HU227387B1 - Antimicrobial polypeptides from pseudoplectania nigrella - Google Patents

Description

MEGADÁS ALAPJÁUL SZOLGÁLÓ VÁLTOZAT

PSEUDOPLECTANIA NIGRELLÁ-BÓL SZÁRMAZÓ ANTÍMÍKROBIÁLIS

POLIPEPTIDEK

A jelen találmány antímíkrobiális aktivitással rendelkező polipeptldekkel és a pollpeptideket kódoló nukleotid szekvenciával rendelkező polinukleotidokkal kapcsolatos, A jelen találmány nukleinsav szerkezetekkel, vektorokkal és a nukleinsav szerkezetetek tartalmazó gazdasejtekkel, valamint a polipeptidek előállítására szolgáló eljárásokkal és azok használatával kapcsolatos.

A jelen találmány célja olyan polipeptidek biztosítása, amelyek antimikrobiális aktivitással rendelkeznek és olyan polinukieotid biztosítása, amelyek a pollpeptideket kódolják.

Az alábbiakban összefoglaljuk a jelen találmányt.

Egy első aspektusban a jelen találmány antímíkrobiális aktivitással rendelkező polipeptiddel kapcsolatos, amely az alábbiak valamelyike lehet;

φ φ φ φ' * * * * »φ φ φ * * φ φ Λ» Λ φΦ><

(a) agy polipeptid, amely olyan aminosav szekvenciát tartalmaz, ami legalább 65%~os azonosságot mutat a 2. számú szekvencia 1-40. aminosavaíval;

(b) egy polipeptid, amely olyan aminosav szekvenciát tartalmaz, ami legalább 85%-ban azonos a Pseuo'op/ectan/a n/gre//a CBS 444.97 törzsben jelen levő nukleotid szekvencia antimikroblálls polipeptidjét kódoló része által kódolt pollpeptlddel;

(c) egy polipeptid, amelyet egy olyan nukleotid szekvencia kódol, ami alacsony szigorúsági körülmények között hibridlzálódik az alábbi polinukleotid próbák egyikével:

(i) az 1. számú szekvencia 186-285 nukleotidjainak komplementer szálával;

(ii) az 1. számú szekvencia 70-285 nukleotidjainak komplementer szálával; vagy (Ili) az 1. számú szekvencia 1-265 nukleotidjainak komplementer szálával; vagy (d) az (a), (b) vagy (ej pontok egy fragmentje, amely antimikroblálls aktivitással rendelkezik.

Egy második aspektusban a jelen találmány olyan polínukleotidokkal kapcsolatos, amelyek a jelen találmány szerinti polipeptidet kódoló nukleotid szekvenciával rendelkeznek.

Egy harmadik aspektusban a jelen találmány olyan nukleinsav szerkezettel kapcsolatos, amely a jelen találmány polipeptidjét kódoló nukleotid szekvenciát tartalmaz, működőképesen kapcsolódva egy vagy több olyan szabályozó szekvenciához, amelyek egy megfelelő gazdában a polipeptid előállítását irányítják.

Egy negyedik aspektusban a jelen találmány egy a jelen találmány nukleinsav szerkezetét tartalmazó rekombináns expressziós vektorral kapcsolatos.

Egy ötödik aspektusban a jelen találmány egy a jelen találmány nukleinsav szerkezetét tartalmazó rekombináns gazdasejttel kapcsolatos.

Egy hatodik aspektusban a jelen találmány olyan eljárással kapcsolatos, ami a jelen találmány szerinti polipeptid előállítására szolgál, ahol az eljárás a következőkből áll:

(a) egy a vad formájában a polipeptid előállítására képes törzset tenyésztünk a polipeptid előállítása céljából, és (b) a polipeptidet kinyerjük.

Egy hetedik aspektusban a jelen találmány olyan eljárással kapcsolatos, ami a jelen találmány szerinti polipeptid előállítására szolgál, ahol az eljárás a következőkből áll:

(a) egy a jelen találmány szerinti rekombináns gazdasejtet tenyésztünk olyan körülmények között, ami a polipeptid előállításához vezet, és (b) a polipeptidet kinyerjük.

A jelen találmány egyéb aspektusai nyilvánvalóak lesznek az alábbi leírás és a csatolt igénypontok alapján.

A jelen találmányban az alábbi fogalmakat használjuk.

A jelen találmány részletes leírása előtt, meghatározzuk, hogy melyik fogalmon, mit értünk:

Lényegében tiszta polipeptid: A jelen szövegösszefüggésben a „lényegében tiszte polipeptid olyan polipeptid készítményt jelent, amely maximum 10 tömeg% egyéb polipeptid anyagot tartalmaz, amellyel natív állapotában kapcsolatban áll (az egyéb polipeptidek alacsonyabb százalékai előnyösebbek, például maximum 8 tömeg%, maximum 6 tömeg%, maximum 5 tömeg%, maximum 4 tömeg%, maximum 3 tömeg%, maximum 2 tömeg%, maximum 1 fömeg%, maximum 0,5 •4· tömeg%). Így előnyös, ha a lényegében tiszta polipeptid legalább 92%ban tiszta, azaz a polipeptid a készítményben jelen levő teljes polipeptid anyag legalább 92 tomeg%~át jelenti és magasabb százalékok előnyösebbek, például a legalább 94%-os tisztaság, a legalább 95%-os tisztaság, a legalább 96%-os tisztaság, a legalább 97%-os tisztaság, a legalább 98%-os tisztaság, a legalább 99%-os tisztaság, és a legalább 99,6%-os tisztaság, A jelen találmányban leírt polipeptidek előnyösen lényegében tiszta formában vannak. Részletesebben, előnyős, ha a jelen találmányban leirt polipeptidek „alapjában véve tiszta formában vannak jelen, azaz a polipeptid készítmény alapjában véve mentes az egyéb olyan polipeptid anyagtól, amivel a polipeptid natlvan kapcsolódik. Ez megvalósítható úgy, például hogy a polipeptidet jól ismert rekombináns módszerekkel állítjuk elő. A jelen találmányban a „lényegében tiszta polipeptid kifejezés szinonim az „izolált polipeptid és az „izolált formában levő poli

Antimikrobíális aktivitás: Az „antimikrobíális aktivitás” a jelen találmány szerinti használatban a mikrobiális sejtek elpusztításának képességét vagy szaporodásának gátló képességét jelöli. A jelen találmány szövegösszefüggésében az „antimikrobíális kifejezés baktericíd és/vagy bakteriosztatikus és/vagy fungicid és/vagy fungisztatlkus hatást és/vagy vlmcid hatást jelent, ahol a „bakferloid kifejezésen azt kell érteni, hogy képes baktérium sejteket elpusztítani. A „bakteriosztatikus kifejezés azt jelenti, hogy képes gátolni a bakteriális szaporodást, azaz gátolja a baktérium sejtek szaporodását. A „fungicid kifejezésen azt értjük, hogy képes elpusztítani a gombasejfeket. A „fungisztatlkus kifejezés azt jelenti, hogy képes gátolni a gomba szaporodását, azaz akadályozza a gomba sejtek szaporodását. A „virucld kifejezésen azt értjük, hogy képes inaktlválni a vírusokat. A „mikrobiális sejt kifejezés baktérium vagy gomba sejteket jelöl (az élesztőgombákat is Ideértve).

A jelen találmány szövegösszefüggésében a „mikrobíális szaporodásának gátlása” kifejezés azt jelenti, hogy a sejtek nem szaporodó állapotban vannak, azaz azok nem képesek megsokszorozódni

A jelen találmány céljához az antirnikrobiáiis aktivitás meghatározható a Lehrer és munkatársai által leírt (Journal of Immunológiái Methods, Vol. 137(2) pp, 167-174,1991) eljárások szerint.

Az antirnikrobiáiis aktivitással rendelkező polipeptidek képesek lehetnek az Escőench/a co// (DSM 1576) élő sejtszámát 1/100 részére csökkenteni 20°C hőmérsékleten végzett 30 percig tartó Inkubálás után, az antirnikrobiáiis aktivitású polipeptid 25 (tömeg/tőmeg)%~os vizes oldatában, előnyösen 10 (tömeg/tőmeg)%-os vizes oldatában, még előnyösebben 5 (tömeg/tömeg)%-os vizes oldatában, még előnyösebben 1 (tömeg/tömeg)%OS vizes oldatában, 0,5 {íömeg/tomeg)%-os vizes oldatában, és különösen előnyösen 0,1 <tőmeg/tömeg)%~os vb oldatában.

Az antirnikrobiáiis aktivitással rendelkező polipeptidek lehetnek gátolni az Eschertch/a co// (DSM 1576) szaporodását 25°C hőmérsékleten 24 óráig tartó inkubálás alatt mikrobíális szaporító tápközegen, ha 1000 ppm mennyiségben adjuk hozzál a tápközeghez, előnyösen ha 500 ppm koncentrációban adjuk a tápközeghez, még előnyösebben ha 250 ppm koncentrációban adjuk a tápközeghez, még előnyösebben, ha 100 ppm koncentrációban adjuk a tápközeghez, még előnyösebben, ha 50 ppm koncentrációban adjuk a tápközeghez, és különösen előnyösen, ha 25 ppm koncentrációban adjuk a tápközeghez.

Az antirnikrobiáiis aktivitással rendelkező polipeptidek képesek lehetnek a Sac///u$ suM///$ (ATCC 6633) élő sejtszámát 1/1ÖÖ részére csökkenteni 20^GC hőmérsékleten végzett 30 percig tartó inkubálás után, az antirnikrobiáiis aktivitású polipeptid 25 (tömeg/tömeg)%Os vizes oldatában, előnyösen 10 (töroeg/tömeg)%»os vizes oldatában, még előnyösebben S (tőmeg/tömeg)%-os vizes oldatában, még előnyösebben 1 (tömeg/tömeg)%«os vizes oldatában, 0,5 (tömeg/iömeg}%~os vizes oldatában, és különösen előnyösen 0,1 (íömeg/tömeg)%-os vizes oldatában.

Az antimíkrobíális aktivitással rendelkező polipeptidek képesek gátolni a Sac7//us sebő/Ás (ATCC 6633) szaporodását 25^ÖC hőmérsékleten 24 óráig tartó ínkubálás alatt mikrobiáiis szaporító tápközegen, ha 1000 ppm mennyiségben adjuk hozzá a tápközeghez, előnyösen ha 500 ppm koncentrációban adjuk a tápközeghez, még előnyösebben ha 250 koncentrációban adjuk a tápközeghez, még előnyösebben, ha 100 koncentrációban adjuk a tápkőzeghez, még előnyösebben, ha 60 ppm koncentrációban adjuk a tápközeghez, és különösen előnyösen, ha 26 ppm koncentrációban adjuk a tápközeghez,

A jelen találmány polípeptídjei a 2, számú szekvencia 1-4Ö aminosavaíban bemutatott aminosav szekvenciát tartalmazó polipeptid antimíkrobíális aktivitásának előnyösen legalább 20%-ával rendelkeznek, Egy különösen előnyös kiviteli alakban a polipeptidek a 2. számú szekvencia 1-40 aminosavaíban bemutatott aminosav szekvenciát tartalmazó polipeptid antimíkrobíális aktivitásának legalább 40%-ával, például legalább 50%-ával, előnyösen k legalább 70%-ával, még előnyösebben legal

80%-ával

80%-ával legalább 90%~ával, még előnyösebben például például például

A-ával körülbelül vagy legalább 100%-ával rendelkeznek.

Azonosság: A jelen találmány szövegösszefüggésében, a két aminosav szekvencia vagy két nukleotid szekvencia közötti homológiát az „azonosság” paraméterével írjuk le.

A jelen találmány céljaihoz a két aminosav szekvencia közötti azonosságot a 2.0~ás FASTA program csomagban található FASTA programmal (lásd W.R, Pearson and DJ. Lipman, 1938, „improved Tools fór Bíologicai Soquence Analysls”, PNAS 85:2444-2448; és W.R, * φ ΦΦ >*«» * Φ X >

< Φ X ν 4 φ *» * φ φ X » Φ *

X φ ΦΦ *·# X ΦΦ

Pearson, 1990, „Rapid and Sensitíve Sequence Cornparison wíth FASTP and FÁSTA, Methods in Enzymology, 183:63-98) határozzuk meg. A használt értékelő mátrix a BLOSUM5Ö, a „gap penalty* -12, és a „gap extension penalty” -2.

A két nukleotid szekvencia közötti azonosság mértékét ugyanezt a fent leírt algoritmust és software csomagot használva határozzuk meg, A használt értékelő mátrix az azonosság! mátrix, a „gap penalty” -16, és a „gap axtension penalty -4,

Fragment A jelen találmány szerinti használatban a 2, számú szekvencia „fragmentje” kifejezés olyan polipeptidet jelent, ahol az ezen aminosav szekvencia amino- és/vagy karboxi-terminusáfoöl delécióval egy vagy több aminosavat eltávolítottunk,

Alléi variáns: A jelen találmány szövegösszefüggésében az; „alléi variáns kifejezés ugyanazon kromoszóma lokuszt elfoglaló gén bármely két vagy főbb alternatív formáját jelöli. Az alléi variáció természetes úton mutáció révén következik be, és populációkon belüli polimorfizmushoz vezethet, A génmutáció lehet csendes (nincs változás a kódolt polipepfidben), vagy kódolhat megváltozott aminosav szekvenciával rendelkező polipeptideket. Egy polipeptid alléi variánsa egy gén allé! variánsa által kódol! polipeptidet jelent.

Lényegében tiszta pofinukíectíd: A „lényegében tiszta polinukieotid” kifejezés a jelen találmány szerinti használatban olyan polinukieotid készítményre utal, ahol a polinukleotídot eltávolították természetes genetikai környezetéből, és így mentes az egyéb külső vagy nem kívánatos kódoló szekvenciáktól, és olyan formában található, amely megfelelő a genetikailag módosított protein termelési rendszeren belüli használathoz, így a lényegében tiszta polinukieotid I mb 10 tÖmeg% olyan egyéb polinukieotid anyagot tartalmaz, amely természetesen hozzákapcsolódik (az egyéb polinukieotid anyagok kisebb %-a előnyösebb, például legfeljebb 8 tömeg%-a, legfeljebb 6 tömeg%-a, * X ««' * * * *

- φ φ *χ X > Φ * * χ ΦΦΦ* * * *ΧΧΦ .ΦΦΦ >* ** Φ#* legfeljebb 5 tömeg%~a, legfeljebb 4 tömeg%-a, legfeljebb 3 tömeg%-a, legfeljebb 2 tömeg%-a, legfeljebb 1 tömeg%~a, legfeljebb 0,5 tömeg%-a). A lényegében tiszta polínukleotid azonban magába foglalhat természetesen előforduló 5’ és 3’ nem-transziált régiókat, például promótereket és terminátorokat. Előnyős, ha a lényegében tiszta polínukleotid legalább 92%-ban tiszta, azaz a polínukleotid a készítményben levő polínukleotid anyag legalább 92 tomeg%-áf tartalmazza, és a még nagyobb %-ok előnyösek, mint például a legalább 94%~os tisztaság, a legalább 95%-os tisztaság, a legalább 96%-os tisztaság, a legalább 97%-os tisztaság, a legalább 98%;-os tisztaság, a legalább 99%-os tisztaság, és a legalább 99,5%-os tisztaság. Az itt leírt polínukleotidok előnyösen lényegében tiszta formában vannak, Főként az előnyös, ha az itt leirt polínukleotidok „lényegében tiszta formában” vannak, azaz a polínukleotid készítmény lényegében az egyéb olyan polínukleotid anyagoktól mentes, amelyekkel a természetben összekapcsolódik. A jelen találmányban a „lényegében tiszta polínukleotid kifejezés szinonimja az „izolált polínukleotid és az „izolált formában levő polínukleotid kifejezéseknek.

Módos! tás( „módos! tás(ok)” magába foglalja, ok): A jelen találmány szövegösszefüggésében a kifejezés a polipeptid bármilyen kémiai módosítását amely a 2, számú szekvencia 1~4Ö amlnosavakénf bemutatott aminosav szekvenciát tartalmazza, valamint a polípeptldet kódoló DNS genetikai manipulációját. A mődosítás(ok) lehel(nek) az aminosav lánc(ok) helyettesítése, szubsztitúciója, deléciöja és/vagy Inszerclőja a kérdéses aminosavban vagy ammosavnál.

Mesterséges variáns: A jelen találmány szerinti használatban a „mesterséges variáns kifejezés olyan antimíkrobiálís aktivitással rendelkező polipepfidet jelent, amelyet egy az 1. számú szekvenciához képest módosított gént expresszáló organizmus termel A módosított gént, amelyből az említett variáns létrejön, ha a megfelelő gazdában

ΐ φ

ΦΦ W * Φ Φ Φ » < Φ ,ΦΦΑ expresszálódik., emberi beavatkozás révén nyerjük ki az 1, számú szekvenciában leirt nukleotid szekvencia módosításával cDNS: A „cDNS kifejezés a jelen találmány szövegösszefüggésében olyan DNS molekulát jelöl, amit egy eukarióta sejtből származó érett, összeillesztett mRNS molekula reverz transzkripciójával állítunk elő. A cDNS-höl hiányoznak azok az intron szekvenciák, amelyek általában jelen vannak a megfelelő genom DNSben. A kezdeti, elsődleges RNS transzkript az mRNS prekurzora, és egy sor feldolgozási eseményen esik át érett, összeillesztett mRNS-ként való megjelenése előtt. Ezen események közé tartozik az intron szekvenciák illesztésnek nevezett eljárással történő eltávolítása. Ha a cDNS mRNSböl származik, akkor abból hiányoznak az intron szekvenciák.

Nukleinsav szerke; .nukleinsav szerkezet” ki t: A jelen találmány szerinti használatban a iezés olyan nukleinsav ~ akár egyszálú, akár kétszálú - molekulát jelöl, amelyet egy természetesen előforduló génből izoláltak, vagy amelyet ügy módosítottak, hogy nukleinsavak szegmentjeit tartalmazza oly módon, ahogy az egyébként nem létezik a természetben. A nukleinsav szerkezet kifejezés szinonim az „expressziós kazetta” kifejezéssel, ha a nukleinsav szerkezet a jelen találmány kódoló szekvenciájának expressziójához szükséges szabályozó szekvenciákat tartalmaz.

Szabályozó szekvencia: A „szabályozó szekvencia kifejezés a jelen találmány szerinti használatban magába foglalja az összes olyan komponenst, amire szükség van, vagy ami előnyös a jelen találmány szerinti polípeptid expressziójához. Az egyes szabályozó szekvenciák lehetnek natívak vagy Idegenek a polipeptídet kódoló nukleotid szekvencia számára. Az ilyen szabályozó szekvenciák közé tartoznak az ezekre való korlátozás nélkül a vezető szekvencia, a poliadenílációs szekvencia, a propeptid szekvencia, a promófer, a jel peptid szekvencia, és a transzkripciós terminátor szekvencia. A szabályozó szekvencia egy

V «

X Φ Φ Í * * * $

V X X * φ Φ « Φ Φ ' φ $«.»·* φ «·'« .« *·· '*'· promótert és egy transzkripciós és transzlációs stop jelet minimum magába kell foglaljon, A szabályozó szekvenciák biztosíthatók kötökkel abból a célból hogy specifikus restrikciós helyeket biztosítsunk a szabályozó szekvenciák egy polipeptidet kódoló nukleotid szekvencia kódoló régiójához való Ugatásának elősegítéséhez,

Működőképesen kapcsolt; A „működőképesen kapcsolt kifejezést olyan konfigurációként határozzuk meg, ahol a szabályozó szekvencia megfelelő módon olyan pozícióban található a DNS szekvencia kódoló szekvenciájához képest, hogy a szabályozó szekvencia irányítja a polipeptid expresszióját,

Kódoló szekvencia; A jelen találmány szerinti használatban a „kódoló szekvencia” olyan nukleotid szekvenciát takar, ami közvetlenül specifikálja protein termékének aminosav szekvenciáját, A kódoló szekvencia határait általában egy nyílt leolvasási határozza meg.

ami általában az ATG start kódonnal kezdődik. A kódoló szekvencia tipikusan DNS, cDNS és rekombináns nukleotid szekvenciákat foglal magába.

Expresszió; A jelen találmány szövegösszefüggésében az „expressziö” kifejezés a polipeptid létrehozásának bármilyen lépését magába foglalja, ideértve az ezekre való korlátozás nélkül a transzkripciót, a post-transzkripcíós módosítást, a transzlációt, a pesttranszlációs módosítást és a szekréciót.

Expressziős vektor: A jelen szövegösszefüggésben az „expressziós vektor kifejezés egy lineáris vagy cirkuláris DNS molekulát takar, ami egy a jelen találmány szerinti polipeptidet kódoló szegmentet tartalmaz, és ami működőképesen kapcsolódik további olyan szegmensekhez, amik transzkripcióját biztosítják.

Gazdasejt: A gazdasejt kifejezés a jelen találmány szerinti használatban bármilyen sejttípust magába foglal, ami fogékony a nukleínsav szerkezettel végzett transzformációra.

A „polinukleotld próba”, a „hibridizáció” kifejezéseket valamint a különböző szigorúsági körülményeket az „Antimikrobiélis aktivitással rendelkező polipeptidek” című részben írjuk te.

Az alábbiakban részletesen bemutatjuk a jelen találmányt.

Antimikrobiális aktivitással rendelkező polipeptidek

Egy első kiviteli alakban a jelen találmány antimikrobiális aktivitással rendelkező pollpeptidekkei kapcsolatos, ahol a polipeptidek egy olyan aminosav szekvenciát tartalmaznak, vagy előnyösen olyan aminosav szekvenciából állnak, amely a 2. számú szekvencia 1-40 sminosavaival (azaz az érett polípeptlddel) legalább 85%-os, előnyösen legalább 70%-os, például legalább 75%-os, még előnyösebben legalább 80%-os, például legalább 85%-os, még előnyösebben legalább 90%-os, még előnyösebben legalább 95%-os, például legalább 96%-os, mint például 97%-os, és még előnyösebben legalább 98%-os, például legalább 99%-os mértékű azonosságot mutat: (a későbbiekben „homológ pölípeptídként” utalunk rá). Egy érdekes kiviteli alakban az aminosav szekvencia legfeljebb 10 aminosavban (például 10 aminosavban), különösen előnyös esetben legfeljebb 8 aminosavban (például 5 aminosavban), például legfeljebb 4 aminosavban (például 4 aminosavban), például legfeljebb 3 aminosavban (például 3 aminosavban) tér el a 2. számú szekvencia 1-40 aminosavaitől· különösen előnyös kiviteli alakban az aminosav szekvencia legfeljebb aminosavban (például 2 aminosavban), például 1 aminosavban fér el a számú szekvencia 1-40 aminosavaífól.

Előnyösen a jelen találmány polipeptldjei tartalmazzák a 2, számú szekvencia aminosav szekvenciáját, ennek egy alléi variánsát, vagy antimikrobiális aktivitással rendelkező fragmentjéf. Egy másik előnyös kiviteli alakban a jelen találmány polípeptidje magába foglalja a 2. számú

Av » szekvencia 1-40 aminosavaít Egy további előnyős kiviteli alakban a polipeptid a 2, számú szekvencia 1-40 aminosavaiból áll.

A jelen találmány polipeptidjét alkotó aminosavak egymástól függetlenül lehetnek D vagy L formájú aminosavak.

A jelen találmány pollpeptidje lehet egy antimíkrebiálís aktivitással rendelkező vad típusú polipeptid, amelyet egy természetes forrásból azonosítottunk és izoláltunk. Az ilyen vad típusú polipeptidek specifikusan szkrlnelhetők a tudomány e területén Ismert standard technikákkal Ezenkívül a jelen találmány pollpeptidje előállítható DNS keverési technikával mint amit például J,E. N'ess és munkatársai írtak le (Natúré Blotechnology 17:893-896 (1999). Sőt, a jelen találmány pollpeptidje lehet egy mesterséges variáns, amely olyan aminosav szekvenciát tartalmaz, vagy amely előnyösen olyan szekvenciából áll. ami a 2. számú szekvencia 1-40 amínosavaíhoz képest legalább egy helyettesítést, deléciőt és/vagy lőszereiét tartalmaz. Az Ilyen mesterséges variánsok megszerkeszthetek a tudomány e területén ismert standard technikákkal például a .2, számú szekvencia 1-40 amínosavaiként bemutatott aminosav szekvenciát tartalmazó polipeptid hely írányiíoii/random muíagenezlsével A jelen találmány egy kiviteli alakjában az aminosav változások (a mesterséges variánsokban, valamint a vad típusú polipeptidekben) kis jelentőségűek, azaz olyan konzervatív aminosav szubsztitúciók, amelyek nincsenek szignifikáns hatással a protein feltekeredésére és/vagy aktivitására: kis deléoíók, tipikusan körülbelül 1-3Ö aminosavból állók: kis amino- vagy karboxi-fermináíis extenzíok, például egy amlno-termínálís mellonín maradék; egy kis, körülbelül 20-25 maradékból álló, kötő polipeptid, vagy egy kis extenziö, amely elősegíti a tisztítást a nettó töltés vagy egyéb funkció, például egy polihisztídin terület, egy antigén epítóp vagy egy kötő dómén megváltoztatása révén.

A konzervatív szubsztitúciók példái a bázikus aminosavak (arginin, lizin, hisztidin), a savas aminosavak (glutaminsav, és aszparaginsav), a poláros aminosavak (glutamín és aszparagin), a hidrofób aminosavak (leucin, izoieucin, valin és metionin), aromás aminosavak (fenllalanin, triptofán, tirozin) és kis aminosavak (gllein, alanín, szerln, threonin) körében történnek. Az olyan aminosav szubsztitúciók, amelyek általában nem változtatják meg a specifikus aktivitást, ismertek a tudomány e területén, és például H, Neuraih és R.L. Hill írták le (1979, The Proteins c. könyvben, Academic Press, New York). A leggyakrabban előforduló cserék a következők: Aía/Ser, Vaf/lle, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Giy, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gíy, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/íte, Leu/Val, Ala/Glu és Asp/Gly, valamint ezek fordítottjai.

A jelen találmány egy érdekes kiviteli alakjában az aminosav változások olyan természetűek, hogy a polipeptidek fizíko-kémiai tulajdonságai megváltoznak. Például, olyan aminosav változtatás végezhető el, ami javítja a polipeptid hösfahilitásáf, ami megváltoztatja a szuhszfrát specifitást, ami megváltoztatja a pH optimumot és más hasonló tulajdonságokat.

Előnyösen, a 2, számú szekvencia 1-40 aminosavaihoz képest az Ilyen szubsztitúciók, deléciok és/vagy inszerciők száma legfeljebb 10, például legfeljebb 9, például legfeljebb 8, még előnyösebben legfeljebb 7, például legfeljebb 8, például legfeljebb 5, legelőnyösebben legfeljebb 4, például legfeljebb 3, például legfeljebb 2, speciálisan legfeljebb 1.

A jelen bejelentés feltalálói izoláltak egy antimikrobiális aktivitással rendelkező polipeptidet kódoló gént a Pseedop/ecfan/a n/greZ/a-bói, A génnek otthont adó Pseuőop/ecfanto n/gre//a törzset a Szabadalmi Céllal Deponált Mikroorganizmus Letétek Nemzetközi Elismerésére vonatkozó Budapesti Szerződés szerint '1987 január 28,-án deponáltuk a Centraal bureau Voor Schlmmelcultures törzsgyűjteménynél (CBS)(Uppsaialaan 3, 3584 CT Utrecht, The Netherlands (vagy P.O.Box 85167, 3508 AD Utrecht, The Netherlands), ahol a CBS 444.97 katalógusszámot kapta.

Igy egy második kiviteli alakban, a jelen találmány olyan polípeptídekkel kapcsolatos, amelyek előnyösen olyan aminosav szekvenciát tartalmaznak (előnyösen abból állnak), ami legalább 6S%~ bán azonos azzal az antimikrobiális polipeptidet kódoló nukleotid szekvencia résszel, ami a Pseudop/ecten/a n/greZZa CBS 444,97 törzsben van jelen. A jelen találmány egy érdekes kiviteli alakjában a polipeptid olyan aminosav szekvenciát tartalmaz/előnyösen olyan szekvenciából áll, amely legalább 70%-ban, például legalább 75%-ban, előnyösen legalább 80%-ban, például 85%-ban, még előnyösebben legalább 90%-ban, még előnyösebben legalább 95%-ban, például 98%-ban, például legalább 97%-ba.n, és még előnyösebben legalább 98%-ban, például legalább 99%-ban azonos azzal az antimikroblálls polipeptidet kódoló nukleotid szekvencia résszel, ami a Pseudpp/ecfon/a n/greZ/s CBS 444.97 törzsben van jelen (a későbbiekben „homológ polipeptidekkénf utalunk rájuk), Egy érdekes kiviteli alakban az aminosav szekvencia legfeljebb 10 aminosavban (például 10 aminosavban), speciálisan legfeljebb 5 aminosavban (például 5 aminosavban), például legfeljebb 4 aminosavban (például 4 aminosavban), például legfeljebb 3 aminosavban (például 3 aminosavban) tér el attól az antimikroblálls polipeptidet kódoló nukleotid szekvencia résztől, ami a Pseuóop/edan/a mgre/Za CBS 444.97 törzsben van jelen. Egy különösen érdekes kiviteli alakban az aminosav szekvencia legfeljebb 2 aminosavban (például 2 aminosavban), például 1 aminosavban tér el a a Pseuóop/ecfan/a n/greZ/a CBS 444.97 törzsben jelen tevő nukleotid szekvencia antimikrobiális polipeptidet kódoló részének aminosav szekvenciájától.

Előnyösen, a jelen találmány pollpeptidjei magukba foglalják a Pseudop/eofan/a n/gre/Za CBS 444.97 törzsben jelen levő nukleotid szekvencia antimikrobiális polipeptidet kódoló részének aminosav szekvenciáját. Egy másik előnyös kiviteli alakban a jelen találmány pohpeptidje a Psenx/op/edan/a n/greZ/a CBS 444.97 törzsben jelen levő

X * nukleotid szekvencia antimikrobiális polipeptidet ködeié része által kódok polipeptid aminosav szekvenciájából áll.

A fentiekben leírtakhoz hasonlóan, a jelen találmány polípeptidje lehet egy olyan mesterséges variáns, ami előnyösen egy olyan aminosav szekvenciából áll, ami legalább egy aminosav szubsztitúciót, deléciót és/vagy lőszereiét tartalmaz a Rseu/opfeefen/a n/gre//a CBS 444.97 törzsben jelen levő nukleotid szekvencia antimikrobiális polipeptidet kódoló része által kódolt aminosav szekvenciához képest.

Egy harmadik kiviteli alakban a jelen találmány antimikrobiális aktivitással rendelkező polipeptidekkel kapcsolatos, amelyeket egy polinukleotld próbával nagyon alacsony szigorúsági körülmények között, előnyösen alacsony szigorúsági körülmények között, még előnyösebben közepes szigorúsági körülmények között, még előnyösebben közepeserős szigorúsági körülmények között, és még előnyösebben szigorú körülmények között, és még előnyösebben nagyon szigorú körülmények között hibridizálódő nukleotid szekvenciák kódolnak. Az említett polinukleotld próba lehet fi) az 1, számú szekvencia 166-285 nukleotidjalnak komplementer szála; (ii) az 1, számú szekvencia 70-285 nukleotidjalt tartalmazó cDNS szekvencia komplementer szála; és (iii) az 1, számú szekvencia 1-285 nukleotidjalnak komplementer szála (J.

Sambrook, E.F. Fritsch and T. Maniatis 1989, Molecular Cloning, A

Laboratory' Manual, 2nd Ed. Cold Spring Harbor, New York).

Az .számú nukleotid szekvencia, vagy ennek egy aiszekvenciája, valamint a 2, számú aminosav szekvencia vagy ennek egy fragmeníje felhasználható egy pelinukleotid próba megtervezéséhez, hogy antimikrobiális aktivitással rendelkező pollpeptideket kódoló DNS~t azonosítsunk és klónozzunk a különböze nemzetségekből vagy fajokból származó törzsekből a tudomány e területén insert módszereket használva.

nemzetség

Nevezetesen, az ilyen próbák felhasználhatók a kérdéses vagy faj genom vagy cDNS-ével való hibridizációhoz a

ΦΦ standard Southern lenyomat eljárást követően, a bennük levő megfelelő gén azonosítása és Izolálása céljából. Az ilyen próbák jelentősen rövíclebbek lehetnek, mint a teljes szekvencia, azonban legalább 15, előnyösen legalább 25, még előnyösebben legalább 35 nukleotid hosszúságúak, lehetnek akár 70 nukleotid hosszúságúak, Azonban, előnyös, ha a polinukíeotíd próba legalább 100 nukleotid hosszúságú. Például, a polinukíeotíd próba lehet legalább 200 nukleotid legalább 300 nukleotid hosszúságú, legalább 400 nukleotid hős: vagy legalább 500 nukleotid hosszúságú. Akár ennél hosszabb próbák is használhatók, például olyan polinukíeotíd próbák, amik legalább 6ÖÖ nukleotid hosszúságúak, legalább 7ÖÖ nukleotid hosszúságúak, legalább 800 nukleotid hosszúságúak, vagy legalább 900 nukleotid hosszúságúak. DNS és RNS próbák is felhasználhatók. A próbákat tipikusan jelöljük a megfelelő gének detektálásához (például 'ⁱ²P»veí, ^áH-val, ^3SS-sel, biotinnal vagy avidinnel), így az egyéb ilyen szervezetekből előállított genom DNS vagy cDNS könyvtár szkrínelhető olyan DNS-re, amely hibhdizáiódík a fent leírt próbákkal, és amely antlmikrobiálís aktivitással rendelkező polipeptidet kódol. Az egyéb ilyen szervezetekből származó genom vagy egyéb DNS agaróz vagy poliakrilamid géleíektroforézissel, vagy egyéb szeparációs technikával szeparálható, A könyvtárakból származó DNS vagy a szeparált DNS transzferálható, és immobíiízálhafő nlfrocellulózon vagy egyéb megfelelő hordozó anyagon. Egy az 1. számú szekvenciával homológ klón vagy DNS azonosításához az immobilizált DNS~f tartalmazó hordozó anyagot használjuk Southern lenyomat vizsgálathoz.

A jelen találmány céljaihoz, a hibridizáció azt jelzi, hogy a nukleotid szekvencia hibhdizáiódík egy jelölt polinukíeotíd próbával, amely nagyon alacsony ··· nagyon magas szigorúsági körülmények között híbridizálödik az 1. számú szekvenciában bemutatott nukleotid szekvenciával. Azok a molekulák, amelyekhez a polinukíeotíd próba Ilyen körülmények között hibridizálódik, detektálhatok röntgen Tibiimé) vagy bármely egyéb, a tudomány e területén ismert eljárással Ha a „poiinukleotid próba” kifejezést bármikor a jelen szövegösszefüggésben használjuk, akkor ezen azt kell érteni, hogy az ilyen próba legalábbis nukleotidot tartalmaz..

Egy érdekes kiviteli alakban a poiinukleotid próba az 1, számú szekvencia 166-285 nukleotidjainak, a 70-285 nukleotidjainak vagy az 1285 nukleotidjainak komplementer szálát jelenti.

Egy megint más érdekes kiviteli alakban a poiinukleotid próba a 2, számú szekvencia poíipeptidjét kódoló nukleotid szekvencia komplementer szálát jelenti. Egy további érdekes kiviteli alakban a poiinukleotid próba az 1. számú szekvencia komplementer szálát jelenti. Egy megint más érdekes kiviteli alakban a poiinukleotid próba az 1. számú szekvencia érett polipeptid ködeié régiójának komplementer szálát jelenti. Egy megint más érdekes kiviteli alakban a poiinukleotid próba a Pseudop/ecfan/a mgre/fa CBS 444.97 törzsben jelen levő antimikrobiális polipeptidet kódoló régió komplementer szálát jelenti. Egy megint más kiviteli alakban a poiinukleotid próba a Paeuo'op/ectan/a rt/gre//a CBS

444.97 törzsben jelen levő érett antimikrobiális polipeptidet kódoló régió komplementer szálát jelenti,

A legalább 100 nukleotid hosszúságú, hosszú próbákhoz nagyon alacsony ~ nagyon magas szigorúsági körülményeket határoznak meg elöhibridlzáclós és hibridizációs körülményekként, 42°C hőmérsékleten, 5X SSPE, 1,0% SDS, 5X Denbardt-féie oldat, 100 pg/ml feldarabolt, denaturált lazac sperma DNS elegyében, amit standard Southern lenyomat eljárás követ. Előnyösen, a legalább 100 nukleotidból álló hosszú próbák nem tartalmaznak 1000 nukleonénál többet A legalább 100 nukleotidból álló hosszú próbákhoz a hordozó anyagot végűi 3-szor mossuk egy-egy alkalommal 15 percig 2 x SSC-t, 0,1% SDS-t használva 42°C hőmérsékleten (nagyon alacsony szigorúsági körülmény), előnyösen 3-szor mossuk egy-egy alkalommal 15 percig 0,5 x SSC-t,

0,1% SDS-t használva 42°C hőmérsékleten (alacsony szigorúsági körülmény), még előnyösebben 3-szor mossuk egy-egy alkalommal 15 percig 0,2 x SSC-t 0,1% SDS-t használva 42°C hőmérsékleten (közepes szigorúsági körülmény), még előnyösebben 3-szor mossuk egy-egy alkalommal 15 percig 0,2 x SSC-t, 0,1% SDS-t használva 55°C hőmérsékleten (közepes-erős szigorúsági körülmény), legelőnyösebben

3-szor mossuk egy-egy alkalommal 15 percig 0,1 SSC-t, 0,1% SDS-t használva 60°C hőmérsékleten (szigorú körülmény), és főként 3-szor mossuk egy-egy alkalommal 15 percig 0,1 x SSC-t, 0,1 SDS-t használva 68°C hőmérsékleten (nagyon szigorú körülmény).

Bár nem különösebben előnyös, úgy tartjuk, hogy a rövidebb próbák, például a körülbelül 15-99 nukleotid hosszúságú próbák, mint a körülbelül 15-70 nukleotid hosszúságú próbák, szintén felhasználhatók. Az ilyen rövid próbákhoz a szigorúsági körülményeket a következőkben határozzuk meg; efőhibridizáciő, hibridizáció és hibridizáció utáni mosás a számított Tm értéknél S-KPC-kai alacsonyabb hőmérsékleten, a számítást Bolton and McCarthy szerint végezzük el (1952, Prooeedings of the National Academy of Sciences USA 48; 1390) mi mennyiségenként 0,9 M NaCI, 0,09 M Tris-HCI, pH 7,6, 6 mM EDTA, 0,5% NP-4Ö, 1x

Denhardt-féle oldat, 1 mM náfrium-pirofoszfát, 1 mM nátriummonobázisos foszfát, 0,1 mM ATP és 0,2 mg élesztőgomba RNS elegyében a standard Southern lenyomat eljárást követően,

A rövid próbákhoz, amelyek körülbelül 15-99 nukleotid hosszúságúak, a hordozó anyagot egyszer mossuk őx SSC* 0,1% SDSben 15 percig, majd kétszer 15 percig 6x SSC-ben a számított Tm értéknél 5~1Ö°C-kai alacsonyabb hőmérsékleten,

N-terminálís extenziö

Az N-terminális extenziö megfelelő módon állhat 1-50 aminosavból, előnyösen 2-20 aminosavból, különösen 2-15 aminosavból. Egy kiviteli <} < *·*

φ* alakban az N-termínáíis peptid extenzíó nem tartalmaz Arg-ot (R). Egy másik kiviteli alakban az N4erminális extenzló egy kox2~őt vagy szerű hasítási helyet tartalmaz, ahogy azt a meghatározzuk. Egy előnyös kiviteli alakban az N-termínális extenzló egy peptid, amely legalább 2 Glu (E) és/vagy Asp (D) aminosav maradékot tartalmaz, mint például az az N-termlnális extenzíó, amely az alá szekvenciák egyikéből áll:

Kex2 helyek

A kex2 helyek (lásd például Methods in Enzymology Vol 185, ed. D. Goeddel, Academic Press Inc., 1990, San Diego, CA, „Gene Expression Technology”) és a kex2~szerö helyek dlbázlsos felismerési helyek (azaz hasítási helyek), amelyek a pro-peptid kódoló régió és néhány protein érett régiója között található.

A kex2 hely vagy a kex2-szerű hely inszerciójárói bizonyos esetekben kimutatták, hogy javítják a helyes endopeptídáz feldolgozást a pro-pepíid hasítási helynél, ami fokozott protein szekréciós szlnteke-t eredményez.

A jelen találmány szövegösszefüggésében egy kex2 vagy egy kex2~szerü hely azt eredményezi, hogy lehetővé válik egy bizonyos pozícióban az N-terminálls extenzló hasítása, ami olyan antimikrobíális aktivitással rendelkező polipeptídet eredményez, ami hosszabb a 2. számú szekvencia 1-40 aminosavaként bemutatott érett pohpeptidnél.

Az antimikrobíális aktivitással rendelkező polípeptidek forrása

A jelen találmány polipeptldje kinyerhető bármilyen nemzetségbe tartozó mikroorganizmusból. A jelen találmány céljaihoz, a „kinyerhető valamiből” kifejezés a jelen találmány szerinti használatban azt jelenti, hogy a nukleotid szekvencia által kódolt polipeptídet olyan sejt termeli, amelyben a nukleotid szekvencia természetes módon jelen van, vagy amelybe a nukleotid szekvenciát inszertálták. Egy előnyös kiviteli alakban a polipeptid extraoeiiulráisan szekretálődik,

A jelen találmány pollpeptidje lehet bakteriális polipeptid. Például, a polipeptid lehet egy gram pozitív bakteriális polipeptid, például egy Secí//oe polipeptid, például egy Sac/te aZka/öp/?//m?_; fíac/ZZus arnyZo/Zguefecíens, Sac///us brev/s, SacZZ/oa o/rcuZans, fíac/7/us coagu/ans, Sac//Zus /autós., SacZZZus tenfus, BacZ/Zua ZZeZ?en/forws, SacZ/Zas megate.num. Sac///oa sZrearot/iermopbZZus, SadZZus suőZZ//s vagy Bac/Z/es tóar/ng/ensZs polipeptid; vagy egy Sfrepkv??yce,5 polipeptid, például egy Strepfomycee Ziv/dans vagy Sfrepfomyces munnos polipeptid; vagy egy gram negatív bakteriális polipeptid, például egy £ co/7 vagy egy Fseodomooas sp, polipeptid,

A jelen találmány pollpeptidje lehet gomba polipeptid is, és még előnyösebben egy élesztőgomba polipeptid, például egy Cand/ds, K/uyvwomyees, P/ch/a, Saccharornyces, Soő/zosacobarornyces vagy YarroivZa polipeptid, vagy még előnyösebben egy fonalasgomba polipeptid, például egy AcremonZao?, Asperg/Z/es, Aureoóas/dá/rn, C/ypfocoocu's, FZ/Z/jas/c/Zurn, Fesar/am, Hum/co/a, Magnaporéöe, ZV-fuoor, Myce/Zophfoora, Afeoca///mastf/x, ZVeorospora, PaecZZomycea, Pen/eZ/Z/um, P/romyces, Sc/?/xop/?yZ/a.m, Ta/aromycas, Fhemjosscas, Fb/eZavZa, Fo/ypoc/ad/om vagy Fr/cöoderma polipeptid.

Egy érdekes kiviteli alakban a polipeptid egy Saocőaromyces capsöergens/s, Saocharomyces cerw/sme, Saccfbaromyces d/asZaZZous, Saccharo.myces doogZaaZZ, Sacoőaromyces k/uyveri/, Saocöarornyoes norőer?67s vagy Sőccharomyces ovZZbrm/a polipeptid.

Egy megint másik, érdekes kiviteli alakban a polipeptid egy AspergZZ/us acuZeatus, Asperg/Z/us árvámon, Asperg/Z/os foefZdos, AspergZZZus /apon/cus, AopergZZ/us n/o'utans, AspergZ/Zos régen AspergZ/Zus oryzae, Fusam/m .őaotndZoZcZas, Fasam/m oereaZZs, Ft/sanurn croo/eve//ense, Fusartorn eu/morum, Fusaní/rn gram/nesrum, Fesartun? gramfoum, Fuser/um heforospori/m, ft/sam/m negundf, Fusw/um oxysporum, Fosar/um ref/cu/afum, Fasariaro roseam, Faaanam sambucmu-m, Fasar/an? sarcocbroam, Fasaaüm sporofr/oő/o/dea, Fasar/an? aa/phareum, Fasar/am foro/osum, Fasaaam frtchofoecfo/des, Fasar/am venenafum, Ham/co/a /nso/ens, Ham/co/a /anug/nosa, Áfcor mfoőe/, Myca/föpWbcra foermopő//a, Naarospora arassa, Fea/c////am parparogenam, rdc/ioderme /wz/anum, Frtchööferma Aonfog//, 77/cdoderma /oag/PraeP/afam, rdoőoderma raase/ vagy Thcőooferma v/dde polipeptid.

Egy előnyös kiviteli alakban a polipeptid egy Pseuohp/ecfan/a n/greí/a polipeptid, még előnyösebben egy Pseodop/ecfanfo n/greZZa CBS

444.97 polipeptid, például a 2. számú szekvencia 1-40 aminosavaiből álló polipeptid.

Érthető, hogy az előbb említett fajok esetében a jelen találmány magába foglalja a periek! és az imperfekí alakokat is, valamint egyéb taxonómiai megfelelőket, például az anamorfokat a jelenleg Ismert Tájnévtől függetlenül. A tudomány e területén képzett szakember könnyen felismeri a megfelelő ekvivalensek azonosságát.

fajok törzsei könnyen beszerezhetők számos törzsgyüjteménybők ilyenek például az American Type Culture Collection (ATCC), a Deutshe Sammlung von Mlkrorganísmen und Zellkulturen GmbH (DSM), a Centraalbureau Voor Schímmelcultures (CBS) és az Agrícultural Reasearch Service Patent Culture Collection, Northern Régiónál Research Center (NRRL),

Ezenkívül, az ilyen polipeptidek azonosíthatók és beszerezhetők egyéb forrásokból, Ideértve a természetből (például talajból, komposztból, vízből stb.) Izolálható mikroorganizmusokat, a fent említett próbákat használva. A természetes élőhelyről származó mikroorganizmusok Izolálásához való technikák jól ismertek a tudomány e területén. A * X nukleotid szekvencia ezután származtatható az egyéb mikroorganizmus genom vagy cDNS könyvtárának hasonló szkríneiésével Ha egy polipeptidet kódoló nukleotid szekvenciát detektáltunk a próbákkal, a szekvencia izolálható vagy klónozható a tudomány e területén jártas szakember számára ismert technikák felhasználásával (lásd például Sambrook et ah, 1989, supra).

A jelen találmány nukleotid szekvenciái által kódolt polipeptidek magukba foglalnak fuzionált polipeptideket, vagy hasítható fúziós polipeptideket is, amelyekben egy másik polipeptid fuzionált a polipeptid vagy egy fragmentje N-fermsnusáboz vagy C-termínusához. Fuzionált polipeptid jön létre, ha egy másik polipeptidet kódoló nukleotid szekvenciát (vagy ennek egy részét) fuzionáltatunk a jelen találmány egy nukleotid szekvenciájához (vagy ennek egy részéhez). A fúziós polipeptidek létrehozására szolgáló technikák ismertek a tudomány e területén, és idetartozik a polipeptideket kódoló kódolószekvencia oly módon történő iigálása, hogy ezek kereten belül vannak, és a fuzionált polipeptid expressziöja ugyanazon promóter(ek) és terminátor szabályozása alatt á

Pöilnukleofidök és nukleotid szekvenciák

A jelen találmány kapcsolatos olyan polinukleetidokkai is, amelyek a jelen találmány pollpeptidjét kódoló nukleotid szekvenciával rendelkeznek. A jelen találmány leginkább olyan polinukleoiidokkal kapcsolatos, amelyek a jelen találmány pollpeptidjét kódoló nukleotid szekvenciát kódolnak. Egy előnyösen kiviteli alakban a nukleotid szekvenciát az 1, számú szekvenciában mutatjuk be. Egy még előnyösebb kiviteli alakban a nukleotid szekvencia az 1. számú szekvencia érett pollpeptidjét kódoló régiót jelenti. Egy megint más előnyös kiviteli alakban a nukleotid szekvencia a Pseudop/ecfsn/a mgre/'/a CBS 444.97 törzsben jelen levő érett anflmikrobiálls polipeptidet kódoló φ* * régiót jelenti. A jelen találmány magába foglal olyan polinukleotidokat, amelyek a 2. számú szekvencia aminosav szekvenciáját tartalmazó polipeptidet kódoló nukleotid szekvenciákkal, vagy ennek egy éreti poHpeptidjével rendelkeznek, vagy előnyösen ebből állnak, amik a genetikai köd degeneráítságáből adódóan különbözik az 1. számú szekvenciától.

A jelen találmány olyan poHnukieotidokkal is kapcsolatos, vagy előnyösen olyan polinukleotidokból áll, amelyek az 1. számú szekvencia egy alszekvendájával rendelkeznek, ami a 2, számú szekvencia antimikrobiális aktivitással rendelkező fragmentjeit kódolja. Az 1. számú szekvencia alszekvenciája olyan nukleofid szekvenciát jelent, ami magába foglalja az 1. számú szekvenciát, azt leszámítva, hogy az 5’ és/vagy 3' végről egy vagy több nukleotídot delécióval eltávolítottunk.

A jelen találmány olyan poHnukieotidokkal is kapcsolatos, amelyek olyan módosított nukleofid szekvenciával rendelkeznek, vagy előnyösen olyan módosított nukleofid szekvenciából állnak, ami legalább egy módosítást tartalmaz az 1. számú szekvencia érett polipeptidet kódoló szekvenciájában, és ahol a módosított nukleofid szekvencia a 2. számú szekvencia 1-4Ö aminosavaiböl álló polipeptidet kódol.

Á polipeptidet kódoló nukleofid szekvencia izolálásához vagy klónozásához használt technikák Ismertek a tudomány e területén, és ezek közé tartoznak a genom DNS-ből való izolálás, a oDNS-ből való előállítás, vagy ezek kombinációja. A jelen találmány nukleofid szekvenciájának ilyen genom DMS-boi való klónozása megvalósítható, például a jól ismert polimeráz láncreakcióval (PCR) vagy az expressziós könyvtárak, antitest szkri nőiesével a közös szerkezeti tulajdonságokkal rendelkező, klónozott DNS fragmentek detektálása céljából. Lásd például Innis et al, 1990, PCR: A Guide to Methods and Application, Academio Press, New York. Egyéb amplifíkáeíös eljárások, mint például a Hgáz áncreakciö (LCR) a ligáit aktivált transzkripció (LAT) és a nukleofid φ >·> X szekvencia-alapú aropíif'ikáciő (NASBA) is használhatók, A nukleotid szekvencia klónozható egy a Pseudop/eofan/a egy törzsében jelen levő antirnikrobiáiis polipeptidet kódoló nukleotid szekvenciából, vagy egy másik, vagy rokon szervezetből, és így például lehet a nukleotid szekvencia polipeptidet kódoló régiójának egy alléi vagy faj variánsa,

A nukleotid szekvencia kinyerhető a génsebészetben használt standard klónozási eljárásokkal abból a célból, hogy áthelyezzük a nukleotid szekvenciát a természetes előfordulási helyéről egy másik helyre, ahol reprodukálódik. A klónozási eljárások magukba foglalhatják a polipeptidet kódoló nukleotid szekvenciát tartalmazó, kívánt fragment kimetszését és izolálását, a fragment egy vektor molekulába való inszertálását és a rekombináns vektor olyan gazdasejtbe való beépítését, ahol a nukleotid szekvencia több kópiája vagy klonja replikáíódni fog, A nukleotid szekvencia lehet genom, cDNS, RNS, félszintetikus, vagy szintetikus eredetű, vagy lehet ezek bármilyen kombinációja,

A jelen találmány egy olyan polinukleofidda! is kapcsolatos, amely előnyösen olyan nukleotid szekvenciából áll, ami legalább 85%-han azonos az 1. számú szekvencia 166-285 nukieofidjaival, Előnyösen a nukleotid szekvencia legalább ?0%~ban azonos, például legalább 8Ö%~ bán azonos, például legalább 9G%~ban azonos, még előnyösebben legalább 95%-ban azonos, például legalább 96%-ban azonos, például legalább 97%-öan azonos, vagy még előnyösebben legalább 98%~ban azonos, például legalább 99%-ban azonos az 1, számú szekvencia 166285 nukieofidjaival Előnyösen a nukleotid szekvencia antirnikrobiáiis aktivitással rendelkező polipeptidet kódol A két nukleotid szekvencia közötti azonosság mértéke a fentiekben leírtak szerint határozható (lásd a „definíciókról” szóló részt), Előnyősén, a nukleotid szekvencia tartalmazza az 1. számú szekvencia 168-285 nukleotidjait, Egy még előnyösebb kiviteli alakban a nukleotid szekvencia az 1, számú szekvencia 188-285 nukteofldiaíböl áll φ*

Egy másik érdekes aspektusban jelen találmány olyan polinukieotiddal kapcsolatos, amely előnyösen olyan nukleotid szekvenciát tartalmaz, vagy olyan nukleotid szekvenciából áll, ami legalább 65%-ban azonos a FseuoőpZecfan/a n/greZ/a CBS 444,97 törzsben jelen levő anfímíkrobiáhs aktivitást kódoló nukleotid szekvenciában jelen levő nukelotid szekvencia antlmikrobiális polipeptidet kódoló régiójával. Egy előnyös kiviteli alakban a PseurZopZocfen/a n/gre/Za CBS 444,97 törzsben jelen levő antlmikrobiális polipeptidet kódoló nukleotid szekvenciában jelen leve nukelotid szekvencia antlmikrobiális polipeptidet kódoló régiójával való azonosság mértéke legalább 70%-ös, például legalább 80%-os, például legalább 90%-os, még előnyösebben legalább 95%-os, például legalább 96%-os, például legalább 97%~os, még előnyösebben legalább 98%-os, például 99%-os. Előnyösen a nukleotid szekvencia magába foglalja a .PseudopZectanZa n/greZZa CBS

444,97 törzsben jelen levő antlmikrobiális polipeptidet kódoló nukleotid szekvenciában jelen levő nukelotid szekvencia antlmikrobiális kódoló régióját. Egy még előnyösebb kiviteli alakban a nukleotid szekvencia magába foglalja a Pseudop/ec/anZa n/gre/Za CBS 444.97 törzsben jelen levő anfimikrobiáiis polipeptidet kódoló nukleotid szekvenciában jelen levő nukelotid szekvencia antlmikrobiális polipeptidet kódoló régióját.

A jelen találmány poíipepiidjét kódoló nukleotid szekvencia módosítására szükség lehet azon polipeptid szintéziséhez, amely olyan aminosav szekvenciát foglal magába, ami a 2, számú szekvencia 1-40 aminosavához képest legalább egy szubsztitúciót, delécíót és/vagy inszerciót tartalmaz. Ezek a mesterséces variánsok különbözhetnek némely génsebészetlleg manipulált módon a natív forrásból izolált polipeptídtől, például lehetnek olyan variánsok, amelyek specifikus aktivitásukban, hőstabilitásukban, pH optimumukban vagy más hasonló tulajdonságukban különböznek.

< * ·>

₀Χ φ φ

< Λ Φ Φ Φ

Φ>Φ

A tudomány e területén képzett szakember számára nyilvánvaló, hogy az Ilyen módosítások a molekula funkció szempontjából kritikus fontosságú régiókon kívül végezhetők et és még mindig aktív polipeptidet eredményeznek. A jelen találmány nukleotid szekvenciája által kódolt polipeptid aktivitásához létfontosságú, és ezért előnyösen a módosítás, például szubsztitúció céljai közé nem tartozó aminosav maradékok azonosíthatók a tudomány e területén Ismert eljárásokkal, például hely irányított mutagenezíssel vagy aíanin-szkenneíő mutagenezisseí (lásd például Cunníngham and Wells, 1989, Science 244:1081-1085). Ez utóbbi technikában a mutációkat: minden pozitív töltésű maradéknál bejuttatjuk a molekulába, és a kapott mutáns molekulát teszteljük antimikrobiális aktivitásra, hogy azonosítsuk a molekula aktivitásához létfontosságú aminosav maradékokat. A szuhsztrái-enzim kölcsönhatás helyei szintén meghatározhatók a három-dimenziós szerkezet elemzéséből, amint azt például a nukleáris mágneses rezonancia anaíízíses, krisztallográfiás vagy fotoaffinitási jelöíéses technikával meghatároztuk (lásd például de Vos et al,, 1992, Science, 255:306-312; Smith et al., 1992, Journal of Molecular Biology, 224:899-904; Wlodaver etaL 1992, FEBS Letters 309:59-64).

Sőt, a jelen találmány polipeptidjét kódoló nukleotid szekvencia módosítható úgy, hogy egy nukleotid szubsztitúciót juttatunk be, amely nem eredményez a nukleotid szekvencia által kódolt másik aminosav szekvenciát, de amely megfelel az enzim termeléshez szánt gazda mikrooroanizmus kódon használatának.

A nukleotid szekvenciába egy nukleotid másikra való cseréjét szolgáló mutáció létrehozása megvalósítható boly irányított mutagenezíssel, a tudomány e területén isméd bármilyen eljárást használva. Különösen hasznos eljárás, amely egy kérdéses ínszertet tartalmazó, szuper feltekeredett, kétszálú DNS vektort használ, és két, a kívánt mutációt tartalmazó szintetikus prímért. Az oligonukleotid primerek, ·>

amelyek mindegyike komplementer a vektor ellentétes szálával, a Pfu DNS polimeráz segítségével hosszabbodnak meg a hőmérsékleti ciklusolás során, A primerek beépítésekor, az eltolt elrendezésű elekeket tartalmazó mutált plazmid jön létre. A hőmérsékleti ciklusolás után a terméket Dpnl-gyel kezeljük, amely specifikus a metilált és hemímetilált DNS-re, hogy megemésszük a szülői DNS tempiátot, és mutációt tartalmazó szintetizált DNS-t szelektáljunk. A tudomány e területén ismert egyéb eljárások is használhatók. A nukleotid leírásához lásd például Ford et ak, 1991, Purification 2:95-107, helyettesítések általános Protein Expression and

A jelen találmány olyan polinukleotiddal is kapcsolatos, amely előnyösen olyan nukleotid szekvenciát tartalmaz, ami antimikrobiális aktivitással rendelkező polipeptidet kódol, és ami nagyon alacsony szigorúsági körülmények között, előnyösen alacsony szigorúsági körülmények között, még előnyösebben közepes szigorúsági körülmények között, még előnyösebben közepes-erős szigorú körülmények között, és még előnyösebben igen szigorú, és még előnyösebben nagyon szigorú körülmények között hibridizátódík egy olyan polinukleotld próbával, ami lehet (1) komplenter az 1. számú szekvencia 166-285 nukleotidjaival, (ii) az 1. számú szekvencia 70-285 nukleotidjait tartalmazó cDNS szekvencia komplementer szála; és (iii) az 1, számú szekvencia 1-285 nukleotidjainak komplementer szála.

Érthető, hogy a nukleotid szekvenciák hibridizációjára vonatkozó részletek és sajátosságok ugyanazok vagy analógok a jelen találmány „Antimikrobiális aktivitással rendelkező polipeptidek” c, részben leírt hibridizációs aspektusaival.

Nukleinsav szerkezetek

A jelen találmány kapcsolatos olyan nukleotid szerkezetekkel is, amelyek a jelen találmány egy nukleotid szekvenciáját tartalmazzák

Φ* *

φ φφ

Φφ

Λ * φ ** működőképesen kapcsolódva egy vagy több - a kódoló szekvencia expresszióját Irányító - szabályozó szekvenciához megfelelő gazdasejtben olyan körülmények között, and kompatibilis a szabályozó szekvenciákkal,

A jelen találmány polípeptidjét kódoló nukleotid szekvencia különféle módokon manipulálható, hogy a polipeptid expresszióját biztosítsa, A nukleotid szekvencia vektorba való ínszercíója előtti manipulálása kívánatos vagy szükséges lehet az expressziós vektortól függően. A rekombináns DNS módszereket használó nukleotid szekvenciák módosítására szolgáló technikák jól Ismertek a tudomány e területén,

A szabályozó szekvencia lehet egy megfelelő promóter szekvencia, egy olyan nukleotid szekvencia, amit a nukleotid szekvencia expressziójához való gazdasejt felismer, A promóter szekvencia tartalmaz a polipeptid expresszióját közvetítő transzkripciós szabályozó szekvenciákat, A promóter lehet bármilyen nukleotid szekvencia, amely transzkripciós aktivitást mutat a választott gazdasejtben, Ideértve a mutáns, csonkított, és hibrid promótereket, és kinyerhető extracelluláris vagy intracelluláris polipeptideket kódoló génekből, amelyek homológok vagy heíerolőgok a gazdasejttel,

A jelen találmány nukleinsav szerkezeteinek különösen egy bakteriális gazdasejfben való transzkripciójának irányításához megfelelő promöterekre példák, az £. co// /ae operonböl, a Sttepfomyoes coe//co/or agaráz génből (dagA), a Sac///os suö////s levanszukráz génből (secö), a 8ac/te //c/?en/.form/s afía-aroiláz génből (ernyő), a Sac/te sdearof/íer.mopby./i.rs maítogén amiláz génből (amyM), a Sac/te amy/o/7guefác/ens aífa~amiiáz génből (arnyQ), a 8ae//7us //chen/form/s penicíllináz génből (oenP), a 0ac//7us suő////s xy/A és xy/S génekből és a prokariőta beta-laktaroáz génből származó promoterek (Viíla-Kamaroíí et ak, 1978, Proceedings of the National Academy of Science USA 75:3727*ν

2Q φ

* φ* φ

φ φ ** φ

3731), valamint a tac promoter (DeBoer et al., 1983, Proeeedings of the National Academy of Sciences USA 30:21-25), További promóterek kerültek leírásra a következőkben: „Useful proteiné írom recombinant bacteha” in Scíeníific American, 1880, 242:74-94 és Sambrook et al, 1939, seprő,

A jelen találmány nukleinsav szerkezetei transzkripciójának irányításra szolgáló megfelelő promóterekre példák fonalasgomba gazda sejtekben azok a promóterek, amiket az Asperg/te oryzae TAKA. amilázhoz, a Rh/zomucor m/ehe/ aszparagln-proteínázhoz, az Asperg///os n/ger semleges alfa-amílázhoz, Asperg/7/us n/ger sav stabil alfaamilázhoz, az Asperg/te n/ger vagy Asperg/Z/ys av/amoh glükoamilázhoz (g/aA), a Ah/zomocof m/ehe/ lípázhoz, az Asperg/Ws oryzae alkalíkus proteázhoz, Aspeg///es oryzee trióz-foszfát izomerázhoz, Aspergf/tes n/dn/ans acetamldázhoz, és a Fusar/om oxysporom tripszín-szerű proteázhoz való (WO 96/00787) génekből nyertünk, valamint az NA2-tpi promoter (az Asperg/te n/ger semleges aífa-amilázhoz és az Asperg/te oryzao trióz foszfát izomerázhoz való génekből származó promóterek hibridje), és ezek mutánsa, csonkított és hibrid promóterei.

Az élesztőgomba gazdában hasznos promóterek a Seccharornyoos cerem/oe enoiázhoz (ENO-1), a Saccharomyces cerevfs/ae galaktoklnázhoz (GAL1), a Sacoriaromycos cerw/s/ae alkohol dehldíogenáz/gíieera)deh)d3~foszíáí dehldrogenázhoz (ADH2./GAP) és a Saceharornyces cerovÁs/ae 3-foszfoglicerát kinázhoz való génekből nyerhetők. Egyéb az élesztőgomba gazdasejtekhez hasznos promótereket írtak le Romanos és munkatársai (1992, Yeast 8:423-488).

A szabályozó szekvencia is lehet megfelelő transzkripciós termínátor szekvencia, egy olyan szekvencia, amit a gazdasejt a transzkripció termínálásához ismer fel. A termínátor szekvencia működőképesen kapcsolódik a polipeptidet kódoló nukleotid szekvencia

3* terminusához. Bármilyen terminálon ami működik a választott gazdasejtben felhasználható a jelen találmányban.

A fonaiasgomba gazdasejtekhez előnyös terminátorok nyerhetők az Asperg/te oryzae TAKA amilázhoz, az Asperg/te n/ger glükoamilázhoz, az Asperg/te mtos anthranilát szintázhoz, az Aspergá'/es o/ger aífa-gíükozidázhoz és a Fusanum oxysporum tripszinszerű proteázhoz való génekből

Az élesztőgomba gazdasejtekhez való előnyös terminátorok nyerhetők a Saeeharomyces cerev/s/ae enolázhoz, a Saccőaromyces cereAs/ae citokrom C-hex (CYC1) és a Saccharomyces oerews/ae glíceraidehid~3~foszfát dehidrogenázhoz való génekből Az élesztőgomba gazdasejtekhez hasznos egyéb terminátorok kerültek leírásra Romanos et al, munkájában 1992, supra.

A szabályozó szekvencia lehet egy megfelelő vezető szekvencia is, egy mRNS olyan nem transziáit régiója, ami a gazdasejt általi transzlációhoz lényeges. A vezető szekvencia működőképesen kapcsolódik a polipeptídet kódoló nukleotid szekvencia 5‘ terminusához. A választott gazdasejtben működőképes bármilyen vezető szekvencia felhasználható a jelen találmányban.

A fonalasgomba gazdasejtekhez előnyős vezetőket az Asperg///us o/yzue TAKA amilázhoz és az Asperg///vs m</u/ans trióz-foszfát izomerázhoz való génekből nyerjük.

Az élesztőgomba gazdasejtekhez való megfelelő vezetők kinyerhetők a Sace/womyc&s cerev/s/ae enolázhoz (ENO-1), a Sacc/womyces cerev/s/ae 3-íoszfoglícerát kinázhoz, a Sacoharornyces cerews/ae alfa-faktorhoz és a Saccőaromyces cerev/s/ae alkohol dehidrogenáz/giiceraldehid~3Toszfáf dehidrogenázhoz (ADH2/GAP) való ö énekből,

V·'

A szabályozó szekvencia lehet egy políadenilációs szekvencia, egy a nukleotid szekvencia 3’ terminusához működőképesen kapcsolódó * φ » . Ϊ »»» szekvencia és egy olyan szekvencia, ami ha átíródík, a gazdasejt olyan jelként ismeri fel, aminek hatására poliadenozin maradékokat ad az átírt mRNS-hez. Bármilyen pöliadenilácios szekvencia, ami működik a választott gazdasejtben, felhasználható a jelen találmányban.

Előnyös poliadenilációs szekvencia nyerhető a fonalasgomba gazdasejtekhez az Asperg//fos o/yzae TAKA amilázhoz, az Asperg/Z/es n/ger glükoamilázhoz, az Aspergf/fos nkfo/ans anthranilát szintázhoz, a Ausar/wm ox/sporom tripszin-szerö proteázhoz és az Asperg/te n/ger aíía-glükozídázhoz való génekből

Az élesztőgomba gazdasejthez megfelelő poliadenilációs szekvenciákat Guo és Sherman írták le (1996, Molecular Cellúlar Biology, 15:5983-5990).

A szabályozó szekvencia lehet egy olyan jel peptidet kódoló régió Is, ami egy a polipeptid amino-terminusához kötött aminosav szekvenciát kódol, és ami a kódolt polipeptidet a sejt szekréciós reakcióútjára Irányítja, A nukleotid szekvencia kódoló szekvenciájának 6^! vége inherensen tartalmazhat egy jel peptidet kódoló régiót, ami természetes módon kötődik a transzlációs leolvasási keretben a kódoló régió olyan szegmensével, ami a szekretált polipeptidet kódolja. Másik lehetőségként, a kódoló szekvencia 5’ vége tartalmazhat egy olyan jel pepiidet kódoló régiót, ami idegen a kódoló szekvencia számára. Az Idegen jel pepiidet kódoló régióra szükség tehet, ha a kódoló szekvencia természetes módon nem tartalmaz egy jel peptidet kódoló régiót, Másik lehetőségként, az idegen jel peptidet kódoló régió egyszerűen helyettesítheti a természetes jel pepiidet kódoló régiót, hogy fokozza a polipeptid szekrécióját. Azonban bármilyen olyan jel peptidet kódoló régió, ami az expresszált polipeptidet a választott gazdasejt szekréciós reakcióútjára irányítja is felhasználható a jelen találmányban.

A jel pepiidet kódoló régió az 1. számú szekvencia 1-69 nukleotídjaít jelenti, amelyek a 2, számú szekvencia -55 - »33 aminosavait (vagy a 3. számú szekvencia 1-23 aminosavait) kódolják.

A bakteriális gazdasejthez való hatékony jel peptidet kódoló régiók azok a jel pepiidet kódoló régiók, amik a Sacta? NCIB 1183? maitogén amilázhoz, a öac//ms stearofoermopőá'us alfa-amilázhoz, a Sac/te //cőeo/form/s szubtiíizinhez, a Sac/te //chem/orm/s beta-íaktamázhoz, a Sac/Z/os smeroá?er,mopd//üs semleges proteázokhoz (nprT, nprS, npr.M) és a Sactf/us sodá/os prsA-hoz való génekből nyerhetők. További jel peptideket írtak le Simonén and Palva, 1993, Microbioíogical Revlews 57:109-137,

A fonalasgomba gazdasejtekhez való hatékony jel pepiidet kódoló régiók azok a jel peptidet kódoló régiók, amik az Asperg/Z/us o/yzae TAKA amiíázhoz, Aspenyá/us n/ger semleges amilázhoz, az Asporp///os n/ger glökoamllázhoz, R/v'zomucor m/ehe/ aszparagin-proteínázhoz, Hom/co/a /nso/ens cellulózhoz és Hum/co/a /a.oogmosa tlpázhoz való génekből nyerhetők.

Az élesztőgomba gazdasejtkehez való hasznos jel peptidek nyerhetők a Saccharomyces cerev/síae alfa-faktorhoz és a Seccheromyces cerev/s/ae inverzáthoz való génekből. Egyéb hasznos jel pepiidet kódoló régiókat írtak le Romanos és munkatársai, 1992, supra.

A szabályozó szekvenciák lehetnek olyan propeptid kódoló régiók Is, amik a polipeptid amino-terminusán elhelyezeti aminosav szekvenciát kódolnak, A kapott polipeptid proenzlmként vagy propolípeptidként (vagy bizonyos esetekben zimogénként) ismert. Egy propolipeptid általában Inaktív, és érett aktív pollpepliddé konvertálható a propeptid propolipeptidről való katalitikus vagy autokafalitlkus hasításával. A propeptidet kódoló régió kinyerhető a Sacá/us suőúAs alkalíkus proteázhoz (aprE), a Saeífe svőé/'/s semleges proteázhoz (nprT), a Saccéazcmycss oerev/s/ee alfa-faktorhoz, a Ró/zomucor m/ehe;

* X * * ❖ f, ' * * * * í i > < « * Ψ <·

aszparagin-proteinázhoz és a Myce//op/?íhora fhermoph/fe iakkázhoz való génekből (WO 95/33836).

A propeptidet kódoló régió az 1. számú szekvencia 70-165 nukleotidjalt jelenti, ami a 2. számú szekvencia -32-1 aminosavait (vagy a 3. számú szekvencia 24-55 aminosavak) kódolja.

Ahol a jel pepiid és propeptíd régió is jelen van a polipeptid amlnoíerminusán, a propeptid régió a polipeptid amino-terminusa mellett helyezkedik el, a jel pepiid pedig a propeptid régió amlno-terminusa melled:.

Kívánatos lehet olyan szabályozó szekvenciák hozzáadása is, amik lehetővé teszik a polipeptid expressziójának szabályozását a gazdasejt szaporodásához viszonyítva. A szabályozó rendszerekre példák azok, amik azt okozzák, hogy a gén expressziója be és kikapcsolódik kémiai vagy fizikai stimulus hatására, ideértve egy szabályozó vegyület jelenlétét. A prokarlóta rendszerekben levő szabályozó rendszerek közé tartoznak a /ao, a tec és a trp operátor rendszerek. Élesztőgombákban az ADH2 rendszer vagy a GÁLI rendszer használható. Fonalasgombákban a T'AKA alta-amiiáz promoter, az Asperg///us n/ger glökoamíláz promoter és az Asperg/fe oryzae glökoamíláz promoter használható szabályozó szekvenciaként. A szabályozó szekvenciákra példák még azok, amik lehetővé teszik a gén amplifikálást Eukaríóta rendszerekben ezek közé tartoznak a dihidrofolát reduktáz gén, ami metotrexát jelenlétében ampiiíikálódik, és a metallotioneln gének, amik nehézfémekkel amplifikáiódnak. Ezekben az esetekben a polipeptidet kódoló nukleotid szekvencia működőképesen kapcsolódik a szabályozó szekvenciával.

Expressziós vektorok

A jelen találmány kapcsolatos olyan rekombináns expressziós vektorokkal Is, amelyek a jelen találmány nukleinsav szerkezetét tartalmazzák. A különböző feni: leírt nukleotid és szabályozó szekvenciák összekapcsolhatók, hogy olyan rekombináns expressziós vektort hozzanak létre, ami egy vagy több megfelelő restrikciós helyet foglal magába, hogy lehetővé tegye a polipeptidet kódoló nukleotid szekvencia inszercióját vagy helyettesítését az ilyen helyeken. Másik lehetőségként, a jelen találmány nukleotid szekvenciája expresszálhafő úgy is, hogy a nukleotid szekvenciát vagy a szekvenciát tartalmazó nukleinsav szerkezetet egy megfelelő vektorba inszertáljuk az expresszióhoz. Az expressziós vektor létrehozásában a kódoló szekvenciát úgy helyezzük el a vektorban, hogy a kódoló szekvencia működőképesen kapcsolódjon az expresszióhoz való megfelelő szabályozó szekvenciákkal.

A rekombináns expressziós vektor lehel bármilyen vektor (például egy plazmid vagy vírus), amely megfelelő rekombináns DNS eljárásoknak vethető alá, és megvalósíthatja a nukleotid szekvencia expresszióját, A vektor kiválasztása tipikusan a vektor azon gazdasejttel való kompatibilitásától függ, amelybe a vektor be akarjuk juttatni, A vektorok lehetnek lineáris vagy zárt kör alakú piazmidok.

A vektor lehet autonóm módon replikálődó vektor, azaz olyan vektor, ami extrakromoszómális egységként létezik, amelynek replikáoíója független a kromoszóma replikádétól, például lehet egy plazmid, egy extrakromoszőmélls elem, egy minikromoszóma, vagy egy mesterséges kromoszóma.

A vektor tartalmazhat bármilyen elemet az önrepiikáció biztosításához. Másik tehetőségként a vektor lehet olyan vektor, ami, ha bejuttatják a gazdasejtbe, integrálódik a genomba, és együtt replikáiódik azzal/azokkal a kromoszómával/kromoszómákkal, amelyikbe bejuttatták. Ezenkívül, egyetlen vektor vagy plazmid, vagy két vagy több vektor vagy plazmid is használható, amelyek együtt tartalmazzák a gazdasejt genomjába bejuttatandó teljes DNS-t, vagy egy transzpozon is alkalmazható.

* > * Φ ·* Φ *

A jelen találmány vektorai előnyösen egy vagy több szelektálható markert tartalmaznak, amelyek lehetővé teszik a transzformált sejtek könnyű kiválasztását. A szelektálható marker egy olyan gén, amelynek terméke bíocid vagy virális rezisztenciát, nehézfémekkel szembeni rezisztenciát, az auxotrófoknak prototrófiát és más hasonló tulajdonságokat biztosít

A bakteriális szelektálható markerekre példák a Bad//us suöbfe~hőí vagy a Bac///us //chen/form/s-ból származó da/ gének, vagy olyan markerek, amelyek antibiotikum rezisztenciát, például ampicillin, kanamycin, kloramfenskol vagy tetraciklin rezfisztencíát biztosítanak. Az élesztőgomba gazdasejtekhez való megfelelő markerek az ADE2, a H1S3, a LEU2, a LYS2, a MET3, a TRP1 és az URA3. Fonalasgomba gazdasejtekben használható szelektálható markerek közé tartoznak az ezekre való korlátozás nélkül az amdS (acetamídáz), az argB (ornitin karbamoil-transzferáz), a bar (íoszfinotrícin-acetiltranszferáz), a hygS (higromicin foszfotranszferáz), a n/aD (nitrát redukláz), a pyrG (orotidin-5foszfát dekarboxiláz), az sC (szulfát adeníl-transzferáz), a hpC (antranilát szintez), valamint ezek ekvivalensek

Egy z4sperg///os sejtben való használathoz előnyösek az Asperg///us n/du/ans vagy az .Asperg///us oryzae arndG és a pyrG génjei és a S/repfomyees óygrosoop/cOS cár génje.

A jelen találmány vektorai előnyösen tartalmaznak olyan elemet, ami lehetővé teszi a vektor gazdasejt genomjába való stabil Integrációját vagy a vektor autonóm replikációját a sejtben a génemtől függetlenül.

A gazdasejt genomba való integrációhoz a vektor a polipeptidet vagy a vektor bármilyen egyéb elemét kódoló nukleotid szekvenciára támaszkodik a vektor homológ vagy nem homológ rekombinációval genomba történő stabil integrációjához. Másik lehetőségként, a vektor tartalmazhat további nukleotid szekvenciákat a gazdasejt genomjába homológ rekombinációval megvalósuló integráció irányításához. A ♦ * *

ΦΦ Λ* *♦* további nukleotid szekvenciák lehetővé teszik, hogy a vektor a kromoszómáik) pontos helye(í)n Integrálódjon a gazdasejt genomjában. A pontos helyen bekövetkező integráció valószínűségének növeléséhez az Integrációs elemek előnyösein megfelelő számú nukleotidot, például 1001500 bázispárt, előnyösen 400-1500 bázispárt, még előnyösebben 8001500 bázispárt tartalmaznak, amelyek erősen homológok a megfelelő cél szekvenciával ahhoz, hogy fokozzák a homológ rekombináció valószínűségét. Az integrációs elemek lehetnek bármilyen szekvenciák, amelyek homológok a gazdasejt genomjában levő cél szekvenciával. Ezenkívül, az integrációs elemek lehetnek nem-kódoló vagy kódoló nukleotid szekvenciák. Másrészt, a vektor integrálódhat a gazdasejt genomjába nem-homológ rekombinációval is.

.Az autonóm replikádéhoz a vektor még tartalmazhat egy replikációs origót, ami lehetővé feszi, hogy a vektor autonóm módon repiikálódjon a kérdéses gazdasejtben, A bakteriális replikációs origóra példák a pBR322, a pUC19, a pACYC177 és a p.ACYC184 plazmidok, amelyek lehetővé teszik az E. co//-ban való replikádét, és a pUB110, a pE194, a pTAtÖbÖ és a ρ.ΑΜβ'Ι plazmldok, amik a BacM/s-ban való replikádét teszik lehetővé. Az élesztőgomba gazdasejtekben való replikációs origókra példák a 2 y-os replikációs origó, az ARS 1, ARS4, az ARS! és CEN3 kombinációja és az ARS4 és CEN6 kombinációja. A replikációs origó lehet olyan replikációs origó, ami mutációval rendelkezik, és ez lehetővé feszi, hogy höszenzitívként funkcionáljon a gazdasejtben (lásd például Ehrilch 1978, Proceedings of the National Academy of Science, USA 75:1433).

A jelen találmány nukleotid szekvenciájának egynél több kópiája is ínszertálható a gazdasejtbe, hogy fokozza a géntermék termelését. A nukleotid szekvencia kópia számának növelése elérhető, ha legalább egy további szekvencia kópiát integrálunk a gazdasejt genomjába vagy ha egy ampliíikáihafó szelektálható markért építünk a nukleotid szekvenciába, ahol a szelektálható marker gén amplífikált kópiáit és így a nukleotid szekvencia további kópiáit tartalmazó sejtek oly módon szelektálhatok, hogy a sejteket megfelelő szelektálható anyag jelenlétében tenyésztjük,

A jelen találmány rekombináns expressziós vektorainak megszerkesztését célzó, a fent leírt elemek Ugatásához használt eljárások, jól ismertek a tudomány e területén jártas szakemberek számára (Lásd például Sambrook et al, 1989, supra).

Gazdasejtek

A jelen találmány a jelen találmány nukleinsav szerkezetét tartalmazó gazdasejttel is kapcsolatos, amely előnyösen használható a polípeptidek rekombináns létrehozásában, A jelen találmány nukleotid szekvenciáját tartalmazó vektort bejuttatjuk egy gazdasejtbe, hogy a vektor kromoszomális integránsként vagy önreplíkálódó extrakromoszómáké vektorként maradjon fenn, ahogy azt korábban leírtuk,

A gazdasejt lehet egysejtű mikroorganizmus, például egy prokarióta vagy egy nem-egysejtű mikroorganizmus, például egy eukarióta.

Hasznos egysejtű sejtek a baktérium sejtek, például a gram pozitív baktériumok, ideértve az ezekre való korlátozás nélkül a fíac///us sejteket, mint például a Öac/7/üs a/ka/oph/fes, Sack/us amy/oá'guefecfens., Sae/te .őrw/s, Bac///us c/rou/a.os, fíac//7us c/aus/í, Sac///us coagu/ans, SaoWus /autós, Bac/Z/us /entos, Sactf/us //chen/Zorm/s, fíacA'us megafenurm Sac/te sfearo/hermop/á/us', Bac///us suőkfe és a SackVus feunng/ena/s vagy a S/roptom/ces sejtek, például a Sfrepfernyces //v/dans, vagy a Sfeepfomyces mur/nus, vagy a gram negatív baktériumok, mint az £ co// és a Rseadömonas fajok. Egy előnyös kiviteli alakban a baktérium gazdasejt Sac///us /en/us-t Sac///os //cáer?/fermfe-t, 8ao?7/us sfearo/áera?o/?Zí//o.s-t vagy SacZ//us sobfe/s-t jelent. Egy másik előnyös kivitel; alakban a Sac///os sejt aikaíofü Bac/Z/us-t jelent

Egy vektor bakteriális gazdasejibe való bejuttatása, például protpoiaszt transzformációval valósítható meg (lásd például Chang and Cehén, 1979, Molecular General Geneilcs 168:111-115), kompetens sejteket (lásd például Young and Spizizin, 1981, Journal of Bacteríology, 81:823-829 vagy Dubnau and Davidoff-Abelson, 1971, Journal of Molecular Biology, 56:209-221) eiektroporáoiót (lásd például Shígekawa and Dower, 1988, Biotechniques 6:742-751) vagy konjugációt (k :5771péidául Koehler and Thorne, 1987, Journal of Sacteriology 5278) használva.

A gazdasejt lehat eukarióta, például emlős, rovar, növény gomba sejt.

Egy előnyös kiviteli alakban a gazdasejt gomba sejtet jelent. A „gomba a jelen találmány szerinti használatban Ascomycofa, Sasidiomyeota, Chytndiomycota és Zygomycoia törzseket jelent (ahogy azt Hawksworth et at, meghatározták in: Ainsworth and Bisby’s Díctionary of The Fungi 8. ed, 1995, CAB International, University Press, Cambridge, UK), valamint az Oomycota (ahogy Hawksworth et al hivatkoztak, 1995, supra, 171, oldal) és az összes mitospórás gombák (Hawksworth et al., 1995, supra).

Egy még előnyösebb kiviteli alakban a gomba gazdasejt élesztőgomba sejtet jelent. Az „élesztőgomba” kifejezés a jelen találmány szerinti használatban ascosporogén élesztőgombákat (Endomycetales), basidiosporogén élesztőgombákat és a Fungí Imperfectí-be (Blasfomycetes~be) tartozó élesztőgombákat jelent. Miután a jövőben várható, hogy az élesztőgombák rendszerezése megváltozik, a jelen találmány céljaihoz ez élesztőgombákat a Biology and Acfivitíes of Yeast c. műben meghatározottak szerint használjuk (Sklnner, E.A. Passmore,

S.M. and Devonport R.R, eds. Soc, App. Bacteriol, Symposíum Series NoA 1980).

<·<·<· φ

Egy még előnyösebb kiviteli alakban az élesztőgomba Cand/cfej, Hansenu/a, K/uyveromyces, P/ch/a, Saccóaromyces vagy Yanwfe sejteket jelent.

Egy még előnyösebb kiviteli alakban az élesztőgomba gazdasejt Saccőaromyces oartsbergens/s, Saccőaromyees cere v/s/ae,

Saccbarornyces b/asfaócus, Saoe/womyoes doog/asF Saccharomycea A'/eyverT Saccharomyoes aorőona/a vagy Saccbaromyces ow/brm/s sejt lehet. Egy másik előnyős kiviteli alakban az élesztőgomba gazdasejt K/eyveromyoes /acf/a sejtet jelent. Egy megint más előnyös kiviteli alakban az élesztőgomba gazdasejt Ye/rowa //potyába sejtet jelent.

Egy másik előnyösebb kiviteli alakban a gomba gazdasejt Fonalasgomba gazdasejtet jelent. A „Fonalasgomba” kifejezés az Eumycota és Oomycota szubdivizioba tartozó összes fonalasgombát magába foglalja (ahogy azt Hawksworth et al., meghatározták, 1995, supra), A fonalasgombák ágy jellemezhetők, hogy sejtfaluk kitinből, cellulózból, qlökánből, kitozá msnnánből és tex poliszachandból ált A vegetatív szaporodás hifa meghosszabbodást jelent, és a szén katabolizmus obligátan aerob. Ezzel szemben az élesztőgombák, például a Saccharornyces oerev/s/ao vegetatív szaporodása az unieeliuláris thallus sarjadzásával történik, szén kataboüzmusuk pedig fermentatlv lehet.

Egy még előnyösebb kiviteli alakban a fonalasgomba gazdasejtek az ezekre való korlátozás nélkül az alábbi fajok sejtjeit jelentik: Acremon/üm. Asperg/ffus.. Fusanum, Hum/co/a, Mueor, A4yoe//ophfore, Neurospora, Pen/Wum, Tő/e/av/a, To/ypoc/acfa? vagy Tdehoderma.

Egy még előnyösebb kiviteli alakban a fonalasgomba gazdasejt egy Asperg///us awamoh, Asperg/te foef/dae, Asperg///us /apoo/cos, Aspery?7/os n/du/ans, Asperg/te n/ger. vagy Aspergfc? oryzae sejtet jelent. Egy másik előnyös kiviteli alakban a fonalasgomba gazdasejt

Feseaum öaemdodes, Fusauum cerea/ls, Fusadom crookwe//ense,

Fusar/um cu/morum, Fusanom gram/neamm, Fusanom gnamfoum, Fosodon? beforospomm, Foswem negmá, Fusanum oxysporum, Főseden? rabcu/ab/m, Fassr/um roseum, Fuaar/un? sam&ac/nam, Fasar/am sarcochroam, Fasar/aro sporob?c/o/des, Fasar/am sa/pftaream, Faaar/am fora/osaa?, Fasaaam foóbkőecíb/des vagy Faaar/am venena/am sejtet jelent. Egy még előnyösebb kiviteli alakban a fonalasgomba gazdasejt Fasar/am venenafom (n/renöerg sp. nov.) sejtet jelent. Egy megint más, előnyös kiviteli alakban a fonalasgomba gazdasejt Ham/co/a foso/ens, Hazn/co/a /anugveosa, Maeor m/ebe/, fdyce/Zopbfora fhenmopö/'/a, Nearaspora arassa, Pee/c////a.m pa/pamgenam, Tb/e/av/s femesfosy Frocboeterma barz/'snam, Tdcbodorms kon/ng/i, rbcboctemra fcng/bracb/áfom, 77/cboderma reesef vagy rdcboderme v/bdae sejtet jelent.

A gomba sejtek transzformálhatok a protoplaszt képződést, a protopiasztok transzformálását és a sejtfal regenerációját magába foglaló, ismert (per se) eljárásokkal. Az Aspergk/us gazdasejfek transzformációjára megfelelő eljárásokat írtak le az EP 238023 szabadalomban és a Proceedings of the National Academy of Science, USA 81:1470-1474 cikkben (Volton et al., 1984). A Fácánon? fajok transzformálására szolgáló megfelelő eljárásokat Írtak le Maladier és munkatársai (1989, Gene 78:147-188) valamint a WÖ 98700787 szabadalomban. Az élesztőgombák transzformálhatok a Beakor and Guarente (In: Abelson, J.N. and Simon, M.l. eds, Gulde to Yeast Genetics and Molecular Biology, Methods in Enzymology, Vol. 194:182-187, Academic Press, Inc,, New York), lto és munkatársai (1983, Journal of Bacteriolocjy 153:183), és Hinnen és munkatársai (1978, Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 75:1929) által leírtak szerint.

Az előállítás eljárásai

A jelen találmány kapcsolatos a jelen találmány pol előállítására szolgáló eljárásokkal Is, amelynek során (a) egy olyan törzset tenyésztünk, ami vad formájában képes előállítani a poh'peptk és (b) a polipeptidet kinyerjük. Előnyösen, a Pseuebp/ectén/a nemzetsí törzsét, még előnyösebben a Aseudőp/ectén/a mgre/te-t használjuk,

A jelen találmány a jelen találmány poOpeptldjének előállítására szolgáló eljárásokkal is kapcsolatos, amelyek során (a) a gazdasejtet olyan körülmények között tenyésztjük, amely a polipeptid termeléséhez vezet, és (fo) a polipeptidet kinyerjük.

A jelen találmány előállítási eljárásaiban a sejteket olyan tenyésztápközegben szaporítjuk, amely megfelel a polipeptid előállításának, és ehhez ismert eljárásokat használunk. Például, a sejt tenyészthető rázó lombikos tenyésztéssel, kis léptékű vagy nagy léptékű fermentációval (ideértve a folyamatos, a bafch, fed-batch vagy szilárd fázisú fermentációkat}, laboratóriumi vagy ipari fermentorokban, megfelelő tenyésztápközegben, és olyan körülmények között, ami lehetővé teszi a polipeptid expresszálását és/vagy Izolálását. A tenyésztés olyan megfelelő tenyésztápközegben történik, ami szén, nitrogén forrásokat és szervetlen sókat tartalmaz, és ehhez a tudomány e területén ismert eljárásokat használunk. A megfelelő tenyésztápkőzegek beszerezhetők kereskedelmi forrásokból, vagy előállíthatok publikált (például az American Type Culture Colíection katalógusában publikált) összetételek szerint. Na a polipeptid a tenyésztápközegbe szekretáiődik, a polipeptid kinyerhető közvetlenül a tenyésztápközegből. Ha a polipeptid nem szekretáiődik, akkor kinyerhető a sejt llzáfumaiból,

A polipeptid detektálható a polípeptidekre specifikus, a tudomány e területén Ismert eljárásokkal. Ezen detektálási eljárások közé tartoznak a specifikus antitestek használata, egy enzim termék létrehozása, vagy egy ί ♦ X * V * φ φ ί φ φ φ φφφ φ φ φ

ΦΦ φ > > X * Φ Φ enzim szubsztrát eltűnése. Például, egy enzim vizsgálat használható az itt leírt polipeptid aktivitásának vizsgálatához.

A kapott polipeptid kinyerhető a tudomány e területén ismert eljárásokkal. Például, a polipeptid kinyerhető a fenyésztápközegből hagyományos eljárásokkal ideértve az ezekre való korlátozás nélkül a centrifugáíást, a szűrést, az extrahálást, a porlasztva szárítást, az evaporácíot és a kíesapatást

A jelen találmány polipeptídjeí különböző a tudomány e területén Ismert eljárásokkal tisztíthatok, ideértve az ezekre való korlátozás nélkül a kromatográfiát (például ioncserés, affinitás, hidrofób, kromatofókuszáió és méret exkíúziós kromatográfiát), az eíektroforetikus eljárásokat (például a preparatív izoelektromos fókuszálást), a differenciáló oldékonyságot (például az ammönium szulfátos kíesapatást), az SDS~ PAGE-t vagy az extrahálást (lásd például Protein Puríficafíon, d,~C, Janson and Lars Ryden, eds, VCH Publishers, New York, 1989).

Növények

A jelen találmány olyan transzgenikus növényekkel, növényi részekkel vagy növényi sejtekkel Is kapcsolatos, amelyeket a jelen találmány antimikrobiális aktivitásával rendelkező polipeptidet kódoló nukleotid szekvenciával transzformáltak, hogy expresszálja és kinyerhető mennyiségben termelje a polipeptidet. A polipeptid kinyerhető a növényből vagy a növényi részből Másik lehetőségként a rekombináns polipeptidet tartalmazó növény vagy növényi rész használható az élelmiszer vagy takarmány minőségének javítására, például a tápérték, az ízletesség, és a reológiai tulajdonságok javítására, vagy a tápértékét csökkentő tényezők megsemmisítésére. A kinyert polipeptid, növény vagy növényi rész felhasználható az állatok és gazdasági állatok emésztőfiórájának javítására vagy megváltoztatására.

*φφ

Φφ· ΦίΦ ΦΦ'#

A transzgenikus növény lehet kétszikű vagy egyszikű. Az egyszikű növényekre példák a füvek, például a réti perje (Poa), a takarmány füvek, mint a Fesíuca, a tollúm, a mérsékeltövi füvek, mint az Agrostis és a gabonák, például a búza, zab, rozs, árpa, rizs, cirok, és kukorica.

Kétszikű növényekre példák a dohány, a burgonya, a cukorrépa, a pillangósok, például a csülagrürí, a borsó, a bab, és a szójabab, a keresztesvirágúak növényei (örassicaceae család tagjai), például a karfiol, a repcemag, és a közeli rokon modell növény az Araó/dops/s föa/.fena.

A növényi részekre példák a szár, a kallusz, a levelek, a gyökér, a gyümölcsök, a magok és a gumók. Specifikus növényi szövetek, mint a klofoplasztisz, az apoplaszt, a mitokondrium, a vakuolum, a peroxiszömák, és a citoplazrna, szintén a növény részének számítanak. Ezenkívül, bármilyen növényi sejt, bármilyen szövetből származó sejt szintén a növény részének számit.

A jelen találmány körébe tartoznak az ilyen növények utódai, növényi részei és növényi sejtjei.

A jelen találmány polipepfidjét expresszié transzgenikus növény vagy növényi sejt megszerkeszthető a tudomány e területén ismert eljárások szerint. Röviden, a növényt vagy növényi sejtet úgy szerkesztjük meg, hogy ogy a jelen találmány polipepfidjét kódoló egy vagy több expressziós szerkezetet bejuttatunk a növény gazda genomiába, és a kapott módosított növényt vagy növényi sejtet transzgenikus növénnyé vagy növényi sejtté neveljük.

Nehézség nélkül az expressziós szerkezet egy olyan nukleinsav szerkezetet jelent, amely a jelen találmány polipeptldjét kódoló nukleotid szekvenciát kódol, amely működőképesen kapcsolódik a választott növényben vagy növényi részben való nukleotid szekvencia expressziójához szükséges megfelelő szabályozó szekvenciákkal. Ezenkívül, az expressziós szerkezet tartalmazhat egy olyan szelektálható

Λ * Φ Φ Φ φ * Φ . £ φΧΑ φ φ *ΦΦ * φ JÍ V * * * > φ AW ΦΦ »» *** markert, amely hasznos az olyan gazdasejt azonosításában, amibe az expressziós szerkezetet Integrálták, valamint olyan DNS szekvenciákat, amik a szerkezet kérdéses növénybe való bejuttatásához szükségesek (ez utóbbi a használt DNS bejuttatás! eljárástól függ),

A szabályozó szekvenciák, például a promoter, és a terminácíós szekvenciák, és adott esetben a jel vagy tranzit szekvenciák kiválasztását például az határozza meg, hogy mikor, hol, és hogyan óhajtjuk a polipeptidet expresszátnL Például, a jelen találmány polipepiidjét kódoló gén expressziója lehet konstitutív vagy Indukálható, vagy lehet fejlődés-, fázis- vagy szövetspecifikus, és a géntermék kötődhet egy specifikus szövethez, vagy növényi részhez, például magokhoz vagy levelekhez. A szabályozó szekvenciákat például Tagúé et al, Írták te (1988, Plánt Physíoiogy, 38:506).

A konstitutív expressziéhez a 35S~CaMV promoter használható (Franck et al, 1980, Coli, 21:285-294), A szerv-specifikus promóterek lehetnek olyan promóterek. amik tároló raktározó szövetekből, például magokból, burgonya gumóból és gyümölcsökből származnak (Edwards & Coruzzi, 1990, Ann, Rév, Génét,, 24:275-303) vagy metabolikus raktározó szövetekből, például merisztémából származnak (lto et ah, 1994, Plánt Moh Biok 24:883-878), lehetnek mag specifikus promóterek, például rizsből származó glutelin, proiamin, globulín vagy albumin promóterek (Wu et ak, 1998, Plánt and Coll Physíoiogy, 39:885-889) lehet egy VVo/a feóa promóter a tegumin 84-ből, és az ismeretlen mag protein gén a V'/c/e feba-ból (Conrad et ak, 1998, Journal of Plánt Physíoiogy 152:703-711), lehet egy mag olaj fest proteinből származó promoter (Chen et al,. 1993, Plánt and Cell Physíoiogy, 39:935-941) lehet a Sress/ce napus-ből származó tároló protein - napA - promóter, vagy lehet bármilyen, a tudomány e területén ismert mag specifikus promóter, például a WO 91/14772 szabadalomban leírt promóter. Ezenkívül, a promóter tehet egy tevéi specifikus promóter, például a rizsből vaay •V *

ΦΦ ·* Jfc

Φ Φ ^ψ Φ Φ ΦΦ Χ· paradicsomból származó rbcs promoter (Kyo2üka et al, 1993, Plánt Physíology 102:991-1000) a Moreija vírus adsnín metiMranszferáz gén promoter (Mítra and Hlgglns, 1994, Plánt Molecular Bíoíogy, 26:85-93), vagy a rizsből származó a/dP gén promoter (Kagaya et al,, 1995, Molecular and General Genetics, 248:668-674) vagy/ lehet egy seb indukálható promóter, például a burgonya pín2 promóter (Xu et at„ 1993, Plánt Molecular Blology, 22:573-588).

Egy promóter erősítő etem is használható az enzim növényben való magasabb szintű expressziójának eléréséhez. Például, a promóter erősítő elem lehet egy intron, amelyet a promóter és a jelen találmány polipeptldjét kódoló nukleotid szekvencia közé helyeztek. Például, Xu et al., 1993, supra, leírták a rizs aktín 1 gén első Intronjának az expresszié fokozásában való használatát.

A szelektálható marker gén és az expressziós szerkezet bármilyen egyéb része választható a tudomány e területén rendelkezésre álló szerkezetek közül,

A nukleinsav szerkezetek a növényi genomba a tudomány e területén ismert, hagyományos technikák szerint építhetők be, ideértve az Agrobactenum-által közvetített transzformációt, a vírus által közvetített transzformációt, a mikroinjektáiást, a részecske bombázást, a biolísztlkus transzformációt és az eiektroporációt (Gasser et al., 1990, Science 244:1293: Potrykus, 1990, Bío/Teohnology 8:535; Sbímamoto et al., 1969 Natúré 338:274).

Jelenleg az .Agroöaefertem-áítal közvetített gén transzfer a választott módszer a transzgenikus kétszikűek létrehozásához (lásd például Hooykas and Schilperoort, 1992, Plánt Molecular Blology, 19:1538), Azonban használható egyszikűek transzformálásához Is, bár ezen növények esetében egyéb transzformációs eljárások részesülnek előnyben. Jelenleg, a transzgenikus egyszikűek létrehozásához választott eljárás az embrionális kalluszok vagy fejlődő embriók részecske

A * *φ Φ Α * * φ 4»' **Φ Φ φ Χ<*

φ. * > * * * * ^\Φ« ΦΦΧ ΦΦ Φ»<» bombázása (a transzformáló DNS-sel burkolt mikroszkopikus arany vagy voifrám részecskék)(Christou, 1992, Plánt Journal 2:275-281; Shimamoto, 1994, Current Opínion Blotechnology 5:158-162; Vasil et al,, 1992, Bio/Technology 10:667-674). Az egyszikűek transzformálásának másik eljárása a protoplaszfos transzformációra alapul, amit Omiruileh és munkatársai írtak le (1993, Plánt Molecular Biology, 21:415-428).

A transzformációt követően, az expressziós szerkezetet magába foglaló transzformánsok szelektálhatok, és teljes növénnyé regenerállathatók a tudomány e területén jól ismert eljárásokkal.

A jelen találmány a jelen találmány polipeptidjének előállítására szolgáló eljárásokkal is kapcsolatos, amelynek során (a) a jelen találmány antiroikrobíális aktivitásával rendelkező polipeptidet kódoló nukleotid szekvenciát tartalmazó transzgeníkus növényt, vagy növényi sejtet olyan körülmények között termesztjük, ami a polipeptid termeléséhez vezet; és (b) a polipeptidet kinyerjük.

transzferáz, dezexlrihonukleáz, qalaktozldáz, olükoamlláz.

Készítmények

Egy további aspektusban a jelen találmány készítményekkel, például a jelen találmány antimíkrobsális polipeptidjét tartalmazó gyógyszerészeti készítményekkel kapcsolatos.

A készítmény tartalmazhatja a jelen találmány egy polipeptidjét a fő polipeptid komponensként például lehet egy mono-komponensü készítmény. Másik tehetőségként, a készítmény tartalmazhat többszörös enzim aktivitásokat, például aminopepfldáz, amiláz, karhohidráz, karboxipeptídáz, kataláz, cellulóz, kiiínáz, kutináz, ciklodextrin, gHkozilsszteráz, aifa-galakiozidáz, bétaalfa-gllkozldáz, beta-glükozidáz, haloperoxidáz, invertaz, lakkáz, lípáz, mannozidáz, oxídáz, pektinolhlkus enzim, peptídogiutamináz, peroxidáz, fitáz, polifenoloxldáz, proteolitikus enzim, ribonukleáz, transzgiutamináz vagy xilanáz aktivitást.

♦ ·> ¢.

* ·*« *> $ v X *<·

A készítmény a továbbiakban egyéb gyógyszerészetileg aktív anyagot is tartalmazhat, például további biocld anyagot, például egy a fentiekben meghatározott antimikrobiális aktivitást mutató másik antimikrobiális poiípeptidet. A biocld anyag lehet aníibiotíkus, ahogy az a tudomány e területén ismert. Az antibiotikumok osztályába tartoznak például a penicillin G, a penicillin V, a methiclllin, az oxadilín, a oarbenicílíin, a nafciliin, az ampiciiiin, stb., penicillinek a beta-iaktamáz inhibitorokkal együtt, a cephaiosporín, például a cefaclor, a oefazolín, a cefuroxime, a moxalactam, stb.; a carbapenemek, a monobactamok, az amínoglíkozidok, a tetracíklínek, a makroiidek, a lincomycinek, a polimixinek, a szulfonamidok, a quinolonok, a chlorampbenícoi, a metronídazol, a spectinomycín, a trimefhoprím, a vancornycln, stb. Á bíocid anyag lehet egy anti-míkotikus anyag is, ideértve a polleneket, például az. amphotericin B, nystatín, az 5~fíucosyn és az azolok, például a miconazol, ketoconazol, itraconazol és a flueonazol.

Egy kiviteli alakban a bíocid anyag egy nem enzimatikus kémiai anyagot jelent. Egy másik kiviteli alakban a biocld anyag nem-poiipeptid kémiai anyagot jelent.

A biocld anyag képes lehet az Eseriorich/a co// (DSM 1576) élő sejt számának 1/100 részére csökkentésére 30 percig tartó 20^QC hőmérsékleten végzett ínkubálás után, a biocld anyag 26 (tömeg/tömeg)%-os vizes oldatában; előnyösen 10%-os vizes oldatában, még előnyösebben 5%-os vizes oldatában, még előnyösebben 1%-os vizes oldatában, még előnyösebben 0,5%-os vizes oldatában és különösen előnyösen 0,1%-os vizes oldatában.

A biocld anyag képes lehet arra Is, hogy gátolja az Escheric/w co// (DSM 1578) szaporodását 24 órán keresztül 25°C hőmérsékleten mikrobíáiís szaporító tenyésztápközegben, ha 1000 ppm koncentrációban alkalmazzuk, előnyösen 500 ppm koncentrációban, még előnyösebben ha 250 ppm koncentrációban adjuk hozzá és még előnyösebben, ha 100 ppm koncentrációban adjuk hozzá, és legelőnyösebben, ha 50 ppm koncentrációban adjuk, különösen ha 25 ppm koncentrációban adjuk

ΠΩ7

ΟΖ.Ζ,α

A biocid anyag képes lehet arra, hegy 1/100 részére csökkentse a fíac/te subáfe (ATCC 6633) élő sejtszámát 30 pere inkubálás után, 2ö^cC hőmérsékleten, a biocid anyag 25 (tömeg/tőmeg)%-os vizes oldatában, előnyösen 10%-os vizes oldatában, még előnyösebben 5%-os vizes oldatában, még előnyösebben 1%-os vizes oldatéban, még előnyösebben 0,5%-os vizes oldatában, és különösen előnyösen 0,1 %-os vizes oldatában,

A biocid anyag képes lehet arra is, hogy gátolja a fíac///os saMfo (ATCC 6033) szaporodását 24 órán keresztül 25°C hőmérsékleten mikrobíális szaporító tenyésztápközegben, ha 1ÖÖÖ ppm koncentrációban alkalmazzuk, előnyösen 5ÖÖ ppm koncentrációban, még előnyösebben, ha 250 ppm koncentrációban adjuk hozzá és még előnyösebben, ha ppm koncentrációban adjuk hozzá, és legelőnyösebben, ha 50 koncentrációban adjuk, különösen ha 25 ppm koncentrációban adjuk hozzá.

A jelen találmány antimikrobíális pollpeptídje és a készítmény biocid anyaga kiválasztható úgy, hogy szinergista antimíkrobiálís hatást érjünk el.

Az antimíkrobiálís polipeptid és a készítmény biocid anyaga megválasztható úgy Is, hogy az Escóebch/a co// (DSM 1578) élő sejtszáma legalább 5%-kal (előnyösen legalább 10%-kal) jobban csökkenjen, ha a baktériumot 10 percig inkubáljuk 20^öC hőmérsékleten a biocid anyag 50 (tőmeg/íömeg)%~os vizes oldatában (előnyösen 25%-os, még előnyösebben 10%-os, még előnyösebben 5%-os vizes oldatában) és 0,5 ppm (előnyösen 0,1 ppm) antimíkrobiálís polipeptid koncentrációjával, mintha a biocid anyaggal és az antimíkrobiálís £«·· Λ.« φ ν <

pollpeptlddel külön-külön történő inkubálás eredményeit összeadjuk és az eredményt ehhez, hasonlítjuk, azaz egyszerű additív hatás esetén.

Az enzimatikus komponens és a készítmény biocid anyaga megválasztható úgy Is, hogy az Eschedcő/e co// (DSM 1576) szaporodása 25°C hőmérsékleten, 500 ppm (előnyösen 250 ppm, még előnyösebben 100 ppm, még előnyösebben 50 ppm) biocid anyagot és 0,5 ppm (előnyösen 0,1 ppm) antimikrobiális polipeptidet tartalmazó mikrobiális szaporító szubsztráton legalább 5%-kal (előnyösen legalább 10%-kal) gátlódjon hosszabb ideig, mint amikor a biocid anyaggal és az antimikrobiális pollpeptlddel külön-külön végzett inkubációvá eredményeket összeadjuk, azaz egyszerű additív hatás esetén.

Az antimikrobiális polipeptid és a készítmény biocid megválasztható úgy is, hogy a Sac///us suőf///s (ATCC 86 élő sejtszáma legalább 5%~kai (előnyösen legalább 10%-kal) jobban csökkenjen, ha a baktériumot 10 percig ínkubáljuk 20°C hőmérsékleten a biocid anyag 50 (tömeg/tömeg)%~os vizes oldatában (előnyösen 25%-os, még előnyösebben 10%-os, még előnyösebben 5%-os vizes oldatában) és 0,5 ppm (előnyösen 0,1 ppm) antimikrobiális polipeptid koncentrációjával, mintha a biocid anyaggal és az. antimikrobiális pollpeptlddel külön-külön történő inkubálás eredményeit összeadjuk és az eredményt ehhez hasonlítjuk, azaz egyszerű additív hatás esetén.

Az enzimatikus komponens és a készítmény biocid anyaga megválasztható úgy is, hogy a Sao///us suMfe (ATCC 8833) szaporodása 25^<SC hőmérsékleten, 5ÖÖ ppm (előnyösen 250 ppm, még előnyösebben 1ÖÖ ppm, még előnyösebben 50 ppm) biocid anyagot és 0,5 ppm (előnyösen 0,1 ppm) antimikrobiális polipeptidet tartalmazó mikrobiális szaporító szubsztráton legalább 5%-kal (előnyösen legalább 10%~kal) gátlódjon hosszabb Ideig, mint amikor a biocid anyaggal és az antimikrobiális pollpeptlddel külön-külön végzett inkubációval kapott eredményeket összeadjuk, azaz egyszerű additív hatás esetén.

A készítmény tartalmazhat megfelelő hordozó anyagot is. A készítmények tartalmazhatnak megfelelő bejuttató eszközt Is, amely képes a jelen találmány antimikrobiális polipeptidjét bejuttatni a kívánt lőkuszba, ha a készítményt gyógyszerként használjuk.

A készítmény előállítható a tudomány e területén ismert eljárásokkal és lehet folyadék vagy száraz készítmény formájában. Például a polipeptid készítmény lehet granulátum vagy mikrogranulátum formájában. A készítménybe szánt polipeptid stabilizálható a tudomány e területén ismert eljárások szerint.

A jelen találmány polipeptid készítményei előnyös alkalmazásainak példáit az alábbiakban adjuk meg. A jelen találmány polipeptid készítményének dózisa és az egyéb körülmények, amelyek között a készítményt használjuk, a tudomány e területén Ismert eljárások alapján határozhatók meg.

Eljárások és alkalmazások

A jelen találmány magába foglalja az antimikrobiális polipepfidek különböző alkalmazásait Is. Az antimikrobiális poíípeptiöek tipikusan bármely olyan helyen alkalmazhatók, amelyek baktériumos, gombás, élesztős vagy algás szennyeződésnek vannak kitéve. Tipikusan ezek a helyek vizes rendszerek, például hütövizes rendszerek, mosodai öblítővíz, olaj rendszerek, például hulladék olaj, lubríkáló anyagok, olajmezek és más hasonlók, ahol szükség van a mikroorganizmusok elpusztítására vagy ahol szaporodásukat gátolni kell. Azonban a jelen találmány felhasználható minden olyan alkalmazásban is,, ahol az ismert antimikrobiális készítmények hasznosak, például fa, latex, ragasztóanyag, enyv, papír, kartonpapír, textil, bőr, műanyagok, tömítések és takarmány védelmében.

Az egyéb alkalmazások közé tartoznak az élelmiszer, ital, kozmetikai szerek, például fejek, krémek, gélek, kenőcsők, szappanok, samponok, kondicionálók, izzadásgátiók, dezodorok, szájőblögető szerek, kontaktlencse termékek, enzim készítmények vagy élelmiszer alkotórészek tartósítása.

igy, a jelen találmány antimikrobiális polipeptídjeí felhasználhatók fertőtlenítőszerként, például acne, szem vagy száj-fertőzések, bőrfertőzések kezelésében, izzadásgátlókban vagy dezodorokban, láb áztató sókban, kontaktlencsék tisztításához és fertőtlenítéséhez, kemény felületek, fogak (orális gondozás), sebek, horzsolások és más hasonlók kezelésében.

Általánosságban, azt tartjuk, hogy a jelen találmány antimikrobiális polipeptídjeí hasznosak tisztításhoz és fertőtlenítéshez, vagy a mlkrobiális szaporodás gátlásához bármilyen kemény felületen. A jelen találmány antimikrobiális poHpeptidjével előnyösen érintkezésbe hozható felületekre példák a feldolgozó gépek felületei, például a tejgazdasági, kémiai vagy gyógyszeripari feldolgozó üzemek, a víz higiéniai rendszerek, az olajfeldolgozó üzemek, a paplrpép feldolgozó üzemek, a vízkezelő telepek, és a hűtőtornyok berendezéseinek felületei. A jelen találmány antimikrobiális polipeptídjeí olyan mennyiségben használandók, ami hatékonyan tisztítja, fertőtleníti a kérdéses felületet vagy gátolja a mikrobiálís szaporodást az ilyen felületeken.

Ezenkívül, úgy véljük, a jelen találmány antimikrobiális polipeptídjeí előnyösen alkalmazhatók a helyben! tisztítási (C.I.P.) rendszerben, a bármilyen típusú feldolgozó gép tisztításához.

A jelen találmány antimikrobiális polipeptidjei ezenkívül felhasználhatók élelmlszerfeldoigozó üzemek felületeinek és főzőedényeinek tisztítására, és bármilyen olyan területen, ahol élelmiszert készítenek vagy szolgálnak fel, például kórházakban, szanatóriumokban, éttermekben, különösen gyorséttermekben, csemegeüzletekben és más hasonló helyeken. Felhasználhatók élelmiszeripari termékekben antimikrobiális anyagokként Is, és különösen hasznosak felületi antirnikrobiáiis anyagokként sajtoknál, gyümölcsöknél, zöldségeknél és salátabárok élelmiszereinél

Felhasználhatók konzerváióanyagkénf vagy fertőtlenítőszerként vizes alapú festékekben.

A jelen találmány antirnikrobiáiis poiípeptidjei hasznosak vízvezetékek mikrobíális szaporodásának gátlására, víz fertőtlenítésre, különösen ipari víz fertőtlenítésére,

A jelen találmány kapcsolatos a jelen találmány antirnikrobiáiis polipeptidjének vagy készítményének gyógyszerként való alkalmazásával is. Ezenkívül, a jelen találmány antirnikrobiáiis polipeptídje vagy készítménye felhasználható olyan gyógyszer előállítására is, amely mikroorganizmusok, például gombák, vagy baktériumok, előnyösen gram pozitív baktériumok elleni védekezésre használható.

A jelen találmány antirnikrobiáiis polipeptídje vagy készítménye felhasználható antirnikrobiáiis állatorvosi vagy humán terápiás vagy profilaktikus anyagként is. így a jelen találmány antirnikrobiáiis polipeptídje vagy készítménye felhasználható mikrobíális, például bakteriális vagy gombás, előnyösen gram pozitív bakteriális fertőzések kezelésére szolgáló állatorvosi vagy humán terápiás vagy profilaktikus anyagok előállítására. Nevezetesen a mikrobíális fertőzés összefüggésben lehet a tüdő betegségeivel, ideértve az ezekre való korlátozás nélkül a tuberculőzíst, a olsztás fi'brőzist, a szexuális úton terjedő betegségeket, ideértve az ezekre való korlátozás nélkül a gonorrheát és a ohlamydiét,

A jelen találmány készítménye a jelen találmány antirnikrobiáiis polipeptidjének hatékony mennyiségét tartalmazza,

A „hatékony mennyiség” kifejezés a jelen találmány szerinti használatban a 2. számú szekvencia 1~40 amínosavalként bemutatott aminosav szekvenciát, vagy ennek egy fragmentjét vagy variánsát tartalmazó antimíkrobíális polipeptid olyan mennyiségét jelenti, ami hatékonyan gátolja a kérdéses mikroorganizmus szaporodását.

A jelen találmány kapcsolatos sebgyógyító készítményekkel vagy termékekkel, például kötszerekkel, orvosi eszközökkel például katéterekkel, valamint korpásodás elleni haj termékekkel, például samponokkal.

In vitro szintézis

A jelen találmány antímikrobíáíis polípeptídjei előállíthatok in vitro szintézissel, a tudomány e területén ismert hagyományos eljárásokat használva, Különböző kereskedelmi szintetikus készülékek kaphatók, például automatizált szintetizátorok, melyeket az Applied Biosystems, Inc, a Beckman cég, stb. gyártanak. Szintetizátorokat használva, a természetesen előforduló aminosavak nem természetes aminosavakkal.

főként D-izomerekkel (vagy D-formákkal), például D-alanín és DIzoieucin, diasztereoizomerekkel, különböző hosszúságú és funkcióscsoportokkal rendelkező oldalláncúkkal rendelkező aminosavakkal, és más hasonló aminosavakkal helyettesíthetők. Az adott szekvenciát és az előállítás módját a megvalósíthatóság, a gazdasági szempontok, a kívánt tisztaság és más hasonló tényezők határozzák meg.

Kémiai kötés biztosítható a kötéshez való megfelelő funkcíőscsoportokat tartalmazó különböző peptidekhez vagy proteinekhez, például amínocsoportok az amid vagy helyettesített amin előállításhoz, például reduktív amlnáláshoz, tíolcsoportok a tioéter vagy diszulfid létrehozáshoz, karboxilcsoportok az amid létrehozáshoz., és más hasonlók.

Szükség esetén, különböző csoportok juttathatók be a pepiidbe a szintézis során, vagy az expresszió alatt, ami lehetővé feszi az egyéb molekulákhoz vagy egy felülethez való kötődést. Így císzteinek használhatók tioéterek létrehozásához, hiszíidinek egy fémion komplexhez való kötéséhez, karboxilcsoportok az araidok vagy észterek létrehozásához, amlnocsoportok araidok létrehozásához, és más hasonlók.

A polipeptidek izolálhatok és tíszílthafók a rekombináns szintézis megfelelő módszerei szerint is. Az expressziós gazda lizátuma is előállítható, és a lizátum tisztítható HPLC-vel, exklúziós kromatográfia val, géielektroforézisseí, affinitás kromatográfiával vagy egyéb tisztítási technikával. A legtöbbször, a használt készítmények legalább 20 tömeg%-ban tartalmazzák a kívánt terméket, még gyakrabban legalább 75%-ban, előnyösen legalább 85%-ban, és terápiás célokból általában legalább körülbelül 99,5%-ban, az előállítási és tisztítás? eljárással kapcsolatos szennyeződésekhez képest. Általában a százalék a teljes protein mennyiségen alapul.

Állati takarmány

A jelen találmány az antimikrobiális aktivitással rendelkező polipeptidek állati takarmányban való használatával is kapcsolatos, valamint a jelen találmány antimikrobiális polipeplidjeit tartalmazó takarmány készítményekkel és takarmány adalékokkal.

Az állat kifejezés minden állatot magába foglal, beleértve az embereket is. Az állatokra példák, a nem kérődző és a kérődző állatok, például a szarvasmarha, a birka, és a lő. Egy különös kiviteli alakban az állat nem kérődző állatot jelent. A nem kérődző állatok egy-gyomrú állatot jelentenek, például malacokat és sertéseket (ideértve az ezekre való korlátozás nélkül a kismalacokat, a süldő malacokat és a kocákat), a szárnyasokat, például a pulykát és a csirkét (ideértve az ezekre való korlátozás nélkül a bróker csirkét és a tojótyúkokat), a fiatal borjakat és a halat (ideértve, de nem egyedül erre korlátozódva, a lazacot).

ΦΦ χ*'

A takarmány, vagy takarmány készítmény kifejezés bármilyen vegyületet, készítményt, keveréket magába foglal, ami alkalmas az cihátok etetésére, vagy amit erre szántak.

A jelen találmány használatában az antlmikrobiális polipeptid feletethető az állattal az etetés előtt, után vagy azzal egyidőben, Ez utóbbit részesítjük előnyben.

Egy különös kiviteli alakban az antlmikrobiális polipeptid, abban a formában, amiben a takarmányhoz adjuk, vagy amiben a takarmány adalékban felhasználjuk, jól definiált, A jól definiált kifejezés azt jelenti, hogy az anfimikrobiáiis polipeptid készítmény legalább 50%-os tisztaságú, amint azt méret exklüziós kromatográfiával meghatároztuk (lásd

WO 01/68275 szabadalom

12. példáját). Egy másik különös kiviteli alakban az antlmikrobiális polipeptid készítmény legalább 60, 70, 80, 85, 88, 90, 92, 94 vagy legalább 95%-ban tiszta, ahogy azt a jelen módszerrel meghatároztuk.

Egy jól definiált antlmikrobiális polipeptid készítmény előnyös. Például, sokkal könnyebb a takarmányhoz helyesen dozírozní az antlmikrobiális polipeptidet, ha az lényegében ínterferáió vagy szennyező egyéb antlmikrobiális polipeptidekfől mentes. A dózis kifejezés helyesen utal, különösen a konzisztens és állandó eredmények kinyerésének céljára, és a kívánt hatásokra alapuló dózis optimalizálás képességére.

Az állati takarmányban való alkalmazáshoz az. antlmikrobiális polipeptid nem kell olyan tiszta legyen, tartalmazhat például egyéb enzimeket, ez esetben antlmikrobiális polipeptid készítménynek nevezhető.

Az antlmikrobiális polipeptid készítmény (a) közvetlenül a takarmányhoz adható (vagy zöldség proteinek kezelési eljárásában közvetlenül alkalmazható), vagy (b) használható egy vagy több köztes készítmény előállításában, például adalékok vagy premixek előállításában, amelyeket ezt követően adunk a takarmányhoz (vagy használunk a kezelési eljárásban). A fent említett tisztaság mértéke az eredeti antlmikrobiális polipeptid készítmény tisztaságára utal, akár a fenti (a) vagy (b) szerint használjuk.

Az ilyen mértékű tisztasággal jellemzett antlmikrobiális polipeptid készítmények kinyerhetők rekombináns termelési eljárásokkal, holott nem nyerhetők ki olyan könnyen, és adagonként sokkal nagyobb eltérések jellemzőek rájuk, ha az antimikrobiáiis polipeptidet hagyományos fermentációs eljárásokkal állítjuk elő.

Az ilyen antlmikrobiális polipeptid készítmények természetesen összekeverhetők egyéb enzimekkel.

A zöldség protein kifejezés a találmány szerinti használatban bármilyen vegyöletre, készítményre vagy keverékre utal, ami legalább egy olyan proteint magába foglal, ami zöldségből származik, ideértve a módosított proteineket és a protein származékokat. Speciális kiviteli alakokban a zöldség proteinek protein tartalma legalább 10, 20, 30, 40, 50 vagy 60 tömeg/tomeg%,

A zöldség proteinek származhatnak zöldség protein forrásból, például pillangósokból és gabonákból, például a Fabaceae (Logum/nosae), Cruc/feraceae, Chenopod/'aceae és Poaceae családba tartozó növények anyagaiból, például lehet szójabab liszt, csillagfürt liszt és repcemag liszt.

Egy speciális kiviteli alakban a zöldség protein forrás a Faóecaae családba tartozó egy vagy több növényt jelenti, például szóját, csillag-fürtöt borsót vagy babot.

Egy másik speciális kiviteti alakban a zöldség protein forrás a Crienopocf/aceae családba tartozó egy vagy több növény anyagát jelenti, például répát, curkorrépát, spenótot vagy kvinoát

Az egyéb zöldség protein forrásokra példák a repcemag és a káposzta.

A szójabab előnyös zöldség protein forrás,

X >'

A zöldség protein forrásra további példák a gabonák, például az árpa, a búza, a rozs, a zab, a kukorica, a rizs és a cirok.

Az antimikrobiális polipeptid bármilyen formában hozzáadható a takarmányhoz, legyen az egy viszonylag tiszta antimikrobiális polipeptid, vagy az állati takarmányhoz hozzáadandó egyéb alkotórészek keveréke, azaz tehet állati takarmány adalék formájában, például az állati takarmányhoz való úgynevezett premixek formájában.

Egy további aspektusban a jelen találmány az állati takarmányokban használandó készítményekkel is kapcsolatos, például állati takarmánnyal, állati takarmány adalékokkal, például premixekkek

A jelen találmány antimikrobiális poiipeptldjétöl eltekintve a jelen találmány állati takarmány adalékai legalább egy zsírban oldódó vitamint és/vagy legalább egy vízoldható vitamint és/vagy legalább egy nyomelemet és/vagy legalább egy makroelemet tartalmaznak.

Ezenkívül, adott esetben, takarmány adalék alkotórészek a színezőanyagok,, az aroma vegyületek, a stabllizátorok, és/vagy legalább egy enzim, ami lehet EC 3,1.3.8 vagy 3,1.3.28 fitáz; EC 3,2.1.8 xllanáz, EC 3,2.1.39 galaktanáz; és/vagy EC 3,2.1,4. béta-glükanáz.

Egy különös kiviteli alakban ezek az. egyéb enzimek jól definiáltak (mint azt fent definiáltuk az antimikrobiális polipeptid készítmények esetében).

Az egyéb antimikrobiális peptídekre (AMP-kre) példák a CAP18, a Leucocln A, a Trifrptícin, Profágén-1, Thenatín, Defensin, Ovispirin, például a Novispirln (Róbert Lehrer, 2000) és ezek antimikrobiális aktivitást megtartó variánsai vagy fragmentjeí.

Az egyéb gombaellenes polipeptidekre (AFP-kre) példák az ,4sperg//tes g/ganfeus és az Aspergd/es o/ger peptidek, valamint ezek gombaeitenes aktivitást megtartó variánsai és fragmentjeí, ahogy a WO 94/01459 és PCT/DK02/0Ö289 (ha közzéteszik a WO számmal helyettesítendő) szabadalmakban leírásra kérőitek.

Általában a zsír·· és vízoldható vitaminok, valamint a nyomelemek a takarmány adaléknak szánt, úgynevezett premixek részét alkotják, míg a makroelemeket általában külön adják a takarmányhoz. Ezen készítmények bármelyik típusáról is legyen sző, ha a jelen találmány szerinti antimikrobiális polipeptiddef dúsítjuk, az a jelen találmány szerinti állati takarmány adalékot jelent.

Egy különös kiviteli alakban a jelen találmány állati takarmány adalékát úgy tervezzük (vagy úgy írjuk ele), hogy az állati étrendnek vagy takarmánynak 0,01 -· 10,0%~a, még specifikusáéban 0,06-5,0%-a, vagy 0,2-1,0%-a legyen (a % gramm adalékot jelent 100 g takarmányra nézve). Ez különösen a premixek esetében igaz.

A következők az ilyen alkotórészek nem kizáró jellegű példáit jelentik:

A zsíroldható vitaminokra példák az A vitamin, a D3 vitamin, az E vitamin és a K vitamin, például a K3 vitamin.

A vízoldható vitaminokra példák a ΒΊ2 vitamin, a bíotln és a kőim, a B1 vitamin, a B2 vitamin, a B6 vitamin, a níaoin, a főisav és a paniotenát, például a Ca~D~paniofenát

A nyomelemekre példák a mangán, a cink, a vas, a réz, a jód, a szelén és a kobalt.

A makro ásványi anyagokra példák a kalcium, a foszfor és a nátrium.

Ezen alkotórészek táplálkozási szükséglete (szárnyasok és malacok esetében bemutatott példákkal) a WO 01/58275 szabadalom A táblázatában található. A táplálkozási szükséglet azt jelenti, hogy ezeket az alkotórészeket a jelölt koncentrációkban kell biztosítani az étrendben.

Másik lehetőségként, a jelen találmány állati takarmány adaléka a

W'O 01/58275 szabadalom A táblázatában felsorolt egyes alkotórészekből legalább egyet tartalmaz. A legalább egy kifejezés egy vagy több, egy, vagy kettő, vagy három, vagy négy, stb,, akár mind a tizenhárom, vagy akár mind a tizenöt egyedi alkotórészt jelent. Még specifíkusabban, ez a legalább egy egyedi alkotórész olyan mennyiségben szerepel a jelen találmány adalékában, hogy az A táblázat

4-es, vagy 5-ös vagy 6-os oszlopában jelölt határértékek közé tartozó takarmányon belük koncentrációt biztosítson.

A jelen találmány állati takarmány készítményekkel Is kapcsolatos. Az állati takarmány készítmények vagy étrend viszonylag magas protein tartalmú. A szárnyas és malactápok a WO 01/68275 szabadalom B táblázatának 2-3-as oszlopában jelöltek szerint jellemezhetők. A haltápok ugyanezen B táblázat 4-es oszlopában jelöltek szerint jellemezhetők. Ezenkívül, az ilyen haltápok általában 200-310 g/kg nyers zsírt tartalmaznak.

A jelen találmány állati takarmány készítményeinek nyers protein tartalma 50-800 g/kg, ezenkívül tartalmaz még legalább egy antimikrobíális polipeptidet, amint azt leírtuk.

Ezenkívül, vagy másik lehetőségként (a fenti nyers protein tartalmon fúl) a jelen találmány állati takarmány készítményeinek metaholizálhatő energia tartalma 1G-3Ö MJ/kg; és/vagy kalcium tartalma 0,1-200 g/kg; és/vagy hasznosítható foszfor tartalma 0,1-200 g/kg; és/vagy metionin tartalma 0,1-100 g/kg; és/vagy metionln^ciszteín tartalma 0,1-150 g/kg; és/vagy lizin tartalma 0,5-50 g/kg.

Speciális kiviteli alakokban a metabollzálhafő energia, a nyers fehérje, a kalcium, a foszfor, a metionin, a matíonin+ciszteín és/vagy lizin tartalom a WO 01/56275 szabadalom 8 táblázatának 2, 3,4 vagy 5 (R. 25) határértékeinek bármelyikébe esik.

A nyers fehérjét nitrogénként (N) számítjuk ki S,25-ös szorzófaktorral, azaz Nyers fehérje (g/kg)“N(g/kg) x 8,25, A nitrogén tartalmat Kjeldahl módszerrel határozzuk meg (A.O.A.C. 1984, Officíal Methods of Analysis 14. kiadás, Association of Öffícial Analyfal Chemists, Washington DC).

< * φ * ιΛ>« φ ♦».·»

A meiaboiizáiható energia az NRC publikáció /Tápanyag szükséglet sertésekben része alapján számítható ki, (9. átdolgozott kiadás, 1988, Sertés Takarmányozási Albizottság, Állati Takarmányozási Bizottság, Mezőgazdasági Tanács, Nemzeti Kutatási Tanács, National Academy Press, Washington, D.C., pp2-8, és a Európán Tabló of Energy Vaiues fór Poulfry Feed-stuffs, Spelderholf centre fór poultry research and extension, 7361 DA, Beekhergeb, The Nethertsnds, Grahsch Bedrijf Ponsen & looijen bv Wageningen, ISBN 90-71463-12-5).

Az étrend kalcium, hasznosítható foszfor és aminosav tartalmát a teljes állati takarmányban takarmány táblázatok alapján számoljuk ki (Veevoedertabel 1997, gegevens over chemiscbe samenstallíng, verfeerbaarheid en voederwaarde van voedermiddelen, Central

Veevoederbureau, Rundeweg 5, 8219 pk Lelystad, ISBN 90-72339-13-7), Egy specifikus kiviteli alakban a jelen találmány állati takarmány készítménye legalább egy zöldség proteint vagy protein forrást tartalmaz, ahogy korábban meghatároztuk.

Egy megint más, specifikus kiviteli alakban a jelen találmány állati takarmány készítménye 0-80-% kukoricát, és/vagy 0-30% cirkot, és/vagy 0-70% búzát, és/vagy 0-70% árpát, és/vagy 0-30% zabot, és/vagy 0-4084 szója lisztet, és/vagy 0-10% hallisztet, és/vagyO-20% tejsavót tartalmaz. Az állati takarmányok például előállíthatok őrölt takarmányként (nem pelletízált) vagy pelletizált takarmányként. Tipikusan az őrölt takarmányt összekeverjük és megfelelő mennyiségű esszenciális vitamint és ásványi anyagot adunk hozzá a kérdéses fajra vonatkozó specifikációnak megfelelően. Az enzimek szilárd vagy folyékony enzim készítmények formájában adhatók hozzá. Például, egy szilárd enzim készítményt tipikusan a keverési lépés előtt vagy alatt adunk hozzá, És a folyékony enzim készítményt tipikusan a peílefizáló lépés után adjuk hozzá. Az enzim beépíthető a takarmány adalékba vagy a premixbe is.

φ φ *

χ·»Φ Λ

ΦΦ

Φ Λ Φ φ X Φ· Φ * φΛΦ * φΦ νΦφ Φ ί *

Φ<Φ*

A takarmányban a végső enzim koncentráció 0,01-200 mg enzim proteint jelent takarmány kg-onként, például 5-30 mg enzim proteint állati takarmány kg-onként.

Az antimikrobíális polípeptid az alábbi mennyiségekben adható (ezek közül egy vagy több)(dózis határok): 0,01-200, vagy 0,01-100, vagy 0,05-100, vagy 0,05-50, vagy 0,10-10 - az összes határérték mg antimikrobíális polípeptid proteint jelent takarmány kg-onként (ppm).

A takarmány kg-onkéntí antimikrobíális polípeptid protein mg mennyiségek meghatározásához az antimikrobíális polipeptídet kitisztítjuk a takarmány készítményből, és a tisztított antimikrobíális polípeptid specifikus aktivitását releváns vizsgálati módszereket használva határozzuk meg (lásd az „Antimikrobíális aktivitás, szubsztrátok és vizsgálatok részeket). A takarmány készítmény antímikrobiáíis aktivitása meghatározható ugyanazon vizsgálatot használva, és ezen két meghatározás alapján, a dózis kiszámítható mg antimikrobíális polípeptid proteinként kg takarmányra vonatkoztatva.

Ugyanazok az elvek vonatkoznak a mg antimikrobíális polípeptid protein takarmány adalékokban való meghatározására. Természetesen, ha a takarmányhoz vagy az adalékhoz használt antimikrobíális polípeptid mintája rendelkezésre áll, a specifikus aktivitás meghatározható ebből a mintából (nincs szükség arra, hogy az antimikrobíális poíipeptidet kitisztítsuk a takarmány készítményből vagy az adalékból).

Detergens készítmény

A jelen találmány antimikrobíális pollpeptidjei hozzáadhatok, és így egy detergens készítmény komponenseivé válhatnak.

A jelen találmány detergens készítménye például formulázható kézi, mosodai detergens készítményként, Ideértve a mosodai adalék készítményeket, melyek alkalmasak a festett szövetek előkezelésére, a hozzáadott textil lágyító készítmények kiöblítésére, vagy formulázhatók az általános háztartási kemény felszíni tisztításban használható detergens készítményként. Vagy formulázhatő kézi vagy gépi mosogatószerként.

Egy specifikus aspektusban a jelen találmány olyan detergens adalékot biztosít, amely tartalmazza a jelen találmány antimikrobiális poiípeptidjeít valamint egy felületaktív anyagot. A detergens adaték, valamint a detergens készítmény tartalmazhat egy vagy több enzimet, például proteázt lípázt, kutínázt, amíiázt, karbobidrázf, cellulózt, pektinázt, mannánázt, arabinázf, galaklanázt, xllanázt vagy oxidázt (például lakkázt) és/vagy egy peroxídázt (például haloperoxidázt).

Általánosságban, a választott enzím(ek) tulajdonságai kompatibilisek kell legyenek a kiválasztott detergenssel (azaz pHoptimum, kompatibilitás egyéb enzimatikus és nem enzimatikus alkotórészekkel stb.), és az enzim(ek) hatékony mennyiségben keli jelen

Proteázok: a megfelelő profeázok közé tartoznak az állati, zöldség vagy mikrobiálís eredetű profeázok. A mikrobiálís eredefűekef részesítjük előnyben. Ide tartoznak a kémiailag módosított vagy protein sebészetlleg módosított mutánsok. A profeázok lehetnek szerin profeázok, vagy fémprofeázok (metallo-proteázok), előnyösen alkalikus míkrobíális profeázok, vagy egy trípszín-szerö proteáz, Az alkalikus proteázokra példák a subtílísínek, különösen a Bac///us~bóí származók, például subtilisin Növő, subtílísín Cadsberg, subtilisin 309, subtilisin 14? és a subtilisin 168 (a WO 89/062?9~ben írták le). A tripszin-szerű proteázokra példák a tripszin (például a sertés vagy szarvasmarha eredetű) és a Fusenum proieáz (amit a WO 89/06270 és WO 94/26583 szabadalmakban írtak le),

A hasznos proteázokra példák a WO 92/19729, a WO 98/20115, a WO 98/20116 és a WO 98/34948 szabadalmakban leirt variánsok, különösen az alábbi pozíciók egyikében vagy többjében szubsztitúcióval •i*.· A rendelkező variánsok: 27, 36, 57, 76, 87, 97, 101, 104, 120, 123, 167, 170, 194, 206, 218, 222, 224, 235 és 274.

Lipázok: A megfelelő lipázok közé tartoznak a bakteriális és gomba eredetű lipázok. Idetartoznak a kémiailag módosított vagy fehérje sebészetheg módosított mutánsok, A hasznos lípázokra példák a Wnm/co/a-öö/ fszfeon/m a Thermomycasj, például a H /anug/nosa-ból fr. /anugfeosus) származó lipázok, amint az EP 258 068 és EP 305 218 szabadalmakban leírták, vagy a H. Znso/ens-ból származó lípáz ahogy a WO 96/13580 szabadalomban leírták, egy Pseodomonas lípáz, például a R. a/ca//genes-'böl vagy a R pseedoa/ca/Zgenes-ből (EP218 272) származó, a P, cepac/s-ből (EP 331 378) a R stofzamből (GB 1.372.034), a R. ák/oreseens-bő/, Rset/domonas sp SD 705 törzsből (WO 95/06720 és WO 96/27002), a R. mscons/nens/s-böl (WO 96/12012), a Sac/te iipáz, például a S, subri7/s~böí (Dartois et al, 1993, Biochemloa et Biophysíca Acta, 1131, 253-360), a B. sfearotoermopri/fes-ből (JP 64/744992) vagy a B. pem/fe-bőí (WO 91/18422) származó lipázok.

A iipáz variánsok egyéb példái a WG 92/05249, a WO 94/01541, az EP 407 225, az EP 260 105, a WG 96/35381, a WO 96/00292, a WO

95/30744, a WO 94/25578, a WO 96/14783, a WG 95/22616, a WO

97^Λ és a WG 97/07202 szabadalmakban Idák le.

Amllázok: A megfelelő amllázok (alfa és/vagy béta) közé tartoznak a baktérium vagy gomba eredetű amllázok. Idetartoznak a kémiailag vagy protein sebészetíieg módosított mutánsok. Az amllázok közé tartoznak például a Baoillus-ből származó alfa-amílázok, például a B. //chen/form/s speciális törzséből származó, amit részletesen a GB 1,296.839 szabadalomban írtak le,

Hasznos amiíázokra példák a WO 94/02597, a WO 94/18314, a WO 96/23873 és a WO 97/43424 szabadalmakban leírt variánsok, különösen az alábbi pozíciók közül egyben vagy több pozícióban szubsztitúciót tartalmazó variánsok: 15, 23,105,108, 124, 128, 133, 154,

156, 181, 188, 190, 197, 202,

2v

09, 243,

304, 305, 391, 408 és

444,

Cellulózok: A megfelelő cellulózok közé tartoznak a bakteriális és gomba eredetű cellulózok. Kémiailag vagy protein sebészetileg módosított mutánsok Is idetartoznak. Megfelelő cellulózok közé tartoznak a Sac/Z/us, Pseudomonas, Humtoo/a, Fusarium, Γ/rie/av/a, Acremonfem nemzetségekből származó cellulózok, például az US 4.435.307 US 5,648.263, az US 5.691,178, az US 5778,757 és a WO 89/09259 szabadalmakban leírt Humfoo/a róso/ens, a Á4yee//opM8öra f/?ermoprt//a és a Fusartarn oxysporum által termelt gomba cellulózok,

Különösen alkalmas cellulózok az alkalikus vagy semleges cellulózok, amelyek szinvédő előnyükkel Is rendelkeznek. Az ilyen cellulázokra példák az EP 0 495 257, az EP 0 531 372, a WO 96/11282, a WO 98/29397, a WO 98/08940 szabadalmakban leirt cellulózok. A cellulóz variánsok egyéb példáit a WO 94/07998, az EP 9 531 315, az US 5.467,046, az US 5,888,593, az US 6,763,254, a WO 95/24471, a WO 98/12307 és a PCT/DK98,/00299 szabadalmakban írták le.

NI lelő per közé tartoznak a növényi, bakteriális vagy gomba eredetű enzimek. A kémiailag vagy protein sebészetileg módosított mutánsok is ezek közé tartoznak, A hasznos peroxidázok példái közé tartoznak a Coprtnus-hól, például a C, c/.nereos-böl származó peroxidázok és ezek variánsai, ahogy azt a WO 93/24818, a WO 95/10502 és a WO 98/15257 szabadalmakban leírták.

A detergens enzim(ek) szerepelhetnek a detergens készítményben úgy, hogy egy vagy több enzimet tartalmazó külön adalékot adunk hozzájuk), vagy úgy, hogy ezen enzimek mindegyikét tartalmazó kombinált adalékot adunk hozzá(juk), A jelen találmány egy detergens adaléka, azaz egy szeparált adalék vagy egy kombinált adalék, formulázható például granulátumként, folyadékként, vagy sűrű * X φ φ ·* * φ φ φ <# φ λ φ * φ* szuszpenzléként stb., Előnyős detergens adalék készítmények a granulátumok, különösen a nem porlódó granulátumok, a folyadékok, különösen a stabilizált folyadékok vagy a sűrű szuszpenziók,

Nem-porlódó granulátumok hozhatók létre, például az US 4.108,991 és 4.661,452 szabadalmakban leírtak szerint; és adott esetben ezek a tudomány e területén ismert eljárásokkal hurkolhatok, A viaszos burkoló anyagokra példák a poh(etllén-öxld) termékek (poheWéngOko!, PEG), amelyek átlagos molekulatömege 1000-20000; az etoxilált nonlfenolok, amelyek 16-50 etilén-oxid egységet tartalmaznak, az etoxilált zsiralkoholok, amelyek 12-20 szénatomos alkoholok és amelyekben 1580 etHén-oxid egység van; a zsíralkoholok, a zsírsavak és a zsírsavak mono-, dl- és trigliceridjei, A filmet képző, folyadékágyas technikával való használathoz megfelelő burkoló anyagokra példák a GB 1483591 szabadalomban kerültek leírásra. A folyékony enzim készítmények például stabilizálbafók egy pallói, például propilén glikol, egy cukor, vagy cukor alkohol, fejsav vagy bórsav hozzáadásával megalapozott eljárásokat használva. Á védett enzimek előállíthatok az EP 238,216 szabadalomban leirt eljárásoknak megfelelően,

A jelen találmány detergens készítmény bármilyen tetszőleges formátumú lehet, például lehet rúd, tabletta, por, granulátum, pép vagy folyadék, A folyékony detergens lehet vizes, tipikusan akár 70% vizet Is tartalmazhat, és 0-30% szerves oldószert, vagy lehet nem vizes detergens is.

A detergens készítmény egy vagy több felületaktív anyagot tartalmaz, amely lehet nem-ionos, ideértve a szemí-poláris és/vagy anionos és/vagy kationos zwiltehonos felületaktív anyagot. A felületaktív anyagok tipikusan 0,1-80 tömeg% mennyiségben vannak jelen.

Ha szerepel a készítményben, a detergens tipikusan körülbelül 1% - 40% anionos felületaktív anyagot tartalmaz, például lineáris alkilbenzén-sxulíonátot alfa-olofin-szulfonátot, alkil-szuifetot (zsíralkohol· szulfátot), alkohol efoxí-szulfátof, szekunder aíkán-szulfonátot, alfa-szulfozsírsav-mehí-észtert, alkil· vagy alkenibborcstyánkősavaf vagy szappant.

Ha szerepel a készítményben, a detergens tipikusan körülbelül 0,2 - 40% nem-ionos felületaktív anyagot tartalmaz, például alkohol· etoxilátoi, nonífenol-etoxílátot, alkH-poliglikozidöl, aiklí-dimetít-amín-oxidöt, etoxilált zsírsav-monoetanol-arnidot, zsirsav-monoetenoi-amidot, pohhidröxí-alkH-zsífsav-amsdöt, vagy gíükozaroln N-acikN-alkil származékait („glükamidok).

A detergens tartalmazhat 0-65% detergens alapozó vagy komplexképző anyagot Is, például zeolifot, difoszfátot, triózfoszfátot, foszfonátot, karbonátot, cifrátok nltnlrtriecefsavat, etílén-diamíntefraecetsavat, dietílén-fhamín-penfaecetsavat, alkil· vagy alkenll· borosfyánkősavat, oldható szilikátokat vagy rétegezett szilikátokat (például SKS~8~ot a Hoechst-főí).

A detergens tartalmazhat egy vagy több polimert. Példák a karboximefilcelíulóz, a poh(vínilpirrolidon), a polí(etiién-glikol), a poli(vínil· alkohol), a poHCyinil-piridín-N-oxíd), a pollfvinlMmldazol}, a poíikarboxilátok, például a poliakrilátok, az almasav/akrilsav kopolímerek es laurlkmefakriláf/akrilsav kopolímerek,

A detergens tartalmazhat fehérítő rendszert, amely tartalmazhat H₂O₂ forrást, például perborátot vagy perkarbonátot, ami kombinálható a persavat képző fehérítő aktíváforral, például tetraacetil-etilén-diamínnal vagy nonanoil-oxi-benzén-szulfonáttal. Másik lehetőségként, a fehérítő rendszer tartalmazhat peroxisavakat, például amid, Imid, vagy szulfon típusú peroxisavakat.

A jelen találmány detergens készítményének enzimje(í) stabilizálhatok hagyományos stabilizáló anyagok, például políoí, például propilén-glíkol vagy glicerin, egy cukor vagy egy cukoralkohol, tejsav, bórsav, vagy bórsav származék, például aromás borát-észfer vagy egy femi-borsav származék, például ΑΤοΓπΜΗοηίΙ-όόΓδβν használatával, és a φφ φ készítmény formulázható a WO 92/19709 bejelentésekben leírtak szerint.

es

92/19708

A detergens tartalmazhat egyéb hagyományos alkotórészeket Is, például gyári kondicionálószereket, például agyagot, habzás erősítőt, szappanhab gátlókat, korróziógátlő anyagokat, szennyeződést szuszpendáló anyagokat, szennyeződést gátló újraülepítő anyagokat, festékeket, bakterieideket, optikai fényesítöszereket, hidrotrőp anyagokat, fakulásgátlókat vagy parfümöket.

Jelenleg úgy véljük, hogy a detergens készítményhez bármilyen enzim, és a jelen találmány antimikrobiális polípeptidjei hozzáadhatok olyan mennyiségben, ami megfelel 0,01-100 mg enzim proteinnek mosó folyadék literenként, előnyösen 0,05-10 mg enzim proteinnek mosó folyadék literenként, még előnyösebben 0,1-5 mg enzim proteinnek mosó folyadék literenként, és legelőnyösebben 0,1-1 mg enzim proteinnek mosó folyadék literenként,

A jelen találmány antimikrobiális pollpeptldjai ezenkívül beépíthetők a WO 97/07202 (mely a hivatkozás révén részét képezi a jelen találmánynak) bejelentésben leírt detergens készítményekbe is.

A jelen találmányt a továbbiakban az alábbi példákkal szemléltetjük, melyeket nem szabad a jelen találmány körének korlátozásaként tekinteni.

A pufferként és szubsztrátként használt vegyszerek legalább reagens tisztaságú kereskedelmi termékek.

1,

A Rseodop/ec/an/a n/gre/fe-bóí származó antímí azonosítása pohpepi

Az alábbi módszereket és anyagokat használjuk.

cDNS könyvtárat állítunk elő 5 napig Mex~1 tápközeqen Indukált R,

Idáiban talált eljárást használva), A PoliA-val dúsított RNS-t tisztítjuk, a cDNS~t szintetizáljuk és a könyvtárat standard molekuláris biológiai eljárásokkal állítjuk elő. Az általános eljárás részletes leírása megtalálható a WO

01/12794 nemzetközi szabadalmi bejelentés példáiban. A klónozáshoz használt vektor a pMhasö, melyet a 4, számú szekvenciában mutatunk be, és amely az alábbi tulajdonságokkal rendelkezik:

Tulajdonság

CDS......................

CDS lel { *

I Promóter Vegyes jellemzők

Élhelyezkedés '365-1156” 2232-2387 '2189-219 2101-2189

I Leírás rCanamycín reziszt.

Shíne Daígarno Lac promóter KanPI primer a BÁCÉ rendszerhez

1. táblázat, A pMhasS vektor jellemzői,

Ezen plazmid figyelemreméltó jellegzetessége az, hogy az EcoRINotl restrikciós helyek szomszédosak a Lac promóter Shine Daígarno régiójával. Ez lehetővé teszi, hogy az EooRI-Notl-hez illesztett cDNS-eket a vektorba klónozzuk, és a kapott szerkezeteket aktívan írjuk át és transzláíjuk az £ co// gazdába.

v·' .s

A Pseudop/ectan/a o/gre/te könyvtár megszerkesztése és a plazmid készletet eredményező cDNS jel befogása

Egy cDNS plazmid készletet állítunk elő az eredeti cDNS-pMhasS vektor Hgálás összesen 20,000 transzformánsából. A plazmid DNS-t közvetlenül a szilárd L.B szelektív tápközegről kinyert telepek készletéből állítjuk elő, a plazmid DNS izoláláshoz való Qiagen (Qiagen Inc/} protokoll szerint. A plazmid készletet SigA2 transzpozonnal és MuA transzpozázzal kezeljük a traoszpozáz gyártójának (Fhmizyme, Flnland) javaslata szerint. A íranszpozon által elősegített jel befogásról szőlő általános információ található a WO 01/77315 szabadalmi bejelentésben. A kapott elegyet etanollal kicsapatjuk, hogy eltávolítsuk a feleslegben levő sőt, és 1,5 pl~t elektroporáltatunk 20 pl DH10S ultra-kompetens sejtekbe a sejtekkel (Giboo-BRL) adott standard protokollnak megfelelően. Az efektroporáltatott sejteket SÖC tápközegben inkuháljuk rázatás mellett (28°C, 2 óra, 250 rpm fordulatszám) a szelektív tápközegre való szélesítés előtt. Három agat tápközeget használunk:

LB * 50 pg/ml kanamycin

LB 4- kanamycin *15 pg/ml kloramphenícol vagy

LB * kanamycin * kloramphenícol * 12,5 pg/ml ampicillin.

Az elektroporáoíő LB * kanamycin^kioramphenlcol tápközegre való higitási szélesztéséből azt határoztuk meg, hogy körülbelül 119,000 telep van jelen, amelyek SigA2 transzpoziclőval rendelkező cDNS könyvtár plazmidot tartalmaznak. Összesen 363 telepet nyertünk a kísérletből hármas szelekció alatt, Az összes 363 telepet replika lemezekre tesszük 50 pg/ml ampicillinnel végzett hármas szelekcióra, a valódi jel befogott telepek szelektálása céljából. Összesen 335 telep képes szaporodni a fokozott mennyiségű ampicillin koncentráció mellett, és ezeket minipreppel vizsgáljuk a Qiagen Qiafurbo98 protokoll szerint (Qiagen Inc.). A plazmidokat a íranszpozon előre irányuló és fordított prímerekkel ♦* < ΦΦ (A és Β primerek) szekvenaíjuk, a WO 91/77315 nemzetközi szabadalmi bejelentés példáiban leírt eljárásnak megfelelően.

A primer; agcgf ttgcg gccgc gatcc (16. számú szekvencia)

B primer: ttatt cggto gaaea ggatc c (17. számú szekvencia)

A reakcióhoz, a DNS szekvenciát egy AB37ÖÖ kapilláris szekvenátoron kapjuk meg. A szekvenciákat hasítjuk, hogy eltávolítsuk a vektor és a transzpozon szekvenciát, valamint az A és B primer leolvasásokat minden egyes összeállított plazmid esetében. Ez 225 összeállított szekvenciát eredményez, amelyeket szekvencia homoíőgía alapján 145 contlg-ba (átfedő DNS szakaszok) soroltunk. Az összes 145 contig-öt egymástól függetlenül összerendezés-keresés programmal vizsgáljuk (blasting), és az eredményeket analizáljuk. Egy plazmid (P!eeíasin_6_B12) némi aminosav homológját mutat Ismert anfimikrobiálls polipeptídekekkel (defenzin-szerű polipeptidekkel).

Az alábbi példákban a jelen találmány anfimikrobiálls polipeptídjeíre .Plectasinkénf” hivatkozunk.

2. példa

Az Asperg/te expressziós vektor megszerkesztése a Plectasínhoz

A Plectasínt kódoló szekvenciát az alábbiak szerint ampliflkáljuk a fonti cDNS könyvtárból (lásd a fenti 1. példát): 1 pl cDNS-t (megközelítőleg 10 nanogramm DNS) használunk terápiáiként a PCR reakcióban, a 176-as és 179-es két primőrrel.

ro-as Primer: tctgg atcca ccafg oaatt tacca ccatc cfcfc(7. sz szekvencia) 179-es Primer: tetei cgagc tagfa acact tgcaa acaaa gc (3,sz. szekvencia) <.·*

Az egyes primerek 10 pmol mennyiségeit használjuk 1GÖ pl reakcíőtérfogalöan. Az anneálásí hőmérséklet 5S°C, és az extenzló 72^ÖC, 1 percig. Összesen 35 ciklust futtatunk, Expand High Fidelity PCR System-et (Roche) használunk.

A PCR reakció aliquot mennyiségeit 4%-os agaróz gélen szeparáljuk. Két különböző sáv látható: a legszembetűnőbb sáv a körülbelül 300 hp.~náí található és a valamivel gyengébb sáv körülbelül

350 bázispárttal

Mindkét fragmentet BamHI-gyei és Xhd-gyel emésztetjük, amelyek a PCR primerek által bejuttatott túllógó szakaszokban hasítanak. Az emésztett fragmenteket izoláljuk és a pMT2188 plazmidba klónozzuk, amely egy a pCaHj527 plazmidra alapozott Aspergillus expressziós plazmid, (lásd a WC 00/70084 nemzetközi szabadalmi bejelentés példáit), amelyet a PA 2001 ÖÖGS8 Dán szabadalmi bejelentés 7. példájában leírtak szerint szerkesztettük meg. Azt találtuk, hogy a rövidebb fragment tartalmazza a Plectasint kódoló szekvenciát, ahogy azt a jel befogó kísérletben (lásd a fenti 1, példát) meghatároztuk. Ezen rövid PCR fragment szekvenciáját az 5. számú szekvenciában mutatjuk be.

Hasonlóképpen, a hosszabb PCR fragment szekvenciájával kapcsolatban azt állapítottuk meg, hogy tartalmazza a Plectasio kódoló szekvenciát, valamint egy további 58 bp hosszúságú inszertet. Megfigyeltük, hogy az 58 bázispár hosszúságú ínszert tartalmazza egy gomba íntron konszenzus tulajdonságait, és ezen termék amplifíkációjáf a nem tökéletes iníron eltávolítás bizonyítékának tekintjük az mRNS készletben és a származtatott cDNS könyvtárban, A hosszabb PCR fragment szekvenciáját a 6. számú szekvenciában mutatjuk be. A rövidebb PCR termékhez való Asperg/te expressziós plazmidot (5. számú szekvencia) pM72548 plazmidnak nevezzük.

φ*

3, példa

A Plectasln expresszlőja Aspergillusban

A pMT2548 plazmidot a BECh2 Asperg///us oryzae törzsbe (a WO 00/39322 nemzetközi szabadalmi bejelentésben Írták le) és az MBín118 Asperg///us r?/gar törzsbe transzformáljuk. Az egyes törzsekből 30 transzformánst kétszer újra izolálunk szelektív és nem-indukáló körülmények között szacharózt és aeetamidot tartalmazó Cove minimál lemezen. A Plectasln expressziójának teszteléséhez, a transzformánsokaf 6 napig 3Ö°C hőmérsékleten szaporítjuk 10 ml YPM (2% pepton, 1% élesztőkivonat, 2% malfóz) tápközeget tartalmazó kémcsövekben. A felülúszókat NuPage 10% Bis-Tris SDS géleken (Invitrogen) futtatjuk a gyártó útmutatásának megfelelően, MES futtató pufferben, hogy lehetővé tegyük a szeparálást az alacsony molekulatömegű tartományban, Mindkét Asperg/te törzs jól szaporodik, még akkor is, ha a Plectasln expressziójára indukáljuk őket. A Plectasinhoz várt méretű elkülönült sávot a legtöbb transzformánsban láthatjuk, miközben ezt a sávot nem látjuk a nem transzformált BECK2 A. o.rtzae és MBin118 A. n/ger gazda törzsekben. Úgy tűnik, a Plectasln sáv erősebb a BECh2 transzíormánsoköan, mint az MBin118 transzformánsokban, Úgy becsültük, nagyon durván, és csak a festés mértéke alapján, hogy az Ilyen szaporítási körülmények közötti hozam 10-50 mg nagyságrendű szaporító tápközeg literenként,

4. példa

A Plectasln klónozása Öngyilkos Expressziós Rendszerbe (SES-be)

A Plectasln íragmentef PCR-ral ampliííkáljuk templátként a teljes hosszúságú Plectasln cDNS-t (Plectasln 6J312) és a DR34F és DR34R Ncoi és Xbal kötő primereket használva.

*** « φ*«·

DR34F: ccggccatgg gatttggatg caatggtcct tggg (9,sz. szekvencia) DR34R: gccgtctaga gccatctagt aacacttgca aacaaagccc cccttagc (1 O.sz.szekvencia)

A PCR ampiifikációt PWO DNS polímerázt használva végezzük el a gyártó (Roche Bíoscíenee, CA) útmutatásának megfelelően, A PCR terméket Ncol és Xbal enzimekkel emésztettük és irányítva inszertáljuk a pHHA és pHH plazmídokba (a WO 00/73433 nemzetközi szabadalmi bejelentés példáiban kerültek leírásra), A kapott plazmídokat pDR-48plectasínnak nevezzük a peptid citoplazmás expressziojához és pDRS~ 1 S-pleclasinnak a periplazmás expressziőhoz.

Mindkét plazmid tartalmazza a Plectasin fragment következő aminosav szekvenciáját:

mGFGCNGPWDEDDMGCHMHCKSíKGYKGGYCA&GGFVCKCY (11, sz, szekvencia) ahol m (metionin) nincs jelen a natív Plectasinban, azonban bejuttatjuk a klónozás! eljárás eredményeként.

Az E, coli szaporodásának gátlása a Plectasin expresszió során

Annak értékeléséhez, hogy az E, coll szaporodása gátolt-e folyadék tápközegben az endogén Plectasin expresszié indukciója során, a következő kísérletet végezzük el, a WO 00/73433 nemzetközi szabadalmi bejelentés példáiban leírtak szerint.. Röviden, friss, egy éjszakás sejt tenyészetet - melyek pDRS-18-píecfasinf, pDR-18plectasínt, pHH-f vagy pHHA-t tartalmaznak - 300-szorosára hígítunk 150 pl LB vagy 0,1% arabinózt tartalmazó LB tápközegbe mikrotiter lemezen, és 37^ÖC hőmérsékleten inkubáljuk erőteljes rázatás mellett. A szaporodási görbét az ÖD₄₅ követjük nyomon BUSA le< mutatják, hogy a Plectasin érték szabályos időközönkénti mérésével ásót használva. Az eredmények azt 3 sejtszaporodás 41%-át gátolja, ha φφ

ΦΦ * > φ* közvetlenül a periplazmára irányult, azonban nem befolyásolta a sejtek szaporodását, ha a cítopíazmában expresszátódott (lásd az alábbi táblázatot).

Szerkezet pHH pHH-piectasín (pDRS-ϊ 8-pÍectasin) oHHÁ | % gátlás

4Ϊ

I pHHA-plactasin (pDR~18-plectasin) 113

5. példa

A R n/grel/a Plectasin £ coléba való klónozása, expresszlója és aktivitásának becslése

A P. nlgrella-ből származó Plectasin klónozása pET31b* plazmidba

A Plectasin antímikrobiáíis aktivitási vizsgálathoz való előállításához a Plectasínt kódoló cDNS-t a pET31bs- expressziós vektorba (Novagen Inc. Wl) inszertáijuk. Specifikusan tervezett oligonukleotídokkai (1-es és 2-es Primerek) a Plectasin gént polímeráz láncreakcióval amplífikáljuk PWO DNS pollmerázt használva a gyártók (Roche Bioscience, GA) útmutatásának megfelelően.

1-es Primer.

attattcagatgcfggafce gaaaaaectgcgtcgcafia tccgcaaaggcafceatatc (12.sz. szekvencia)

2~es Primer aataatctegagttattagc cafattttttaatgatatgg atgcctttgcggataatgcg ac (13. sz. szekvencia)

A szomszédos restrikciós endonukleáz helyek (AlwNI/Avai) enzimatikus emésztése lehetővé teszi, hogy ezt a gént fúziós szerkezetként a pET31b* plazmidba klónozzuk (a gyártók (New England Biolabs inc„_s MA) útmutatásának megfelelő, standard eljárásokkal). Az összes standard protokollt máshol írták le (Sambrook, Fritsch and maniatis, 1989),

A P, n/gre//a Píectasin transzfomálása és expresszíója £, co/éban,

A rekombináns pET31b+ plazmidot E co// Novablue-ba transzformáljuk a gyártók (Novagen) útmutatásának megfelelően. Plazmidot állítunk elő QIAprep Mini Oszlopokat (GlAGEN Inc. CÁ) használva, és automatizált szekvenálássai szekvenáljuk plazmid specifikus primőröket (3-as és 4-es primerek) használva,

3-as Primer: tgctagttat tgctcagcgg (14. sz. szekvencia)

4~es Primer: accgtagttg cgccoatcg (15, sz, szekvencia)

Plazmidot transzformálunk az E, coli BLR-DE3 törzsbe a gyártók útmutatásának megfelelően (Novagen). A baktériumokat LB tápközegben szaporítjuk körülbelül 0,8 OD^oo értékig, és a rekombináns protein szintézist 1 mM IPTG-vel (izopropil beta-D-tiogalakiopíraneziddai) Indítjuk, Három órás Indukció után a baktériumokat begyöjtjük, 1/10 térfogatú A pufferben (50 mM Tris-HCI, 1 mM EDTA, 100 mM NaCI, pH 8) reszuszpendásjuk, majd nyomásos roncsolással (1500 mBar) lizáljuk, A kapott pelletet kétszer mossuk B púderben (50 mM Tris-HCI '10 mM EDTA, 0,5% TritonX-töö, 100 mM NaCI, pH 8). Az összes standard protokollt máshol Írták le (Sambrook, Fritsch and Maniatis, 1989),

A P. n/gre//a Píectasin tisztítása E co// inkiúziős testekből.

X » 3» *

Λ Φ Φ* * κ * * * *

X * * ^Φφ· φφχ ** ₀Χ φ φ φ # φ * «* > φ φ φ

ί»*φ

A fenti tisztítási eljárásból kapott peííet tisztított ínklúziós testeket tartalmaz, A peptid KSi fúziós partnerből való kiszabadításához savas hidrolízist végzünk egy a Plactaslnt kódoló génbe N-termínálisan bejuttatott manipulált Asp-Pro helyen. Az ínklúziós testeket reszuszpendáljuk 1ÖÖ mM nátrium-foszfátban (pH 2,3) és egy éjszakán át inkubáijuk 85^ÖC hőmérsékleten, A kapott felülúsző Proíin-Píaefaslnt tartalmaz, és a mintát 100 mM nátrium-foszfáttal (pH 12,3) semlegesítjük. A Proíín-Píeetasin azonosságát fömeg-spekfrometriávaí megerősítjük. Az összes standard protokollt máshol írták le (Sambrook, Fritsch and Maniatís, 1989).

Antlmikrobiális aktivitás Radiális Diffúziós Vizsgálattal

A korábban leírt profokol módosított verzióját alkalmazzuk az antimikrobiáiis aktivitás detektálásához (Lehrer et al., 1991, Uitrasensitive assays fór endogenous antimicrobíal polypeptídes, J. Immunoi, Methods, 137:167-173). A cél baktériumot (10^b telepképzö egység (cfu)) adunk a 10 ml-nyi aluirétegezeff agarózhoz (1% alacsony elektro-endosmosis agarőz, 0,03% Tripficase szója tápleves, 10 mM nátrium-foszfát, pH 7,4,

37°C hőmérséklet). A szuszpenziót INTEGRID perticsészén {Becton Dickinson Labware, Nd) megszilárdítjuk. Három mm-es gél lyukasztót használunk az alulrétegezett agarózon (Amersham Pharmacia Biotech, Sweded) lyukak készítéséhez. A lyukakba mintákat helyezünk, majd a petrlcsészéket 37°C hőmérsékleten inkubáijuk 3 órán keresztül. Egy takaró réteget öntünk a lemezek tetejére, és a lemezeket (LB fápkozeg, ,584 agar) egy éjszakán keresztül

Az antlmikrobiális aktivitás az üregek körüli bakteriális feltiszíuíásí zónaként látható. Az élő sejteket megfestjük 10 ml 0,2 mM MTT (3~(4_í6-Dimetil-fiazol-2~íl)-2,5-dífeniltetrazélium bromid Tlazol-kék) hozzáadásával, .Az összes standard protokoll máshol került leírásra (Sambrook, Fritsch and Maniatis, 1989), ·?·-?

* *<· φ φ φ

ΦΦ X

X « * φ φ > ·* _Λ* φΦ* < Φ V φ X Φ φ Φ φ φ <#* χφφ

A Plectasín öac/Z/us scó/ff/s elleni antimikrobiális aktivitása.

A Plectasín antimikrobiális aktivitásának értékeléséhez rekombináns Asperg/te oryzae fermentációs tápleveseit alkalmazzuk kétszeres sorozatos hígításban egy radiális diffúziós vizsgálatban (fent irtuk le), A tesztelés során nagy feltisztuíásí zónákat láttunk a fíac/te sub/ZZ/s mintáival szemben, a fenti eljárás után. A legnagyobb feltisztuíásí zónát (15 mm) a nem hígított fermentációs tápievessel kaptuk, míg a nem rekombináns Asparg/Z/os oryzee-böi vett minta nem mutatott antimikrobiális aktivitást a öac/te subf///s~sel szemben.

Egy alternatív fc.

co// gazdában inkluziős testekben expresszált Plectasín

Az antimikrobiális aktivitással rendelkező, kinyert Plectasín mennyiségének növeléséhez a Pleotasint az £ co// Origamí-DES (Novagen Inc.) törzsben expresszáljuk. Ez a törzs mutációt hordoz a tioredoxin-reduktázl (fcxS) és a giufatíon-reduKtázt (gon) kódoló génekben. A Pfeefasínt kódoló rekombináns pET31 B+plazmídot az E. co// 0rigami~DE3 törzsbe transzformáljuk a gyártók (Novagen) útmutatásának megfelelően. A Pleotasint tartalmazó ínklúzlós festek szaporítását, expressziójáf és izolálását a fentiekben leírtak szerint (A P. n/gre//a Plectazín transzformálása és expressziója £ co//~ban) végeztük. A Plectasín kinyerését a fentiek szerint (A P. n/gre/Za Plectasín tisztítása E. coli ínklúziostestekböí) végezzük. Ezt követően, radiális diffúziós vizsgálatot használunk az antimikrobiális aktivitás értékeléséhez (lásd fent: Antimikrobiális aktivitás radiális diffúziós vizsgálattal).

Az eredmények azt mutatják, hogy a Plectasín peptidek termelése az £ co/Z 0rigami-DE3 törzsben 5-10-szeres növekedést mutat a peptid antimikrobiális aktivitásában. A Pleofasin megnövekedett biológiai aktivitását tovább erősítette az a hogy hasonló eredményeket nyertünk egy másik defensin, a humán befa-defonsín 3, expressziojával. Arra a következtetésre jutottunk, hogy azok az E, coli törzsek, amelyek ·* V ·*·£ Λ* i- *

Φ x <·*> S

lehetővé teszik a diszulfid kötések kialakulását a citoplazmában, általában felhasználhatók a biológiailag aktív defensinek és egyéb diszulfid kötésű antimikröbiális peptidek bícszíntézlséhen.

6, példa

A Plecfasinhoz való Saccharomyoes cerev/s/ae expressziós vektor megszerkesztése

A Piectasin S. cerem/ae-ben való expressziójának értékeléséhez, két különböző plazmid szerkezetet, a pHH3S75-öt és pHH33?8~ot, hozunk létre, A pHH3875 az S. cerevisiaeből származó alfa-vezetőt kódolja az érett Plecfasinhoz fuzionálva. A Piectasin az alfa-vezetőtől leválasztható és érlelhető a KEX2 hasítási szekvencián keresztül A PHH3876 az alfa-vezetőt a Piectasin pro-régiohoz fuzionáltatva kódolja, amit az érett Piectasin követ. Ebben a szerkezetben egy KEX2 hely van jelen az alfa-vezető és a Piectasin pro-régíója között, míg egy másik KEX2 hely elkülöníti egymástól a Piectasin pro-régiöjáf magától a Plectasintól

A pHH3875 - alva vezetö/KEX2/Plectasin - megszerkesztése

A Piectasin gént standard PCR reakcióban amplifikáljuk az alábbiakban leírt pHH3875-Forw és pHH3875~Rev phmerekef használva. A 2. példából származó Asperg/te pMT2548 plazmidot használjuk DNS terápiáiként a PCR reakcióban. A kapott DNS fragmentet Qiaguíck tisztító kitel (Qiagen) használva tisztítjuk, és Xbaí és Cíal restrikciós enzimekkel emésztetjük, amelyek a primerek által bejuttatott túllógó részeket hasítják. A fragmentet tovább tisztítjuk 2% agaróz gélről, és egy C, cerev/s/ae expressziős vektorba ligáljuk, majd Xbal és Clal enzimekkel emésztetjük. Ez a 2p alapú E, co# élesztő hordozó vektor a konstitutív tpi promotert használja az alfa-vezefö/plectasin fúzió expressziójának irányítására,

7<>

beta-laktamázt használ az E, coléban való fenotípusos szelekcióhoz, és hordozza a Alpi élesztőben (MT883, a/α, Áfpi/Atpi, pep4-3/pep4-3) való plazmid szelekcióhoz a PÓT gént.

pHH3875-Forw primer:

gaagg ggtat ogat gctaa gagag gattf ggatg caafg gtcct tggga tgagg (18. sz. szekvencia) pHH3875~Rev primer:

ettag tttct agaci agtaa cactt gcaaa caaag ccccc c (19, sz. szekvencia)

A pHH3878 - aifa~vezef6/KEX2/pro~régiő/KEX2 /Plectasin megszerkesztése

A pHH3878 plazmid megszerkesztéséhez való protokoll azonos a pHH3875~ével, azzal az eltéréssel, hogy DHS primereket használunk, A pHH3878~hoz az alábbi primereket használjuk:

pHH3878Forw primer:

gaagg ggtat cgatg gctaa gagag oaccc cagcc tgttc cogag gctta ege (20. sz. szekvencia) pHH3878“REV primer (azonos a pHH3875~Rev primerrei):

ettag tttct agact agtaa cactt gcaaa caaag ccccc c (21. ez. szekvencia)

A Piectasin expressziója $, cerevA/ee-ben

A pHH3902 (kontroll), a pHH38?8 és pHH3878 plazmidokat az S.

cerev/s/ae használva

MT833 törzsbe transzformáljuk lifium-acetátos eljárást

A pHH3902, pHH3875 és pHH3878 számos transzformánsát * * Φ * * φ Φ χ φ > X Φ φ Φ ΦΦΦΦ

X Φ φ Φ φ φ χ.

ΦΦ*χ ΦΦφ φφ «φ «»» (SC alap agart, 284 D-glükőzt, és 3Ö°C hőmérsékleten Inkubáljuk szelektáljuk, SC alap/agar lemezekre 0_s02TÓ fhreonint tartalmaz) szélesztjük, a te

Az expresszié teszteléséhez az egyes telepeket 10 ml folyékony SC alapba (SC alapot, 2% D-glüküzt, 0,0284 fhreonint tartalmaz) inokuláljuk, erős rázatás mellett inkubáljuk 30°C hőmérsékleten, 3 napon át. A felűlúszőkat 1684 Trióin géleken (Novex) futtatjuk, hogy optimális szeparálást kapjunk alacsony molekulatömagű területen. A felűlúszőkat párhuzamosan koncentráljuk 500 pl-ről 20 pl mennyiségre, rnikrocen spin oszlopot alkalmazva 3 kDa molekulatömegö elválasztási méretet használva, A pHH3875 és pHH3878 plazmidokból származó összes minta a várt méretű peptid sávokat mutatja, A koncentrált minták mutatták a legszembetűnőbb sávokat.

A sokkal részletesebb információkhoz, a felűlúszőkat egy MALDIfí

Íizáiíuk (Voyager DE-Pro a Perseotive

Bíosystems-től).

A pHH387S piazmldhoz a fő megfigyelt csúcs a 4410-44TI tömegeknél jelent meg. Ez nagyon közel van a helyesen létrehozott és feldolgozott Plectasin 4402 várt tömegéhez.

A pHH3376 plazmid esetében számos csúcsot megfigyeltünk, A két legszembetűnőbb csúcsot a 4411-4413 és 7870-7871 tömegeknél figyeltük meg, A 4411 csúcs megint csak egyezik a helyesen feldolgozott plectasinnal. A 7870-nél levő csúcs legjobban a félig feldolgozott Flectasínnak felel meg, ahol a Pro-régié nem hasadt le a Plectasinről. Számos bomlási termék feltehetően a 7870 csúcsnál volt mgftgyelhetö.

A pHH3875 és pHH3878 plazmidokból származó Plectasin aktivitása

A fent leírt felűlúszőkat radiális diffúziós vizsgálatban analizáljuk az

5, példában leid módon.

X XX X 4 4 X

Χ<4 44* « jf «4 fAJ

I Píazmid ΓρΗΗ3902 i Normál l'ö...........

Koncentrált ^^ö78

4 .4 • s ·4

3. táblázat A gátlás körülbelüli zónája (mm).

Meglepő módon, a pHH3876 eredményezte a legnagyobb gátlás! zónát, ami több terméket, vagy nagyobb aktivitással rendelkező terméket jelez a pH H3876~höz képest.

A Plectasin variánsok HTP szkrínelése

A Plectasin antimikrobiális aktivitásának további optimalizálásához az aktivitás nagy teljesítményű vizsgálatát végeztük el. Egy ilyen rendszer felállításához a kontrol! pH H3902 plazmidot vagy a két Plectasin expressziós plazmidot, a pHH387S~öt és pHH3876~of, tartalmazó élesztőgomba sejteket 96 üregű mlkrotifer lemezekben szaporítjuk. Ésszerű sejtsűrüségnél az élesztőgomba tenyészet 6 vagy 20 pl mennyiségeit eltávolítjuk a mlkrotifer lemezről, és a radiális diffúziós vizsgálatban használjuk fel az 5, példában leírtak szerint. A radiális diffúziós teszt lemezen a feitlsztulásl zónák egyértelműek voltak a két Plectasín-t termelő (a pHH3875~öl és a pHH3878-ot tartalmazó) törzsből származó felülúszók esetében. Amint fent is megfigyeltük, a felfíszfulási zónák nagyobbak a pHH3S?8~ból származó felülúszók esetében. Nem figyeltünk meg felfíszfulási zónákat a kontrol! plazmidból. Ez azt jelzi, hogy ez az egyszerű HTP vizsgálat különbséget tud tenni az antimikrobiális aktivitás különböző szintjeit expresszáló élesztőgomba sejtek között, és alkalmas a kívánt aktivitással rendelkező Plectasin variánsok szkrínelésére.

ö.Z

7. példa

Plectasinhoz való indukálható élesztőgomba termelési és a HTP szkrfnelö rendszer létrehozása ~ a pYES2~3902, a pHH388ó (Plectasin) és a pHH3887 (Pro-pleefasin) megszerkesztése

Az indukálható expressziós rendszerek értékeléséhez, és a jobb biológiai aktivitással rendelkező Pleolasin variánsok azonosításához való HTP szkrlnelő rendszer potenciális felállításához, a pYES2 plazmldot használva Plectasinf és pro-plectaslnt kódoló indukálható expressziós vektorokat szerkesztünk meg,

A pYES2 (invitrogen) plazmid egy 5,9 kb vektor, amelyet rekombináns proteinek és peptidek Saccharomyoes cerw/s/ae-ben való indukálható expressziójához terveztünk, A vektor a következőkkel jellemezhető: tartalmaz élesztőgomba GAL1 promotert a galakfőz általi magas szintű Indukálható expresszióhoz és glükóz általi represszióhoz, Uracll protofrófiát és ampioiilin rezisztenciát használunk a transzformánsok sorrendben élesztőgomba és £ co// sejtekben való szelektálásához.

Három plazmldot szerkesztünk meg, egy kontroll plazmldot, a pYES-3902-őt, és két Plectasínt kódoló plazmldot, a pHH3888-ot és a pHH3887~et

Mivel a pYES2 egy nem fúziós vektor, a pHH3902~ből, pHH3875~ böl és a pHH3878~ból származó teljes alfa-vezető régiókat PCR amplifikáljuk standard PCR reakcióban. A fragmenteket 2% agarőz gélen futtatjuk, Qiagen tisztító kitel használva tisztítjuk, és Hindii l-mal és Xbalgyel emésztettük, és a pYES2 plazmid megfelelő helyeire ligáljuk. Ez az alfa-vezetőt a GAL1 promoter elő helyezi. A ligálási keveréket kompetens E, co/Aba transzformáljuk., A transzformánsokal újra szélesztjük, és számos egyedi kiónt analizálunk a megfelelő méretű inszertet tartalmazó plazmidokra, A végső ellenőrzést DNS szekvenálással végezzük az

ΦΦ

Α « Φ Φ Φ Φ

ΦΦ * φ *Φ Φ > X ΦΦ

ΑΟΡ107 és ΑΟΡ446 primőröket használva, A plazmidokat pYES-3902 (kontroll), pHH3886 (Plectasin) és pHH3887 (Pro-plectasín) plazmídoknak jelöljük.

AGP 107 primer:

caata taaaa aagct agctt tccg (22, sz. szekvencia)

ÁOP448 primer:

Céggé tgaag ctgct atcgg (23. sz. szekvencia)

A három plazmidot (pYES-3902, pHH3886 és pHH3887) a JG169 élesztőgomba törzsbe transzformáljuk, majd 0,5% glükózt és 1,5% galaktőzt tartalmazó lemezekre szélesztjük. A glükóz biztosítja a megfelelő méretű telepek kialakulását, és a glükóz elfogyása után a galaktőz biztosítja a további szaporodást és a Plectasin transzkripciójának és megfelelő termelésének indukcióját. Mintán a telepek kialakultak, az indikátor törzs (8, suhiílis) rétegét (körülbelül 10^δ efu) rétegezzük a telepekre, és a lemezeket tovább inkubáljuk egy éjszakán át. Ahogy az egyéb, fent leírt élesztőgomba plazmidok esetében látható, a kontroll plazmidot tartalmazó élesztőgomba törzs nem eredményez feitísztulási zónát, míg a pHH3386 és pHH3887 plazmidokat tartalmazó igen. A legnagyobb feltisztulási zónát a Pro-plectasint kódoló pHH3887 esetében figyeltük meg, *Λ ί *

Φ* Φ

8. példa

Plectasinhoz való indukálható élesztőgomba termelési és a HTP szkrlnelési rendszer megszerkesztése ~ a mutáltatott Ptectasin könyvtárak megszerkesztése

Mutáltatott Ptectasin könyvtárakat szerkesztünk meg „error prone” (hibára hajlamos) PCR-ral. A random mutáltatott DNS fragmenteket a pYES-mut és pHH388S-Rev prímereket és vagy a pHH3875 (Proptectasin) vagy a pHH3878 (Ptectasin) templátot használva hozzuk létre 0,5 mM MnCI₂~őf tartalmazó PCR reakcióban.

Primer pYES-mut:

taaatactac tattgocagc atlgctgcta aagaagaagg ggtatogatg gccaagaga (24. szekvencia)

Primer pHH3885-Rev:

Tgtaagcgtg acataaotaa tlacatgatg cggccctcta ga (25. szekvencia)

A fragmenteket 2%-os agaróz gélen futtatjuk, Quiagen tisztító kilét használva tisztítjuk, és a pYES2~3902 plazmidba ínszerfáljuk. A píazmidokat kompetens JG169 élesztőgomba sejtekbe etektroporáhatjuk.

A két különböző könyvtárat 0,5% glükózt és 1,5% gaíakiózt tartalmazó nagy agar lemezekre (23cm x 23cm) szélesztjük. 30°C hőmérsékleten 2 napig tartó Inkubálás után a könyvtár lemezeket körülbelül 10^? cfu R suóf/fe-t tartalmazó vékony agaróz réteggel felülrétegezzük, A lemezeket tovább inkubáljuk 24 órán keresztül, 3Ö°C hőmérsékleten. Megközelítően 10.ÖÖÖ telepet tesztelünk. A jelentős feltisztulási zónát mutató élesztőgomba telepeket további jellemzés céljából izoláljuk.

X φ Φ φ X φ V φ φ Φ φ ** X φ ΦΦ ο c φ φ φ φ χ φ ^$3 φφφ φ Χ-Χ-Φ ΦΦ νφ φ *

A biológiai anyag deponálása

A következő biológiai anyagot deponáljuk a Budapesti Szerződés rendelkezései értelmében a Centraalbureau Voor Schimmeicuiiures törzsgyűjteménynél ((CBS), Uppsalalaan 8, 3584 CT ütrechí, The Netherlands vagy P,O. Box 85167 3808 AD, Utrecht, The Netherlands), ahol a következő katalógusszámon található;

Deponált anyag__

Pseudop/ectan/a n/gre/Za deponálás dátuma M, január

A deponálást a Növő Nordlsk A/S tette, melyet később a

Novozimes A/S lett a jogutóda.

A Pseudop/ec/anZa n/gre//e rendszertani besorolása:

Eukarióta, Gomba, Ascomycota, Pezizomycotina, Pezízomyoetos, Pezizales, Sarcosomataceae, Pseudoplecfania, * <

ft φ φ Φ** *·ν ** * * *

WO «3/04484$ SSOÜEUCE IxJSTim

PCT/ÖK8 2/06781 ífevozymes* A/S <12 o> Antimikrobiális polipeptidek <130> 1Ö212-WO <IS0> 25 «170» PatentIn version 3,1 <210» < 211 > < 212 ·» <2I3>

,288 ^sKeudop.lectan.i.« nigrella < 2 2 0 » <221» CDS <-.22;

<22ö» «221» 813„P«P t í 0' «222» {1 í · C δ $ $ <223>

<z z 8 .» <221-··· c-at _peptid <222» ; 186) . . (} <223» <40δ» 1 atg c&a fctt acc Met Oln Phe

C &£.C CCC C r Thr He Leu Ss -50 &te ggt atc sec gtc ttc gga ott Ile Gly He Thr Val Phe Oly Leu

4S

-3 5 :tc sac acc gga gcc ttfc gca gca ccc ca.g cet gtt ccc gag gcí

Len Asxí Thr Glv Alá Phe Alá Alá

Gin Pro Val Pro Glu Alá -30 -25 tac

Tyr

SCt

Alá

Ϋ <·’<· qaq cet qat ttt

Alá his Pro Asn Aso Phe

ggt a tg gat.

Oly Mac Asp

;.44

> ·

Y

λ Φ X *

* Sí ' í« X 9

>

*

φ o v > *

* «- ♦

«><•4 ♦

< i

WO 03/(0 4049

PCTZÖKÖ2/8Ö7

Alá Asn Gin Leu

ζ>ΛΪΛ bVii

Arg

Ph.s

Gi v

OvSí

Asn

Oly

Pro

1*2ΓΡ

Asp

•x

Λ

v·

gag gat gat atg

cég tgc

cao

•ssx

c«c

C.QG

>· zX P* X- x. w

art

aag

ggt

t«c

240

Glu Asp A«p Mst

Gin Cys

His

Asn

His

Cys

Lys

Aííí'

He

Lys

Gly

Tyr

10

*. *x

f·

*> c, -a C3

aag gga ggt rat.

tgt get

a&g

ggg

99 c

ttt

att

tgc

x·. X4

tac

tag

283

Lys Gly' Gly Tyx-

Cys Alá

LyS

Gly

Gly

Phe

Val

Cys

Lys

Cys

*L v x*

30

35

40

<210> 2

<211> 35

<212> PP.T

«213;» Pseudoplectanía nigre

Ί1 &

«400» 2

Met Gin Phe Thr

Tnx' .il.í:

L&n

Ser

Ile

Gly

Ile

Thr

Val

Phe

Gly

Leu

-55

-50

-45

'40

Lss.s As» Thr Gly

AÍe. Phő.

Al«

Alá

3r ΤΌ

Gl a

Pro

Val

Pro

Glu

Alá

Tyr·

~ 3S

- 3 0

-25

Alá Val Ser Asp

Pro Glu

A X 3.

His

Pro

Asp

Asp

Phe

Ά1&

Gly

Met

A-S<p

•x 0 X- <'·

.. 1 '1

x <c ~ λ, V

A.i.iít Asn Εϊ.Ι.λϊ .l.í£?Ái

Gin ny 3

Ax 9

Gly

Phe

Gly

C γ s

&SX5

Gly

Pro

Trp

Asp

-· R

-1

1

ες

Gin Asp Asp Met

Gin Cys

Asn

His

Cy s

Lys

' * íi*

Γ ''•‘‘•’x

Gly

Tyr

V Z\ ν'

1 £ •A

2ö

25

Lys Gly Gly Tyr

Cys Als

Lys

Gly

Gly

Phe

val

£y&

Lys

cys

Tyr

30

3 5

4 0

5' 5

WÖ 03/(s44049

PCT/ftjmwsi <22 Ο>

< 2 21 > SIGhAL ( 3 £ ί») < 2 2 2 > (1)--(2 3} <223 >

<22 Ο >

<22.1> PROPEP <222=· (24>..(S5;

<220>

<221 > ΡΕΡΤΧΕ (se),,<95} ;223>

Hét Gin Phe Thr Thr Ile Leu Ser Ile Gly Ile Thr Val Phe Gly Lei 1 5 10 IS

Leu Asn Thr Gly Alá Phe Alá Alá Pro Gin Pro Val Pro Glu AI« Ty:

Alá Val Ser Asp Pro Glu Alá His Pro Asp Asp Phe Alá Gly Mer Asp

4S

Alá Asn Gin Leu Gin Lys Arg Gly Phe Gly Cys Asn Gly Pro Trp Asp iu Asp Asp Hét Gin Cys His Asn His Cys Lys Ser Ile Lys Gly Ty:

Lys Gly Gly Tyr Cys Alá Lys Gly Gly Phe Val Cys Lys: Cys Tyx·

Mesterséges sze&veneia

WO S3/ÍM4ÍU3 * ,· Λ*

Φ Φ ·> xf x * í v ; .; y S > Λ X <- * · ν'·« »ϊ« *»·»* *-«» '>

Ρ€’ΤΦΚβ2/0δ?8ί < 2 2 3 > · p.MHas5 vektor <4ÖO> 4

cgstaagcta	gcttcacgct	gccgcaagca	efcc&gggcgc	asgggcfcgct	aaaggaagcg	Sft
gaacacgtag	aaagccagcc	cgcagaaaog	gtgctgaccc	C9^9<ifcgaa r. g	tcagctactg	120
ggctatcfcgg	scaaggga&a	c^L* tvv-χζΛ a.v* ζ,.ν·*3^.	aa&g&gaaag	caggtagctt	gcagcgggct	180
tacacggcga	fc Sm C fc agaC-fc	gggcggtxtt		agcgaaccgg	aatfcgccagc	'23 0
t3gssc?”:c:c:	tctggtaagg	fc fcfc 99'** ögCC	cfcgcaaagta	aac’tagatssí?	cttccttgcc	300
gccaaggatc	tgatggcgca	ggggaccaag	atctgatcaa	gagacaggat	gaggatcgfct	360
tcgcatgatt	gaacaagatg	gattgcacgc	aggttctccg	gccgctfcggg	tggagaggcfc	4 2 0
attcggctat	gactgggcao		cggctgctct	gatgccgccg	tgttccggct	4S0
gtcagcgcag	999*~9ccegg	ttcfcttttgt	eaagaceg&c	ctgtccggtg	ccctgaatga	5 4 0
actccaagac	gaggcagcgc	ggctatcgtg	gctggecacg	acgggcgctc	cttgcgcagc	600
tgtgctcgas:	gttgtcactg	aagcgggaag	ggaetggctg	ctar.tgggcg	asgtgccagg	6 6 0'
gcaggatctc	ctgtcar..cfcc	accttgctcc	tgccgagaaa	gtatcoatca	fcggctgatgc	720
aatgcggcgg	cfcgcatacgc	tt.gatccggc	tacctgccca	fc fc C'CJ&CC'&CC	aagcgasaca	'7 § Q
tcgcatcgag	•:::«&9caegfc&	ctcgg&tgga	agceggtefcfc	•^'fcC’fcJSt. G<^99	& t. <í &· fc C- fc g g &	84 0
cgaagagcat	c g cs Q 9 ö fc 9	cgccagccga	acfcgttcgcc	aggctcaagg	tgcc	800
cgacggcg&a	gatctcgtcg	tgacccatgg	cg&fcgccfcge	Ugccgaata	tcatggtgga	9S0
saat-ggircgc	ttttctggat	fc C ü t. C? O <?. C tv <’.}	C ÖCZ·'·’*»£?£$<;* Q'	2 3 fc 9 fc 9 9 fc 9 9	accgctatca	Λ O fc 0
gg&c&t&gcg	ttggctaccc	gtgatatcgc	tgaagagctt	ggcggcgaat	999£· fc 9 fc fc *·?	10 8 0
Ct t CCtCO·· O	.-· «· *· f	•v- ·... '··· <.; >·. <.	c.fs3?. r	,- .·· ,---v .'·. t-	>· ...<· -ν,γν	·> '' Z Λ

WO 03/044049 PCm>K02/0078J.

tcfcfcgacgag	tccfctctgag	cgggacfcctg	gggttcgega	fcgata&gcfcg	fccaaacatga	1200
gaafcfcaeaac	ttatasrcgts	fcggggctgac	tfccaggtgct	aca·: fctgaag	agataaafcfcg	1250
cacfcgaaatc	tagooafcafcfc	fctatctgafcfc	aafcaagafcga	tcttcttgag	atcgfcfcfctgg	1320
tctgcgcgfca	atctcttgct	ctgaaaaoga	aaaaacegec	fctgcagggcg	gfcttttegaa	1380
ggttctet.g»	gcfcaccaact	cttfcgaaccg	aggta&ctgg	Cfcfcggaggag	cgeagtca.cc	1440
aaaaofctgte	cfcfcfccagttt	agccttaacc	ggcgcatgac	ttcaagacta	actcctctaa	1500
afccaafctacc	agtggctgct	gecagtggtg	ettttgeatg	fccfcfcfceccgg	ttggactcaa	1500
gaegatagtt	aecggatsag	gcgcagcggt	cgg&efcgaae	ggggggttcg	tgeatacagt	1620
ccagcttggs	gcgaactgcc	fcseccggaac	tgagtgteag	gcgfcggaafcg	agacaaacgc	16SÖ
ggccataaca	gcggaacgac	accggtaaac	cgaaaggcag	ga&caggaga	gcgcacgagg	174 8
gagccgccag	gggaaacgcc	fcggtatctfct	afcagr.cct.gt	cgggtttcgc	caccacfcgat	1800
ttgagcgtca	gatttcgtga	tgcttgtcag	OSSSScggag	cctatggaaa	aacggctttg	1SS0
ccttctttcc	tgcgttatee	ccfcgattctg	fcggataaceg	rar fcaccgcc	tttgagfcgag	1520
ctgataccgc	tcgccgcagc	cgaacgaccg	agcgeagcga	gfccagtgagc	gaggaagcgg	138ö
aagagcgccc	aatacgca«a	ccgcctcfccc	ccgcgcgttg	gccgattcat	taatgeagct	204 0
ggcacgacag	gtttcccgae	tggaaagcgg	gcagtgagcg	caacgcaatt	aatgtgagtt	2100
sgctcaccca	ttaggcaccc	eaggctttac	actttatgcfc	fcecggctegt	atgfcfcgtgtg	2.160
gaafctgtgag	cggataacaa	ttttacacag	gaattcaeag	cfcáfcgcfcaga	gcggccgctc	2220
gaccfcgcagg	catgcaagct	fcggcactggc	cgtcgttfcfca	caacgtcgfcg	acfcgggasaa	22 80
eccfcggcgtt	acccaacfcfca	atcgccfctge	agcacatccc	ccfcttcgces	gctggcgtas	2240
tagegaagag	gcccgcaecg	a ? cccet t c	ccaaeagfctg	cgcagcctgs	atggcgaatq	14 00

WÖ 03/044049

Φ * A > V «« / ψ * Φ V φ φ X * X * Φ * φ Φ Φ φ » * * # Φ Φ φφφ ΦΦ XX *»*

Κ.:Τ/»Κ02/Ο6?83

2407$ <2ΧΟ> S <2.1 .ί> 303 <2'! 2>

<213> Pseudoplectania nigreiL <40ö> S ggatccacca tgcaafcfcfcac caccatcctc tecatcggta tcaccgtctt cggsefcfccfcc bü aacaccggag ccfcttgcagc accccagcct gttcccgagg ctfcacgctgt fcfcctgatccc 2 20 g&ggctcacc ctgacgattt tgctggtatg gatgcgaacc aacttcagaa acgtggattt ISO ggafcgcaatg gtccfctggga tgaggatgat atgcagfcgcc acaatcactg caagtctatt 240 aagggttaca agggaggtta ttgtgctaag gggggcfcfctg ttfcgcaagtg tfcactagctc 3C0 aaq

30/ <210> δ <2Ü> 3S:

<212>

DNS <2i3> Paauccplecfcacia niarella <:4 00-.> ggatccő :ca tgcaatttac caccatcctc tccatcggfca tcaccgfccfcfc cggacfctctc 60 sacaccggag cctttgcsgc accccagcct gttcccgagg cttacgcfcgt. fctcfcgatccc 120 gaggctcatc ctgacgattt tgctggtatg gafcgcgaacc aacttcagaa acgfcggattt ISO ggafcgcaatg gfcccttggga tgaggatgat afcgcaghgcc acaagtaaga afccacttata 240 acfcafcagafct. aagccaagag tattggaacfc gat.gafc.aaat agtcacfcgca agfccfcatfcaa 300 gggfctacaag ggaqqttatt «tcctaaccc? qqgct.t.t.qtt tqcaaqfcgfcfc aetaccfccca

WO Ö3/044W * X * Φ φ * >

Φ * « x «φ φ pcr/ö&wmsí •'Λ W Λ Λ ·'* d <212 > DNS <2ΐ3> Mesterséges szekvencia <22C>

<223 > 17 8-as Primer <·ιοο> ·?

tc-tggatcca ccatgcaatt taccaccafcc etec <210> 8 <211» 32 <212> DNS < 213 > Mesterséges szekvencia <;220:>

< 2 2 3 > 179~es Primer <4öö> 8 tc::c;:.i::«agc tagraacacfc Cgcaaacasa gc <2II> 34 <212> DNS <2i3> Mesterséges szekvencia < 2 2 0 >

< 2 2 3 > DR34F Primer <4ÖG> 3 ccggc-'cat.gg gatrcggarg caafcggeccr rggg

r.21ö>

Mesterséges szekvencia

v? >	*♦ * ».♦ *< ΦΧΦΦ ***** * y > * * ♦#* X φ *φΛ * * * * X Φ φ *·**·♦ ΦΦφ XKy
WO 0	,1/0440411		PC17OK02./0Ö7S
•i n c Λ V?-ζ»
223»	DR34R Primer
400»	X ö
ccg r.c	taga gccatctagt aacacttgca aacaaagcec	ccc b v.	48

* <· <21ö> 11 <211» 41 «212» PRT «213» Mesterséges szekvencia < 220» <22 3» met -- Plsetas in <4 Cö22

Met Gly Phe Gly Cys Asn Gly Pro 'Trp Asp G'.ln Asp Asp Met Gl.n Cys

Asn His Cys Lys Ser Ile Cys Gly Tyr Lys Gly Gly Tyr Cys Alá

2S

Lys Gly Gly Phe Val Cys Lys Cys Tyr

3.0

«213» Mesterséges szekvenci a < Z 0 >

<223» 1-es Primer «400» 12 attattcaga tgctggatcc gaaaaacctg cgtegcatta :cgeaaagg afcccat&tc

OO 03/644047 <213 > Mesterséges szekvencia <220» <223> 2~es Púmer <40»'» aataatctcg agütattagc catattttc

FCT/ÖR02/0078Í aatgatatgg atgcctttgc ggataatgcg ^Q<·· »2 < 21 ö » 14 <221» 20 <222» DNS <· 213 > Mesterséges szekvencia <220» «223.» 3__as prímet <400» 24 cgctagctat tgctcagcgg ^0 <210» 15 <211» 19

<223» 4-es Púmer <400» 15 öccgragctg cgcccatcg

Mesterséges szekvencia

A Primer

X * XXX

WO 85/04404$

PCF/OK02/007M «400» lő agcgtttgcg gccgcg&tcc «210» 17 <212 > DNS <21.3 > Mesterséges szekvencia «220» <223 > B Primer «400» .1?

t“öifceggfcc gaaaaggafcc c «2.10» IS

«213» Mesterséges szekvencia « 2 2 ö » «223 » pHH38?5~Forw Primer «400» IS gaaggggtat cgacggcraa gagaggattt ggatgcaaig gtccttggga igagg

«210»	19
'} Ȓ
«.<. 3.1»	Λ
«212»	DNS
<213»	Mesterséges szekvenci
«220» «223»	pHH38?5-Rev Primer
< 4 0 0 >	i 9
ctt	tttct sq&cüaqr&a. e&ct

. ί' *» φφ ^K'\ pcT/öKöMumi

2¹³ > Mesterséges szekvencia <220>

<223 > pHH3 876-Fonv Primer <4Ö0> 2« gaaggggtafc cgatggctaa gagagcaccc cagcetgtre ccgaggctfca eg

<210 >	21
<211> <212 > <213>	41 DNS Mesterséges szekvencia
< 2 2 0 .> < 2 2 3 >	pHB3876»Rev Primer
<400 > ettagfc	21 fcfccfc agactagfcaa cacscgc·

<2'lö.> <211>	24
<212 >	DNS
<213 >	Mesterséges szekvenc
<22 0 >
< 22 A >	AOPIÖ7-es Primer
<400>	2 2
castac	aaaa a&gst&gctt tccg

<21ö>	23
<22l.>	20
< z x 2 >	DNS
<213>	Mesterséges szekvencia
< 2 2 ü >
< 2 2 3 >	ÁOP446-os Primer

, ¥

WO 03/844049 φ ·>

PCTZÖK.Ö2/0Ö781 <400> 23 ccggccgaag ctgctstcgg 2 ο <21Ö> 24 <2.Ι1> S8 <242 > DNS ^{< 513} * Mesterséges szekvencia <220>

< 2 2 3 > pYES-mut Primer <400> 24 s&aatactac uarfcgecagc at ec? c t a a asa α a t a t a t o <2W> DNS < 2.13 > Mesterséges szekvencia <22 o>

«223 > pHH3S85-Rev Primer <40Ö> 25 tgtaagcgtg acataactaa ttacatgatg cggccctcta ga

Φ Φ X φ φ

X φ φ

Φ X ΦΦ φ ' φ φ φ φ φ

Φ X φ X s * φ φφφφ

Claims (15)

1. Polipeptid, amely antimikrobiálls aktivitással rendelkezik, azzal jellemezve, hogy a polipeptid lehet:

(a) egy polipeptid, amely olyan aminosav szekvenciát tartalmaz, ami legalább 65%-os azonosságot mutat a 2. számú szekvencia 1~40. amlnosavalval, (b) egy polipeptid, amelyet egy olyan nukleotid szekvencia kódol, ami közepes szigorúsági körülmények között, 0,2 x SSC-vel 42 °C-on történő mosás mellett, hibridlxálodlk egy olyan polinukleotid próbával, ami:

(I) az 1, számú szekvencia 168-285 nukleotidjaínak komciementer szálát: (ii) az 1. számú szekvencia 70-285 nukleotidjaínak komplementer szálát; vagy (iii) az 1, számú komplementer szálát jelenti; M v- szekvencia 1-285 nukleotidjaínak

\ Cf'tó az (a) vagy (b) pontok egy íragmentje, amely antimikrobiálls aktivitással rendelkezik.

2, Az 1. igénypont szerinti polipeptid azzal jellemezve, hogy olyan aminosav szekvenciával rendelkezik, amely legalább 70%-os azonosságot mutat a 2. számú szekvencia 1~4Ö, amlnosavalval, előnyösen legalább 80%-os azonosságot, legalább 85%-os azonosságot, legalább 90%-os azonosságot, legalább 95%-os azonosságot, vagy legalább 99%-os azonosságot mutat a 2. számú szekvencia 1-4Ö aminosava! vak

3. A 2. Igénypont szerinti polipeptid azzal jellemezve, hogy a 2. számú szekvencia 1-40 aminosavaít tartalmazza.

v

φ * Φ Φ β φ X « φ φ * φ φ φ φ φ φ φ _# * X φφφ φ φ φ * φ φφ φφφ

X > X

4. Αζ 1-3. igénypontok bármelyike szerinti polipeptid azzal jellemezve, hogy a 2. számú szekvencia 1-4Ö amínosavaiből áll.

5. Az 1. igénypont szerinti polipeptid, amelyet egy olyan nukleotid szekvencia kódol ami közepes-nagy szigorúsági körülmények között, 0,2 x SSC-vel 55 °C-on történő mosás mellett, előnyösen nagy szigorúsági körülmények között, 0,1 x SSC-vel 60 °C~on történő mosás mellett híbridizálódlk egy olyan polínukleotid próbával, ami:

(i) az 1, számú szekvencia 168-285 nukleotidjainak komplementer szálát;

(il) az 1. számú szekvencia 70-285 nukleotidjainak komplementer szálat; vagy (ül) az 1, számú szekvencia 1-285 nukleotidjainak komplementer szálát jelenti; és

8. Az 5, igénypont szerinti polipeptid, amelyet egy olyan nukleotid szekvencia kódol, ami közepes-nagy szigorúsági körülmények között, 0,2 x SSC-vel 55 °C-en történő mosás mellett, előnyösen nagy szigorúsági körülmények között, 0,1 x SSC-vel 80 °C~on történő mosás mellett blbridizálódik egy olyan polínukleotid próbával, ami az 1. számú szekvencia 186-285 nukleotidjainak komplementer szálát jelenti. ;

7. Polínukleotid azzal jellemezve, hogy olyan nukleotid szekvenciával rendelkezik, ami az 1-

8. igénypontok bármelyike szerinti polípeptldet kódolja.

leinsav szerkezet azzal jellemezve, hogy a 7, igénypont szerinti nukleotid szekvenciát tartalmazza, amely

100 kapcsolódik egy vagy több olyan szabályzó szekvenciához, ami a polipeptid megfelelő gazdában való termelését irányítja

9. Rekombináns expressziós vektor azzal jellemezve, hogy a 8. Igénypont szerinti nukleinsav szerkezetet tartalmazza,

10, Rekombináns gazdasejt azzal jellemezve, hogy a 8. igénypont szerinti nukleinsav szerkezetet tartalmaz.

11, Eljárás az 1-6, igénypontok bármelyike szerinti polipeptid előállítására azzal jellemezve, hogy (a) egy a vad formájában a polipeptidet előállítani képes törzset tenyésztünk, a polipeptid előállítása céljából; és

12, Eljárás az 1-6, igénypontok bármelyike szerinti polipeptid előállítására azzal jellemezve, hogy (a) egy a 10, igénypont szerinti rekombináns gazdasejtet tenyésztünk olyan körülmények között, ami a polipeptid termeléséhez vezet: és (b) a polipeptidet kinyerjük.

13. Eljárás mikrobiális sejtek elpusztítására vagy szaporodásának gátlására, amely nem az emberi vagy állati test kezelését célzó eljárás, azzal jellemezve, hogy a mikrobiális sejteket az 1-6, Igénypontok bármelyike szerinti antlmikrobiális polípeptiddel kapcsolatba hozzuk,

14. Az 1-6, igénypontok bármelyike szerinti anfimikrobiáiis polipeptid gyógyszerként történő alkalmazásra.

101

15, Az. 1-6. Igénypontok bármelyike szerinti antimikrobiáiis polipeptid alkalmazása mikrobiáhs fertőzés kezelésére vagy profiiaktikus felhasználásra szolgáló állatorvosi vagy humán terápiás szer előlh'tására.

16. Az 1-6, Igénypontok legalább egyike szerinti antlmikrobiális polipeptid állati takarmányban történő alkalmazása.

A meghatalmazott