JP4361796B2 - シュードプレクタニア・ニグレラからの抗菌ポリペプチド - Google Patents
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Description
(a) 配列番号2のアミノ酸1〜40と少なくとも65%の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなるポリペプチド;
(b) シュードプレクタニア・ニグレラ (Pseudoplectania nigrella) CBS 444.97中に存在するヌクレオチド配列の抗菌ポリペプチドをコードする部分によりコードされるポリペプチドと少なくとも65%の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなるポリペプチド;
(i) 配列番号1のヌクレオチド166〜285の相補鎖、
(ii) 配列番号1のヌクレオチド70〜285の相補鎖、および
(iii) 配列番号1のヌクレオチド1〜285の相補鎖、および
(d) 抗菌活性を有する (a)、(b) または (c) のフラグメント。
第3の面において、本発明は、本発明のポリペプチドをコードし、適当な宿主におけるポリペプチドの産生を指令する1または2以上の調節配列に作用可能に連鎖されたヌクレオチド配列を含んでなる核酸構築物に関する。
第4の面において、本発明は、本発明の核酸構築物を含んでなる組換え発現ベクターに関する。
第5の面において、本発明は、本発明の核酸構築物を含んでなる組換え宿主細胞に関する。
(a) 野生型の形態においてポリペプチドを産生することができる株を培養してポリペプチドを産生し、そして
(b) ポリペプチドを回収する。
第7の面において、本発明は、下記の工程を含んでなる、本発明のポリペプチドを製造する方法:
(a) ポリペプチドの産生を促す条件下に本発明の組換え宿主細胞を培養し、そして
(b) ポリペプチドを回収する。
定義
本発明をさらに詳細に論ずるの前に、下記の用語およびコンベンションをまず定義する:
実質的に純粋なポリペプチド:本発明の関係において、用語「実質的に純粋なポリペプチド」は、最大10重量%の自然に関連する他のポリペプチド物質を含有するポリペプチド調製物を意味する (他のポリペプチド物質のより低い百分率が好ましい、例えば、最大8重量%、最大6重量%、最大5重量%、最大4重量%、最大3重量%、最大2重量%、最大1重量%、および最大0.5重量%)。
本発明の目的に対して、抗菌活性は下記の文献に記載されている手法に従い決定できる:Lehrer他、JouRNAl of Immunological Methods、Vol. 137 (2) pp. 167−174 (1991)。
抗菌活性を有するポリペプチドは、20℃において抗菌活性を有するポリペプチドの25%(w/w) の水溶液、好ましくは10%(w/w) 水溶液、より好ましくは5%(w/w) の水溶液、さらにより好ましくは1%(w/w) の水溶液、最も好ましくは0.5%(w/w) の水溶液、特に0.1%(w/w) の水溶液中で30分間インキュベートした後、大腸菌 (Escherichia coli) (DSN 1576) の生きている細胞の数を1/100に減少させることができる。
本発明の目的に対して、2アミノ酸配列間の同一性の程度は、FASTAプログラムパッケージのバージョン2.0の中に含まれるプログラムFASTAを使用して決定される (W. R. PearsonおよびD. J. Lipman (1988) 、”Improved Tools for Biological Sequence Analysis”、PNAS 85:2444−2448;およびW. R. Pearson (1990) 、”Rapid and Sensitive Sequence Comparison with FASTPおよびFASTA”、Methods in Enzymology 183:63−98参照)。使用したスコアリングマトリックスはBLOSUM 50であり、ギャップペナルティーは−12であり、そしてギャップエクステンションペナルティーは−2であった。
発現:本発明の関係において、用語「発現」はペプチド産生における任意の工程を包含し、この工程は転写、転写後の修飾、翻訳、翻訳後の修飾、および分泌を包含するが、これらに限定されない。
宿主細胞:用語「宿主細胞」は、本明細書において使用するとき、核酸構築物を使用する形質転換に対して感受性である、任意の細胞型を包含する。
用語「ポリヌクレオチドプローブ」、「ハイブリーダーイゼーション」ならびに種々のストリンジェンシイの条件は、「抗菌活性を有するポリペプチド」と題する節において定義される。
抗菌活性を有するポリペプチド
第1の態様において、本発明は抗菌活性を有するポリペプチドに関し、ここでポリペプチドは、好ましくは配列番号2のアミノ酸1〜40 (すなわち、成熟ポリペプチド) に対してある程度の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなり、好ましくは前記アミノ酸配列から成り、同一性は少なくとも65%、好ましくは少なくとも70%、例えば少なくとも75%、より好ましくは少なくとも80%、例えば少なくとも85%、さらにより好ましくは少なくとも90%、最も好ましくは少なくとも95%、例えば少なくとも96%、例えば少なくとも97%、さらに最も好ましくは少なくとも98%、例えば少なくとも99%である (以後において「相同ポリペプチド」)。
本発明のポリペプチドを構成するアミノ酸は、独立にD型またはL型から選択することができる。
好ましくは、配列番号2のアミノ酸1〜40に比較した、このような置換、欠失および/または挿入の数は、最大10、例えば最大9、例えば最大8、より好ましくは最大7、例えば最大6、例えば最大5、最も好ましくは最大4、例えば最大3、例えば最大2、特に最大1である。
本発明の他の興味ある態様において、ポリヌクレオチドプローブは配列番号2のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の相補鎖である。本発明のそれ以上の興味ある態様において、ポリヌクレオチドプローブは配列番号1の相補鎖である。なおそれ以上の本発明の興味ある態様において、ポリヌクレオチドプローブは配列番号1の成熟ポリペプチドをコードする領域の相補鎖である。本発明の他の興味ある態様において、ポリヌクレオチドプローブはシュードプレクタニア・ニグレラ (Pseudoplectania nigrella) CBS 444.97中に存在する抗菌ポリペプチドをコードする領域の相補鎖である。本発明のなお他の興味ある態様において、シュードプレクタニア・ニグレラ (Pseudoplectania nigrella) CBS 444.97中に存在する成熟抗菌ポリペプチドをコードする領域の相補鎖である。
N末端のエクステンションは適当には1〜50アミノ酸、好ましくは2〜20アミノ酸、特に3〜15アミノ酸から成ることができる。1つの態様において、N末端のペプチドエクステンションはArg (R) を含有しない。他の態様において、N末端のエクステンションは、以後さらに定義するように、kex2またはkex2様切断部位を含んでなる。好ましい態様において、N末端のエクステンションは少なくとも2つのGlu (E) および/またはAsp (D) アミノ酸残基を含んでなるペプチドである、例えば、N末端のエクステンションは下記の配列の1つを含んでなる:EAE、EE、DE、DD。
kex2部位 (例えば、Methods in Enzymology Vol. 185、編者D. Goeddel、Academic Press Inc. (1990) 、カリフオールニア州サンディエゴ、”Gene Expression Technology”参照) およびkex2様部位はプロペプチドエンコーディング領域といくつかのタンパク質の成熟領域との間に見出される二塩基性認識部位 (すなわち、切断部位) である。
kex2部位またはkex2様部位の挿入は、ある場合において、プロペプチド切断部位における正しいエンドペプチダーゼのプロセシングを改良して、タンパク質分泌レベルを増加させる。
本発明の関係において、kex2部位またはkex2様部位の挿入はN末端のエクステンションにおけるある位置を切断して、配列番号2のアミノ酸1〜40に示す成熟ポリペプチドに比較して延長されている抗菌ポリペプチドを生ずる可能性を発生させる。
本発明のポリペプチドは、任意の属の微生物から得ることができる。本発明の目的に対して、本明細書において使用する用語「から得る」は、ヌクレオチド配列が天然に存在する細胞またはヌクレオチド配列が挿入されている細胞により、ヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドが産生されることを意味する。好ましい態様において、ポリペプチドは細胞外に分泌される。
前述の種について、本発明は、それらが知られている種名に無関係に、完全な種および不完全な種の両方、および分類学上の同等物、例えば、アナモルフを包含することが理解されるであろう。当業者は適当な同等物を容易に認識するであろう。
また、本発明は、本発明のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドに関する。特に、本発明は、本発明のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列から成るポリヌクレオチドに関する。好ましい態様において、ヌクレオチド配列は配列番号1に記載されている。より好ましい態様において、ヌクレオチド配列は配列番号1の成熟ポリペプチドコーディング領域である。他のより好ましい態様において、ヌクレオチド配列はシュードプレクタニア・ニグレラ (Pseudoplectania nigrella) CBS 444.97中に存在する成熟抗菌ポリペプチドコーディング領域である。本発明は、また、遺伝暗号のデジェネラシーにより配列番号1と異なる、配列番号2のアミノ酸配列から成るポリペプチドまたはその成熟ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有する、好ましくは前記ヌクレオチド配列から成る。
本発明は、また、配列番号1の成熟ポリペプチドエンコーディング配列中の少なくとも1つの修飾を含んでなり、そして修飾されたヌクレオチド配列が配列番号2のアミノ酸1〜40から成るポリペプチドをコードする、修飾されたヌクレオチド配列を有する、好ましくは前記ヌクレオチド配列から成る、ポリヌクレオチドである。
本発明は、また、調節配列と適合性の条件下に適当な宿主細胞におけるコーディング配列の発現を指令する1または2以上の調節配列に作用可能に連鎖された、本発明のヌクレオチド配列を含んでなる核酸構築物に関する。
本発明のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を種々の方法で操作して、ポリペプチドを発現させることができる。ベクターの中へヌクレオチド配列を挿入する前に、発現ベクターに依存してヌクレオチド配列を操作することは望ましいか、あるいは必要であることがある。組換えDNA法を利用してヌクレオチド配列を修飾する技術は、この分野においてよく知られている。
糸状菌宿主細胞のために好ましいリーダー配列は、アスペルギルス・オリゼ (Aspergillus oryzae) TAKAアミラーゼおよびアスペルギルス・ニヅランス (Aspergillus nidulans) トリオースリン酸イソメラーゼの遺伝子から得られる。
糸状菌宿主細胞のために好ましいポリアデニル化配列は、アスペルギルス・オリゼ (Aspergillus oryzae) TAKAアミラーゼ、アスペルギルス・ニガー (Aspergillus niger) グルコアミラーゼ、アスペルギルス・ニヅランス (Aspergillus nidulans) アントラニル酸シンターゼ、フザリウム・オキシスポラム (Fusarium oxysporum) トリプシン様プロテアーゼ、およびアスペルギルス・ニガー (Aspergillus niger) α−グルコシダーゼの遺伝子から得られる。
調節配列は、また、ポリペプチドのアミノ末端に作用可能に連鎖されたアミノ酸配列をコードし、コード化ポリペプチドを細胞の分泌経路の中へ向ける、シグナルペプチドコーディング領域であることができる。ヌクレオチド配列のコーディング配列の5’ 末端は、分泌されたポリペプチドをコードするコーディング領域のセグメントと翻訳リ−デイングフレ−ムで自然に結合された、シグナルペプチドコーディング領域を固有に含有することができる。
細菌宿主細胞のために有効なシグナルペプチドコーディング領域は、バシラス (Bacillus) NCIB 11837マルトジェニックアミラーゼ、バシラス・ステアロサーモフィラス (Bacillus stearothermophilus) α−アミラーゼ、バシラス・リヘニフオールミス (Bacillus licheniformis) スブチリシン、バシラス・リヘニフオールミス (Bacillus licheniformis) β−ラクタマーゼ、バシラス・ステアロサーモフィラス (Bacillus stearothermophilus) 中性プロテアーゼ (nprT、nprS、nprM) 、およびバシラス・サチリス (Bacillus subtilis) prsAの遺伝子から得られるシグナルペプチドコーディング領域である。それ以上のシグナルペプチドは下記の文献に記載されている:SimonenおよびPafva、1993、Microbiological Reviews 57:109−137。
シグナルペプチドおよびプロペプチド領域の両方がポリペプチドのアミノ末端に存在する場合、プロペプチド領域はポリペプチドのアミノ末端の次に位置し、そしてシグナルペプチドはプロペプチド領域のアミノ末端の次に位置する。
本発明は、また、本発明の核酸構築物を含んでなる組換え発現ベクターに関する。種々のヌクレオチド配列および調節配列を一緒に接合して組換え発現ベクターを製造することができ、これらのベクターは1または2以上の便利な制限部位を含み、このような部位におけるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の挿入または置換を可能とする。選択的に、本発明のヌクレオチド配列またはこの配列を含んでなる核酸構築物を適当な発現用ベクター中に挿入することによって、本発明のヌクレオチド配列を発現させることができる。発現ベクターをつくるとき、コーディング配列が適当な発現用調節配列と作用可能に連鎖するように、コーディング配列をベクター中に位置決定する。
ベクターは自己複製を保証する、任意の手段を含有することができる。選択的に、ベクターは、宿主細胞の中に導入されるとき、ゲノム中に組込まれ、それが組込まれている、1または2以上の染色体と一緒に複製されるものことができる。さらに、単一のベクターまたはプラスミド、あるいは宿主細胞のゲノムの中に導入すべき全DNAを一緒に含有する、2またはそれ以上のベクターまたはプラスミド、またはトランスポゾーンを使用できる。
本発明のベクターは、宿主細胞ゲノムの中へのベクターの安定な組込みまたは遺伝子に対して独立な細胞におけるベクターの自律的複製を可能とする、1または2以上の因子を含有することが好ましい。
前述の因子を結合して本発明の組換え発現ベクターを構築する手法は、この分野において知られている (例えば、下記文献を参照のこと、Sambrook他、1989、前掲)。
本発明は、また、ポリペプチド組換え体の産生において好都合に使用される、本発明の核酸構築物を含んでなる組換え宿主細胞に関する。ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んでなるベクターを宿主細胞の中に導入し、こうしてベクターが染色体組込み体として、または前述したように自己複製する染色体外ベクターとして維持されるようにする。
宿主細胞は単細胞微生物、例えば、原核生物、または非単細胞微生物、例えば、真核生物であることができる。
宿主細胞は真核生物、例えば、哺乳動物、昆虫、植物、または菌類細胞であることができる。
本発明は、また、(a) その野生型の形態において、ポリペプチドを産生することができる株を培養し、そして (b) ポリペプチドを回収することを含んでなる、本発明のポリペプチドを製造する方法に関する。好ましくは、株はシュードモナス (Pseudomonas) 属、最も好ましくはシュードプレクタニア・ニグレラ (Pseudoplectania nigrella) である。
本発明は、また、(a) ポリペプチドの産生を促す条件下に細胞を培養し、そして (b) ポリペプチドを回収することを含んでなる、本発明のポリペプチドを製造する方法に関する。
生ずるポリペプチドをこの分野において知られている方法により回収することができる。例えば、ポリペプチドは栄養培地から慣用法により回収可能であり、このような方法は遠心法、濾過、抽出、噴霧乾燥、蒸発、または沈降を包含するが、これらに限定されない。
本発明は、また、ポリペプチドを回収可能な量で発現および産生するように、本発明の抗菌活性を有するヌクレオチド配列で形質転換された、トランスジェニック植物、植物部分、または植物細胞に関する。ポリペプチドを植物または植物部分から回収できる。選択的に、組換えポリペプチドを含有する植物または植物部分をそのまま使用して、食物または飼料の品質を改良する、例えば、栄養価、嗜好性、および流動学的性質を改良するか、あるいは反栄養因子を破壊することができる。また、回収されたポリペプチド、植物または植物部分を使用して、動物および家畜における消化フロラを改良することができる。
植物部分の例は、茎、カルス、葉、根、果実、種子、および塊茎である。また、特定の植物組織、例えば、葉緑体、アポプラスト、ミトコンドリア、液胞、ペルオキシソ−ム、および細胞質は植物部分であると考えられる。さらに、任意の植物細胞は、どんな組織由来であっても、植物部分であると考えられる。
本発明のポリペプチドを発現するトランスジェニック植物または植物細胞は、この分野において知られている方法に従い構築することができる。簡単に述べると、本発明のポリペプチドをコードする1または2以上の発現構築物を植物宿主の中に組込み、生ずる修飾された植物または植物細胞をトランスジェニック植物または植物細胞に繁殖させることによって、植物または植物細胞を構築する。
選択可能なマーカー遺伝子および発現構築物の他の部分は、この分野において入手可能なものから選択することができる。
本発明は、また、(a) 本発明の抗菌活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んでなるトランスジェニック植物または植物細胞を、前記ポリペプチドの産生を促す条件下に、培養し、そして (b) 前記ポリペプチドを回収することを含んでなる、本発明のポリペプチドを製造する方法に関する。
なお他の態様において、本発明は、本発明の抗菌ポリペプチドを含んでなる、組成物、例えば医薬組成物に関する。
ある態様において、生物致死剤は非酵素化学剤である。他の態様において、生物致死剤は非ポリペプチド化学剤である。
生物致死剤は、大腸菌 (Escherichia coli) (DSM 1576) の生きている細胞の数を、生物致死剤の25%(w/w) の水溶液中で、好ましくは10%(w/w) の水溶液中で、最も好ましくは5%(w/w) の水溶液中で、さらにより好ましくは1%(w/w) の水溶液中で、最も好ましくは0.5%(w/w) の水溶液中で、特に0.1%(w/w) の水溶液中で、20℃において30分間のインキュベ−ション後、1/100に減少させる。
生物致死剤は、バシラス・サチリス(Bacillus subtilis) (ATCC 6633) の生きている細胞の数を、生物致死剤の25%(w/w) の水溶液中で、好ましくは10%(w/w) の水溶液中で、最も好ましくは5%(w/w) の水溶液中で、さらにより好ましくは1%(w/w) の水溶液中で、最も好ましくは0.5%(w/w) の水溶液中で、特に0.1%(w/w) の水溶液中で、20℃において30分間のインキュベ−ション後、1/100に減少させる。
組成物の本発明の抗菌ポリペプチドおよび生物致死剤は、相乗的抗菌作用が得られるように、選択することができる。
組成物はこの分野において知られている方法に従い調製することができ、そして液状または乾燥組成物の形態であることができる。例えば、ポリペプチド組成物は粒状または微粒状の形態であることができる。組成物中に添加すべきポリペプチドは、この分野において知られている方法に従い安定化することができる。
本発明のポリペプチド組成物を使用する好ましい例を後述する。本発明のポリペプチド組成物の投与量および組成物を使用する他の条件は、この分野において知られている方法に基づいて決定することができる。
本発明は、また、抗菌ポリペプチドの種々の使用を包含する。抗菌ポリペプチドは、典型的には、細菌、真菌、酵母または藻類による汚染に暴露される位置において有効である。典型的には、微生物を殺す必要があるか、あるいは微生物の増殖を制御する必要がある、水性系、例えば、冷却水系、洗濯すすぎ水、油系、例えば、切削油、潤滑油、油田およびその他の中に位置は存在する。しかしながら、本発明は、また、既知の抗菌組成物が有効である、すべての用途、例えば、木材、ラテックス、接着剤、にかわ、紙、厚紙、繊維材料、皮革、プラスチック、コーキング材、および飼料の保護において使用することができる。
こうして、本発明の抗菌ポリペプチドは、消毒剤として、例えば、アクネ、眼または口の感染、皮膚の感染の治療において;発汗防止剤または防臭剤において;足浴塩において;コンタクトレンズ、硬質表面、歯 (口腔のケアー) 、創傷、挫傷およびその他のクリーニングおよび消毒のために有効である。
本発明の抗菌ポリペプチドは、食物加工プラント、および食物を調製または供給する区域、例えば、病院、ナーシングホ−ム、レストラン、特にファーストフードレストラン、調理済み食品店およびその他における、表面および料理台所道具のクリーニングにさらに使用できる。また、それは食物製品における抗微生物剤として使用することができ、そしてサラダバー上のチーズ、果物および野菜および食物における表面抗微生物剤として特に有効であろう。
本発明の抗菌ポリペプチドは、また、水ラインの微生物制御、および水の消毒、特に工業用水の消毒に有効である。
本発明は、また、薬剤として本発明の抗菌ポリペプチドまたは組成物を使用することに関する。さらに、本発明の抗菌ポリペプチドまたは組成物は、また、微生物、例えば、真菌生物または細菌、好ましくはグラム陽性菌を制御または防除する薬剤の製造に使用できる。
用語「有効量」は、本発明において使用するとき、問題の微生物の増殖を阻害するために十分である、配列番号2のアミノ酸1〜40として示すアミノ酸配列、またはそのフラグメントまたは変異型を含んでなる抗菌ポリペプチドの量を意味することを意図する。
本発明は、また、創傷治癒組成物または製品、例えば、帯具、医学的装置、例えば、カテーテル、さらに抗ふけ毛製品、例えば、シャンプーに関する。
本発明の抗菌ポリペプチドは、in vitro合成において、この分野において知られている慣用法を使用して製造することができる。種々の商業的合成装置は、入手可能な、例えば、自動化合成装置 (Applied Biosystems, Inc.、Beckman、およびその他) である。合成装置を使用することによって、天然に産出するアミノ酸を天然に見出されないアミノ酸、特にD−異性体 (またはD−型) 、例えば、D−アラニンおよびD−イソロイシン、ジアステレオマー、異なる長さまたは機能を有する側鎖、およびその他で置換することができる。特定の配列および製造方法は、便利さ、必要な純度、およびその他により決定されるであろう。
必要ならば、他の分子または表面に対する結合を可能とする、種々の基を合成または発現の間にペプチドの中に導入することができる。こうして、チオエーテルを形成するためにシステイン、金属イオン複合体に対する結合を形成するためにヒスチジン、アミドまたはエステルを形成するためにカルボキシル基、アミドを形成するためにアミノ基、およびその他を使用することができる。
本発明は、また、動物飼料において抗菌活性を有するポリペプチドを使用する方法、ならびに本発明の抗菌ポリペプチドを含んでなる飼料組成物および飼料添加剤に関する。
動物という用語は、人間を含む、すべての動物を包含する。動物の例は、非反芻動物、および反芻動物、例えば、雌牛、ヒツジおよびウマである。特定の態様において、動物は非反芻動物である。非反芻動物は、単胃動物、例えば、ブタ (子豚、成長するブタ、および雄ブタを包含するが、これらに限定されない);家禽、例えば、シチメンチョウおよびニワトリ (ブロイラーひな、産卵鶏を包含するが、これらに限定されない);若い仔ウシ;および魚類 (サケを包含するが、これらに限定されない) を包含する。
本発明による使用において、食事の前、後、またはそれと同時に抗菌ポリペプチドを動物に供給することができる。
しかしながら、動物において使用するために、抗菌ポリペプチドはその純度であることは必要ではない;それは、例えば、他の酵素を含むことができ、この場合において、それは抗菌ポリペプチド調製物と命名される。
このような抗菌ポリペプチド調製物は、もちろん、他の酵素と混合することができる。
植物性タンパク質という用語は、本明細書において使用するとき、植物に由来するか、あるいは植物を起源とする少なくとも1種のタンパク質、例えば、修飾されたタンパク質およびタンパク質誘導体を包含する、任意のコンパウンド、組成物、調製物または混合物を意味する。特定の態様において、植物性タンパク質のタンパク質含有率は少なくとも10、20、30、40、50、または60% (w/w) である。
特定の態様において、植物性タンパク質源は、科ファバセアエ (Fabaceae) の1または2以上の植物、例えば、ダイズ、ハウチワマメ、エンドウマメ、またはソラマメ・インゲン・ササゲの類からの材料である。
植物性タンパク質源の他の例は、ナタネ、およびキャベツある。
ダイズは、好ましい植物性タンパク質源である。
植物性タンパク質源の他の例は、穀物、例えば、オオムギ、コムギ、ライムギ、カラスムギ、トウモロコシ、イネ、およびモロコシである。
それ以上の面において、本発明は、動物飼料、例えば、動物飼料、および動物飼料添加剤、例えば、プレミックスにおいて使用するための組成物に関する。
さらに、任意の、飼料添加剤成分は、着色剤、芳香化合物、安定剤、および/またはフィターゼEC 3.1.3.8または3.1.3.26;キシラナーゼEC 3.2.1.8;ガラクタナーゼEC 3.2.1.89;および/またはβ−グルカナーゼEC 3.2.1.4から選択される少なくとも1種の他の酵素である。
他の抗菌ペプチド (AMP) の例は、CAP18、ロイコシン (Leucosin) A、トリトルプチシン (Tritrpticin) 、プロテグリン (Protegrin)−1、タナチン (Thanatin) 、デフェンシン (Defensin) 、オビスピリン (Ovispirin) 、例えば、ノビスプリン (Novispirin) (Robert Lehrer、2000) 、および抗菌活性を保持するそれらの変異型またはフラグメントである。
通常、脂溶性および水溶性ビタミン、ならびに微量ミネラルは飼料への添加に意図される、いわゆるプレミックスの一部分を形成するが、多量ミネラルは通常飼料に別々に添加される。これら組成物のいずれのタイプも、本発明の抗菌ポリペプチドで濃縮されると、本発明の動物飼料添加剤である。
これらの成分の例を下に列挙する。
可溶性ビタミンの例は、ビタミンA、ビタミンD3、ビタミンE、およびビタミンK、例えば、ビタミンK3である。
微量ミネラルの例は、マンガン、亜鉛、鉄、銅、ヨウ素、セレン、およびコバルトである。
多量ミネラルの例は、カルシウム、リンおよびナトリウムである。
これらの成分の栄養必要条件 (家禽および子豚/ブタで例示する) は、WO 01/58275の表Aに列挙されている。栄養必要条件は、これらの成分を食餌に示した濃度で添加すべきであることを意味する。
さらに、または別の態様 (上に示した粗タンパク質含有率に対して) において、本発明の動物飼料組成物は、10〜30 MJ/kgの代謝可能なエネルギー含有率、0.1〜200 g/kgのカルシウム含有率、および/または0.1〜200 g/kgの有効リン含有率、および/または0.1〜100 g/kgのメチオニン含有率、および/または0.1〜150 g/kgのメチオニン+システイン含有率、および/または0.5〜50 g/kgのリシン含有率を有する。
粗タンパク質は、窒素 (N) ×係数6.25として計算される、すなわち、粗タンパク質 ( g/kg) = N ( g/kg) × 6.25。窒素含有率はKjedahl法により決定される (A.O.A.C.、1984、Official Methods of Analysis 第14版、Association of Official Analytical Chemists、ワシントンD.C.) 。
特定の態様において、本発明の動物飼料組成物は、上に定義した植物性タンパク質またはタンパク質源の少なくとも1種を含有する。
抗菌ポリペプチドは下記の1または2以上の量 (投与量範囲) で投与できる:0.01〜200、または0.01〜100、または0.05〜100、または0.05〜50、または0.10〜10 − すべてのこれらの範囲はmg抗菌ポリペプチドタンパク質/kg飼料(ppm) である。
mg抗菌ポリペプチドタンパク質/kg飼料を決定するために、抗菌ポリペプチドを飼料組成物から精製し、そして精製した抗菌ポリペプチドの比活性を関係するアッセイにより測定する (抗菌活性、基質、およびアッセイを参照) 。また、飼料組成物それ自体の抗菌活性を同一アッセイにより測定し、これら2つの測定値に基づいて、mg抗菌ポリペプチドタンパク質/kg飼料を計算する。
本発明の抗菌ポリペプチドを洗剤組成物に添加することができ、こうしてそれは洗剤組成物の1成分となることができる。
本発明の洗剤組成物は、例えば、汚れた布帛の前処理に適当な洗濯添加剤組成物およびリンス添加布帛柔軟剤組成物を包含する手および機械による洗濯用洗剤組成物として配合することができ、または家庭の一般的硬質表面クリーニング操作において使用する洗剤組成物として配合することができ、または手および機械による皿洗浄操作のために配合することができる。
一般に、選択する1または2以上の酵素の性質は選択する洗剤と適合性であるべきであり (すなわち、pH最適値、他の酵素および非酵素成分との適合性、およびその他) 、そして1または2以上の酵素は有効量で存在すべきである。
アミラーゼ:適当なアミラーゼ (αおよび/またはβ) は、細菌または真菌由来のリパーゼを包含する。化学的に修飾された突然変異体またはタンパク質操作された突然変異体が包含される。アミラーゼは、例えば、GB 1,296,839にいっそう詳細に記載されているバシラス・リヘニフオールミス (B. licheniformis) の特別の株から得られるα−アミラーゼを包含する。
典型的には、洗剤組成物は1または2以上の界面活性剤を含んでなり、半極性を包含する非イオンおよび/またはアニオンおよび/またはカチオンおよび/または両性イオンであることができる。界面活性剤は典型的には0.1〜60重量%のレベルで存在する。
洗剤は0〜65%の洗剤ビルダ−または錯化剤、例えば、ゼオライト、二リン酸塩、三リン酸塩、ホスホン酸塩、炭酸塩、クエン酸塩、ニトリロ三酢酸、エチレンジアミン四酢酸、ジエチレントリアミン五酢酸、アルキル−またはアルケニルコハク酸、可溶性ケイ酸塩または層状ケイ酸塩 (例えば、HoechstからのSKS−6) を含有することができる。
現在、洗剤組成物において、任意の酵素、および本発明の抗菌ポリペプチドを洗浄液の1リットル当たり0.01〜100 mg、好ましくは0.05〜10 mg、より好ましくは0.1〜5 mg、最も好ましくは0.1〜1 mgの酵素タンパク質に対応する量で添加できることが考えられる。
下記の実施例を参照して本発明をいっそう詳細に例示するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものと解釈すべきでない。
実施例1.シュードプレクタニア・ニグレラ (Pseudoplectania nigrella) からの抗菌ポリペプチドの同定
材料および方法
Mex−1培地上で5日間誘導したシュードプレクタニア・ニグレラ (P. nigrella) 培地から、cDNAライブラリーを調製した (国際特許出願WO 98/38288の実施例に記載されているプロトコル) 。標準分子生物学的手法に従い、ポリA濃縮RNAを精製し、cDNAを合成し、そしてライブラリーを作った。一般的プロセスについての詳細なプロトコルは、国際特許出願WO 01/12794の実施例の中に見出すことができる。クローニングに使用したベクターはpMhas5であった。これは配列番号4に示されており、下記の特徴を有する。
もとのcDNA−pMHas5ベクター結合の合計20,000の形質転換体から、cDNAプラスミドプールを調製した。プラスミドDNA単離についてのQiagenプロトコル (Qiagen Inc.) に従い、固体LB選択的培地から回収したコロニーのプールから、プラスミドDNAを直接調製した。トランスポゼースの製造会社の使用説明書 (Finnizyme、フィンランド国) に従い、プラスミドプールをトランスポゾーンSigA2およびMuAトランスポゼースで処理した。トランスポゾーン促進シグナルトラッピングについての一般的情報は、国際特許出願WO 01/77315の中に見出すことができる。
LB + 50μg/mlのクロラムフェニコール、または
LB +カナマイシン + 15 μg/mlのクロラムフェニコール、または
LB + カナマイシン + クロラムフェニコール + 12.5 μg/mlのアンピシリン。
プライマーA: agcgt ttgcg gccgc gatcc (配列番号16)
プライマーB: ttatt cggtc gaaaa ggatc c (配列番号17)
下記の実施例において、本発明の抗菌ポリペプチドを「プレクタシン(Plectasin)」と呼ぶ。
下記の方法において、上記cDNAライブラリー (上記実施例1参照) からプレクタシンをコードする配列を増幅した。2つのプライマー178および179とのPCR反応において、1 μlのcDNA (ほぼ10 ngのDNA) を鋳型として使用した。
プライマー178:tctgg atcca ccatg caatt tacca ccatc ctctc (配列番号7)
プライマー179:tctct cgagc tagta acact tgcaa acaaa gc (配列番号8)
10 pmolの各プライマーを100 μlの反応体積で使用した。アニリ−ング温度は55℃であり、そしてエクステンションを72℃において1分間実施した。全5サイクルを実施した。ザ・エクスパンド・ハイ・ファイデルティPCRシステム (The Expand High Fidelty PCR System) (Roche) を使用した。
PCRプライマーにより導入されたオ−バ−ハング中で切断するBamH IおよびXhoIで、両方のフラグメントを消化した。消化したフラグメントを単離し、そしてpMT2188の中にクローニングした。pMT2188は、オランダ国特許出願PA 2001 00088の実施例7に記載されているように構築したプラスミドpCaHj527 (国際特許出願WO 00/0064の実施例参照) に基づく、アスペルギルス (Aspergillus) の発現プラスミドである。より短いフラグメントは、シグナルトラッピング実験 (上記実施例1参照) から決定して、プレクタシンをコードする配列を含有することが見出された。このより短いPCRフラグメントの配列を配列番号5に示す。
pMT2548をアスペルギルス・オリゼ (Aspergillus oryzae) BECh2 株 (国際特許出願WO 00/39322に開示されている) およびアスペルギルス・ニガー (Aspergillus niger) MBin118中に形質転換した。スクロースおよびアセトアミドを含むコーブ (Cove) 最小プレート上で選択的および非誘導条件下に、各株の30の形質転換体を2回再単離した。プレクタシンの発現を試験するために、10 mlのYPM (2%ペプトン、1%酵母エキス、2%マルトース) を含む管中で、形質転換体を30℃において6日間インキュベートした。製造業者が推奨するようにMES展開緩衝液を使用して、上清をNuPage 10% Bis−Tris SDSゲル (Invitrogen) 上に展開して低い分子量範囲における分離を可能とした。
鋳型として全長プレクタシンcDNA (プレクタシン_6_B12) およびNcoIおよびXhoIリンカープライマーDR34FおよびDR34Rを使用して、プレクタシンフラグメントをPCRにより増幅した。
DR34F:ccggccatgg gatttggatg caatggtcct tggg (配列番号9)
DR34R:gccgtctaga gccatctagt aacacttgca aacaaagccc cccttagc (配列番号10)
mGFGCNGPWDEDDMQCHNHCKSIKGYKGGYCAKGGFVCKCY
(配列番号11)
ここでm (メチオニン) は天然プレクタシン中に存在しないが、クローニング戦略の結果として導入された。
内因的プレクタシン発現が誘導されるとき、液体培地中で大腸菌 (E. coli) の増殖が阻害されるかどうかを評価するために、下記の実験を国際特許出願WO 00/73433の実施例に開示されているように実施した。簡単に述べると、マイクロタイタープレート中の150 μlのLBまたは0.1%のアラビナーゼを含有するLB中に、pDRS−18−プレクタシン、pDR−18−プレクタシン、pHHまたはpHHAプラスミドを含有する細胞の新鮮な一夜培養物を300倍に希釈し、37℃において激しく震蘯しながらインキュベートした。ELISAリーダーを使用して規則的間隔でOD450を測定することによって、増殖曲線をモニタ−した。結果は周辺質に向けるとき、プレクタシンが細胞増殖を41%阻害することを示したが、細胞質中で発現されるとき、それは細胞増殖に影響を与えなかった (下記表参照)。
pET31b+中のシュードプレクタニア・ニグレラ (P. nigrella) からのプレクタシンのクローニング
抗微生物剤活性のアッセイのためにプレクタシンを産生するために、プレクタシンをコードするcDNAを発現ベクターpET31b+ (Novagen Inc.、ウィスコンシン州) の中に挿入した。
プライマー1:attattcagatgctggatcc gaaaaacctgcgtcgcatta tccgcaaaggcatccatatc (配列番号12)
プライマー2: aataatctcgagttattagc catattttttaatgatatgg atgcctttgcggataatgcg ac (配列番号13)
組換え体pET31b+を大腸菌 (E. coli) Novablue中に形質転換した (製造会社 (Novagen) により記載されている) 。プラスミドをQIAprep Mini Columns (QIAGEN Inc.、カリフオールニア州) により調製し、プラスミド特異的プライマー (プライマー3およびプライマー4) を使用する自動化配列決定により配列決定した。
プライマー3: tgctagttat tgctcagcgg (配列番号14)
プライマー4: accgtagttg cgcccatcg (配列番号15)
上記精製から得られるペレットは、精製された封入体を含有した。KSI融合相手からペプチドを遊離するために、プレクタシンをコードする遺伝子に対してN末端に導入された、操作されたAsp−Pro部位上で酸加水分解を実施した。
封入体を100 mMのリン酸ナトリウム (pH 2.3) 中に再懸濁させ、85℃において一夜インキュベートした。生ずる上清はプロリン−プレクタシンを含有し、そして試料を100 mMのリン酸ナトリウム (pH 12.3) で中和した。プロリン−プレクタシンの同一性を質量分析により確認した。すべての標準プロトコルはどこかに記載されてきている (Sambrook、Fritsch、およびManiatis、1989) 。
従来発表されたプロトコルの変更バージョンを抗菌活性の検出に適用した (Lehrer他、(1991) 、Ultrasensitive assay for endogenous antmicrobial polypeptides、J. Immunol. Methods 137:167−173) 。ターゲット細菌 (106コロニー形成単位 (CFU)) を10 mlのアンダーレイアガロース (1%の低い電気内浸透、0.03%のトリプチカーゼソイブロス、10 mMのリン酸ナトリウム、pH 7.4、37℃) に添加した。懸濁液をINTEGRIDペトリ皿 (Becton Dicknson Labware、ニュ−ジャ−ジ−州) 上で固化させた。3 mmのゲル・パンチャ− (Gel Puncher) を使用して、アンダーレイアガロース (Amersham Pharmacia Biotech、スウェ−デン国) 中に孔を形成した。
プレクタシンの抗菌活性を評価するために、組換えアスペルギルス・オリゼ (Aspergillus oryzae) の発酵ブロスを放射拡散アッセイ (前述) において2倍の連続希釈物として適用した。上記プロトコルに従い、試料をバシラス・サチリス(Bacillus subtilis) に対して試験したとき、大きい清浄化ゾーンが見られた。未希釈発酵ブロスで最大の清浄化ゾーン (15 mm) が見られたが、非組換えアスペルギルス・オリゼ (Aspergillus oryzae) から採取した試料はバシラス・サチリス(Bacillus subtilis) に対して抗菌活性を示さなかった。
抗菌活性を有するプレクタシンの回収量を増加させるために、プレクタシンを大腸菌 (E. coli) Origami−DE3 (Novagen Inc.) において発現させた。この株はチオレドキシンレダクターゼ (trxB) およびグルタチオンレダクターゼ (gor) をコードする遺伝子の中に変異を担持する。製造会社 (Novagen) に従い、プレクタシンをコードする組換え体pET31b+プラスミドを大腸菌 (E. coli) Origami−DE3中で形質転換した。封入体を含有するプレクタシンの培養、発現および単離を前述したように実施した (大腸菌 (E. coli) 中のシュードプレクタニア・ニグレラ (P. nigrella) プレクタシンの形質転換および発現) 。プレクタシンの回収を前述したように実施した (大腸菌 (E. coli) 封入体からのシュードプレクタニア・ニグレラ (P. nigrella) プレクタシンの精製) 。引き続いて、放射拡散アッセイを使用して抗菌活性をアクセスした (上記参照:放射拡散アッセイによる抗菌活性) 。
サッカロマイセス・セレビシエ (S. cerevisiae) 中のプレクタシンの発現を評価するために、2つの異なるプラスミド構築物、pHH3875およびpHH3876を作った。pHH3875は、成熟プレクタシンに融合したサッカロマイセス・セレビシエ (S. cerevisiae) からのα−リーダーをコードする。プレクタシンをα−リーダーから遊離することができ、それゆえKEX2切断配列を通して成熟させることができる。pHH3876は、プレクタシンのプロ領域に融合し、次いで成熟プレクタシンに融合したα−リーダーをコードする。この構築物において、1つのKEX2部位はプレクタシンのα−リーダーとプロ領域との間に存在するが、他のKEX2部位はプレクタシンそれ自体でプレクタシンのプロ領域を分離する。
後述するプライマーpHH3875−ForwおよびpHH3875−Revを使用する標準PCR反応により、プレクタシン遺伝子を増幅した。PCR反応におけるDNA鋳型として、実施例2からのアスペルギルス (Aspergillus) プラスミドpMT2548を使用した。生ずるDNAフラグメントをQiaquick PCR精製キット (Qiagen) で精製し、プライマーにより導入されたオーバーハングにおいて切断するXbaIおよびClaIで制限した。フラグメントを2%のアガロースゲルからさらに精製し、同様にXbaIおよびClaIで制限したサッカロマイセス・セレビシエ (S. cerevisiae) 発現ベクター中に結合した。
プライマーpHH3875−Forw:
gaagg ggtat cgatg gctaa gagag gattt ggatg caatg gtcct tggga tgagg
(配列番号18)
プライマーpHH3875−Rev:
cttag tttct agact agtaa cactt gcaaa caaag ccccc c
(配列番号19)
pHH3876の構築プロトコルは、使用したDNAプライマーを除外して、pHH3875のそれと同一である。pHH3876について、後述するプライマーを使用した。
プライマーpHH3876−Forw:
gaagg ggtat cgatg gctaa gagag caccc cagcc tgttc ccgag gctta cgc
(配列番号20)
プライマーpHH3876−Rev (pHH3875−Revと同一):
cttag tttct agact agtaa cactt gcaaa caaag ccccc c
(配列番号21)
酢酸リチウムのプロトコルを使用して、プラスミドpHH3902 (対照) 、pHH3875およびpHH3876をサッカロマイセス・セレビシエ (S. cerevisiae) MT633株の中に形質転換した。pHH3902、pHH3875およびpHH3876のいくつかの形質転換体を選択し、SC基本/寒天 (SC基本寒天、2%のD−グルコ−ス、0.02%のトレオニンを含有する) プレート上にストリ−クし、コロニーが発生するまで30℃においてインキュベートした。
いっそう詳細な情報を得るために、MALDI型質量分析計 (Voyager DE−Pro、Perseptive Biosystems) を使用して、上清を分析した。
pHH3876について、いくつかのピ−クが観測された。2つの最も顕著なピ−クが質量4411〜4413および7870〜7871において見出された。4411ピ−クは再び正しくプロセシングされたプレクタシンと一致した。7870におけるピ−クは、プロ領域がプレクタシンから切断されていない、半処理プレクタシンに最もよく対応する。多分7870ピークのいくつかの破壊生成物が観測された。
プレクタシンの抗菌活性を最適化するために、活性についての高い処理量の (HTP) アッセイが必要である。このような系を構成するために、対照プラスミド、pHH3902、または2つのプレクタシン発現プラスミド、pHH3875およびpHH3876を96ウェルのマイクロタイタープレート中で増殖させた。合理的細胞密度において、5または20 μlの酵母培養物をマイクルタイタープレートから取出し、実施例5に記載されている放射拡散アッセイにおいて使用した。
誘導可能な発現系および改良された生物活性を有するプレクタシン変異型を同定するHTPスクリーニング系を構成する可能性を評価するために、pYES2を使用してプレクタシンおよびプロプレクタシンをコードする誘導可能な発現ベクターを構築した。
pYES2は非融合ベクターであるので、pHH3902、pHH3875およびpHH3876からの全体のα−リーダー領域を標準PCR反応においてPCR増幅した。フラグメントを2%アガロースゲル上に展開し、Qiagen精製キットで精製し、HindIIIおよびXbaIで制限し、プラスミドpYES2中の対応する部位中に結合した。
プライマーAOP 107: caata taaaa aagct agctt tccg (配列番号22)
プライマーAOP 446: ccggc tgaag ctgct atcgg (配列番号23)
誤りがちなPCRを使用して、突然変異したプレクタシンライブラリーを構築した。0.5 mMのMnCl2を含有するPCR反応において、プライマーpYES−mutおよびpHH3885−Revと、鋳型pHH3875 (プロプレクタシン) またはpHH3876 (プレクタシン) とを使用して、ランダムに突然変異したDNAフラグメントを発生させた。
taaatactac tattgccagc attgctgcta aagaagaagg ggtatcgatg gccaagaga
(配列番号24)
プライマーpHH3885−Rev:
tgtaagcgtg acataactaa ttacatgatg cggccctcta ga (配列番号25)
0.5%のグルコースおよび1.5%のガラクトースを含有する大きい寒天平板 (23 cm×23 cm) 上に、2つの異なるライブラリーをプレートした。30℃において2日間インキュベートした後、ほぼ107 cfuのバシラス・サチリス (B. subtilis) を含有する薄いアガロース層をライブラリープレート上にオーバーレイした。プレートを30℃においてさらに24時間インキュベートした。ほぼ10,000コロニーを試験した。それ以上の特性決定のために、有意な清浄化ゾーンを生ずる酵母コロニーを単離した。
下記の生物学的物質をブタベスト条約の規定に従い下記の寄託機関に寄託した:セントラアルブレアウ・ブーア・シムモレカルチュアーズ (Centraalbureau Voor Schimmelcultures) (CBS)、オランダ国ウトレヒト3584 CTウップサララーン8 (選択的に、オランダ国ウトレヒト3508 AD、郵便私書箱85167) 。下記の受け入れ番号を与えられた:
受け入れ番号:CBS 444.97
寄託日:1997年1月28日
寄託はノボ・ノールディスク社 (Novo Nordisk A/S) によりなされ、後にノボザイム社 (Novozymes A/S) に譲渡された。
エウカリオタ (Eukaryota);真菌 (Fungi) ;子嚢菌門 (Ascomycota);ペジゾモコチナ (Pezizomycotina);ペジゾミセテス (Pezizomycetes);ペジザレス (Pezizales);サルコソマタセアエ (Sarcosomataceae);シュードプレクタニア (Pseudoplectania) 。
Claims (15)
- 下記のポリペプチド:
(a)配列番号:2のアミノ酸1−40に対して少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列から成るポリペプチド;
(b)配列番号:1のヌクレオチド166−285の相補鎖に高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチド;及び
(c)配列番号:2のアミノ酸1−40に対して最大4個のアミノ酸が異なるアミノ酸配列から成るポリペプチド;
から成る群から選択される、抗微生物活性を有するポリペプチド。 - 配列番号:2のアミノ酸1−40に対して少なくとも95%の同一性を有するアミノ酸配列から成る、請求項1に記載のポリペプチド。
- 配列番号:2のアミノ酸1−40に対して少なくとも97%の同一性を有するアミノ酸配列から成る、請求項1に記載のポリペプチド。
- 配列番号:2のアミノ酸1−40から成る、請求項1に記載のポリペプチド。
- 請求項1〜4のいずれか1項に記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド。
- 宿主中でポリペプチドの産生を指令する1または2以上の調節配列に作用可能に連結された請求項5に記載のヌクレオチド配列を含んでなる核酸構築物。
- 請求項6に記載の核酸構築物を含んでなる組換え発現ベクター。
- 請求項7に記載の核酸構築物を含んでなる組換え宿主細胞。
- 請求項1〜4のいずれか1項に記載のポリペプチドの製造方法において、
(a)前記ポリペプチドを産生することができるシュードプレクタニア・ニグレラ(Pseudoplectania nigrella)の野生型形態の株を培養して当該ポリペプチドを産生し;そして
(b)前記ポリペプチドを回収する;
ことを含んで成る方法。 - 前記シュードプレクタニア・ニグレラ(Pseudoplectania nigrella)が、シュードプレクタニア・二グレラ(Pseudoplectania nigrella) CBS444.97である、請求項9に記載の方法。
- 請求項1〜4のいずれか1項に記載のポリペプチドの製造方法において、
(a)ポリペプチドの産生を促す条件下に請求項8に記載の組換え宿主細胞を培養し;そして
(b)前記ポリペプチドを回収する;
ことを含んで成る方法。 - 微生物細胞を請求項1〜4のいずれか1項に記載の抗菌ポリペプチドと接触させることを含んでなる、微生物細胞を殺しまたは微生物細胞の増殖を阻害する方法。
- 薬剤として使用するための請求項1〜4のいずれか1項に記載の抗菌ポリペプチド。
- 微生物感染の治療または予防的使用のための獣またはヒトの治療剤の製造において使用するための請求項1〜4のいずれかに記載の抗菌ポリペプチドの使用。
- 動物飼料における請求項1〜4のいずれかに記載の少なくとも1種の抗菌ポリペプチドの使用。
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