CN103360469A - 抗微生物多肽 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及抗微生物多肽,具体地涉及具有抗微生物活性的多肽和具有编码这些多肽的核苷酸序列的多核苷酸。本发明还涉及核酸构建体,包含该核酸构建体的载体和宿主细胞,以及生产和使用这些多肽的方法。
Description
本发明申请是基于申请日为2005年5月3日,申请号为“200580022675.5”(国际申请号为“PCT/DK2005/000302”),名称为“抗微生物多肽”的发明专利申请的分案申请。
技术领域
本发明涉及具有抗微生物活性的多肽和具有编码这些多肽的核苷酸序列的多核苷酸。本发明还涉及核酸构建体,包含该核酸构建体的载体和宿主细胞,以及生产和使用这些多肽的方法。
背景技术
近年来,在抗微生物剂的种类显著增加的同时,具有抗性的病原微生物也同步增加。现在已认识到所有临床上可得的抗微生物剂都有抗性存在。迄今为止,医学界对抗微生物剂抗药性的应对手段是使用对抗性药细菌尚未使用过的新的或者替代性的抗生素。这就需要持续开发新的抗生素,或者作为现有化合物的变体,或者作为多种化合物的组合,它们可以抑制或者绕开细菌的抗性药机制。
本发明的一个目的是提供具有改善的抗微生物活性的新多肽,以及编码这些多肽的多核苷酸。
本发明的另一个目的是提供新的抗微生物多肽,其可能具有降低的溶血活性和/或降低的细胞毒性。这些多肽还可能显示对例如Ca2+、Mg2+和Na+等阳离子的降低的敏感性。
发明概述
本发明的第一个方面中涉及具有抗微生物活性的多肽,其对应于SEQID NO:2所列出的氨基酸序列:
K-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17;
其中X1=N,F,I,W,M,S,A,T,Y,V,H,L,C,K或G;X2=L,I,F或W;X3=R,I,F,L,Y,V,A,T,C,H,G,Q或P;X4=R或C;X5=I,L,W,M,V或F;X6=I,L或W;X7=R,L,T或C;X8=K,V,F,L,C,Y,I,R,N或W;X9=G,C,Y,L,F,W或V;X10=I,W,F或R;X11=H,K,C,A,S,I,N,L或Q;X12=I,L,F或V;X13=I,L,F,T或V;X14=K,I,S,L或R;X15=K,R或I;X16=Y,I,L,F或K;X17=G,I,S,L,R,F,T,C或V;
且其中所述氨基酸序列与SEQ ID NO:1的氨基酸1至18具有多于55%且少于100%的同一性。
本发明的另一个方面中涉及具有编码本发明的多肽的核苷酸序列的多核苷酸。
本发明的另一个方面中涉及核酸构建体,该构建体包括编码本发明的多肽的核苷酸序列,其可操作地连接于一种或多种指导所述多肽在合适的宿主中产生的控制序列。
本发明的另一个方面中涉及包含本发明的核酸构建体的重组表达载体。
本发明的另一个方面中涉及包含本发明的核酸构建体的重组宿主细胞。
本发明的另一个方面中涉及产生本发明的多肽的方法,该方法包括:
(a)在有助于产生该多肽的条件下,培养本发明的重组宿主细胞;及
(b)回收该多肽。
本发明的其它方面可以通过下面的详述和所附权利要求而得以明示。
具体地,本发明涉及如下各项:
1.具有抗微生物活性的多肽,包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列:
K-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17;
其中
X1=N,F,I,W,M,S,A,T,Y,V,H,L,C,K或G;优选X1=S,T,V,Y,W,I,G,F或L;
X2=L,I,F或W;优选X2=W或I;
X3=R,I,F,L,Y,V,A,T,C,H,G,Q或P;优选X3=F,I,V或L;
X4=R或C;
X5=I,L,W,M,V或F;优选X5=L或I;
X6=I,L或W;优选X6=I;
X7=R,L,T或C;
X8=K,V,F,L,C,Y,I,R,N或W;优选X8=Y,F,W,V或L;
X9=G,C,Y,L,F,W或V;优选X9=G或F;
X10=I,W,F或R;优选X10=W或I;
X11=H,K,C,A,S,I,N,L或Q;优选X11=I,S或K;
X12=I,L,F或V;优选X12=L;
X13=I,L,F,T或V;优选X13=L;
X14=K,I,S,L或R;优选X14=I,R或L;
X15=K,R或I;
X16=Y,I,L,F或K;优选X16=L;
X17=G,I,S,L,R,F,T,C或V;优选X17=I,F或L;
其中该氨基酸序列与SEQ ID NO:1的氨基酸1至18具有多于55%的同一性而少于100%的同一性。
2.具有抗微生物活性的多肽,包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列:
K-R-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16;
其中
X1=L,I,F或W;优选X1=W或I;
X2=R,I,F,L,Y,V,A,T,C,H,G,Q或P;优选X2=F,I,V或L;
X3=R或C;
X4=I,L,W,M,V或F;优选X4=L或I;
X5=I,L或W;优选X5=I;
X6=R,L,T或C;
X7=K,V,F,L,C,Y,I,R,N或W;优选X7=Y,F,W,V或L;
X8=G,C,Y,L,F,W或V;优选X8=G或F;
X9=I,W,F或R;优选X9=W或I;
X10=H,K,C,A,S,I,N,L或Q;优选X10=I,S或K;
X11=I,L,F或V;优选X11=L;
X12=I,L,F,T或V;优选X12=L;
X13=K,I,S,L或R;优选X13=I,R或L;
X14=K,R或I;
X15=Y,I,L,F或K;优选X15=L;
X16=G,I,S,L,R,F,T,C或V;优选X16=I,F或L;
其中该氨基酸序列与SEQ ID NO:1的氨基酸1至18具有多于55%的同一性而少于90%的同一性。
3.具有抗微生物活性的多肽,包含SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列:
K-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-R-X11-X12-X13-X14-X15-X16;
其中
X1=N,F,I,W,M,S,A,T,Y,V,H,L,C,K或G;优选X1=S,T,V,Y,W,I,G,F或L;
X2=L,I,F或W;优选X2=W或I;
X3=R,I,F,L,Y,V,A,T,C,H,G,Q或P;优选X3=F,I,V或L;
X4=R或C;
X5=I,L,W,M,V或F;优选X5=L或I;
X6=I,L或W;优选X6=I;
X7=R,L,T或C;
X8=K,V,F,L,C,Y,I,R,N或W;优选X8=Y,F,W,V或L;
X9=G,C,Y,L,F,W或V;优选X9=G或F;
X10=I,W,F或R;优选X10=W或I;
X11=I,L,F或V;优选X11=L;
X12=I,L,F,T或V;优选X12=L;
X13=K,I,S,L或R;优选X13=I,R或L;
X14=K,R或I;
X15=Y,I,L,F或K;优选X15=L;
X16=G,I,S,L,R,F,T,C或V;优选X16=I,F或L;
其中该氨基酸序列与SEQ ID NO:1的氨基酸1至18具有多于55%的同一性而少于90%的同一性。
4.项1-3任一项的多肽,其中所述氨基酸序列与SEQ ID NO:1的氨基酸1到18具有至少60%的同一性,优选与SEQ ID NO:1的氨基酸1到18具有至少65%的同一性,至少70%的同一性,至少75%的同一性,或至少80%的同一性。
5.项1-4任一项的多肽,包含SEQ ID NO:5到SEQ ID NO:114的任一序列的氨基酸序列。
6.项1-4任一项的多肽,由SEQ ID NO:5到SEQ ID NO:114的任一序列的氨基酸序列组成。
7.多核苷酸,其具有编码项1-6的任一项所定义的多肽的核苷酸序列。
8.核酸构建体,包含项7中定义的核苷酸序列,该核苷酸序列可操作地连接到一种或多种指导所述多肽在合适的宿主中生产的控制序列。
9.包含项8中所定义的核酸构建体的重组表达载体。
10.包含项8中所定义的核酸构建体的重组宿主细胞。
11.生产如项1-6的任一项所定义的多肽的方法,该方法包括:
(a)在有助于产生该多肽的条件下,培养项10所定义的重组宿主细胞;及
(b)回收该多肽。
12.包含如项1-6的任一项所定义的抗微生物多肽的组合物。
13.项12的组合物,其还包含附加的杀生物剂。
14.杀死微生物细胞或抑制其生长的方法,包括将微生物细胞与如项1-6的任一项所定义的抗微生物多肽相接触。
15.去污剂组合物,包含表面活性剂和如项1-6的任一项所定义的抗微生物多肽。
16.如项1-6的任一项所定义的抗微生物多肽,其用作药物。
17.如项1-6的任一项所定义的抗微生物多肽,其用作兽用或人用抗微生物治疗剂或预防剂。
18.如项1-6的任一项所定义的抗微生物多肽在制备用于治疗微生物感染或预防用途的兽用或人用治疗剂中的用途。
19.如项1-6的任一项所定义的抗微生物多肽用于杀死微生物细胞或抑制其生长的用途。
20.转基因植物、植物部分或植物细胞,其用编码如项1-6的任一项所定义的具有抗微生物活性的多肽的核苷酸序列转化。
21.至少一种如项1-6的任一项所定义的抗微生物多肽在动物饲料中的用途。
22.至少一种如项1-6的任一项所定义的抗微生物多肽在制备用于动物饲料的组合物中的用途。
23.动物饲料添加剂,包含:
(a)至少一种如项1-6的任一项所定义的抗微生物多肽,和
(b)至少一种脂溶性维生素,和/或
(c)至少一种水溶性维生素,和/或
(d)至少一种痕量矿物质,和/或
(e)至少一种大量矿物质。
24.项23的动物饲料添加剂,还包含肌醇六磷酸酶,木聚糖酶,半乳聚糖酶和/或β-葡聚糖酶。
25.动物饲料组合物,具有50-800g/kg的粗蛋白含量,并包含至少一种如项1-6的任一项所定义的抗微生物多肽。
定义
在进一步详细讨论本发明之前,首先定义下面的术语和约定:
抗微生物活性:术语“抗微生物活性”在本文中定义为能够杀死微生物细胞或者抑制其生长的活性。在本发明的语境中,术语“抗微生物的”(antimicrobial)意指存在杀细菌(bactericidal)和/或抑细菌(bacteriostatic)和/或杀真菌(fungicidal)和/或抑真菌(fungistatic)和/或杀病毒(virucidal)的作用,其中术语“杀细菌的”应理解为能够杀死细菌细胞。术语“抑细菌的”应理解为能够抑制细菌细胞生长,即抑制生长中的细菌细胞。术语“杀真菌的”应理解为能够杀死真菌细胞。术语“抑真菌的”应理解为能够抑制真菌的生长,即抑制生长中的真菌细胞。术语“杀病毒的”应理解为能够灭活病毒。术语“微生物细胞”指细菌或真菌细胞(包括酵母)。
在本发明的语境中,术语“抑制微生物细胞的生长”意指所述细胞在非生长状态,即它们不能增殖。
对本发明而言,抗微生物活性可以根据Lehrer等,Journal of ImmunologicalMethods,Vol.137(2)pp.167-174(1991)所描述的方法来测定。
具有抗微生物活性的多肽可能具有下面的能力:在20℃下,在所述具有抗微生物活性的多肽的25%(w/w)水溶液,优选10%(w/w)水溶液,更优选5%(w/w)水溶液,更优选1%(w/w)水溶液,最优选0.5%(w/w)水溶液,特别是0.1%(w/w)水溶液中,温育8小时后(优选4小时后,更优选2小时后,最优选1小时后,特别是30分钟后),将大肠杆菌(Escherichia coli)(DSM1576)活细胞的数目降低到1/100。
具有抗微生物活性的多肽还可能具有下面的能力:当其以1000ppm的浓度,优选以500ppm的浓度,更优选以250ppm的浓度,更优选以100ppm的浓度,更优选以50ppm的浓度,特别是以25ppm的浓度加入时,在25℃下的微生物生长底物中,可抑制大肠杆菌(DSM1576)的长出(outgrowth)24小时。
具有抗微生物活性的多肽还可能具有下面的能力:在20℃下,在具有抗微生物活性的多肽的25%(w/w)水溶液,优选10%(w/w)水溶液,更优选5%(w/w)水溶液,更优选1%(w/w)水溶液,最优选0.5%(w/w)水溶液,特别是0.1%(w/w)水溶液中,温育8小时后(优选4小时后,更优选2小时后,最优选1小时后,特别是30分钟后),将枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)(ATCC6633)活细胞的数目降低到1/100。
具有抗微生物活性的多肽还可能具有下面的能力:当其以1000ppm的浓度,优选以500ppm的浓度,更优选以250ppm的浓度,更优选以100ppm的浓度,更优选以50ppm的浓度,特别是以25ppm的浓度加入时,在25℃下的微生物生长底物中,可抑制枯草芽孢杆菌(ATCC6633)的长出24小时。
本发明的多肽应优选地具有由SEQ ID NO:5到SEQ ID NO:114的任一序列的氨基酸1到18的所示的氨基酸序列所构成的多肽的至少20%的抗微生物活性。在一个特别优选的实施方式中,该多肽应具有由SEQ ID NO:5到SEQ ID NO:114的任一序列的氨基酸1到18的所示的氨基酸序列所构成的多肽的至少40%,例如至少50%,优选至少60%,例如至少70%,更优选至少80%,例如至少90%,最优选至少95%,例如大约或至少100%的抗微生物活性。
同一性:在本文的语境中,两个氨基酸序列或两个核苷酸序列之间的同源性以参数“同一性”来描述。
对本发明而言,两个氨基酸序列之间的同一性程度是利用FASTA程序包2.0x版本中包含的FASTA程序来确定的(参考W.R.Pearson和D.J.Lipman(1988),"Improved Tools for Biological Sequence Analysis",PNAS85:2444-2448;及W.R.Pearson(1990)"Rapid and Sensitive SequenceComparison with FASTP and FASTA",Methods in Enzymology183:63-98)。所用的评分矩阵(scoring matrix)是BLOSUM50,缺口罚分(gap penalty)为-12,缺口延伸罚分(gap extension penalty)为-2。
两个核苷酸序列之间的同一性程度是利用同上所述的算法和程序包来确定的。所用的评分矩阵(scoring matrix)是同一性矩阵(identity matrix),缺口罚分为-16,缺口延伸罚分为-4。
片段:用于本文时,如SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:114的任一序列所示的氨基酸序列的“片段”是指这些多肽的子序列,其中从氨基和/或羧基末端缺失了一个或多个氨基酸。优选地,所述一个或多个氨基酸是从羧基末端缺失的。
等位变体:在本文的上下文中,术语“等位变体”(allelic variant)指基因的占据同一染色体座位的两种或更多种可选形式中的任一种。等位变异由突变而自然产生,并可以导致群体内的多态性。基因突变可能是沉默的(被编码的多肽不发生变化)或者可能编码具有改变的氨基酸序列的多肽。多肽的等位变体是被基因的等位变体所编码的多肽。
基本上纯的多核苷酸:术语“基本上纯的多核苷酸”在本文中指多核苷酸的制备物,其中多核苷酸已从其天然遗传环境分离,因此不含其它外来的或不需要的编码序列,而且具有适合在基因工程蛋白质生产系统中使用的形式。因此,基本上纯的多核苷酸含有以重量计最多10%的与其天然伴随的其它多核苷酸物质(优选更低百分比的其它多核苷酸物质,例如最多8%重量,最多6%重量,最多5%重量,最多4%重量,最多3%重量,最多2%重量,最多1%重量,和最多1/2%重量)。但是,基本上纯的多核苷酸还可以包含天然存在的5’和3’非翻译区,例如启动子或终止子。优选地,该基本上纯的多核苷酸是至少92%纯的,即该多核苷酸构成制备物中存在的多核苷酸物质的至少92%重量,优选更高的百分比,例如至少94%纯,至少95%纯,至少96%纯,至少96%纯,至少97%纯,至少98%纯,至少99%纯,和至多99.5%纯。本发明的多核苷酸优选地为基本上(substantially)纯的形式。具体地,本文公开的多核苷酸优选为“实质上(essentially)纯的形式”,即,该多核苷酸的制备物实质上不含有与其天然相伴随的其他多核苷酸物质。本文中,术语“基本上纯的多核苷酸”与术语“分离的多核苷酸”和“分离形式的多核苷酸”同义。
修饰:本发明的语境中,术语“修饰”意指由SEQ ID NO:2到SEQ IDNO:114的任一序列的氨基酸1到18所示的氨基酸序列组成的多肽的任何化学修饰,以及对编码这些多肽的DNA的遗传操作。修饰可以是在氨基酸序列中氨基酸侧链的置换,目标氨基酸中或目标氨基酸处的取代、缺失和/或插入;或者使用具有相似特征的非天然氨基酸。具体地,修饰可以是酰胺化,例如C-末端的酰胺化。
cDNA:术语“cDNA”在本文的语境中使用时,涵盖可以从来自真核细胞的成熟的、经过剪接的mRNA分子通过逆转录而制备得到的DNA分子。cDNA缺少相应的基因组DNA中通常存在的内含子序列。初始的初级RNA转录本是mRNA的前体,它经过一系列的加工事件后,作为成熟的、经剪接的mRNA出现。上述事件包括通过称为剪接的过程去除内含子序列。当cDNA来源于mRNA时,其因此缺少内含子序列。
核酸构建体:本文中使用的术语“核酸构建体”指单链或双链的核酸分子,其分离自天然存在的基因,或者该核酸分子已受到修饰使得其以自然界中本来不存在(not otherwise)的方式含有核酸的片段。当核酸构建体含有表达本发明的编码序列所需要的控制序列时,术语“核酸构建体”和术语“表达盒”是同义的。
控制序列:术语“控制序列”在这里定义为包括所有对于本发明的多肽的表达而言是必需的或者有利的组分。每一调控序列对于编码该多肽的多核苷酸可以是天然的或者外来的。这些控制序列包括但不限于,前导序列,聚腺苷酸化序列,前肽序列,启动子,信号肽序列和转录终止子。调控序列至少包括启动子及转录和翻译终止信号。这些调控序列还可以被提供接头(linkers),用于导入特定的限制性位点以便于将该控制序列和编码多肽的核苷酸序列的编码区域连接起来。
可操作地连接(operably linked):术语“可操作地连接”指这样一种构型,其中控制序列被置于相对DNA序列的编码序列的合适位置上,使得该控制序列指导多肽的表达。
编码序列:本文中使用术语“编码序列”时,意在涵盖这样的核苷酸序列,其直接指定其蛋白质产物的氨基酸序列。编码序列的边界一般是由开放阅读框确定的,开放阅读框一般从起始密码子ATG开始。编码序列通常包含DNA、cDNA和重组核苷酸序列。
表达:在本文的语境中,术语“表达”包括所述多肽的生产中涉及的任何步骤,包括但不限于,转录、转录后修饰、翻译和翻译后修饰。优选地,表达还包括多肽的分泌。
表达载体:在本文的语境中,术语“表达载体”涵盖线性或者环状的DNA分子,其包含编码本发明的多肽的片段,且可操作地连接到为其转录提供条件的其他片段。
宿主细胞:本文使用的术语“宿主细胞”包括易于用核酸构建体进行转化的任何细胞种类。
术语“多核苷酸探针”、“杂交”及各种严紧度条件将在“具有抗微生物活性的多肽”一节定义。
发明详述
具有抗微生物活性的多肽
在第一个方面中,本发明涉及具有抗微生物活性的多肽,其中该多肽包含并优选地由SEQ ID NO:2所列出的氨基酸序列组成:
K-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17;
其中X1=N,F,I,W,M,S,A,T,Y,V,H,L,C,K或G;优选X1=S,T,V,Y,W,I,G,F或L;X2=L,I,F或W;优选X2=W或I;X3=R,I,F,L,Y,V,A,T,C,H,G,Q或P;优选X3=F,I,V或L;X4=R或C;X5=I,L,W,M,V或F;优选X5=L或I;X6=I,L,W或Y;优选X6=I;X7=R,L,T或C;X8=K,V,F,L,C,Y,I,R,N或W;优选X8=Y,F,W,V或L;X9=G,C,Y,L,F,W或V;优选X9=G或F;X10=I,W,F或R;优选X10=W或I;X11=H,K,C,A,F,S,I,N,L或Q;优选X11=I,S或K;X12=I,L,F或V;优选X12=L;X13=I,L,F,T或V;优选X13=L;X14=K,I,S,L或R;优选X14=I,R或L;X15=K,R,I或G;X16=Y,I,L,F或K;优选X16=L;X17=G,I,S,L,R,F,T,C或V;优选X17=I,F或L;其中所述氨基酸序列与SEQ ID NO:1的氨基酸1到18具有多于55%而少于100%的同一性。在一个实施方式中该氨基酸序列与SEQ ID NO:1的氨基酸序列相比有1,2,3,4,5,6,7或8个(优选1,2,3,4,5或6个;更优选1,2,3,4或5个;更优选1,2,3或4个;更优选1,2或3个,最优选1或2个)氨基酸的不同。
在第二个方面中,本发明涉及具有抗微生物活性的多肽,其中该多肽包含并优选地由SEQ ID NO:3所列出的氨基酸序列组成:
K-R-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16;
其中X1=L,I,F或W;优选X1=W或I;X2=R,I,F,L,Y,V,A,T,C,H,G,Q或P;优选X2=F,I,V或L;X3=R或C;X4=I,L,W,M,V或F;优选X4=L或I;X5=I,L或W;优选X5=I;X6=R,L,T或C;X7=K,V,F,L,C,Y,I,R,N或W;优选X7=Y,F,W,V或L;X8=G,C,Y,L,F,W或V;优选X8=G或F;X9=I,W,F或R;优选X9=W或I;X10=H,K,C,A,S,I,N,L或Q;优选X10=I,S或K;X11=I,L,F或V;优选X11=L;X12=I,L,F,T或V;优选X12=L;X13=K,I,S,L或R;优选X13=I,R或L;X14=K,R或I;X15=Y,I,L,F或K;优选X15=L;X16=G,I,S,L,R,F,T,C或V;优选X16=I,F或L;且其中该氨基酸序列与SEQ ID NO:1的氨基酸1到18具有多于55%而少于90%的同一性。在一个实施方式中该氨基酸序列与SEQID NO:1的氨基酸序列相比有2,3,4,5,6,7或8个(优选2,3,4,5或6个;更优选2,3,4或5个;更优选2,3或4个;更优选2或3个,最优选2个)氨基酸的不同。
在第三个方面中,本发明涉及具有抗微生物活性的多肽,其中该多肽包含并优选地由SEQ ID NO:4所列出的氨基酸序列组成:
K-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-R-X11-X12-X13-X14-X15-X16;
其中X1=N,F,I,W,M,S,A,T,Y,V,H,L,C,K或G;优选X1=S,T,V,Y,W,I,G,F或L;X2=L,I,F或W;优选X2=W或I;X3=R,I,F,L,Y,V,A,T,C,H,G,Q或P;优选X3=F,I,V或L;X4=R或C;X5=I,L,W,M,V或F;优选X5=L或I;X6=I,L或W;优选X6=I;X7=R,L,T或C;X8=K,V,F,L,C,Y,I,R,N或W;优选X8=Y,F,W,V或L;X9=G,C,Y,L,F,W或V;优选X9=G或F;X10=I,W,F或R;优选X10=W或I;X11=I,L,F或V;优选X11=L;X12=I,L,F,T或V;优选X12=L;X13=K,I,S,L或R;优选X13=I,R或L;X14=K,R或I;X15=Y,I,L,F或K;优选X15=L;X16=G,I,S,L,R,F,T,C或V;优选X16=I,F或L;其中所述氨基酸序列与SEQ ID NO:1的氨基酸1到18具有多于55%而少于90%的同一性。在一个实施方式中该氨基酸序列与SEQ ID NO:1的氨基酸序列相比有2,3,4,5,6,7或8个(优选2,3,4,5或6个;更优选2,3,4或5个;更优选2,3或4个;更优选2或3个,最优选2个)氨基酸的不同。
在一个实施方式中,本发明的多肽与SEQ ID NO:1的氨基酸1到18具有至少60%的同一性,优选与至少65%的同一性,至少70%的同一性,至少75%的同一性,和至少80%的同一性。
在另一个实施方式中,所述多肽包含并优选地由SEQ ID NO:5到SEQID NO:114的任一序列的氨基酸1到18组成。
术语:“SEQ ID NO:5到SEQ ID NO:114的任一序列”是指:SEQ ID NO:5,SEQ ID NO:6,SEQ ID NO:7,SEQ ID NO:8,SEQ ID NO:9,SEQ ID NO:10,SEQ ID NO:11,SEQ ID NO:12,SEQ ID NO:13,SEQ ID NO:14,SEQ IDNO:15,SEQ ID NO:16,SEQ ID NO:17,SEQ ID NO:18,SEQ ID NO:19,SEQ ID NO:20,SEQ ID NO:21,SEQ ID NO:22,SEQ ID NO:23,SEQ ID NO:24,SEQ ID NO:25,SEQ ID NO:26,SEQ ID NO:27,SEQ ID NO:28,SEQ IDNO:29,SEQ ID NO:30,SEQ ID NO:31,SEQ ID NO:32,SEQ ID NO:33,SEQ ID NO:34,SEQ ID NO:35,SEQ ID NO:36,SEQ ID NO:37,SEQ ID NO:38,SEQ ID NO:39,SEQ ID NO:40,SEQ ID NO:41,SEQ ID NO:42,SEQ IDNO:43,SEQ ID NO:44,SEQ ID NO:45,SEQ ID NO:46,SEQ ID NO:47,SEQ ID NO:48,SEQ ID NO:49,SEQ ID NO:50,SEQ ID NO:51,SEQ ID NO:52,SEQ ID NO:53,SEQ ID NO:54,SEQ ID NO:55,SEQ ID NO:56,SEQ IDNO:57,SEQ ID NO:58,SEQ ID NO:59,SEQ ID NO:60,SEQ ID NO:61,SEQ ID NO:62,SEQ ID NO:63,SEQ ID NO:64,SEQ ID NO:65,SEQ ID NO:66,SEQ ID NO:67,SEQ ID NO:68,SEQ ID NO:69,SEQ ID NO:70,SEQ IDNO:71,SEQ ID NO:72,SEQ ID NO:73,SEQ ID NO:74,SEQ ID NO:75,SEQ ID NO:76,SEQ ID NO:77,SEQ ID NO:78,SEQ ID NO:79,SEQ ID NO:80,SEQ ID NO:81,SEQ ID NO:82,SEQ ID NO:83,SEQ ID NO:84,SEQ IDNO:85,SEQ ID NO:86,SEQ ID NO:87,SEQ ID NO:88,SEQ ID NO:89,SEQ ID NO:90,SEQ ID NO:91,SEQ ID NO:92,SEQ ID NO:93,SEQ ID NO:94,SEQ ID NO:95,SEQ ID NO:96,SEQ ID NO:97,SEQ ID NO:98,SEQ IDNO:99,SEQ ID NO:100,SEQ ID NO:101,SEQ ID NO:102,SEQ ID NO:103,SEQ ID NO:104,SEQ ID NO:105,SEQ ID NO:106,SEQ ID NO:107,SEQID NO:108,SEQ ID NO:109,SEQ ID NO:110,SEQ ID NO:111,SEQ ID NO:112,SEQ ID NO:113,或SEQ ID NO:114。
在一个令人感兴趣的实施方式中,所述氨基酸序列与SEQ ID NO:2到SEQ ID NO:114的任一序列的氨基酸1到18具有最多5个氨基酸(例如5个氨基酸)的不同,例如最多4个氨基酸(例如4个氨基酸),例如最多3个氨基酸(例如3个氨基酸),特别是最多2个氨基酸(例如2个氨基酸),例如最多1个氨基酸的不同。
优选地,本发明的多肽包括SEQ ID NO:2到SEQ ID NO:114的任一序列的氨基酸序列;或其具有抗微生物活性的片段。
术语“SEQ ID NO:2到SEQ ID NO:114的任一序列”是指SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:4,或SEQ ID NO:5到SEQ ID NO:114的任一序列。
组成本发明的多肽的氨基酸可以独立地选自D或L型。
本发明的多肽可以是人工变体,其包括并优选由这样的氨基酸序列组成:该氨基酸序列与SEQ ID NO:2到SEQ ID NO:114的任一序列的氨基酸1到18相比,具有最多3个,例如最多2个,如最多1个氨基酸的置换、缺失和/或插入。这样的人工变体可以通过本领域已知的标准技术来构建,例如通过对包含SEQ ID NO:2到SEQ ID NO:114的任一序列的氨基酸1到18所示的氨基酸序列的多肽进行定点/随机诱变。在本发明的一个实施方式中,氨基酸改变从性质而言是微小的,即其是:不显著影响蛋白质的折叠和/或活性的保守性的氨基酸置换;小的缺失,通常为1到大约5个氨基酸;小的氨基或羧基末端延伸,例如氨基末端的甲硫氨酸残基;长达大约10-25个残基的小接头肽;或改变净电荷或另一功能,从而有助于纯化的小段延伸,诸如多组氨酸序列段(poly-histidine tract)、抗原性表位、或结合域。
保守性置换的例子在下面各组内:碱性氨基酸(精氨酸、赖氨酸和组氨酸)、酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水性氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸和甲硫氨酸)、芳香族氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)、和小氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、和苏氨酸)。一般不改变特异活性的氨基酸置换是本领域已知的,例如H.Neurath和R.L.Hill在The Proteins中所述(1979,Academic Press,New York)。最常发生的取代是Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu、和Asp/Gly,以及上述反向的置换。
在一个令人感兴趣的实施方式中,所述氨基酸改变具有改变多肽的物理化学特性的性质。例如,氨基酸改变可提高多肽的热稳定性、改变底物特异性、改变最佳pH等等。
在另一个实施方式中,所述氨基酸改变是在SEQ ID NO:2到SEQ ID NO:114的任一序列的氨基酸1到18所示的氨基酸序列的第一个氨基酸(赖氨酸)之后插入小氨基酸(例如甘氨酸,丙氨酸,丝氨酸或苏氨酸)。
N-末端延伸
本发明的多肽的N-末端延伸可合适地由1到50个氨基酸,优选2-20个氨基酸,特别是3-15个氨基酸组成。在一个实施方式中,N-末端肽延伸不含有Arg(R)。在另一个实施方式中,N-末端延伸包含将在下文进一步定义的kex2或类kex2切割位点。在一个优选的实施方式中,N-末端延伸是包含至少两个Glu(E)和/或Asp(D)氨基酸残基的肽,例如包含下列序列之一的N-末端延伸:EAE,EE,DE和DD。
Kex2位点
Kex2位点(参见例如Methods in Enzymology Vol185,D.Goeddel编,Academic Press Inc.(1990),San Diego,CA,“Gene Expression Technology”)和类Kex2位点是存在于某些蛋白质的前肽编码区域和成熟区域之间的di-basic的识别位点(即切割位点)。
在某些实例中,kex2位点或类kex2位点的插入已被证明可促进前肽切割位点处的正确的内肽酶加工,从而使蛋白质分泌水平提高。
在本发明的条件下,kex2位点或类kex2位点的插入使得在N-末端延伸中的特定位置发生切割成为可能,从而得到与SEQ ID NO:2到SEQ ID NO:114的任一序列的氨基酸1到18所示的成熟多肽相比得以延伸的抗微生物多肽。
融合多肽
本发明的多肽还包括融合多肽或可切割的融合多肽,其中另一多肽被融合到本发明的多肽或其片段的N-末端或C-末端。融合多肽可通过将编码另一多肽的核苷酸序列(或其部分)与本发明的核苷酸序列(或其部分)融合来产生。用于产生融合多肽的技术在本领域是已知的,包括连接编码多肽的编码序列,使得它们处于同一读码框中且使得融合多肽的表达在相同启动子和终止子的控制之下。
多核苷酸和核苷酸序列
本发明还涉及具有编码本发明的多肽的核苷酸序列的多核苷酸。具体地,本发明涉及由编码本发明的多肽的核苷酸序列组成的多核苷酸。由于遗传密码的简并性,本领域技术人员很容易认识到,对本发明的每一种多肽可以制备编码它的数种核苷酸序列。编码本发明的多肽的氨基酸密码子由哪些核苷酸组成是本领域中众所周知的。
本发明还涉及多核苷酸,其编码SEQ ID NO:2到SEQ ID NO:114的任一序列所示的氨基酸序列的片段,所述片段具有抗微生物活性。所述多核苷酸的子序列是一个或多个核苷酸已从5’和/或3’末端缺失的核苷酸序列。
所述核苷酸序列可以这样得到:通过基因工程中使用的标准克隆方法将核苷酸序列从一个位置重新置于另一不同位置,在该位置上此核苷酸序列将被复制。克隆方法可包括切出和分离包含编码所述多肽的核苷酸序列的所希望片段,将该片段插入载体分子,和将该重组载体纳入宿主细胞,在该细胞中所述核苷酸序列多个拷贝或克隆将被复制。所述核苷酸序列可以是基因组、cDNA、RNA、半合成和合成来源,或上述的任意组合。
对编码本发明的多肽的核苷酸序列进行修饰可能是合成这样的多肽所必需的:该多肽包含这样的氨基酸序列,其与SEQ ID NO:2到SEQ ID NO:114的任一序列的氨基酸1到18相比具有至少一个置换,缺失和/或插入。这样的人工变体可能以某些经过工程改造的方式相异于分离自其天然来源的多肽,例如特异性活性、热稳定性、最适pH等相异的变体。
对本领域技术人员而言显而易见的是,这样的修饰可以在分子功能的关键区域之外进行,而仍然得到活性多肽。有的氨基酸残基对于由本发明的核苷酸序列所编码的多肽的活性来说是至关重要的,因此优选不被修饰例如置换,这样的氨基酸残基可根据本领域的已知程序诸如通过定点诱变或丙氨酸扫描诱变(alanine-scanning mutagenesis)(例如参见Cunningham和Wells,1989,Science244:1081-1085)来鉴定。在后一种技术中,在分子中每一带正电荷残基处引入突变,然后测试所得到的突变分子的抗微生物活性,以鉴定对分子活性至关重要的氨基酸残基。底物-酶相互作用位点也可通过三维结构分析来确定,其中三维结构可由诸如核磁共振分析、晶体学、或光亲和标记等技术来测定(例如参见de Vos等,1992,Science255:306-312;Smith等,1992,Journal of Molecular Biology224:899-904;Wlodaver等,1992,FEBS Letters309:59-64)。
另外,编码本发明的多肽的核苷酸序列还可以通过引入这样的核苷酸取代来修饰,这些取代不会产生该核苷酸序列所编码的多肽的另一种氨基酸序列,而是对应于要用来生产酶的宿主生物的密码子用法。
利用本领域已知的任何方法进行定点诱变,可以将突变导入核苷酸序列中,使一个核苷酸被另一个核苷酸所替换。特别有用的是利用具有目标插入片段的超螺旋双链DNA载体和两个包含所需突变的合成引物的方法。各自与载体的相对链互补的寡核苷酸引物借助Pfu DNA聚合酶在温度循环过程中延伸。掺入引物后,生成包含错列缺口的突变质粒。在温度循环后,用对甲基化和半甲基化DNA特异性的DpnI处理产物以消化亲代DNA模板并选择包含突变的合成的DNA。还可以使用本领域已知的其它方法。关于核苷酸取代的一般性描述参见,例如,Ford等,1991,Protein Expression andPurification2:95-107。
核酸构建体
本发明还涉及包含可操作性连接到一种或多种控制序列上的本发明的核苷酸序列的核酸构建体,所述控制序列在与控制序列相容的条件下于合适的宿主细胞中指导编码序列的表达。
可以用多种方式操作编码本发明的多肽的核苷酸序列以便于所述多肽的表达。在核苷酸序列插入载体之前对其进行操作可以是有利的或必需的,这取决于表达载体。利用重组DNA方法修饰核苷酸序列的技术是本领域公知的。
控制序列可以是合适的启动子序列,它是为了核酸序列的表达而被宿主细胞识别的核酸序列。启动子序列含有介导多肽表达的转录控制序列。启动子可以是在所选宿主细胞中显示转录活性的任何核苷酸序列,包括突变型、截短型或杂合型启动子,并可从编码与宿主细胞同源或异源的胞外或胞内多肽的基因中获得。
用于指导本发明核酸构建体转录,尤其是在细菌宿主细胞中转录的适当启动子的实例,有从大肠杆菌lac操纵子、天蓝色链霉菌(Streptomycescoelicolor)琼脂酶基因(dagA)、枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶基因(sacB)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)α-淀粉酶基因(amyL)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)生麦芽糖淀粉酶基因(amyM)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)α-淀粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢杆菌青霉素酶基因(penP)、枯草芽孢杆菌xylA和xylB基因、和原核生物的β-内酰胺酶基因(Villa-Kamaroff等,1978,Proceedings of the National Academy of SciencesUSA75:3727-3731)中获得的启动子,以及tac启动子(DeBoer等,1983,Proceedings of the National Academy of Sciences USA80:21-25)。还有“Usefulproteins from recombinant bacteria”,Scientific American,1980,242:74-94及Sambrook等,1989,同上中描述的其它启动子。
用于在丝状真菌宿主细胞中指导本发明核酸构建体转录的适当启动子的实例有从米曲霉(Aspergillus oryzae)TAKA淀粉酶、米赫根毛霉(Rhizomucormiehei)天冬氨酸蛋白酶、黑曲霉(Aspergillus niger)中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉(Aspergillus awamori)葡糖淀粉酶(glaA)、米赫根毛霉脂肪酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉磷酸丙糖异构酶、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)乙酰胺酶,和尖孢镰孢(Fusarium oxysporum)胰蛋白酶样蛋白酶(WO96/00787),以及NA2-tpi启动子(来自黑曲霉中性α-淀粉酶和米曲霉磷酸丙糖异构酶基因的杂合启动子);及其突变的、截短的、和杂合的启动子。
在酵母宿主中,有用的启动子是从酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)烯醇化酶(ENO-1)、酿酒酵母半乳糖激酶(GAL1)、酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH2/GAP)和酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶基因中所获得的。其它用于酵母宿主细胞的有用启动子在Romanos等,1992,Yeast8:423-488中有描述。
控制序列也可以是适当的转录终止子序列,即由宿主细胞识别来终止转录的序列。终止子序列可操作连接于编码多肽的核苷酸序列的3'端。在所选择的宿主细胞中起作用的任何终止子都可用于本发明。
优选用于丝状真菌宿主细胞的终止子是从米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、构巢曲霉邻氨基苯甲酸(anthranilate)合酶、黑曲霉α-葡糖苷酶、和尖孢镰孢胰蛋白酶样蛋白酶的基因中获得的。
优选用于酵母宿主细胞的终止子是从酿酒酵母烯醇化酶、酿酒酵母细胞色素C(CYC1)、和酿酒酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因中获得的。还有Romanos等,1992,同上中描述的用于酵母宿主细胞的其它有用终止子。
控制序列还可以是适当的前导序列,即对宿主细胞翻译重要的mRNA非翻译区。前导序列可操作连接于编码多肽的核苷酸序列的5'端。在所选择的宿主细胞中起作用的任何前导序列都可用于本发明。
优选地用于丝状真菌宿主细胞的前导序列是从米曲霉TAKA淀粉酶和构巢曲霉磷酸丙糖异构酶基因中获得的。
优选地用于酵母宿主细胞的前导序列是从酿酒酵母烯醇化酶(ENO-1)、酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶、酿酒酵母α-因子、和酿酒酵母乙醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH2/GAP)基因中获得的。
控制序列还可以是聚腺苷酸化序列,即可操作连接于核苷酸序列3'端的序列,当转录时可由宿主细胞识别为将聚腺苷残基添加到转录的mRNA上的信号。在所选择的宿主细胞中起作用的任何聚腺苷酸化序列都可用于本发明。
优选地用于丝状真菌宿主细胞的聚腺苷酸化序列是从米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、尖孢镰孢胰蛋白酶样蛋白酶、和黑曲霉α-葡糖苷酶的基因获得的。
Guo和Sherman等,1995,Molecular Cellular Biology15:5983-5990中描述了对酵母宿主细胞有用的聚腺苷酸化序列。
控制序列还可以是信号肽编码区,它编码的氨基酸序列连接于多肽的氨基末端并指导编码的多肽进入细胞分泌途径。核苷酸序列的编码序列的5'端可固有的包含信号肽编码区,它在翻译读码框中与编码分泌多肽的编码区段天然连接。或者,编码序列的5'端可以包含对编码序列是外来的信号肽编码区。如果编码序列天然不含信号肽编码区,则可能需要外来的信号肽编码区。或者,可能仅由外来的信号肽编码区替换天然信号肽编码区以便增强多肽的分泌。然而,指导表达的多肽进入所选择宿主细胞分泌途径的任何信号肽编码区均可用于本发明。
用于细菌宿主细胞有效的信号肽编码区有从芽孢杆菌NCIB11837的生麦芽糖淀粉酶、嗜热脂肪芽孢杆菌的α-淀粉酶、地衣芽孢杆菌的枯草杆菌蛋白酶、地衣芽孢杆菌的β-内酰胺酶、嗜热脂肪芽孢杆菌的中性蛋白酶类(nprT、nprS、nprM)、和枯草芽孢杆菌的prsA基因获得的信号肽编码区。还有Simonen和Palva,1993,Microbiological Reviews57:109-137中描述的其它信号肽。
对于丝状真菌宿主细胞有效的信号肽编码区是从米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、米赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶、Humicola insolens纤维素酶和柔毛腐质霉(Humicola lanuginosa)脂肪酶的基因获得的信号肽编码区。
对于酵母宿主细胞有用的信号肽是从酿酒酵母α-因子和酿酒酵母转化酶的基因获得的。Romanos等,1992,同上中描述了的其它有用的信号肽编码区。
控制序列还可以是前肽(propeptide)编码区,它编码位于多肽氨基末端的氨基酸序列。所得的多肽称为酶原(proenzyme)或多肽原(propolypeptide)(或有时候称作酶原(zymogen))。多肽原一般是没有活性的,且可通过前肽的催化或自催化切割从多肽原转变成成熟有活性的多肽。前肽编码区可从枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprE)、枯草芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT)、酿酒酵母α-因子、米赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶、和嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)漆酶(WO95/33836)的基因获得。
当信号肽和前肽区都存在于多肽的氨基末端时,前肽区与多肽氨基末端相邻,而信号肽区于前肽区的氨基末端相邻。
还可能需要加上调节序列以使多肽的表达可以相对于宿主细胞的生长进行调节。调节系统的实例是能响应化学或物理刺激(包括调节化合物的存在)而引起基因表达的开启或关闭的那些。在原核系统中,调节系统包括lac、tac、和trp操纵子系统。在酵母中,可使用ADH2系统或GAL1系统。在丝状真菌中,可使用TAKAα-淀粉酶启动子、黑曲霉葡糖淀粉酶启动子和米曲霉葡糖淀粉酶启动子作为调节序列。调节序列的其它实例是那些允许基因扩增的调节序列。在真核系统中,这些包括在氨甲喋呤存在时扩增的二氢叶酸还原酶基因,以及有重金属存在时扩增的金属硫蛋白基因。在这些情况中,编码多肽的核苷酸序列将与调节序列可操作连接。
表达载体
本发明还涉及包含本发明的核酸构建体的重组表达载体。可以将上述的各种核苷酸和控制序列连接到一起以产生重组表达载体,此重组表达载体可包括一个或多个便利的限制性位点使得在这些位点可插入或替换编码多肽的核苷酸序列。或者,可将核苷酸序列或含有序列的核酸构建体插入适当的表达载体,来表达本发明的核苷酸序列。构建表达载体时,将编码序列置于载体中,使编码序列与适当的表达控制序列可操作的连接。
重组表达载体可以是可方便的接受重组DNA操作并能引起核苷酸序列表达的任何载体(例如质粒或病毒)。载体的选择通常取决于载体与要引入此载体的宿主细胞之间的相容性。载体可以是线性的或闭合环状的质粒。
载体可以是自主复制载体,也就是说载体可以以染色体外实体的形式存在,其复制独立于染色体的复制,例如质粒、染色体外元件、微型染色体、或人工染色体。
载体可包含任何用于确保自我复制的手段。或者,载体可以是这样的一种载体,它在导入宿主细胞后,整合到基因组中并与整合的染色体一起复制。此外,可使用单一载体或质粒,或是一起含有待引入宿主细胞基因组的全部DNA的两种或多种载体或质粒,或者转座子。
本发明载体优选包含一种或多种选择标记,所述选择标记允许易于选择转化的的等细胞。选择标记是一种基因,其产物有助于产生杀生物(biocide)或病毒抗性、重金属抗性、营养缺陷型变成原养型等等。
细菌选择标记的实例有来自枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌的dal基因,或者赋予抗生素抗性诸如氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素或四环素抗性的标记。适于酵母宿主细胞的标记有ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1和URA3。在丝状宿主细胞中使用的选择标记包括但不限于:amdS(乙酰胺酶)、argB(鸟氨酸氨甲酰基转移酶)、bar(膦丝菌素乙酰基转移酶)、hpgB(潮霉素磷酸转移酶)、niaD(硝酸还原酶)、pyrG(乳清苷-5'-磷酸脱羧酶)、sC(硫酸腺苷酰转移酶(sulfate adenyltransferase))、trpC(邻氨基苯甲酸合酶)及其等价物。
优选用于曲霉属细胞的是构巢曲霉或米曲霉的amdS和pyrG基因以及吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)的bar基因。
本发明的载体优选地含有这样的元件,其允许载体向宿主细胞基因组中的稳定整合或载体在细胞中不依赖于细胞基因组的自主复制。
对于向宿主细胞基因组中的整合而言,载体可依赖编码多肽的核苷酸序列,或用于通过同源或非同源重组使载体稳定地整合到基因组中的载体的任何其它元件。或者,载体可以含有额外的核苷酸序列用于引导通过同源重组向宿主细胞基因组中整合。所述额外的核苷酸序列使载体能在染色体的精确位置整合到宿主细胞基因组中。为了增加在精确位置整合的可能性,整合元件优选地应含有足够数量的核苷酸,如100-1,500个碱基对,优选地400-1,500个碱基对,最优选地800-1,500个碱基对,这些核苷酸与相应靶序列高度同源,以增加同源重组的概率。整合元件可以是与宿主细胞基因组中的靶序列同源的任何序列。另外,整合元件可以是非编码的或编码的核酸序列。另一方面,可以通过非同源重组将载体整合到宿主细胞的基因组中。
对于自主复制而言,载体还可以包含使载体能在所述宿主细胞中自主复制的复制起点。细菌复制起点的实例有:允许在大肠杆菌中复制的质粒pBR322、pUC19、pACYC177和pACYC184的复制起点,以及允许在芽孢杆菌中复制的pUB110、pE194、pTA1060和pAMβ1的复制起点。用于酵母宿主细胞的复制起点的实例有2微米(micro)复制起点、ARS1、ARS4、ARS1与CEN3的组合、以及ARS4与CEN6的组合。复制起点可以具有突变,使其在宿主细胞内的作用成为温度敏感型的(见,例如,Ehrlich,1978,Proceedings of the National.Academy of Sciences USA75:1433)。
可以将多于一个拷贝的本发明的核苷酸序列插入宿主细胞中以提高该基因产物的生产。通过将核苷酸序列的至少一个额外拷贝整合到宿主细胞基因组中,或者将核酸序列包含有可扩增的选择性标记基因,通过在合适的选择剂的存在下培养细胞,能筛选出含有扩增拷贝的选择性标记基因、从而也就含有所述核酸序列的更多拷贝的细胞,由此可以获得核苷酸序列拷贝数的增加。
用于连接上述元件以构建本发明重组表达载体的方法是本领域技术人员所熟知的(例如参见Sambrook等,1989,同上)。
宿主细胞
本发明还涉及包含本发明的核酸构建体的重组宿主细胞,其有利地用于所述多肽的重组生产。将含有本发明的核苷酸序列的载体引入宿主细胞,以使载体作为染色体整合体或作为自我复制的染色体外载体而维持,如前述那样。
宿主细胞可以是单细胞微生物,例如原核生物,或非单细胞微生物,例如真核生物。
有用的单细胞微生物有细菌细胞,诸如革兰氏阳性细菌,包括但不限于芽孢杆菌属(Bacillus)细胞,例如嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌(Bacillus brevis)、环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)、Bacillus clausii、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、灿烂芽孢杆菌(Bacilluslautus)、迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、和苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis);或链霉菌属(Streptomyces)细胞,例如浅青紫链霉菌(Streptomyces lividans)和鼠灰链霉菌(Streptomyces murinus),或者革兰氏阴性细菌,诸如大肠杆菌和假单胞菌菌种(Pseudomonas sp.)。在一个优选的方面,细菌宿主细胞是迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、或枯草杆菌细胞。在另一个优选的方面,芽孢杆菌属细胞是嗜碱的(alkalophilic)芽孢杆菌。
将载体导入细菌宿主细胞可通过例如原生质体转化(参见例如Chang和Cohen,1979,Molecular General Genetics168:111-115)、利用感受态细胞(参见例如Young和Spizizen,1961,Journal of Bacteriology81:823-829;或Dubnau和Davidoff-Abelson,1971,Journal of Molecular Biology56:209-221)、电穿孔(参见例如Shigekawa和Dower,1988,Biotechniques6:742-751)、或接合(参见例如Koehler和Thorne,1987,Journal of Bacteriology169:5771-5278)来实现。
宿主细胞可以是真核细胞,诸如哺乳动物、昆虫、植物、或真菌细胞。
在一个优选的方面,宿主细胞是真菌细胞。“真菌”在用于本文时包括子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)、壶菌门(Chytridiomycota)、和接合菌门(Zygomycota)(如Hawksworth等,在《Ainsworth and Bisby’sDictionary of The Fungi》,第八版,1995,CAB International,University Press,Cambridge,UK中所定义的),以及卵菌门(Oomycota)(如Hawksworth等,1995,同上第171页中所引用的)和所有有丝分裂孢子真菌(Hawksworth等,1995,同上)。
在一种更优选的实施方案中,真菌宿主细胞是酵母细胞。在此所用的“酵母”包括产子囊酵母(ascosporogenous yeast)(内孢霉目(Endomycetales))、产担子孢子囊酵母(basidiosporogenous yeast)和属于半知菌类(Fungi Imperfecti)(芽生菌纲(Blastomycetes))的酵母。由于酵母的分类在将来可能改变,对于本发明的目的而言,将如Biology and Activities of Yeast Skinner,F.A.,Passmore,S.M.和Davenport,R.R.编,Soc.App.Bacteriol.Symposium Series No.9,1980所述定义酵母。
在一个更优选的方面,酵母宿主细胞是假丝酵母属(Candida)、汉逊氏酵母属(Hansenula)、克鲁维氏酵母属(Kluyveromyces)、毕赤氏酵母属(Pichia)、糖酵母属(Saccharomyces)、裂殖糖酵母属(Schizosaccharomyces)、或Yarrowia属细胞。
在一个最优选的方面,酵母宿主细胞是卡尔斯伯糖酵母(Saccharomycescarlsbergensis)、酿酒酵母、糖化糖酵母(Saccharomyces diastaticus)、Saccharomyces douglasii、克鲁弗糖酵母(Saccharomyces kluyveri)、诺地酵母(Saccharomyces norbensis)、或卵形糖酵母(Saccharomyces oviformis)细胞。在另一个最优选的方面,酵母宿主细胞是乳克鲁维氏酵母(Kluyveromyces lactis)细胞。在另一个最优选的方面,酵母宿主细胞是Yarrowia lipolytica细胞。
在另一个更优选的方面,真菌宿主细胞是丝状真菌细胞。“丝状真菌”包括真菌门(Eumycota)和卵菌门亚门的所有丝状体(如Hawksworth等,1995,同上中所定义的)。丝状真菌通常是以由壳多糖、纤维素、葡聚糖、壳聚糖(chitosan)、甘露聚糖、及其他复合多糖组成的菌丝壁为特征。营养生长表现为菌丝伸长,碳代谢是专性需氧的。相反,酵母诸如酿酒酵母的营养生长表现为单细胞菌体的出芽而碳代谢可以是发酵性的。
在一个更优选的实施方式中,丝状真菌宿主细胞是Acremonium属、曲霉属、镰孢属(Fusarium)、腐质霉属(Humicola)、毛霉属(Mucor)、毁丝霉属(Myceliophthora)、脉孢霉菌(Neurospora)、青霉属(Penicillium)、梭孢壳属(Thielavia)、Tolypocladium属或木霉属(Trichoderma)的细胞。
在一个最优选的实施方案中,丝状真菌宿主细胞是泡盛曲霉、臭曲霉(Aspergillus foetidus)、日本曲霉(Aspergillus japonicus)、构巢曲霉、黑曲霉、或米曲霉细胞。在另一个最优选的方面,丝状真菌宿主细胞是杆孢状镰孢(Fusarium bactridioides)、Fusarium cerealis、Fusarium crookwellense、大刀镰孢(Fusarium culmorum)、禾谷镰孢(Fusarium graminearum)、禾赤镰孢(Fusarium graminum)、异孢镰孢(Fusarium heterosporum)、合欢木镰孢(Fusarium negundi)、尖孢镰孢(Fusarium oxysporum)、多枝镰孢(Fusariumreticulatum)、玫瑰色镰孢(Fusarium roseum)、接骨木镰孢(Fusariumsambucinum)、肽色镰孢(Fusarium sarcochroum)、拟分枝孢镰孢(Fusariumsporotrichioides)、硫色(Fusarium sulphureum)、Fusarium torulosum、Fusariumtrichothecioides或Fusarium venenatum细胞。在一个进一步最优选的实施方式中,所述丝状真菌亲本细胞是Fusarium venenatum(Nirenberg sp.nov.)细胞。在另一个最优选的实施方式中,所述丝状真菌宿主细胞是Humicolainsolens、柔毛腐质霉(Humicola lanuginosa)、米赫毛霉、嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)、粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)、产紫青霉(Penicillium purpurogenum)、Thielavia terrestris、Trichoderma harzianum、康宁木霉(Trichoderma koningii)、Trichoderma longibrachiatum、Trichodermareesei或绿色木霉(Trichoderma viride)细胞。
真菌细胞可以以本身已知的方式,通过涉及原生质体形成、原生质体转化、和细胞壁再生的过程进行转化。EP238023和Yelton等,1984,Proceedingsof the National Academy of Sciences USA81:1470-1474中描述了适合曲霉属宿主细胞转化的过程。Malardier等,1989,Gene78:147-159和WO96/00787中描述了适合转化镰孢属物种的方法。可利用Becker和Guarente在Abelson,J.N.和Simon,M.I.编的《Guide to Yeast Genetics and MolecularBiology》,Methods in Enzymology,Vol.194,pp182-187,Academic Press公司,New York;Ito等,1983,Journal of Bacteriology153:163;及Hinnen等,1978,Proceedings of the National Academy of Sciences USA75:1920中所描述的程序转化酵母。
生产方法
本发明还涉及生产本发明的多肽的方法,包括(a)在有助于生产该多肽的条件下培养宿主细胞;和(b)回收该多肽。
在本发明的生产方法中,用本领域中已知的方法在适于多肽产生的营养培养基中培养细胞。例如,可在实验室或工业发酵罐中通过摇瓶培养、小规模或大规模发酵(包括连续发酵、分批发酵、分批补料发酵或固态发酵)培养细胞,这在合适的培养基中和使多肽能被表达和/或分离的条件下进行。用本领域中已知的方法,在含有碳源和氮源和无机盐的合适营养培养基中进行培养。合适的培养基可从商业供应商得到或根据公开的组成(例如,于美国典型培养物保藏中心的目录中)制备。如果多肽分泌到营养培养基中,则可直接从培养基中回收该多肽。如果该多肽不被分泌,则可从细胞裂解产物中回收。
所述多肽可使用本领域中已知的对该多肽特异性的方法检测。这些检测方法可包括特异性抗体的使用、酶产物的形成或酶底物的消失。例如,如本文所述可使用酶测定法确定多肽的活性。
可以通过本领域已知的方法回收得到的多肽。例如,可以通过常规方法,包括但不限于离心、过滤、抽提、喷雾干燥、蒸发或沉淀,将多肽从营养培养基中回收出来。
本发明的多肽可通过本领域中已知的多种方法进行纯化,所述方法包括但不限于层析(例如,离子交换、亲和、疏水、层析聚焦和大小排阻)、电泳方法(例如,制备型等电聚焦)、差异溶解度法(例如,硫酸铵沉淀)、SDS-PAGE或萃取(见,例如,Protein Purification J.-C.Janson和Lars Ryden编,VCHPublishers,New York,1989)。
植物
本发明还涉及转基因植物、植物部分或者植物细胞,其被编码本发明的具有抗微生物活性的多肽的核苷酸序列所转化,从而以可回收的量表达和生产该生物活性物质的。该多肽可以从该植物或植物部分中回收。或者,含有该重组多肽的植物或植物部分本身可以用来提高食品或饲料的质量,例如,用来改善营养价值、适口性和流变学性质,或破坏抗营养因子(antinutritionalfactor)。回收的多肽、植物或植物部分还可以用来改善或改变动物或家畜的消化菌群(digestive flora)。
所述转基因植物可以是双子叶的(双子叶植物)或单子叶的(单子叶植物)。单子叶植物的例子有:禾本科的,禾草类(grasses),例如早熟禾(blue grass,Poa);牧草(forage grass),例如狐茅属(festuca)和黑麦草属(lolium);寒地型牧草(temperate grass),例如剪股颖属(Agrotis);和谷类(cereals),如小麦、燕麦、黑麦、大麦、稻、高粱和玉米(maize)(玉米(corn))。
双子叶植物的例子有:烟草;马铃薯;甜菜;豆类(legumes),例如羽扇豆(lupins);豌豆;菜豆(bean)和大豆,和十字花科(Brassicaceae)植物,例如花椰菜、油菜籽(rape seed)和与之亲缘关系紧密的模式生物拟南芥(Arabidopsis thaliana)。
植物部分的例子有茎、愈伤组织、叶、根、果实、种子和块茎。另外,特定的植物组织,例如叶绿体、质外体、线粒体、液泡、过氧化物酶体和细胞质,都被认为是植物部分。另外,任何植物细胞,无论来自什么组织,都被认为是植物部分。
这些植物、植物部分和植物细胞的后代也被包括在本发明的范围之内。
所述表达本发明的多肽的转基因植物或植物细胞可以根据本领域已知的方法构建。简单地说,所述植物或植物细胞这样构建的:将一个或多个编码本发明的多肽的表达构建体并入植物宿主的基因组,并使所得的修饰植物或植物细胞增殖形成转基因植物或植物细胞。
方便地,所述表达构建体可为核酸构建体,其包含编码本发明的多肽的核苷酸序列、该序列可操作地连接于在所选植物或植物部分中表达该核苷酸序列所需的合适的调控序列。另外,该表达构建体还可以包括:可选择的标记,可用于鉴定其中已经整合了表达构建体的宿主细胞;以及将该构建体导入所述的植物所需的DNA序列(后者取决于要使用的DNA导入方法)。
如启动子、终止子序列,以及可选的信号或转运序列等调节序列的选择,是根据例如想要在何时、何处、怎样表达该多肽而决定的。例如,编码本发明的多肽的基因的表达可以是组成型或诱导型的,或者可为发育特异性、阶段特异性或组织特异性的,而且基因产物可以被靶向于具体的组织或者植物部分例如种子或叶。对调节序列的描述有例如Tague等,1988,PlantPhysiology86:506。
对于组成性表达,可以使用35S-CaMV启动子(Franck等,1980.Cell21:285-294)。器官特异性的启动子可以是,例如,来自存储性贮藏组织(storagesink tissues)例如种子、马铃薯的块茎及果实的启动子(Edwards和Coruzzi,1990,Ann.Rev.Genet.24:275-303),或者来自代谢性贮藏组织(metabolic sinktissues),例如分生组织的启动子(Ito等,1994,Plant Mol.Biol.24:863-878);或者是种子特异性的启动子,例如来自水稻的谷蛋白、谷醇溶蛋白、球蛋白或白蛋白启动子(Wu等,1998,Plant and Cell Physiology39:885-889),来自蚕豆(Vicia faba)的豆球蛋白B4和未知的种子蛋白基因的蚕豆启动子(Conrad等,1998,Journal of Plant Physiology152:708-711),来自一种种子油体蛋白的启动子(Chen等,1998,Plant and Cell Physiology39:935-941),来自欧洲油菜(Brassica napus)的贮存蛋白napA启动子,或任何其他本领域已知的种子特异性的启动子,例如WO91/14772所描述的。另外,该启动子还可以是叶特异性的启动子,例如水稻或西红柿的rbcs启动子(Kyozuka等,1993,PlantPhysiology102:991-1000);小球藻病毒腺嘌呤甲基转移酶基因启动子(Mitra和Higgins,1994,Plant Molecular Biology26:85-93),或来自水稻的aldP基因启动子(Kagaya等,1995,Molecular and General Genetics248:668-674);或为创伤诱导的启动子例如马铃薯pin2启动子(Xu等,1993,Plant MolecularBiology22:573-588)。
也可以使用启动子增强元件来获得在植物中酶的更高表达。例如,启动子增强元件可以是位于启动子和编码本发明的多肽的核苷酸序列之间的内含子。例如Xu等,1993(同上)公开了水稻肌动蛋白1基因的第一个内含子增强表达的用途。
所述可选择的标记基因和表达构建体的任何其他部分都可以从本领域可得到的那些中进行选择。
根据本领域已知的常规技术将该核酸构建体整合入植物基因组,所述技术包括农杆菌(Agrobacterium)介导的转化、病毒介导的转化、显微注射、粒子轰击、生物射弹转化和电穿孔(Gasser等,1990,Science244:1293;Potrykus,1990,Bio/Technology8:535;Shimamoto等,1989,Nature338:274)。
目前,根瘤农杆菌(Agrobacterim tumefaciens)介导的基因转移是产生转基因双子叶植物的优选方法(见Hooykas和Schilperoort,1992,Plant MolecularBiology19:15-38的综述)。不过该方法也可以用于转化单子叶植物,尽管单子叶植物一般优选别的转化方法。目前,产生转基因单子叶植物的优选方法是粒子(被用于转化的DNA所包被的极小的金或钨粒子)轰击胚愈伤组织(embroynic calli)或发育中的胚(Christou,1992,Plant Journal2:275-281;Shimamoto,1994,Current Opinion Biotechnology5:158-162;Vasil等,1992,Bio/Technology10:667-674)。另外一种可选的转化单子叶植物的方法是基于原生质体转化,如Omirulleh等,1993,Plant Molecular Biology21:415-428所述。
转化以后,选择并入了表达构建体的转化子,并根据本领域熟知的方使其再生为完整植株。
本发明还涉及产生本发明的多肽的方法,其包括(a)在有利于生产本发明的具有抗微生物活性的多肽的条件下,培养包含编码该多肽的基因的转基因植物或植物细胞;和(b)回收该多肽。
组合物
在进一步的一个方面中,本发明涉及包含本发明的抗微生物多肽的组合物,例如药物组合物。
该组合物可以含有一种本发明的多肽作为主要多肽组分,例如单组分组合物。或者,该组合物可以包含多种酶活性,例如氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维素酶、几丁质酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡萄糖苷酶、β-葡萄糖苷酶、卤素过氧化物酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、氧化酶、溶果胶酶、肽谷氨酰胺酶、过氧化物酶、肌醇六磷酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶或木聚糖酶。
所述组合物还可以包含另一药学活性剂,例如附加的杀生物剂(biocidalagent),例如另一种显示如上述定义的抗微生物活性的抗微生物多肽。所述杀生物剂可以是本领域所知的抗生素。抗生素的种类包括青霉素类(penicillins),例如青霉素G,青霉素V,甲氧苯青霉素(methicillin),苯唑青霉素,羧苄青霉素,乙氧萘青霉素,氨苄青霉素,等等;青霉素类结合β-内酰胺酶抑制剂,头孢菌素,例如头孢克洛,头孢唑啉,头孢呋辛,拉氧头孢等等;碳青霉烯类;单菌霉素(monobactams);氨基糖苷类;四环素类;大环内酯类;林可霉素类;多粘菌素类;磺胺类;喹诺酮类;氯霉素cloramphenical;甲硝哒唑;壮观霉素;trimethoprim;万古霉素等。所述杀生物剂还可以是抗真菌剂(anti-mycotic agent),包括多烯类化合物,例如两性霉素B,制霉菌素;5-flucosyn;以及唑类,例如咪康唑(miconazol),酮康唑(ketoconazol),伊曲康唑和氟康唑(fluconazol)。
在一个实施方式中所述杀生物剂是非酶的化学剂。在另一个实施方式中所述杀生物剂是非多肽的化学剂。
该杀生物剂可能具有下面的能力:在20℃下,在该杀生物剂的25%(w/w)水溶液,优选10%(w/w)水溶液,更优选5%(w/w)水溶液,甚至更优选1%(w/w)水溶液,最优选0.5%(w/w)水溶液,特别是0.1%(w/w)水溶液中,温育8小时后(优选4小时后,更优选2小时后,最优选1小时后,特别是30分钟后),将大肠杆菌(DSM1576)活细胞的数目降低到1/100。
该杀生物剂还可能具有下面的能力:当其以1000ppm的浓度,优选以500ppm的浓度,更优选以250ppm的浓度,甚至更优选以100ppm的浓度,更优选以50ppm的浓度,特别是以25ppm的浓度加入时,在25℃下的微生物培养基中,可抑制大肠杆菌(DSM1576)的长出(outgrowth)24小时。
该杀生物剂还可能具有下面的能力:在20℃下,在该杀生物剂的25%(w/w)水溶液,优选10%(w/w)水溶液,更优选5%(w/w)水溶液,更优选1%(w/w)水溶液,最优选0.5%(w/w)水溶液,特别是0.1%(w/w)水溶液中,温育8小时后(优选4小时后,更优选2小时后,最优选1小时后,特别是30分钟后),将枯草芽孢杆菌(ATCC6633)活细胞的数目降低到1/100。
该杀生物剂还可能具有下面的能力:当其以1000ppm的浓度,优选以500ppm的浓度,更优选以250ppm的浓度,甚至更优选以100ppm的浓度,更优选以50ppm的浓度,特别是以25ppm的浓度加入时,在25℃下的微生物培养基中,可抑制枯草芽孢杆菌(ATCC6633)的长出24小时。
该组合物可包含合适的载体物质。该组合物还可包含合适的送递媒介物,当该组合物用作药物时,该媒介物可以将本发明的抗微生物多肽送递到希望的位点。
该组合物可以根据本领域已知的方法制备,并可以是液体或干燥组合物的形式。例如,该多肽组合物可以使颗粒或微颗粒的形式。组合物中要包含的多肽可以根据本领域已知的方法来稳定化。
下面给出了本发明的多肽组合物的优选的用途。本发明的多肽组合物的剂量和该组合物的使用条件可以根据本领域已知的方法来确定。
方法和用途
本发明还包含本发明的抗微生物多肽的各种用途。所述抗微生物多肽通常可以用于任何受到细菌、真菌、酵母或藻类污染的地方。通常,在水系统例如冷却水系统、洗衣漂洗用水,和油系统例如切削油(cutting oil),润滑剂,油田(oil field)等中有需要杀死微生物或控制微生物生长的地方。但是,本发明还可以用于已知的抗微生物组合物有用的所有用途,例如木材、胶乳(latex)、胶粘剂(adhesive)、胶水类(glue)、纸、纸板、纺织品、皮革、塑料、敛缝材料(caulking)和饲料的保护。
其他的应用包括:保存食品,饮料,化妆品如洗液(lotions),乳膏,凝胶(gel),油膏,肥皂,香波,护发剂(conditinoers),止汗剂(antiperspirants),除臭剂(deodorants),漱口剂(mouth wash),隐形眼镜(contact lens)产品,酶制剂,或食品成分。
因此,本发明的抗微生物多肽可以用作消毒剂(disinfectant),例如在痤疮(acne)、眼或口腔感染,及皮肤感染的治疗中;在止汗剂或除臭剂中;在足浴盐(foot bath salts)中;及用于隐形眼镜、硬表面、牙齿(口腔护理)、伤口、瘀伤(bruises)等等的清洁和消毒。
一般认为本发明的抗微生物多肽可用于在任何硬表面上进行清洁、消毒和抑制微生物生长。可有利地与本发明的抗微生物多肽相接触的表面的例子有例如乳制品厂、化学或药品加工厂、水净化系统、油加工厂、纸浆加工厂、水处理厂和冷却塔中所用的加工设备的表面。本发明的抗微生物多肽的使用量应该能够有效地在所述的表面上进行清洁、消毒或抑制微生物生长。
另外,认为本发明的抗微生物多肽可以有利地应用于在位清洗(cleaning-in-place,C.I.P.)系统中,用于清洁任何种类的加工设备。
本发明的抗微生物多肽还可以用在食品加工厂和任何制备或供应食品的地方,例如医院,疗养院(nursing home),及餐馆尤其是快餐厅,熟食店(delicatessens)等地方,用于清洁表面和烹饪用具。它还可以用作食品中的抗微生物剂,并且作为干酪(cheese)、水果、蔬菜及沙拉自助长条桌(salad bars)上的食物的抗微生物剂特别有用。
它还可以用作水基涂料中的防腐剂保存剂(preservation agent)或消毒剂。
本发明的抗微生物多肽还可以用于水线路的微生物控制,水的消毒,特别是用于工业用水的消毒。
本发明还涉及本发明的抗微生物多肽或组合物作为药物的用途。另外本发明的抗微生物多肽或组合物还可以用来制造药物,用于控制或抗(combating)微生物,例如真菌类生物或细菌,尤其是革兰氏阳性细菌。
本发明的抗微生物多肽或组合物还可以用作人用或兽用的抗微生物治疗或预防剂。因此,本发明的抗微生物多肽或组合物可以用于制备人用或兽用的抗微生物治疗或预防剂,用于治疗微生物感染,例如细菌或真菌感染,优选革兰氏阳性细菌感染。具体地,所述微生物感染可以与肺病相关,所述肺病包括但不限于结核,肺炎和囊性纤维化病;还可与性转播疾病相关,所述性转播疾病包括但不限于淋病(gonorrhea)和衣原体感染(chlamydia)。
本发明的组合物包含有效量的本发明的抗微生物多肽。
术语“有效量”在本文中指包含SEQ ID NO:2到SEQ ID NO:114的任一序列的氨基酸1到18所示的氨基酸序列的抗微生物多肽,或其片段或变体的足以抑制所述微生物的生长的量。
本发明还涉及愈合伤口的组合物或产品,例如绷带(bandages),医疗设备例如导管,还涉及抗头屑(anti-dandruff)的头发用品,例如香波。
本发明的抗微生物多肽的制剂被施用给受到或易受微生物感染的宿主。施用可以是表面、局部或全身性的,这取决于具体的微生物,优选局部施用(localized)。一般而言,本发明的抗微生物多肽的剂量足以使微生物群体减少至少50%,通常为至少1个对数级,还可能是2个或更多对数级的杀灭。本发明的化合物的施用量可减小微生物群体而同时使任何副作用最小化。本发明人认为该组合物将在内科医生的建议下获得并用于体内用途。本发明的抗微生物多肽特别有用于杀死革兰氏阴性细菌,包括铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa),和沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis);及革兰氏阳性细菌,包括链球菌例如肺炎链球菌(S.pneumonia),乳房链球菌(S.uberis),S.hyointestinalis,化脓链球菌(S.pyogenes)或S.agalactiae;和葡萄球菌例如金黄色葡萄球菌(S.aureus),表皮葡萄球菌(S.epidermidis),S.simulans,S,xylosus和S.carnosus。
本发明的抗微生物多肽的制剂可以被施用给受到或易受微生物性肺感染例如肺炎,或微生物性伤口感染例如伤口细菌感染的宿主。
本发明的抗微生物多肽的制剂还可以被施用给受到或易受皮肤感染例如痤疮,特应性皮炎(atopic dermatitis)或脂溢性(seborrheic)皮炎的宿主;优选地,该皮肤感染是细菌性皮肤感染,例如由表皮葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、痤疮丙酸杆菌(Propionibacterium acnes),卵瓶形酵母(Pityrosporum ovale)或Malassezia furfur引起的感染。
本发明的抗微生物多肽还可以用于体外制剂来杀死微生物,特别是当人们不希望引入大量的常规抗生素的时候。例如,本发明的抗微生物多肽可以添加到动物和/或人的食品制备物中;或者它们可以作为体外细胞培养的添加剂,用于防止和抑制组织培养物中长出微生物。
特定的微生物对本发明的抗微生物多肽杀灭的敏感性可以通过本文实验部分要详述的体外测试来确定。典型地,使微生物培养物和不同浓度的抗微生物多肽在一起经过足以使该蛋白起作用的时间,通常为大约1小时到1天。然后计算活的微生物的数目并确定杀灭水平。
目标微生物包括但不限于,柠檬酸杆菌属菌种(Citrobacter sp.);肠杆菌属菌种(Enterobacter sp.);埃希氏菌属菌种(Escherichia sp.),例如大肠杆菌;克雷白氏杆菌属菌种(Klebsiella sp.);Morganella sp.;变形菌属菌种(Proteus sp.);普罗威登斯菌属菌种(Providencia sp.);沙门氏菌属菌种(Salmonella sp.),例如伤寒沙门氏菌(S.typhi),鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium);沙雷氏菌属菌种(Serratia sp.);志贺氏菌属菌种(Shigella sp.);假单胞菌属菌种,例如铜绿假单胞菌;耶尔森氏菌属菌种(Yersinia sp.),例如鼠疫耶尔森氏菌(Y.pestis),假结核耶尔森氏菌(Y.pseudotuberculosis),小肠结肠炎耶尔森氏菌(Y.enterocolitica);弗朗西斯氏菌属菌种(Franciscella sp.);巴斯德氏菌属菌种(Pasturella sp.);弧菌属菌种(Vibrio sp.),例如霍乱弧菌(V.cholerae),副溶血性弧菌(V.parahemolyticus);弯曲杆菌属菌种(Campylobacter sp.),例如C.jejuni;嗜血杆菌属菌种(Haemophilus sp.),例如流感嗜血菌(H.influenzae),杜克氏嗜血杆菌(H.ducreyi);博德特氏菌属菌种(Bordetella sp.),例如百日咳博德特氏菌(B.pertussis),B.bronchiseptica,副百日咳博德特氏杆菌(B.parapertussis);布鲁氏菌属菌种(Brucella sp.),奈瑟氏球菌属菌种(Neisseria sp.),例如淋病奈瑟氏球菌(N.gonorrhoeae),脑膜炎奈瑟氏球菌(N.meningitidis),等等。其他目标细菌包括Legionella sp.,例如L.pneumophila;利斯特氏菌属菌种(Listeria sp.),例如单核细胞增生利斯特氏菌(L.monocytogenes);枝原体属菌种(Mycoplasmasp.),例如人型枝原体(M.hominis),肺炎枝原体(M.pneumoniae);分枝杆菌属菌种(Mycobacterium sp.),例如结核分枝杆菌(M.tuberculosis),麻疯分枝杆菌(M.leprae);密螺旋体属菌种(Treponema sp.),例如苍白密螺旋体(T.pallidum);疏螺旋体属(Borrelia sp.),例如B.burgdorferi;Leptospirae sp.;立克次氏体属菌种(Rickettsia sp.),例如立氏立克次氏体(R.rickettsii),伤寒型立克次氏体(R.typhi);Chlamydia sp.,例如沙眼衣原体(C.trachomatis),C.pneumoniae,鹦鹉热衣原体(C.psittaci);螺旋杆菌属菌种(Helicobacter sp.),例如幽门螺旋杆菌(H.pylori),等等。
非细菌类的目标病原体包括真菌和原生动物病原体,例如疟原虫属的种(Plasmodia sp.),例如恶性疟原虫(P.falciparum);锥虫属的种(Trypanosomasp.),例如布氏锥虫(T.brucei);血吸虫(shistosomes);内阿米巴属的种(Entaemoeba sp.),隐球菌属的种(Cryptococcus sp.),念珠菌属的种(Candidasp.),例如白色念珠菌(C.albicans);等等。
可以采取多种施用方法。所述多肽制剂可以口服施用,或者可以血管内、皮下和腹膜注射,通过气雾剂施用,眼施用,膀胱内施用,表面施用(topically)等等。例如,通过吸入施用的方法是本领域熟知的。所述治疗性制剂的剂量可以在宽的范围内变化,这取决于要施用的具体的抗微生物多肽、疾病的性质、施用频率、施用方式、宿主对该试剂的清除,等等。开始的剂量可以较大,然后以维持较小的剂量。剂量使用的频率可以低到每周或每两周,也可以分成较小的剂量,每天或每半周使用一次或数次等等,来维持有效的剂量水平。在很多情况下,口服施用比静脉内施用要求更高的剂量。可以修饰酰胺键以及氨基和羧基末端,以增加口服时的稳定性。例如,羧基末端可以酰胺化。
制剂
本发明的化合物可以掺入多种用于治疗性施用的制剂中。更具体地,本发明的化合物可通过与适当的药学上可接受的载体或稀释剂组合配制成药物组合物,还可以制成固体、半固体、液体或气体形式的制剂,例如片剂、胶囊剂、粉剂、颗粒剂、软膏剂、乳膏、泡沫、溶液、栓剂、注射剂、吸入剂、凝胶、微球、洗剂和气雾剂(aerosols)。同样地,可以通过多种途径施用这些化合物,包括口服、含服(buccal)、直肠、胃肠外、腹膜内、皮内、透皮、气管内施用等等。本发明的抗微生物多肽可以在施用后作用于全身,也可以通过使用能在植入部位维持活性剂量的植入物(implant)或其他制剂而作用于局部。
在一个实施方式中,表面使用的制剂包含螯合剂,其可降低二价阳离子特别是钙和镁的有效浓度。例如,可以包含柠檬酸盐,EGTA或EDTA,其中优选柠檬酸盐。通常柠檬酸盐的浓度为大约1-10mM。
本发明的化合物可以单独施用,相互组合施用,或者与其它已知的化合物(例如穿孔蛋白,抗炎剂,抗生素等等)。在药物剂型中,这些化合物可以以它们的药学上可接受的盐的形式施用。下面所述的方法和赋形剂都是示例性的而不是限制性的。
对于口服制剂,这些化合物可以单独使用或者与合适的添加剂组合制造片剂、粉剂、颗粒剂或胶囊剂,例如与常规的添加剂如乳糖、甘露醇、玉米淀粉或马铃薯淀粉;与粘合剂如结晶纤维素、纤维素衍生物、阿拉伯胶(acacia)、玉米淀粉或明胶;与崩解剂(disintegrators)例如玉米淀粉,马铃薯淀粉或羧甲基纤维素钠;与润滑剂如云母或硬脂酸镁组合;希望的话,还可以与稀释剂、缓冲剂、润湿剂、防腐剂和调味剂组合。
通过将所述化合物溶解、悬浮或乳化在水性或非水性的溶剂中,例如植物油或其它类似的油,合成的脂肪族酸甘油酯,高碳脂肪酸(higher aliphaticacids)或丙二醇的酯;希望的话可加入常规的添加剂例如增溶剂、等渗剂(isotonic agents)、助悬剂、乳化剂、稳定剂和防腐剂,所述化合物可以制成注射制剂。
所述化合物可以在用于吸入给药的气雾剂制剂中使用。本发明的化合物可以制入加压的可接受的推进剂(propellant)中,例如二氯二氟甲烷,丙烷,氮气等。
通过与常规的添加剂例如增溶剂、等渗剂、助悬剂、乳化剂、稳定剂和防腐剂配制,所述化合物可以用作洗剂,例如用来防止烧伤感染的洗剂。
另外,通过与多种基质(bases)例如乳化基质或水溶性基质混合,所述化合物可以制成栓剂。本发明的化合物可以通过栓剂直肠施用。所述栓剂可包含溶媒(vehicles)例如可可脂(cocoa butter),carbowaxes和聚乙二醇,它们在体温下熔解,在室温下固化。
可以提供糖浆、酏剂和混悬剂等口服或直肠施用的单位剂型,其中每个剂量单位,例如每茶匙量、每汤匙量、每片或每栓,含有预定量的、包含一种或多种本发明的化合物的组合物。类似地,注射或静脉内施用的单位剂型可以包含这样的组合物中的本发明的化合物:该组合物是无菌水、生理盐水或另一药学上可接受的载体中的溶液。
用于缓释剂型的植入物是本领域熟知的。植入物与生物可降解的或非生物可降解的聚合物配制成微球、板(slab)等。例如,乳酸和/或乙醇酸的聚合物形成宿主可良好耐受的易蚀聚合物。含有本发明的抗微生物多肽的植入物被置于感染部位附近,使得活性剂的局部浓度相对于身体的其它部分升高。
本文中使用的术语“单位剂型”是指适合作用单位剂量用于人和动物受体的物理上离散的单位,每个单位包含预定量的本发明的化合物,该化合物的量根据计算足以产生所希望的作用;还包含药学上可接受的稀释剂、载体和溶媒。本发明的单位剂型的规格取决于所用的具体化合物和要实现的作用,及该化合物在宿主中的相关药物动力学。
所述药学上可接受的赋形剂,例如溶媒、佐剂、载体或稀释剂,是公众容易获得的。另外,药学上可接受的辅助物质,例如pH调节和缓冲剂、稳定剂、湿润剂等等,是公众容易获得的。
用于全身施用的通常剂量为0.1pg到100毫克每千克受体体重每次施用。典型的剂量可以是每天2至6次,每次一片,或者每天一次,每次一颗/片缓释(time release)胶囊或片,其中该缓释胶囊或片含有按比例增高的活性成分。该缓释作用可以通过下列手段实现:在不同的pH值下溶解的胶囊材料,通过渗透压缓慢释放的胶囊,或者其他任何已知的控释手段。
技术人员容易理解,剂量水平可能作为具体的化合物、症状的严重性、以及受体对副作用的敏感性的函数而变化。一些特定的化合物比其他化合物更强效。对于给定的化合物,本领域的技术人员可以容易地使用多种手段确定其优选剂量。一种优选的手段是测量给定的化合物的生理效能。
一种感兴趣的方法是用脂质体作送递载体。脂质体与目标部位的细胞融合并将内腔中的内容物送到胞内。使用多种保持接触的方法,如分离,结合剂等等,使脂质体与细胞维持足以融合的时间的接触。在本发明的一个方面中,脂质体设计为可以被雾化(aerosolized)以便肺部给药。脂质体可以用介导膜融合的纯化的蛋白或肽例如仙台病毒(Sendai virus)或流感病毒(influenza)等来制备。脂类可以是已知的形成脂质体的脂类—包括阳离子或两性离子例如磷脂酰胆碱—的任何有用的组合。剩下的脂类通常是中性或酸性的脂类,例如胆固醇,磷脂酰丝氨酸,磷脂酰甘油,等等。
可以用Kato等,(1991)J.Biol.Chem.266:3361所述的方法来制备脂质体。简单地说,在合适的水性介质中合并脂类和含有肽的内腔(lumen)组合物,方便地,水性介质可以为盐水介质,其中总固形物为大约1-10重量%。短时间(约5-60秒)剧烈搅拌后,将管置于25-40℃的温水浴中,如此循环5-10次。然后将该组合物超声处理合适的时间,一般为1-10秒,还可以通过涡旋混合来进一步搅拌。然后加入水性介质来扩大体积,一般将体积扩大至约1-2倍,再进行振荡和冷却。该方法使得高分子量的分子可以被纳入到内腔中。
含其他活性剂的制剂
本发明的抗微生物多肽可以与其他的药学活性剂,特别是其他的抗微生物剂配制来用于本发明主题的方法。其他感兴趣的试剂包括如本领域已知的多种抗生素。抗生物的类别包括青霉素类(penicillins),例如青霉素G,青霉素V,甲氧苯青霉素,苯唑青霉素,羧苄青霉素,乙氧萘青霉素,氨苄青霉素,等等;青霉素类结合β-内酰胺酶抑制剂,头孢菌素,例如头孢克洛,头孢唑啉,头孢呋辛,拉氧头孢等等;碳青霉烯类;单菌霉素;氨基糖苷类;四环素类;大环内酯类;林可霉素类;多粘菌素类;磺胺类;喹诺酮类;氯霉素;甲硝哒唑;壮观霉素;trimethoprim;万古霉素等。
抗真菌剂也是有用的,包括多烯类化合物,例如两性霉素B,制霉菌素;5-flucosyn;以及唑类,例如咪康唑,酮康唑,伊曲康唑和氟康唑。抗结核药包括异烟肼、乙胺丁醇、链霉素和利福平。本发明的抗微生物多肽的制剂中还可包含细胞因子,例如干扰素γ、肿瘤坏死因子α、白介素12等。
体外合成
本发明的抗微生物肽可以用本领域已知的常规技术通过体外合成来制备。可以获得的商品化的合成设备有很多,例如Applied Biosystems Inc.,Beckman提供的自动合成仪等等。使用合成仪,天然的氨基酸可以被置换为非天然的氨基酸,尤其是D-异构体(或D-型)例如D-丙氨酸和D-异亮氨酸、非对映异构体、具有不同长度或功能性的侧链等等。具体的序列和制备方式将取决于方便性、经济性、所需的纯度等等。
可以对含有合适的成键官能团(functionalities)的多种肽或蛋白质进行化学交联,所述成键官能团的例子有:氨基,用于形成酰胺或取代的胺,例如还原性氨化;硫醇基,用于形成硫醚或二硫键;羧基,用于形成酰胺,等等。
需要的话,在合成或者表达过程中可以向肽中引入多种可供于连接其他分子或表面的基团。这样,半胱氨酸可用来形成硫醚,组氨酸可以用来与金属离子复合物连接,羧基可用来形成酰胺或酯,氨基可用来形成酰胺,等等。
还可以依照常规的重组合成方法来分离纯化所述多肽。可以制备表达载体的裂解物,再利用HPLC、排阻色谱、凝胶电泳、亲和色谱(affinitychromatography)或其它纯合技术来纯化该裂解物。大多数情况下,所使用的组合物可包括至少20重量%的所希望的产物,更通常为至少约75重量%,优选至少约95重量%,用于治疗的,通常至少约99.5重量%,相对于与该产物的制备和纯化方法相关的污染物。上述百分数通常基于总蛋白。
动物饲料
本发明还涉及在动物饲料中使用所述具有抗微生物活性的多肽的方法,以及包含本发明的抗微生物多肽的饲料组合物和饲料添加剂。
术语“动物”包含所有的动物,包括人类。动物的例子有非反刍类动物,和反刍类动物如牛、绵羊和马。在一个具体的实施方案中,所述动物是非反刍类动物。非反刍类动物包括单胃动物,例如猪(pigs)或猪(swine)(包括但不限于仔猪、生长期猪和大母猪(sow));禽类例如火鸡和鸡(包括但不限于肉仔鸡(broiler chick),产蛋鸡(layers));年幼的小牛;和鱼类(包括但不限于鲑鱼)
术语“饲料”或“饲料组合物”指适于被动物摄取或供动物摄取的任何化合物、制备物、混合物或组合物。
在根据本发明的用途中,所述抗微生物多肽可以在饮食之前、之后或同时饲喂给动物。优选后者。
在一个特定的实施方案中,当所述抗微生物多肽被添加到饲料中或被包含在饲料添加剂中时,它是明确定义的。“明确定义”(well-defined)是指该抗微生物多肽制备物如大小排阻层析(size exclusion chromatography)测定为至少50%纯(参考WO01/58275的实施例12)。在其他的具体实施方案中,如该方法所测定的,微生物多肽制备物为至少60,70,80,85,88,90,92,94,或至少95%纯。
明确定义的抗微生物多肽制备物是有利的。例如,对于基本上不含其他干扰性或污染性的抗微生物多肽的抗微生物多肽,将其正确地按剂量施用于饲料要容易得多。术语“正确地按剂量施用”(dose correctly)具体是指获得一致和恒定结果的目标,和根据所需效果来最优化剂量的能力。
但是用于动物饲料时,该抗微生物多肽并不需要那么纯;它可以,例如,包含其他的酶,在这种情况下它可以称为抗微生物多肽制备物。
该抗微生物多肽制备物可以(a)直接加入饲料中(或直接用于植物蛋白的处理工艺中),或(b)用于生产一种或多种中间性组合物,例如饲料添加剂或预混物,其随后被加入饲料(或用于处理工艺中)。上面所述的纯度是指原来的抗微生物多肽制备物的纯度,该制备物是根据上述(a)或(b)使用的。
具有该数量级的纯度的抗微生物多肽制备物,具体地可以使用重组生产方法得到,但当使用常规的发酵方法来生产所述抗微生物多肽时,它们不那么容易获得,并且批次间的变差要高得多。
当然,这样的抗微生物多肽制备物可与其他的酶混合。
术语“植物蛋白”(vegetable proteins)在本文中用于指包含至少一种来自或源自植物的蛋白,包括修饰蛋白和蛋白衍生物的任何化合物、组合物、制备物或混合物。在具体的实施方案中,植物蛋白的蛋白含量为至少10,20,30,40,50,或60%(w/w)。
植物蛋白可以来自植物蛋白源,例如豆类和谷物,如来自豆科(Fabaceae(Leguminosae))、十字花科(Cruciferaceae)、藜科(Chenopodiaceae)和禾本科(Poaceae)等科的植物的材料,如大豆粕(soy bean meal)、羽扇豆粕(lupin meal)和油菜籽粕(rapeseed meal)。
在一个具体的实施方案中,植物蛋白源是来自豆科的一种或多种植物例如大豆、羽扇豆、豌豆或菜豆(bean)的材料。
在另一个具体的实施方案中,植物蛋白源是来自藜科的一种或多种植物例如甜菜(beet)、糖用甜菜(sugar beet)、菠菜或昆诺阿藜(quinoa)的材料。
植物蛋白源的其他例子有油菜籽和甘蓝。
大豆是优选的植物蛋白源。
植物蛋白源的其他例子有谷物,例如大麦、小麦、黑麦、燕麦、玉米(maize/corn)、水稻和高粱。
抗微生物多肽可以以任何形式加入饲料,或者作为相对纯的抗微生物多肽,或者与其他供加入该动物饲料的组分掺合,即以动物饲料添加剂的形式,例如所谓的动物饲料用预混物(pre-mix)。
在进一步的一个方面,本发明涉及组合物,其用于动物饲料,例如动物饲料,或动物饲料添加剂,例如预混物。
除了本发明的抗微生物多肽,本发明的动物饲料添加剂含有至少一种脂溶性维生素,和/或至少一种水溶性维生素,和/或至少一种痕量矿物质,和/或至少一种大量矿物质(macro mineral)。
另外,任选的饲料添加剂成分包括着色剂(coloring agents)、香味化合物(aroma compounds)、稳定剂,和/或至少一种选自下列的酶:肌醇六磷酸酶EC3.1.3.8或3.1.3.26;木聚糖酶EC3.2.1.8;半乳聚糖酶EC3.2.1.89;和/或β-葡聚糖酶EC3.2.1.4。
在一个具体的实施方式中,所述其他酶是明确定义的(如上述用于抗微生物多肽制备物的定义)。
其他抗微生物肽(AMP’s)的例子有CAP18、Leucocin A、Tritrpticin、Protegrin-1、Thanatin、Defensin、Ovispirin例如Novispirin(Robert Lehrer,2000)、及它们的保留抗微生物活性的变体或片段。
其他抗真菌多肽(AFP’s)的例子有巨大曲霉(Aspergillus giganteus)和黑曲霉的肽,及它们的保留抗真菌活性的变体和片段,如WO94/01459和WO02/090384所公开的。
通常,脂溶性和水溶性维生素以及痕量矿物质形成要加入饲料的所谓预混物的一部分,而大量矿物质通常单独加入该饲料。这些组合类型中的任一种当添加了本发明的抗微生物多肽时就是本发明的动物饲料添加剂。
在一个具体的实施方案中,本发明的动物饲料添加剂要以0.01-10.0%,更具体为0.05-5.0%,或0.2-1.0%(%表示g添加剂每100g饲料)的水平被包含在(或者根据配方必须包含在)动物饮食或饲料中。特别是对于预混物是这样。
下面列出了这样的组分的非排他性示例:
脂溶性维生素的例子有维生素A、维生素D3、维生素E、和维生素K,例如维生素K3。
水溶性维生素的例子有维生素B12、生物素和胆碱、维生素B1、维生素B2、维生素B6、烟酸、叶酸和泛酸和其盐(panthothenate),例如D-泛酸钙。
痕量矿物质的例子有锰、锌、铁、铜、碘、硒和钴。
大量矿物质的例子有钙、磷和钠。WO01/58275的表A列出了这些组分的营养需求(以家禽和猪/仔猪为例)。营养需求(nutritional requirement)是指这些组分必须以所指明的浓度在饮食中提供。
或者,本发明的动物饲料添加剂包含WO01/58275的表A所列的单个组分中的至少一种。“至少一种”指组分中的任一种,一种或多种,一种,或两种,或三种,或四种,如此直至全部13种,或全部15种单个组分。更具体地,该至少一种单个组分以这样的量被包含在本发明的添加剂中,以提供表A的第4列,或第5列,或第6列所示的范围之内的饲料中浓度(in-feedconcentration)。
本发明还涉及动物饲料组合物,动物饲料组合物或饮食具有较高的蛋白质含量。家禽和猪的饮食可以如WO01/58275的表B、列2-3来描述。鱼类的饮食可以如表B的第4列来描述。另外该鱼类饮食通常具有200-310g/kg的粗脂肪含量。
根据本发明的动物饲料组合物具有50-800g/kg的粗蛋白含量,还包含至少一种如本申请所要求保护的抗微生物多肽。
并且,或者作为(上述粗蛋白含量的)替代,本发明的动物饲料组合物具有10-30MJ/kg的可代谢能量(metabolizable energy)含量;和/或0.1-200g/kg的钙含量;和/或0.1-200g/kg的有效磷(available phosphorus)含量;和/或0.1-100g/kg的甲硫氨酸含量,和/或0.1-150g/kg的甲硫氨酸加半胱氨酸含量;和/或0.5-50g/kg的赖氨酸含量。
在具体的实施方案中,所述可代谢能量、粗蛋白、钙、磷、甲硫氨酸、甲硫氨酸加半胱氨酸和/或赖氨酸含量在WO01/58275的表B的范围2、3、4或5(2-5行)的任一范围内。
粗蛋白是用氮(N)乘以因数6.25来计算的,即,粗蛋白(g/kg)=N(g/kg)×6.25。氮含量是用凯氏(Kjeldahl)定氮法(A.O.A.C.,1984,Official Methods ofAnalysis第14版,Association of Official Analytical Chemists,Washington DC)确定的。
可代谢能量可以根据下列文献来计算:国家研究委员会(NRC)的出版物Nutrient requirements in swine,第九次修订版,1988,subcommittee on swinenutrition,committee on animal nutrition,board of agriculture,national researchcouncil.National Academy Press,Washington,D.C.,pp.2-6;和European Tableof Energy Values for Poultry Feed-stuffs,Spelderholt centre for poultry researchand extension,7361DA Beekbergen,The Netherlands.Grafisch bedrijf Ponsen&looijen bv,Wageningen.ISBN90-71463-12-5。
钙、有效磷和氨基酸在完全动物饮食中的饮食含量根据例如Veevoedertabel1997,gegevens over chemische samenstelling,verteerbaarheiden voederwaarde van voedermiddelen,Central Veevoederbureau,Runderweg6,8219pk Lelystad.ISBN90-72839-13-7等饲料表来计算。
在一个具体的实施方案中,本发明的动物饲料组合物含有至少一种如上面定义的植物蛋白或蛋白源。
在进一步的具体的实施方案中,本发明的动物饲料组合物含有0-80%的玉米;和/或0-80%的高粱;和/或0-70%的小麦;和/或0-70%的大麦;和/或0-30%的燕麦;和/或0-40%的大豆粕(soybean meal);和/或0-10%的鱼粉;和/或0-20%的乳清。动物饮食可以例如制成粉状(mash)饲料(非颗粒的)或颗粒饲料。典型地,将粉碎的饲料原料混合,并根据所述物种所用的规格加入足够量的必需维生素和矿物质。酶可以作为固体或液体酶制剂加入。例如,固体酶制剂通常在混合步骤前或期间加入;而液体酶制备物通常在造粒步骤之后加入。酶还可以掺入饲料添加剂或预混物。
饮食中的酶终浓度为0.01-200mg酶蛋白每kg饮食,例如为5-30mg酶蛋白每kg动物饮食。
所述抗微生物多肽可以以下列量施用(剂量范围):0.01-200;或0.01-100;或0.05-100;或0.05-50;或0.10-10-上述范围都是指mg抗微生物多肽蛋白每kg饲料(ppm)。
如下测定mg抗微生物多肽蛋白每kg饲料:从饲料组合物中纯化出抗微生物多肽,再使用相关的测定方法(见抗微生物活性、底物和测定方法条目下)确定纯化的抗微生物多肽的具体活性(specific activity)。使用同样的测定方法确定所述饲料组合物的抗微生物活性,根据这两个测定,计算以mg抗微生物多肽蛋白每kg饲料表示的剂量。
同样的原则也可以用于确定饲料添加剂中的mg抗微生物多肽蛋白质。当然,如果可以获得制备所述饲料添加剂或饲料所用的抗微生物多肽的样品,就由此样品确定具体的活性(不需要从饲料组合物或添加剂中纯化该抗微生物多肽)。
去污剂组合物
本发明的抗微生物多肽可以添加到去污剂组合物中并因此成为其组分。
本发明的去污剂组合物可以,例如,配制为手洗或机洗衣物用去污剂组合物,其包括适用于预处理染污织物的洗衣添加剂组合物和漂洗加入的织物软化组合物(rinse added fabric softener composition);或者可以配制为用于一般家用清洗硬表面的去污剂组合物,或配制用于手洗或机洗碗碟。
在一个特定的方面中,本发明提供去污添加剂,其包含本发明的抗微生物多肽和表面活性剂。该去污添加剂及去污剂组合物可包含一种或多种其他的酶例如蛋白酶、脂肪酶、角质酶、淀粉酶、糖酶、纤维素酶、果胶酶、甘露聚糖酶、阿拉伯糖酶、半乳聚糖酶、木聚糖酶、氧化酶(例如漆酶)和/或过氧化物酶(例如卤素过氧化物酶)。
一般而言,所选的酶的性质应该与所选的去污剂相容(例如最适pH、与其他酶或非酶成分的相容性等等),而且该酶应当以有效量存在。
蛋白酶:合适的蛋白酶包括动物、植物或微生物来源的那些蛋白酶。微生物来源是优选的。还包括化学修饰的或蛋白质工程改造的突变体。该蛋白质可以是丝氨酸蛋白酶或金属蛋白酶,优选地为碱性微生物蛋白酶或胰蛋白酶样(trypsin-like)蛋白酶。碱性蛋白酶的例子有枯草杆菌蛋白酶,特别是来自芽孢杆菌的那些,例如枯草杆菌蛋白酶Novo、枯草杆菌蛋白酶Carlsberg、枯草杆菌蛋白酶309、枯草杆菌蛋白酶147和枯草杆菌蛋白酶168(如WO89/06279所述)。胰蛋白酶样蛋白酶的例子有胰蛋白酶(例如猪或牛来源的)和镰孢属真菌蛋白酶,其在WO89/06270和WO94/25583中有描述。
有用的蛋白酶的例子有WO92/19729、WO98/20115、WO98/20116和WO98/34946中所描述的变体,特别是在下面一个或多个位置上有置换的变体:27,36,57,76,87,97,101,104,120,123,167,170,194,206,218,222,224,235和274。
脂肪酶:合适的脂肪酶包括细菌或真菌来源的那些脂肪酶。还包括化学修饰的或蛋白质工程改造的突变体。有用的脂肪酶的例子包括来自腐质霉属(Humicola,与Thermomyces同义)的脂肪酶,例如EP258068和EP305216所描述的来自H.lanuginosa(T.lanuginosus)的脂肪酶,或WO96/13580所描述的来自H.insolens的脂肪酶,假单胞菌脂肪酶,例如来自产碱假单胞菌(P.alcaligenes)或类产碱假单胞菌(P.pseudoalcaligenes)(EP218272)、葱头假单胞菌(P.cepacia)(EP331376)、司徒茨氏假单胞菌(P.stutzeri)(GB1,372,034)、荧光假单胞菌(P.fluorescens)、假单胞菌菌株SD705(WO95/06720和WO96/27002)和P.wisconsinensis(WO96/12012)的脂肪酶;芽孢杆菌脂肪酶,例如来自枯草芽孢杆菌(Dartois等,(1993),Biochemica et Biophysica Acta,1131,253-360)、嗜热脂肪芽孢杆菌(JP64/744992)、或短小芽孢杆菌(B.pumilus)(WO91/16422)的脂肪酶。
其他的例子有WO92/05249,WO94/01541,EP407225,EP260105,WO95/35381,WO96/00292,WO95/30744,WO94/25578,WO95/14783,WO95/22615,WO97/04079和WO97/07202中所描述的脂肪酶变体。
淀粉酶:合适的淀粉酶(α和/或β)包括细菌或真菌来源的那些淀粉酶。还包括化学修饰的或蛋白质工程改造的突变体。淀粉酶包括,例如,得自芽孢杆菌,例如一个特别的地衣芽孢杆菌菌株(在GB1,296,839中有详述)的α-淀粉酶。
有用的淀粉酶的例子有WO94/02597,WO94/18314,WO96/23873和WO97/43424中描述的变体,特别是在下列一个或多个位置上有置换的变体:15,23,105,106,124,128,133,154,156,181,188,190,197,202,208,209,243,264,304,305,391,408和444。
纤维素酶:合适的纤维素酶包括细菌或真菌来源的那些纤维素酶。还包括化学修饰的或蛋白质工程改造的突变体。合适的纤维素酶包括来自芽孢杆菌属、假单胞菌属、腐质霉属、镰孢属、梭孢壳属和Acremonium属的纤维素酶,例如在US4,435,307,US5,648,263,US5,691,178,US5,776,757和WO89/09259中描述的、由Humicola insolens、嗜热毁丝霉(Myceliophthorathermophila)和尖孢镰孢产生的真菌纤维素酶。
特别合适的纤维素酶是具有护色(color care)效益的碱性或中性纤维素酶。这样的纤维素酶的例子有EP0495257,EP0531372,WO96/11262,WO96/29397和WO98/08940中描述的纤维素酶。其他例子有纤维素酶变体,例如WO94/07998,EP0531315,US5,457,046,US5,686,593,US5,763,254,WO95/24471,WO98/12307和PCT/DK98/00299中描述的那些。
过氧化物酶/氧化酶:合适的过氧化物酶/氧化酶包括细菌或真菌来源的那些过氧化物酶/氧化酶。还包括化学修饰的或蛋白质工程改造的突变体。有用的过氧化物酶的例子包括来自鬼伞属(Coprinus)的过氧化物酶,例如来自灰盖鬼伞(C.cinereus),及其变体,如WO93/24618,WO95/10602,和WO98/15257所述的那些的过氧化物酶。
可以通过加入单独的含有一种或多种酶的添加剂,或加入包含所有酶的复合添加剂,来使去污酶(detergent enzyme(s))包含在去污剂组合物中。本发明的去污添加剂,即单独的添加剂或复合添加剂,可以配置为例如颗粒、液体、浆液等等。优选的去污添加剂的剂型为颗粒,特别是非粉化(non-dusting)颗粒、液体,特别是稳定化的液体,或浆液。
非粉化(non-dusting)颗粒可以,例如,如US4,106,991和4,661,452所公开的那样制备,任选地,还可以用本领域已知的方法来包被。蜡包被材料的例子有平均摩尔(mole)为1000-20000的聚(环氧乙烷)产品(聚乙二醇,PEG);具有16-50个环氧乙烷单位的乙氧基化壬基酚;乙氧基化脂肪醇,其中醇含12-20个碳原子,且其中有15-80个环氧乙烷单位;脂肪醇;脂肪酸;以及脂肪酸的甘油单酯、甘油二酯和甘油三酯。GB1483591提供了适于通过流化床施用的成膜包被材料的例子。液体酶制备物可以,例如,按照已确立的方法,通过加入多元醇,如丙二醇、糖或糖醇、乳酸或硼酸来稳定化。可以根据EP238,216所公开的方法制备被保护的酶。
本发明的去污剂组合物可以是任何方便的形式,例如条、片、粉、颗粒、糊或液体。液体去污剂可以是水性的,通常含有高达70%的水和0-30%的有机溶剂,或者是非水性的。
所述去污剂组合物包含一种或多种表面活性剂,表面活性剂可以是非离子型包括半极性的,和/或阴离子型的,和/或阳离子型的,和/或两性离子型的。表面活性剂典型地以0.1-60重量%的水平存在。
当被包括在其中时,所述去污剂通常含有大约1%到大约40%的阴离子表面活性剂例如线性烷基苯磺酸盐(alkylbenzenesulfonate)、α-烯属磺酸酯、烷基硫酸盐(alkyl sulfate)(脂肪醇硫酸酯)、脂肪醇乙氧基硫酸盐(alcoholethoxysulfate)、二级链烷磺酸盐(secondary alkanesulfonate)、α-磺基脂肪酸甲酯、烷基或烯基琥珀酸或肥皂。
当被包括在其中时,所述去污剂通常含有约0.2%到约40%的非离子表面活性剂如脂肪醇乙氧基化物、壬基苯酚乙氧基化物、烷基多苷、烷基二甲基胺氧化物、乙氧基化脂肪酸单乙醇胺、脂肪酸单乙醇胺、多羟基烷基脂肪酰胺、或葡糖胺(“葡萄糖胺”(“glucamides”))的N-酰基N-烷基衍生物。
所述去污剂可进一步包括0-65%的洗涤增效剂(detergent builder)或络合剂如沸石、二磷酸盐、三磷酸盐、磷酸盐(phosphonate)、碳酸盐、柠檬酸盐、氨三乙酸、乙二胺四乙酸、二亚乙基三胺五乙酸、烷基或烯基琥珀酸、可溶的硅酸盐或分层的(layered)硅酸盐(例如来自Hoechst的SKS-6)。
所述去污剂可包含一种或多种聚合物。例如羧甲基纤维素、聚(乙烯吡咯烷酮)、聚(乙二醇)、聚(乙烯醇)、聚(乙烯吡啶-N-氧化物)、聚(乙烯咪唑)、聚羧酸酯如聚丙烯酸酯、马来酸/丙烯酸共聚物和甲基丙烯酸月桂酯/丙烯酸共聚物。
所述去污剂可包含漂白系统,所述系统包括H2O2来源如过硼酸盐或过碳酸盐,其可与产过酸漂白激活剂(peracid-forming bleach activator)如四乙酰基乙二胺或壬酰氧苯磺酸酯(nonanoyloxybenzenesulfonate)组合。或者,漂白系统可包括例如酰胺、二酰亚胺或砜类型的过氧酸。
本发明的去污剂组合物的酶可以用常规的稳定剂来稳定化,例如多元醇如丙二醇或丙三醇、糖或糖醇、乳酸、硼酸或硼酸衍生物,例如,芳香族硼酸酯,或苯硼酸衍生物如4-甲酰苯硼酸,并且该组合物可以如WO92/19709和WO92/19708中描述的那样配制。
洗涤剂也可包括其他常规的洗涤剂组分,例如织物调理剂(conditioner)包括粘土,促泡剂,抑泡剂,防蚀剂,污物悬浮剂,防污物再沉淀剂,染料,杀菌剂,荧光增白剂,水溶助长剂,晦暗抑制剂,或香料。
在此预计,在所述去污剂组合物中,任何酶,以及本发明的抗微生物多肽,可以以相应于0.01-100mg酶蛋白每升洗涤液,优选0.05-10mg酶蛋白每升洗涤液,更优选0.1-5mg酶蛋白每升洗涤液,最优选0.1-1mg酶蛋白每升洗涤液的量加入。
本发明的抗微生物多肽还可以掺入到WO97/07202所公开的去污剂组合物中,在此将WO97/07202并入本文作为参考。
下面通过实施例来进一步描述本发明,这些实施例不应被理解为对本发明的范围的限制。
实施例
用作缓冲液和底物的化学品是商业产品,至少为试剂级。
实施例1
抗微生物活性的评估
如国际专利申请WO00/73433的实施例1所公开的那样(作了微小的修改),在大肠杆菌TOP10(Invitrogen)中用阿拉伯糖作诱导物表达了若干抗微生物多肽,它们都是SEQ ID NO:1的变体。本发明的抗微生物多肽的表达导致了宿主细胞的生长抑制。
简言之,在微量滴定板中,将在含0.2%葡萄糖和氨苄青霉素(100μg/ml)的RM培养基中生长的新鲜过夜培养物在150微升的含0.2%甘油和氨苄青霉素(100μg/ml)及0.01%阿拉伯糖的RM培养基中稀释300倍,然后在37℃下剧烈振荡培养。每隔30分钟用Bioscreen C Microbiology reader(Thermo ElectronCorporation)测量OD450,持续14小时,来检测生长曲线(缓冲液的培养基组成可参考Invitrogen的pBAD/gIII A,B和C载体操作规程,目录号V450-01)。
生长抑制的百分率这样计算:以每个样品的终点OD测量值,除以从含对照载体的细胞获得的终点OD测量值,再乘以100。公式如下:
其中,“空白OD”相应于空白孔中的OD。
表1列出了与SEQ ID NO:1相比较的氨基酸置换,以及相应的多肽的抗微生物效果。每个实验中都包括野生型作为标准。
表1.
表1所示的结果有力地表明,所有被测试的抗微生物多肽都显示强烈的抗微生物活性。
实施例2
通过QSAR设计的具有抗微生物活性的多肽
从大肠杆菌TOP10文库中随机挑选50个含有通过易错PCR(Error PronePCR)产生的野生型基因中的随机突变的克隆。用Bioscreen OD测定仪分析这些克隆,以定量测定不同克隆在阿拉伯糖存在下相比于野生型的生长抑制程度(详见实施例1)。对所有的克隆测序以确定突变的性质。将所得的数据用于QSAR模型。
根据QSAR模型,预计了一些相比野生型具有提高的抗微生物活性的变体。将这些变体中的15个克隆到pBAD载体中,并在自杀表达系统(SuicideExpression System)中检测改善的活性(见实施例1)。
按照Sambrook J.,Fritsch E.F和Maniatis,T(Molecular cloning,a laboratorymanual,第2版,Cold spring Harbor Laboratory Press,1989)中描述的操作规程,将编码野生型的和含有不同的突变的寡核苷酸K9V,N2F,N2I,N2I+K9L,N2W,R4I,G18I,H12K,H12R,K9F,K9L,N2L,N2A,N2M,K9Y退火,并用Klenow(Boheringer,DNA聚合酶I,大片段)补平。
将这些双链寡核苷酸用NcoI/XbaI消化,并定向插入pBAD gIII A。对所有的构建体测序以确认突变。然后将构建体转化到大肠杆菌TOP10细胞中,并使用自杀表达系统,用Bioscreen OD测定仪分析所得的转化子,以定量测定生长抑制的程度(见实施例1)。
为了建立定量结构活性关系(Quantitative Structure Activity Relationship,QSAR)模型,对用自杀表达系统分离的变体的结构建立计算机模型。计算基于肽部分表面积和分子相互作用场(MIF)的理化参数,并将其与生物活性相关联。根据该QSAR模型,提出了所有可能的单残基突变体的预测活性。用自杀表达系统(SES)测试并验证了含有不同突变的15个变体K9V,N2F,N2I,N2I+K9L,N2W,R4I,G18I,H12K,H12R,K9F,K9L,N2L,N2A,N2M,K9Y。
下面的表中显示了使用自杀表达系统所得到的野生型和不同变体的生长抑制。
实施例3
抗微生物多肽的克隆、表达和评估
编码野生型的合成基因的克隆
为了产生野生型(SEQ ID NO:1)用于抗微生物活性测定,制得一合成基因(见下)并将其插入表达载体pET31b+(Novagen Inc.)。该合成基因是由特定设计的寡核苷酸构成的(引物1和引物2)。
编码野生型的合成基因(SEQ ID NO:115):
AAA AAC CTG CGT CGC ATT ATC CGC AAA GGC ATC CAT ATC ATT AAA AAA TAT GGC TAG
K N L R R I I R K G I H I I K K Y G *
引物1(SEQ ID NO:117):
ATTATTCAGA TGCTGGATCC GGACGAAAAA AACCTGCGTC GCATTATCCG CAAAGGCATC
CATATCATTA AAAAATATGG CTAATAACTC GAGATTATT
引物2(SEQ ID NO:118):
AATAATCTCG AGTTATTAGC CATATTTTTT AATGATATGG ATGCC TTTGC GGATAATGCG
ACGCAGGTTT TTTTCGTCCG GATCCAGCAT CTGAATAAT
通过侧翼的限制酶位点(AlwNI/AvaI)的酶消化,我们可以将该合成基因作为融合构建体克隆到pET31b+中(如制造商New England Biolabs Inc.所描述的标准方法)。所有标准操作规程在别处都有描述(Sambrook,Fritsch,和Maniatis,1989)。
转化大肠杆菌
将重组pET31b+转化入大肠杆菌Novablue,如制造商(Novagen)所描述的。用QIAprep Mini Columns(QIAGEN Inc.)制备质粒,并用质粒特异性的引物(引物3和引物4)对质粒进行自动测序:
引物3(SEQ ID NO:119):
TGCTA GTTAT TGCTC AGCGG
引物4(SEQ ID NO:120):
ACCGT AGTTG CGCCC ATCG
变体的克隆
使用一种直接质粒扩增的方法来产生编码野生型序列特定位置上的单个突变的质粒,来进一步验证由SES、QSAR和合理的设计所提出的变体。
作为例子,我们设计了引物5和引物6来产生编码野生型第4位上精氨酸突变为缬氨酸的变体的质粒。我们用聚合酶链式反应直接扩增该质粒,用DpnI处理,再转化大肠杆菌Novablue,回收到了在第4位上具有明确的突变的变体。
引物5: 5′-G GAA AAA AAC CTG GTG CGG ATT ATC CG-3′
5′-G GAA AAA AAC CTG CGT CGC ATT ATC CG-3′
3′-C CTT TTT TTG GAC GCA GCG TAA TAG GC-5′
引物6: 3′-C CTT TTT TTG GAC CAC GCG TAA TAG GC-5′
编码的变体: K N L R/V R I I
大肠杆菌中的表达
根据供应商(Novagen)将质粒转化大肠杆菌BLR-DE3。将该细菌在LB培养基中培养到OD600~0.8,加入1mM IPTG(异丙基β-硫代半乳糖苷)启动重组蛋白的合成。诱导3小时时,收集细菌,重悬于1/10体积缓冲液A(50mMTris-HCl,1mM EDTA,100mM NaCl,pH8)中,用压力破碎(1500mBar)裂解。所得的沉淀用缓冲液B(50mM Tris-HCl,10mM EDTA,0.5%TritonX-100,100mM NaCl,pH8)洗涤2次。所有标准操作规程在别处都有描述(Sambrook,Fritsch,和Maniatis,1989)。
从大肠杆菌包含体纯化抗微生物肽
由上述的纯化所得的沉淀含有纯化的包含体。为了将所述肽从KSI融合伙伴(partner)中释放出来,对在野生型的编码基因中以引入N末端的工程位点Asp-Pro进行酸水解。将包含体重悬于100mM磷酸钠(pH2.3)中,在85℃温育过夜。所得上清中含有肽(Pro-Arg-Glu-野生型)。加入100mM磷酸钠(pH12.3)将样品中和。为了使所述肽成熟,用谷氨酰内肽酶I(来自地衣芽孢杆菌)处理该肽。用质谱验证成熟的肽,并用标准的色谱方法将其进一步纯化。
实施例4
抗微生物多肽变体的产生
上面的实施例还被用来产生第2位和第4位上的随机突变,使用简并引物,用随机密码子(NNN)取代特定的密码子。这由下面的引物7+8所描述,
其在第4位产生随机变体。还使用引物9+10在第2位产生随机变体。
引物7: 5′-G GAA AAA AAC CTG NNN CGG ATT ATC CG-3′
5′-G GAA AAA AAC CTG CGT CGC ATT ATC CG-3′
3′-C CTT TTT TTG GAC GCA GCG TAA TAG GC-5′
引物8: 3′-C CTT TTT TTG GAC NNN GCG TAA TAG GC-5′
编码的变体: K N L ? R I I
氨基酸位置# 1 2 3 4 5 6 7
引物9: 5′-GCG GAA AAA NNN CTG CGT CGG ATT ATC C-3′
5′-GCG GAA AAA AAC CTG CGT CGC ATT ATC C-3′
3′-CGC CTT TTT TTG GAC GCA GCG TAA TAG G-5′
引物10: 3′-CGC CTT TTT NNN GAC GCA GCG TAA TAG G-5′
编码的变体: K ? L R R I I
氨基酸位置# 1 2 3 4 5 6 7
单个的克隆的突变用DNA测序来验证。如实施例3所述的那样表达和纯化这些变体。
纯化的变体的直接抗微生物活性按如下所述评估(实施例5)。发现下面4种变体针对金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)比野生型好(MIC用微克/ml表示)。
实施例5
根据微量肉汤稀释测定(Microbroth Dilution Assay)的所选抗微生物多肽
的抗微生物活性(MIC)
使用微量肉汤(Microbroth)稀释测定,评估所述抗微生物多肽的由最小抑制浓度(Minimal Inhibitory Concentrations,MIC)度量的直接抗微生物活性。按上述实施例所述或通过化学合成产生变体。所用的操作规程按照NCCLS的推荐(www.nccls.org),使用阳离子调整的Mueller hinton肉汤。使用来自金黄色葡萄球菌(ATCC29737)和表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)(DSM1798)的细菌分离物来鉴定所述肽的活性特征。MIC以微克/ml表示。
结果由下表显示:
Claims (25)
1.具有抗微生物活性的多肽,包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列:
K-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17;
其中
X1=N,F,I,W,M,S,A,T,Y,V,H,L,C,K或G;优选X1=S,T,V,Y,W,I,G,F或L;
X2=L,I,F或W;优选X2=W或I;
X3=R,I,F,L,Y,V,A,T,C,H,G,Q或P;优选X3=F,I,V或L;
X4=R或C;
X5=I,L,W,M,V或F;优选X5=L或I;
X6=I,L或W;优选X6=I;
X7=R,L,T或C;
X8=K,V,F,L,C,Y,I,R,N或W;优选X8=Y,F,W,V或L;
X9=G,C,Y,L,F,W或V;优选X9=G或F;
X10=I,W,F或R;优选X10=W或I;
X11=H,K,C,A,S,I,N,L或Q;优选X11=I,S或K;
X12=I,L,F或V;优选X12=L;
X13=I,L,F,T或V;优选X13=L;
X14=K,I,S,L或R;优选X14=I,R或L;
X15=K,R或I;
X16=Y,I,L,F或K;优选X16=L;
X17=G,I,S,L,R,F,T,C或V;优选X17=I,F或L;
其中该氨基酸序列与SEQ ID NO:1的氨基酸1至18具有多于55%的同一性而少于100%的同一性。
2.具有抗微生物活性的多肽,包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列:
K-R-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16;
其中
X1=L,I,F或W;优选X1=W或I;
X2=R,I,F,L,Y,V,A,T,C,H,G,Q或P;优选X2=F,I,V或L;
X3=R或C;
X4=I,L,W,M,V或F;优选X4=L或I;
X5=I,L或W;优选X5=I;
X6=R,L,T或C;
X7=K,V,F,L,C,Y,I,R,N或W;优选X7=Y,F,W,V或L;
X8=G,C,Y,L,F,W或V;优选X8=G或F;
X9=I,W,F或R;优选X9=W或I;
X10=H,K,C,A,S,I,N,L或Q;优选X10=I,S或K;
X11=I,L,F或V;优选X11=L;
X12=I,L,F,T或V;优选X12=L;
X13=K,I,S,L或R;优选X13=I,R或L;
X14=K,R或I;
X15=Y,I,L,F或K;优选X15=L;
X16=G,I,S,L,R,F,T,C或V;优选X16=I,F或L;
其中该氨基酸序列与SEQ ID NO:1的氨基酸1至18具有多于55%的同一性而少于90%的同一性。
3.具有抗微生物活性的多肽,包含SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列:
K-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-R-X11-X12-X13-X14-X15-X16;
其中
X1=N,F,I,W,M,S,A,T,Y,V,H,L,C,K或G;优选X1=S,T,V,Y,W,,G,F或L;
X2=L,I,F或W;优选X2=W或I;
X3=R,I,F,L,Y,V,A,T,C,H,G,Q或P;优选X3=F,I,V或L;
X4=R或C;
X5=I,L,W,M,V或F;优选X5=L或I;
X6=I,L或W;优选X6=I;
X7=R,L,T或C;
X8=K,V,F,L,C,Y,I,R,N或W;优选X8=Y,F,W,V或L;
X9=G,C,Y,L,F,W或V;优选X9=G或F;
X10=I,W,F或R;优选X10=W或I;
X11=I,L,F或V;优选X11=L;
X12=I,L,F,T或V;优选X12=L;
X13=K,I,S,L或R;优选X13=I,R或L;
X14=K,R或I;
X15=Y,I,L,F或K;优选X15=L;
X16=G,I,S,L,R,F,T,C或V;优选X16=I,F或L;
其中该氨基酸序列与SEQ ID NO:1的氨基酸1至18具有多于55%的同一性而少于90%的同一性。
4.权利要求1-3任一项的多肽,其中所述氨基酸序列与SEQ ID NO:1的氨基酸1到18具有至少60%的同一性,优选与SEQ ID NO:1的氨基酸1到18具有至少65%的同一性,至少70%的同一性,至少75%的同一性,或至少80%的同一性。
5.权利要求1-4任一项的多肽,包含SEQ ID NO:5到SEQ ID NO:114的任一序列的氨基酸序列。
6.权利要求1-4任一项的多肽,由SEQ ID NO:5到SEQ ID NO:114的任一序列的氨基酸序列组成。
7.多核苷酸,其具有编码权利要求1-6的任一项所定义的多肽的核苷酸序列。
8.核酸构建体,包含权利要求7中定义的核苷酸序列,该核苷酸序列可操作地连接到一种或多种指导所述多肽在合适的宿主中生产的控制序列。
9.包含权利要求8中所定义的核酸构建体的重组表达载体。
10.包含权利要求8中所定义的核酸构建体的重组宿主细胞。
11.生产如权利要求1-6的任一项所定义的多肽的方法,该方法包括:
(a)在有助于产生该多肽的条件下,培养权利要求10所定义的重组宿主细胞;及
(b)回收该多肽。
12.包含如权利要求1-6的任一项所定义的多肽的组合物。
13.权利要求12的组合物,其还包含附加的杀生物剂。
14.杀死微生物细胞或抑制其生长的方法,包括将微生物细胞与如权利要求1-6的任一项所定义的多肽相接触。
15.去污剂组合物,包含表面活性剂和如权利要求1-6的任一项所定义的多肽。
16.如权利要求1-6的任一项所定义的多肽,其用作药物。
17.如权利要求1-6的任一项所定义的多肽,其用作兽用或人用抗微生物治疗剂或预防剂。
18.如权利要求1-6的任一项所定义的多肽在制备用于治疗微生物感染或预防用途的兽用或人用治疗剂中的用途。
19.如权利要求1-6的任一项所定义的多肽用于杀死微生物细胞或抑制其生长的用途。
20.转基因植物、植物部分或植物细胞,其用编码如权利要求1-6的任一项所定义的具有抗微生物活性的多肽的核苷酸序列转化。
21.至少一种如权利要求1-6的任一项所定义的多肽在动物饲料中的用途。
22.至少一种如权利要求1-6的任一项所定义的多肽在制备用于动物饲料的组合物中的用途。
23.动物饲料添加剂,包含:
(a)至少一种如权利要求1-6的任一项所定义的多肽,和
(b)至少一种脂溶性维生素,和/或
(c)至少一种水溶性维生素,和/或
(d)至少一种痕量矿物质,和/或
(e)至少一种大量矿物质。
24.权利要求23的动物饲料添加剂,还包含肌醇六磷酸酶,木聚糖酶,半乳聚糖酶和/或β-葡聚糖酶。
25.动物饲料组合物,具有50-800g/kg的粗蛋白含量,并包含至少一种如权利要求1-6的任一项所定义的多肽。
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