和冷却。该方法使得高分子量的分子得以掺入到内腔中。

与其他活性剂的制剂

为了用于本发明主题的方法，本发明的抗微生物多肽可以与其它药学活性剂，特别是其他的抗微生物剂一起配制。其它感兴趣的作用剂包括如本领域已知的多种抗生素。抗生物的类别包括青霉素类(penicillins)，例如青霉素G，青霉素V，甲氧苯青霉素，苯唑青霉素，羧苄青霉素，乙氧萘青霉素，氨苄青霉素，等等；青霉素类与β-内酰胺酶抑制剂的组合，头孢菌素，例如头孢克洛，头孢唑啉，头孢呋辛，拉氧头孢等等；碳青霉烯类；单菌霉素；氨基糖苷类；四环素类；大环内酯类；林可霉素类；多粘菌素类；磺胺类；喹诺酮类；氯霉素；甲硝哒唑；壮观霉素；trimethoprim；万古霉素等。

抗真菌剂也是有用的，包括多烯类化合物，例如两性霉素B，制霉菌素；5-flucosyn；以及唑类，例如咪康唑，酮康唑，伊曲康唑和氟康唑。抗结核药包括异烟肼、乙胺丁醇、链霉素和利福平。本发明的抗微生物多肽的制剂中还可包含细胞因子，例如干扰素γ、肿瘤坏死因子α、白介素12等。

体外合成

本发明的抗微生物肽可以用本领域已知的常规技术通过体外合成来制备。可以商购的合成设备有很多，例如Applied Biosystems Inc.，Beckman提供的自动合成仪等等。使用合成仪可以将天然氨基酸置换为非天然氨基酸，尤其是D-异构体(或D-型)例如D-丙氨酸和D-异亮氨酸、非对映异构体、具有不同长度或官能性(functionalities)的侧链等等。具体的序列和制备方式将根据方便性、经济性、所需的纯度等等而定。

可以为包含合适官能性的多种肽或蛋白质提供化学连接，所述成键官能团的例子有：氨基，用于酰胺或取代的胺的形成，例如还原性氨化；硫醇基，用于硫醚或二硫键的形成；羧基，用于酰胺的形成，等等。

需要的话，在合成或者表达过程中可以向肽中引入多种可供连接于其他分子或表面的基团。这样，半胱氨酸可用来形成硫醚，组氨酸用来与金属离子络合物(complex)连接，羧基用来形成酰胺或酯，氨基用来形成酰胺，等等。

还可以依照常规的重组合成方法来分离和纯化所述多肽。可以制备表达宿主的裂解物，再利用HPLC、排阻色谱、凝胶电泳、亲和色谱(affinitychromatography)或其它纯合技术来纯化该裂解物。大多数情况下，所使用的组合物可包括至少20重量％的所希望的产物，更通常为至少约75重量％，优选至少约95重量％，对于治疗目的，通常至少约99.5重量％，相对于与该产物的制备和纯化方法相关的污染物。上述百分数通常基于总蛋白。

动物饲料

本发明还涉及在动物饲料中使用所述具有抗微生物活性的多肽的方法，以及包含本发明抗微生物多肽的饲料组合物和饲料添加剂。

术语“动物”包含所有的动物，包括人类。动物的例子有非反刍类动物，和反刍类动物如牛、绵羊和马。在一个具体的实施方案中，所述动物是非反刍类动物。非反刍类动物包括单胃动物，例如猪(pigs)或猪(swine)(包括但不限于仔猪、生长期猪和大母猪(sow))；禽类例如火鸡和鸡(包括但不限于肉仔鸡(broiler chick)，产蛋鸡(layers))；年幼的小牛；和鱼类(包括但不限于鲑鱼)

术语“饲料”或“饲料组合物”指适于被动物摄取或意欲供动物摄取的任何化合物、制备物、混合物或组合物。

在根据本发明的用途中，所述抗微生物多肽可以在进食之前、之后或同时饲喂给动物。优选后者。

在一个特定的实施方案中，当所述抗微生物多肽被添加到饲料中或被包含在饲料添加剂中时，它是明确定义的。“明确定义”(well-defined)是指该抗微生物多肽制备物由大小排阻层析(size exclusion chromatography)测得为至少50％纯(参考WO01/58275的实施例12)。在其他的具体实施方案中，如该方法所测定的，微生物多肽制备物为至少60，70，80，85，88，90，92，94，或至少95％纯。

明确定义的抗微生物多肽制备物是有利的。例如，对于基本上不含其他干扰性或污染性的抗微生物多肽的抗微生物多肽，将其正确地按剂量施用于饲料要容易得多。术语“正确地按剂量施用”(dose correctly)具体是指获得一致和恒定结果的目标，和根据所需效果来最优化剂量的能力。

但是用于动物饲料时，该抗微生物多肽并不需要那么纯；它可以，例如，包含其他的酶，在这种情况下它可以称为抗微生物多肽制备物。

该抗微生物多肽制备物可以(a)直接加入饲料中(或直接用于植物蛋白的处理工艺中)，或(b)用于生产一种或多种中间性组合物，例如随后被加入饲料(或用于处理工艺中)的饲料添加剂或预混物。上面所述的纯度是指原来的抗微生物多肽制备物的纯度，无论其是按照以上(a)或(b)使用。

具有该数量级的纯度的抗微生物多肽制备物尤其可以使用重组生产方法得到，但当使用常规的发酵方法来生产所述抗微生物多肽时，它们不那么容易获得，并且批次间的变差要高得多。

当然，这样的抗微生物多肽制备物可与其他的酶混合。

术语“植物蛋白”(vegetable proteins)在本文中用于指包含至少一种衍生自或源自植物的蛋白，包括修饰蛋白和蛋白衍生物的任何化合物、组合物、制备物或混合物。在具体的实施方案中，植物蛋白的蛋白含量为至少10，20，30，40，50，或60％(w/w)。

植物蛋白可以来自植物蛋白源，例如豆类和谷物，如来自豆科(Fabaceae(Leguminosae))、十字花科(Cruciferaceae)、藜科(Chenopodiaceae)和禾本科(Poaceae)等科的植物的材料，如大豆粕(soy bean meal)、羽扇豆粕(lupin meal)和油菜籽粕(rapeseed meal)。

在一个具体的实施方案中，植物蛋白源是来自豆科的一种或多种植物例如大豆、羽扇豆、豌豆或菜豆(bean)的材料。

在另一个具体的实施方案中，植物蛋白源是来自藜科的一种或多种植物例如甜菜(beet)、糖用甜菜(sugar beet)、菠菜或昆诺阿藜(quinoa)的材料。

植物蛋白源的其他例子有油菜籽和甘蓝。

大豆是优选的植物蛋白源。

植物蛋白源的其他例子有谷物，例如大麦、小麦、黑麦、燕麦、玉蜀黍/玉米(maize/corn)、水稻和高粱。

抗微生物多肽可以作为任何形式加入饲料，或者作为相对纯的抗微生物多肽，或者与其他供加入该动物饲料的组分掺合，即以动物饲料添加剂的形式，例如所谓的动物饲料用预混物(pre-mix)。

在进一步的一个方面，本发明涉及组合物，其用于动物饲料，例如动物饲料，和动物饲料添加剂，例如预混物。

除了本发明的抗微生物多肽，本发明的动物饲料添加剂含有至少一种脂溶性维生素，和/或至少一种水溶性维生素，和/或至少一种痕量矿物质，和/或至少一种大量矿物质(macro mineral)。

另外，任选的饲料添加剂成分包括着色剂(coloring agents)、香味化合物(aroma compounds)、稳定剂，和/或至少一种选自下列的其它酶：肌醇六磷酸酶EC 3.1.3.8或3.1.3.26；木聚糖酶EC 3.2.1.8；半乳聚糖酶EC 3.2.1.89；和/或β-葡聚糖酶EC 3.2.1.4。

在一个具体的实施方式中，所述其他酶是明确定义的(如上述用于抗微生物多肽制备物的定义)。

其他抗微生物肽(AMP’s)的例子有CAP18、Leucocin A、Tritrpticin、Protegrin-1、Thanatin、Defensin、Ovispirin例如Novispirin(Robert Lehrer，2000)、及它们的保留抗微生物活性的变体或片段。

其他抗真菌多肽(AFP’s)的例子有巨大曲霉(Aspergillus giganteus)和黑曲霉的肽，及它们的保留抗真菌活性的变体和片段，如WO 94/01459和WO02/090384所公开的。

通常，脂溶性和水溶性维生素以及痕量矿物质构成要加入饲料的所谓“预混物”的一部分，而通常将大量矿物质单独加入该饲料。这些组合类型中的任一种当添加了本发明的抗微生物多肽时，就是本发明的动物饲料添加剂。

在一个具体的实施方案中，本发明的动物饲料添加剂要以0.01-10.0％，更具体为0.05-5.0％，或0.2-1.0％(％表示g添加剂每100g饲料)的水平被包含在(或者根据配方必须包含在)动物饮食或饲料中。对于预混物尤其如此。

下面列出了这样的组分的非排他性示例：

脂溶性维生素的例子有维生素A、维生素D3、维生素E、和维生素K，例如维生素K3。

水溶性维生素的例子有维生素B12、生物素和胆碱、维生素B1、维生素B2、维生素B6、烟酸、叶酸和泛酸盐(或酯)(panthothenate)，例如D-泛酸钙。

痕量矿物质的例子有锰、锌、铁、铜、碘、硒和钴。

大量矿物质的例子有钙、磷和钠。WO 01/58275的表A列出了这些组分的营养需求(以家禽和猪/仔猪为例)。营养需求(nutritional requirement)是指这些组分必须以所指明的浓度在饮食中提供。

或者，本发明的动物饲料添加剂包含WO 01/58275的表A所列的单个组分中的至少一种。“至少一种”指组分中的任一种，一种或多种，一种，或两种，或三种，或四种，如此往上直至全部13种，或全部15种单个组分。更具体地，该至少一种单个组分以这样的量被包含在本发明的添加剂中，以提供表A的第4列，或第5列，或第6列所示的范围之内的饲料中浓度(in-feed concentration)。

本发明还涉及动物饲料组合物，动物饲料组合物或饮食具有较高的蛋白质含量。家禽和猪的饮食可以如WO 01/58275的表B、列2-3来描述。鱼类的饮食可以如表B的第4列来描述。另外该鱼类饮食通常具有200-310g/kg的粗脂肪含量。

根据本发明的动物饲料组合物具有50-800g/kg的粗蛋白含量，还包含至少一种如本申请所要求保护的抗微生物多肽。

并且，或者作为(上述粗蛋白含量的)替代，本发明的动物饲料组合物具有10-30MJ/kg的可代谢能量(metabolizable energy)含量；和/或0.1-200g/kg的钙含量；和/或0.1-200g/kg的有效磷(available phosphorus)含量；和/或0.1-100g/kg的甲硫氨酸含量，和/或0.1-150g/kg的甲硫氨酸加半胱氨酸含量；和/或0.5-50g/kg的赖氨酸含量。

在具体的实施方案中，所述可代谢能量、粗蛋白、钙、磷、甲硫氨酸、甲硫氨酸加半胱氨酸和/或赖氨酸含量在WO 01/58275的表B的范围2、3、4或5(2-5行)的任一范围内。

粗蛋白是用氮(N)乘以因数6.25来计算的，即，粗蛋白(g/kg)＝N(g/kg)×6.25。氮含量是用凯氏(Kjeldahl)定氮法(A.O.A.C.，1984，Official Methods ofAnalysis 14th ed.，Association of Official Analytical Chemists，Washington DC)测定的。

可代谢能量可以根据下列文献来计算：国家研究委员会(NRC)的出版物Nutrient requirements in swine，第九次修订版，1988，subcommittee onswine nutrition，committee on animal nutrition，board of agriculture，nationalresearch council.National Academy Press，Washington，D.C.，pp.2-6；和European Table of Energy Values for Poultry Feed-stuffs，Spelderholt centre forpoultry research and extension，7361 DA Beekbergen，The Netherlands.Grafischbedrijf Ponsen & looijen bv，Wageningen.ISBN 90-71463-12-5。

钙、有效磷和氨基酸在完全动物饮食中氨基酸的饮食含量根据例如Veevoedertabel 1997，gegevens over chemische samenstelling，verteerbaarheiden voederwaarde van voedermiddelen，Central Veevoederbureau，Runderweg 6，8219 pk Lelystad.ISBN 90-72839-13-7等饲料表来计算。

在一个具体的实施方案中，本发明的动物饲料组合物含有至少一种如上面定义的植物蛋白或蛋白源。

在进一步的具体实施方案中，本发明的动物饲料组合物含有0-80％的玉米；和/或0-80％的高粱；和/或0-70％的小麦；和/或0-70％的大麦；和/或0-30％的燕麦；和/或0-40％的大豆粕(soybean meal)；和/或0-10％的鱼粉；和/或0-20％的乳清。动物饮食可以例如制成粉状(mash)饲料(非颗粒的)或颗粒饲料。通常，将粉碎的饲料原料混合，并根据所述物种所用的规格加入足够量的必需维生素和矿物质。酶可以作为固体或液体酶制剂加入。例如，固体酶制剂通常在混合步骤前或期间加入；而液体酶制备物通常在造粒步骤之后加入。酶还可以掺入饲料添加剂或预混物。

饮食中的酶终浓度为0.01-200mg酶蛋白每kg饮食，例如为5-30mg酶蛋白每kg动物饮食。

所述抗微生物多肽可以以下列量施用(剂量范围)：0.01-200；或0.01-100；或0.05-100；或0.05-50；或0.10-10-上述范围都是指mg抗微生物多肽蛋白每kg饲料(ppm)。

如下测定mg抗微生物多肽蛋白每kg饲料：从饲料组合物中纯化出抗微生物多肽，再使用相关的测定方法(见抗微生物活性、底物和测定方法条目下)确定纯化的抗微生物多肽的比活性(specific activity)。使用同样的测定方法确定所述饲料组合物的抗微生物活性，根据这两个测定，计算以mg抗微生物多肽蛋白每kg饲料表示的剂量。

同样的原则也可以用于确定饲料添加剂中的mg抗微生物多肽蛋白质。当然，如果可以获得制备所述饲料添加剂或饲料所用的抗微生物多肽的样品，就由此样品确定比活性(不需要从饲料组合物或添加剂中纯化该抗微生物多肽)。

信号肽与前肽

本发明还涉及核酸构建体，其包括编码蛋白质的基因，该基因可操作地连接至以下两者之一或两者：由SEQ ID NO：1的核苷酸1至60组成的第一核苷酸序列，其编码由SEQ ID NO：2的氨基酸-48至-29组成的信号肽；以及由SEQ ID NO：1的核苷酸61至144组成的第二核苷酸序列，其编码由SEQ ID NO：2的氨基酸-28至-1组成的前肽，其中该基因对第一与第二核苷酸序列是外来的。

本发明还涉及重组表达载体与重组宿主细胞，其包括这样的核酸构建体。

本发明还涉及用于产生蛋白质的方法，其包括(a)在适合产生该蛋白质的条件下培养这样的重组宿主细胞；以及(b)回收该蛋白质。

所述第一与第二核苷酸序列和其它控制序列可以单独地或组合地与外来基因可操作连接。这样的其它控制序列系如上述。如之前所述，当信号肽与前肽区域两者均存在于蛋白质的氨基末端时，前肽区域与蛋白质氨基末端相邻，而信号肽区域与前肽区域氨基末端相邻。

蛋白质对宿主细胞而言可为固有的或异源的。术语“蛋白质”于此并非意指特定长度的编码产物，因此涵盖肽、寡肽和蛋白质。术语“蛋白质”还涵盖结合形成编码产物的两条或多条多肽。蛋白质还包括杂合多肽，其包括从至少两种不同蛋白质获得的部分或完整多肽序列的组合，其中一种或多种蛋白质对宿主细胞可为异源的或固有的。蛋白质进一步包括以上提及的蛋白质与杂合蛋白质的天然存在的等位变体与工程化变化形式。

优选地，所述蛋白质是激素或其变体、酶、受体或其部分、抗体或其部分、或报道分子。在一个更优选的方面，蛋白质是氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂合酶、异构酶、或连接酶。在一个更优选的方面，所述蛋白质是氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维素酶、几丁质酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、变位酶(mutanase)、氧化酶、果胶分解酶(pectinolyticenzyme)、过氧化物酶、肌醇六磷酸酶、多酚氧化酶(polyphenoloxidase)、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶(transglutaminase)或木聚糖酶。

基因可获得自任何原核的、真核的、或其它来源。

通过以下实施例描述进一步本发明，这些实施例不应被理解为限制本发明的范围。

实施例

用作缓冲剂和底物的化学品为至少试剂级的商业产品。在以下实施例中，由SEQ ID NO：2的氨基酸1至42表示的抗微生物多肽称作“Eurocin”。

实施例1

阿姆斯特丹散囊菌的cDNA文库

从已经用马铃薯葡萄糖琼脂(Potato dextrose agar，PDA)培育5天的阿姆斯特丹散囊菌制备cDNA文库。根据标准分子生物学程序来纯化富含PolyA的RNA、合成cDNA并制备文库。关于该一般方法的详细规程可在国际专利申请WO 01/12794的实施例中找到。用于克隆的载体是pMhas5，其由SEQID NO：8所示，且具有以下特征：

特征	位置	描述
			CDS	365-1156	卡那霉素抗性
CDS	2232-2387	β半乳糖苷酶α肽
			-10信号	2189-2192	Shine Dalgarno
启动子	2101-2189	Lac启动子
			杂项特征(misc feature)	626-650	用于BACE系统的KanP1引物

表1.载体pMhas5的特征

实施例2

用于Eurocin的曲霉表达载体的构建

从该cDNA文库(见实施例1)以下述方式扩增编码Eurocin的核苷酸序列：使用1微升cDNA(大约10纳克DNA)作为模板，使用引物A与引物B进行PCR反应。

引物A：TCTTGGATCCACCATGCACTTCACCAAGGTCTCC

(SEQ ID NO：4)

引物B：TCTTCTCGAGTTAGAAAGAACAGGTGCAGGTAGG

(SEQ ID NO：5)

在50微升反应体积中使用10pmole的每种引物。退火温度为摄氏55度，并于摄氏72度延伸1分钟。总共进行35个循环。使用Expand HighFidelity PCR System(Roche)。

利用4％琼脂糖凝胶分离等份的PCR反应物。在大约300bp的大小处见到一清楚的条带。用BamH1与Xho1消化该PCR片段，其在PCR引物所导入的突出(overhang)处切割。分离经消化的片段并将其克隆入经BamH1-Xho1消化的pMT2786，pMT2786是基于质粒pMT2188的曲霉表达质粒，而质粒pMT2188基于pCaHj527(参见国际专利申请WO 02/12472的实施例7；以及WO 00/70064)。所插入的序列被证明编码如上述鉴定的Eurocin序列。PCR片段的序列示为SEQ ID NO：6。

将具有PCR产物插入序列的曲霉表达质粒命名为pMT2935且示为SEQID NO：7。

实施例3

Eurocin在曲霉中的表达

将pMT2935(参见SEQ ID NO：7)转化到米曲霉菌种BECh2(参见国际专利申请WO 00/39322)中。将30个转化体于选择性且非诱导性的条件下在具有蔗糖与乙酰胺的Cove基本培养平板(Cove minimal plate)上再分离(re-isolate)两次。为了测试Eurocin表达，将转化体于摄氏30度在具有10毫升YPM(2％蛋白胨1％、酵母提取物、2％麦芽糖)的试管中培育6天。将上清液在NuPage 10％Bis-Tris SDS凝胶(Invitrogen)上泳动，如生产商所建议，使用MES电泳缓冲液，以允许在低分子量范围内分离。米曲霉转化体即使在被诱导表达Eurocin时仍生长良好。在大多数的转化体中均见到了具有Eurocin预期大小的清楚条带，而在未转化的宿主菌株米曲霉BECh2中未见到此条带。

实施例4

Eurocin的纯化

将发酵液以0.22μm Corning 431118滤器过滤并使用甲酸将pH调整为4.0。在调整pH之后再次通过0.22μm过滤器过滤以去除额外的沉淀物。测量电导，通过加入MQ-水(Millipore)调整至大约10mS cm^-1。然后使用

explorer HPLC仪将滤液加载到12毫升Source 30S(Amersham Biosciences17-1273-01)柱上。上样缓冲液为50mM甲酸，pH4(缓冲液A)。

使用20个柱体积的0-100％缓冲液B的梯度洗脱Eurocin。缓冲液B为50mM甲酸、2M氯化钠，pH4.0。通过MALDI-TOF MS(Voyager DE Proinstrument，Applied Biosystems)检查纯化级分的特征(identity)，并利用SDS-PAGE(Invitrogen，NuPage 12％Bis-Tris/MES，用Gel code Blue StainReagent，Pierce 24592染色)大略地检查纯度。

将包含相关化合物(根据MALDI-TOF MS)的级分合并，并在AmiconUltra 5000 Da MWCO过滤器(Millipore UFC900524)上浓缩。在4000g离心大约30分钟。接着通过使用相同的过滤与离心条件，用0.01％乙酸(acidicacid)洗涤3次，使溶液脱盐。

通过氨基酸分析与MALDI-TOF MS分析产物的正确序列及纯度。所测得的Eurocin质量为4339 Da。其基于SEQ ID NO：2的氨基酸1至42的理论分子量为4338.8 Da(平均)。

储备溶液保存于-20℃。

实施例5

抗微生物活性的评价

在微稀释(microdillution)测定中评价纯化的Eurocin的抗微生物活性。依照来自CLSI(临床与实验室标准学会(Clinical and Laboratory StandardsInstitute)的NCCLS/CLSI指南来测定最小抑制浓度(Mininal InhibitoryConcentration，MIC)。

测试以下浓度的Eurocin：32；16；8；4；2；1；0.50；0.25；0.13；以及0.06μg/ml。

如表2所示，Eurocin对多种ATCC菌株显示强的抗微生物活性。

菌株	MIC(μg/ml)
		金黄色葡萄球菌，ATCC 29213	16
表皮葡萄球菌，ATCC 12228	16
		肉葡萄球菌，ATCC 51365	8
肺炎链球菌，ATCC 49619	0.25
		酿脓链球菌，ATCC 12344	0.13
屎肠球菌(Enterococcus faecium)，ATCC 49624	16
		藤黄微球菌(Micrococcus luteus)，ATCC 9341	0.5

表2.Eurocin的抗微生物活性

实施例6

使用来自PFAM数据库的HMM文件鉴定防卫素

使用隐蔽马尔科夫模型子集(HMM profiles)的序列分析，可以使用广为人知的HMMER免费软件包在互联网在线进行或在本地计算机上进行。目前的版本是HMMER 2.3.2，自2003年10月起。

HMM子集可从广为人知的PFAM数据库获得。目前的版本是PFAM16.0，从2004年11月起。用于所有计算机平台的HMMER与PFAM均可从例如美国华盛顿大学圣路易斯分校医学院(Washington University in St.Louis(USA)，School of Medicine)获得(http://pfam.wustl.edu与http://hmmer.wustl.edu)。

若查询的氨基酸序列或其片段属于以下五个PFAM家族之一，则该氨基酸序列是根据本发明的防卫素：

·防卫素_β或“β防卫素”登录号：PF00711；

·防卫素_propep或“防卫素前肽”登录号：PF00879；

·防卫素_1或“哺乳类防卫素”登录号：PF00323；

·防卫素_2或“节肢动物防卫素”登录号：PF01097；

·γ-硫堇或“γ-硫堇家族”登录号：PF00304。

当在线使用PFAM数据库时，或当本地使用hmmpfam程序(来自HMMER软件包)时，若氨基酸序列产生大于0.1的E值及大于或等于零的分数，根据本发明，其属于PFAM家族。

当使用hmmpfam程序在本地进行序列分析时，需要从PFAM数据库获得(下载)HMM子集。每个家族存在两个子集：用于全局搜索的xxx_ls.hmm，以及用于本地搜索的xxx_fs.hmm(“xxx”为家族的名称)。这使得上述5个家族共有10个子集。

这10个子集可独立地使用，或可连结(添加)成单一档案(使用文本编辑软件-所述子集为ASCII文件)，其可被命名为例如defensin.hmm。然后可使用以下指令行评估查询氨基酸序列：

hmmpfam-E 0.1 defensin.hmm sequence_file

-其中“sequence_file”是带有查询氨基酸序列的文件，所述序列为任何可被HMMER软件包识别的格式。

若所述分数大于或等于零(0.0)，且E值大于0.1，该查询氨基酸序列是根据本发明的防卫素。

PFAM数据库在Bateman等人(2004)“The Pfam Protein FamiliesDatabase”，Nucleic Acid s Research，Vol.32(Database Issue)pp.D138-D141中有更多描述。

序列表

<110>诺维信公司(Novozymes A/S)

<120>抗微生物多肽

<130>10736.204-WO

<160>8

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>273

<212>DNA

<213>阿姆斯特丹散囊菌(Eurotium amstelodami)

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(270)

<220>

<221>信号肽

<222>(1)..(60)

<220>

<221>成熟肽

<222>(145)..(270)

<400>1

atg cac ttc acc aag gtc tcc acc att ctt ttt acc atc ttc gcc gcc       48

Met His Phe Thr Lys Val Ser Thr Ile Leu Phe Thr Ile Phe Ala Ala

            -45                 -40                 -35

ggc atc atg gct gct ccc acc gaa gga gtc cgt gag gaa gcc gcc cct       96

Gly Ile Met Ala Ala Pro Thr Glu Gly Val Arg Glu Glu Ala Ala Pro

        -30                 -25                 -20

ggc cag gag gtt tac ccc gac gaa cct cct gct tct ctg acc aag cgt      144

Gly Gln Glu Val Tyr Pro Asp Glu Pro Pro Ala Ser Leu Thr Lys Arg

    -15                 -10                 -5              -1

ggc ttc gga tgt cct ggt gat gcc tac cag tgc agt gaa cac tgc agg      192

Gly Phe Gly Cys Pro Gly Asp Ala Tyr Gln Cys Ser Glu His Cys Arg

1               5                   10                  15

gcc ctg ggc ggt gga cgc act gga gga tac tgt gct gga cct tgg tat      240

Ala Leu Gly Gly Gly Arg Thr Gly Gly Tyr Cys Ala Gly Pro Trp Tyr

            20                  25                  30

ttg ggt cac cct acc tgc acc tgt tct ttc taa                          273

Leu Gly His Pro Thr Cys Thr Cys Ser Phe

        35                  40

<210>2

<211>90

<212>PRT

<213>阿姆斯特丹散囊菌

<400>2

Met His Phe Thr Lys Val Ser Thr Ile Leu Phe Thr Ile Phe Ala Ala

            -45                 -40                 -35

Gly Ile Met Ala Ala Pro Thr Glu Gly Val Arg Glu Glu Ala Ala Pro

        -30                 -25                 -20

Gly Gln Glu Val Tyr Pro Asp Glu Pro Pro Ala Ser Leu Thr Lys Arg

    -15                 -10                 -5              -1

Gly Phe Gly Cys Pro Gly Asp Ala Tyr Gln Cys Ser Glu His Cys Arg

1               5                   10                  15

Ala Leu Gly Gly Gly Arg Thr Gly Gly Tyr Cys Ala Gly Pro Trp Tyr

            20                  25                  30

Leu Gly His Pro Thr Cys Thr Cys Ser Phe

        35                  40

<210>3

<211>90

<212>PRT

<213>阿姆斯特丹散囊菌

<220>

<221>信号

<222>(1)..(20)

<220>

<221>PROPEP

<222>(21)..(48)

<220>

<221>成熟肽

<222>(49)..(90)

<400>3

Met His Phe Thr Lys Val Ser Thr Ile Leu Phe Thr Ile Phe Ala Ala

            -45                 -40                 -35

Gly Ile Met Ala Ala Pro Thr Glu Gly Val Arg Glu Glu Ala Ala Pro

        -30                 -25                 -20

Gly Gln Glu Val Tyr Pro Asp Glu Pro Pro Ala Ser Leu Thr Lys Arg

    -15                 -10                 -5              -1

Gly Phe Gly Cys Pro Gly Asp Ala Tyr Gln Cys Ser Glu His Cys Arg

1               5                   10                  15

Ala Leu Gly Gly Gly Arg Thr Gly Gly Tyr Cys Ala Gly Pro Trp Tyr

            20                  25                  30

Leu Gly His Pro Thr Cys Thr Cys Ser Phe

        35                  40

<210>4

<211>34

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>引物A

<400>4

tcttggatcc accatgcact tcaccaaggt ctcc                                 34

<210>5

<211>34

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>引物B

<400>5

tcttctcgag ttagaaagaa caggtgcagg tagg                                 34

<210>6

<211>296

<212>DNA

<213>阿姆斯特丹散囊菌

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(296)

<223>PCR片段

<400>6

tcttggatcc accatgcact tcaccaaggt ctccaccatt ctttttacca tcttcgccgc     60

cggcatcatg gctgctccca ccgaaggagt ccgtgaggaa gccgcccctg gccaggaggt    120

ttaccccgac gaacctcctg cttctctgac caagcgtggc ttcggatgtc ctggtgatgc    180

ctaccagtgc agtgaacact gcagggccct gggcggtgga cgcactggag gatactgtgc    240

tggaccttgg tatttgggtc accctacctg cacctgttct ttctaactcg agaaga        296

<210>7

<211>7218

<212>DNA

<213>质粒pMT2935

<400>7

tgtataagct agcttatggt gttttgatca ttttaaattt ttatatggcg ggtggtgggc     60

aactcgcttg cgcgggcaac tcgcttaccg attacgttag ggctgatatt tacgtaaaaa    120

tcgtcaaggg atgcaagacc aaaccgttaa atttccggag tcaacagcat ccaagcccaa    180

gtccttcacg gagaaacccc agcgtccaca tcacgagcga aggaccacct ctaggcatcg    240

gacgcaccat ccaattagaa gcagcaaagc gaaacagccc aagaaaaagg tcggcccgtc    300

ggccttttct gcaacgctga tcacgggcag cgatccaacc aacaccctcc agagtgacta    360

ggggcggaaa tttatcggga ttaatttcca ctcaaccaca aatcacagtc gtccccggta    420

atttaacggc tgcagacggc aatttaacgg cttctgcgaa tcgcttggat tccccgcccc    480

tggccgtaga gcttaaagta tgtcccttgt cgatgcgatg tatgaattca tggtgttttg    540

atcattttaa atttttatat ggcgggtggt gggcaactcg cttgcgcggg caactcgctt    600

accgattacg ttagggctga tatttacgta aaaatcgtca agggatgcaa gaccaaaccg    660

ttaaatttcc ggagtcaaca gcatccaagc ccaagtcctt cacggagaaa ccccagcgtc    720

cacatcacga gcgaaggacc acctctaggc atcggacgca ccatccaatt agaagcagca    780

aagcgaaaca gcccaagaaa aaggtcggcc cgtcggcctt ttctgcaacg ctgatcacgg    840

gcagcgatcc aaccaacacc ctccagagtg actaggggcg gaaatttatc gggattaatt    900

tccactcaac cacaaatcac agtcgtcccc ggtaatttaa cggctgcaga cggcaattta    960

acggcttctg cgaatcgctt ggattccccg cccctggccg tagagcttaa agtatgtccc   1020

ttgtcgatgc gatgtatcac aacatataaa tactggcaag ggatgccatg cttggagttt   1080

ccaactcaat ttacctctat ccacacttct cttccttcct caatcctcta tatacacaac   1140

tggggatcca ccatgcactt caccaaggtc tccaccattc tttttaccat cttcgccgcc   1200

ggcatcatgg ctgctcccac cgaaggagtc cgtgaggaag ccgcccctgg ccaggaggtt   1260

taccccgacg aacctcctgc ttctctgacc aagcgtggct tcggatgtcc tggtgatgcc   1320

taccagtgca gtgaacactg cagggccctg ggcggtggac gcactggagg atactgtgct   1380

ggaccttggt atttgggtca ccctacctgc acctgttctt tctaactcga gatctagagg   1440

gtgactgaca cctggcggta gacaatcaat ccatttcgct atagttaaag gatggggatg   1500

agggcaattg gttatatgat catgtatgta gtgggtgtgc ataatagtag tgaaatggaa   1560

gccaagtcat gtgattgtaa tcgaccgacg gaattgagga tatccggaaa tacagacacc   1620

gtgaaagcca tggtctttcc ttcgtgtaga agaccagaca gacagtccct gatttaccct   1680

tgcacaaagc actagaaaat tagcattcca tccttctctg cttgctctgc tgatatcact   1740

gtcattcaat gcatagccat gagctcatct tagatccaag cacgtaattc catagccgag   1800

gtccacagtg gagcagcaac attccccatc attgctttcc ccaggggcct cccaacgact   1860

aaatcaagag tatatctcta ccgtccaata gatcgtcttc gcttcaaaat ctttgacaat   1920

tccaagaggg tccccatcca tcaaacccag ttcaataata gccgagatgc atggtggagt   1980

caattaggca gtattgctgg aatgtcgggg ccagttggcc gggtggtcat tggccgcctg   2040

tgatgccatc tgccactaaa tccgatcatt gatccaccgc ccacgaggcg cgtctttgct   2100

ttttgcgcgg cgtccaggtt caactctctc ctctagactg gaaacgcaac cctgaaggga   2160

ttcttccttt gagagatgga agcgtgtcat atctcttcgg ttctacggca ggtttttttc   2220

tgctctttcg tagcatggca tggtcacttc agcgcttatt tacagttgct ggtattgatt   2280

tcttgtgcaa attgctatct gacacttatt agctatggag tcaccacatt tcccagcaac   2340

ttccccactt cctctgcaat cgccaacgtc ctctcttcac tgagtctccg tccgataacc   2400

tgcactgcaa ccggtgcccc atggtacgcc tccggatcat actcttcctg cacgagggca   2460

tcaagctcac taaccgcctt gaaactctca ttcttcttat cgatgttctt atccgcaaag   2520

gtaaccggaa caaccacgct cgtgaaatcc agcaggttga tcacagaggc atacccatag   2580

taccggaact ggtcatgccg taccgcagcg gtaggcgtaa tcggcgcgat gatggcgtcc   2640

agttccttcc cggccttttc ttcagcctcc cgccatttct caaggtactc catctggtaa   2700

ttccacttct ggagatgcgt gtcccagagc tcgttcatgt taacagcttt gatgttcggg   2760

ttcagtaggt ctttgatatt tggaatcgcc ggctcgccgg atgcactgat atcgcgcatt   2820

acgtcggcgc tgccgtcagc cgcgtagata tgggagatga gatcgtggcc gaaatcgtgc   2880

ttgtatggcg tccacggggt cacggtgtga ccggctttgg cgagtgcggc gacggtggtt   2940

tccacgccgc gcaggatagg agggtgtgga aggacattgc cgtcgaagtt gtagtagccg   3000

atattgagcc cgccgttctt gatcttggag gcaataatgt ccgactcgga ctggcgccag   3060

ggcatgggga tgaccttgga gtcgtatttc catggctcct gaccgaggac ggatttggtg   3120

aagaggcgga ggtctaacat acttcatcag tgactgccgg tctcgtatat agtataaaaa   3180

gcaagaaagg aggacagtgg aggcctggta tagagcagga aaagaaggaa gaggcgaagg   3240

actcaccctc aacagagtgc gtaatcggcc cgacaacgct gtgcaccgtc tcctgaccct   3300

ccatgctgtt cgccatcttt gcatacggca gccgcccatg actcggcctt agaccgtaca   3360

ggaagttgaa cgcggccggc actcgaatcg agccaccgat atccgttcct acaccgatga   3420

cgccaccacg aatcccaacg atcgcaccct caccaccaga actgccgccg cacgaccagt   3480

tcttgttgcg tgggttgacg gtgcgcccga tgatgttgtt gactgtctcg cagaccatca   3540

gggtctgcgg gacagaggtc ttgacgtaga agacggcacc ggctttgcgg agcatggttg   3600

tcagaaccga gtccccttcg tcgtacttgt ttagccatga gatgtagccc attgatgttt   3660

cgtagccctg gtggcatatg ttagctgaca aaaagggaca tctaacgact taggggcaac   3720

ggtgtacctt gactcgaagc tggtctttga gagagatggg gaggccatgg agtggaccaa   3780

cgggtctctt gtgctttgcg tagtattcat cgagttccct tgcctgcgcg agagcggcgt   3840

cagggaagaa ctcgtgggcg cagtttgtct gcacagaagc cagcgtcagc ttgatagtcc   3900

cataaggtgg cgttgttaca tctccctgag aggtagaggg gaccctacta actgctgggc   3960

gattgctgcc cgtttacaga atgctagcgt aacttccacc gaggtcaact ctccggccgc   4020

cagcttggac acaagatctg cagcggaggc ctctgtgatc ttcagttcgg cctctgaaag   4080

gatcaccgat ttctttggga aatcaataac gctgtcttcc gcaggcagcg tctggacttt   4140

ccattcatca gggatggttt ttgcgaggcg ggcgcgctta tcagcggcca gttcttccca   4200

ggattgaggc attctgtgtt agcttatagt caggatgttg gctcgacgag tgtaaactgg   4260

gagttggcat gagggttatg taggcttctt tagccccgca tccccctcat tctcctcatt   4320

gatcccgggg gagcggatgg tgttgataag agactaatta tagggtttag ctggtgccta   4380

gctggtgatt ggctggcttc gccgaatttt acgggccaag gaaagctgca gaaccgcggc   4440

actggtaaac ggtaattaag ctatcagccc catgctaacg agtttaaatt acgtgtattg   4500

ctgataaaca ccaacagagc tttactgaaa gatgggagtc acggtgtggc ttccccactg   4560

cgattattgc acaagcagcg agggcgaact tgactgtcgt cgctgagcag cctgcagtca   4620

aacatacata tatatcaacc gcgaagacgt ctggccttgt agaacacgac gctccctagc   4680

aacacctgcc gtgtcagcct ctacggttgt tacttgcatt caggatgctc tccagcgggc   4740

gagctattca aaatattcaa agcaggtatc tcgtattgcc aggattcagc tgaagcaaca   4800

ggtgccaagg aaatctgcgt cggttctcat ctgggcttgc tcggtcctgg cgtagatcta   4860

gagtcgacct gcaggcatgc ggcgtaatca tggtcatagc tgtttcctgt gtgaaattgt   4920

tatccgctca caattccaca caacatacga gccggaagca taaagtgtaa agcctggggt   4980

gcctaatgag tgagctaact cacattaatt gcgttgcgct cactgcccgc tttccagtcg   5040

ggaaacctgt cgtgccagct gcattaatga atcggccaac gcgcggggag aggcggtttg   5100

cgtattgggc gctcttccgc ttcctcgctc actgactcgc tgcgctcggt cgttcggctg   5160

cggcgagcgg tatcagctca ctcaaaggcg gtaatacggt tatccacaga atcaggggat   5220

aacgcaggaa agaacatgtg agcaaaaggc cagcaaaagg ccaggaaccg taaaaaggcc   5280

gcgttgctgg cgtttttcca taggctccgc ccccctgacg agcatcacaa aaatcgacgc   5340

tcaagtcaga ggtggcgaaa cccgacagga ctataaagat accaggcgtt tccccctgga   5400

agctccctcg tgcgctctcc tgttccgacc ctgccgctta ccggatacct gtccgccttt   5460

ctcccttcgg gaagcgtggc gctttctcat agctcacgct gtaggtatct cagttcggtg   5520

taggtcgttc gctccaagct gggctgtgtg cacgaacccc ccgttcagcc cgaccgctgc   5580

gccttatccg gtaactatcg tcttgagtcc aacccggtaa gacacgactt atcgccactg   5640

gcagcagcca ctggtaacag gattagcaga gcgaggtatg taggcggtgc tacagagttc   5700

ttgaagtggt ggcctaacta cggctacact agaagaacag tatttggtat ctgcgctctg   5760

ctgaagccag ttaccttcgg aaaaagagtt ggtagctctt gatccgacaa acaaaccacc   5820

gctggtagcg gtggtttttt tgtttgcaag cagcagatta cgcgcagaaa aaaaggatct   5880

caagaagatc ctttgatctt ttctacgggg tctgacgctc agtggaacga aaactcacgt   5940

taagggattt tggtcatgag attatcaaaa aggatcttca cctagatcct tttaaattaa   6000

aaatgaagtt ttaaatcaat ctaaagtata tatgagtaaa cttggtctga cagttaagca   6060

aggattttct taacttcttc ggcgacagca tcaccgactt cggtggtact gttggaacca   6120

cctaaatcac cagttctgat acctgcatcc aaaacctttt taactgcatc ttcaatggcc   6180

ttaccttctt caggcaagtt caatgacaat ttcaacatca ttgcagcaga caagatagtg   6240

gcgatagggt tgaccttatt ctttggcaaa tctggagcag aaccgtggca tggttcgtac   6300

aaaccaaatg cggtgttctt gtctggcaaa gaggccaagg acgcagatgg caacaaaccc   6360

aaggaacctg ggataacgga ggcttcatcg gagatgatat caccaaacat gttgctggtg   6420

attataatac catttaggtg ggttgggttc ttaactagga tcatggcggc agaatcaatc   6480

aattgatgtt gaaccttcaa tgtagggaat tcgttcttga tggtttcctc cacagttttt   6540

ctccataatc ttgaagaggc caaaacatta gctttatcca aggaccaaat aggcaatggt   6600

ggctcatgtt gtagggccat gaaagcggcc attcttgtga ttctttgcac ttctggaacg   6660

gtgtattgtt cactatccca agcgacacca tcaccatcgt cttcctttct cttaccaaag   6720

taaatacctc ccactaattc tctgacaaca acgaagtcag tacctttagc aaattgtggc   6780

ttgattggag ataagtctaa aagagagtcg gatgcaaagt tacatggtct taagttggcg   6840

tacaattgaa gttctttacg gatttttagt aaaccttgtt caggtctaac actgccggta   6900

ccccatttag gaccacccac agcacctaac aaaacggcat cagccttctt ggaggcttcc   6960

agcgcctcat ctggaagtgg aacacctgta gcatcgatag cagcaccacc aattaaatga   7020

ttttcgaaat cgaacttgac attggaacga acatcagaaa tagctttaag aaccttaatg   7080

gcttcggctg tgatttcttg accaacgtgg tcacctggca aaacgacgat cttcttaggg   7140

gcagacatac tcttcctttt tcaatattat tgaagcattt atcagggtta ttgtctcatg   7200

agcggataca tatttgaa                                                 7218

<210>8

<211>2403

<212>DNA

<213>质粒pMhas5

<400>8

cgataagcta gcttcacgct gccgcaagca ctcagggcgc aagggctgct aaaggaagcg     60

gaacacgtag aaagccagtc cgcagaaacg gtgctgaccc cggatgaatg tcagctactg    120

ggctatctgg acaagggaaa acgcaagcgc aaagagaaag caggtagctt gcagtgggct    180

tacatggcga tagctagact gggcggtttt atggacagca agcgaaccgg aattgccagc    240

tggggcgccc tctggtaagg ttgggaagcc ctgcaaagta aactggatgg ctttcttgcc    300

gccaaggatc tgatggcgca ggggatcaag atctgatcaa gagacaggat gaggatcgtt    360

tcgcatgatt gaacaagatg gattgcacgc aggttctccg gccgcttggg tggagaggct    420

attcggctat gactgggcac aacagacaat cggctgctct gatgccgccg tgttccggct    480

gtcagcgcag gggcgcccgg ttctttttgt caagaccgac ctgtccggtg ccctgaatga    540

actccaagac gaggcagcgc ggctatcgtg gctggccacg acgggcgttc cttgcgcagc    600

tgtgctcgac gttgtcactg aagcgggaag ggactggctg ctattgggcg aagtgccggg    660

gcaggatctc ctgtcatctc accttgctcc tgccgagaaa gtatccatca tggctgatgc    720

aatgcggcgg ctgcatacgc ttgatccggc tacctgccca ttcgaccacc aagcgaaaca    780

tcgcatcgag cgagcacgta ctcggatgga agccggtctt gtcgatcagg atgatctgga    840

cgaagagcat caggggctcg cgccagccga actgttcgcc aggctcaagg cgcggatgcc    900

cgacggcgag gatctcgtcg tgacccatgg cgatgcctgc ttgccgaata tcatggtgga    960

aaatggccgc ttttctggat tcatcgactg tggccggctg ggtgtggcgg accgctatca   1020

ggacatagcg ttggctaccc gtgatattgc tgaagagctt ggcggcgaat gggctgaccg   1080

cttcctcgtg ctttacggta tcgccgctcc cgattcgcag cgcatcgcct tctatcgcct   1140

tcttgacgag ttcttctgag cgggactctg gggttcgcga tgataagctg tcaaacatga   1200

gaattacaac ttatatcgta tggggctgac ttcaggtgct acatttgaag agataaattg   1260

cactgaaatc tagaaatatt ttatctgatt aataagatga tcttcttgag atcgttttgg   1320

tctgcgcgta atctcttgct ctgaaaacga aaaaaccgcc ttgcagggcg gtttttcgaa   1380

ggttctctga gctaccaact ctttgaaccg aggtaactgg cttggaggag cgcagtcacc   1440

aaaacttgtc ctttcagttt agccttaacc ggcgcatgac ttcaagacta actcctctaa   1500

atcaattacc agtggctgct gccagtggtg cttttgcatg tctttccggg ttggactcaa   1560

gacgatagtt accggataag gcgcagcggt cggactgaac ggggggttcg tgcatacagt   1620

ccagcttgga gcgaactgcc tacccggaac tgagtgtcag gcgtggaatg agacaaacgc   1680

ggccataaca gcggaatgac accggtaaac cgaaaggcag gaacaggaga gcgcacgagg   1740

gagccgccag gggaaacgcc tggtatcttt atagtcctgt cgggtttcgc caccactgat   1800

ttgagcgtca gatttcgtga tgcttgtcag gggggcggag cctatggaaa aacggctttg   1860

ccttctttcc tgcgttatcc cctgattctg tggataaccg tattaccgcc tttgagtgag   1920

ctgataccgc tcgccgcagc cgaacgaccg agcgcagcga gtcagtgagc gaggaagcgg   1980

aagagcgccc aatacgcaaa ccgcctctcc ccgcgcgttg gccgattcat taatgcagct   2040

ggcacgacag gtttcccgac tggaaagcgg gcagtgagcg caacgcaatt aatgtgagtt   2100

agctcactca ttaggcaccc caggctttac actttatgct tccggctcgt atgttgtgtg   2160

gaattgtgag cggataacaa tttcacacag gaattcacag ctatgctaga gcggccgctc   2220

gacctgcagg catgcaagct tggcactggc cgtcgtttta caacgtcgtg actgggaaaa   2280

ccctggcgtt acccaactta atcgccttgc agcacatccc cctttcgcca gctggcgtaa   2340

tagcgaagag gcccgcaccg atcgcccttc ccaacagttg cgcagcctga atggcgaatg   2400

gcg                                                                 2403

Claims (37)

1.具有抗微生物活性的多肽，其选自下组：

(a)包含与SEQ ID NO：2的氨基酸1至42有至少60％同一性的氨基酸序列的多肽；

(b)由在至少中度严紧条件下与以下者杂交的多核苷酸所编码的多肽：(i)SEQ ID NO：1的核苷酸145至270、(ii)SEQ ID NO：1的核苷酸1至270中包含的cDNA序列、或(iii)(i)或(ii)的互补链；以及

(c)包含SEQ ID NO：2的氨基酸1至42的一或多个氨基酸的保守性取代、缺失、和/或插入的变体。

2.权利要求1的多肽，其包括与SEQ ID NO：2的氨基酸1至42有至少60％同一性的氨基酸序列。

3.权利要求2的多肽，其包括与SEQ ID NO：2的氨基酸1至42具有至少70％同一性的氨基酸序列。

4.权利要求3的多肽，其包括与SEQ ID NO：2的氨基酸1至42具有至少80％同一性的氨基酸序列。

5.权利要求4的多肽，其包括与SEQ ID NO：2的氨基酸1至42具有至少90％同一性的氨基酸序列。

6.权利要求5的多肽，其包括与SEQ ID NO：2的氨基酸1至42具有至少95％同一性的氨基酸序列。

7.权利要求1至6中任一项的多肽，其包括SEQ ID NO：2的氨基酸序列。

8.权利要求1至7中任一项的多肽，其由SEQ ID NO：2或其具有抗微生物活性的片段组成。

9.权利要求8的多肽，其由SEQ ID NO：2组成。

10.权利要求8的多肽，其由SEQ ID NO：2的氨基酸1至42组成。

11.权利要求1的多肽，其由在至少中度严紧条件下与以下者杂交的多核苷酸所编码：(i)SEQ ID NO：1的核苷酸145至270、(ii)SEQ ID NO：1的核苷酸1至270中包含的cDNA序列、或(iii)(i)或(ii)的互补链。

12.权利要求1的多肽，其由在至少中度-高度严紧条件下与以下者杂交的多核苷酸所编码：(i)SEQ ID NO：1的核苷酸145至270、(ii)SEQ ID NO：1的核苷酸1至270中所含的cDNA序列、或(iii)(i)或(ii)的互补链。

13.权利要求1的多肽，其由在至少高度严紧条件下与以下者杂交的多核苷酸所编码：(i)SEQ ID NO：1的核苷酸145至270、(ii)SEQ ID NO：1的核苷酸1至270中所含的cDNA序列、或(iii)(i)或(ii)的互补链。

14.权利要求1的多肽，其中该多肽是包括SEQ ID NO：2的氨基酸1至42的一个或多个氨基酸的保守性取代、缺失和/或插入的变体。

15.分离的多核苷酸，其包括编码权利要求1至14中任一项的多肽的核苷酸序列。

16.权利要求15的分离的多核苷酸，其在SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列中具有至少一个突变，其中该突变核苷酸序列编码由SEQ ID NO：2的氨基酸1至42组成的多肽。

17.核酸构建体，其包含权利要求15的多核苷酸，其可操作地连接至一或多种控制序列，所述控制序列指导该多肽在表达宿主中的产生。

18.重组表达载体，其包含权利要求17的核酸构建体。

19.重组宿主细胞，其包含权利要求17的核酸构建体。

20.用于产生权利要求1至14中任一项的多肽的方法，其包括(a)在有益于产生该多肽的条件下培养细胞，该细胞的野生型形式能够产生该多肽；以及(b)回收该多肽。

21.用于产生权利要求1至14中任一项的多肽的方法，其包括(a)在有益于该多肽产生的条件下培养包含核酸构建体的宿主细胞，所述核酸构建体包含编码该多肽的核苷酸序列；以及(b)回收该多肽。

22.分离的多核苷酸，其通过下述步骤获得：(a)在中度严紧条件下将DNA群体与以下者杂交：(i)SEQ ID NO：1的核苷酸145至270、(ii)SEQ IDNO：1的核苷酸1至270中所含的cDNA序列、或(iii)(i)或(ii)的互补链；以及(b)分离发生杂交的多核苷酸，其编码具有抗微生物活性的多肽。

23.权利要求22的分离的多核苷酸，其通过下述步骤获得：(a)在中度-高度严紧条件下将DNA群体与以下者杂交：(i)SEQ ID NO：1的核苷酸145至270、(ii)SEQ ID NO：1的核苷酸1至270中所含的cDNA序列、或(iii)(i)或(ii)的互补链；以及(b)分离发生杂交的多核苷酸，其编码具有抗微生物活性的多肽。

24.权利要求23的分离的多核苷酸，其通过下述步骤获得：(a)在高度严紧条件下将DNA群体与以下者杂交：(i)SEQ ID NO：1的核苷酸145至270、(ii)SEQ ID NO：1的核苷酸1至270中所含的cDNA序列、或(iii)(i)或(ii)的互补链；以及(b)分离发生杂交的多核苷酸，其编码具有抗微生物活性的多肽。

25.产生具有突变核苷酸序列的多核苷酸的方法，其包括(a)在SEQ IDNO：1的成熟多肽编码序列中引入至少一个突变，其中该突变核苷酸序列编码由SEQ ID NO：2的氨基酸1至42组成的多肽；以及(b)回收包含该突变核苷酸序列的多核苷酸。

26.一种突变多核苷酸，其由权利要求25的方法产生。

27.产生多肽的方法，其包括(a)在有益于该多肽产生的条件下培养包含权利要求26的突变多核苷酸的细胞，其中所述突变多核苷酸编码该多肽；以及(b)回收该多肽。

28.核酸构建体，其包括编码蛋白质的基因，该基因可操作地连接至以下两者之一或两者：第一核苷酸序列，其编码由SEQ ID NO：1的核苷酸1到60组成的信号肽；和第二核苷酸序列，其编码由SEQ ID NO：1的核苷酸61至144组成的前肽，其中所述基因对于第一与第二核苷酸序列是外来的。

29.重组表达载体，其包括权利要求28的核酸构建体。

30.重组宿主细胞，其包括权利要求28的核酸构建体。

31.产生蛋白质的方法，其包括(a)在有益于产生所述蛋白质的条件下培养权利要求30的重组宿主细胞；以及(b)回收该蛋白质。

32.产生权利要求1至14中任一项的多肽的方法，其包括(a)在有益于产生所述多肽的条件下培养转基因植物或植物细胞，所述植物或植物细胞包含编码本发明的具有抗微生物活性的多肽的多核苷酸；以及(b)回收该多肽。

33.转基因植物、植物部分或植物细胞，其已经用编码权利要求1至14中任一项的多肽的多核苷酸转化。

34.用于杀死微生物细胞或抑制微生物细胞生长的方法，其包括将微生物细胞与如权利要求1至14中任一项所定义的抗微生物多肽接触。

35.如权利要求1至14中任一项所定义的抗微生物多肽，其用作药物、或抗微生物的兽医用或人用治疗剂或预防剂。

36.如权利要求1至14中任一项所定义的抗微生物多肽在制备用于治疗微生物感染或供预防用的兽医用或人用治疗剂中的用途。

37.至少一种如权利要求1至14中任一项所定义的抗微生物多肽在动物饲料中的用途。