ES2641039T3 - Polipéptidos con actividad de proteasa - Google Patents

Abstract

Polipeptido aislado que tiene actividad de proteasa, seleccionado del grupo que consiste en: (a) un polipeptido con al menos 85% de identidad de secuencia al polipeptido maduro de SEQ ID NO:2 y/o SEQ ID NO:4 y/o (b) un polipeptido codificado por un polinucleotido con al menos 86% identidad de secuencia a la secuencia codificante del polipeptido maduro de SEQ ID NO:1 o SEQ ID NO:3.

Description

Polipéptidos con actividad de proteasa

5 Referencia a un listado de secuencias

[0001) Esta solicitud contiene un listado de secuencias en ta forma teg ible por ordenador.

Antecedentes de la invención

Campo de la invención

[0002) La presente invención se refiere a polipéptidos aislados que tienen actividad de proteasa y secuencias de écidos nucleicos aisladas que cod ifican las proteasas. La invención también se refiere a constructos de

15 acidos nucleicos, vectores, y células huésped, incluidas células vegetales y animales, que comprenden las secuencias de acidos nucleicos, al igual que a métodos para producir y utilizar las proteasas, en particular al uso de las proteasas en el pienso para animales, y detergentes.

Antecedentes de la invención

20 [0003) En el uso de proteasas en el pienso para animales (in vivo), y/o el uso de tales proteasas para tratar proteínas vegetales (in vitro) cabe señalar que las proteínas son faclores nutricionales esenciales para animales y seres humanos. Muchos seres humanos y ganado obtienen las proteínas necesarias de fuentes de proteínas vegetales. Fuentes de proteínas vegetales importantes son por ejemplo cultivos oleaginosos,

25 legumbres y cereales.

[0004) Cuando por ejemplo se incluye harina de soja en el pienso de animales monogastricos tales como cerdos y aves, una proporción significativa de los sólidos de harina de soJa no es digerida de manera eficaz (la digestibilidad de proteína ileal aparente en lechones, cerdos en crecimiento y aves tales como ponos tipo

30 broiler, gallinas ponedoras y gallos es solo alrededor de 80'%).

[0005) El tracto gastrointestinal de animales consiste en una serie de segmentos cada uno representando entornos de pH diferentes. En animales monogastricos tales como cerdos y aves y muchos peces el estómago muestra fuertemente pH acido tan bajo como pH 1-2, mientras que el intestino muestra un pH mas 35 neutro en el area de pH 6-7. Las aves ademas del estómago e intestino también tienen un cultivo que precede al estómago, el pH en el cultivo se determina en su mayoría por el pienso ingerido y por lo tanto típicamente se encuentra en el rango de pH de 4-6. La digestión de proteínas por una proteasa puede ocurrir a lo largo del tracto digestivo entero, suponiendo que la proteasa es activa y sobrevive a las condiciones en el tracto digestivo. Por lo tanto, las proteasas que son altamente estables en acido para la supervivencia en el

40 ambiente gastrico y al mismo tiempo son eficazmente activas a pH fisiológico amplio del animal objetivo son especialmente deseables.

[0006) También, el pienso para animales es frecuentemente formulado en la forma granulada, donde se aplica vapor en el proceso de granulación. Es por lo tanto deseable también que las proteasas usadas en 45 pienso para animales sean capaces de permanecer activas después de la exposición al tratamiento con vapor.

Polipéptidos con actividad de proteasa

50 [0007) Los polipéptidos con actividad de proteasa, o proteasas, son a veces llamadas también peptidasas, proteinasas, péptido hidrolasas, o enzimas proteolíticas. Las proteasas pueden ser del tipo exo que hidrolizan péptidos que comienzan en cada final de las mismas, o del endotipo que actúa internamente en las cadenas del polipéptido (endopeptidasas). Las endopeptidasas muestran actividad en sustratos de péptidos bloqueados N-y C-terminalmente que son pertinentes para la especificidad de la proteasa en cuestión.

[0008) El término "proteasa" es definido aquí como una enzima que hidroliza enlaces de péptidos. Esta definición de proteasa también se aplica a la parte de proteasa de los términos "proteasa progenitora" y "variante de proteasa." como se utiliza aquí. El término "proteasa" incluye cualquier enzima del grupo enzimatico EC 3.4 (incluidas cada una de las trece subclases del mismo). El número EC se refiere a la

60 nomeclatura enzimática de 1992 de NC-IUBMB, Academic Press, San Diego, California, incluidos los suplementos 1-5 publicados en Eur. J. BioChem. 1994, 223,1-5; Eur. J. Biochem. 1995, 232,1-6; Eur. J. Biochem. 1996, 237,1-5; Eur. J. Biochem. 1997, 250,1-6; Y Eur. J. Biochem. 1999, 264,610-650; respectivamente. La nomenclatura se suplementa y actualiza regularmente; véase por ejemplo Wortd Wide Web (WV'NI ) en http://www.chem.qmw.ac.uk/iubmb/enzyme/index.html.

[0009) Las proteasas de la invención y para uso según la invención son seleccionadas del grupo que consiste en:

(a)

proteasas del grupo enzimatico EC 3.4.21.; y/o

(b)

serina proteasas de la familia de peptidasa S1, o más específicamente S1A;

5 como se describe en Biochem.J. 290:205-218 (1993) y en la base de datos de proteasas MEROPS, publicaCión 9.4 (31 enero 2011) (www.merops.ac.uk). La base de datos es descrita en Rawlings, N.D., Barrelt, A.J. & Bateman, A. (2010) MEROPS: the peptidase database. Nucleic Acids Res 38, D227-D233 ..

[0010) Más específicamente las proteasas de la invención son aquellas que prefieren un residuo de aa aromatico hidrofóbico en la posición P 1.

[0011 ) Para la determinación de si una proteasa dada es una serina proteasa, y una proteasa de la familía

S1A, se hace referencia al manual anterior y los principios indicados en el mismo. Tal determinación puede

llevarse a cabo para todos los tipos de proteasas, sea proteasas de origen natural o de tipo salvaje; o

15 proteasas genéticamente modificadas o sintéticas.

[0012) Las peptidasas de familia S1 contienen la tríada catalítica His, Asp y Ser en este orden. La mutación de cualquiera de los aminoacidos de la tríada catalilica dara lugar a la pérdida de actividad enzimatica. Los aminoácidos de la tríada catalítica de la proteasa 1 de S1 de Kribbella solani (SEQ ID N.O: 2) y Kribbella aluminosa (SEO ID N.O: 4) son probablemente las posiciones His-138; Asp-168 y Ser-250.

[0013) La actividad de proteasa se puede medir utilizando cualquier ensayo, donde un sustrato es empleado,

que incluye enlaces de péptidos pertinentes para la especificidad de la proteasa en cuestión. El pH de ensayo

y temperatura de ensayo deben asimismo ser adaptados a la proteasa en cuestión. Los ejemplos de valores

25 de pH de ensayo son pH 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , o 12. Ejemplos de temperatura de ensayo son 5, 10, 15, 20,25,30,35,37,40, 45,50,55,60,65,70,80,90, o 95"C. Ejemplos de sustratos de proteasa son caseína, tal como caseína reticulada con azurina (caseína AZCL), o suc-AAPF-pNA,. Ejemplos de ensayos de proteasa adecuados son descritos en la parte experimental.

Descripción de las técnicas relacionadas

[0014) Proteasas aisladas de Kribbella, y Streptomyces se conocen en la técnica. Una proteasa de Kribbel1a flavida se describe en Lucas,S. et al. "The complete genome of KribbeUa flavida DSM 17836."; remitido (SEP2009) a las bases de datos EMBUGenBank/DDBJ (SWISSPROT: C1WJ16 SEO ID NO:6 aquí). La secuencia

35 tiene 80,23% de identidad a la secuencia de SEO ID NO:2 y 80,81% de identidad a la secuencia de SEO ID NO:4 para la proteasa madura. La secuencia de ONA de la referencia (SEO ID NO:5 aquí) tiene una identidad de 81,6% a la secuencia de la secuencia SEO 10 NO:1 y 85,51% de identidad a la secuencia SEO ID NO:3, aquí.

[0015) El documento WO 2004/033668 divulga una proteasa de bacterias, con el número de registro GeneSeq ADM99133, que tiene una identidad del 56,1% 56,1% a la secuencia de SEO ID NO:2 y una identidad del 55,9% a la secuencia de SEO ID N.O: 4. La secuencia de DNA correspondiente tiene una identidad de 66,3% a la secuencia de SEO ID NO:1 y una identidad del 65,9% a la secuencia de SEO ID NO:3. Este documento también divulga composiciones detergentes y aditivos para piensos y alimentos que

45 contienen dicha proteasa al igual que el tratamiento de alimentos usando dicha proteasa.

[0016) Una proteasa, Streptogrisina B, se describe en Henderson, G. Krygsman, P. Liu,C.J. Davey,C.C. Malek, LT.; "Characterization and structure of genes for proteases A and B from Streptomyces griseus."; J. Bacterio!. 169:3778-3784 (1987). Identidades de secuencia para esta proteasa son inferiores a aquellas indicadas arriba:

[0017) La presente invención proporciona polipéplidos con actividad de proteasa y polinucleótidos que

codifican los polipéptidos. Las proteasas de la invención son serina proteasas de la familia de peptidasa S1A.

Las proteasas de la invención presentan propiedades de pH sorprendentes, especialmente estabilidad de pH

55 Y propiedades de actividad de pH que las convierten en candidatos interesantes para usar en el pienso para animales. Las proteasas de la invención por lo tanto son activas en Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA dentro de una gama amplia de pH 4-11 Y presentan actividad especialmente alta en el rango de pH de 6-11, son activas en un sustrato de harina de maíz-harina de soja relevante en el pienso dentro de un amplio rango de pH fisiológico de pH 3-7 y retiene mas del 80% de actividad después de ser sometido durante 2 horas a un pH tan bajo como 2.

[0018) El uso de proteasas en el pienso para animales para mejorar la digestión de proteínas en el pienso es conocido. WO 95/28850 divulga la combinación de una fitasa y una o más enzimas proteolílicas microbianas para mejorar la solubilidad de proteínas vegetales. WO 01/58275 divulga el uso de proteasas estables en 65 acido de la familia de subtilisina en el pienso para animales. WO 01/58276 divulga el uso en el pienso para animales de proteasas estables en ácido relacionadas con la proteasa derivada de Nocardiopsis sp. NRRL

18262 (la proteasa 10R), al igual que una proteasa derivada de Nocardiopsis alba OSM 14010. WO 04f072221 , WO 04/111220, WO 04/111223 , WQ 051035747, y WO 05f123911 divulgan proteasas relacionadas con la proteasa 10R y su uso en el pienso para animales. También, WQ 04/072279 divulga el uso de otras proteasas.

[0019) WO 04f034776 divulga el uso de una subtilisinalqueratinasa, PWD-1 de B. Licheniformis en el pienso

de aves. WO 04/077960 divulga un método para aumentar la digestibilidad de forraje o grano en rum iantes

aplicando una proteasa bacteriana o fúngica.

10 [0020) Productos comerciales que comprenden una proteasa y comercializados para usar en el pienso para animales incluyen RONOZYME® ProAct (DSM NP/Novozymes) Axtra® (Danisco), Avizyme® (Danisco), Porzyme® (Danisco), Al1zyme™ (Alltech), Versazyme® (BioResources; In!.), Poultrygrow™ (Jefo) y Cibenza® DP100 (Novus).

15 Resumen de la invención

[0021) La presente invención se refiere a polipéptidos aislados que tienen actividad de proteasa seleccionada del grupo que consiste en:

(a) un polipéptido con al menos 85% identidad de secuencia al polipéptido maduro de SEO ID NO:2 o SEO ID 20 NO:4;

(b)

un polipéptido codificado por un polinucleótido con al menos 86% de identidad de secuencia a la secuencia codificante del polipéptido maduro de SEO ID N.o: 1 o SEO ID NO:3;

(c)

un fragmento de un polipéptido de (a) o (b), que tiene actividad de proteasa.

25 [0022) La presente invención también se refiere a polinucleótidos aislados que codifican los polipéptidos de la presente invención, constructos de ácidos nucleicos, vectores de expresión recombinantes, y células huésped recombinantes que comprenden los polinucleótidos, y a métodos para producir los polipéptidos.

[0023) La presente invención también se refiere a métodos para la preparaCión de una composición para usar 30 en el pienso para animales, para mejorar el valor nulricional de un pienso para animales, y métodos de tratamiento de proteínas para usarse en las composiciones de pienso para animales.

[0024) Además la presente invención también se refiere a al uso de las proteasas en composiciones detergentes y tales composiciones detergentes.

Visión general del listado de secuencias

[0025) SEa ID NO:1 es la secuencia de DNA como se aisla de Kribbella solani.

40 SEa ID NO:2 es la secuencia de aminoácidos como se deduce de SEO ID NO:1 SEa ID NO:3 es la secuencia de DNA como se aisla de la Kribbella aluminosa. SEa ID NO:4 es la secuencia de aminoácidos como se deduce de SEO ID NO:3 SEO ID NO:5 es la secuencia de DNA de Kribbella flavida (EMBL:CP001736) SEa ID NO:6 es la secuencia de aminoácidos de Kribbella flavida (Lucas,S. Et al. "The complete genome of

45 Kribbella f1avida DSM 17836." UNIPROT:D201F6) SEa ID NO:7 es la secuencia de DNA de la proteasa 10R (WO 05/035747, SEO ID NO:1) SEa ID NO:8 es la secuencia de aminoácidos de la proteasa 10R (WO 05/035747, SEa ID NO:2) SEO ID NO:9 es el cebador directo específico de peptidasa de Kribbefla solan; S1. SEa ID NO:10 es el cebador inverso específico de peptidasa de Kribbella solani S1.

50 SEO ID NO: 11 es el cebador directo especifico de peptidasa de Kribbella aluminosa S1. SEa ID NO:12 es el cebador inverso específico de peptidasa de Kribbella aluminosa S1. SEO ID NO:13 es el cebador directo especifico del fragmento f1anqueante corriente arriba. SEO ID NO:14 es el cebador inverso especifico del fragmento f1anqueante corriente arriba. SEa ID NO:15 es el cebador directo especifico del fragmento flanqueante corriente abajo.

55 SEO ID NO:16 es el cebador inverso especifico del fragmento flanqueante corriente abajo. SEO ID:17 es una señal de secreción de Bacillus lentus.

a flZ e I en I aM t ' d 'd fd d d e secuencias:

Proteína SEO ID NO:2 SEa ID NO:4

SEO ID NO:2 100 SEO ID NO:4 95 100 SEO ID NO:6 Kribbella f1avida 80.23 80.81 SEO ID [ oroleasa 10R 46.41 47.51 NO:8

SEa ID NO:6

100 60.23

SEa ID NO:8 DNA

SEO ID NO:1 SEO ID NO:3 SEO ID NO:5 100 SEO ID NO:7

SEO ID NO:1

100 90.76 Kribbella f1avida 81 .82 roteasa 10R 70.96

SEO ID NO:3 SEO ID NO:5

90.76 100 85.51 100 72.92 72 .68

SEO ID NO:7

100

Definiciones

[0026[

5 Actividad de proteasa: el término "actividad de proteasa" significa una actividad proteolitica (EC 3.4). Las proteasas de la invención son endopeptidasas (EC 3.4.21). Hay diferentes tipos de actividad de proteasa: los tres tipos de actividad principal son: de tipo tripsina donde hay escisión de sustratos de amida después de Arg o Lys en P1, tipo quimiotripsina donde ocurre la escisión después de que uno de los aminoácidos hidrofóbicos en P1, Y tipo elastasa con escisión después de un Ala en P1 . Para fines de la presente

10 invención, la actividad de proteasa se determina según el procedimiento descrito en "Materiales y Métodos" a continuación. Los polipéptidos de la presente invención tienen al menos 20%, por ejemplo, al menos 40%, al menos 50%, al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, al menos 90%, al menos 95%, y al menos 100% de la actividad de proteasa del polipéptido maduro de SEQ ID NO:2 o SEO ID NO:4.

15 Aislado: el término "aislado" significa una sustancia en una forma o ambiente que no se origina en la naturaleza. Ejemplos no limitativos de sustancias aisladas incluyen (1) cualquier sustancia que no ocurra de forma natural, (2) cualquier sustancia que incluye, pero no se limita a, cualquier enzima, variante, ácido nucleico, proteina, péptido o cofactor, que es al menos parcialmente quitado de uno o más o todos los constituyentes de origen natural con los cuales se asocia en la naturaleza; (3) cualquier sustancia modificada

20 por la mano humana con respecto a la sustancia encontrada en la naturaleza; o (4) cualquier sustancia modificada mediante el aumento de la cantidad de la sustancia con respecto a otros componentes con los cuales se asocia naturalmente (por ejemplo, copias múltiples de un gen que codifica la sustancia; uso de un promotor más fuerte que el promotor naturalmente asociado al gen que codifica la sustancia). Una sustancia aislada puede estar presente en una muestra de caldo de fermentación.

25 Un "polipéptido aislado" es al menos 1% puro, por ejemplo, al menos 5% puro, al menos 10% puro, al menos 20% puro, al menos 40% puro, al menos 60% puro, al menos 80% puro, y al menos 90% puro, como se determina por SOS-PAGE.

Polipéptido sustancialmente puro: el término "polipéptido sustancialmente puro" significa una preparación que contiene como mucho 10%, como mucho 8%, como mucho 6%, como mucho 5%, como mucho 4%, 30 como mucho 3%, como mucho 2%, como mucho 1%, y como mucho 0,5% en peso de otro material de polipéptido con el cual se asocia de forma original o recombinante. Preferiblemente, el polipéptido es al menos 92% puro, por ejemplo, al menos 94% puro, al menos 95% puro, al menos 96% puro, al menos 97% puro, al menos 98% puro, al menos 99%, al menos 99.5% puro, y 100% en peso puro del material de polipéptido total presente en la preparación. Los polipéptidos de la presente invención están preferiblemente

35 en una forma sustancialmente pura. Esto puede ser realizado, por ejemplo, preparando el polipéptido por métodos recombinantes bien conocidos o por métodos de purificación tradicionales. Polipéptido maduro: el término "polipéptido maduro~ significa un polipéptido en su forma final después de la traducción y cualquier modificación postraduccional, tal como tratamiento N-terminal, truncamiento Cterminal, glicosilación, fosforilación, etc. En un aspecto, el polipéptido maduro es aminoácidos 1 a 188 en la

40 numeración de SEQ ID N.O: 2, aminoácidos -105 a -75 en la numeración de SEQ ID N.O: 2 es un péptido señal. En otro aspecto, el polipéptido maduro es aminoácidos 1 a 189 en la numeración de SEO ID N.O: 4, aminoácidos -105 a -75 en la numeración de SEQ ID N.O: 4 es un péptido señal. Secuencia codificante del polipéptido maduro: el término "secuencia codificante del polipéptido maduro" significa un polinucle6tido que codifica un polipéptido maduro que tiene actividad de proteasa. En un aspecto,

45 la secuencia codificante del polipéptido maduro es los nucleótidos 316 a 879 en la numeración de SEO ID

N.O: 1. Otros nucleótidos 1 a 90 en la numeración de SEO ID N.O: 1 codifican un péptido señal. En otro aspecto, la secuencia codificante del polipéptido maduro es los nucleótidos 316 a 882 en la numeración de SEO ID N.O: 1. Otros nucleótidos 1 a 90 en la numeración de SEO ID N.O: 1 codifican un péptido señal. Identidad de secuencias: la relación entre dos secuencias de aminoácidos o entre dos secuencias de

50 nucleótidos es descrita por el parámetro "identidad de secuencias". Para fines de la presente invención, el grado de identidad de secuencias entre dos secuencias de aminoácidos es determinado utilizando el algoritmo de Needleman-Wunsch (Needleman y Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453) como se implementa en el programa de Needle del paquete EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Gene!. 16: 276-277), preferiblemente versión 5.0.0 o posterior.

55 Los parámetros opcionales usados son penalización por apertura de gap de 10, penalización por extensión de gap de 0.5, y la matriz de sustitución EBLOSUM62 (versión de EMBOSS de BLOSUM62). El resultado de Needle etiquetado "identidad más larga" (obtenido utilizando la opción -nobrief) se usa como el porcentaje de identidad y se calcula de la siguiente manera:

60 (Residuos idénticos x 100)/{Longitud de alineamiento -Número total de Gaps en alineamiento) Para fines de la presente invención, el grado de identidad de secuencias entre dos secuencias desoxirribonucleótidas es determinado utilizando el al90ritmo de NeedJeman-Wunsch (NeedJeman y Wunsch, 1970, supra) como se implementa en el programa de Needle del paquete EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, supra), preferiblemente versión 5.0.0 o

5 posterior. Los parámetros opcionales usados son penalización por apertura de espacio de 10, penalización por extensión de espacio de 0.5, y la matriz de sustitución EDNAFULL (versión de EMBOSS de NCBI NUC4.4). El resultado de Needle etiquetado "identidad más larga" (obtenido utilizando la opción -nobrief) se usa como el porcentaje de identidad y se calcula de la siguiente manera:

(Desoxirribonucleótidos idénticos x 100)/{Longitud de alineamiento -Número total de Gaps en alineamiento)

Fragmento: el término "fragmento" significa un polipéptido con uno o más (diferentes) aminoácidos eliminados del término amino yfo carboxilo de un polipéptido maduro; donde el fragmento tiene actividad de proteasa. En un aspecto, un fragmento contiene al menos 168 residuos de aminoácidos (por ejemplo,

15 aminoácidos 11 a 178 de SEa ID N.o: 2), al menos 178 residuos de aminoácidos (por ejemplo, aminoácidos 6 a 183 de SEa ID N.o: 2) o correspondientemente para SEO ID NO:4 un fragmento contiene al menos 169 residuos de aminoácidos (por ejemplo, aminoácidos 11 a 179 de SEQ ID N.o: 4) o al menos 180 residuos de aminoácidos (por ejemplo, aminoácidos 5 a 184 de SEQ ID N.O: 4), Subsecuencia: El término "subsecuencia" significa un polinucleótido con uno o más (diferentes) nucleótidos eliminados del extremo 5' yfo 3' de una secuencia codificante del polipéptido maduro; donde la subsecuencia codifica un fragmento con actividad de proteasa. En un aspecto, una subsecuencia contiene al menos 504 nucleótidos (por ejemplo, nucleótidos 346 a 849 de SEO ID N.o: 1), o por ejemplo, al menos 534 nucleótidos (por ejemplo, nucleótidos 331 a 864 de SEO ID N.o: 1); o correspondientemente para SEO ID NO:3 un fragmento contiene como minimo 507 nucleótidos (por ejemplo nucleótidos 346 a 852 de SEa ID N.o: 3) o por

25 ejemplo como mínimo 540 nucleótidos (por ejemplo nucleótidos 328 a 867 de SEa ID N.o: 3). Variante alélica: el término "variante alélica" significa cualquiera de dos o más formas alternativas de un gen que ocupa el mismo locus cromosómico. La variación alélica surge naturalmente a través de la mutación, y puede resultar en polimorfismo dentro de poblaciones. Las mutaciones de genes pueden ser silenciosas (ningún cambio en el polipéptido codificado) o pueden codificar polipéptidos que tienen secuencias de aminoácidos alteradas. Una variante alélica de un polipéptido es un polipéptido codificado por una variante alélica de un gen. Polinucleótido aislado: el término "polinucleótido aislado" significa un polinucleótido que se modifica por la mano humana con respecto al polinucleótido como se encuentra en la naturaleza. En un aspecto, el polinucleótido aislado es al menos 1% puro, por ejemplo, al menos 5% puro, más al menos 10% puro, al

35 menos 20% puro, al menos 40% puro, al menos 60% puro, al menos 80% puro, al menos 90% puro, y al menos 95% puro, como se determina por electrofóresis de agarosa. Los polinucleótidos pueden ser de origen genómico, cDNA, RNA, semisintético, sintético, o cualquier combinación de los mismos. Polinucleótido sustancialmente puro: el término "polinucleótido sustancialmente puro" significa una preparación de polinucleótido libre de otros nucleótidos extraños o no deseados y en una forma adecuada para uso dentro de sistemas de producción de polipéptidos genéticamente modificados. Así, un polinucleótido sustancialmente puro contiene como mucho 10%, como mucho 8%, como mucho 6%, como mucho 5%, como mucho 4% , como mucho 3% , como mucho 2%, como mucho 1%, y como mucho 0,5% en peso de otro material de polinucleótido con el cual se asocia originalmente o recombinantemente. Un polinucleótido sustancialmente puro puede, sin embargo, incluir regiones no traducidas 5' y 3' de origen natural, tales como

45 promotores y terminadores. Preferiblemente, el polinucleótido es al menos 90% puro, por ejemplo, al menos 92% puro, al menos 94% puro, al menos 95% puro, al menos 96% puro, al menos 97% puro, al menos 98% puro, al menos 99% puro, y al menos 99,5% en peso puro. Los polinucleótidos de la presente invención están preferiblemente en una forma sustancialmente pura. Secuencia codificante: el término "secuencia codificante" significa un polinucleótido, que especifica directamente la secuencia de aminoácidos de un polipéptido. Los límites de la secuencia codificante se determinan generalmente por un marco de lectura abierto, que empieza normalmente con el codón de inicio ATG o codones de inicio alternativos tales como GTG y TTG Y termina con un codón de terminación tal como, TAA, TAG, Y TGA. La secuencia codificante puede ser un DNA, cDNA, polinucleótido sintético o recombinante.

55 cONA: el término "cONA" significa una molécula de DNA que se puede preparar por transcripción inversa a partir de una molécula de RNAm madura, empalmada, obtenida a partir de una célula eucariota. cDNA carece de secuencias de intrones que pueden estar presentes en el DNA genómico correspondiente. El transcrito de RNA inicial primario es un precursor para RNAm que se procesa a través de una serie de pasos, incluyendo empalme, antes de aparecer como RNAm empalmado maduro. Condiciones de alta astringencia: el término "condiciones de alta astringencia" significa sondas de al menos 100 nucleótidos de longitud, prehibridación e hibridación a 42"C en 5X SSPE, 0,3% SDS, 200 microgramos/ml de ONA de esperma de salmón cortado y desnaturalizado, y 50% de formamida, después de procedimientos de Southern blolting estándar durante 12 a 24 horas. El material portador es finalmente lavado tres veces cada uno durante 15 minutos utilizando 2X SSC, 0,2% SDS a 65"C.

65 Condiciones de muy alta astringencia: el término "condiciones de muy alta astringencia" significa sondas de al menos 100 nucleótidos de longitud, prehibridación e hibridación a 42"C en 5X SSPE, 0,3% SDS, 200 microgramos/ml de ONA de esperma de salmón cortado y desnaturalizado, y 50% de formamida, después de los procedimientos de Southem blotting estándar durante 12 a 24 horas. El material portador es finalmente lavado tres veces cada uno durante 15 minutos utilizando 2X SSC, 0,2'% SDS a 70Q C. Constructo de ácidos nucleicos: el término "constructo de ácidos nucleicos" significa una molécula de

5 ácido nucleico, bien mono-o bicatenario, que es aislada de un gen de origen natural o que se modifica para contener segmentos de ácidos nucleicos en cierto modo que de lo contrario no existiría en la naturaleza o que es sintético. El término constructo de ácidos nudeicos es sinónimo del término "cassette de expresión" cuando el constructo de ácidos nucleicos contiene las secuencias de control requeridas para la expresión de una secuencia codificante de la presente invención. Secuencias de control: el término "secuencias de control" significa todos los componentes necesarios para la expresión de un polinucleótido que codifica un polipéptido de la presente invención. Cada secuencia de control puede ser nativa o exterior al polinucleótido que codifica el polipéptido o nativa o exterior entre si. Tales secuencias de control incluyen, pero de forma no limitativa, una secuencia líder, de poliadenilación, secuencia de propéptido, de promotor, secuencia de péptido señal, y de terminador de transcripción. Como

15 mínimo, las secuencias de control incluyen un promotor, y señales de parada transcripcional y traduccional. Las secuencias de control pueden ser provistas de enlaces con el fin de introducir sitios de restricción especificos que facilitan la unión de las secuencias de control con la región de codificación del polinucleótido que codifica un polipéptido. Operativamente enlazado: el término "operativamente enlazado" significa una configuración en la que una secuencia de control se coloca en una posición apropiada relativa a la secuencia de codificación de un polinucleótido de modo que la secuencia de control dirige la expresión de la secuencia codificante. Expresión: el término "expresión" incluye cualquier paso implicado en la producción del pOlipéptido incluyendo, pero no limitado a, transcripción, modificación postranscripcional, traducción, modificación postraduccional, y secreción.

25 Vector de expresión: el término "vector de expresión" significa una molécula de DNA lineal o circular que comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido y está operativamente enlazada a nucleótidos adicionales que proveen su expresión. Célula huésped: el término "célula huésped" significa cualquier tipo de célula que es susceptible de transformación, transfección, transducción, y similar, con un constructo de ácidos nucleicos o vector de expresión que comprende un polinucleótido de la presente invención. El término "célula huésped" abarca cualquier progenie de una célula madre que no es idéntica a la célula madre debido a mutaciones que ocurren durante la repl icación. Variante: el término "variante" significa un polipéptido con actividad de proteasa que comprende una alteración, es decir, una sustitución, inserción, y/o deleción de uno o más (varios) residuos de aminoácidos en

35 una o más (varias) posiciones. Una sustitución significa una sustitución de un aminoácido que ocupa una posición con un aminoácido diferente; una deleción significa la deleción de un aminoácido que ocupa una posición; y una inserción significa la adición de 1-3 aminoácidos adyacentes a un aminoácido que ocupa una posición.

Descripción detallada de la invención

POlipéptidos con actividad de proteasa

[0027] La presente invención se refiere a polipéptidos aislados que tienen actividad de proteasa seleccionada 45 del grupo que consiste en:

(a)

un polipéptido con al menos 85% de identidad de secuencias al polipéptido maduro de SEO ID NO:2 y SEO ID NO:4;

(b)

un polipéptido codificado por un polinucleótido con al menos 86% de identidad de secuencia a la secuencia codificante del polipéptido maduro de SEO ID NO:1 o SEO ID NO:3 y/o

[0028) La presente invención se refiere a polipéptidos aislados que tienen una identidad de secuencia al polipéptido maduro de SEO ID NO:2 de al menos 85%, por ejemplo, al menos 87%, al menos 89%, al menos 90%, al menos 93%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, al menos 99%, o 100%, que tiene actividad de proteasa. En un aspecto, los polipéptidos difieren de no más de diez aminoácidos, por

55 ejemplo, de nueve aminoácidos, de ocho aminoácidos, de siete aminoácidos, de seis aminoácidos, de cinco aminoácidos, de cuatro aminoácidos, de tres aminoácidos, de dos aminoácidos, y de un aminoácido desde el polipéptido maduro de SEO ID NO:2.

[0029) Una forma de realización de la invención es un pOlipéptido o un pOlipéptido codificado por un polinucleótido con al menos 87% de identidad de secuencia al polipéptido de SEO ID N.o: 2.

[0030) Una forma de realización de la invención es un polipéptido o un polipéptido codificado por un polinucleótido con al menos 89% de identidad de secuencia al polipéplido de SEO ID N.o: 2.

65 [0031) Una forma de realización de la invención es un polipéptido o un polipéptido codificado por un polinucleótido con al menos 90% de identidad de secuencia al polipéplido de SEO ID N.o: 2.

[0032) Una forma de realización de la invención es un polipéptido o un polipéptido codificado por un polinucleólido con al menos 93% de identidad de secuencia al polipéplido de SEO ID N.o; 2.

5 [0033) Una forma de realización de la invención es un polipéptido o un polipéptido codificado por un polinucleótido con al menos 95% de identidad de secuencia al polipéptido de SEO ID N.O: 2.

[0034) Una forma de realización de la invención es un polipéptido o un polipéptido codificado por un polinucleótido con al menos 96% de identidad de secuencia al polipéptido de SEO ID N.o: 2.

[0035) Una forma de realización de la invención es un polipéptido o un polipéptido codificado por un pOlinucleótido con al menos 97% de identidad de secuencia al polipéptido de SEO ID N.o: 2.

[0036) Una forma de realización de la invención es un polipéptido o un polipéptido codificado por un 15 pOlinucleólido con al menos 98% de identidad de secuencia al polipéptido de SEO ID N.o: 2.

[0037) Una forma de realización de la invención es un polipéptido o un polipéptido codificado por un polinucleótido con al menos 99% de identidad de secuencia al polipéptido de SEO ID N.O: 2.

[0038) Una forma de realización de la invención es un polipéptido o un polipéptido codificado por un polinucleótido con al menos 100% de identidad de secuencia al pol ipéptido de SEO ID N.o: 2.

[0039) La presente invención se refiere a polipéptidos aislados que tienen una identidad de secuencia al polipéptido maduro de SEO ID NO:4 de al menos 85%, por ejemplo, al menos 87%, al menos 89%, al menos

25 90%, al menos 93%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, al menos 99%, o 100%, que tienen actividad de proteasa. En un aspecto, los polipéptidos difieren de no más de veinticinco aminoácidos, por ejemplo, de veinte aminoácidos, de quince aminoácidos, de diez aminoácidos, de nueve aminoácidos, de ocho aminoácidos, de siete aminoácidos, de seis aminoácidos, de cinco aminoácidos, de cuatro aminoácidos, de tres aminoácidos, de dos aminoácidos, y de un aminoácido a partir del polipéptido maduro de SEO ID NO:4.

[0040) Una forma de realización de la invención es un polipéptido o un polipéptido codificado por un polinucleótido con al menos 87% de identidad de secuencia al polipéptido de SEO ID N.O: 4.

35 [0041) Una forma de realización de la invención es un polipéptido o un polipéptido codificado por un pOlinucleótido con al menos 89% de identidad de secuencia al polipéplido de SEO ID N.o: 4.

[0042) Una forma de realización de la invención es un polipéplido o un polipéptido codificado por un pOlinucleótido con al menos 90% de identidad de secuencia al polipéplido de SEO ID N.o: 4.

[0043) Una forma de realización de la invención es un polipéptido o un polipéptido codificado por un polinucleólido con al menos 93% de identidad de secuencia al polipéptido de SEO ID N.O: 4.

[0044) Una forma de realización de la invención es un polipéptido o un pOlipéptido codificado por un 45 polinucleólido con al menos 95% de identidad de secuencia al polipéptido de SEO ID N.O: 4.

[0045) Una forma de realización de la invención es un polipéplido o un polipéptido codificado por un pOlinucleótido con al menos 96% de identidad de secuencia al polipéptido de SEO ID N.o: 4.

[0046) Una forma de realización de la invención es un polipéptido o un polipéptido codificado por un pOlinucleótido con al menos 97% de identidad de secuencia al polipéplido de SEO ID N.o: 4.

[0047) Una forma de realización de la invención es un polipéptido o un polipéptido codificado por un pOlinucleótido con al menos 98% de identidad de secuencia al polipéplido de SEO ID N.o: 4.

55 [0048) Una forma de realización de la invención es un polipéptido o un polipéptido codificado por un polinucleótido con al menos 99% de identidad de secuencia al polipéplido de SEO ID N.o: 4.

[0049) Una forma de realización de la invención es un polipéptido o un POlipéptido codificado por un polinucleótido con al menos 100% de identidad de secuencia al polipéptido de SEO ID N.": 4.

[OOSO) Un pOlipéptido de la presente invención preferiblemente comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:2 o SEa ID NO:4 o una variante alélica del mismo; o es un fragmento del mismo que tiene actividad de proteasa. En otro aspecto, el polipéptido comprende o consiste en el polipéptido

65 maduro de SEO ID NO:2 o SEO ID NO:4. En otro aspecto preferido, el polipéptido comprende o consiste en los aminoácidos 1 a 188 de SEO ID NO:2, o aminoácidos 1 a 189 de SEO ID NO:4.

(0051) La presente descripción también se refiere a polipéptidos aislados que tienen actividad de proteasa que se codifican por polinucleótidos que se hibridan bajo condiciones de alta astringencia, o condiciones de muy alta astringencia con (i) la secuencia codifican te del polipéptido maduro de SEO ID NO:1 o SEO ID 5 NO:3, (ii) [la secuencia de ONA genómico que comprende] la secuencia codificante del polipéptido maduro de SEO ID NO:1 o SEO ID NO:3, o (iii) la cadena complementaria en toda su longitud de (i) o (ii) (J. Sambrook,

E.F. Fritsch, y T. Maniatis, 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2a edición, Cold Spring Harbor, New YOrk).

[0052) El polinucleótido de SEO ID NO:1 o SEO ID NO:3 o una subsecuencia del mismo, al igual que la secuencia de aminoácidos de SEO ID NO:2 o SEO ID NO:4, o un fragmento de la misma, se puede utilizar para el diseño de sondas de ácidos nucteicos para identificar y clonar polipéptidos codificantes de ONA que tienen actividad de proteasa de cepas de diferentes géneros o especies según métodos bien conocidos en la técnica. En particular, tales sondas se pueden usar para hibridación con el cONA o genómico del género o

15 especie de interés, después de los procedimientos estándar de Southem blotting, para identificar y aislar el gen correspondiente en el mismo. Tales sondas pueden ser considerablemente más cortas que la secuencia entera, pero deberían ser al menos 14, por ejemplo, al menos 25, al menos 35, o al menos 70 nucleótidos de longitud. Preferiblemente, la sonda de ácidos nucleicos es al menos 100 nucleótidos de longitud, por ejemplo, al menos 200 nucteótidos, al menos 300 nucteótidos, al menos 400 nucteótidos, al menos 500 nucteótidos, al menos 600 nucleótidos, al menos 700 nucleótidos, al menos 800 nucleótidos, o al menos 900 nucleótidos de longitud. Tanto sondas de ONA como de RNA pueden usarse. Las sondas son típicamente marcadas para la detección del gen correspondiente (por ejemplo, con 32p, 3H, 35S, biotina, o avidina). Tales sondas están comprendidas por la presente descripción.

25 [0053) Un ONA genómico o genoteca de cONA obtenido a partir de tales otras cepas se pueden seleccionar para ONA que se hibrida con las sondas anteriormente descritas y codifica un polipéptido con actividad de proteasa. ONA genómico u otro ONA de tales otras cepas se pueden separar por electrofóresis en gel de poliacrilamida o agarosa, u otras técnicas de separación. El ONA de las bibliotecas o el ONA separado se puede transferir e inmovilizar en la nitrocelulosa u otro material portador adecuado. Para identificar un clon o ONA que es homólogo a SEO ID NO:1 o SEO ID NO:3; o una subsecuencia de las mismas, el material portador es preferiblemente usado en un Southern blol.

[0054] Para fines de la presente descripción, hibridación indica que el polinucleótido se hibrida a una sonda de ácidos nucleicos marcada que corresponde con la secuencia codificante del polipéptido maduro de SEO

35 ID NO:1 o SEO ID NO:3 [la secuencia de ONA genómico que comprende] la secuencia codificante del polipéptido maduro de SEO ID NO:1 o SEO ID NO:3; su cadena complementaria en toda su longitud; o una sub secuencia de la misma; bajo condiciones de astringencia muy baja a muy alta. Moléculas a las que la sonda de ácidos nucleicos se hibrida bajo estas condiciones se pueden detectar usando, por ejemplo, película rad iográfica.

[0055] En un aspecto, la sonda de ácidos nucleicos es la secuencia codificante del polipéptido maduro de SEO ID NO:1 o SEO ID NO:3. En olro aspecto, la sonda de ácidos nucleicos es un fragmento de la misma. En otro aspecto, la sonda de ácidos nucleicos es un polinucleótido que codifica el polipéptido de SEO ID NO:2 o SEO ID NO:4 o un fragmento de la misma. En otro aspecto preferido, la sonda de ácidos nucleicos es

45 SEO ID NO:1 o SEQ ID NO:3.

[0056] Para sondas largas de al menos 100 nucleótidos de longitud, condiciones de astringencia alta a muy alta son definidas como prehibridación e hibridación a 42~C en 5X SSPE, 0.3% SOS, 200 microgramos/ml de ONA de esperma de salmón cortado y desnaturalizado, y bien 25% formamida para astringencias muy baja y baja, 35% formamida para astringencias medias y medias altas, o 50% forma mida para astringencias altas y muy altas, después de los procedimientos estándar de Southern blotting durante 12 a 24 horas óptimamente. El material portador es finalmente lavado tres veces cada uno durante 15 minutos utilizando 2X SSC, 0.2% SOS a 65"C (alta astringencia), y a 70"C (muy alta astringencia).

55 [0057] Para sondas cortas de aproximadamente 15 nucleólidos a aproximadamente 70 nucleótidos de longitud, condiciones de astringencia son definidas como prehibridación e hibridación en alrededor de 5"C a aproximadamente 10~C por debajo de la Tm calculada utilizando el cálculo según Bolton y McCarthy (1962, Proc. NaU. Acad. Sci. USA 48:1390) en O,g M DE NaCI, O,Og M de Tris-HCI pH 7.6, 6 mM de EOTA, 0,5% de

NP-40, 1X solución de Oenhardt, 1 mM de pirofosfato de sodio, 1 mM de fosfato monobásico de sodio, 0,1 mM de ATP, y 0.2 mg de RNA de levadura por mi después de los procedimientos estándar de Southem blotting durante 12 a 24 horas óptimamente. El material portador se lava finalmente una vez en 6X SCC más 0,1 '% de SOS durante 15 minutos y dos veces cada uno durante 15 minutos utilizando 6X SSC a 5"C a 10"C por debajo de la T m calculada.

65 [0058] La presente invención también se refiere a polipéptidos aislados que tienen actividad de proteasa codificada por polinucleótidos que tienen una identidad de secuencia a la secuencia codificante del polipéptido maduro de SEO ID N.o; 1 de al menos 86%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, al menos 99%, o 100%.

[0059) Una forma de realización de la invención es polipéptidos que tienen actividad de proteasa codificada 5 por polinucleótidos que tienen una identidad de secuencia a la secuencia codificante del polipéptido maduro de SEO ID N. O; 1 de al menos 86%.

[0060) Una forma de realización de la invención es polipéptidos que tienen actividad de proteasa codificada por polinucleótidos que tienen una identidad de secuencia a la secuencia cod ificante del polipéptido maduro 10 de SEO ID N. O; 1 de al menos 90%.

[0061) Una forma de realización de la invención es polipéptidos que tienen una actividad de proteasa codificada por polinucleótidos que tienen una identidad de secuencia a la secuencia codificante del poljpéptido maduro de SEO ID N.O; 1 de al menos 95%.

[0062) Una forma de realización de la invención es polipéptidos que tienen una actividad de proteasa codificada por polinucleótidos que tienen una identidad de secuencia a la secuencia cod ificanle del polipéptido maduro de SEO ID N.O; 1 de al menos 96%.

20 [0063) Una forma de realización de la invención es polipéptidos que tienen actividad de proteasa codificada por polinucleótidos que tienen una identidad de secuencia a la secuencia codificante del polipéptido maduro de SEO ID N.O; 1 de al menos 97%.

[0064) Una forma de realización de la invención es polipéptidos que tienen actividad de proteasa codificada 25 por polinucleótidos que tienen una identidad de secuencia a la secuencia codificante del polipéptido maduro de SEO ID N. O; 1 de al menos 98%.

[0065) Una forma de realización de la invención es polipéptidos que tienen actividad de proteasa codificada por polinucleótidos que tienen una identidad de secuencia a la secuencia codificante del polipéptido maduro 30 de SEO ID N.O; 1 de al menos 99%.

[0066) Una forma de realización de la invención es polipéptidos que tienen actividad de proteasa codificada por polinucleótidos que tienen una identidad de secuencia a la secuencia codificante del polipéptido maduro de SEO ID N.O; 1 de al menos 100%.

35 [0067] La presente invención también se refiere a polipéptidos aislados que tienen actividad de proteasa codificada por polinucleótidos que tienen una identidad de secuencia a la secuencia codificanle del polipéptido maduro de SEO ID N. O; 3 de al menos 86%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, al menos 99%, o 100%.

40 [0068) Una forma de realización de la invención es polipéptidos que tienen actividad de proleasa codificada por polinucleótidos que tienen una identidad de secuencia a la secuencia codificante del polipéptido maduro de SEO ID N.O; 3 de al menos 86%.

45 [0069) Una forma de realización de la invención es polipéptidos que tienen actividad de proleasa codificada por polinucleótidos que tienen una identidad de secuencia a la secuencia codificante del polipéptido maduro de SEO ID N. O; 3 de al menos 90%.

[0070) Una forma de realización de la invención es polipéptidos que tienen actividad de proteasa codificada 50 por polinucleótidos que tienen una identidad de secuencia a la secuencia codificante del polipéptido maduro de SEO ID N.O; 3 de al menos 95%.

[0071) Una forma de realización de la invención es polipéptidos que tienen actividad de proteasa codificada por polinucleótidos que tienen una identidad de secuencia a la secuencia codificante del polipéptido maduro 55 de SEO ID N.O; 3 de al menos 96%.

[0072) Una forma de realización de la invención es polipéptidos que tienen actividad de proteasa codificada por polinucleótidos que tienen una identidad de secuencia a la secuencia codificante del polipéptido maduro de SEO ID N.O; 3 de al menos 97%.

60 [0073) Una forma de realización de la invención es polipéptidos que tienen actividad de proteasa codificada por polinucleótidos que tienen una identidad de secuencia a la secuencia codificante del polipéptido maduro de SEO ID N.O; 3 de al menos 98%.

[0074) Una forma de realización de la invención es polipéptidos que tienen actividad de proteasa codificada por polinucleótidos que tienen una identidad de secuencia a la secuencia codificante del polipéptido maduro de SEO ID N.o: 3 de al menos 99%.

5 [0075) Una forma de realización de la invención es polipéptidos que tienen actividad de proteasa codificada por polinucleótidos que tienen una identidad de secuencia a la secuencia codificante del polipéptido maduro de SEO ID N.o: 3 de al menos 100%.

[0076) En formas de realización particulares, las proteasas originales y/o las variantes de proteasa de la 10 invención y para uso según la invención son seleccionadas del9rupo que consiste en:

(a)

proteasas del grupo enzimático EC 3.4.21 y

(b)

serina proteasas de familia de peptidasa S1A; como se describe en Biochem.J. 290:205-218 (1993) Y en la base de datos de proteasa MEROPS, publicación 9.5 (www.merops.ac.uk). La base de datos es descrita en Rawlings, N.o., Barrett, A.J. & Bateman, A. (2010) MERQPS: the peptidase database. Nucleic Acids Res

15 38, D227-D233.

[0077) Para determinar si una proteasa dada es una proteasa serínica, y una proleasa de familia S1A, se hace referencia al manual anterior y los principios indicados en este. Tal determinación puede llevarse a cabo para todos tipos de proteasas, siendo estas proteasas de origen natural o de tipo salvaje; o proteasas

20 modificadas genéticamente o sintéticas.

[0078) La presente invención también se refiere a variantes que tienen actividad de proteasa y al menos 85% de identidad de secuencia al polipéptido maduro de SEO ID NO:2 yfo SEO ID NO:4, que comprende una sustitución, deleción, y/o inserción de uno o más (o diferentes) aminoácidos del polipéptido maduro de SEO 25 ID NO:2 o SEO ID NO:4. Preferiblemente, cambios aminoácidos son de una naturaleza menor, que las sustituciones o inserciones de aminoácidos conservadoras que significativamente no afectan al pliegue yfo actividad de la proteína; delaciones pequeñas, típicamente de uno a aproximadamente 30 aminoácidos; pequeñas extensiones amino o carboxilo terminales, tal como un residuo de metionina aminoterminal; un pequeño péptido enlazador de hasta aproximadamente 20-25 residuos; o una pequeña extensión que facilita

30 la purificación cambiando la carga neta u otra función, tal como un tracto de polihistidina, un epítopo antigénico o un dominio de unión.

[0079) Ejemplos de sustituciones conservadoras están en el grupo de aminoácidos básicos (arginina, lisina e histidina), aminoácidos acídicos (ácido glutámico y ácido aspártico), aminoácidos polares (glutamina y 35 asparagina), aminoácidos hidrofóbicos (Ieucina, isoleucina y valina), aminoácidos aromáticos (fenilalanina, triptófano y tirosina), y aminoácidos pequeños (glicina, alanina, serina, treonina y metionina). Sustituciones de aminoácidos que generalmente no alteran la actividad específica se conocen en la técnica y son descritas, por ejemplo, por H. Neuralh y R.L. Hill, 1979, en, The Proteins, Academic Press, New York. Los intercambios que ocurren con más frecuencia son Ala/Ser, Val/lle, AspfGlu, ThrfSer, AlalGly, AlafThr, Ser/Asn, AlaN al,

40 SeriGly, TyrfPhe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/lle, LeuNal, Ala/Glu, y AspfGly.

[0080) Alternativamenle, los cambios de aminoácidos son de tal naturaleza que las propiedades físico químicas de los polipéptidos son alteradas. Por ejemplo, cambios de aminoácidos pueden mejorar la termoestabilidad del polipéptido, alterar la especificidad de sustrato, cambiar el pH óptimo, y similar. 45 Aminoácidos esenciales en un polipéptido progenitor se pueden identificar según procedimientos conocidos en la técnica, tal como mutagénesis dirigida al sitio o mutagénesis de escaneado de alanina (Cunningham y Wells, 1989, Science 244: 1081-1085). En la técnica anterior, mutaciones de alanina únicas se introducen en cada residuo en la molécula, y las moléculas mutantes resultantes se evalúan para la actividad de proleasa para identificar residuos de aminoácidos que son críticos para la actividad de la molécula. Véase también, 50 Hilton et al., 1996, J. Biol. Chem. 271: 4699-4708. El sitio activo de la enzima u otra interacción biológica puede también ser determinado por análisis físico de estructura, como se determina por tales técnicas como resonancia magnética nuclear, cristalografía, difracción electrónica, o marcaje por fotoafinidad, conjuntamente con mutación de aminoácidos de sitio de contacto putativo. Véase, por ejemplo, de Vos et al., 1992, Science 255: 306-312; Smith et al., 1992, J. Mol. Biol. 224: 899-904; Wlodaver et al., 1992, FEBS Lelt.

55 309: 59-64. Las identidades de aminoácidos esenciales también pueden ser inferidas de análisis de identidades con polipéptidos que se relacionan con el polipéptido progenitor.

[0081) Sustituciones de aminoácidos únicas o múltiples, deleciones, y/o inserciones pueden ser hechas y evaluadas usando métodos conocidos de mutagénesis, recombinación, y/o redistribución, seguido de un 60 procedimiento de selección pertinente, tal como los descritos por Reidhaar-Olson y Sauer, 1988, Science

241: 53-57; Bowie and Sauer, 1989, Proc. Nat!. Acad. ScL USA 86: 2152-2156; WQ 95f17413; o WQ 95f22625 . Otros métodos que se pueden usar incluyen PCR con tendencia al error, presentación en fagos (por ejemplo, Lowman et al., 1991, Biochemistry 30: 10832-10837; patente norteamericana nO 5,223,409; WO 92f06204 ), y mutagénesis dirigida a la región (Derbyshire el al., 1986, Gene 46: 145; Neret al., 1988, DNA 7:

65 127).

[0082) Métodos de mutagénesisfredistribución se pueden combinar con alto rendimiento, métodos de selección automatizados para detectar actividad de polipéptidos clonados, mutagenizados, expresados por células huésped (Ness et al., 1999, Nature Biotechnology 17: 893-896). Moléculas de DNA mutagenizadas que codifican polipéptidos activos se pueden recuperar de las células huésped y secuenciar rápidamente

5 usando métodos estándar en la técnica. Estos métodos permiten la determinación rápida de la importancia de residuos de aminoácidos individuales en un polipéptido.

[0083) El número total de sustituciones de aminoacidos, deleciones yfo inserciones del polipéptido maduro de SEO ID NO:20 SEQ ID NO:4 noes mas del 20, por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 10 17, 18,19 o 20.

[0084) El polipéptido puede ser un polipéptido híbrido donde una porción de un polipéptido se fusiona en el Ntérmino o el C-término de una porción de otro polipéptido.

15 [0085) El polipéptido puede ser un polipéptido fusionado o polipéptido de fusión escindible donde otro polipéptido se fusiona en el N-término o el C-término del polipéptido de la presente invención. Un polipéptido fusionado se produce por la fusión de un polinucleótido que codifica otro polipéptido a un polinucleótido de la presente invención. Técnicas para producir polipéptidos de fusión se conocen en la técn ica , e incluyen la unión de las secuencias codificantes que codifican los polipéptidos de modo que éstas están en marco y que

20 la expresión del polipéptído fusionado esté bajo control del(los) mismo(s) promotor(es) y terminador. Proteínas de fusión también se pueden construir usando la tecnología de inteína donde se crean fusiones postraduccionalmente (Cooper et al., 1993, EMBO J. 12: 2575-2583; Dawson et al., 1994, Science 266: 776779).

25 [0086) Un polipéptido de fusión puede ademas comprender un sitio de escisión entre los dos polipéptidos. En la secreción de la proteína de fusión, el sitio es dividido liberando los dos polipéptidos. Ejemplos de sitios de escisión incluyen, pero de forma no limitativa, los sitios descritos en Martin et al., 2003, J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 3: 568-576; Svetina el al., 2000, J. Biolechnol. 76: 245-251; Rasmussen-Wilson el al., 1997, Appl. Environ. Microbiol. 63: 3488-3493; cuadra et al., 1995, Biotechnology 13: 498-503; y Contreras et al., 1991,

30 Biotechnology 9: 378-381; Eaton et al., 1986, Biochemistry 25: 505-512; Collins-Racie et al., 1995, Biotechnology 13: 982-987: Carter el al., 1989, Proleins: Slructure, Funclion, and Genelics 6: 240-248: y Stevens, 2003, Drug Discovery World 4: 35-48.

[0087) Las proteasas de la invención presentan propiedades de pH sorprendentes, especialmente estabilidad 35 de pH y propiedades de aclividad de pH, especialmente a valores de pH bajos, que las convierten en candidatos interesantes para usar en el pienso para animales y detergentes.

Formas de realización

40 [0088) En formas de realización determinadas de la invención, la proteasa de la invención muestra propiedades térmicas beneficiosas tal como termoestabilidad, estabilidad en vapor, etc yfo propiedades de pH, tal como estabilidad en ácido, pH óptimo, etc.

[0089) Una forma de realización de la invención es polipéptidos aislados que tienen actividad de proteasa 45 mejorada entre pH 4 Y 9, tal como entre pH 5 Y 8, tal como a pH 5, a pH 6, a pH 7 o a pH 8, a 25"C en comparación con proteasa 10R.

[0090) Una forma de realización adicional de la invención es actividad de proteasa mejorada en la harina de soja-maíz entre pH 3.0 Y 6.0 Y 40"C, tal como a pH 3.0, a pH 4.0, a pH 5.0 o a pH 6.0, en comparación con 50 proteasa 10R.

Propiedades de acidez/alcalinidad

[0091) En formas de realización determinadas de la invención la proteasa de la invención muestra pH con

55 respeclo a propiedades beneficiosas, tal corno estabilidad en ácido, pH óptimo, etc. La estabilidad de la proteasa a un pH bajo es beneficiosa ya que la proteasa puede tener actividad en el intestino después de pasar a través del estómago. En una forma de realización de la invención la proteasa retiene >95% de actividad después de 2 horas a pH 3 según se determina usando el método descrito en el ejemplo 3.

60 Termoestabilidad

[0092) Termoestabilidad se puede determinar como se describe en el ejemplo 6, es decir usando mediciones de OSC para determinar la temperatura de desnaturalización, Td, de la proteína de proteasa purificada. La Td es indicativa de la termoestabilidad de la proteína: a mayor Td, mayor termoestabilidad. Por consiguiente, en 65 una forma de realización preferida, la proteasa de la invención tiene una Td que es superior a la Td de una

proteasa de referencia, donde Td se determina en las muestras de proteasa purificada (preferiblemente con una pureza de al menos 90% o 95%, como se determina por SDS-PAGE).

[0093) En formas de realización preferidas, las propiedades térmicas tal como estabilidad térmica, estabilidad

5 de temperatura, termoestabilidad, estabilidad de vapor, yfo estabilidad de 9ranulación como está provista por la actividad residual, temperatura de desnaturalización Td, u otro parámetro de la proteasa de la invención es superior al valor correspondiente, como la actividad residual o Td, de la proteasa de SEQ ID NO:5, más preferiblemente al menos 101% de la misma, o al menos 102%, 103%, 104%, 105%, 106%, 107%, 108%, 109%, o al menos 110% de la misma. Aún más preferiblemente, el valor del parámetro, tal como actividad

10 residual o Td, de la proteasa de la invención es al menos 120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, o al menos 190% del valor para la proteasa de SEQ ID NO:5.

[0094) En todavía otras formas de realización particulares, la proteasa termoestable de la invención tiene una temperatura de fusión, Tm (o una temperatura de desnaturalización, Td), como se determina usando

15 calorimetria diferencial de barrido (DSC) como se describe en el ejemplo 10 (es decir en 20 mM de acetato sódico, pH 4.0), de al menos SOQC. En todavia otras formas de realización particulares, la T m es al menos 51 , 52, 53, 54, 55,56,57, 58, 59,60, 61 , 62, 63, 64,65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82,83,84,85,86, 87,88, 89,90,91,92,93,94,95, 96, 97, 98,99 o al menos 100QC.

20 Estabilidad en vapor

[0095) La estabilidad en vapor se puede determinar como se describe en el ejemplo 7 determinando la actividad residual de moléculas de proteasa después del tratamiento con vapor a 85QC o 90QC durante un periodo corto.

Estabilidad de granulación

[0096) La estabilidad de granulación se puede determinar como se describe en el ejemplo 8 usando granulado enzimático premezclado con pienso. Desde el mezclador el pienso se acondiciona con vapor a 30 95QC. Después de la preparación del pienso se prensa hasta gránulos y la actividad residual determinada.

Fuentes de polipéptidos con actividad de proteasa

[0097) Un polipéptido con actividad de proteasa de la presente invención se puede obtener de

35 microorganismos de cualquier género. Para fines de la presente invención, el término ·obtenido de" como se utiliza en este caso en relación con una fuente dada debe significar que el polipéptido codificado por un polinucleótido se produce por la fuente o por una cepa donde el pol inucleótido de la fuente ha sido insertado. En un aspecto, el polipéptido obtenido a partir de una fuente dada es secretado extracelularmente.

40 [0098) El polipéptido puede ser un pol ipéptido bacteriano. Por ejemplo, el polipéptido puede ser un polipéptido con actividad de proteasa a partir de una bacteria gram-positiva dentro de un filo tal como Aclinobacteria o a partir de una bacteria gram-negativa dentro de un filo tal como Proteobacteria.

[0099) En un aspecto, el polipéptido es una proteasa a partir de una bacteria de la clase Actinobacteria, tal 45 como del orden de los actinomicetales, o del suborden Propionibacterineae, o de la familia Nocardioidaceae,

o de los géneros Kribbella, Saccharomonospora, Saccharopolyspora; o Amycolatopsis.

[0100) Cepas de estos taxones son accesibles fácilmente al público en un número de colecciones de cultivo, tal como la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCG), Deutsche Sammlung van Mikroorganismen und 50 Zellkulturen GmbH (DSMZ), Centraalbureau Voor Schimmelcultures (CBS), y colección de cultivos para Patentes del Servicio de Investigación Agricola, Northem Regional Research Center (NRRL).

[0101) El polipéptido se puede identificar y obtener de otras fuentes incluyendo microorganismos aislados de la naturaleza (por ejemplo, suelo, abonos, agua, etc.) utilizando las sondas anteriormente mencionadas. 55 Técnicas para el aislamiento de microorganismos de hábitats naturales se conocen en la técnica. El polinucleótido que codifica el polipéptido puede luego ser obtenido por cribado de forma similar de una genoteca de cDNA o genómica de otro microorganismo o muestra de DNA mezclado. Una vez un polinucleótido que codifica un polipéptido ha sido detectado con la(s) sonda(s), el polinucleótido se puede aislar o clonar por la utilización de técnicas que son bien conocidas por los expertos en la materia (véase, por

60 ejemplo, Sambrook et al., 1989, supra).

Polinucleótidos

[0102) La presente invención también se refiere a polinucleótidos aislados que codifican un polipéptido de la 65 presente invención.

[0103) Las técnicas usadas para aislar o clonar un polinucle6tido que codifica un polipéptido se conocen en la técnica e incluyen aislamiento de DNA genómico, preparación de cONA, o una combinación de las mismas. La clonación de los polinucleótidos de tal DNA genómico puede ser efectuada, por ejemplo, usando la reacción en cadena de polimerasa (PCR) bien conocida o cribado de anticuerpos de bibliotecas de expresión

5 para detectar fragmentos de DNA clonados con características estructurales compartidas. Véase, por ejemplo, Innis et al., 1990, PCR: A Guide to Methods and Application, Academic Press, New York. Otros procedimientos de amplificación de ácido nucleico tal como reacción en cadena de la ligasa (LCR), transcripción activada por ligamiento (LAT) y amplificación basada en polinucleótidos (NASBA) pueden ser utilizados. Los polinucleótidos se pueden clonar a partir de una cepa de Kribbel1a, u otro u organismo relacionado a partir de los actinomicetales y así, por ejemplo, puede ser una variante alélica o de especies de la región codificante de polipéptidos del polinucleótido.

[0104) La presente invención también se refiere a polinucleótidos aislados que comprenden o consisten en polinucleótidos con un grado de identidad de secuencias a la secuencia codificante del polipéptido maduro de 15 SEO ID NO:1 o SEO ID NO:3 de al menos 86'%, al menos 90%, al menos 95'%, al menos 96%, al menos 970/0 , al menos 98%, al menos 99%, o 100%, que codifica un pOlipéptido con actividad de proteasa.

[0105) La modificación de un polinucleótido que codifica un polipéptido de la presente invención puede ser necesaria para la síntesis de polipéptidos sustancialmente similares al polipéptido. El término "sustancialmente similar" al polipéptido se refiere a formas que no se originan de forma natural del polipéptido. Estos polipéptidos pueden diferir en alguna via diseñada del polipéptido aislado de su fuente nativa, por ejemplo, variantes que difieren en la actividad específica, termoestabilidad, pH óptimo, o similar. La variante se puede construir basándose en el polinucleótido presentado como la secuencia codificante del polipéptido maduro de SEa ID NO:1 o SEa ID NO:3, por ejemplo, una subsecuencia de la misma, yfo por

25 introducción de sustituciones de nucleótidos que no suponen un cambio en la secuencia de aminoácidos del polipéptido, pero que corresponden al uso del codón del organismo huésped destinado para la producción de la enzima, o por introducción de sustituciones de nucleótidos que pueden dar lugar a una secuencia de aminoácidos diferente. Para una descripción general de sustitución de nucleótidos, véase, por ejemplo, Ford et al., 1991 , Protein Expression and Purification 2: 95-107.

[0106) La presente descripción también se refiere a polinucleótidos aislados que codifican polipéptidos de la presente invención, que se hibridan bajo condiciones de astringencia muy baja, condiciones de astringencia baja, condiciones de astringencia media, condiciones de astringencia media alta, condiciones de astringencia alta, o condiciones de astringencia muy alta con (i) la secuencia codificante del polipéptido maduro de SEO 35 ID NO:1 o SEO ID NO:3, (ii la secuencia de DNA genómico que comprende la secuencia codificante del polipéptido maduro de SEO ID NO:1 o SEO ID NO:3, o (iii) la cadena complementaria en toda su longitud de

(i) o (ii); o variantes alélicas y subsecuencias de las mismas (Sambrook et al., 1989, supra), tal y como se define aqui.

[0107) En un aspecto, el polinucleótido comprende o consiste en SEO ID NO:1 o SEO ID NO:3, la secuencia codificante del polipéptido maduro de SEO ID N.O: 1, o una subsecuencia de SEO ID NO:1 o SEa ID NO:3 que codifica un fragmento de SEa ID NO:2 o SEQ ID NO:4 que tiene actividad de proteasa, tal como el polinucleótido de nucleótidos 316 a 879 de SEO ID NO:1 o nucleótidos 316 a 882 SEQ ID NO:3.

45 Constructos de ácidos nucleicos

[0108) La presente invención también se refiere a constructos de ácidos nucleicos que comprenden un polinucleótido de la presente invención operativa mente enlazada a una o más (diferentes) secuencias de control que dirigen la expresión de la secuencia codificante en una célula huésped adecuada bajo condiciones compatibles con las secuencias de control.

[0109) Un polinucleótido se puede manipular en una variedad de vías para proveer la expresión del polipéptido. La manipulación del polinucleótido antes de la inserción en un vector puede ser deseable o necesaria dependiendo del vector de expresión. Las técnicas para modificar polinucleótidos utilizando

55 métodos de DNA recornbinante se conocen en la técnica.

[0110) La secuencia de control puede ser una secuencia de promotor, un polinucleótido que se reconoce por una célula huésped para la expresión de un polinucle6tido que codifica un polipéptido de la presente invención. La secuencia del promotor contiene secuencias de control transcripcionales que median la expresión del polipéptido. El promotor puede ser cualquier polinucleótido que muestra actividad transcripcional en la célula huésped de elección incluyendo promotores mutantes, truncados, e híbridos, y se pueden obtener de genes que codifican polipéptidos extracelulares o intracelulares bien homólogos o heterólogos a la célula huésped.

65 [0111) Ejemplos de promotores adecuados para dirigir la transcripción de los constructos de ácidos nucleicos de la presente invención en una célula huésped bacteriana son los promotores obtenidos del gen de alfa

ami lasa de Bacillus amy/o/iquefaciens (amyQ) , gen de alfa-amilasa de Bacillus /icheniformis (amyL ), gen de penicilinasa de Bacillus /ichenifonnis (penP) , gen de amilasa malto9énica de Bacillus stearothermophi/us (amyM), gen de levansucrasa de Bacillus subtilis (sacB), genes xylA y xylS de Bacillus subtilis, operón lac de

E. Goli, gen de agarasa de Streptomyces coe/ic%r (dagA ), y gen de beta-Iactamasa procariota (Villa

5 Kamaroff et al., 1978, Proc. Nat!. Acad. Sci. USA 75: 3727-3731), al igual que el promotor tac (DeSoer et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 21-25). Otros promotores son descritos en "Useful proteins from recombinant bacteria" en Gilbert et al., 1980, Scientific American, 242: 74-94; y en Sambrook et al., 1989,

supra.

[0112) Ejemplos de promotores adecuados para dirigir la transcripción de los constructos de ácidos nucleicos de la presente invención en una célula huésped fúngica filamentosa son promotores obtenidos de los genes para acetamidasa de Aspergillus nidu/ans, alfa-amilasa neutra de Aspergillus niger, alfa-amilasa estable en ácido de Aspergillus niger, glucoamilasa de Aspergillus niger o Aspergillus awamori (g/aA), TAKA amilasa de Aspergillus oryzae, proteasa alcalina de Aspergillus oryzae, triosa fosfato isomerasa de Aspergillus oryzae, 15 proteasa de tipo tripsina de Fusarium oxysporum (WO 96f00787l , amiloglucosidasa de Fusarium venenatum (WO 00f56900 ), Fusarium venenatum Daria (WO 00/56900), Fusarium venenatum Quinn (WO 00f56900), lipasa de Rhizomucor miehei, proteinasa aspártica de Rhizomucor miehei, beta-glucosidasa de Trichodenna reesei, celobiohidrolasa I de Trichodenna reesei, celobiohidrolasa 11 de Trichoderma reesei, endoglucanasa I de Trichodenna reesei, endoglucanasa 11 de Trichoderma reesei, endoglucanasa 111 de Trichodenna reesei, endoglucanasa IV de Trichoderma reesei, endoglucanasa V de Trichoderma reesei, xilanasa I de Trichoderma reesei, xilanasa 11 de Trichodenna reesei, beta-xilosidasa de Trichoderma reesei, al igual que el promotor NA2-tpi (un promotor modificado que incluye un gen que cod ifica una alfa-amilasa neutra en Aspergilli donde elllder no traducido ha sido sustituido por un líder no traducido de gen que cod ifica la triosa fosfato isomerasa en Aspergilli; ejemplos no limitativos incluyen promotores modificados con la alfa-amilasa

25 neutra en Aspergillus nigerdonde el lider no traducido ha sido sustituido por un líder no traducido del gen que codifica la triosa fosfato isomerasa en el Aspergillus nidulans o Aspergillus oryzae); y promotores mutantes, truncados, e híbridos de los mismos.

[0113) En un huésped de levadura, promotores útiles se obtienen de los genes para enolasa de Saccharomyces cerevisiae (ENO-1 l, galactocinasa de Saccharomyces cerevisiae (GAL 1 l, alcohol deshidrogenasa/gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa de Saccharomyces cerevisiae (ADH1 , aDH2JGAP l, triosa fosfato isomerasa de Saccharomyces cerevisiae (TPI), metalotioneína de Saccharomyces cerevisiae (CUP1), y quinasa de 3-fosfoglicerato de Saccharomyces cerevisiae. Otros promotores útiles para células huésped de levadura son descritos por Romanos et al., 1992, Yeast 8: 423-488.

35 [0114) La secuencia de control también puede ser una secuencia del terminador de la transcripción adecuada, que se reconoce por una célula huésped para terminar la transcripción. La secuencia terminadora está operativa mente enlazada al término 3' del polinucleótido que codifica el polipéptido. Cualquier terminador que es funcional en la célula huésped de elección se puede utilizar en la presente invención.

[0115) Terminadores preferidos para células huésped fúngicas filamentosas son obtenidos de los genes para antranilato sintasa de Aspergillus nidu/ans, glucoamilasa de Aspergillus niger, alfa-glucosidasa de Aspergillus niger, TAKA amilasa de Aspergillus oryzae, y proteasa de tipo tripsina de Fusarium oxysporum.

45 [0116) Terminadores preferidos para células huésped de levadura son obtenidos de los genes para enolasa de Saccharomyces cerevisiae, citocromo de Saccharomyces cerevisiae C (CYC1), y gliceraldehído-3-fosfatodeshidrogenasa de Saccharomyces cerevisiae. Otros terminadores útiles para células huésped de levadura son descritos por Romanos et al., 1992, supra.

[0117) La secuencia de control también puede ser una secuencia lider adecuada, cuando el transcrito está en una región no traducida de un RNAm que es importante para la traducción por la célula huésped. La secuencia líder está operativamente enlazada al término 5' del polinucleótido que codifica el polipéptido. Cualquier secuencia líder que es funcional en la célula huésped de elección puede ser utilizada.

55 [0118) Líderes preferidos para células huésped fúngicas filamentosas son obtenidos de los genes para TAKA ami lasa de Aspergillus oryzae y triosa fosfato isomerasa de Aspergillus nidu/ans.

[0119) Líderes adecuados para células huéspedes de levadura son obtenidos de los genes para enolasa de Saccharomyces cerevisiae (ENO-1), 3-fosfoglicerato quinasa de Saccharomyces cerevisiae, alfa-factor de Saccharomyces cerev/s/ae, y alcohol deshidrogenasa/gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa de Saccharomyces cerevisiae (ADH2/GAP).

[0120) La secuencia de control también puede ser una secuencia de poliadenilación, una secuencia operativamente enlazada al término 3' del polinucleótido y, cuando se transcribe, se reconoce por la célula 65 huésped como una señal para añad ir residuos de poliadenosina al mRNA transcrito. Cualquier secuencia de poliadenilación que es funcional en la célula huésped de elección puede ser utilizada.

[0121) Secuencias de poliadenilación preferidas para células huéspedes fún9icas filamentosas son obtenidas de los genes para T AKA amilasa de Aspergillus oryzae, glucoamilasa de Aspergillus niger, antranilato sintasa de Aspergillus nidulans, proteasa de lipo tripsina de Fusarium oxysporum, y alfa-glucosidasa de Aspergillus

5 niger.

[0122) Secuencias de poliadenilación útiles para células huéspedes de levadura son descritas por Guo y Sherman, 1995, Mol. Cellular Biol. 15: 5983-5990.

10 [0123) La secuencia de control también puede ser una región codificante del péptido señal que codifica un péptido señal enlazado al N-término de un polipéptido y dirige el polipéptido en la via secretora de la célula. El extremo 5' de la secuencia codificante del polinucleótido puede intrínsecamente contener una secuencia codificante del péptido señal naturalmente enlazado en el marco de lectura de traducción con el segmento de la secuencia codificante que codifica el polipéptido. Alternativamente, el extremo 5' de la secuencia

15 codificante puede contener una secuencia codificante del péptido señal que es exterior a la secuencia codificante. La secuencia codifican te del péptido señal exterior se puede requerir donde la secuencia codificante no contienen de forma natural una secuencia codificante del péptido señal. Alternativamente, la secuencia codificante del péptido señal foráneo puede sencillamente reemplazar la secuencia codificante del péptido señal natural para mejorar la secreción del polipéptido. Sin embargo, cualquier secuencia codificante

20 del péptido señal que dirige el polipéptido expresado en la via secretora de una célula huésped de elección puede ser utilizada.

[0124) Secuencias codificantes del péptido señal eficaces para células huésped bacterianas son las secuencias codificantes del péptido señal obtenidas de los genes para amilasa maltogénica de Bacillus NCIB

25 11837, subtilisina de Bacillus licheniformis, beta-lacia masa de Bacillus licheniformis, alfa-amilasa de Bacillus stearothermophilus, proteasas neutras de Bacillus stearothermophilus (nprT, nprS, nprM), y prsA de Bacillus subtilis. Otros péptidos señal son descritos por Simonen y Palva, 1993, Microbiological Reviews 57: 109-137.

[0125) Secuencias codificantes del péptido señal eficaces para células huésped fúngicas filamentosas son las

30 secuencias codificantes del péptido señal obtenidas a partir de los genes para amilasa neutra de Aspergillus niger, glucoamilasa de Aspergillus niger, TAKA amilasa de Aspergillus oryzae, celulasa de Humicola insoiens, endoglucanasa V de Humicola inso/ens, lipasa de Humicola lanuginosa, y proteinasa aspártica de Rhizomucor miehei.

35 [0126) Péptidos señal útiles para células huésped de levadura son obtenidos de los genes para alfa-factor de Saccharomyces cerevisiae e inverlasa de Saccharomyces cerevisiae. Otras secuencias codificantes del péptido señal útiles son descritas por Romanos et al. , 1992, supra.

[0127) La secuencia de control también puede ser una secuencia codificante del propéptido que codifica un

40 propéptido posicionado en el N-término de un polipéptido. El polipéptido resultante es conocido como una proenzima o propolipéptido (o un zimógeno en algunos casos). Un propolipéptido es inactivo generalmente y se puede convertir en un polipéptido activo por escisión catalítica o autocatalitica del propéptido a pa rtir del propolipéptido. La secuencia codificante del propéptido se puede obtener a partir los genes para proteasa alcalina de Bacillus subtilis (aprE), proteasa neutra de Bacillus subtilis (nprT), lacasa myceliophthora

45 thermophila (WO 95f33836), proteinasa aspártica de Rhizomucor miehei, y alfa-factor de Saccharomyces cerevisiae.

[0128) Cuando ambas secuencias de péptido señal y de propéptido están presentes en el N-término de un polipéptido, la secuencia de propéptido está situada junto al N-término de un polipéptido y la secuencia de 50 péptido señal está situada junto al N-término de la secuencia del propéptido.

[0129) También puede ser deseable añadir secuencias reguladoras que permiten la regulación de la expresión del polipéptido relativo al crecimiento de la célula huésped. Ejemplos de sistemas reguladores son aquellos que causan la expresión del gen que se debe activar o desactivar en respuesta a una sustancia 55 quimica o estimulo físico, con la presencia de un compuesto regulador. Sistemas reguladores en sistemas procariotas incluyen los sistemas de los operadores lac, tac, y trp. En la levadura, el sistema ADH2 o sistema GAL 1 puede ser utilizado. En hongos filamentosos, el promotor de glucoamilasa de Aspergillus niger, promotor de TAKA alfa-amilasa de Aspergillus oryzae, y promotor de glucoamilasa de Aspergillus aryzae puede ser utilizado. Otros ejemplos de secuencias reguladoras son aquellas que permiten la amplificación

60 génica. En sistemas eucarióticos, estas secuencias reguladoras incluyen el gen de dihidrofolato reductasa que se amplifica en presencia de metotrexato, y los genes de metalotioneína que se amplifican con metales pesados. En estos casos, el polinucleótido que codifica el polipéptido sería operativa mente enlazado con la secuencia reguladora.

65 Vectores de expresión [0130) La presente invención también se refiere a vectores de expresión recombinantes que comprenden un polinucleótido de la presente invención, un promotor, y señales de parada transcripcional y traduccional. Las distintas secuencias de nucleótidos y de control se pueden unir entre sí para producir un vector de expresión recombinante que puede incluir uno o más (varios) sitios de restricción convenientes para permitir la inserción

5 o sustitución del polinucleótido que codifica el polipéptido entales sitios. De forma alternativa, el polinucleótido se puede expresar por la inserción del polinucleótido o un constructo de ácidos nucleicos que comprende la secuencia en un vector apropiado para la expresión. En la creación del vector de expresión, la secuencia codificante se localiza en el vector de modo que la secuencia codificante es operativamente enlazada con las secuencias de control apropiadas para la expresión.

[0131) El vector de expresión recombinante puede ser cualquier vector (por ejemplo, un plásmido o virus) que puede ser convenientemente sometido a procedimientos de DNA recombinante y pueden provocar la expresión del polinucleótido. La elección del vector típicamente dependerá de la compatibilidad del vector con la célula huésped en que el vector debe ser introducido. El vector puede ser un plásmido lineal o circular

15 cerrado.

[0132) El vector puede ser un vector de replicación autónoma, es decir, un vector que existe como una entidad extracromosómica, cuya replicación es independiente de la replicación cromosómica, por ejemplo, un plásmido, un elemento exlracromosómico, un minicromosoma, o un cromosoma artificial. El vector puede contener cualquier medio para asegurar la autorreplicación. Alternativamente, el vector puede ser uno que, cuando se introduce en la célula huésped, se integra en el genoma y se replica con el{los) cromosoma{s) en el(los) que se ha integrado. Además, un único vector o plásmido o dos o más vectores o plásmidos que juntos contienen el DNA total que se debe introducir en el genoma de la célula huésped, o un transposón, puede ser util izado.

25 [0133) El vector contiene preferiblemente uno o más (varios) marcadores seleccionables que permiten la selección fácil de células transformadas, transfectadas, transducidas, o similares. Un marcador seleccionable es un gen cuyo producto proporciona resistencia biocida o vírica, resistencia a metales pesados, prolotrofía a auxótrofos, y similar.

[0134) Ejemplos de marcadores seleccionables bacterianos son los genes dal de Bacillus subtilis o Bacillus licheniformis, o marcadores que confieren resistencia a antibióticos tal como resistencia a la ampicilina, cloranfenicol, canamicina, o tetraciclina. Marcadores adecuados para células huésped de levadura son ADE2, HIS3, LEU2, LYS2, MET3, TRP1, Y URA3. Marcadores seleccionables para usar en una célula huésped

35 fúngica filamentosa incluyen, pero de forma no limitativa, amdS (acetamidasa), argB (orn itinacarbamoiltransferasa), bar (fosfonitricina acetiltransferasa), hph (higromicina fosfotransferasa), niaO (n itratoreductasa), pyrG (orotidina-5'-fosfato-descarboxilasa), se (sulfato adeniltransferasa), y trpe (antranilato sintasa), al igual que equivalentes de los mismos. Se prefieren para el uso en una célula de Aspergillus los genes amdS y pyrG de Aspergiflus nidulans o Aspergillus oryzae y el gen bar de Streptomyces hygroscopicus.

[0135) El vector contiene preferiblemente un(os) elemento(s) que permite(n) la integración del vector en el genoma de la célula huésped o replicación autónoma del vector en la célula independiente del genoma.

45 [0136) Para integración en el genoma de la célula huésped, el vector puede depender de la secuencia del polinucleótido que codifica el polipéptido o cualquier otro elemento del vector para integración en el genoma por recombinación homóloga o no homóloga. Alternativamente, el vector puede contener polinucleótidos adicionales para dirigir la integración por recombinación homóloga en el genoma de la célula huésped en una(s) ubicación(es) precisa(s) en el(los) cromosoma(s). Para aumentar la probabilidad de integración en una ubicación precisa, los elementos integracionales deberían contener un número suficiente de ácidos nucleicos, tal como 100 a 10.000 pares de bases, 400 a 10.000 pares de bases, y 800 a 10.000 pares de bases, que tienen un alto grado de identidad de secuencia a la secuencia objetivo correspondiente para mejorar la probabilidad de recombinación homóloga. Los elementos integracionales pueden ser cualquier secuencia que es homóloga a la secuencia objetivo en el genoma de la célula huésped. Además, los elementos

55 inlegracionales pueden ser polinucleólidos codificantes o no codificanles. Por olro lado, el vector se puede integrar en el genoma de la célula huésped por recombinación no homóloga.

[0137] Para replicación autónoma, el vector puede comprender además un origen de replicación que permite al vector replicarse de forma autónoma en la célula huésped en cuestión. El origen de replicación puede ser cualquier replicador delplásmido que media la replicación autónoma que funciona en una célula. El término "origen de replicación" o "replicador de plásmido" significa un polinucleótido que permite que un plásmido o vector se replique in vivo.

[0138) Ejemplos de orígenes bacterianos de replicación son los origenes de replicación de plásmidos 65 pBR322; pUC19; pACYC177, y pACYC184 que permiten la replicación en E. eoli, y pUB110; pE194; pTA1060, y pAMr..1 que permite la replicación en Bacillus.

[0139) Ejemplos de origenes de replicación para usar en una célula huésped de levadura son el origen de replicación de 2 micras, ARS1, ARS4, la combinación de ARS1 y CEN3, y la combinación de ARS4 y CEN6.

5 [0140) Ejemplos de orígenes de replicación útiles en una célula fúngica filamentosa son AMA1 y ANS1 (Gems et al., 1991, Gene 98: 61-67; Cullen et al., 1987, Nucleic Acids Res. 15: 9163-9175; WO 00f24883). Aislamiento del gen AMA1 y construcción de plasmidos o vectores que comprenden el gen que se puede realizar según los métodos descritos en WO 00f24883 .

[0141) Mas de una copia de un polinucleótido de la presente invención se puede insertar en una célula huésped para aumentar la producción de un polipéptido. Un aumento en el número de copias del polinucleótido puede ser obtenido por la integración de al menos una copia adicional de la secuencia en el genoma de la célula huésped o por la inclusión de un gen marcador seleccionable amplificable con el polinucleótido donde células que contienen copias amplificadas del gen marcador seleccionable, y por lo

15 tanto copias adicionales del polinucleótido, se pueden seleccionar por el cultivo de las células en presencia del agente seleccionable apropiado.

[0142) Los procedimientos usados para enlazar los elementos anteriormente descritos para construir los vectores de expresión recombinantes de la presente invención se conocen por un experto en la materia (véase, por ejemplo, Sambrook et al., 1989, supra).

Células huésped

[0143) La presente invención también se refiere a células huésped recombinantes, que comprenden un

25 polinucleótido de la presente invención operativa mente enlazada a una o mas (diferentes) secuencias de control que dirigen la producción de un polipéptido de la presente invención. Un constructo o vector que comprende un pOlinucleótido se introduce en una célula huésped de modo que el constructo o vector es mantenido como un integrante cromosómico o como un vector extracromosómico que se duplica como se ha descrito anteriormente. El término "célula huésped" abarca cualquier progenie de una célula madre que no es idéntica a la célula madre debido a mutaciones que ocurren durante la replicación. La elección de una célula huésped dependerá en gran parte del gen que codifica el polipéptido y su fuente .

[0144) La célula huésped puede ser cualquier célula útil en la producción recombinante de un polipéptido de la presente invención, por ejemplo, un procariota o un eucariota.

35 [0145) La célula huésped procariota puede ser cualquier bacteria gram-positiva o gram-negativa. Bacterias gram-positivas incluyen, pero de forma no limitativa, Bacillus, Brevibacillus, C/ostridium, Geobacillus, Lactobacillus, Lactococcus, Paenibacillus, y Streptomyces. Bacterias gram-negativas incluyen, pero de forma no limitativa E. Co/i, y Pseudomonas.

[0146) La célula huésped bacteriana puede ser cualqu ier célula de Bacilla/es incluidas, pero sin limitarse a, células de Bacillus amyloliquefaciens, Brevibacillus brevis, Bacillus circu/ans, Bacillus c/ausii, Bacillus coagu/ans, Bacillus /entus, Bacillus licheniformis, Geobacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis, y Bacillus thuringiensis.

45 [0147] La célula huésped bacteriana también puede ser cualquier célula de Streptomyces incluidas, pero sin limitarse a, células de Streptomyces achromogenes, Streptomyces avennitilis, Streptomyces cae/ic%r, Streptomyces griseus, y Streptomyces lividans.

[0148) La introducción de DNA en una célula de Bacillus puede, por ejemplo, ser efectuada por transformación de protoplastos (véase, por ejemplo, Chang y Cohen, 1979, Mol. Gen. Gene!. 168: 111-115), usando células competentes (véase, por ejemplo, Young y Spizizen, 1961 , J. Bacteriol. 81: 823-829, o Dubnau y Davidoff-Abelson, 1971 , J. Mol. Biol. 56: 209-221), por electroporación (véase, por ejemplo, Shigekawa y Dower, 1988, Biotechniques 6: 742-751 ), o por conjugación (véase, por ejemplo, Koehler y

55 Thorne, 1987, J. Bacteriol. 169: 5271-5278). La introducción de DNA en una célula de E. coli puede, por ejemplo, ser efectuada por transformación de protoplastos (véase, por ejemplo, Hanahan, 1983, J. Mol. Biol.

166: 557-580) o electroporación (véase, por ejemplo, Dower et al., 1988, Nucleic Acids Res. 16: 6127-6145). La introducción de DNA en una célula de Streptomyces puede, por ejemplo, ser efectuada por transformación de protoplasto y electroporaci6n (véase, por ejemplo, Gong el al., 2004, Folia Microbiol. (Praha) 49: 399-405), por conjugación (véase, por ejemplo, Mazodier et al., 1989, J. Bacteriol. 171: 3583-3585), o por transducción (véase, por ejemplo, Burke et al., 2001, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98: 6289-6294). La introducción de DNA en una célula de Pseudomonas puede, por ejemplo, ser efectuada por electroporación (véase, por ejemplo, Chai et al., 2006, J. Microbiol. Methods 64: 391-397) o por conjugación (véase, por ejemplo, Pinedo y Smets, 2005, App!. Environ. Microbio!. 71: 51-57). La introducción de DNA en una célula de Streptococcus puede,

65 por ejemplo, ser efectuada por competencia natural (véase, por ejemplo, Perry and Kuramitsu, 1981, Infect. Immun. 32: 1295-1297), por transformación de protoplasto (véase, por ejemplo, Cal! y Jollick, 1991, Microbios

68: 189-207, por electroporación (véase, por ejemplo, Buckley et al., 1999, Appl. Environ. Microbiol. 65: 38003804) o por conju9ación (véase, por ejemplo, Clewell, 1981, Microbiol. Rev. 45: 409-436). Sin embar90 ' cualquier método conocido en la técnica para la introducción de DNA en una célula huésped puede ser usado.

[0149) La célula huésped también puede ser una eucariota, tal como una célula de mamifero, insecto, planta,

o fúngica .

[0150) La célula huésped puede ser una célula fúngica. "Hongos" como se utiliza en este caso incluye los filos Ascomycota, Basidiomycota, Chytridiomycota, y ZY90mycota (como se define por Hawksworlh et al., en, Ainsworth and Bisby's Dictionary of The Fun9i, 8' edición, 1995, CAB International, University Press, Cambridge, UK) al igual que los Oomycota (como se cita en Hawksworth et al., 1995, supra " pagina 171) y todos los hongos mitospóricos (Hawksworth et al., 1995, supra).

[0151) La célula huésped fúngica puede ser una célula de levadura. "Levadura" como se utiliza en este caso incluye levadura ascoesporógena (Endomycetales), levadura basidioesporogénea, y levadura de los Fungi Imperlecti (Blastomicetos). Ya que la clasificación de levadura puede cambiar en el futuro, para los fines de esta invención, levadura debe ser definida como se describe en Biology and Activities of Yeast (Skinner, F.A., Passmore, S.M., and Davenport, R.R., eds, Soco App. Bacteriol. Symposium Series nO 9,1980).

[0152) La célula huésped de levadura puede ser una célula de Candida, Hansenula, Kluyveromyces, Pichia, Saccharomyces, Schizosaccharomyces, o Yarrowia tal como una célula de Kluyveromyces /actis, Saccharomyces carlsbergensis, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces diastaticus, Saccharomyces douglasii, Saccharomyces kluyveri, Saccharomyces norbensis, Saccharomyces oviformis, o Yarrowia /ipolytica.

[0153) La célula huésped fúngica puede ser una célula fúngica filamentosa. "Hongos filamentosos" incluyen todas las formas filamentosas de la subdivisión Eumycota y Oomycota (como definido por Hawksworth et al., 1995, supra). Los hongos filamentosos son generalmente caraclerizados por una pared micelial compuesta por quitina, celulosa, glucano, quitosano, manano, y otros polisacáridos complejos. Crecimiento vegetativo es por alargamiento hifal y el catabolismo de carbono es estrictamente aeróbico. En cambio, el crecimiento vegetativo por levaduras tal como Saccharomyces cerevisiae es por el injerto de un talo unicelular y el catabolismo de carbono puede ser fermentativo.

[0154) La célula huésped fúngica filamentosa puede ser una célula de Acremonium, Aspergillus, Aureobasidium, Bjerkandera, Ceriporiopsis, Chrysosporium, Coprinus, Corio/us, Cryptococcus, Filibasidium, Fusarium, Humicola, Magnaporthe, Mucor, Myceliophthora, Neocallímastix, Neurospora, Paecilomyces, Penicillium, Phanerochaete, Phlebia, Piromyces, Pleurotus, Schizophyllum, Talaromyces, Thermoascus, Thielavia, Tolypocladium, Trametes, o Trichoderma .

[0155) Por ejemplo, la célula huésped fúngica filamentosa puede ser una célula de Aspergil/us awamori, Aspergil/us foetidus , Aspergil/us fumigatus, Aspergillus japonicus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergil/us oryzae, Bjerkandera adusta, Ceriporiopsis aneirina, Ceriporiopsis caregiea, Ceriporiopsis gi/vescens, Ceriporiopsis pannocinta, Ceriporiopsis rivulosa, Ceriporiopsis subrufa, Ceriporiopsis subvermispora, Chrysosporium inops, Chrysosporium keratinophilum, Chrysosporium lucknowense, Chrysosporium merdarium, Chrysosporium pannico/a, Chrysosporium queens/andicum, Chrysosporium tropicum, Chrysosporium zonatum, Coprinus cinereus, Coriolus hirsutus, Fusarium bactridioides, Fusarium cerealis, Fusarium crookwellense, Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusarium negundi, Fusarium oxysporum, Fusarium reticulalum, Fusarium roseum, Fusarium sambucinum, Fusarium sarcochroum, Fusarium sporotrichioides, Fusarium su/phureum, Fusarium torulosum, Fusarium trichothecioides, Fusarium venenatum, Humico/a insolens, Humicola lanuginosa, Muror miehei, Myceliophthora thermophiJa, Neurospora crassa, Penicillíum purpurogenum, Phanerochaete chrysosporium, Phlebia radiata, Pleurotus eryngii, Thielavia terrestris, Trametes vil/osa, Trametes versicolor, Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei, o

Trichoderma viride.

[0156) Células fúngicas se pueden transformar por un proceso que implique formación de protoplastos, transformación de protoplastos, y regeneración de la pared celular en cierto modo conocido por se. Procedimientos adecuados para transformación de células huésped de Aspergillus y Trichoderma son descritas en EP 238023 Y Yellon el al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 1470-1474. Métodos adecuados para transformar las especies de Fusarium descritas por Malardier et al., 1989, Gene 78: 147-156, y WO 96fOO787 . Levadura se puede transformar utilizando los procedimientos descritos por Becker y Guarente, en Abelson, J.N. y Simon, M.I., editors, Guide to Veast Genetics and Molecular Biology, Methods in Enzymology, Volumen 194, pp 182-187, Academic Press, Inc., New York; Ito el al., 1983, J. Bacleriol. 153: 163; e Hinnen et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 1920.

Métodos de producción

[0157) La presente invención también se refiere a métodos de producción de un potipéptido de la presente invención, que comprende: (a) cultivo de una célula, que en su forma tipo salvaje produce el polipéptido, bajo

5 condiciones propicias para la producción del polipéptido; y (b) recuperación del polipéptido. En un aspecto preferido, la célula es del género Kribbella. En un aspecto más preferido, la célula es Kribbella solani o Kribbella aluminosa.

[0158) La presente invención también se refiere a métodos de producción de un polipéptido de la presente invención, que comprende: (a) cultivo de una célula huésped recombinante de la presente invención bajo las condiciones propicias para la producción del polipéptido; y (b) recuperación del polipéptido.

[0159) Las células huésped se cultivan en un medio nutritivo adecuado para la producción del polipéptido métodos de utilización bien conocidas en la técnica. Por ejemplo, la célula se puede cultivar por cultivo en

15 matraz de agitación, y fermentación a escala pequeña o a gran escala (incluidas las fermentaciones continuas, discontinuas, de lote alimentado, o en estado SÓlido) en los fermentadores de laboratorio o industriales realizados en un medio adecuado y bajo condiciones que permiten al polipéptido expresarse yfo aislarse. El cultivo tiene lugar en un medio nutritivo adecuado comprendiendo fuentes de nitrógeno y carbono y sales inorgánicas, usando procedimientos conocidos en la técnica. Medios adecuados están disponibles de proveedores comerciales o se pueden preparar según composiciones publicadas (por ejemplo, en catálogos de la American Type Culture CoUection). Si el polipéptido se segrega en el medio nutritivo, el polipéptido se puede recuperar directamente del medio. Si el polipéptido no es segregado, se puede recuperar de lisatos celulares.

25 [0160) El polipéptido se puede detectar utilizando métodos conocidos en la técnica que son específicos para los polipéptidos. Estos métodos de detección pueden incluir el uso de anticuerpos específicos, formación de un producto enzimático, o desaparición de un sustrato enzimático. Por ejemplo, un ensayo enzimático se puede utilizar para determinar la actividad del polipéptido.

[0161) El polipéptido se puede recuperar utilizando métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, el pOlipéptido se puede recuperar del medio nutritivo por procedimientos convencionales que incluyen, pero sin limitarse a, centrifugación, filtración, extracción, secado por pulverización, evaporación, o precipitación.

[0162) El polipéptido se puede purificar por una variedad de procedimientos conocidos en la técnica incluida,

35 pero sin limitarse a, cromatografía (por ejemplo, intercambio iónico, afinidad, hidrofóbico Cfomatoenfoque, y exclusión por tamaños), procedimientos electroforéticos (por ejemplo, isoelectroenfoque preparativo), solubilidad diferencial (por ejemplo, precipitación de sulfato amónico), SDS-PAGE, o extracción (véase, por ejemplo, Protein Purification, J.-C. Janson y Lars Ryden, editors, VCH Publishers, New York, 1989) para obtener pOlipéptidos sustancialmente puros.

[0163) En un aspecto alternativo, el polipéptido no es recuperado, sino que preferiblemente una célula huésped de la presente invención que expresa un polipéptido se usa como una fuente del polipéptido.

Plantas

45 [0164) La presente descripción también se refiere a plantas, por ejemplo, una planta transgénica, parte de la planta, o célula vegetal, que incluye un polinucleótido aislado de la presente invención para expresar y producír el polipéptido en cantidades recuperables. El polipéptido se puede recuperar de la planta o parte de la planta. Alternativamente, la planta o parte de la planta con el polipéptido se puede utilizar como tal para mejorar la calidad de un alimento o pienso, por ejemplo, mejorando el valor nutricional, palatabilidad, y propiedades reológicas, o para destruir un factor antinutritivo.

[0165) La planta transgénica puede ser dicotiledónea (una dicot) o monocotiledónea (una monocot). Ejemplos de plantas monacal son hierbas, tales como poa de prados (pasto azul, Poa), hierba forrajera tal como

55 Festuca, Lolium, césped templado, tal corno Agroslis, y cereales, por ejemplo, trigo, avena, centeno, cebada, arroz, sorgo, y maíz (grano).

[0166) Ejemplos de plantas dicotiledóneas son tabaco, legumbres, tales como altramuces, patata, remolacha azucarera, guisante, judía y soja, y plantas crucíferas (familia Brassicaceae), tal como coliflor, semilla de colza, y el organismo modelo Arabidopsis thaliana relacionado de forma cercana.

[0167) Ejemplos de partes de plantas son tailo, callo, hojas, raíz, frutas, semillas, y tubérculos al igual que los tejidos individuales que comprenden estas partes, por ejemplo, epidermis, mesofllo, parénquima, tejidos vasculares, meristemas. Compartimentos de células vegetales específicas, tales como cloroplastos, 65 apoplastos, mitocondria, vacuolas, peroxisomas y citoplasma son también considerados una parte de la planta. Además, cualquier célula vegetal, cualquiera que sea el origen del tejido, se considera una parte de la

planta. Asimismo, partes de la planta tales como tejidos específicos y células aisladas para facilitar la utilización de la invención son también consideradas partes de la planta, por ejemplo, embriones, endospermas, aleurona y revestimientos de semillas.

5 [0168) También dentro del campo de la presente descripción está la pr0genie de tales plantas, partes de la planta, y células vegetales.

[0169) La planta transgénica o célula vegetal que expresa un polipéptido se puede construir conforme a métodos conocidos en la técnica. En resumen, la planta o célula vegetal se construye por la incorporación de uno o más (varios) constructos de expresión que codifican un polipéptido en el genoma del huésped de la planta o genoma de cloroplasto y propagando la planta modificada resultante o célula vegetal en una planta transgén ica o célula vegetal.

[0170) El constructo de expresión es convenientemente un constructo de acidos nucleicos que comprende un

15 polinucleótido que codifica un polipéptido operativamente enlazado con secuencias reguladoras apropiadas requeridas para la expresión del polinucleótido en la planta o parte de la planta de elección. Además, el constructo de expresión puede comprender un marcador seleccionable útil para la identificación de células huésped en las que el constructo de expresión ha sido integrado y las secuencias de DNA necesarias para la introducción del constructo en la planta en cuestión (la última depende del método de introducción de DNA para ser usado).

[0171) La elección de secuencias reguladoras, tales como secuencias del promotor y terminador y opcionalmente secuencias señalo de tránsito, se determina, por ejemplo, basándose en cuándo, dónde, y cómo se desea que el polipéptido sea expresado. Por ejemplo, la expresión del gen que codifica un

25 polipéptido puede ser constitutiva o inducible, o puede estar en fase de desarrollo o ser especifica del tejido, y el producto génico puede ser dirigido a un tejido especifico o parte de la planta tal como semillas u hojas. Secuencias reguladoras son, por ejemplo, descritas por Tague et al., 1988, Plant Physiology 86: 506.

[0172) Para expresión constitutiva, el promotor 35S-CaMV, de ubiquitina-1 de maiz, y de actina 1 de arroz se pueden utilizar (Franck et al., 1980, Cell 21: 285-294; Christensen et al., 1992, Plant Mol. Biol. 18: 675-689; Zhang et al., 1991, Plant Ce113: 1155-1165). Promotores especificos de un 6rgano pueden ser, por ejemplo, un promotor de tejidos sumidero de almacenamiento tales como semillas, tubérculos de patata, y frutas (Edwards y Coruzzi, 1990, Ann. Rev. Gene!. 24: 275-303), o de tejidos sumidero metabólicos tales como meristemas (110 et al., 1994, Plant Mol. Biol. 24: 863-878), un promotor especifico de la semilla como el 35 promotor de glutelina, prolamina, globulina, o de albúmina de arroz (Wu et al., 1998, Plant Cell Physiol. 39: 885-889), un promotor de Vicia faba de la legúmina 84 y el gen de proteína de semilla desconocida de Vicia faba (Conrad et al., 1998, J. Plant Physiol. 152: 708-711), un promotor de una proteína del cuerpo de aceite de semilla (Chen et al., 1998, Plant Cell Physiol. 39: 935-941), el promotor napA de proteina de almacenamiento de Brassica napus, o cualquier otro promotor específico de semilla conocido en la técnica, por ejemplo, como se describe en WO 91/14772. Ademas, el promotor puede ser un promotor específico de la hoja tal como el promotor rbes de arroz o tomate (Kyozuka et al., 1993, Plant Physiol. 102: 991-1000), el promotor del gen de adenina metillransferasa del virus chlorella (Mitra y Higgins, 1994, Plant Mol. Biol. 26: 85-93), el promotor del gen aldP de arroz (Kagaya et al., 1995, Mol. Gen. Gene!. 248: 668-674), o un promotor inducible de herida como el promotor pin2 de patata (Xu et al., 1993, Plant Mol. Biol. 22: 573-588).

45 Asimismo, el promotor puede ser inducible por tratamientos abióticos tales como temperatura, sequía, o alteraciones en la salinidad o inducidas por sustancias aplicadas exógenamente que activan el promotor, por ejemplo, etanol, estrógenos, hormonas vegetales tales como etileno, ácido abscísico, yacido giberélico, y metales pesados.

[0173) Un elemento intensificador del promotor también se puede usar para consegu ir expresión más alta de un polipéptido en la planta. Por ejemplo, el elemento intensificador del promotor puede ser un intrón que es colocado entre el promotor y el polinucleótido que codifica un polipéptido. Por ejemplo, Xu et al., 1993, supra, revelan el uso del primer intrón del gen de actina 1 de arroz para mejorar la expresión.

55 [0174) El gen marcador seleccionable y cualqu iera de las otras partes del constructo de expresión se pueden elegir de aquellas disponibles en la técnica.

[0175) El constructo de ácidos nucleicos se incorpora en el genoma de la planta según técnicas convencionales conocidas en la técnica, incluyendo transformación mediada por Agrobacterium, transformación mediada por virus, microinyección, bombardeo de partículas, transformación biolística, y electroporación (Gasser et al., 1990, Science 244: 1293; Potrykus, 1990, BiofTechnology 8: 535; Shimamoto et al., 1989, Nature 338: 274).

[0176) Actualmente, la transferencia de genes mediada por de Agrobacterium tumefaciens es el método de 65 elección para generar dicotiledóneas transgénicas (para una revisión, véase Hooykas y Schilperoort, 1992, Plant Mol. Biol. 19: 15-38) y también pueden usarse para la transfomación de monocotiledóneas, aunque otros métodos de transformación son frecuentemente usados para estas plantas. Actualmente, el método de elección para generar monocotiledóneas trans9énicas es bombardeo de particulas (oro microscópico o partículas de tungsteno recubiertas con el DNA transformanle) de callos embriogénicos o embriones en desarrollo (Christou, 1992, Plant J. 2: 275-281; Shimamoto, 1994, Curr. Opino Biolechnol. 5: 158-162; Vasil el 5 al., 1992, BiofTechnology 10: 667-674). Un método alternativo para transformación de monocotiledóneas se basa en transformación de protoplasto como se describe por Omirulleh et al., 1993, Pla nt Mol. Biol. 21: 415

428. Métodos de transformación adicionales para uso conforme a la presente descripción incluyen aquellas descritas en las patentes estadounidenses Nos. 6,395,966 y 7,151,204.

[0177) Después de la transformación, los transformantes que han incorporado el constructo de expresión se seleccionan y regeneran en plantas enteras según métodos bien conocidos en la técnica. frecuentemente el procedimiento de transformación se diseña para la eliminación selectiva de genes de selección bien durante la regeneración o en las siguientes generaciones usando, por ejemplo, cotransformación con dos constructos de T-DNA separados o escisión especifica del sitio del gen de selección por una recombinasa especifica.

[0178) Ademas de dirigir la transformación de un genotipo de planta particular con un constructo preparado según la presente invención, las plantas tra nsgénicas pueden ser hechas cruzando una planta que tiene el constructo con una segunda planta que carece del constructo. Por ejemplo, un constructo que codifica un pOlipéptido se puede introducir en una variedad de plantas particular por cruzamiento, sin la necesidad de transformar siempre directamente una planta de esta variedad dada. Por lo tanto, la presente descripción abarca no solo una planta directamente regenerada de células que han sido transformadas conforme a la presente descripción, sino también la progenie de tales plantas. Como se utiliza en este caso, progenie puede referirse a la descendencia de cualquier generación de una planta progenitora preparada conforme a la presente descripción. Tal progenie puede incluir un constructo de DNA preparado conforme a la presente

25 descripción, o una porción de un constructo de DNA preparado conforme a la presente descripción. El cruzamiento resulta en la introducción de un transgen en una linea de planta por polinización cruzada de una linea de partida con una línea de planta donadora. Ejemplos no limitativos de tales etapas son ademas articuladas en la patente estadounidense No: 7,151,204.

[0179) Plantas se pueden generar a través de un proceso de conversión retrocruzado. Por ejemplo, las plantas incluyen plantas referidas como un genotipo, línea, consanguíneo, ° híbrido convertido por retrocruzamiento.

[0180) Marcadores genéticos se pueden utilizar para asistir en la introgresión de uno o más transgenes de la

35 invención de un contexto genético en otro. La selección asistida por marcador ofrece ventajas con respecto al cultivo convencional en cuanto a que se puede usar para evitar errores provocados por variaciones fenotipicas. Además, marcadores genéticos pueden proporcionar datos con respecto al grado relativo de germoplasma de élite en la progenie individual de un cruzamiento particular. Por ejemplo, cuando una planta con una característica deseada que de otro modo tiene un contexto genético no deseable agronómica mente se cruza con un progenitor de élite, marcadores genéticos se pueden utilizar para seleccionar la progenie Que no solo posee la característica de interés, sino que también tiene una proporción relativamente grande del germoplasma deseado. De esta manera, el número de generaciones requeridas para la introgresión de uno o más rasgos en un contexto genético particular es minimizado.

45 [0181) La presente descripción también se refiere a métodos de producción de un polipéptido de la presente invención que comprende: (a) cultivo de una planta transgénica o una célula vegetal que comprende un polinucleótido que codifica el polipéptido bajo condiciones propicias para la producción del polipéptido; y (b) recuperación del polipéptido.

Composiciones

[0182) La presente invención tamb ién se refiere a composiciones que comprenden una proteasa de la presente invención. Preferiblemente, las composiciones se enriquecen con tal proteasa. El término "enriquecido" indica que la actividad de proteasa de la composición ha sido aumentada, por ejemplo, con un

55 factor de enriquecimiento de al menos 1.1 .

[0183) La composición puede comprender una proteasa de la presente invención como el componente enzimatico principal, por ejemplo, una composición monocomponente. Alternativamente, la composición puede comprender actividades enzimaticas múltiples, tales como una aminopeptidasa, amilasa, carbohidrasa, carboxipeptidasa, catalasa, celulasa, quitinasa, cutinasa, glicosiltransferasa de ciclodextrina, desoxiribonucleasa, esterasa, alfa-galactosidasa, beta-galactosidasa, glucoamilasa, alfa-glucosidasa, betaglucosidasa, haloperoxidasa, invertasa, lacasa, lipasa, manosidasa, oxidasa, enzima pectinolitica, peptidoglutaminasa, peroxidasa, fitasa, polifenoloxidasa, enzima proteolitica, ribonucleasa, transglutaminasa,

o xilanasa. La(s) enzima(s) adicional(es) puede(n) ser producida(s), por ejemplo, por microorganismos tales

65 como bacterias u hongos o por plantas o por animales. Las composiciones se pueden preparar conforme a métodos conocidos en la técnica y pueden estar en forma de un liquido o una composición seca. Por

ejemplo, la composición puede estar en la forma de un granulado o un microgranulado. La proteasa se puede estabilizar conforme a métodos conocidos en la técnica.

Usos

[0184) La presente invención está también dirigida a métodos para utilizar los polipéptidos que tienen actividad de proteasa, o composiciones de las mismas.

Pienso para animales

[0185) La presente invención está también dirigida a métodos para utilizar las proteasas con actividad de proteasa en el pienso para animales, al igual que a suministrar composiciones y aditivos alimenticios comprendiendo las proteasas de la invención.

15 [0186) El término animal incluye todos los animales, incluidos los seres humanos. Ejemplos de animales son no rumiantes, y rumiantes. Animales rumiantes incluyen, por ejemplo, animales tales como oveja, cabras, y ganado bovino, por ejemplo ganado bovino para carne, vacas, y terneros jóvenes. En una forrna de realización particular, el animal es un animal no rurniante. Animales no rumiantes incluyen animales monogástricos, por ejemplo cerdos o puercos (incluidos, pero sin limitarse a, lechones, cerdos en

20 crecimiento, y cerdas); aves tales como pavos, patos y pollo (incluidos pero sin limitarse a pollos para asar, ponedoras); caballos (incluidos pero sin lirnitarse a, de sangre caliente, de sangre fria y mestizos), terneros jóvenes; y pescado (incluido pero sin limitarse a salmón, trucha, tilapia, siluro y carpas; y crustáceos (incluidos pero sin limitarse a langostinos y gambas).

25 [0187] El término pienso o composición de pienso significa cualquier compuesto, preparación, mezcla, o cornposición adecuada para, o destinada para la ingesta por un anirnal.

[0188) En el uso según la invención la proteasa se puede alimentar al animal antes, después, o simultánearnente con la dieta. Lo último es preferido.

[0189) En una forma de realizaci6n particular, la proteasa, en la forma en la que se añade al pienso, o cuando se incluye en un aditivo de pienso, es bien definida. Bien definido significa que la preparación de proteasa es al rnenos 50% puro como se determina por crornatografia de exclusión por tarnaños (véase ejernplo 12 de WQ 01/58275). En otras forrnas de realización particulares la preparación de proteasa es al menos 60, 70,

35 80, 85,88,90, 92, 94, o al menos 95% pura como se determina por este método.

[0190) Una preparación de proteasa bien definida es ventajosa. Por ejernplo, es rnucho rnás fácil adrninistrar la dosis correctarnente al pienso de una proteasa que está libre esencialrnente de interferir o contarninar otras proteasas. El término administrar la dosis correctamente se refiere en particular al objetivo de obtener los

40 resultados consistentes y constantes, y la capacidad de optimizar la dosificación dependiendo del efecto deseado.

[0191) Para el uso en el pienso para animales, sin embargo, la proteasa no necesita ser pura; puede por ejemplo incluir otras enzimas, en cuyo caso podria denominarse una preparación de proteasa.

45 [0192) La preparación de proteasa puede ser (a) añadida directamente al pienso (o usada directamente en un proceso de tratarniento de proteína), o (b) se puede usar en la producción de una o más composiciones intermedias tales como aditivos alirnenticios o prernezclas que es posteriormente añadida al pienso (o usada en un proceso de tratamiento). El grado de pureza anteriormente descrito se refiere a la pureza de la 50 preparación de proteasa original, si se usa según (a) o (b) arriba.

[0193) Las preparaciones de proteasa con purezas de este orden de magnitud son en particular obtenibles usando métodos recombinantes de producción, aunque no se obtienen tan fácilmente y también se someten a una variación entre lotes mucho más alta cuando la proteasa se produce por métodos de fermentación

55 tradicionales.

[0194) Tal preparación de proteasa puede por supuesto mezclarse con otras enzimas.

[0195) la proteina puede ser una proteina animal, tal como harina de carne y de huesos, harina de plumas, 60 ylo harina de pescado; o puede ser una proteína vegetal.

[0196) El término proteínas vegetales como se utiliza en este caso se refiere a cualquier compuesto, composición, preparación o mezcla que incluye al menos una proteina derivada de u originada de un vegetal, incluidas proteinas modificadas y derivados de proteina. En formas de realización particulares, el contenido

65 de proteina de las proteínas vegetales es al rnenos 10, 20, 30, 40, 50, o 60% (p/p).

[0197] Proteínas vegetales se pueden derivar de fuentes de proteína vegetal, tales como leguminosas y cereales, por ejemplo materiales de plantas de las familias Fabaceae (Leguminosae), Cruciferaceae, Chenopodiaceae, y Poaceae, tal como harina de soja, harina de lupino y harina de semilla de colza.

5 [0198) En una forma de realización particular, la fuente de proteína vegetal es material de una o más plantas de la familia Fabaceae, por ejemplo soja, altramuz, guisante, o judía.

[0199) En otra forma de realización particular, la fuente de proteína vegetal es material de una o más plantas de la familia Chenopodiaceae, por ejemplo remolacha, remolacha azucarera, espinaca o quinoa.

[0200) Otros ejemplos de fuentes de proteínas vegetales son semilla de colza , semilla de girasol , semilla de algodón, y repollo.

[0201) La soja es una fuente de proteína vegetal preferida.

[0202) Otros ejemplos de fuentes de proteínas vegetales son cereales tales como cebada, trigo, centeno, avena, maíz (grano), arroz, triticale, y sorgo.

[0203) En una forma de realización particular de un proceso de tratamiento la proteasa(s) en cuestión está afectando (o actuando en, o ejerciendo su hidrolización o degradando influencia en) las proteínas, tales como proteínas vegetales o fuentes de proteína. Para conseguir esto, la proteína o fuente de proteína es típicamente suspendida en un solvente, por ejemplo un solvente acuoso tal como agua, y los valores de pH y de temperatura son ajustados prestando la debida consideración a las características de la enzima en cuestión. Por ejemplo, el tratamiento puede ocurrir a un valor de pH en el que la actividad de la proteasa real

25 es al menos 5%, 10%, 200!o, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, o al menos 90%. Asimismo, por ejemplo, el tratamiento puede ocurrir a una temperatura en la que la actividad de la proteasa real es al menos 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, o al menos 90%. Las indicaciones de porcentaje de actividad anteriores son relativas a las actividades máximas. La reacción enzimática es continuada hasta que el resultado deseado es conseguida, tras lo cual éste puede o no puede ser detenido por inactivación de la enzima, por ejemplo por un paso de tratamiento térmico.

[0204) En otra forma de realización particular de un proceso de tratamiento de la invención, la acción de la proteasa es prolongada, lo que significa por ejemplo que la proteasa se añade a las proteínas, pero su innuencia de hidrolización por así decirlo no es accionada hasta más tarde cuando se desea, una vez que las

35 condiciones de hidrolización son establecidas, o una vez que cualquier inhibidor enzimático es inactivado, o cualquier otro medio podría haber sido aplicado para posponer la acción de la enzima.

[0205) En una forma de realización del tratamiento es un pretratamiento de pienso para animales o proteínas para usar en el pienso para animales, es decir las proteínas son hidrolizadas antes de la ingesta.

[0206) El término mejora del valor nutricional de un pienso para animales significa que mejora la disponibilidad de nutrientes en el pienso. En esta invención la mejora de los valores nutricionales se refiere en particular a la mejora de la disponibilidad de la fracción de proteína del pienso, conduciendo así a la extracción de proteína aumentada, rendimientos de proteína más altos, y/o utilización de proteínas

45 mejoradas. Cuando se aumenta el valor nutricional del pienso, la digestibilidad de la proteína y/o del aminoácido aumenta y el índice de crecimiento y/o aumento de peso y{o conversión de pienso (es decir el peso de pienso ingerido con respecto al aumento de peso) del animal puede ser mejorada.

[0207] La proteasa se puede añadir al pienso en cualquier forma, sea una proteasa relativamente pura, o en mezcla con otros componentes destinados para la adición al pienso para animales, es decir en forma de aditivos de pienso para animales, tales como las denominadas premezclas para pienso para animales.

[0208) En otro aspecto la presente invención se refiere a composiciones para usar en el pienso para animales, tal como pienso para animales, y aditivos de pienso, por ejemplo premezclas.

55 [0209) Aparte de la proteasa de la invención, los aditivos de pienso para animales de la invención contienen al menos una vitamina liposoluble, y/o al menos una vitamina soluble en agua, y/o al menos un oligoelemento, y{o al menos un macromineral.

[0210) Además, ingredientes de aditivos de pienso opcionales, son agentes colorantes, por ejemplo carotenoides tales como beta-caroteno, astaxantina, y luteína; estabilizadores; aditivos de mejora del crecimiento y compuestos{aromatizantes de aroma, por ejemplo creosol, anetol, deca, undeca-yfo dodecalaclonas, iononas, irona, gingerol, piperidina, flálido de propilideno, ftálido de butilideno, capsaicina y{o tanino; péptidos antimicrobianos; ácidos grasos poliinsaturados (PUF A); especies generadoras de oxígeno 65 reactivo; también, un soporte se puede utilizar que puede contener, por ejemplo, 40-50% en peso de fibras de madera, 8-10% en peso de estearina, 4-5% en peso de polvo de cúrcuma, 4-58% en peso de polvo de

romero, 22-28% en peso de piedra caliza, 1-3% en peso de una goma, tal como goma arábiga, 5-50% en peso de azúcar yfo almidón y 5-15% en peso de agua.

[0211) Un pienso o un aditivo de pienso de la invención también puede comprender al menos otra enzima

5 seleccionada de entre titasa (EC 3.1.3.8 o 3.1.3.26); xilanasa (EC 3.2.1.8); galactanasa (EC 3.2.1.89); alfagalactosidasa (EC 3.2.1.22); otra proteasa (EC 3.4), fosfolipasa A1 (EC 3.1.1.32); fosfolipasa A2 (EC 3.1.1.4); lisofosfolipasa (EC 3.1.1 .5); fosfolipasa C (3.1.4.3); fosfolipasa D (EC 3.1.4.4); amilasa tal como, por ejemplo, alfa-amilasa (EC 3.2.1 .1) yfo beta-glucanasa (EC 3.2.1 .4 o EC 3.2.1.6).

[0212) En una forma de realización particular estas otras enzimas son bien definidas (como se define arriba para preparaciones de proteasa).

[0213) Ejemplos de péptidos antimicrobianos (AMP) son CAP18, Leucocina A, Tritrpticina, Protegrina-1, Tanatina, defensina, lactoferrina, lactoferricina, y ovispirina tal como novispirina (Robert Lehrer, 2000), 15 plectasinas, y esta tinas, incluidos los compuestos y polipéptidos descritos en WQ 03f044049 y WQ 03f048148, al igual que variantes o fragmentos de los anteriores que retienen actividad antimicrobiana.

[0214) Ejemplos de polipéptidos antifúngicos (AFP) son el Aspergillus giganteus, y péptidos de Aspergillus niger, al igual que variantes y fragmentos del mismo que retienen actividad antifúngica, como se describe en WQ 94/01459 y WO 02f090384.

[0215) Ejemplos de ácidos grasos poliinsaturados son ácidos grasos poliinsaturados C18, C20 y C22, tales como ácido araquidónico, ácido docosahexaenoico, ácido eicosapentanoico y ácido gamma-linolénico.

25 [0216) Ejemplos de especies generadoras de oxígeno reactivo son productos químicos tales como perborato, persulfato, o percarbonato; y enzimas tales como una oxidasa, una oxigenasa o una sintetasa.

[0217) Por lo general vitaminas hidrosolubles y liposolubles, al igual que oligoelementos forman parte de una denominada premezcla destinada a la adición al pienso, mientras que macrominerales son normalmente añadidos separadamente al pienso. Cualquiera de estos tipos de composición, cuando se enriquecen con una proteasa de la invención, es un aditivo de pienso de la invención.

[0218) En una forma de realización particular, el aditivo de pienso de la invención se destina a ser incluido (o prescrito como teniendo que ser incluido) en dietas para animales o pienso a niveles de 0,01 a 10,0%; más

35 particularmente 0,05 a 5,0%; o 0,2 a 1,0% (% significa g de aditivo por 100 g pienso). Esto es así en particular para premezclas.

[0219) Las siguientes son listas no exclusivas de ejemplos de estos componentes:

Ejemplos de vitaminas liposolubles son vitamina A, vitamina 03, vitamina E, y vitamina K, por ejemplo vitamina K3.

[0220) Ejemplos de vitaminas hidrosolubles son vitamina B12, biotina y colina, vitamina B1, vitamina B2, vitamina B6, niacina, ácido fólico y pantotenato, por ejemplo Ca-D-pantotenato.

[0221) Ejemplos de oligoelementos son manganeso, zinc, hierro, cobre, yodo, selenio, y coballo.

[0222) Ejemplos de macrominerales son calcio, fósforo y sodio.

[0223) Los requisitos nutricionales de estos componentes (ejemplificados con aves y lechones/cerdos) se enumeran en la tabla A de WO 01158275. Requ isito nutricional significa que estos componentes deberían ser proporcionados en la dieta en las concentraciones indicadas.

[0224) En la alternativa, el aditivo de pienso de la invención comprende al menos uno de los componentes

55 individuales especificados en la tabla A de WO 01158275. Al menos uno significa cualquiera de, uno o más de, uno, o dos, o tres, o cuatro etcétera hasta los trece, o hasta los quince componentes individuales. Más específicamente, este al menos un componente individual se incluye en el aditivo de la invención en tal cantidad como para proporcionar una concentración en pienso en la gama indicada en la columna cuatro, o columna cinco, o columna seis de tabla A.

[0225) En una otra forma de realización adicional, el aditivo de pienso de la invención comprende al menos una de las vitaminas siguientes, preferiblemente para proporcionar una concentración en pienso en los rangos específicados en la siguiente tabla 1 (para dietas de lechón, y dietas de pollos de engorde, respectivamente).

Tabla 1: recomendaciones de vitaminas típicas

Vitamina

Dieta de lechón Dieta de pollo de en90rde

Vitamina A

10,000-15,000 Ullkg pienso 8-12,500 UI/kg pienso

Vitamina 03

1800-2000 UIIk ienso 3000-5000 UI/k ienso

Vitamina E

60-100 mgfkg pienso 150-240 mgfkg pienso

Vitamina K3

2-4 m fk ienso 2-4 m Ik ienso

Vitamina B1

2-4 m /k ienso 2-3 m fk ienso

Vitamina B2

6-10 mglkg pienso 7-9 mg/kg pienso

Vitamina B6

4-8 m /k ienso 3-6 m Ik ienso

Vitamina B12

0,03-0,05 m /k ienso 0,015-0,04 m /k ienso

Niacina vitamina B3)

30-50 mq/kq pienso 50-80 mqlkq pienso

Acido pantoténico

20-40 mg/kg pienso 10-18 mgfkg pienso

cido fólico

1-2 m /k ienso 1-2 m fk ienso

Biotina

O 15-0 4 mq/kq de pienso O 15-0 3 mqfkq de pienso

Cloruro de colina

200-400 mg/kg de pienso 300-600 mgfkg de pienso

5

[0226) La presente invención también se refiere a composiciones de pienso para an imales. Composiciones de pienso para animales o dietas tienen un contenido relativamente alto de proteina. Aves y dietas de cerdo se pueden caracterizar como se indica en la tabla B de WO 01158275 , columnas 2-3. Dietas de pescado se pueden caracterizar como se indica en la columna 4 de esta tabla B. Además ta les dietas de pescado normalmente tienen un contenido de grasa cruda de 200-310 g/kg.

10

[0227) WO 01158275 corresponde a US 09f779334. [0228) Una composición de pienso para animales según la invención tiene un contenido bruto de proteina de 50-800 glkg, Y comprende además al menos una proteasa como se reivindica aqui.

15

[0229) Además, o en la alternativa (al contenido bruto de proteína indicado arriba), la composición de pienso para animales de la invención tiene un contenido de energía metabolizable de 10-30 MJlkg; y/o un contenido de calcio de 0,1-200 gfkg; yfo un contenido de fósforo disponible de 0,1-200 g/kg; y/o un contenido de metionina de 0,1-100 gfkg; yfo un contenido de metionina más cisteína de 0,1-150 g/kg; y/o un contenido de lisina de 0,5-50 gfkg.

20

[0230) En formas de realización particulares, el contenido de energía metabolizable, proteína cruda, calcio, fósforo, metionina, metionina más cisteína, y/o lisina está dentro de cualquiera de los rangos 2, 3,4 o 5 en la tabla B de WO 01f58275 (R. 2-5).

25

[0231) Proteina cruda se calcula como nitrógeno (N) multiplicado por un factor 6,25 , es decir proteina cruda (glkg)= N (glkg) x 6 ,25. El contenido de nitrógeno se determina por el método de Kjeldahl (A.O.A.C., 1984, Official Methods of Analysis 14" ed., Association of Official Analytical Chemists, Washington OC).

30

[0232) Energía metabolizable se puede calcular basándose en NRC publication Nutrient requirements in swine, novena edición revisada 1988, subcommittee on swine nutrition, commiltee on animal nutrition, board of agriculture, national research council. National Academy Press, Washington, D.C., pp. 2-6 , and the European Table of Energy Values for Poultry Feed-stuffs, Spelderholl centre for poultry research and exlension, 7361 DA Beekbergen, The Netherlands. Grafisch bedrijf Ponsen & looijen bv, Wageningen. ISBN 90-71463-12-5.

35

[0233) El contenido dietético de calcio, fósforo disponible y aminoácidos en las dietas para animales completas se calcula basándose en tablas de pienso tal como Veevoederlabel 1997, gegevens over chemische samenstelling, verteerbaarheid en voederwaarde van voedermiddelen, Central Veevoederbureau, Runderweg 6, 8219 pk Lelystad. ISBN 90-72839-13-7.

40

[0234) En una forma de realización particular, la composición de pienso para animales de la contiene al menos una proteína vegetal tal como se ha definido anteriormente. invención

45

[0235) La composición de pienso para animales de la invención también puede contener proteína animal , tal como harina de carne y de huesos, harina de plumas, yfo harina de pescado, típicamente en una cantidad de 0-25%. La composición de pienso para animales de la invención también puede comprender granos de destilería seca con solubles (DDGS), típicamente en cantidades de 0-30%.

SO

[0236) En otras formas de realización particulares adicionales, la composición de pienso para animales de la invención contiene 0-80% maíz; y/o 0-80% sorgo; yfo 0-70% trigo ; y/o 0-70% cebada; yfo 0-30% avena ; y/o O40% harina de soja; yfo 0-25% harina de pescado; y/o 0-25% harina de carne y de huesso; yfo 0-20% suero de leche.

26

[0237) Dietas para animales pueden por ejemplo ser fabricadas como pienso triturado (no 9ranulado) o pienso granulado. Típicamente, los materiales de pienso molidos se mezclan y cantidades suficientes de vitaminas esenciales y minerales se agregan según las especificaciones para las especies en cuestión.

5 Enzimas se pueden adicionar como formulaciones enzimáticas sólidas o líquidas. Por ejemplo, para pienso triturado una formulación sólida o líquida enzimática se puede añadir antes o durante la etapa de mezcla de ingredientes. Para pienso granulado la preparación de proteasa/enzima (líquida o sólida) también se puede añadir antes o durante la etapa de ingredientes del pienso. Típicamente una preparación de proteasalenzima líquida se añade después del paso de granulación. La enzima también se puede incorporar en un aditivo de pienso o premezcla.

[0238) La concentración enzimática final en la dieta está en la gama de 0,01-200 mg de proteína enzimática por kg dieta, por ejemplo en el rango de 0,5-25 mg proteína enzimática por kg de dieta animal.

15 [0239) La proteasa debería por supuesto aplicarse en una cantidad eficaz, es decir en una cantidad adecuada para mejorar la hidrólisis, digestibilidad, ylo mejora del valor nutricional del pienso. Está actualmente contemplado que la enzima se administra en una o varias de las siguientes cantidades (rangos de dosificación): 0,01-200, 0,01-100, 0,5-100,1-50, 5-100, lO-lOO, 0,05-50; o 0,10-10 -todos estos rangos siendo en mg de proteína proteasa por kg de pienso (ppm).

[0240) Para determinar mg de proteína proteasa por kg pienso, la proteasa es purificada de la composición de pienso, y la actividad específica de la proteasa purificada es determinada usando un ensayo pertinente (véase bajo actividad proteasa, sustratos, y ensayos). La actividad de proteasa de la composición de pienso como tal se determina también usando el mismo ensayo, y basándose en estas dos determinaciones, la

25 dosificación en mg de proteína proteasa por kg de pienso es calculada.

[0241) Los mismos principios pueden aplicarse para determinar mg de proteína proteasa en aditivos de piensos. Por supuesto, si una muestra está disponible de la proteasa usada para la preparación del aditivo de pienso o el pienso, la actividad específica es determinada de esta muestra (sin necesidad de purificar la proteasa a partir de la composición de pienso o el aditivo).

Composiciones de detergente

[0242) La proteasa de la invención se puede adicionar y así volverse un componente de una composición de 35 detergente.

[0243) La composición de detergente de la invención puede por ejemplo ser formulada como una composición de detergente para ropa a mano o a máquina que incluye una composición de aditivo de lavandería adecuada para pretratamiento de tejidos teñidos y una composición de suavizante añadida al enjuague, o ser formulada como una composición de detergente para usar en operaciones de limpieza de supelficies duras del hogar en general, o ser formulada para operaciones de lavado de la vajilla a mano o a máquina.

[0244) En un aspecto específico, la invención proporciona un aditivo de detergente que comprende la

45 proteasa de la invención. El aditivo de detergente al igual que la composición de detergente puede comprender una u otras enzimas adicionales tal como otra proteasa, tales como proteasas alcalinas de Bacillus, una lipasa, una cutinasa, una amilasa, una carbohidrasa, una celulasa, una pectinasa, una mananasa, una arabinasa, una galactanasa, una xilanasa, una oxidasa, por ejemplo, una lacasa, ylo una peroxidasa.

[0245) En general las propiedades de la enzima(s) elegida deberían ser compatibles con el detergente seleccionado, (es decir pH óptimo, compatibilidad con otros ingredientes enzimáticos y no enzimáticos, etc.), y la(s) enzima(s) debería(n) estar presente(s) en cantidades eficaces.

55 [0246) Lipasas adecuadas incluyen aquellas de origen bacteriano o rúngico. Mulanles químicamente modificados o creados genéticamente de proteínas están incluidos. Ejemplos de lipasas útiles incluyen lipasas de Humico/a (sinón imo de Thermomyces) , por ejemplo de H. Lanuginosa (T. Lanuginosus) como se describe en EP 258068 Y EP 305216 o de H. Inso/ens como se describe en WO 96/13580, una lipasa de Pseudomonas, por ejemplo de P. a/caligenes o P. Pseudoa/caligenes (EP 218272), P. cepacia (EP 331376),

P. stutzeri (GB 1,372,034), P. fluorescens, Pseudomonas sp. cepa SO 705 (WO 95/06720 Y WO 96(27002) ,

P. wisconsinensis (WO 96/12012), una lipasa de Bacillus, por ejemplo de B. subtilis (Dartois et al. (1993), Biochemica et Biophysica Acta, 1131 , 253-360), B. stearothermophi/us (JP 64/744992) o B. pumi/us (WO 91116422). Otros ejemplos son variantes de lipasa tales como los que se describe en WO 92/05249, WO 94101541 , EP 407225, EP 260105, WO 95135381, WO 96/00292, WO 95/30744, WO 94/25578, WO

65 95114783 , WO 95/22615, WO 97/04079 Y WO 97/07202. Enzimas de lipasa preferidas disponibles comercialmente incluyen Lipolase™ y Lipolase Ultra™ (Novozymes AlS). Amilasas adecuadas (alfa ylo beta) incluyen aquellas de origen bacteriano o fúngico. Mutantes químicamente modificados o creados genéticamente de proteínas están incluidos. Amilasas incluyen, por ejemplo, alfa-amilasas obtenidas de Bacil/us, por ejemplo una cepa especial de B. licheniformis, descrita con mas detalle en GB 1,296,839. Ejemplos de amilasas útiles son las variantes descritas en WO 94/02597, WO 94/18314, WO 95f26397 , WO

5 96f23873 , WO 97/43424, WO 00/60060, Y WO 01/66712, especialmente las variantes con sustituciones en una o mas de las siguientes posiciones: 15, 23, 105, 106, 124, 128, 133, 154, 156, 181 , 188, 190, 197, 202, 208, 209, 243, 264, 304, 305, 391, 408, Y 444. Amilasas disponibles comercialmente son Natalase™, Supramyl""", Stainzyme""", Duramyl""", Termamyl""", Fungamyl """ y BAN™ (Novozymes AlS), Rapidase TM y Purastar™ (de Genencor Internationallnc.).

[0247) Celulasas adecuadas incluyen aquellas de origen bacteriano o fúngico. Mutantes químicamente modificados o creados genéticamente de proteínas están incluidos. Celulasas adecuadas incluyen celulasas de los géneros Bacil/us, Pseudomonas, Humicola, Fusarium, Thielavia, Acremonium, por ejemplo las celulasas fúngicas producidas de Humicola insolens, Myceliophthora thennophila y Fusarium oxysporum 15 descritas en US 4,435,307, US 5,648,263, US 5,691,178, US 5,776,757 y WO 89f09259. Celulasas especialmente adecuadas son las celulasas alcalinas o neutras que tienen beneficios de cuidado del color. Ejemplos de tales celulasas son celulasas descritas en EP O 495257, EP 531372, WO 96/11262, WO 96f29397 , WO 98f08940. Otros ejemplos son variantes de celulasa tales como las que se describe en WO 94107998 , EP O 531 315, US 5,457,046, US 5,686,593, US 5,763,254, WO 95f24471 , WO 98/12307 Y WO

20 99101544. Celulasas disponibles comercialmente incluyen Celluzyme""", y Carezyme™ (Novozymes AlS), Clazinase""", y Puradax HA""" (Genencor Internationallnc.), y KAC-500(B)TM (Kao Corporation).

[0248) Peroxidasasfoxidasas adecuadas incluyen aquellas de origen vegetal, origen bacteriano o fúngico. Mutantes químicamente modificados o creados genéticamente de proteínas estan incluidos. Ejemplos de

25 peroxidasas útiles incluyen peroxidasas de Coprinus, por ejemplo de G. cinereus, y variantes de las mismas como aquellas descritas en WO 93/24618, WO 95f10602 , Y WQ 98/15257. Peroxidasas disponibles comercialmente incluyen Guardzyme""" (Novozymes).

[0249) La(s) enzima(s) detergente{s) se puede{n) incluir en una composición de detergente añadiendo

30 aditivos separados que contienen una o más enzimas, o añadiendo un aditivo combinado que comprende todas estas enzimas. Un aditivo de detergente de la invención, es decir un aditivo separado o un aditivo combinado, se puede formular por ejemplo como un granulado, un liquido, un lodo, etc. Formulaciones de aditivos de detergente preferidos son granulados, en particular granulados no pulverulentos, líquidos, en particular líquidos estabilizados, o lodos.

[0250) Granulados no pulverulentos se pueden producir, por ejemplo, como se describe en US 4,106,991 y 4,661 ,452 Y pueden opcionalmente ser recubiertos por métodos conocidos en la técnica. Ejemplos de materiales de recubrimiento ceroso son productos de óxido de polietileno (polietilenoglicol; PEG) con pesos molares medios de 1000 a 20000; nonilfenoles etoxilados teniendo de 16 a 50 unidades de óxido de etileno; 40 alcoholes grasos etoxilados donde el alcohol contiene de 12 a 20 átomos de carbono y en el cual hay 15 a 80 unidades de óxido de etileno; alcoholes grasos; ácidos grasos; y mono-y di-Y triglicéridos de ácidos grasos. Ejemplos de materiales de recubrimiento que forman películas adecuadas para aplicación por técnicas de lecho nuidificado se dan en GB 1483591. Preparaciones enzimáticas líquidas pueden, por ejemplo, ser estabilizadas añadiendo un poliol tal como propilenglicol, un azúcar o alcohol de azúcar, ácido láctico o ácido

45 bórico según métodos establecidos. Enzimas protegidas se pueden preparar según el método descrito en EP 238216.

[0251) La composición de detergente de la invención puede estar en cualquier forma conveniente, por ejemplo, una barra, un comprimido, un polvo, un gránulo, una pasta o un líquido. Un detergente líquido puede 50 ser acuoso, típicamente conteniendo hasta 70 % agua y 0-30 % de solvente orgánico, o no acuoso.

[0252) La composición de detergente comprende uno o más surtactantes, que pueden ser no iónicos incluidos semi polares y/o aniónicos yfo catiónicos y/o zwitteriÓnicos. Los surtactantes están típicamente presentes a un nivel de 0,1 % a 60% en peso.

[0253) Cuando se incluyen en este el detergente normalmente contendrá de aproximadamente 1% a aproximadamente 40% de un surfactante aniónico tal como alquilbencenosulfonato lineal, alfa-olefinsulfonato, alquil sulfato (sulfato de alcohol graso), etoxisulfato alcohólico, alcanosulfonato secundario, éster metílico de ácido alfa-sulfo graso, ácido alquil-o alquenilsuccínico o jabón.

60 [0254) Cuando se incluye aquí el detergente normalmente contendrá de aproximadamente 0,2% a aproximadamente 40'% de un surfactante no iónico tal como alcohol etoxilato, nonilfenol etoxilato, alquilpoliglicósido, óxido de alquildimetilamina, monoetanolamida de ácido graso etoxilado, monoetanolamida de ácido graso, amida de ácido polihidroxi alquil graso, o derivados de N-acil N-alquil glucosa mina

65 ("glucamidas").

[0255) Cuando se incluye en este el detergente puede contener un hidrótropo, que es un compuesto que solubiliza compuestos hidrofóbicos en soluciones acuosas (u opuestamente, sustancias polares en un ambiente no polar). Típicamente, hidrótropos tienen tanto un carácter hidrofílico e hidrofóbico (propiedades denominadas anfifílicas como se conocen de surfactantes); sin embargo, la estructura molecular de 5 hidrótropos generalmente no favorecen la autoagregación espontánea, véase por ejemplo revisión por Hodgdon y Kaler (2007), Current Opinion in Colloid & Intelface Science 12: 121-128. Hidrótropos no muestran una concentración crítica por encima de la cual la autoagregación ocurre como se ha descubierto para surfactantes y lipidos que forman mesofases micelares, laminares u otras mesofases bien definidas. En cambio, muchos hidrótropos muestran un proceso de agregación de tipo continuo donde los tamaños de 10 agregados crecen conforme aumenta la concentración. Sin embargo, muchos hidrótropos alteran el comportamiento de fase, estabilidad, y propiedades coloidales de sistemas que contienen sustancias de carácter polar y no polar, incluyendo mezclas de agua, aceite, surfactantes, y polímeros. Hidrótropos se usan clásicamente a través de industrias de farma, cuidado personal, alimentos, para aplicaciones técnicas. Uso de hidrótropos en composiciones detergentes permiten por ejemplo formulaciones más concentradas de

15 surfactantes (como en el proceso de compactación de detergentes líquidos eliminando el agua) sin fenómenos no deseados de inducción tales como separación de fase o alta viscosidad.

[0256) El detergente puede contener 0-5% en peso, tal como aproximadamente 0,5 a aproximadamente 5%,

o aproximadamente 3% a aproximadamente 5%, de un hidrótropo. Cualquier hidrótropo conocido en la

20 técnica para usar en detergentes puede ser utilizado. Ejemplos no limitativos de hidrótropos incluyen benceno sulfonato de sodio, p-tolueno sulfonato de sodio (ST8), xileno sulfonato de sodio (SXS), cumeno sulfonato de sodio (SCS), cimeno sulfonato de sodio, óxidos de amina, alcoholes y poliglicoléteres, hidroxinaftoato de sodio, hidroxinaflaleno sulfonato de sodio, etilhexil sulfato de sodio, y combinaciones de los mismos.

25 [0257] El detergente puede contener 0-65 % de un constructor de detergente o agente complejante tal como zeolita, difosfato, trifosfato, fosfonato, carbonato, citrato, ácido nitrilotriacético, ácido etilenodiaminatetraacético, ácido dietilenotriaminopentaacético, ácido alquil o alquenilsuccínico, silicatos solubles o silicatos estratificados (por ejemplo SKS-6 de Hoechst).

30 [0258) El detergente puede comprender uno o más polímeros. Ejemplos son carboximetilcelulosa, polivinilpirrolidona, polietilenglicol, alcohol polivinílico, poli(vinilpiridina-N-óxido), polivinilimidazol, policarboxilatos tales como poliacrilatos, copolimeros de ácido maléicofacrílico y copolimeros de lauril metacrilatofácido acrilico.

35 [0259) El detergente puede contener un sistema blanqueante que puede comprender una fuente de H20 2 tal como perborato o percarbonato que se puede combinar con un activador blanqueante de formación de perecido tal como tetraacetiletilenodiamina o nonanoiloxibencenosulfonato. Alternativamente, el sistema blanqueante puede comprender peroxiácidos de por ejemplo tipo amida, imida, o sulfona.

40 [0260) La(s) enzima(s) de la composición de detergente de la invención se puede estabilizar utilizando agentes estabilizantes convencionales, por ejemplo, un poliol tal como propilenglicol o glicerol, un azúcar o alcohol de azúcar, ácido láctico, ácido bórico, o un derivado de ácido bórico, por ejemplo, un éster de borato aromático, o un derivado de ácido fenil borónico tal como ácido 4-formilfenil borónico, o un péptido aldehido como se describe en por ejemplo WO 101055052 , y la composición se puede formular como se describe en

45 por ejemplo WO 92/19709 y WO 92/19708.

[0261) El detergente también puede contener otros ingredientes de detergentes convencionales tales como

por ejemplo acondicionadores de tejidos incluyendo arcillas, potenciadores de espuma, supresores de

espuma, agentes anticorrosivos, agentes suspensores de suciedad, agentes antirredeposición de suciedad,

50 tintes, bactericidas, blanqueadores óptiCOS, hidrótropos, inhibidores de decoloración, o pelfumes.

[0262) Es actualmente contemplado que en las composiciones de detergente cualquier enzima, en particular

la enzima de la invención, se puede adicionar en una cantidad que corresponde con 0,01-100 mg de proteina

enzimática por litro de licor de lavado, preferiblemente 0,05-5 mg de proteína enzimática por litro de licor de

55 lavado, en particular 0, 1-1 mg de proteína enzimálica por lilro de licor de lavado.

[0263) La enzima de la invención puede adicionalmente ser incorporada en las formulaciones detergentes descritas en WO 97/07202.

60 Constructos de ácidos nucleicos, vectores de ex presión, células huésped recombinantes, y metodos para la producción de proteasas

[0264) La presente invención también se refiere a constructos de ácidos nucleicos, vectores de expresión y células huésped recombinantes que comprenden tales polinucleótidos que codifican las proteasas de la 65 invención.

[0265) La presente invención también se refiere a métodos de producción de una proleasa, que comprende:

(a) cullivo de una célula huésped recombinante que comprende lal polinucleótido; y (b) recuperación de la proteína.

[0266) La proteína puede ser nativa o heteróloga a una célula huésped. El término "proteína" no pretende aquí referirse a una longitud específica del producto codificado y, por lo tanto, abarca péptidos, oligopéptidos, y proteinas. El término "proteína" también abarca dos o más polipéptidos combinados para formar el producto codificado. Las proteínas también incluyen polipéptidos híbridos y polipéptidos fusionados.

[0267) Preferiblemente, la proteina es una hormona o variante de la misma, enzima, receptor o porCión de la misma, anticuerpo o porCión de la misma, o reportero. Por ejemplo, la proteína puede ser una oxidorreductasa, transferasa, hidrolasa, liasa, isomerasa, o ligasa tal como una aminopeptidasa, amilasa, carbohidrasa, carboxipeptidasa, catalasa, celulasa, quitinasa, cutinasa, ciclodextrina glicosiltransferasa, desoxiribonucleasa, esterasa, alfa-galactosidasa, beta-galactosidasa, glucoamilasa, alfa-glucosidasa. betaglucosidasa, invertasa. lacasa, olra lipasa. manosidasa, mutanasa, oxidasa. enzima pectinolitica, peroxidasa, fitasa, polifenoloxidasa, enzima proteolitica, ribonucleasa, transglutaminasa o xilanasa.

[0268) El gen puede ser obtenido de cualquier fuente procariota, eucariota, u otra fuente.

[0269) La presente invención es posteriormente descrita por los ejemplos siguientes que no deberían ser interpretados como limitación del ámbito de la invención.

Ejemplos

Materiales y métodos

Ensayos:

Ensayos de proteasa:

[0270[ 1) Ensayo Suc-AAPF-pNA: sustrato pNA: Suc-AAPF-pNA (Bachem L-1400). Temperatura: Temperatura ambiente (25""C) Tampones de ensayo: 100mM de ácido succinico, 100mM HEPES, 100mM CHES, 100mM CABS, 1 mM

CaClz.150mM KCI, 0,01% Tritón X-lOO ajustado a valores de pH 2.0, 3.0, 4.0, 5.0, 6.0,7.0,8.0,9.0,10.0, Y 11.0con HCI o NaOH.

[0271)20jJl de proteasa (diluida en 0,01% Tritón X-lOO) fueron mezclados con tampón de ensayo de 100jJI. El ensayo fue comenzado añadiendo 100jJl de sustrato pNA (50mg disuelto en 1,Oml DMSO y diluido adicionalmente 45x con 0,01% Tritón X-lOO). El aumento en OD405 fue monitoreado como una medida de la actividad de proteasa.

2) Ensayo de Protazyma AK: Sustrato : comprimido de Protazyma AK (caseína reliculada y teñida; de Megazyme) Temperatura : controlada (ensayo temperatura). Tampón de ensayo 100mM ácido succínico, 100mM HEPES, 100mM CHES, 100mM CABS, 1mM

CaClz.l50mM KCI, 0,01% Tritón X-lOO, pH 6.5 o pH 7.0.

[0272) Un comprimido de Protazyme AK fue suspendido en 2.0ml 0.01% Tritón X-lOO por agitación suave. 500jJI de esta suspensión y 500jJI de tampón de ensayo fueron dispensados en un tubo de Eppendorf y colocados en hielo. 20jJI de muestra de proteasa (diluida en 0,01% Tritón X-lOO) fueron añadidos. El ensayo fue in iciado por transferencia del tubo de Eppendorf a un termomezclador de Eppendorf, que fue ajustada a la temperatura de ensayo. El tubo fue incubado durante 15 minutos en el termomezclador de Eppendoñ a su índice de agitación máximo (1400 rpm.). La incubación fue detenida por transferencia del tubo de nuevo al baño de hielo. Luego el tubo fue centrifugado en un centrífugo helado durante unos pocos minutos y 200jJI de sobrenadante fueron transferidos a una placa de microtitulaciÓn. OD65O fue leido como una medida de actividad de proteasa. Un tampón ciego fue incluido en el ensayo (en vez de la enzima).

3) Ensayo Suc-AAPX-pNA:

Sustratos pNA: Suc-AAPA-pNA (Bachem L-1775) Suc-AAPR-pNA (Bachem L-1720) Suc-AAPD-pNA (Bachem L-1835) Suc-AAPI-pNA (Bachem L-1790) Suc-AAPM-pNA (Bachem L-1395) Suc-AAPV-pNA (Bachem L-I770) Suc-AAPL-pNA (Bachem L-1390) Suc-AAPE-pNA (Bachem L-1710) Suc-AAPK-pNA (Bachem L-1725) Suc-AAPF-pNA (Bachem L-1400)

Temperatura: Temperatura ambiente (25°°C) 5 Tampón de ensayo: 100mM de ácido succínico, 100mM de HE PES, 100mM de CHES, 100mM de CABS, 1 mM de CaCI2, 150mM de KCI, 0.01 % Tritón X-100, pH 9.0.

[0273)201.11 de proteasa (diluida en 0.01% Tritón X-100) fueron mezclados con 1001.11 de tampón de ensayo. El ensayo fue comenzado añadiendo 1001.11 de sustrato pNA (50mg disueltos en 1.0ml DMSO y diluidos ad icionalmente 45x con 0,01% Tritón X-100). El aumento en 00405 fue monitoreado como una medida de la actividad de proteasa.

Ensayo de harina de soja-maíz (ensayo SMM)

15 [0274) Un ensayo de valoración usando harina de soja-maíz como sustrato fue usado para la obtención del perfil de actividad de las proteasas a pH 3-7.

[0275) Tampones de ensayo: 100 mM de ácido succínico , 100 mM de HEPES, 100 mM de CHES , 100 mM de CAPS, 1 mM de CaCi2,150 mM de KCI, 0.01% Tritón X-100 ajustado utilizando HCI o NaOH a valores de pH 3.0,4.0,5.0,6.0,7.0,8.0,9.0,10.0 Y 11.0 cuando la mezcla 10 mi tampón de ensayo con 1 9 de harina de soja-maíz (proporción 30:70). 2 mL de mezcla de harina de soja-maíz se mezclan durante 30 min antes de la adición de proteasa e incubación dumate 3 horas a 40QC (500 r.p.m.). Proteasa se añade por 100 1.11100 mM de tampón de acetato sódico (NaAc) (9.565 gfl NaAc, 1.75 gfl de ácido acético, 5 mM CaCI2,0.01 % BSA,

0.01 % Tween20, pH 6.0). Sobrenadantes fueron rec09idos después de la centrifugación (10 min, 4000

25 r.p. m., OQC) y la actividad de proteína es determinada usando un ensayo colorimétrico basado en el método o-ftaldialdehído (OPA) esencialmente según Nielsen et al. (Nielsen, PM, Petersen, O, Oampmann, C. Improved methad for determining foad protein degree of hydrolysis. J Food Sci, 2001, 66: 642-646). Este ensayo detecta grupos de u-amino libre y por lo tanto actividad de proteasa se puede medir como un aumento en la absorbancia. Primeros 5001.11 de cada sobrenadante se filtra a través de un filtro de 100 kDa por centrifugación (60 min, 11,000 r,p.m., 5QC), Las muestras son diluidas 10x en agua desionizada y 25 1.11 de cada muestra se carga en una placa de microtitulación de 96 pocillos (5 réplicas). Finalmente 200 1.11 de reactivo OPA se dispensan en todos los pocillos y la placa es agitada (10 seg, 750 r.p. m.) y la absorbancia es medida a 340 nm. El nivel de actividad de proteasa se calcula como la diferencia entre absorbancia en la muestra tratada enzimática y la muestra en blanco.

35 Resultados se proporcionan en el ejemplo 4 a continuación

Ensayo de digestión in vitro

[0276) Un ensayo de digestión in vitro fue usado para evaluar el efecto de las proteasas en un sustrato de pienso (harina de soja-maíz) en una disposición diseñada para simular la digestión en animales monogástricos. El proceso de incubación consistió en una fase de digestión gástrica con pepsina porcina (SP7000, Sigma-Aldrich, SI. Louis, MO, EE.UU) a pH 3 seguida de una corta incubación duodenal a pH 3.8 y una incubación intestinal pequeña con pancreatina (8xUS8, P-7545, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE.UU) a

45 pH 7.0. La d igestión in vitre fue realizada utilizando un sistema automatizado basado en un manipulador de líquidos Gilson (Biolab, Dinamarca). Para cada muestra 0,8 g de pienso fue pesado en un tubo y todos los tubos fueron colocados en el manipulador de liquidas (40QC, 500 r.p.m.). Adiciones de soluciones al igual que mediciones de pH fueron realizadas automáticamente. Al tiempo de O min, 4.1 mL de HCt (24 mM CaCI2) se añadió hasta alcanzar pH 3.0 en la solución. Al tiempo de 30 min 0.5 mi de HCI (24 mM CaC12,3000 U pepsina/g de pienso) y 100 I.IL de un tampón de acetato sódico de 100 mM (258,6 g de NaAc por litro, 0,57 % ácido acético, pH 6.0) fue añadido. Al tiempo de 90 min 900 I.IL NaOH se añadió hasta alcanzar pH -3.8 y al tiempo de 120 min 400 I.IL de una solución 1 M NaHCOl conteniendo 6,5 mg de pancreatinalg de pienso fue añadida conduciendo a pH 6.8 en la solución. El pH fue medido al tiempo de 30, 60, 90, 115,120 Y 180 mino

55 Las proteasas de prueba fueron anadidas vla el tampón de 100 1.11 de NaAc al tiempo de 30 mino El nivel de proteína cruda soluble (N x 6.25) medido utilizando un analizador LECO FP-528 de proteínafnitrógeno, fue usado como una indicación de eficacia de proteasa en el ensayo.

[0277) Estadística: análisis estadístico de los parámetros registrados fue realizado utilizando un análisis de procedimiento de va rianza (ANOVA) y comparación de medias fue hecha utilizando la prueba de Tukey (o. = 0,05) proporcionada por el procedimiento ANOVA «SAS, JMP® 5 Administrators Guide to AnnuaUy Licensed Windows, Mackintosh, and Linux Versions, Release 5.1. SAS Institute, Cary, NC. (2003».

[0278) Resultados se proporcionan en el ejemplo 5 sigu iente.

Cepas [0279) Kribbella solani, aislado 067 P2, fue aislada a partir de una muestra de suciedad del Reino Unido obtenida por la Universidad de Warwick en 1990.

5 [0280) Kribbella aluminosa, aislado 05C3Y, fue aislada a partir de una muestra de China proporcionada a NO\iozymes en 2009 bajo contrato con Yunnan Institute of Microbiology; Kunming.

Ejemplo 1:

Preparación de DNA y secuenciación delgenoma de Kribbella sotani y de KribbeJ/a aluminosa

[0281 ) DNA cromosómico de Kribbella solani y Kribbella aluminosa fue aislado por OIAamp DNA Blood Mini Kit " (Oiagen, Hilden " Alemania). 5ug de DNA cromosómico de cada cepa fueron enviados para secuenciación de genoma a FASTERIS SA, Suiza. Los genomas fueron secuenciados por secuenciación de

15 IlIumina. Las secuencias del genoma fueron analizados para proteasas S1 segregadas y las dos proteasas S1 (SEO ID:1 fSEO ID:2 y SEO ID: 3/SeqID:4) donde se identificaron.

Expresión de peptidasas 51 de Kribbella solani y Kribbella aluminosa

[0282) Un sistema de vector de integración lineal fue usado para la expresión clonación de dos genes de peptidasa S1 de Kn·bbella solani (SEO ID N.O: 1) y Kribbella aluminosa (SEO ID N.O: 3), respectivamente. El constructo de integración lineal fue un producto de fusión de PCR hecho por fusión del gen entre dos regiones cromosómicas homólogas de Bacillus subtilis junto con un promotor fuerte y un marcador de resistencia al cloranfenicol. La fusión fue hecha por SOE PCR (Horton, R.M., Hunt, H-D., Ho, S.N., Pullen,

25 J.K. and Pease, L.R. (1989) Engineering hybrid genes without the use of restriction enzymes, gene splicing by overlap extension Gene 77: 61-68). El método de SOE PCR es también descrito en la solicitud de patente WO 2003095658. El gen fue expresado bajo control de un sistema de promotor triple (como se describe en WO 99/43835), que consiste en los promotores del gen de alfa-amilasa de Bacillus licheniformis (amyL) , gen de alfa-amilasa de Bacillus amyloliquefaciens (amyQ), y el promotor de Bacillus thuringiensis crylllA que incluye la secuencia estabilizante. El gen que codifica para cloranfenicol acetiltransferasa fue usado como marcador (descrito en por ejemplo Diderichsen,B.: Poulsen,G.B.: Joergensen,S.T.: A useful cloning vector for Bacillus subtilis. Plasmid 30:312 (1993». Los constructos del gen finales fueron integrados en el cromosoma de Bacillus por recombinación homóloga en el locus de pectato liasa.

35 [0283) Los fragmentos de genes de los dos genes fueron amplificados de DNA cromosómico de las dos cepas con cebadores específicos (KS-directo (SEO ID NO:9) y KS-inverso (SEO ID NO:10) para la proteasa S1 de Kribbella solani y KA-directo (SEO ID NO:11) y KA-inverso (SEO ID NO:12) para la proteasa S1 de Kribbella aluminosa. El fragmento flanqueante corriente arriba fue amplificado con los cebadores 260558 (SEO ID NO:13) e iMB1361Uni2 (SEO ID NO:14) y el fragmento f1anqueante corriente abajo fue amplificado con los cebadores 260559 (SEO ID NO:15) y oth435 (SEO ID NO:16) de ONA genómico de la cepa iMB1361 (descrita en la solicitud de patente WO 2003095658). Ambas peptidasas S1 fueron expresadas con una señal de secreción de Bacillus lentus (con la siguiente secuencia de aminoácidos: MKKPLGKIVASTALLlSVAFSSSIASA (SEO 10:17) reemplazando las señales de secreción nativas. La señal fue colocada en el fragmento f1anqueante corriente arriba. los cebadores directos

45 fueron diseñados de modo que los genes fueron amplificados desde el sitio de escisión de péptido señal y tuvieron preponderancias de 26 pb Y los cebadores inversos contenían una proyección consistente en 24-27 pb (las preponderancias se muestran en ilélico en la tabla siguiente). Estas preponderancias fueron cada una complementaria a parte de uno u otro de los dos fragmentos de vectores líneales y fue usada cuando los fragmentos de gen y los fragmentos de vector fueron ensamblados (descritos a continuación). Todos los cebadores usados se enumeran en la tabla 2 siguiente. Los fragmentos de gen fueron amplificados utilizando una polimerasa de PHUSIONTM DNA Polymerase (Finnzymes, Finlandia) según las instrucciones del fabricante. Los dos fragmentos de ONA f1anqueantes fueron amplificados con "Expand High Fidelity PCR System" (Roche-Applied-Science) según procedimientos estándar (siguiendo las recomendaciones del fabricante). las condiciones de PCR fueron de la siguiente

55 manera para el gen S1 de Kribbella aluminosa: 98"C durante 30 seg. seguido de 35 ciclos de (98"C durante 10 seg, 54"C durante 20 seg, 72"C durante 1,5 min) y finalización con un ciclo a 72~C durante 10 mino Las condiciones de PCR fueron como sigue para el gen de Kribbella solani S1: 98"C durante 30 seg. seguido de 35 ciclos de (98"C durante 10 seg, 72"C durante 20 seg, 72"C durante 45 seg.) y terminando con un ciclo a 72"C durante 10 min. Para ambos constructos de expresión los 3 fragmentos de la PCR fueron sometidos a un empalme posterior por reacción por PCR de extension de superposición (SOE) para ensamblar los 3 fragmentos en un constructo de vector lineal. Esto fue hecho mediante la mezcla de los 3 fragmentos en proporciones molares iguales y una reacción por PCR nueva fue realizada bajo las condiciones siguientes: inicial 2 mino a 94"C, seguido de 10 ciclos de (94"C durante 15 seg., 55"C durante 45 seg., 68"C durante 5 min.), 10 ciclos de (94"C durante 15 seg., 55"C

65 durante 45 seg., 68"C durante 8 min.), 15 ciclos de (94~C durante 15 seg., 55"C durante 45 seg., 68~C durante 8 mino Además 20 seg. extra por ciclo). Después del primer ciclo los dos cebadores finales 260558 y 260559 fueron añadidos (20pMol de cada uno). Dos ~I de cada uno de los productos de PCR fueron transformados en Bacillus subtilis. Los transformantes fueron seleccionados en placas LB suplementadas con 6 ~g de cloranfenicol por mI.. Dos dones de Bacillus subtilis recombinanles cada uno que contiene uno de los construclos de expresión integrados fueron crecidos en cultivos liquidas. Los sobrenadanles que contienen enzimas fueron cosechados y las dos enzimas fueron purificadas como se describe en el ejemplo 2.

Tabla 2. Cebadores usados

Amplificación de

CEBADOR ESPECIFICO DIRECTO CEBADOR ESPECIF ICO INVERSO

peplidasa S1 de Kribbella solani

KS DIRECTO (SEO ID N.o: 9) 5' CTTTTAGTTCATCGATCGCATCGG CT GCACCGGTGAACCCGTCCGCG 3' KS INVERSO (SEO ID N.o: 10) S' GGGCCAAGGCCGGTTTTTTAT GTTTTA GACGCTGACGCCGTAGCGGG AGAG3·

peptidasa de KribbeUa aluminosa S1

KA directo (SEO 10 N.o: 11) 5'eTTTT/lG TTCII TeGII TeGC/ITCG GeT GCACCGGTCGACCCGTCC 3' KA inverso (SEO 10 N.o: 12) S' CCAAGGCCGG ///I//ATGTTT CA GTAGACGCTCACGCCGT 3'

Fragmento flanqueanle corriente arriba

260558: (SEO ID N.o: 1~) S' GAGTATCGCCAGTAAGGGGCG 3' iM81361Uni2 (SEO ID N.o: 14) S' AGCCGATGCGATCGATGAACT A3'

Fragmento flanqueante corriente abajo

OTH435 (SEO 10 N.o: 15) S' T AMAGAT AAAAAAGCGGCCTTG GC3' 260559: (SEO 10 N.o: 16) S' GCAGCCCTAAAATCGCATAAA GC3'

10

Ejemplo 2:

Purificación de las proteasas

Purificación de la proteasa S 1 A de Kribbella salan;

1S

[0284) El caldo de cultivo fue centrifugado (20000 x g, 20 min) y el sobrenadante fue cuidadosamente

decantado del precipitado. El sobrenadante fue filtrado a través de una unidad de filtración de Nalgene de

0,21Jm para elim inar el resto de las células huéspedes de Bscll/us. El filtrado de 0.21Jm fue transferido a

50mM H3B03,20mM CH3COOH/NaOH , 1 mM CaCI2, pH 4.5 en una columna Sephadex G25 (de GE

20

Healthcare). La enzima transferida a Sephadex G25 fue ligeramente turbia y fue filtrada a través de un filtro

de microfibra de vidrio GF/A (de Whatman). El filtrado claro se aplicó a una columna FF de SP-sepharosa (de

GE Healthcare) equilibrada en 50mM H3B03, 20mM CH3COOH/NaOH , 1 mM CaCI2, pH 4.5. Después del

lavado de la columna extensamente con el tampón de equilibrado, la proteasa fue eluida con un gradiente de

NaCI lineal (O -> 0.5M) en el mismo tampón sobre cinco volúmenes de columna. Las fracciones de la

25

columna fueron analizadas para actividad de proteasa (utilizando el ensayo Suc-AAPF-pNA a pH 9). El valor

máximo de proteasa fue agrupado y el sulfato de amonio sólido se añadió at grupo a una concentración de

sulfato de amonio final de 1,8M (NH.)2S0... El grupo de sulfato de amonio ajustado se aplicó a una (alta sub)

columna de Fenil-sepharose FF (de GE Hea1thcare) equilibrada en 100mM de H3B03,10mM de MES/NaOH,

2mM de CaCI2,1.8M de (NH.hSO., pH 6.0. Después del lavado de la columna extensamente con el tampón

30

de equilibrado, la proteasa fue eluida con un gradiente lineal sobre ocho volumenes de columna entre el

tampón de equilibrado y 100mM de H3B03,10mM de MES/NaOH, 2mM de CaCI2, pH 6.0 con 25%(v/v) 2

propano!. Fracciones de la columna fueron analizadas para actividad de proteasa (utilizando el ensayo Suc

AAPF-pNA a pH 9). El valor máximo de proteasa fue agrupado y el grupo fue transferido a 50mM

H3B03.20mM CH3COOH/NaOH, 1mM CaCI2, pH 4.5 en una columna Sephadex G25 (de GE Heallhcare). La

35

enzima transferida a Sephadex G25 fue aplicada a una columna SOURCE S (de GE Healthcare) equilibrada

en 50mM de H3B03, 20mM de CH3COOH/NaOH, 1mM de CaCI2, pH 4.5. Después del lavado de la columna

extensamente con el tampón de equilibrado, la proteasa fue eluida con un gradiente de NaCI lineal (O ->

0,5M) en el mismo tampón sobre veinte volúmenes de columna. Las fracciones de la columna fueron

analizadas para actividad de proteasa (utilizando el ensayo Suc-AAPF-pNA a pH 9) y las fracciones activas

40

fueron anatizadas adicionalmente por SOS-PAGE. Las fracciones, donde solo una banda fue vista en el gel

de SOS-PAGE tei'lido de coomassie, fueron agrupadas y transferidas a 100mM de HJB03, 10mM de

MES/NaOH, 2mM de CaCI2, pH 6.0 en una columna Sephadex G25 (de GE Heallhcare). La enzima

transferida a Sephadex G25 fue la preparación purificada y fue usada para otra caracterización .

45 Purificación de la proteasa S 1 A de Kribbella aluminosa

[0285) El caldo de cultivo fue centrifugado (20000 x g, 20 min) y el sobrenadante fue cuidadosamente decantado desde el precipitado. El sobrenadante fue filtrado a través de una unidad de filtración Nalgene O.2lJm para eliminar el resto de las células huéspedes de Bacillus. El filtrado de 0.21Jm fue transferido a 10mM de ácido succinicofNaOH, 1 mM de CaCh, pH 5.0 en una columna Sephadex G25 (de GE Heallhcare). 5 La enzima transferida a Sephadex G25 fue ligeramente turbia y fue filtrada a través de un filtro de microfibra de vidrio GFfA (de Whatman). El filtrado claro se aplicó a una columna FF de SP-sepharose (de GE Healthcare) equilibrado en 10mM de ácido succinico/NaOH, 1 mM de CaCh, pH 5.0. Después del lavado de la columna extensamente con el tampón de equilibrado, la proteasa fue eluida con un gradiente de NaCI lineal (O -> 0.5M) en el mismo tampón sobre cinco volúmenes de columna. Fracciones de la columna fueron 10 analizadas para actividad de proteasa (utilizando el ensayo Suc-AAPF-pNA a pH 9). El valor máximo de proteasa fue agrupado y sulfato de amonio sólido se añadió al grupo a una concentración de sulfato de amonio final de 1.2M de (NH4l2S04. El grupo ajustado de sulfato de amonio se aplicó a una columna de Phenyl-Toyopearl (de TosoHaas) equilibrada en 100mM H3B03, 10mM de MESfNaOH, 2mM de CaC12,1 .2M de (NH4)2S04, pH 6.0. Después del lavado de la columna extensamente con el tampón de equilibrado, la 15 proteasa fue eluida con un gradiente lineal de (NH412S04 (1.2 --> OM) en el mismo tampón sobre cinco volúmenes de columna. Fracciones de la columna fueron analizadas para actividad de proteasa (utilizando el ensayo Suc-AAPF-pNA a pH 9) Y fracciones activas fueron además analizadas por SDS-PAGE. Fracciones, donde solo una banda fue vista en el gel de SDS-PAGE teñido de coomassie, fueron agrupadas y el grupo fue transferido a 10mM de ácido succinicofNaOH, 1mM de CaCh, pH 5.0 en una columna Sephadex G25 (de

20 GE Heallhcare). La enzima transferida a Sephadex G25 fue aplicada a una columna SOURCE S (de GE Healthcare) equilibrada en 10mM de ácido succínico/NaOH, 1 mM de CaCI2, pH 5.0. Después del lavado de la columna extensamente con el tampón de equilibrado, la proteasa fue eluida por pasos con 10mM de ácido succinicofNaOH, 1 mM de CaCI2, O.5M de NaCl, pH 5.0. El valor máximo eluido de la columna fue la preparación purificada y se usó para otra caracterización.

Ejemplo 3:

Caracterización de las proteasas S1A de Kribbella

30 [0286) El ensayo de Suc-AAPF-pNA fue usado para obtener el perfil de actividad de pH y el perfil de estabilidad de pH (actividad residual después de 2 horas a valores de pH indicados). Para el perfil de estabilidad de pH la proteasa fue diluida 10x en los tampones de ensayo diferentes para alcanzar los \lalores de pH de estos tampones y luego incubados durante 2 horas a 37"C. Tras la incubación, el pH de las incubaciones de proteasa fue transferido al mismo valor de pH, antes del ensayo para actividad residual, por

35 dilución en el tampón de ensayo de pH 9.0. El ensayo de Protazyme AK fue usado para la obtención del perfil de temperatura-acti\lidad a pH 6.5 (Kribbella solam) o a pH 7.0 (Kribbella aluminosa). El ensayo Suc-AAPXpNA y diez sustratos diferentes de Suc-AAPX-pNA fueron usados para la obtención de la especificidad P1 de las enzimas a pH 9.0.

40 [0287) Los resultados se muestran en tablas 3-6 siguientes. Para tabla 3, las actividades son relativas al pH óptimo para las enzimas. Para tabla 4, las actividades son actividades residuales con respecto a una muestra, que fue mantenida a condiciones estables (5°C, pH 9.0). Pata tabla 5, las actividades son relativas a la temperatura óptima a pH 6.5 o pH 7.0 para las enzimas. Para tabla 6, las actividades son relativas al mejor sustrato (Suc-AAPF-pNA) para las enzimas.

Tabla 3: perfil de actividad-pH

H 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

roteasa S 1 A de Kribbella solani 0,00 0,01 004 015 0.48 074 0,92 098 100 0,91 roteasa S1A de Kribbella aluminosa 000 001 005 O 19 049 072 093 100 097 0,90 Proteasa 10R 000 002 007 021 044 067 088 1 00 0,93

Tabla 4: Perfil de estabilidad de pH (actividad residual después de 2 horas a 37°C)

pH

proteasa S1A de KribbeJla proteasa S1A de Kribbella Proteasa

solani

aluminosa 10R

2

0,94 082 0,78

3

1,00 1 04 1,03

1,00

1 06

1,00

1,02

1,03

1 01

0,99

0,97

0,98

0,38

0,99

0,00

1,00 (a pH 9)

1,00(apH9)

Después de 2 horas a 5

1,00 (a pH 9)

'C

Tabla 5: perfil de actividad y temperatura a pH 6.5 o pH 7

TempI (' C)

proteasa S1A de Kribbella solani (DH 6.5) proleasa S1 A de Kribbella aluminosa (DH 7) Proleasa 10R (pH 6.5)

15

000 001 0,01

25 37

0,02 004 0,01 002 0,02 006

50

O14 011 0,13

60 70

039 1,00 036 1,00 0,35 0,96

80

040 098 1,00

90

- 020 O18

Tabla 6: especificidad de P1 en 10 sustratos de Suc-AAPX-pNA a pH 9

Suc-AAPX-pNA

roteasa S1A de Kribbella solani 1 proteasa S1Ade Kribbella aluminosa Proteasa 10R

Suc-AAPA-pNA Suc-AAPR-NA

0,13 015 0,15 017 0,13 009

Suc-AAPD-NA Suc-AAPI-pNA

001 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00

Suc-AAPM-pNA

035 0,37 0,78

Suc-AAPV-NA Suc-AAPL-pNA

001 021 001 O19 001 O18

Suc-AAPE-pNA Suc-AAPK-NA

000 0,08 0,00 0,09 0,00 0,08

Suc-AAPF-NA

100 1,00 1,00

Otras características para la proteasa S1A de Kribbella solani

10 [0288J Inhibidor: PMSF. El peso molecular relativo como determinado por SDS-PAGE fue aprox. M, = 23kDa. El peso molecular determinado por anál isis de peso molecular intacto fue 18900.5Da. La secuencia madura (de datos de MS-EDMAN y secuencia P23BSS) fue como se indica en SEQ ID NO:2: El peso molecular calculado de esta secuencia madura fue 18900.5Da.

Otras caracteristicas para la proteasa S 1 A de Kribbella aluminosa

[0289) lnhibidor: PMSF. El peso molecular relativo como determinado por SDS-PAGE fue aprox. M, = 21 kDa.

20 El peso molecular determinado por anál isis de peso molecular inlaclo fue 19078.1 Da. La secuencia madura (de datos de MS-EDMAN y secuencia de P23XDA) fue como se indica en SEQ ID NO:4 El peso molecular calculado de esta secuencia madura fue 19077.7Da

Ejemplo 4

Actividad de proteasa en el ensayo de harina de soja-maíz (ensayo SMM)

[0290) Un ensayo de harina de soja-maíz fue usado para describir la actividad de las proteasas en un sustrato pertinente para pienso para animales. Los resultados se muestran en la tabla 7 siguiente. La 30 actividad máxima para cada proteasa se fija en 1,00 Y los otros valores se representan como relativos a la actividad máxima. Las proteasas de la invención muestran un pH óptimo inferior en la harina de soja-maíz Que 10R y una actividad relativa más alta en la gama de pH fisiológ ico ampl ia de 3-7 . Esto indica una posibilidad de las proteasas de la invención de hidrolizar una proteina de la dieta en el tracto digestivo entero

de cerdos y aves. El pH en el tracto gastrointestinal varía de ácido (típicamente pH 2-4) en el estómago de cerdos y proventrículo y molleja de aves a pH 4-6 en el buche de a\ies y pH 6-7 en el intestino delgado de cerdos y aves.

5 Tabla 7 : actlvl a re atlva de Qroteasa en harlna de sOla-malz a 12 H 30 405060 ,70

pH

proteasa S1A de Kribbella solani I proteasa S1A de Kribbella aluminosa Proteasa 10R

30

0,55 0,41 0,08

4.0 5.0

0,47 082 0,53 083 0,10 024

6.0

1,00 1 00 062

7.0

0,76 0,83 1,00

Ejemplo 5

10 Ensayo de digestión in vitro

[0291) Un ensayo de digestión gastro-intestinal simulado fue realizado para evaluar el potencial de proteasas

para aumentar la digestibilidad de proteína en animales monogástricos. El efecto de las proteasas fue medido

como un aumento en la solubilizaci6n de proteínas. Los resultados se muestran en la tabla 8 siguiente. La

15 proteasa S1A de K. solani aumentó la cantidad de proteína soluble en las muestras que indicaban hidrólisis de proteínas, sin embargo, no al mismo nivel en cuanto a proteasa 10R. Una explicación lógica para esto es que la incubación de digestión in vitro como se diseña para este estudio incluye 4 horas de incubación a pH 7 Y solo 1~ hora de incubación a pH s 6, el área de pH donde la proteasa S1A de K. Solani de la invención tiene una ventaja sobre aquella de la proteasa 10R.

Tabla 8: el nivel de proteína soluble como porcentaje de proteína total en las muestras de digestión in vitro después del tratam iento con Qroteasa S1A de Kribbella solani o Qroteasa 10R

Enzima (mg de proteína enzimática/kg pienso)

Proteína Soluble de total %

Promedio

Desviación tí ;ca

Ninguna enzima

93,45 206

roteasa S1A de Kr;bbella solani

100 9764 106

Proteasa 10R

100 10064 a 175

Letras de superindice diferentes indican diferencias significativas P<O 05 .

25 Ejemplo 6: termoestabilidad

[0292) Una parte alícuota de la muestra de proteína de proteasa (purificada como se describe en el ejemplo 2) es bien desalada o cambiada de tampón en 20 mM de Na-acetato, pH 4.0 utilizando un preempaquetado de columna PD-10 o dializada contra 2 x 500 mi 20 mM Na-acetato, pH 4.0 a 4°C en un paso de 2-3h seguida

30 de un paso durante toda la noche. La muestra es 0,45 IJm filtrada y diluida con tampón hasta aprox. 2 A280 unidades. El tampón de diálisis se usa como referencia en la calorimetría diferencial de barrido (DSC). Las muestras son desgasificadas usando la succión de vacío y agitación durante aprox. 10 minutos.

[0293) Un escaneado de DSC se realiza en un MicroCal VP-DSC a una tasa de barrido constante de 1.5

35 °C/min de 20-90 oC. La manipulación de datos es realizada utilizando el software MicroCal Origin (\iersión 4.10), y la temperatura de desnaturalización, Td (llamada también la temperatura de fusión, Tm) se define como la temperatura en el ápice del valor máximo en eltermograma.

Ejemplo 7: estabilidad de vapor

[0294) La actividad residual de la proteasa después del tratamiento con vapor se puede evaluar utilizando el ensayo siguiente.

[0295) En estos experimentos una configuración modificada se usa por la cual el vapor se proporciona a partir

45 de un generador de vapor y se conduce a la caja. Las muestras colocadas en una placa se insertan en la caja a través de un cajón cuando la temperatura ha alcanzado aprox. 93-94°C. Tras la inserción de las muestras la temperatura cae 4 oC. La incubación se realiza durante 30 segundos mientras la temperatura permanece constante aproximadamente a 90"C. Luego la placa es rápidamente quitada de la caja, las muestras colocadas en hielo, resuspendidas y evaluadas con respecto a la actividad de proteasa usando por ejemplo el

50 ensayo Suc-AAPF-pNA u oftaldialdehido (OPA). Cada muestra de enzima es comparada con una muestra similar que no ha sido tratada por vapor para calcular la actividad residual.

Ejemplo 8: pruebas de estabilidad de granulación [0296) La 9ranulación enzimática se realiza en una manera como se describe en la patente de EEUU nO 4,106,991 , Ejemplo 1. El granulado obtenido se seca en un lecho f1uidizado a un conten ido de agua por debajo de 1% y tamizado para obtener un producto con el rango de particulas 250 IJm a 850 IJm. Finalmente,

5 el producto es recubierto con aceite de palma y carbonato cálcico como se describe en la patente de EEUU nO 4, 106,991 , ejemplo 22.

[0297) Aproximadamente 50 g de granulado enzimático se premezda con 10 kg de pienso durante 10 minutos en un mezclador horizontal pequeño. Esta premezcla se mezcla con 90 kg de pienso durante 10 10 minutos en un mezclador horizontal mayor. Desde el mezdador el pienso se conduce al acondicionador (un mezclador de cascada con inyección de vapor) a razón de aproximadamente 300 kg/hora. El acondicionador calienta el pienso a 95Q C (medido en la salida) inyectando vapor. El periodo de permanencia en el acondicionador es 30 segundos. Desde el acondicionador el pienso se conduce hasta una prensa de Simon Heesen equipada con una boquilla horizontal de 3,Ox35 mm y se prensa hasta gránulos con una longitud de

15 alrededor de 15 mm. Después de la prensa los gránulos se colocan en un refrigerador de aire y se enfrían durante 15 minutos.

[0298) La actividad de proteasa es medida utilizando el ensayo Suc-AAPF-pNA antes de la granulación yen los gránulos de pienso después de la granulación. La estabilidad de granulación se determina comparando la 20 actividad de proteasa en el pienso granulado con respecto a la actividad en el pienso no granulado.

[0299) La invención descrita y reivindicada aquí no pretende limitarse en su alcance por los aspectos específicos aqu í descritos, ya que estos aspectos se destinan como ilustraciones de diferentes aspectos de la invención. Cualquier aspecto equivalente se destina a estar dentro del campo de esta invención. De hecho,

25 varias modificaciones de la invención además de aquellas mostradas y descritas aquí se volverán aparentes para los expertos en la técnica a partir de la descripción precedente. Tales modificaciones están también destinadas a caer dentro del campo de las reivindicaciones anexas.

LISTADO DE SECUENCIAS

[0300) <110> Novozymes AlS

<120> POLlPE::PTIDOS CON ACTIVIDAD DE PROTEASA

35 <130> 11706-EP-EPA

<150> EP 11178201.7

<151 > 2011-08-19

40 <160> 17

<170> versión de Patentln 3.5

<210> 1 45 <211 > 879

<212> DNA

<213> Kribbella solani

<220> <221> CDS 50 <222> (1 ) .. (879)

<220>

<221 > sig-.peptide

<222> (1 ) .. (90)

<220>

<221> mat_peptide

<222> (316) ..(879)

60 <400> 1

atg aaa etg tee eea tte ege ege aee aee gea ate etg gee geg gee Met Lys Leu Ser Pro Phe Arg Arg Thr Thr Ala I1e Leu Ala Ala Ala -105 -100 -95 -90

ggg ett gee gee gee gga etg etg geg teg eaa gee teg gee gea eeg G1y Leu Ala Ala Ala Gly Leu Leu Ala Ser Gln Ala Ser Ala Ala Pro -85 -80 -75

gtg aae eeg tee geg etg tee gee teg geg ate aeg teg aeg etg age Val Asn Pro Ser Ala Leu Ser Ala Ser Ala Ue Thr Ser Thr Leu Ser -70 -65 -60

aag gae geg aee ate eee ggt aeg geg tgg eag aee get eeg gae gge Lys As. Ala Thr I1e Pro Gly Thr Ala Trp Gln Thr Ala Pro Asp Gly -55 -50 -45

egg ate ate gtg teg tae gae gae aee gtg aee gge geg aag etg tee Arg Ue Ue Val Ser Tyr As. As. Thr Val Thr Gly Ala Lys Leu Ser -40 -35 -30

aag etg aee agt gtg aee aag eag tte gge eag egg ate aeg etg gag Lys Leu Thr Ser Val Thr Lys Gln Phe G1y Gln Arg Ue Thr Leu Glu -25 -20 -15 -10

aag atg aag gge aag etg aee aag tae ate gee gge gge gae gee ate Lys Met Lys Gly Lys Leu Thr Lys Tyr I1e Ala Gly Gly As. Ala Ue -5 -1 1 5

tac ggc ggt cag tae cgg tgc tcg ete gge ttc aac gtc ege agc ggc

Tyr Gly Gly Gln Tyr Arq Cys Ser Leu Gly Phe Asn 10 15

aqe aeq tae tae tte etq aee qeq qqt cae tqe qqe Ser Thr Tyr Tyr Phe Leu Thr Ala Gly His Cys Gly 25 30 35

aqc tqq tac qcq aac tcc qcc aaq acc acq ctq etc Ser Trp Tyr Ala Asn Ser Ala Lys Thr Thr Leu Leu 40 45 50

OOa teO aOe tte cee OOe aae Oae tae OeO ate qtO Gly Ser Ser Phe Pro Gly Asn Asp Tyr Ala Ile Val 60 65

teO tae aea aae cae cee Ooe aeO qte oae etO tae Ser Tyr Thr Asn Bis Pro Gly Thr Val Asp Leu Tyr 75 80

eaO oae ate aeO tee Oee OOe aae OeO aet qttoqt Gln Asp Ile Thr Ser Ala Gly Asn Ala Thr Val Gly 90 95

eOe aqt oqt aOe aee aee OOe qte cae aOc OOe aqt Arq Ser Gly Ser Thr Thr Gly Val Bis Ser Gly Ser 105 UO U5

aae qee aee qtq aae tae qee qaa qqe aee qte aee Asn Ala Thr Val Asn Tyr Ala Glu Gly Thr Val Thr 120 125 130

aee aae qte tqe qee qaa qqe qqe qae tee qqe qqe Thr Asn Val Cys Ala Glu Gly Gly Asp Ser Gly Gly 140 145

Ooe aec qta oce etc ooe ctO ace tcc Ooc Ooc tcc Gly Thr Val Ala Leu Gly Leu Thr Ser Gly Gly Ser 155 160

tec Ooc QOc acc ace tae tte eaQ cee qte aee oaa Ser Gly Gly Thr Thr Tyr Phe Gln Pro Val Thr Glu 170 175

tac ooc qtc aoe qte Tyr Gly Val Ser Val 185

<210> 2

<211> 293

<212> PRT

<213> Kribbella solani

<400> 2

Met Lys Leu Ser Pro Phe Arq Arq Thr Thr -105 -100

Val 20

aae Asn

qot Gly

eaO Gln

aae Asn

eaO Gln 100

qte Val

qqe

Gly

qee Ala

Oqc Gly

qte Val 180

Ala -95

Arq Ser Gly

ate qee tee Ile Ala Ser

acq aco tac Thr Thr Tyr 55

tae aOe tee Tyr Ser Ser 70

Ooe tee tcO Gly Ser Ser 85

OeO qte aaO Ala Val Lys

aee 000 eto Thr Gly Leu

etq ate eqe Leu Ile Arq 135

etc tte qee Leu Phe Ala 150

aac toe tcc Asn Cys Ser 165

etc tee eoe Leu Ser ArO

Ile Leu Ala Ala

Ala -90

Gly Leu Ala Ala Ala Gly Leu Leu Ala Ser Gln Ala Ser Ala Ala Pro -85 -80 -75

Val Asn Pro Ser Ala Leu Ser Ala Ser Ala Ile Thr Ser Thr Leu Ser -70 -65 -60

Lys Asp Ala Thr Ile Pro Gly Thr Ala Trp Gln Thr Ala Pro Asp Gly -55 -50 -45

Arg Ile Ile Val Ser Tyr Asp Asp Thr Val Thr Gly Ala Lys Leu Ser -40 -35 -30

Lys

Leu Thr Ser Val Thr Lys Gln Phe Gly Gln Arg Ile Thr Leu Glu

-25

-20 -15 -10

Lys Met Lys Gly Lys

Leu Thr Lys Tyr Ile Ala Gly Gly Asp Ala Ile

~

-1 1 5

Tyr Gly Gly Gln Tyr Arg Cys Ser Leu Gly Phe Asn Val Arg Ser Gly 10 15 20

Ser Thr Tyr Tyr Phe Leu Thr Ala Gly His Cys Gly Asn Ile Ala Ser 25 30 35

Ser Trp Tyr Ala Asn Ser Ala Lys Thr Thr Leu Leu Gly Thr Thr Tyr 40 45 50 55

Gly Ser Ser Phe Pro Gly Asn Asp Tyr Ala Ile Val Gln Tyr Ser Ser 60 65 70

Ser Tyr Thr Asn His Pro Gly Thr Val Asp Leu Tyr Asn Gly Ser Ser 75 80 85

Gln Asp Ile Thr Ser Ala Gly Asn Ala Thr Val Gly Gln Ala Val Lys 90 95 100

Arg Ser Gly Ser Thr Thr Gly Val His Ser Gly Ser Val Thr Gly Leu 105 110 115

As n Ala Thr Val As n Tyr Ala Glu Gly Thr Val Thr Gly Leu Ile Arg 12 0 125 130 135

Thr Asn Val Cys Ala Glu Gly Gly Asp Ser Gly Gly Ala Leu Phe Ala 140 145 150

Gly Thr Val Ala Leu Gly Leu Thr Ser Gly Gly Ser Gly Asn Cys Ser 155 160 165

Ser Gly Gly Thr Thr Tyr Phe Gln Pro Val Thr Glu Val Leu Ser Arg 170 175 180

<210> 3

<211> 882

<212> DNA 5 <2 13> Kribbella aluminosa

<220>

<221 > CDS

<222> (1) ..(882)

<220>

<221 > sigyeptide

<222> (1) ..(90)

15 <220>

<221 > malJ)eplide

<222> (316)..(882)

<400> 3

atq aae atq tee eeq tte Met Asn Met Ser Pro Phe

Tyr Gly Val Ser Val 185

cqc cqt aee ete qet qte etq qee qeq qee 48 Arq Arq Thr Leu Ala Val Leu Ala Ala Ala

-105 -100 -95 -90

qqq ett qet qee aqe qqa etq etq qeq aeq eaq qee teq qee qea eeq 96 Gly Leu Ala Ala Ser Gly Leu Leu Ala Thr Gln Ala Ser Al. Al. Pro -85 -80 -75

qte qae eeq tee aee etq teq qee qee qeq ate aeq tee aee etq aqe 144 Val Asp Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ala Ala Ile Thr Ser Thr Leu Ser -70 -65 -60

qaq aae qeq aeq ate eee qqt aeq qeq tqq qaq aee qqe eet qae qqe 192 Glu Asn Ala Thr Ile Pro Gly Thr Ala Trp Glu Thr Gly Pro Asp Gly -55 -50 -45

eqq ate ate qtq teq tae qae qaq aee qte aee qqt qee aaq etq qeq 240 Arq Ile Ile val Ser Tyr Asp Glu Thr val Thr Gly Ala Lys Leu Ala -40 -35 -30

aaq etq aee aqe qtq aeq aaq eaq tte qqe aaq eqq ate aag ete qag 288 Lys Leu Thr Ser Val Thr Lys Gln Phe Gly Lys Arq Ile Lys Leu Glu -25 -20 -15 -10

aag atg tee qqe aaq etq aeq aaq tae ate qee qqe qqe qae qee ate 336 Lys Met Ser Gly Lys Leu Thr Lys Tyr Ile Ala Gly Gly ASp Ala Ile -5 -1 1 5

tae qqe qqq eaq tae eqe tqe teq ete qqe tte aae qtq eqe aqe qqe 384 Tyr Gly Gly Gln Tyr Arq Cys Ser Leu Gly Phe Asn Val Arq Ser Gly 10 15 20

aqe aee tae tae tte etq aee qeq qqe eae tqe qqq aae ate qeq tee Ser Thr Tyr Tyr Phe Leu Thr Ala Gly Bis Cys Gly Asn Ile Al. Ser 25 30 35

aqe tqq tae qeq aae tee aqe aaq aee aeq etq ete qqe aee qte qee 480

Ser Trp Tyr Ala Asn Ser Ser Lys Thr Thr Leu Leu Gly Thr Val Ala 20 40 4

qqt tea aqe tte cee qqe aae qae

tae qee ate qte aqq tae aqe aeq 528

Gly Ser Ser Phe Pro Gly Asn ASp

Tyr Ala Ile Val Arq Tyr Ser Thr

60

65 70

teq tae aee aae cae eeq qqe aee

qtq aae etc tae aae qqt teq tee 576

Ser Tyr Thr Asn Bis Pro Gly Thr

V.l Asn Leu Tyr Asn Gly Ser Ser

75

80 85

eaq qae ate aeq tee qee qqe aae

qee tae qtq qqe eaq qeq qte aaq 62.

Gln Asp Ile Thr Ser Ala Gly Asn

Ala Tyr Val Gly Gln Ala val Lys

90 95

100

eqe aqt qqt aqe aeq aee qqt qtq

cae aqe qqe teq qte aee qeq aee 672

Arq Ser Gly Ser Thr Thr Gly Val

His Ser Gly Ser Val Thr Ala Thr

105 UO

U5

aae qee aeq qte aae tae qee qaa

qqe aee qte aee qqe etq ate eqe 720

Asn Ala Thr Val Asn Tyr Ala Glu

Gly Thr Val Thr Gly Leu Ile Arq

120 125

130 135

aee .e. qte tqe qee qaa qqe qqe

qae tee qqe qqe qee etq tte qee 768

Thr Thr Val Cys Ala Glu Gly Gly

Asp Ser Gly Gly Ala Leu Phe Ala

140

"5 150

qqe aee qta qee etc qqe etq aee

tee qqe qqe tee qqe aae tqe tea 816

Gly Thr Val Ala Leu Gly Leu Thr

Ser Gly Gly Ser Gly Asn Cys Ser

155

160 165

tee qqe qqe aee aee tae tte eaq

cee qte aee qaa qte etc tee eqe 86.

Ser Gly Gly Thr Thr Tyr Phe Gln

Pro Val Thr Glu Val Leu Ser Arq

170 175

1SO

tae qqe qtq aqe qte tae

882

Tyr Gly Val Ser Val Tyr

1

<210> 4

<211> 294

<212> PRT

<213> Kribbella aluminosa

<400> 4

Met Asn Met Ser Pro Phe Arg Arg Thr Leu Ala Val Leu Ala Ala Ala -105 -100 -95 -90

Gly Leu Ala Ala Ser Gly Leu Leu Ala Thr Gln Ala Ser Ala Ala Pro -85 -80 -75

val ASp Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ala Ala tle Thr Ser Thr Leu Ser -70 -65 -60

Glu Asn Ala Thr tle Pro Gly Thr Ala Trp Glu Thr Gly Pro Asp Gly -55 -50 -45

Arq Ile tle val Ser Tyr ASp Glu Thr val Thr Gly Ala Lys Leu Ala -40 -35 -30

Lys Leu Thr Ser Val Thr Lys Gln Phe Gly Lys Arq Ile Lys Leu Glu

-25 -20 -15 -10

Lys Met Ser Gly Lys Leu Thr Lys Tyr Ile Ala Gly Gly Asp Ala Ile

-5 -1 1 5

Tyr Gly Gly Gln Tyr Arq Cys Ser Leu Gly Phe Asn Val Arq Ser Gly

10 15 20

Ser Thr Tyr Tyr Phe Leu Thr Ala Gly His Cys Gly Asn Ile Ala Ser

25 30 35

Ser Trp Tyr Ala Asn Ser Ser Lys Thr Thr Leu Leu Gly Thr Val Ala

40 45 50 55

Gly Ser Ser Phe Pro Gly Asn Asp Tyr Ala Ile Val Arg Tyr Ser Thr

60 65 70

Ser Tyr Thr Asn His Pro Gly Thr Val Asn Leu Tyr Asn Gly Ser Ser

75 80 85

Gln ASp Ile Thr Ser Ala Gly Asn Ala Tyr Val Gly Gln Ala Val Lys

90 95 100

Arg Ser Gly Ser Thr Thr Gly Val His Ser Gly Ser Val Thr Ala Thr

105 110 115

Asn Ala Thr Val Asn Tyr Ala Glu Gly Thr Val Thr Gly Leu Ile Arq

120 125 130 135

Thr Thr Val Cys Ala Glu Gly Gly Asp Ser Gly Gly Ala Leu Phe Ala

140 145 150

Gly Thr Val Ala Leu Gly Leu Thr Ser Gly Gly Ser Gly Asn Cys Ser

155 160 165

Ser Gly Gly Thr Thr Tyr Phe Gln Pro Val Thr Glu Val Leu Ser Arq

170 175 180

Tyr Gly Val Ser Val Tyr

5

<210> 5 <211> 888 <212> DNA <213> Kribbel1a f1 avida <220> <221> CDS <222> (1 )..(888)

10

<220> <221> sig-.peptide <222> (1) ..(84)

15

<220> <221> mat_peptide <222> (319) ..(888)

<400> 5

atg egt Met Arg -105

att cge cgt gee gtg Ile Arg Arg Ala Val -100 gee etg etg gea Ala Leu Leu Ala ace gee ggt ctg gee Thr Ala Gly Leu Ala -95 48

aee Thr -90

aee aee gtt eag etc gea gee eeg gee aae geg gee eeg ggt Thr Thr Val Gln Leu Ala Ala Pro Ala Asn Ala Ala Pro Gly -85 -80 gge Gly -75 96

gag gea cee gce gte Glu Ala Pro Ala Val -70

aee teg geg age Thr Ser Ala Ser age ate aee gee aee Ser Ile Thr Ala Thr -65 etg gee Leu Ala -60 144

aag gag geg tcg ate eeg gge aee Lys Glu Ala Ser Ile Pro Gly Thr -55

gee Ala -50 tgg atg aee gae Trp Met Thr Asp gag Glu -45 aag tee Lys Ser 192

gge ege ate ate gte teg tae Gly Arg Ile Ile Val Ser Tyr -40

gae Asp -35 gae aee gtg age Asp Thr Val Ser gge Gly -30 gge aag tte Gly Lys Phe 240

gee get etc ace gee gte Ala Ala Leu Thr Ala Val -25

aee Thr -20 aag ege tte gge age Lys Arg Phe Gly Ser -15 eag gte gtg etg Gln Val Val Leu 288

gag Glu -la

aag etg cee gge gta etc age aag Lys Leu Pro Gly Val Leu Ser Lys -5 egg Arg -1 ate age gge gga Ile Ser Gly Gly 1 eag gee Gln Ala 5 336

ate tae ggt gqe gge tae ege tge Ile Tyr Gly Gly Gly Tyr Arq Cys 10

teg Ser 15 etc gge tte aae gte ege gae Leu Gly Phe Asn Val Arq Asp 20 384

age gee gge ace tae tae tte Ser Ala Gly Thr Tyr Tyr Phe 25

ate Ile 30 ace gee gge cae Thr Ala Gly His tge aee aae teq Cys Thr Asn Ser 35 432

gee Ala

age Ser 40 aee tqg tae gee aae Thr Trp Tyr Ala Asn 45 teg teq eag tee Ser Ser Gln Ser aee Thr 50 gtq etc gge aee Val Leu Gly Thr 480

egg Arg 55

aee gge aqe age tte ecg gge aae gae tae gge Thr Gly Ser Ser Phe Pro Gly Asn Asp Tyr Gly 60 65 ate gte egg tae Ile Val Arq Tyr 70 528

aqe aeg teg tae Ser Thr Ser Tyr

aeg aae Thr Asn 75 cae cee gge Bis Pro Gly aae Asn 80 gtq tae etc tae aae Val Tyr Leu Tyr Asn 85 gge Gly 576

teg tae eag gae

ate ace acg gcg gge aae geg tce gte gge eag gee 624

Ser Tyr Gln Asp Ile Thr Thr Ala Gly Asn Ala Ser Val Gly Gln Ala 90 95 100

qtq cqc cqc aqe qqe aqe aee aee qqt etq eqe aqe qqe teq qte aee 672 Val Arq Arq Ser G1y Ser Thr Thr Gly Leu Arq Ser Gly Ser Val Thr 105 110 115

qqe qte aae qeq aeq qtq aae tae eee qaq qqe tee qte aqe qqe etq 720 Gly Val Asn Ala Thr Val Asn Tyr Pro Glu Gly Ser Val Ser Gly Leu 120 125 130

ate eqe aee aae qte tqe qee qaa qqe qqe qae tee qqe qqe tea etq 768 ne Arq Thr Asn Val Cys Ala Glu Gly Gly Asp Ser Gly Gly Ser Leu 135 140 145 150

tte qee qqe tee aee qee etq -etq aee tee qqe qqe aqe qqe aae 816 Phe Ala Gly Ser Thr Ala Leu Gly Leu Thr Ser Gly Gly Ser Gly Asn 155 160 165

tqe tee aee qqe qqe aeq aee tae tte eaq eee qte ate qaq qte ete 864 Cy. Ser Thr Gly Gly Thr Thr Tyr Phe Gln Pro Vel ne Glu Vel Leu 170 175 180

aae eqe tae qqe qte aae qte tae 888 Asn Arq Tyr Gly Val Asn Val Tyr 185 190

<210> 6

<211> 296

<212> PRT

<213> Kribbella flavida

<400> 6

Met Arg Ile Arg Arg Ala Val Ala Leu Leu Ala Thr Ala Gly Leu Ala -1 05 -100 -95

Thr Thr Thr Val Gln Leu Ala Ala Pro Ala Asn Ala Ala Pro Gly Gly -90 -85 -80 -75

Glu Ala Pro Ala Val Thr Ser Ala Ser Ser Ile Thr Ala Thr Leu Ala -70 -65 -60

Lys Glu Ala Ser Ile Pro Gly Thr Ala Trp Met Thr ASp Glu Lys Ser -55 -50 -45

Gly Arg Ile Ile Val Ser Tyr Asp Asp Thr Val Ser Gly Gly Lys Phe -40 -35 -30

Ala Ala Leu Thr Ala Val Thr Lys Arg Phe Gly Ser Gln Val Val Leu -25 -20 -15

Glu Lys Leu Pro Gly Val Leu Ser Lys Arq Ile Ser Gly Gly Gln Ala -10 -5 -1 1 5

I~e Tyr Gly Gly Gly Tyr Arq Cys Ser Leu Gly Phe Asn Val Arq Asp 10 15 20

Ser Ala Gly Thr Tyr Tyr Phe Ile Thr Ala Gly His Cys Thr Asn Ser 25 30 35

A~a Ser Thr Trp Tyr Ala Asn Ser Ser Gln Ser Thr val Leu Gly Thr 40 45 50

Arq Thr Gly Ser Ser Phe Pro Gly Asn Asp Tyr Gly Ile Val Arq Tyr 55 60 65 70

Ser Thr Ser Tyr Thr Aso Bis Pro Gly Asn Val Tyr Leu Tyr Aso Gly 75 80 85

Ser Tyr Gln Asp Ile Thr Thr Ala Gly Asn Ala Ser Val Gly Gln Ala 90 95 100

Val Arq Arq Ser Gly Ser Thr Thr Gly Leu Arq Ser Gly Ser Val Thr 105 110 115

Gly Val Aso Ala Thr Val Asn Tyr Pro Glu Gly Ser Val Ser Gly Leu 120 125 130

Ile Arq Thr Aso Val Cys Ala Glu Gly Gly Asp Ser Gly Gly Ser Leu 135 140 145 150

Phe Ala Gly Ser Thr Ala Leu Gly Leu Thr Ser Gly Gly Ser Gly Asn 155 160 165

Cys Ser Thr Gly Gly Thr Thr Tyr Phe Gln Pro Val Ile Glu val Leu 170 175 180

Asn Arq Tyr Gly Val Aso Val Tyr

185 190

<210> 7

<211> 1473 5 <212> DNA

<213> Nocardiopsis sp.

<220>

<221> CDS 10 <222> (318) ..(1463)

<220>

<221> sigyeptide

<222> (318) ..(404)

<220>

<221> maU)eptide

<222> (900) ..(1463)

<400> 7

aegtttggta egggtaeegg tgteegeatg tggeeagaat geeeeettge gaeagggaae

60

gqattcggtc ggtagcgcat cgactccgac aaccgcgagg tggccgttcg cgtcgccacg

120

ttctgcgacc gtcatgcgac ccatcatcgg gtgaccccac cgagctctga atggtccacc

180

gttctgacgg tettteeete aeeaaaaegt geaeetatgg ttaggaegtt gtttaeegaa

240

tgteteggtg aacgaeaggg gecggaeggt atteggcecc gateeceegt tgatceeece

300

aggagagtag ggaeeec atg cqa

cee tee cec gtt gtc tce gcc ate gqt 350

Met Arg Pro Ser Pro Val Val Ser Ala Ile Gly -190 -185

aeg gga gcg etg Thr Gly Ala Leu -180

gec etc geg gce Ala Leu Ala Ala -165

gce gae gcg gte Ala Asp Ala Val -150

etg acc tcc gcc Leu Thr Ser Ala -135

gce tte gag gte Ala Phe Glu Val -120

tac ggc ggc tcc Tyr Gly Gly Ser -105

gee ttc ggt etg geg Ala Phe Gly Leu Ala -175

ace gga geg etc cee Thr Gly Ala Leu Pro -160

tee atg eag gag geg Ser Met Gln Glu Ala -145

gag gec gag gag ctg Glu Ala Glu Glu Leu -130

gae gag gec geg gec Asp Glu Ala Ala Ala -115

gtc ttc gac aec gag Val Phe Asp Thr Glu -100

etg tee ggt aee eeg Leu Ser Gly Thr Pro -170

gqt Gly 395

cag tea cee aee ccg Gln Ser Pro Thr Pro -155

gag Glu 440

etc eag ege gae Leu Gln Arg Asp

etc Leu -140 gae Asp 4B5

ctg gee gce cag gac Leu Ala Ala Gln Asp -125

aee Thr 530

gag gee gce ggg gae Glu Ala Ala Gly Asp -110

gee Ala 575

age ctg gaa ctg acc gtc etg Ser Leu Glu Leu Thr Val Leu -95

623

gtc aec gat gcc gec geg gte gag gee gtg gag gce acc ggc gee ggg 671 Val Thr Asp Ala Ala Ala Val Glu Ala Val Glu Ala Thr Gly Ala Gly -90 -B5 -BO

aec gag etg gte tce tae gge ate gae ggt etc gac gag ate gte eag 719 Thr Glu Leu Val Ser Tyr Gly Ile Asp Gly Leu Asp Glu Ile Val Gln

-

75

gag etc aac gcc gcc Glu Leu Asn Ala Ala -60

gac gtg geg ggt gac Asp Val Ala Gly Asp -40

-

70

gae gee gtt cee Asp Ala Val Pro -55

ace gte gte ctg Thr Val Val Leu

gce gae gte age gge ctg etc gcg gae Ala Asp Val Ser Gly Leu Leu Ala Asp -25 -20

-

65

ggt gtg gtc ggc tgg tae eeg 767 Gly Val Val Gly Trp Tyr Pro -50 -45

gag gte ctg gag ggt tee gga BIS Glu Val Leu Glu Gly Ser Gly -35 -30

gce gge gtg gae gee tcg gcc B63 Ala Gly Val Asp Ala Ser Ala -15

gtc gag gtq ace acq age gae eag cee gag etc tae gce gac ate ate

Val Glu Val -la

Thr Thr Ser Asp Gln Pro Glu Leu Tyr Ala Asp Ile Ile -5 -1 1

qqt qqt Gly Gly 5

etq gee tae Leu Ala Tyr aee atq qqe qqe cge tgt tcq gte qge tte Thr Met Gly Gly Arq Cys Ser Val Gly Phe la 15 qeq Ala 20 959

qee aee aae qee qee Ala Thr Asn Ala Ala 25

qqt eaq Gly Gln cee qqq tte qte aee qee qqt cae tqe Pro Gly Phe Val Thr Ala Gly His Cys 30 35 1007

qqe eqe qtq qqe aee eaq qtq Gly Arq Val Gly Thr Gln Val 40

aec Thr ate Ile 45 ggc aae ggc agg gge gte ttc Gly Asn Gly Arg Gly Val Phe 50 1055

gag cag tce gte tte cee gge aae Glu Gln Ser Val Phe Pro Gly Asn 55 60

qae qeq qee tte Asp Ala Ala Phe qte Val 65 ege qqt acg Arq Gly Thr 1103

tce aae Ser Asn 70

tte aeg ctg aec aac Phe Thr Leu Thr Asn 75 ctq qte age ege tae aae Leu Val Ser Arq Tyr Asn 80 ace qge ggq Thr Gly Gly 1151

tae qce acq qtc qec Tyr Ala Thr Val Ala 85

oqt Gly 90 cae aac cag gce His Asn Gln Ala eec Pro 95 ate qge Ile Gly tce tce Ser Ser qte Val 100 1199

tge ege tee qqe eys Arg Ser Gly

tee aee aee qqt tqq cae t qe gqe aee ate Ser Thr Thr Gly Trp His Cys Gly Thr Ile 105 110 eag gec Gln Ala 115 1247

ege gge eaq teq gtg agc tac cee Arq Gly Gln Ser Val Ser Tyr Pro 120

qaq Glu 125 gge ace qte ace aae atg aec Gly Thr Val Thr Asn Met Thr 130 1295

egg acc aee gtg tqe gee gag cee Arg Thr Thr Val Cys Ala Glu Pro 135 140

gqe gae tee gqe gqe Gly Asp Ser Gly Gly 145 tee tae ate Ser Tyr Ile 1343

tee gge Ser Gly 150

aee eag gee eag gge gtg Thr Gln Ala Gln Gly Val 155 aee tee gge Thr Ser Gly O"C Gly 160 tee gqe aae Ser Gly Asn tge Cys 1391

ege aee gge ggg aee aee Arq Thr Gly Gly Thr Thr 165 170

tte tae eag gag gte Phe Tyr G1n G1u Val 175 aee cee atg gtg aae Thr Pro Met Val Asn 180 1439

5

tee tqq qqe qte cqt etc cqq aec Ser Trp Gly val Arq Leu Arq Thr <210> 8 <211 > 382 <212> PRT <213> Nocardiopsis sp. 185 tqatececqc 1473

<400> 8 Met Arg Pro

Ser Pro -190 Val Val Ser Ala Ile -185 Gly Thr Gly Ala Leu -lBO

Ala Phe Gly Leu Ala Leu Ser Gly Thr Pro Gly Ala Leu Ala Ala -175 -170 -165

Thr Gly Ala Leu Pro Gln Ser Pro Thr Pro Glu Ala Asp Ala Val -160 -155 -150

Ser Met Gln Glu Ala Leu Gln Arq Asp Leu Asp Leu Thr Ser Ala -145 -140 -135

Glu Ala Glu Glu Leu Leu Ala Ala Gln Asp Thr Ala Phe Glu Val -130 -125 -120

Asp Glu Ala Ala Ala Glu Ala Ala Gly Asp Ala Tyr Gly Gly Ser -115 -110 -105

Val Phe Asp Thr Glu Ser Leu Glu Leu Thr Val Leu Val Thr Asp Ala -100 -95 -90

Ala Ala Val Glu Ala Val Glu Ala Thr Gly Ala Gly Thr Glu Leu Val -85 -80 -75

Ser Tyr Gly Ile Asp Gly Leu Asp Glu Ile Val Gln Glu Leu Asn Ala -70 -65 -60

Ala Asp Ala Val Pro Gly Val Val Gly Trp Tyr Pro Asp Val Ala Gly -55 -50 -45

Asp Thr Val Val Leu Glu Val Leu Glu Gly Ser Gly Ala Asp Val Ser -40 -35 -30 -25

Gly Leu Leu Ala Asp Ala Gly Val Asp Ala Ser Ala Val Glu Val Thr -20 -15 -10

Thr Ser Asp Gln Pro Glu Leu Tyr Ala Asp Ile Ile Gly Gly Leu Ala -5 -1 1 5

Tyr Thr Met Gly Gly Arq Cys Ser Val Gly Phe Ala Ala Thr Asn Ala 10 15 20

Ala Gly Gln Pro Gly Phe Val Thr Ala Gly Mis Cys Gly Arq Val Gly 25 30 35 40

Thr Gln Val Thr Ile Gly Asn Gly Arg Gly Val Phe Glu Gln Ser Val 45 50 55

Phe Pro Gly Asn Asp Ala Ala Phe Val Arq Gly Thr Ser Asn Phe Thr 60 65 70

Leu Thr Asn Leu Val Ser Arq Tyr Asn Thr Gly Gly Tyr Ala Thr Val 75 80 85

Ala Gly His Asn Gln Ala Pro Ile Gly Ser Ser Val Cys Arq Ser Gly 90 95 100

Ser Thr Thr Gly Trp His Cys Gly Thr Ile Gln Ala Arq Gly Gln Ser 105 110 115 120

Val Ser Tyr Pro Glu Gly Thr Val Thr Asn Met Thr Arq Thr Thr Val 125 130 135

Cys Ala Glu Pro Gly Asp Ser Gly Gly Ser Tyr Ile Ser Gly Thr Gln 140 145 150

Ala Gln Gly Val Thr Ser Gly Gly Ser Gly Asn Cys Arq Thr Gly Gly 155 160 165

Thr Thr Phe Tyr Gln Glu Val Thr Pro Met Val Asn Ser Trp Gly Val 170 175 180

Arq Leu Arq Thr 185

<210> 9

<211> 47 5 <212> ONA

<213> sintético

<220>

<221> cebador 10 <222> (1) ..(47)

<400> 9 ctmagltc alcgalcgca Icggclgcac cgglgaaccc gtccgcg 47

15 <210> 10

<211> 51

<212> DNA

<213> sintético

20 <220>

<221> cebador

<222> (1) ..(51)

<400> 10 25 gggccaaggc cggmltla tgmlagac gctgacgccg tagcgggaga 9 51

<210> 11

<211> 44

<212> DNA 30 <213> sintético

5

<220> <221 > cebador <222> (1 ) .. (44) <400> 11 ctlltagllc atcgatcgca tcggctgcac cggtcgaccc gtcc 44

<210>12 <211 > 41 <212> DNA <213> sintético

15

<220> <221> cebador <222> (1 ) .. (41)

<400> 12 ccaaggccgg IIlIlIatgt IIcagtagac gctcacgccg t

41

25

<210> 13 <211>21 <212> DNA <213> sintético <220> <221> cebador <222> (1 ) .. (21)

<400> 13 gagtatcgcc agtaaggggc 9

21

35

<210>14 <211>22 <212> DNA <213> sintético

<220> <221> cebador <222> (1 ) .. (22)

<400> 14 agccgatgcg atcgatgaac ta

22

45

<210> 15 <211>25 <212> DNA <213> sintético

<220> <221> cebador <222> (1) ..(25)

55

<400> 15 laaaacalaa aaaaccggcc Ilggc 25

<210>16 <211>23 <212> DNA <213> sintético

65

<220> <221> cebador <222> (1) ..(23) <400> 16

gcagccclaa aalcgcalaa agc

23

5

<210> 17 <211>23 <212> PRT <213> Bacillus lentus

10

<220> <221> sei\al <222> (1) ..(23)

<400> 17 Met Lys Lys 1

Pro Leu Gly Lys 5 Ile Val Ala 10 Se r Thr Ala Le u Leu 15 I l e

Ser Val Ala Phe 2 0

Ser Ser Ser

Claims (19)

1. REIVINDICACIONES

   1. Polipéptido aislado que tiene actividad de proteasa, seleccionado del grupo que consiste en:

   (a) un polipéptido con al menos 85% de identidad de secuencia al polipéptido maduro de SEO ID NO:2 y{o 5 SEO ID NO:4 y{o

   (b) un polipéptido codificado por un polinucleótido con al menos 86% identidad de secuencia a la secuencia codificante del polipéptido maduro de SEO ID NO:1 o SEO ID NO:3.

2. 2.

   Polipéptido según la reivindicación 1, que comprende o consiste en SEO ID NO:2 o SEO ID NO:4.

3. 3.

   Polipéptido según la reivindicación 1, que es un fragmento de bien SEO ID NO:2 o SEO ID NO:4, donde el fragmento tiene actividad de proteasa.

4. 4.

   Polipéptido variante que tiene actividad de proteasa y al menos 85% de identidad de secuencia al

   15 polipéptido maduro de SEO ID NO:2 y{o SEO ID NO:4, que comprende una sustitución, deleci6n, y{o inserción de uno o más (varios) aminoácidos del polipéptido maduro de SEO ID NO:2 o SEO ID NO:4.

5. 5.

   Composición que comprende el polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1-4.

6. 6.

   Composición según la reivindicación 5, donde la composición está en forma de un granulado o un microgranulado.

7. 7.

   Polinucleótido aislado que codifica el polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1-4.

   25 8. Constructo de ácidos nucleicos o vector de expresión que comprende el polinucleótido según la reivindicación 7 operativa mente enlazado a una o más (diferentes) secuencias de control que dirigen la producción del polipéptido en una célula huésped de expresión.

8. 9.

   Célula huésped de expresión recombinante que comprende un polinucleótido según la reivindicación 7 operativamente enlazada a una o más secuencias de control que dirigen la producción del polipéptido.

9. 10.

   Método pata producir el polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1-4, que comprende:

   (a) cultivo de una célula, que en su forma tipo salvaje produce el polipéptido, bajo condiciones propicias para

   la producción del polipéptido; y 35 (b) recuperación del polipéptido.
10. 11. Método para producir el polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1-4, que comprende:

    (a)

    cultivo de una célula huésped según la reivindicación 9 bajo condiciones propicias para la producción del polipéptido; y

    (b)

    recuperación del polipéptido.

11. 12. Uso de al menos un polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 1-4 en el pienso animal; en los aditivos de pienso para animales; en la preparación de una composición para usar en el pienso para an imales; para mejorar el valor nutricional de un pienso para animales; para aumentar la proteína digerible

    45 y{o soluble en el pienso para animales; para aumentar el grado de hidrólisis de proteinas en dietas animales; y{o para el tratam iento de proteínas.

12. 13.

    Método para mejorar el valor nutricional de un pienso para animales, donde al menos un polípéptido de cualquiera de las reivindicaciones 1-4 se añade al pienso.

13. 14.

    Aditivo de pienso que comprende al menos un polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 1-4; yal menos una vitamina liposoluble, y{o al menos una vitamina hidrosoluble, y{o al menos un oligoelemento.

14. 15.

    Aditivo de pienso según la reivindicación 14, que comprende además una o más amilasas, fitasas,

    55 xilanasas, galaclanasas, alfa-galaclosidasas, proleasas, fosfolipasas; beta-glucanasas, o cualquier mezcla de las mismas.

15. 16.

    Pienso para animales con un contenido bruto de proteína de 50 a 800 gfkg Y que comprende al menos un pOlipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 1-4.

16. 17.

    Método para el tratamiento de proteinas, que comprende el paso de adición de al menos un polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 1-4 a al menos una proteína o fuente de proteína.

17. 18.

    Uso de al menos un polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 1-4 en detergentes.

18. 19.

    Composición de detergente que comprende al menos un polipéptido de las reivindicaciones 1 a 4.

19. 20.

    Composición de detergente según la reivindicación 19, donde la composición comprende una o varias otras enzimas seleccionadas del grupo que comprende proleasas, amilasas, lipasas. CUlinasas, celulasas, endoglucanasas, xiloglucanasas. pectinasas. pectina liasas, xanlanasas, peroxidasas. haloperoxigenasas, catalasas y mananasas, o cualquier mezcla de las mismas.