JP2008510452A - 抗菌ポリペプチド - Google Patents
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Abstract
Description
細菌、抗菌剤の種類は、病原耐性微生物の同時増加と共に、実質的に上昇している。耐性は、すべての臨床学的に入手できる抗菌剤に対して、現在認識されている。医学界における抗菌耐性に対する応答は、耐性細菌に対してこれまで使用されていない新規の又は他の抗生物質を使用することであった。このアプローチは、現在存在する化合物の変性として、又は細菌耐性機構を阻害するか又は回避することができる化合物の組合せとして、新規抗生物質の連続した開発を必要として来た。
本発明のもう1つの目的は、低められた溶血活性及び/又は低められた細胞毒性を有する新規抗菌ポリペプチドを供給することである。前記ポリペプチドはまた、カチオン、例えばCa2+, Mg2+, Na+に対して低められた感受性を示すことができる。
第1の観点においては、本発明は、下記配列番号2:
K-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17
[配列中、X1 = N, F, I, W, M, S, A, T, Y, V, H, L, C, K 又は G; X2 = L, I, F 又は W; X3 = R, I, F, L, Y, V, A, T,C,H, G, Q 又は P; X4 = R 又は C; X5 = I, L,W, M, V 又は F; X6 = I, L 又は W; X7 = R, L,T 又は C; X8 = K, V, F, L, C, Y, I, R, N 又は W; X9 = G, C, Y, L, F, W 又は V; X10 = I, W, F 又は R; X11 = H, K, C, A, S, I, N, L 又は Q; X12 = I, L, F 又は V; X13 = I, L, F, T 又は V; X14 = K, I, S, L 又は R; X15 = K, R 又は I; X16 = Y, I, L, F 又は K; X17 = G, I, S, L, R, F, T, C 又は V]
で表される、配列番号1のアミノ酸1〜18に対して55%〜100%の同一性を有するアミノ酸配列を含んで成る、抗菌活性を有するポリペプチドに関する。
もう1つの観点においては、本発明は、適切な宿主においてポリペプチドの生成を方向づける1又は複数の制御配列に作用可能に連結される本発明のヌクレオチド配列を含んで成る核酸構造体に関する。
もう1つの観点においては、本発明は、本発明の核酸構造体を含んで成る組換え発現ベクターに関する。
もう1つの観点においては、本発明は、本発明のポリペプチドの生成方法に関し、ここで前記方法は、
(a)本発明の組換え宿主細胞を、前記ポリペプチドの生成の助けとなる条件下で培養し;そして
(b)前記ポリペプチドを回収することを含んで成る。
定義:
本発明をさらに詳細に論じる前、次の用語及び慣例がまず、定義されるであろう:
抗菌活性:用語“抗菌活性”とは、微生物細菌を殺害するか、又はその増殖を阻害できる活性として本明細書において定義される。本発明においては、用語“抗菌”とは、殺細菌及び/又は静菌、及び/又は殺真菌及び/又は静真菌効果、及び/又はウィルス効果が存在することを意味し、ここで用語“殺菌”とは、細菌細胞を殺害できるものとして理解されるべきである。用語“静菌”とは、細菌増殖を阻害でき、すなわち細菌細胞の増殖を阻害できるものとして理解されるべきである。用語“殺真菌”とは、真菌を阻害でき、すなわち真菌細胞の増殖を阻害できるものとして理解されるべきである。用語“殺ウィルス”とは、ウィルスを不活性化できるものとして理解されるべきである。用語“微生物細胞”とは、細菌又は真菌細胞(酵母を包含する)を示す。
本発明のためには、抗菌活性は、Lehrer など., Journal of Immunological Methods, Vol. 137 (2) pp. 167-174 (1991)により記載される方法に従って決定され得る。
本発明のためには、2種のアミノ酸配列間の同一性の程度は、FASTAプログラムパッケージのバージョン2.0×に包含されるプログラムFASTAを用いて決定される(W. R. Pearson and D. J. Lipman (1988), "Improved Tools for Biological Sequence Analysis", PNAS 85:2444-2448; 及び W. R. Pearson (1990) "Rapid and Sensitive Sequence Comparison with FASTP and FASTA", Methods in Enzymology 183:63-98を参照のこと)。使用される評点マトリックスは、BLOSUM50であり、ギャップペナルティーは−12であり、そしてギャップ延長ペナルティーは−2であった。
発現:本発明においては、用語“発現”とは、ポリペプチドの生成に包含されるいずれかの段階、例えば転写、後−転写修飾、翻訳及び後−翻訳修飾(但し、それらだけには制限されない)を包含する。好ましくは、発現はまた、ポリペプチドの分泌を包含する。
宿主細胞:用語“宿主細胞”とは、本明細書において使用される場合、核酸構造体による形質転換に対して感受性であるいずれかの細胞型を包含する。
用語“ポリヌクレオチドプローブ”、“ハイブリダイゼーション”、及び種々の緊縮条件とは、“抗菌活性を有するポリペプチド”の標題のセクションにおいて定義される。
抗菌活性を有するポリペプチド:
第1の観点においては、本発明は、下記配列番号2:
K-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17
[配列中、X1 = N, F, I, W, M, S, A, T, Y, V, H, L, C, K 又は G; 好ましくは X1 = S, T, V, Y, W, I, G, F 又は L; X2 = L, I, F 又は W; 好ましくは X2 = W 又は I; X3 = R, I, F, L, Y, V, A, T,C,H, G, Q 又は P; 好ましくは X3 = F,I, V 又は L; X4 = R 又は C; X5 = I, L,W, M, V 又は F; 好ましくは X5 = L 又は I; X6 = I, L 又は W; 好ましくは X6 = I; X7 = R, L,T 又は C; X8 = K, V, F, L, C, Y, I, R, N 又は W; 好ましくは X8 = Y, F, W, V 又は L; X9 = G, C, Y, L, F, W 又は V; 好ましくは X9 = G 又は F; X10 = I, W, F 又は R; 好ましくは X10 = W 又は I; X11 = H, K, C, A, S, I, N, L 又は Q; 好ましくは X11 = I, S 又は K; X12 = I, L, F 又は V; 好ましくは X12 = L; X13 = I, L, F, T 又は V; 好ましくは X13 = L; X14 = K, I, S, L 又は R; 好ましくは X14 = I, R 又は L; X15 = K, R 又は I; X16 = Y, I, L, F 又は K; 好ましくは X16 = L; X17 = G, I, S, L, R, F, T, C 又は V; 好ましくは X17 = I, F 又は L]
で表される、配列番号1のアミノ酸1〜18に対して55%〜100%の同一性を有するアミノ酸配列を含んで成る、抗菌活性を有するポリペプチドに関する。1つの態様においては、アミノ酸配列は配列番号1に比較して、1,2,3,4,5,6,7又は8個(好ましくは、1,2,3,4,5又は6個;より好ましくは1,2,3,4又は5個;さらにより好ましくは1,2,3又は4個;さらにより好ましくは1,2又は3個;最も好ましくは1又は2個)のアミノ酸差異を有する。
K-R-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16
[配列中、X1 = L, I, F 又は W; 好ましくは X1 = W 又は I; X2 = R, I, F, L, Y, V, A, T, C, H, G, Q 又は P; 好ましくは X2 = F, I, V 又は L; X3 = R 又は C; X4 = I, L, W, M, V 又は F; 好ましくは X4 = L 又は I; X5 = I, L 又は W; 好ましくは X5 = I; X6 = R, L, T 又は C; X7 = K, V, F, L, C, Y, I, R, N 又は W; 好ましくは X7 = Y, F, W, V 又は L; X8 = G, C, Y, L, F, W 又は V; 好ましくは X8 = G 又は F; X9 = I, W, F 又は R; 好ましくは X9 = W 又は I; X10 = H, K, C, A, S, I, N, L 又は Q; 好ましくは X10 = I, S 又は K; X11 = I, L, F 又は V; 好ましくは X11 = L; X12 = I, L, F, T 又は V; 好ましくは X12 = L; X13 = K, I, S, L 又は R; 好ましくは X13 = I, R 又は L; X14 = K, R 又は I; X15 = Y, I, L, F 又は K; 好ましくは X15 = L; X16 = G, I, S, L, R, F, T, C 又は V; 好ましくは X16 = I, F 又は L]
で表される、配列番号1のアミノ酸1〜18に対して55%〜90%の同一を有するアミノ酸配列を含んで成る、抗菌活性を有するポリペプチドに関する。1つの態様においては、アミノ酸配列は配列番号1に比較して、2,3,4,5,6,7又は8個(好ましくは、2,3,4,5又は6個;より好ましくは2,3,4又は5個;さらにより好ましくは2,3又は4個;さらにより好ましくは2又は3個;最も好ましくは2個)のアミノ酸差異を有する。
K- X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-R-X11-X12-X13-X14-X15-X16
[配列中、X1 = N, F, I, W, M, S, A, T, Y, V, H, L, C, K 又は G; 好ましくは X1 = S, T, V, Y, W, I, G, F 又は L; X2 = L, I, F 又は W; 好ましくは X2 = W 又は I; X3 = R, I, F, L, Y, V, A, T, C, H, G, Q 又は P; 好ましくは X3 = F, I, V 又は L;X4 = R 又は C; X5 = I, L, W, M, V 又は F; 好ましくは X5 = L 又は I; X6 = I, L 又は W; 好ましくは X6 = I; X7 = R, L, T 又は C; X8 = K, V, F, L, C, Y, I, R, N 又は W; 好ましくは X8 = Y, F, W, V 又は L; X9 = G, C, Y, L, F, W 又は V; 好ましくは X9 = G 又は F; X10 = I, W, F 又は R; 好ましくは X10 = W 又は I; X11 = I, L, F 又は V; 好ましくは X11 = L; X12 = I, L, F, T 又は V; 好ましくは X12 = L; X13 = K, I, S, L 又は R; 好ましくは X13 = I, R 又は L; X14 = K, R 又は I; X15 = Y, I, L, F 又は K; 好ましくは X15 = L; X16 = G, I, S, L, R, F, T, C 又は V; 好ましくは X16 = I, F 又は L]
で表される、配列番号1のアミノ酸1〜18に対して55%〜90%の同一を有するアミノ酸配列を含んで成る、抗菌活性を有するポリペプチドに関する。
1つの態様においては、本発明のポリペプチドは、配列番号1のアミノ酸1〜18に対して、少なくとも60%の同一性、好ましくは少なくとも65%の同一性、少なくとも70%の同一性、少なくとも75%の同一性、又は少なくとも80%の同一性を有する。
もう1つの態様においては、前記ポリペプチドは、配列番号5〜114のいずれかのアミノ酸1〜18を含んで成り、好ましくはそれらから成る。
用語“配列番号2〜114のいずれか”とは、配列番号2,3,4又は配列番号5〜114のいずれかを意味する。
本発明のポリペプチドを製造するアミノ酸は、D又はL形から独立して選択され得る。
もう1つの態様においては、アミノ酸変化は、配列番号2〜114のいずれかのアミノ酸1〜18として示されるアミノ酸配列における第1のアミノ酸(リシン)の後への小アミノ酸(例えば、グリシン、アラニン、セリン又はトレオニン)の挿入である。
本発明のポリペプチドのN−末端延長は適切には、1〜50個のアミノ酸、好ましくは2〜20個のアミノ酸、特に3〜15個のアミノ酸から成る。1つの態様においては、N−末端ペプチド延長は、Arg(R)を含まない。もう1つの態様においては、N−末端延長は、下記にさらに定義されるように、kex2又はkex2−様分解部位を含んで成る。好ましい態様においては、N−末端は、少なくとも2個のGlu(E)及び/又はAsp(D)アミノ酸残基を含んで成るペプチド、例えば次の配列:EAE、EE、DE及びDDの1つを含んで成るN−末端延長である。
kex2部位(例えば、Methods in Enzymology Vol 185, ed. D. Goeddel, Academic Press Inc. (1990), San Diego, CA, "Gene Expression Technology"を参照のこと)及びkex2−様部位は、プロペプチドコード領域といくつかのタンパク質の成熟領域との間に見出される二塩基性認識部位(すなわち、分解部位)である。
本発明においては、kex2又はkex2−様部位の挿入は、配列番号2〜114のいずれかのアミノ酸1〜18として示される成熟ポリペプチドに比較して、延長される抗菌ポリペプチドをもたらすN−末端延長における一定の位置での分解を得るための可能性をもたらす。
本発明のポリペプチドはまた、もう1つのポリペプチドが本発明のポリペプチド又はそのフラグメントのN−末端又はC−末端で融合されている、融合されたポリペプチド又は分解できる融合ポリペプチドを包含する。融合されたポリペプチドは、本発明のヌクレオチド配列(又はその一部)に、もう1つのポリペプチドをコードするヌクレオチド配列(又はその一部)を融合することにより生成される。融合ポリペプチドを生成するための技法は、当業界において知られており、ポリペプチドをコードするコード配列を連結することを包含し、その結果、それらは読み取り枠を整合し、そして融合されたポリペプチドの発現は、同じプロモーター及びターミネーターの制御下にある。
本発明はまた、本発明のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドにも関する。特に、本発明は、本発明のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列から成るポリヌクレオチドに関する。遺伝子コードの縮重のために、当業者は、本発明のポリヌクレオチドの個々をコードするいくつかのヌクレオチド配列が調製され得ることを容易に認識するであろう。ヌクレオチドが本発明のポリペプチドのアミノ酸をコードするコドンを構成することは、当業界において良く知られている。
本発明はまた、適切な宿主細胞においてコード配列の発現を方向づける1又は複数の制御配列に作用可能に連結される本発明のヌクレオチド配列を、制御配列と適合できる条件下で含んで成る核酸構造体にも関する。
糸状菌宿主細胞のための好ましいリーダーは、アスペルギラス・オリザエTAKAアミラーゼ、アスペルギラス・ニジュランストリオースリン酸イソメラーゼについての遺伝子から得られる。
酵母宿主細胞のための有用なポリアデニル化配列は、Guo and Sherman, 1995, Molecular Cellular Biology 15: 5983-5990により記載されている。
本発明はまた、本発明の核酸構造体を含んで成る組換え発現ベクターにも関する。上記の種々のヌクレオチド及び制御配列は、1又は複数の便利な制限部位でポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の挿入又は置換を可能にするためにそれらの部位を含むことができる組換え発現ベクターを生成するために一緒に連結され得る。他方では、本発明のヌクレオチド配列は、前記ヌクレオチド配列又は前記配列を含んで成る核酸構造体を、発現のための適切なベクター中に挿入することによって発現され得る。発現ベクターを創造する場合、そのコード配列はベクターに位置し、その結果、コード配列は発現のための適切な制御配列により作用可能に連結される。
本発明のベクターは好ましくは、宿主細胞ゲノム中へのベクターの安定した組み込み、又は細胞のゲノムに無関係に細胞におけるベクターの自律的複製を可能にする要素を含む。
本発明の組換え発現ベクターを構成するために上記要素を連結するために使用される方法は、当業者に良く知られている(例えば、Sambrookなど., 1989, 前記を参照のこと)。
本発明はまた、ポリペプチドの組換え生成において都合良く使用される、本発明の核酸配列を含んで成る組換え宿主にも関する。本発明のヌクレオチド配列を含んで成るベクターは、そのベクターが染色体組み込み体として、又は前記のような自己複製染色体外ベクターとして維持されるように、宿主細胞中に導入される。
宿主細胞は、単細胞微生物、例えば原核生物、又は単細胞微生物、真核生物であり得る。
好ましい態様においては、宿主細胞は菌類細胞である“菌類”とは、本明細書において使用される場合、門アスコミコタ(Ascomycota)、バシジオミコタ(Basidiomycota)、キトリジオミコタ(Chytridiomycota)及びヅイゴミコタ(Zygomycota)(Hawksworth など., Ainsworth and Bisby’s Dictionary of the Fungi, 8th edition, 1995, CAB International, University Press, Cambridge, UKにより定義される)、及びオーミコタ(Oomycota)(Hawksworth など., 1995, 前記、171ページに引用される)、並びに栄養胞子菌(Hawksworh など., 1995, 前記)を包含する。
本発明はまた、(a)ポリペプチドの生成を助ける条件下で宿主細胞を培養し;そして(b)ポリペプチドを回収することを含んで成る、本発明のポリペプチドを生成するための方法にも関する。
得られるポリペプチドは、当業界において知られている方法により回収され得る。例えば、ポリペプチドは、従来の方法、例えば遠心分離、濾過、抽出、噴霧−乾燥、蒸発又は沈殿(但し、それらだけには限定されない)により、栄養培地から回収され得る。
本発明はまた、ポリペプチドを、回収可能な量で発現し、そして生成するために、本発明の抗菌活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列により形質転換されている、トランスジェニック植物、植物部分又は植物細胞にも関する。ポリペプチドは、植物又は植物部分から回収され得る。他方では、組換えポリペプチドを含む植物又は植物部分が、食品又は飼料の品質を改良するために、例えば、栄養価値、味のよさ及び流動性質を改良するために、又は抗栄養因子を破壊するために使用され得る。回収されたポリペプチド、植物、又は植物部分はまた、動物又は家畜において消化フロラを改良するか又は変更するためにも使用され得る。
また、そのような植物、植物部分及び植物細胞の子孫も、本発明の範囲内に包含される。
選択マーカー遺伝子、及び発現構造体のいずれかの他の部分は、当業界において入手できるものから選択され得る。
本発明はまた、(a)ポリペプチドの生成のために適切な条件下で、本発明の抗菌活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んで成るトランスジェニック植物又は植物細胞を培養し;そして(b)前記ポリペプチドを回収することを含んで成る本発明のポリペプチドを生成するための方法にも関する。
さらなる観点においては、本発明は、本発明の抗菌ポリペプチドを含んで成る組成物、例えば医薬組成物に関する。
組成物は、主要ポリペプチド成分、例えば一成分組成として、本発明のポリペプチドを含んで成る。
1つの態様においては、殺菌剤は、非酵素化学剤である。もう1つの態様においては、殺菌剤は、非ポリペプチド化学剤である。
組成物は、当業界において知られている方法に従って調製され、そして液体又は乾燥組成物の形で存在することができる。例えば、ポリペプチド組成物は、当業界において知られている方法に従って安定化され得る。
本発明はまた、本発明の抗菌ポリペプチドの種々の使用を包含する。抗菌ポリペプチドは、典型的には、細菌、菌類、酵母又は藻類による汚染にさらされるいずれかの遺伝子座で有用である。典型的には、遺伝子座、微生物が殺害される必要があり、又はそれらの増殖が制御される必要がある、水性システム、例えば冷却水システム、洗濯すすぎ水、油システム、例えば切削油、滑剤、油田及び同様のものにおいて存在する。しかしながら、本発明はまた、既知の抗菌組成物が有用であるすべての用途、例えば木材、ラテックス、接着剤、グルー、紙、厚紙、布、革、プラスチック、コーキング及び飼料に使用され得る。
従って、本発明の抗菌ポリペプチドは、例えばアクネ、眼又は口における感染、皮膚感染の処理において;足浴用塩において;コンタクトレンズ、硬質表面、歯(経口ケアー)、創傷、挫傷及び同様のものの清浄及び殺菌のために、消毒薬として有用である。
さらに、本発明の抗菌ポリペプチドは、食品加工プラントにおいて、及び食品が調製されるか又は加工されるいずれかの領域、例えば病院、老人ホーム、レストラン、特にファーストフードレストラン、デリカテッセン及び同様の場所における表面及び調理用品の清浄のために使用され得る。それは、食品における抗菌剤としても使用され得、そしてサラダバー上のチーズ、果物及び野菜、及び食品における表面抗菌剤として特に有用である。
本発明の抗菌ポリペプチドはまた、水ラインの微生物制御のために、及び水の消毒、特に産業用水の消毒のためにも有用である。
本発明はまた、本発明の抗菌ポリペプチド又は組成物の薬剤としての使用にも関する。さらに、本発明の抗菌ポリペプチド又は組成物はまた、微生物、例えば菌類又は細菌、好ましくはグラム陽性細菌を制御するか又は攻撃するための薬剤の製造のためにも使用され得る。
用語“有効量”とは、本明細書において使用される場合、配列番号2〜114のいずれかのアミノ酸1〜18として示されるアミノ酸配列、又はそれらのフラグメント又は変異体を含んで成る、問題の微生物の増殖を阻害するのに十分である抗菌ポリペプチドの量を意味する。
本発明はまた、創傷治癒組成物又は製品、例えば包帯、医療装置、例えばカテーテル、及び抗−フケ髪用製品、例えばシャンプーにも関する。
本発明の抗菌ポリペプチドの配合物はまた、皮膚感染、例えばアクネ、アトピー性皮膚炎又は脂漏性皮膚炎を有するか、又はその素因を有する宿主に投与され得;好ましくは、皮膚感染は、例えばスタフィロコーカス・エピダーミヂス、スタフィロコーカス・アウレウス、プロピオニバクテリウム・アクネス、ピチロスポラム・オバレ又はマラセジア・フルフルにより引起される細菌皮膚感染である。
本発明の化合物は、治療投与のために種々の配合物中に組込まれ得る。特に、本発明の化合物は、適切な医薬的に許容できるキャリヤー又は希釈剤と組合すことにより医薬組成物中に配合され、そして固体、半固体、液体又は気体形、例えば錠剤、カプセル、粉末、顆粒、軟膏、クリーム、発泡体、溶液、坐剤、注射剤、吸入剤、ゲル、微小球、ローション及びエアロゾルでも調製物中に配合され得る。化合物の投与は、種々の手段、例えば経口、頬内、直腸、非経口、腹膜内、皮膚内、経皮内、鞘内、等の投与で達成され得る。本発明の抗菌ポリペプチドは、投与の後、全身性であるか、又は移植の部位で活性用量を保持するように作用する移植物又は他の配合物の使用により局在化され得る。
化合物は、吸入を通して投与されるエアロゾル配合物に使用され得る。本発明の化合物は、加圧された許容できる噴射剤、例えばジクロロジフルオロメタン、プロパン、窒素及び同様のもの中に配合され得る。
さらに、化合物は、種々の塩基、例えば乳化塩基又は水溶性塩基と共に混合することにより、坐剤に製造され得る。本発明の化合物は、坐剤を通して直腸投与され得る。坐剤は、ビークル、例えば体温で溶解し、室温で固化される、コアアバター、カーボワックス及びポリエチレングリコールを含むことができる。
本発明の方法への使用に関しては、本発明の抗菌ポリペプチドは、他の医薬的活性剤、特に他の抗菌剤により配合され得る。興味ある他の剤は、当業界において知られているような広範囲の種類の抗生物質を包含する。抗生物質の種類は、ペニシリン、例えばペニシリンG、ペニシリンV、メチシリン、オキサシリン、カルベニシリン、ナフシリン、アンピシリン、等;β−ラクタマーゼインヒビターと組合してのペニシリン、セファロスポリン、例えばセファクロール、セファゾリン、セフロキシム、モキサラクタム、等;カルバペネム;モノベクタム;アミノグリコシド;テトラサイクリン;マクロリド;リンコマイシン;ポリミキシン;スルホンアミド;キノロン;クロラムフェニコール;メトロニダゾール;スペクチノマイシン;トリメトプリム、バンコマイシン、等を包含する。
本発明の抗菌ペプチドは、当業界において知られている従来の方法を用いて、インビトロ合成により調製され得る。種々の市販の合成装置、例えばApplied Biosystems Inc., Beckman, 等による自動化された合成機は市販されている。合成機を用いることにより、天然に存在するアミノ酸は、不自然なアミノ酸、特にD−異性体(又はD−形)、例えばD−アラニン及びD−イソロイシン、ジアステレオ異性体、異なった長さ又は官能性を有する側鎖、及び同様のものにより置換され得る。特定の配列及び調製の態様は、便利性、経済性、必要とされる純度及び同様のものにより決定されるであろう。
本発明はまた、動物飼料への抗菌活性を有するポリペプチドの使用方法、及び本発明の抗菌ポリペプチドを含んで成る飼料組成物及び飼料添加物にも向けられる。
本発明従っての使用においては、抗菌ポリペプチドは、食事の前、後又は同時に動物に供給され得る。後者が好ましい。
しかしながら、動物飼料への使用に関しては、純粋である抗菌ポリペプチドは必要ではなく;それは他の酵素を含むことができ、この場合、それは抗菌ポリペプチド調製物と呼ばれる。
そのような抗菌ポリペプチド調製物はもちろん、他の酵素と共に混合され得る。
特定の態様においては、植物タンパク質源は、1又は複数のマメ科植物、例えば大豆、ルピナス、エンドウ又はインゲン豆からの材料である。
植物タンパク質源の他の例は、ナタネ種子、及びキャベツである。
大豆は、好ましい植物タンパク質源である。
植物タンパク質源の他の例は、穀物、例えば大麦、小麦ライ麦、オート麦、トウモロコシ、イネ、ライコムギ及びモロコシである。
さらなる観点においては、本発明は、動物の飼料への使用のための組成物、例えば動物飼料及び動物飼料添加物、例えばプレミックスに関する。
さらに、任意の飼料添加物成分は、着色剤、;芳香化合物;安定剤;及び/又は中でも、フィターゼ(EC3.1.3.8又は3.1.3.26);キシラーゼ(EC3.2.1.8)、ガラクタナーゼ(EC3.2.1.89);及び/又はβグルカナーゼ(EC3.2.1.4)から選択された少なくとも1つの他の酵素である。
抗菌ペプチド(AMP)の例は、CAP18, Leucocin A, Tritrpticin, Protegrin-1, Thanatin, Defensin,及び Ovispirin 、例えば Novispirin (Robert Lehrer, 2000)、及び抗菌活性を保持するそれらの変異体又はフラグメントである。
次のものは、それらの成分の例の非制限的列挙である:
脂溶性ビタミンの例は、ビタミンA、ビタミンD3、ビタミンE及びビタミンK、例えばビタミンK3である。
微量鉱物の例は、マンガン、亜鉛、鉄、銅、ヨウ素、セレン及びコバルトである。
マクロ鉱物の例は、カルシウム、リン及びナトリウムである。
それらの成分(家禽、及び子豚/豚により例示される)の栄養必要条件は、WO01/58275号の表Aに列挙される。栄養必要条件とは、それらの成分が示される濃度で規定食に供給されるべきであることを意味する。
本発明の動物飼料組成物は、50−800g/kgの粗タンパク質含有率を有し、そしてさらに、本明細書に請求されるように、少なくとも1つの抗菌ポリペプチドを含んで成る。
粗タンパク質は、係数6.25により掛け算される窒素(N)、すなわち粗タンパク質(g/kg)=N(g/kg)×6.25として計算される。窒素含有率は、Kjeldahl方法 (A. O. A. C. , 1984, Official Methods of Analysis 14th ed., Association of Official Analytical Chemists, Washington DC)により決定され得る。
特定の態様においては、本発明の動物飼料組成物は、上記に定義されるような少なくとも1つの植物タンパク質の又はタンパク質源を含む。
抗菌ポリペプチドは、1又は複数の次の量(用量範囲)で投与される:0.01-200 ; 又は0.01-100 ; 又は0.05-100 ;又は0.05-50; 又は0.10-10−すべてのそれらの範囲はmgプロテアーゼタンパク質/kg飼料(ppm)である。
本発明の抗菌ポリペプチドは、洗剤組成物に添加され得、そして従って、洗剤組成物の成分になることができる。
本発明の洗剤組成物は、手動又は機械洗濯用洗剤組成物、例えば染色された布の前処理のために適切な洗濯用添加剤組成物及びすすぎ用布ソフトナー組成物として配合され得、又は一般的な家庭用硬質表面洗浄操作における使用のための洗剤組成物として配合され得、又は手動又は機械皿洗い操作のために配合され得る。
洗剤組成物は、非イオン性、例えば半−極性及び/又はアニオン性及び/又はカチオン性及び/又は両性イオンであり得る1又は複数の界面活性剤を含んで成る。界面活性剤は典型的には、0.1〜60重量%のレベルで存在する。
洗剤組成物においては、いずれかの酵素、特に本発明の酵素は、洗浄液体1L当たり0.01−100mgの酵素タンパク質、好ましくは洗浄液体1L当たり0.05−10mgの酵素タンパク質、より好ましくは洗浄液体1L当たり0.1−5mgの酵素タンパク質、特に好ましくは洗浄液体1L当たり0.1−1mgの酵素タンパク質に対応する量で添加され得ることが、現在企画される。
本発明はさらに次の例により記載されるが、それらは本発明の範囲を制限するものではない。
緩衝液及び基質として使用される化学物質は、少なくともし試薬品種の市販の製品であった。
配列番号1の変異体である、広範囲の合成抗菌ポリペプチドを、国際特許出願WO00/73433号の例1に開示されるようにして(少々の改良を伴う)、インデューサーとしてアラビノースを用いて、E. コリTOP10(Invitrogen)において発現した。本発明の抗菌ポリペプチドの発現は、宿主細胞の増殖阻害をもたらした。
(1−(サンプルOD−ブランク0D)/(対照ベクターOD−ブランクOD))×100
ここで、“ブランクOD”は空のウェルのODに対応する。
配列番号1に比較してのアミノ酸置換、及びその対応するポリペプチドの抗菌効果が、表1〜表3に列挙される。野生型は、個々の標準として包含された。
Error Prone PCRにより創造された、野生型遺伝子におけるランダム突然変異を含む50個のクローンを、E. コリTOP10ライブラリーからランダムに採取した。それらのクローンを、Bioscreen ODリーダーにより分析し、アラビノースの存在下での野生型に比較して、異なったクローンの増殖阻害の程度を定量化した(詳細には、例1を参照のこと)。すべてのクローンを配列決定し、突然変異の性質を決定した。得られるデータを、QSARモデルのために使用した。
自殺発現システムを用いて、野性型及び異なった変異体により得られた増殖阻害を、下記表に示す:
野生型をコードする合成遺伝子のクローニング:
抗菌活性アッセイのための野生型(配列番号1)を生成するために、合成遺伝子を製造し(下記を参照のこと)、そして発現ベクターpET31b+(Novagen Inc.)中に挿入した。合成遺伝子を、特別に企画されたオリゴヌクレオチド(プライマー1及び2)により構成した。
組換えpET31b+を用いて、製造業者(Novagen)により記載のようにして、E. コリNovablueを形質転換した。プラスミドを、QlAprep Mini Columns(QIAGEN Inc.)により調製し、そしてプラスミド特異的プライマー(プライマー3及び4)を用いて自動配列決定により配列決定した:
プライマー3(配列番号119):TGCTA GTTAT TGCTC AGCGG
プライマー4(配列番号120):ACCGT AGTTG CGCCC ATCG
直接的プラスミド増幅の方法を用いて、SES、QSAR及び合理的企画からの提供される変異体のさらなる確認のために配列における特定された位置での野生型の単一突然変異をコードするプラスミドを生成した(上記例を参照のこと)。
プラスミドを用いて、E. コリBLR−DE3を、その製造業者(Novagen)に従って形質転換した。細菌を、LB培地において約0.8のOD600まで培養し、そして組換えタンパク質合成を、1mMのIPTG(イソプロピルβ−E−チオガラクトピラノシド)により開始した。3時間の誘発の後、細菌を収穫し、1/10体積の緩衝液A(50mMのトリス−HCl、1mMのEDTA、100mMのNaCl、pH8)に再懸濁し、そして圧力破壊(1500mバール)により溶解した。得られるペレットを、緩衝液B(50 mM のトリス-HCI, 10 mMの EDTA, 0.5%のTritonX-100, 100 mMのNaCl, pH 8)により2度、洗浄した。すべての標準プロトコールは、他の場所に記載されてきた(Sambrook, Fritsch, and Maniatis, 1989)。
上記精製に起因するペレットは、精製された封入体を含んだ。KSIパートナーからペプチドを開放するために、酸化加水分解を、野生型をコードする遺伝子のN−末端側に導入され、構築されたAsp-Pro部位に対して行った。封入体を、100mMのリン酸ナトリウム(pH2.3)に再懸濁し、そして85℃で一晩インキュベートした。得られる上清液はペプチド(Pro-Arg-Glu-野生型)を含んだ。サンプルを、100mMのリン酸ナトリウム(pH12.3)の添加により中和した。ペプチドを成熟せしめるために、ペプチドを、グルタミルエンドペプチダーゼI(B. リケニホルミスからの)により処理した。成熟したペプチドは、質量−分光計により確められ、そしてさらに、標準クロマトグラフィー方法により精製された。
上記例をまた用いて、ランダムコドン(NNN)により特定コドンを置換する、変性プライマーを用いての位置2及び4でのランダム突然変異を生成した。これは、下記プライマー7+8により示され、位置4でのランダム変異体を製造する。位置2でのランダム変異体をまた、プライマー9+10を用いて生成した。
精製された変異体の直接的な抗菌活性を、下記のようにして評価した(例5)。次の4種の変異体は、スタフィロコーカス・アウレウスに対して、野生型よりも良好であることを現出された(MICはμg/mlにより表される)。
抗菌ポリペプチドの最少阻害濃度(MIC)の測定を通しての直接的抗菌活性を、マイクロブイヨン希釈アッセイを用いて評価した。変異体を、上記例に示されるようにして、又は化学合成を通して生成した。使用されるプロトコールは、カチオン調節されたMueller hintonブイヨンを用いて、NCCLS(www.nccls.org)による推薦に従う。スタフィロコーカス・アウレウス(ATCC29737)及びスタフィロコーカス・エピターミジス(DSM1798)からの細菌単離物を用いて、ペプチドの活性を特徴づけた。MICは、μg/mlで表される。
下記表は結果を示す。
Claims (25)
- 下記配列番号2:
K-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17
[配列中、X1 = N, F, I, W, M, S, A, T, Y, V, H, L, C, K 又は G; 好ましくは X1 = S, T, V, Y, W, I, G, F 又は L;
X2 = L, I, F 又は W; 好ましくは X2 = W 又は I;
X3 = R, I, F, L, Y, V, A, T,C,H, G, Q 又は P; 好ましくは X3 = F,I, V 又は L;
X4 = R 又は C;
X5 = I, L,W, M, V 又は F; 好ましくは X5 = L 又は I;
X6 = I, L 又は W; 好ましくは X6 = I;
X7 = R, L,T 又は C;
X8 = K, V, F, L, C, Y, I, R, N 又は W; 好ましくは X8 = Y, F, W, V 又は L;
X9 = G, C, Y, L, F, W 又は V; 好ましくは X9 = G 又は F;
X10 = I, W, F 又は R; 好ましくは X10 = W 又は I;
X11 = H, K, C, A, S, I, N, L 又は Q; 好ましくは X11 = I, S 又は K;
X12 = I, L, F 又は V; 好ましくは X12 = L;
X13 = I, L, F, T 又は V; 好ましくは X13 = L;
X14 = K, I, S, L 又は R; 好ましくは X14 = I, R 又は L;
X15 = K, R 又は I;
X16 = Y, I, L, F 又は K; 好ましくは X16 = L;
X17 = G, I, S, L, R, F, T, C 又は V; 好ましくは X17 = I, F 又は L]
で表される、配列番号1のアミノ酸1〜18に対して55%〜100%の同一性を有するアミノ酸配列を含んで成る、抗菌活性を有するポリペプチド。 - 下記配列番号3:
K-R-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16
[配列中、X1 = L, I, F 又は W; 好ましくは X1 = W 又は I;
X2 = R, I, F, L, Y, V, A, T, C, H, G, Q 又は P; 好ましくは X2 = F, I, V 又は L;
X3 = R 又は C;
X4 = I, L, W, M, V 又は F; 好ましくは X4 = L 又は I;
X5 = I, L 又は W; 好ましくは X5 = I;
X6 = R, L, T 又は C;
X7 = K, V, F, L, C, Y, I, R, N 又は W; 好ましくは X7 = Y, F, W, V 又は L;
X8 = G, C, Y, L, F, W 又は V; 好ましくは X8 = G 又は F;
X9 = I, W, F 又は R; 好ましくは X9 = W 又は I;
X10 = H, K, C, A, S, I, N, L 又は Q; 好ましくは X10 = I, S 又は K;
X11 = I, L, F 又は V; 好ましくは X11 = L;
X12 = I, L, F, T 又は V; 好ましくは X12 = L;
X13 = K, I, S, L 又は R; 好ましくは X13 = I, R 又は L;
X14 = K, R 又は I;
X15 = Y, I, L, F 又は K; 好ましくは X15 = L;
X16 = G, I, S, L, R, F, T, C 又は V; 好ましくは X16 = I, F 又は L]
で表される、配列番号1のアミノ酸1〜18に対して55%〜90%の同一を有するアミノ酸配列を含んで成る、抗菌活性を有するポリペプチド。 - 下記配列番号4:
K- X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-R-X11-X12-X13-X14-X15-X16
[配列中、X1 = N, F, I, W, M, S, A, T, Y, V, H, L, C, K 又は G; 好ましくは X1 = S, T, V, Y, W, I, G, F 又は L;
X2 = L, I, F 又は W; 好ましくは X2 = W 又は I;
X3 = R, I, F, L, Y, V, A, T, C, H, G, Q 又は P; 好ましくは X3 = F, I, V 又は L;
X4 = R 又は C;
X5 = I, L, W, M, V 又は F; 好ましくは X5 = L 又は I;
X6 = I, L 又は W; 好ましくは X6 = I;
X7 = R, L, T 又は C;
X8 = K, V, F, L, C, Y, I, R, N 又は W; 好ましくは X8 = Y, F, W, V 又は L;
X9 = G, C, Y, L, F, W 又は V; 好ましくは X9 = G 又は F;
X10 = I, W, F 又は R; 好ましくは X10 = W 又は I;
X11 = I, L, F 又は V; 好ましくは X11 = L;
X12 = I, L, F, T 又は V; 好ましくは X12 = L;
X13 = K, I, S, L 又は R; 好ましくは X13 = I, R 又は L;
X14 = K, R 又は I;
X15 = Y, I, L, F 又は K; 好ましくは X15 = L;
X16 = G, I, S, L, R, F, T, C 又は V; 好ましくは X16 = I, F 又は L]
で表される、配列番号1のアミノ酸1〜18に対して55%〜90%の同一を有するアミノ酸配列を含んで成る、抗菌活性を有するポリペプチド。 - 前記アミノ酸配列が、配列番号1のアミノ酸1〜18に対して、少なくとも60%の同一性、好ましくは少なくとも65%の同一性、少なくとも70%の同一性、少なくとも75%の同一性、又は少なくとも80%の同一性を有する請求項1〜3のいずれか1項記載のポリペプチド。
- 配列番号5〜114のいずれかのアミノ酸配列を含んで成る請求項1〜4のいずれか1項記載のポリペプチド。
- 配列番号5〜114のいずれかのアミノ酸配列から成る請求項1〜4のいずれか1項記載のポリペプチド。
- 請求項1〜6のいずれか1項記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド。
- 適切な宿主においてポリペプチドの生成を方向づける1又は複数の制御配列に操作可能的に連結される請求項7記載のヌクレオチド配列を含んで成る核酸構造体。
- 請求項8記載の核酸構造体を含んで成る組換え発現ベクター。
- 請求項8記載の核酸構造体を含んで成る組換え宿主細胞。
- 請求項1〜6のいずれか1項記載のポリペプチドの生成方法であって、
(a)請求項10記載の組換え宿主細胞を、前記ポリペプチドの生成の助けとなる条件下で培養し;そして
(b)前記ポリペプチドを回収することを含んで成る方法。 - 請求項1〜6のいずれか1項記載の抗菌ポリペプチドを含んで成る組成物。
- 追加の殺生物剤をさらに含んで成る請求項12記載の組成物。
- 請求項1〜6のいずれか1項記載の抗菌ポリペプチドと、微生物細胞とを接触することを含んで成る、微生物細胞の増殖を殺害するか又は阻害するための方法。
- 界面活性剤、及び請求項1〜6のいずれか1項記載の抗菌ポリペプチドを含んで成る洗剤組成物。
- 薬剤としての使用のための請求項1〜6のいずれか1項記載の抗菌ポリペプチド。
- 家畜又はヒト治療又は予防抗菌剤としての使用のための請求項1〜6のいずれか1項記載の抗菌ポリペプチド。
- 微生物感染の処理又は予防使用のための家畜又はヒト治療剤の調製への使用のためへの請求項1〜6のいずれか1項記載の抗菌ポリペプチドの使用。
- 微生物細胞を殺害するか又はその増殖を阻害するための請求項1〜6のいずれか1項記載の抗菌ポリペプチドの使用。
- 請求項1〜6のいずれか1項記載の抗菌活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列により形質転換されている、トランスジェニック植物、植物部分又は植物細胞。
- 動物飼料への少なくとも1つの請求項1〜6のいずれか1項記載の抗菌ポリペプチドの使用。
- 動物飼料への使用のための組成物の調製への少なくとも1つの請求項1〜6のいずれか1項記載の抗菌ポリペプチドの使用。
- (a)少なくとも1つの請求項1〜6のいずれか1項記載の抗菌ポリペプチド;及び
(b)少なくとも1つの脂溶性ビタミン、及び/又は
(c)少なくとも1つの水溶性ビタミン、及び/又は
(d)少なくとも1つの微量鉱物、及び/又は
(e)少なくとも1つのマクロ鉱物、
を含んで成る動物飼料添加物。 - フィターゼ、キシラナーゼ、ガラクタナーゼ及び/又はβ−グルカナーゼをさらに含んで成る請求項23記載の動物飼料添加剤。
- 1kg当たり50〜800gの粗タンパク質、及び少なくとも1つの請求項1〜6のいずれか1項記載の抗菌ポリペプチドを含んで成る動物飼料組成物。
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