CN1606567A - 来自假黑盘菌的抗微生物多肽 - Google Patents

Abstract

本发明涉及具有抗微生物活性的多肽和具有编码该多肽的核苷酸序列的多核苷酸。本发明也涉及核酸构建体、载体和包含该核酸构建体的宿主细胞以及产生和使用该多肽的方法。

Description

来自假黑盘菌的抗微生物多肽

发明领域

本发明涉及具有抗微生物活性的多肽和具有编码该多肽的核苷酸序列的多核苷酸。本发明也涉及核酸构建体、载体和包含该核酸构建体的宿主细胞以及生产和使用该多肽的方法。

发明背景

本发明的目的是提供具有抗微生物活性的多肽和编码该多肽的多核苷酸。

发明概述

本发明第一个方面涉及有抗微生物活性的多肽，其选自：

(a)包含与SEQ ID NO：2的1-40位氨基酸有至少65％同一性的氨基酸序列的多肽；

(b)包含与假黑盘菌(Pseudoplectania nigrella)CBS 444.97中存在的核苷酸序列的抗微生物多肽编码部分编码的多肽有至少65％同一性的氨基酸序列的多肽；

(c)由与选自下列的多核苷酸探针在低严谨条件下杂交的核苷酸序列编码的多肽：

(i)SEQ ID NO：1的166-285位核苷酸的互补链，

(ii)SEQ ID NO：1的70-285位核苷酸的互补链，和

(iii)SEQ ID NO：1的1-285位核苷酸的互补链，以及

(d)有抗微生物活性的(a)、(b)或(c)的片段。

本发明第二个方面涉及具有编码本发明多肽的核苷酸序列的多核苷酸。

本发明第三个方面涉及包含将编码本发明多肽的核苷酸序列可操作地连接到一种或多种在适和的宿主中控制多肽产生的调控序列上的核酸构建体。

本发明第四个方面涉及包含本发明核酸构建体的重组表达载体。

本发明第五个方面涉及包含本发明核酸构建体的重组宿主细胞。

本发明第六个方面涉及产生本发明多肽的方法，该方法包括：

(a)培养其野生型能够产生该多肽的菌株以产生该多肽；并

(b)回收该多肽。

本发明第七个方面涉及产生本发明多肽的方法，该方法包括：

(a)在有益于产生该多肽的条件下培养本发明的重组宿主细胞；并

(b)回收该多肽。

本发明的其他方面将在下述说明书和所附的权利要求中表明。

定义

在进一步详细讨论本发明之前，先定义下列术语和惯用语：

基本上纯的多肽：本发明上下文中，术语“基本上纯的多肽”指含有最多10％重量的与其天然缔合的其他多肽物质(更低百分比的其他多肽物质是优选的，例如最多8％重量、最多6％重量、最多5％重量、最多4％重量、最多3％重量、最多2％重量、最多1％重量和最多1/2％重量)的多肽制品。因此，优选基本上纯的多肽是至少92％纯，即该多肽组成制品中总的多肽物质重量的至少92％，并且更高百分比是优选的，例如至少94％纯、至少95％纯、至少96％纯、至少96％纯、至少97％纯、至少98％纯，至少99％纯和最多99.5％纯。在此公开的多肽优选基本纯的形式。特别地，优选在此公开的多肽是“实质上纯的形式”，即该多肽制品实质上不含有与其天然缔合的其他多肽物质。这可例如通过公知的重组方法的方式制备多肽实现。在此，术语“基本上纯的多肽”与术语“分离的多肽”和“分离形式的多肽”是同义的。

抗微生物活性：术语“抗微生物活性”在此定义为能够杀死或抑制微生物细胞生长的活性。本发明上下文中的术语“抗微生物”意指具有杀细菌的和/或制细菌的和/或杀真菌的和/或制真菌的效果和/或杀病毒的效果，其中术语“杀细菌的”可理解为能够杀死细菌细胞。术语“制细菌的”可理解为能够抑制细菌生长，即抑制正在生长的细菌细胞。术语“杀真菌的”可理解为能够杀死真菌细胞。术语“制真菌的”可理解为能够抑制真菌生长，即抑制正在生长的真菌细胞。术语“杀病毒的”可理解为能够使病毒失活。术语“微生物细胞”表示细菌或真菌细胞(包括酵母)。

本发明上下文中的术语“抑制微生物细胞的生长”意指细胞处于非生长状态，即它们不能够繁殖。

为了本发明的目的，抗微生物活性可根据Lehrer等人，免疫学方法杂志(Journal of Immunological Methods)，137(2)，167-174页，1991中描述的方法确定。

有抗微生物活性的多肽能够在其25％(w/w)的水溶液中，优选在10％(w/w)的水溶液中，更优选在5％(w/w)的水溶液中，甚至更优选在1％(w/w)的水溶液中，最优选在0.5％(w/w)的水溶液中，以及特别地在其0.1％(w/w)有抗微生物活性的多肽的水溶液中，于20℃孵育30分钟后，减少大肠杆菌(Escherichia coli)(DSM 1576)活细胞的数量至1/100。

有抗微生物活性的多肽也能够当其以1000ppm的浓度加入，优选当其以500ppm的浓度加入，更优选当其以250ppm的浓度加入，甚至更优选当其以100ppm的浓度加入；最优选当其以50ppm的浓度加入，以及特别地当其以25ppm的浓度加入微生物生长的培养基时，于25℃抑制大肠杆菌(DSM 1576)的生长晕24小时。

有抗微生物活性的多肽能够在其25％(w/w)的水溶液中，优选在10％(w/w)的水溶液中，更优选在5％(w/w)的水溶液中，甚至更优选在1％(w/w)的水溶液中，最优选在0.5％(w/w)的水溶液中，以及特别地在含0.1％(w/w)有抗微生物活性的多肽的水溶液中，于20℃孵育30分钟后，减少枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)(ATCC 6633)活细胞的数量至1/100。

有抗微生物活性的多肽也能够当其以1000ppm的浓度加入，优选当其以500ppm的浓度加入，更优选当其以250ppm的浓度加入，甚至更优选当其以100ppm的浓度加入；最优选当其以50ppm的浓度加入，以及特别的当其以25ppm的浓度加入微生物生长的培养基时，于25℃抑制枯草芽孢杆菌(ATCC 6633)的生长晕24小时。

本发明的多肽应优选具有由SEQ ID NO：2的1-40位氨基酸所示的氨基酸序列组成的多肽的至少20％的抗微生物活性。在一个特别优选的实施方案中，该多肽应具有由SEQ ID NO：2的1-40位氨基酸所示的氨基酸序列组成的多肽的至少40％、例如至少50％、优选至少60％、例如至少70％、更优选至少80％、例如至少90％、最优选至少95％、例如大约或至少100％的抗微生物活性。

同一性：本发明的上下文中，两种氨基酸序列之间或两种核苷酸序列之间的同源性用参数“同一性”来描述。

为了本发明的目的，两种氨基酸序列之间同一性的程度通过利用包括在FASTA程序包(参见W.R.Pearson和D.J.Lipman(1988)，“生物序列分析的改进工具”(“Improved Tools for Biologocal Sequence Analysis”)，PNAS 85：2444-2448；和W.R.Pearson(1990)“使用FASTP和FASTA的快速和灵敏的序列比较”(“Rapid and Sensitive Sequence Comparisonwith FASTP and FASTA”)，酶学方法(Methods in Enzymology)183：63-98)的2.0x版本中的FASTA程序确定。使用的评分矩阵是BLOSUM50，缺口罚分是-12，且缺口延伸罚分是-2。

两种核苷酸序列之间同一性的程度通过利用与上述相同的算法和软件包确定。使用的评分矩阵是同一性矩阵，缺口罚分是-16，且缺口延伸罚分是-4。

片段：在此所用的SEQ ID NO：2的“片段”是该氨基酸序列的氨基端和/或羧基端有一个或多个氨基酸删除的多肽。

等位基因变体：本发明的上下文中，术语“等位基因变体”表示占据相同染色体基因座的基因的任何两种或多种备选的形式。等位基因变体通过突变自然出现，并可在种群中导致多态性。基因突变可以是沉默的(编码的多肽中没有变化)或可能编码具有改变氨基酸序列的多肽。多肽的等位基因变体是由基因的等位基因变体编码的多肽。

基本上纯的多核苷酸：术语“基本上纯的多核苷酸”在此指多核苷酸制品，其中多核苷酸已从其天然的遗传环境中分离出，因此不含外来的或不需要的编码序列并是适合在遗传工程蛋白质生产系统中使用的形式。因此，基本上纯的多核苷酸含有最多10％重量的与其天然缔合的其他多核苷酸物质(更低百分比的其他多核苷酸物质是优选的，例如最多8％重量、最多6％重量、最多5％重量、最多4％重量、最多3％重量、最多2％重量、最多1％重量和最多1/2％重量)。但是，基本上纯的多核苷酸可包括天然存在的5’和3’非翻译区，例如启动子和终止子。优选基本上纯的多核苷酸是至少92％纯，即该多核苷酸组成制品中总的多核苷酸物质重量的至少92％，并且更高百分比是优选的，例如至少94％纯、至少95％纯、至少96％纯、至少96％纯、至少97％纯、至少98％纯、至少99％纯和最多99.5％纯。在此公开的多核苷酸优选地为基本纯的形式。特别地，优选在此公开的多核苷酸是“实质上纯的形式”，即该多核苷酸制品实质上不含有与其天然缔合的其他多核苷酸物质。在此，术语“基本上纯的多核苷酸”与术语“分离的多核苷酸”和“分离形式的多核苷酸”是同义的。

修饰：本发明的上下文中术语“修饰”意指对由SEQ ID NO：2位1-40位氨基酸所示的氨基酸序列组成的多肽进行的任何化学修饰以及对编码该多肽的DNA的遗传操作。该修饰可以是氨基酸侧链的置换，目标氨基酸中或目标氨基酸处的替换、删除和/或插入。

人工变体：在此所用的术语“人工变体”指由表达与SEQ ID NO：1相比经修饰基因的生物产生的有抗微生物活性的多肽。能在合适的宿主中表达产生所述变体的经修饰基因是通过修饰SEQ ID NO：1中公开的核苷酸序列的人为干涉获得的。

cDNA：上下文中用到的术语“cDNA”指涵盖可通过逆转录对分离自真核细胞的成熟剪接的mRNA分子而制备的DNA分子。cDNA缺少通常存在于相应的基因组DNA中的内含子序列。最初的初级RNA转录物是mRNA的前体并且它在作为成熟剪接的mRNA出现前经历一系列的加工。这些加工包括通过称为剪接的处理以除去内含子序列。当cDNA来自mRNA时它因此缺少内含子序列。

核酸构建体：在此所用的术语“核酸构建体”指分离自天然存在的基因或已被修饰为含有不以天然方式存在的核酸片段的单链或双链的核酸分子。当该核酸构建体包含为本发明的编码序列表达所需的调控序列时，术语核酸构建体与术语“表达盒”同义。

调控序列：术语“调控序列”在此定义为包括对本发明多肽的表达必要的或有益的所有元件。每个调控序列可以是编码该多肽的核苷酸序列的自身的或外源的调控序列。这些调控序列包括但不限于前导序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列和转录终止子。最小的调控序列包括启动子及转录和翻译的终止信号。可提供携带以引入特异的限制性位点为目的的接头调控序列，其中所述限制性位点易于调控序列和编码多肽的核苷酸序列的编码区的连接。

可操作地连接的：术语“可操作地连接的”在此定义为构型中调控序列被适当地置于DNA序列的编码序列相关的位置，以使得调控序列指导多肽的表达。

编码序列：在此所用的术语“编码序列”指涵盖直接指定其蛋白产物的氨基酸序列的核苷酸序列。编码序列的边界通常由一般以ATG为起始密码子的开放阅读框确定。编码序列一般包括DNA、cDNA和重组核苷酸序列。

表达：上下文中，术语“表达”包括涉及多肽产生中的任何步骤，其包括但不限于转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰以及分泌。

表达载体：上下文中，术语“表达载体”涵盖包括编码本发明多肽的片段和可操作地连接到提供其转录的其它片段上的线性或环状的DNA分子。

宿主细胞：术语“宿主细胞”在此包括用核酸构建体易于转化的任何细胞类型。

术语“多核苷酸探针”、“杂交”以及不同的严谨条件在题为“有抗微生物活性的多肽”部分定义。

发明详述

有抗微生物活性的多肽

在第一个实施方案中，本发明涉及有抗微生物活性的多肽并且该多肽包含，优选地由与SEQ ID NO：2(即成熟多肽)的1-40位氨基酸有至少65％，优选至少70％，例如至少75％，更优选至少80％，例如至少85％，甚至更优选至少90％，最优选至少至少95％，例如至少96％，例如至少97％，以及甚至最优选至少98％，例如至少99％同一性程度的氨基酸序列组成(下文中的“同源多肽”)。在一个令人感兴趣的实施方案中，该氨基酸序列与SEQ ID NO：2的1-40位氨基酸最多10个氨基酸(例如10个氨基酸)，特别的最多5个氨基酸(例如5个氨基酸)，例如最多4个氨基酸(例如4个氨基酸)，例如最多3个氨基酸(例如3个氨基酸)不同。在一个尤其令人感兴趣的实施方案中，该氨基酸序列与SEQ ID NO：2的1-40位氨基酸最多2个氨基酸(例如2个氨基酸)，例如1个氨基酸不同。

优选地，本发明的多肽包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列；其等位基因变体；或其具有抗微生物活性的片段。在另一个优选的实施方案中，本发明的多肽包含SEQ ID NO：2的1-40位氨基酸。在一个进一步优选的实施方案中，多肽由SEQ ID NO：2的1-40位氨基酸组成。

组成本发明多肽的氨基酸可独立地选自D或L型。

本发明的多肽可以是有抗微生物活性、鉴定和分离自自然源的野生型多肽。该野生型多肽可通过本领域公知的标准技术特定筛选。进一步的，本发明的多肽可通过例如J.E.Ness等人在自然生物技术(NatureBiotechnology 17，893-896(1996))中描述的DNA改组技术制备。此外，本发明的多肽可以是包含，优选地由与SEQ ID NO：2的1-40位氨基酸相比具有至少一个氨基酸的替换、删除和/或插入的氨基酸组成的人工变体。该人工变体可通过本领域公知的标准技术，例如通过对包含SEQ ID NO：2的1-40位氨基酸所示的氨基酸序列的多肽进行定点/随机诱变构建。在本发明的一个实施方案中，氨基酸变化(在人工变体中以及在野生型多肽中)具有次要特性：是不会显著影响蛋白质的折叠和/或活性的保守氨基酸替换；一般1至约30个氨基酸的小删除；氨基端或羧基端的小延伸，例如氨基端的甲硫氨酸残基；多至约20-25个残基的小连接肽；或通过改变静电荷或具有例如多聚-组氨酸序列段、抗原表位或结合结构域的其他功能而易于纯化的小延伸。

保守替换的实例是在碱性氨基酸(精氨酸、赖氨酸和组氨酸)，酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)，极性氨基酸(谷氨酰胺和天冬酰胺)，疏水性氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸和甲硫氨酸)，芳香氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)和小氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸和苏氨酸)的基团中。通常不会改变特定活性的氨基酸替换是本领域公知的并被例如H.Neurath和R.L.Hill，1979，蛋白质(The Proteins)，学院出版社(Academic Press)，纽约(New York)一书中所描述。最常见的交换是Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu和Asp/Gly以及它们的逆向交换。

在本发明令人感兴趣的一个实施方案中，氨基酸变化是多肽的物理-化学特性改变的种类。例如氨基酸变化可以是改进多肽的热稳定性、改变底物特异性、改变最适pH等。

优选地，与SEQ ID NO：2的1-40位氨基酸相比上述替换、删除和/或插入的数目最多10个，例如最多9个，例如最多8个，更优选最多7个，例如最多6个，例如最多5个，最优选最多4个，例如最多3个，例如最多2个，特别是最多1个。

本发明已从假黑盘茵中分离出编码有抗微生物活性的多肽的基因。含有该基因的假黑盘菌根据国际承认用于专利程序的微生物保存布达佩斯条约，于1997年1月28日保藏于真菌菌种保藏中心(Centraalbureau VoorSchimmelcultures(CBS))，Uppsalalaan 8，3584 CT Utrecht，荷兰(备选地P.O.Box 85167，3508 AD Utrecht，The Netherlands)并且指定保藏号CBS444.97。

因此在第二个实施方案中，本发明涉及包含，优选地由与假黑盘菌CBS444.97中存在的核苷酸序列的抗微生物多肽编码部分有至少65％同一性的氨基酸序列组成的多肽。在本发明令人感兴趣的一个实施方案中，该多肽包含，优选地由与假黑盘菌CBS 444.97中核苷酸序列的抗微生物多肽编码部分有至少70％，例如至少75％，优选至少80％，例如至少85％，更优选至少90％，最优选至少95％，例如至少96％，例如至少97％，以及甚至最优选至少98％，例如至少99％同一性的氨基酸序列组成(下文中的“同源多肽”)。在令人感兴趣的一个实施方案中，该氨基酸序列与假黑盘菌CBS 444.97中核苷酸序列的抗微生物多肽编码部分最多10个氨基酸(例如10个氨基酸)，特别的最多5个氨基酸(例如5个氨基酸)，例如最多4个氨基酸(例如4个氨基酸)，例如最多3个氨基酸(例如3个氨基酸)不同。在一个特别令人感兴趣的实施方案中，该氨基酸序列与假黑盘菌CBS444.97中核苷酸序列的抗微生物多肽编码部分最多2个氨基酸(例如2个氨基酸)，例如1个氨基酸不同。

优选地，本发明的多肽包含假黑盘菌CBS 444.97中核苷酸序列的抗微生物多肽编码部分的氨基酸序列。在另一个优选的实施方案中，本发明的多肽由假黑盘菌CBS 444.97中核苷酸序列的抗微生物多肽编码部分所编码多肽的氨基酸序列组成。

如上述相似的方式，本发明的多肽可以是包含，优选地由与假黑盘菌CBS 444.97中抗微生物多肽编码部分的核苷酸序列编码的氨基酸序列相比有至少一个氨基酸的替换、删除和/或插入的氨基酸序列组成的人工变体。

在第三个实施方案中，本发明涉及在非常低严谨的条件下，优选地在低严谨条件下，更优选在中等严谨条件下，更优选在中-高严谨条件下，甚至更优选在高严谨条件下，和最优选在非常高严谨的条件下，与选自下列多核苷酸探针(i)SEQ ID NO：1的166-285位核苷酸的互补链，(ii)SEQID NO：1的70-285位核苷酸中含有的cDNA序列的互补链，和(iii)SEQID NO：1的1-285位核苷酸的互补链杂交的核苷酸序列编码的有抗微生物活性的多肽(J.Sambrook，E.F.Fritsch和T.Maniatus，1989，分子克隆，实验室手册，第二版，冷泉港，纽约)。

SEQ ID NO：1的核苷酸序列或其亚序列，以及SEQ ID NO：2的氨基酸序列或其片段可根据本领域公知的方法用于设计多核苷酸探针以鉴定和克隆来自不同属或种的菌株的编码有抗微生物活性多肽的DNA。特别地，此类探针可用于与目标属或种的基因组或cDNA杂交，按照标准的Southern印迹步骤以鉴定和分离其中相对应的基因。此类探针可以是较全长序列短许多，但应是至少15，优选至少25，更优选至少35个核苷酸的长度，例如至少70个核苷酸的长度。但是优选该多核苷酸探针是至少100个核苷酸的长度。例如该多核苷酸探针可以是至少200个核苷酸的长度，至少300个核苷酸长度，至少400个核苷酸长度或至少500个核苷酸长度。甚至可使用更长的探针，例如至少600个核苷酸长度，至少700个核苷酸长度，至少800个核苷酸长度，或至少900个核苷酸长度的多核苷酸探针。DNA和RNA探针都可以使用。探针通常被标记以检测相应的基因(例如，用³²P，³H，³⁵S，生物素或抗生物素蛋白标记)。

因此，制备自此类其他生物体的基因组DNA或RNA文库可用于筛选与上述探针杂交和编码有抗微生物活性的多肽的DNA。来自此类其他生物体的基因组或其他DNA可通过琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳，或其他分离技术分离。来自文库的DNA或分离的DNA可被转移和固定至硝酸纤维素膜或其他合适的载体材料上。为了鉴定与SEQ ID NO：1同源的克隆或DNA，带有固定化DNA的载体材料被用于Southern印迹。

为了本发明的目的，杂交说明该核酸序列在非常低至非常高的严谨条件下与和SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列杂交的标记多核苷酸探针杂交。在这些条件下与多核苷酸探针杂交的分子可利用X-射线胶片或通过本领域公知的任何其他方法检测。无论何时在上下文中使用的术语“多核苷酸探针”可理解为该探针含有至少15个核苷酸。

在一个令人感兴趣的实施方案中，多核苷酸探针是SEQ ID NO：1的核苷酸166-285的互补链，核苷酸70-285的互补链，核苷酸1-285的互补链。

在另一个令人感兴趣的实施方案中，多核苷酸探针是编码SEQ IDNO：2的多肽的核苷酸序列的互补链。在一个进一步令人感兴趣的实施方案中，多核苷酸探针是SEQ ID NO：1的互补链。在更进一步令人感兴趣的实施方案中，多核苷酸探针是SEQ ID NO：1的成熟多肽编码区的互补链。在另一个令人感兴趣的实施方案中，多核苷酸探针是假黑盘菌CBS444.97中抗微生物多肽编码区的互补链。在另一个更令人感兴趣的实施方案中，多核苷酸探针是假黑盘菌CBS 444.97中成熟抗微生物多肽编码区的互补链。

对于至少100个核苷酸长度的长探针，非常低至非常高的严谨条件定义为在5×SSPE，1.0％SDS，5×Denhardt’s溶液，100μg/ml剪切和变性的鲑鱼精DNA中于42℃预杂交和杂交，按照标准的Southern印迹步骤进行。优选的，至少100个核苷酸的长探针不包含多于1000个核苷酸。对于至少100个核苷酸长度的长探针，载体材料最终用2×SSC，0.1％SDS于42℃洗涤15分钟，洗三次(非常低严谨)，优选每次用0.5×SSC，0.1％SDS于42℃洗涤15分钟，洗三次(低严谨)，更优选每次用0.2×SSC，0.1％SDS于42℃洗涤15分钟，洗三次(中严谨)，甚至更优选每次用0.2×SSC，0.1％SDS于55℃洗涤15分钟，洗三次(中-高严谨)，最优选每次用0.1×SSC，0.1％SDS于60℃洗涤15分钟，洗三次(高严谨)，特别的每次用0.1×SSC，0.1％SDS于68℃洗涤15分钟，洗三次(非常高严谨)。

尽管不是特别优选的，较短的探针，例如约15至99个核苷酸长度的探针，例如约15至约70个核苷酸长度也可被使用。对于这些短探针，严谨条件定义为在比根据Bolton和McCarthy(1962，美国国家科学院学报(Proceeding of the National Academy of Sciences USA)48：1390)计算的T_m低5℃至10℃下，在0.9M NaCl，0.09M Tris-HClpH7.6，6mM EDTA，0.5％NP-40，1×Denhardt’s溶液，1mM焦磷酸钠，1mM磷酸二氢钠，0.1mM ATP和0.2mg/ml的酵母RNA中预杂交、杂交和杂交后洗涤，按照标准的Southern印迹步骤进行。

对于约15至99个核苷酸长度的短探针，载体材料在比计算的T_m低5℃至10℃下用加入0.1％SDS的6×SCC洗涤15分钟以及再每次用6×SCC洗涤15分钟洗两次。

N-末端延伸

N-末端延伸可适当地由1-50个氨基酸，优选2-20个氨基酸，尤其3-15个氨基酸组成。在一个实施方案中N-末端肽的延伸不含有Arg(R)。在另一个实施方案中N-末端延伸包含将在下文进一步定义的kex2或kex2样切割位点。在一个优选的实施方案中N-末端延伸是包含至少2个Glu(E)和/或Asp(D)的氨基酸残基的肽，例如包含下列序列之一的N-末端延伸：EAE、EE、DE、DD。

Kex2位点：

Kex2位点(参见例如酶学方法(Methods in Enzymology)，185卷，D.Goeddel编辑，Academic Press Inc.(1990)，San Diego，CA，“基因表达技术”(“Gene Expression Technology”))和Kex2样位点是在一些蛋白质的前肽编码区和成熟区之间发现的二价识别位点(即切割位点)。

Kex2位点或Kex2样位点的插入已经在一些情况下显示于前肽切割位点处改善了正确的肽链内切酶处理而导致蛋白质分泌水平的提高。

在本发明的上下文中Kex2位点或Kex2样位点的插入导致可能获得在使抗微生物多肽与SEQ ID NO：2的1-40位氨基酸所示的成熟多肽相比被延伸的N-末端延伸的特定位点处断裂。

有抗微生物活性的多肽的来源

本发明的多肽可获得自任何属的微生物。为了本发明的目的，在此所用的术语“获得自”应指核苷酸序列编码的多肽是由其中该核苷酸天然存在或其中已被插入该核苷酸的细胞产生的。在优选的实施方案中，该多肽是胞外分泌的。

本发明的多肽可以是，细菌多肽。例如，该多肽可以是革兰氏阳性细菌多肽，例如嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、短芽孢杆菌(Bacillus brevis)、环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、灿烂芽孢杆菌(Bacillus lautus)、迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)、枯草芽孢杆菌或苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)多肽的芽孢杆菌(Bacillus)多肽；或例如浅青紫链霉菌(Streptomyces lividans)或鼠灰链霉菌(Streptomycesmurinus)多肽的链霉菌(Streptomyces)多肽；或是革兰氏阴性细菌多肽，例如大肠杆菌(E.coli)或假单胞菌(Pseudomonas sp.)多肽。

本发明的多肽可以是真菌多肽，更优选例如假丝酵母属(Candida)、克鲁维氏酵母属(Kluyveromyces)、毕赤酵母属(Pichia)、酵母属(Saccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)或Yarrowia多肽的酵母多肽；或更优选例如支顶孢属(Acremonium)、曲霉属(Aspergillus)、短柄霉属(Aureobasidium)、隐球酵母属(Cryptococcus)、Filibasidium、镰孢属(Fusarium)、腐质霉属(Humicola)、Magnaporthe、毛霉属(Mucor)、毁丝霉属(Myceliophthora)、Neocallimastix、链孢霉属(Neurospora)、拟青霉属(Paecilomyces)、青霉属(Penicillium)、Piromyces、裂褶菌属(Schizophyllum)、踝节菌属(Talaromyces)、热子囊菌属(Thermoascus)、草根霉属(Thielavia)、Tolypocladium或木霉属(Trichoderma)多肽的丝状真菌多肽。

在一个令人感兴趣的实施方案中，多肽是卡尔酵母(Saccharomycescarlsbergensis)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、糖化酵母(Saccharomyces diastaticus)、Saccharomyces douglasii、克鲁弗酵母(Saccharomyces kluyveri)、诺地酵母(Saccharomyces norbensis)或卵形酵母(Saccharomyces oviformis)多肽。

在另一个令人感兴趣的实施方案中，多肽是棘孢曲霉(Aspergillusaculeatus)、泡盛曲霉(Aspergillus awamori)、臭曲霉(Aspergillusfoetidus)、日本曲霉(Aspergillus japonicus)、构巢曲霉(Aspergillusnidulans)、黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、杆孢状镰孢(Fusarium bactridioides)、Fusarium cerealis、Fusariumcrookwellense、大刀镰孢(Fusarium culmorum)、禾谷镰孢(Fusariumgraminearum)、禾赤镰孢(Fusarium graminum)、异孢镰孢(Fusariumheterosporum)、合欢木镰孢(Fusarium negundi)、尖孢镰孢(Fusariumoxysporum)、多枝镰孢(Fusarium reticulatum)、粉红镰孢(Fusariumroseum)、接骨木镰孢(Fusarium sambucinum)、肤色镰孢(Fusariumsarcochroum)、拟分枝孢镰孢(Fusarium sporotrichioides)、硫色镰孢(Fusarium sulphureum)、Fusarium torulosum、Fusariumtrichothecioides、Fusarium venenatum、Humicola insolens、Humicolalanuginosa、米赫毛霉(Mucor miehei)、嗜热毁丝霉(Myceliophthorathermophila)、粗糙链孢霉(Neurospora crassa)、产紫青霉(Penicilliumpurpurogenum)、哈茨木霉(Trichoderma harzianum)、康宁氏木霉(Trichoderma koningii)、Trichoderma longibrachiatum、里氏木霉(Trichoderma reesei)或绿色木霉(Trichoderma viride)多肽。

在优选的实施方案中，该多肽是假黑盘菌多肽，更优选是假黑盘菌CBS444.97多肽，例如由SEQ ID NO：2的1-40位氨基酸序列组成。

可以理解的是对于在前提到的种，本发明包含有性和无性状态，以及其他分类学等同物，例如无性型，而不考虑使其被认知的种名。本领域的技术人员容易识别合适等同物的身份。

这些种的菌株是公众在很多培养中心容易得到的，例如美国典型培养物保藏中心(ATCC)，德国微生物保藏中心(DSM)，真菌培养中心(CBS)和农业研究机构培养物保藏中心，北部研究中心(NRRL)。

进一步的，该多肽可利用上述的探针从其他来源鉴定和获得，包括分离自天然(例如土壤、堆肥、水等)的微生物。用于从自然生活环境中分离微生物的技术是本领域公知的。核苷酸序列可随后通过类似筛选另一个微生物的基因组或cDNA文库获得。一旦编码多肽的核苷酸序列已经用探针检测到，该序列可通过对于本领域的普通技术人员来说公知的实用技术(参见例如Sambrook等人，1989，如上)分离或克隆。

本发明的核苷酸序列编码的多肽也包括其中另一个多肽被融合到该多肽或其片段的N-末端或C-末端的融合多肽或可切割融合多肽。融合多肽可通过将编码另一个多肽的核苷酸序列(或其部分)融合到本发明的核苷酸序列(或其部分)产生。用于产生融合多肽的技术是本领域公知的，并包括连接编码多肽的编码序列以使它们在阅读框中并且该融合蛋白的表达在相同的启动子和终止子的调控下。

多核苷酸和核苷酸序列

本发明也涉及具有编码本发明多肽的核苷酸序列的多核苷酸。特别地，本发明涉及由编码本发明多肽的核苷酸序列组成的多核苷酸。在一个优选的实施方案中，该核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。在一个更优选的实施方案中，该核苷酸序列是SEQ ID NO：1的成熟多肽编码区。在另一个更优选的实施方案中，该核苷酸序列是假黑盘茵CBS444.97中成熟抗微生物多肽编码区。本发明也包括具有，优选地由编码下述多肽的核苷酸序列组成的多核苷酸，其中所述多肽由SEQ ID NO：2或其成熟多肽的氨基酸序列组成，其中所述多核苷酸由于遗传密码子的简并性而与SEQ ID NO：1不同。

本发明也涉及具有，优选地由SEQ ID NO：1的编码SEQ ID NO：2的有抗微生物活性的片段的亚序列组成的多肽。SEQ ID NO：1的亚序列是除了5’和/或3’末端的一个或多个核苷酸删除外被SEQ ID NO：1包括的核苷酸序列。

本发明也涉及具有，优选由在SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列中包含至少一个修饰的经修饰核苷酸序列组成的多核苷酸，并且其中经修饰的核苷酸序列编码由SEQ ID NO：2的1-40位氨基酸组成的多肽。

用于分离或克隆编码多肽的核苷酸序列的技术是本领域公知的并包括从基因组DNA的分离，从cDNA的制备或它们的组合。从这些基因组DNA中克隆本发明的核苷酸序列可通过如利用公知的多聚酶链反应(PCR)或用来检测具有共同结构特性的克隆DNA片段的表达文库抗体筛选来完成。参见例如Innis等人，1990，PCR：方法和应用的指导(PCR：A Guide toMethods and Application)，学院出版社，纽约。可使用例如连接酶链反应(LCR)、连接激活转录(LAT)和基于核苷酸序列的扩增(NASBA)的其他扩增方法。核苷酸序列可克隆自假黑盘菌属中存在有编码抗微生物多肽的核苷酸序列的菌株，或另一个或相关的生物体，因此核苷酸序列可以例如是该核苷酸序列多肽编码区的等位基因变体或种间变体。

核苷酸序列可通过用于使核苷酸序列从其天然位置重置到其将被再产生的不同位点的遗传工程中所用的标准克隆方法获得。克隆方法可涉及对包含编码多肽的核苷酸序列的目标片段进行切除和分离，将片段插入载体分子以及重组载体掺入到其中进行核苷酸序列的多拷贝或克隆复制的宿主细胞中。该核苷酸序列可以是基因组的、cDNA、RNA、半合成的、合成来源的或为它们的任意组合。

本发明也涉及具有，优选地由与SEQ ID NO：1的166-285位核苷酸有至少65％同一性的核苷酸序列组成的多核苷酸。优选地该核苷酸序列与SEQ ID NO：1的166-285位核苷酸有至少70％的同一性，例如至少80％的同一性，例如至少90％的同一性，更优选至少95％的同一性，例如至少96％的同一性，例如至少97％的同一性，甚至更优选至少98％的同一性，例如至少99％的同一性。优选地，该核苷酸序列编码有抗微生物活性的多肽。两个核苷酸序列之间的同一性程度如上述确定(参见题为“定义”的部分)。优选地，核苷酸序列包含SEQ ID NO：1的166-285位核苷酸。在一个甚至更优选的实施方案中，该核苷酸序列由SEQ ID NO：1的166-285位核苷酸组成。

在另一个令人感兴趣的方面，本发明涉及具有，优选地由与假黑盘菌CBS444.97中编码抗微生物多肽的核苷酸序列中抗微生物多肽编码部分的核苷酸序列具有至少65％同一性的核苷酸序列组成的多核苷酸。在一个优选的实施方案中，该多核苷酸与假黑盘菌CBS444.97中编码抗微生物多肽的核苷酸序列中抗微生物多肽编码部分的核苷酸序列的同一性程度是至少70％，例如至少80％，例如至少90％，更优选至少95％，例如至少96％，例如至少97％，甚至更优选至少98％，例如至少99％。优选地，该核苷酸序列包含假黑盘菌CBS444.97中编码抗微生物多肽的核苷酸序列中抗微生物多肽编码部分的核苷酸序列。在一个甚至更优选的实施方案中，该核苷酸序列由假黑盘菌CBS444.97编码抗微生物多肽的核苷酸序列中抗微生物多肽编码部分的核苷酸序列组成。

编码本发明多肽的核苷酸序列的修饰可能是合成与SEQ ID NO：2的1-40位氨基酸相比包含至少一个氨基酸序列替换、删除和/或插入的多肽所必需的。这些人工变体可能与分离自天然来源的多肽在例如比活性、热稳定性、最适pH等的一些工程方式上不同。

对于本领域的技术人员来说能够确定在分子功能的关键区域外进行修饰并仍然保持多肽活性。为本发明核苷酸序列编码的多肽的活性所必需的并且优选不进行修饰例如替换修饰的氨基酸残基可根据例如定点诱变或丙氨酸-扫描诱变的本领域公知方法(参见例如Cunningham和Wells，1989，科学(Science)244：1081-1085)鉴定。在后一个技术中，突变被引入分子中每个正电荷残基并且对所得到的突变分子用于抗微生物活性测试以确定分子活性的关键氨基酸残基。底物-酶相互作用位点也可通过三维结构的分析确定，其中所述三维结构分析是通过如下技术如核磁共振分析、结晶学或光亲和标记技术(参见例如de Vos等人，1992，科学255：306-312；Smith等人，1992，分子生物学杂志(Journal of Molecular Biology)224：899-904；Wlodaver等人，1992，FEBS Letters 309：59-64)确定的。

此外，编码本发明多肽的核苷酸序列可通过导入这样的核苷酸替换而修饰，其中所述核苷酸替换不会产生由该核苷酸序列编码的多肽的另一个氨基酸序列，但该核苷酸替换对应于产生酶的宿主生物的密码子使用。

使一个核苷酸变换为另一个核苷酸的核苷酸序列突变的引入可利用本领域公知的任何方法通过定点诱变实现。特别有用的是使用具有目标插入片段的超螺旋双链DNA载体和包含所需突变的两条合成引物的方法。每条相对于载体的相对链互补的寡核苷酸引物借助于Pfu DNA聚合酶在温度循环下延伸。引物掺入后，形成含有交错切口的突变质粒。在温度循环之后，产物用特异于甲基化和半甲基化DNA的DpnI处理以消化亲本DNA模板并筛选含有突变的合成DNA。本领域公知的其他方法也可使用。对于核苷酸替换的概括性描述参见例如Ford等人，1991，蛋白质的表达和纯化(Protein Expression and Purification)2：95-107。

本发明也涉及含有，优选地由以下核苷酸序列组成的多核苷酸，其中所述核苷酸序列编码具有抗微生物活性的多肽，并且该核苷酸序列在非常低严谨条件下，优选在低严谨条件下，更优选在中严谨条件下，更优选在中-高严谨条件下，甚至更优选在高严谨条件下，以及最优选在非常高严谨条件下与选自以下的多核苷酸探针杂交(i)SEQ ID NO：1的166-285位核苷酸的互补链，(ii)SEQ ID NO：1的70-285位核苷酸中含有的cDNA序列的互补链，以及(iii)SEQ ID NO：1的1-285位核苷酸的互补链。

可以理解，关于核苷酸序列杂交的细节以及具体情形与在题为“有抗微生物活性的多肽”部分讨论的杂交方面是相同或相似的。

核酸构建体

本发明也涉及包含被可操作地连接至一个或多个调控序列上的本发明核苷酸序列的核酸构建体，其中所述调控序列于合适的宿主细胞中在适于调控序列的条件下指导编码序列表达。

编码本发明多肽的核苷酸序列可用多种方式操作以提供多肽的表达。取决于表达载体，希望或必需在核苷酸序列插入载体前进行操作。利用重组DNA方法修饰核苷酸序列的技术是本领域公知的。

调控序列可以是合适的启动子序列，其中所述启动子序列是被宿主细胞识别的用于表达核苷酸序列的核苷酸序列。该启动子序列含有介导多肽表达的转录调控序列。启动子可以是在选择的宿主细胞中显示转录活性的任何核苷酸序列，其包括突变、截短和杂合的启动子，并且可从编码与宿主细胞同源或异源的胞外或胞内多肽的基因获得。

适合的用于指导本发明核酸构建体转录的启动子实例，尤其是在细菌宿主细胞中的启动子实例，是从大肠杆菌lac操纵子、天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)琼脂糖酶基因(dagA)、枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶基因(sacB)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyL)、嗜热脂肪芽孢杆菌产麦芽糖淀粉酶基因(amyM)、解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢杆菌青霉素酶基因(penP)、枯草芽孢杆菌xylA和xylB基因和原核细胞β-内酰胺酶基因(Villa-Kamaroff等人，1978，美国国家科学院学报75：3727-3731)获得的启动子以及tac启动子(DeBoer等人，1983，美国国家科学院学报80：21-25)。进一步的启动子在科学美国人(Scientific American)，1980，242：74-79的“来自重组细菌的有用蛋白质”(“Useful proteins from recombinant bacteria”)和Sambrook等人，1989，同上中有描述。

用于指导本发明核酸构建体在丝状真菌宿主细胞中转录的合适启动子实例是从米曲霉TAKA淀粉酶、米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)天冬氨酸蛋白酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶(glaA)、米黑根毛霉脂肪酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉磷酸丙糖异构酶、构巢曲霉乙酰胺酶和尖孢镰孢胰蛋白酶样蛋白酶(WO96/00787)基因获得的启动子以及NA2-tpi启动子(来自黑曲霉中性α-淀粉酶和米曲霉磷酸丙糖异构酶基因启动子的杂合启动子)，及它们的突变、截短和杂合的启动子。

在酵母宿主中，有用的启动子是从酿酒酵母烯醇化酶(ENO-1)、酿酒酵母半乳糖激酶(GAL1)、酿酒酵母醇脱氢酶/3-磷酸甘油醛脱氢酶(ADH2/GAP)和酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶基因获得的。其他用于酵母宿主细胞的有用启动子在Romanos等人，1992，酵母(Yeast)8：423-488中有描述。

调控序列也可以是被宿主细胞识别而终止转录的合适转录终止子序列。终止子序列被可操作地连接到编码多肽的核苷酸序列的3’末端。任何在所选择的宿主细胞中发挥作用的终止子都可在本发明中使用。

优选的用于丝状真菌宿主细胞的终止子是从米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、构巢曲霉邻氨基苯甲酸合成酶、黑曲霉α-葡糖苷酶和尖孢镰孢胰蛋白酶样蛋白酶的基因获得的。

用于酵母宿主细胞的优选终止子从酿酒酵母烯醇化酶、酿酒酵母细胞色素C(CYC1)和酿酒酵母3-磷酸甘油醛脱氢酶的基因获得。其他用于酵母宿主细胞的有用终止子在Romanos等人，1992，同上中有描述。

调控序列也可以是合适的前导序列，其为对宿主细胞的翻译至关重要的mRNA非翻译区。前导序列被可操作地连接至编码多肽的核苷酸序列的5’末端。任何在所选择的宿主细胞中发挥作用的前导序列都可在本发明中使用。

优选的用于丝状真菌宿主细胞的前导序列是从米曲霉TAKA淀粉酶和构巢曲霉磷酸丙糖异构酶的基因获得的。

酵母宿主细胞的合适前导序列从酿酒酵母烯醇化酶(ENO-1)、酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶、酿酒酵母α-因子和酿酒酵母醇脱氢酶/3-磷酸甘油醛脱氢酶(ADH2/GAP)的基因获得。

调控序列也可以是被可操作地连接到核苷酸序列的3’末端并在转录时被宿主细胞作为向转录的mRNA上添加聚腺苷残基的信号识别的聚腺苷酸化序列。任何在选择的宿主细胞中有功能的聚腺苷酸化序列都可在本发明中使用。

优选的用于丝状真菌宿主细胞的聚腺苷酸化序列是从米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、构巢曲霉邻氨基苯甲酸合成酶、尖孢镰孢胰蛋白酶样蛋白酶和黑曲霉α-葡糖苷酶的基因获得的。

其他用于酵母宿主细胞的有用聚腺苷酸化序列在Guo和Sherman，1995，分子细胞生物学(Molecular Cellular Biology)15：5983-5990中有描述。

调控序列也可以是信号肽编码区，其编码连接至多肽的氨基末端并指导编码多肽进入细胞分泌途径的氨基酸序列。核苷酸序列的编码序列的5’端可本来就含有天然连接在翻译阅读框中的信号肽编码区，其中所述翻译阅读框具有编码分泌性多肽的编码区片段。备选地，编码序列的5’端可含有对编码序列而言为外源的信号肽编码区。该外来信号肽编码区可能在不天然含有信号肽编码区的编码序列中是必需的。备选地，该外来信号肽编码区可简单置换天然的信号肽编码区以增强多肽的分泌。但是，任何在选择的宿主细胞中指导表达多肽进入分泌途径的信号肽编码区都可在本发明中使用。

信号肽编码区是编码SEQ ID NO：2中-55至-33位氨基酸(或序列3的1-23位氨基酸)的SEQ ID NO：1中1-69位核苷酸。

对细菌宿主细胞有效的信号肽编码区是从芽孢杆菌NCIB 11837产麦芽糖淀粉酶、嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶、地衣芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶、地衣芽孢杆菌β-内酰胺酶、嗜热脂肪芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT，nprS，nprM)和枯草芽孢杆菌prsA的基因获得的信号肽编码区。其它信号肽在Simonen和Palva，1993，微生物综述(MicroBiological Reviews)57：109-137中有描述。

对丝状真菌宿主细胞有效的信号肽编码区是从米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶、Humicola insolens纤维素酶和Humicola lanuginosa脂肪酶的基因获得的信号肽编码区。

对酵母宿主细胞有用的信号肽是从酿酒酵母α-因子和酿酒酵母转化酶的基因获得的。其他有用的信号肽编码区在Romanos等人，1992，同上中有描述。

调控序列也可以是编码置于多肽氨基末端的氨基酸序列的前肽编码区。所得到的多肽公知为原酶或多肽原(或在一些情况下为酶原)。多肽原通常是无活性的并且可通过对来自多肽原的前肽催化或自动催化断裂转化为成熟有活性的多肽。前肽编码区可从枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprE)、枯草芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT)、酿酒酵母α-因子、米黑根毛酶天冬氨酸蛋白酶和嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)漆酶(WO95/33836)的基因获得。

前肽编码区是编码SEQ ID NO：2中-32至-1位氨基酸(或序列3中24-55位氨基酸)的SEQ ID NO：1中70-165位核苷酸。

当信号肽和前肽区都出现在多肽的氨基末端时，前肽区置于靠近多肽的氨基末端而信号肽区置于靠近前肽区的氨基末端。

也可能需要加入允许相对于宿主细胞的生长调节多肽表达的调节序列。调节系统的实例是那些对化学或物理刺激起反应而导致基因表达打开或关闭的系统，其中所述化学或物理刺激包括调节化合物的存在。原核系统中的调节系统包括lac，tac，和trp操纵子系统。在酵母中，可使用ADH2系统或GAL1系统。在丝状真菌中，TAKAα-淀粉酶启动子、黑曲霉葡糖淀粉酶启动子和米曲霉葡糖淀粉酶启动子可用作调节序列。其他调节序列的实例是允许基因扩增的序列。在真核系统中包括在氨甲蝶呤存在时被扩增的二氢叶酸还原酶基因和伴随重金属扩增的金属硫蛋白基因。在这些情况下，编码多肽的核苷酸序列被可操作地连接到调节序列上。

表达载体

本发明也涉及包含本发明核酸构建体的重组表达载体。上述多种核苷酸和调控序列可被连接到一起以生产可能包括允许于该位点对编码多肽的核苷酸序列进行插入或替换的一个或多个方便的限制性位点的重组表达载体。备选地，本发明的核苷酸序列可通过将该核苷酸序列或包含该序列的核酸构建体插入合适的载体而表达。在构建表达载体时，编码序列定位于载体使得编码序列被可操作地连接到合适的调控序列上用于表达。

重组表达载体可以是能够方便地进行重组DNA步骤并能够实现核苷酸序列表达的任何载体(例如质粒或病毒)。载体的选择一般取决于载体与该载体将被导入的宿主细胞间的相容性。载体可以是线性的或闭合环状质粒。

载体可以是自主复制载体，即其复制不依赖于染色体复制的、作为染色体外实体存在的载体，例如质粒、染色体外元件、微型染色体或人工染色体。

载体可包含保证自我复制的任何方式。备选地，载体可以是当被引入宿主细胞时整合到基因组中并随被整合的染色体一起复制的载体。进一步的，可使用单一载体或质粒，或可使用一起包含被导入宿主细胞基因组的总DNA的二种或多种载体或质粒，或可使用转座子。

本发明的载体优选包含允许转化细胞易于选择的一种或多种选择性标记。选择性标记是其产物提供杀生物剂或病毒抗性、重金属抗性、原养型到营养缺陷型等的基因。

细菌选择性标记的实例是来自枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌的dal基因，或赋予例如氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素或四环素抗性的抗生素抗性标记。适合酵母宿主细胞的标记是ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1和URA3。用于丝状真菌宿主细胞的选择性标记包括但不限于amdS(乙酰胺酶)、argB(鸟氨酸转氨甲酰酶)、bar(膦丝菌素乙酰转移酶)、hygB(潮霉素磷酸转移酶)、niaD(硝酸盐还原酶)、pyrG(乳清酸核苷-5’-磷酸脱羧酶)、sC(硫酸腺苷酰转移酶)、trpC(邻氨基苯甲酸合成酶)及它们的等同物。

优选用于曲霉属细胞的是构巢曲霉或米曲霉的amdS和pyrG基因以及吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)的bar基因。

本发明的载体优选含有允许载体稳定整合到宿主细胞基因组中或在细胞中不依赖于基因组的载体自主复制的元件。

为了整合到宿主细胞基因组中，载体可依赖编码多肽的核苷酸序列或用于通过同源或非同源重组将载体稳定整合到基因组中的任何其它载体元件。备选地，载体可包含用于指导通过同源重组整合到宿主细胞基因组的额外核苷酸序列。该额外核苷酸序列使载体能够被整合到宿主细胞基因组染色体的精确位点。为了提高在精确位点整合的可能性，整合元件应优选含有充足数目的核苷酸，例如100-1,500个碱基对、优选地400-1,500个碱基对和最优选地800-1,500个碱基对，并且该核苷酸与相应的靶序列高度同源以增强同源重组的可能性。整合元件可以是与宿主细胞基因组中的靶序列同源的任何序列。进一步地，整合元件可以是非编码或编码的核苷酸序列。另一方面，载体可通过非同源重组整合到宿主细胞的基因组中。

对于自主复制，载体可进一步包含能够使载体在所讨论的宿主细胞中自主复制的复制起点。细菌复制起点的实例是允许在大肠杆菌中复制的质粒pBR322、pUC19、pACYC177和pACYC184的复制起点，以及允许在芽孢杆菌中复制的pUB110、pE194、pTA1060和pAMβ1。用于酵母宿主细胞的复制起点的实例是2微米复制起点、ARS1、ARS4、ARS1和CEN3的组合以及ARS4和CEN6的组合。复制起点可以含有在宿主细胞中行使温度敏感功能的突变(参见例如Ehrlich，1978，美国国家科学院学报75：1433)。

本发明核苷酸序列的多于一个拷贝可被插入宿主细胞以提高基因产物的产量。核苷酸序列拷贝数的增加可通过将该序列的至少一个附加拷贝整合到宿主细胞的基因组中得到，或者通过包含可扩增的选择性标记基因和该核苷酸序列的细胞而获得该核苷酸序列拷贝数的增加，其中可通过在存在合适的选择剂时培养细胞，从而选择含有选择性标记基因的扩增拷贝并因此含有该核苷酸序列的附加拷贝的细胞。

用于连接上述元件以构建本发明的重组表达载体的方法对于本领域的技术人员是公知的(参见例如Sambrook等人，1989，同上)。

宿主细胞

本发明也涉及包含本发明核酸构建体的重组宿主细胞，其有利地用于该多肽的重组产生。包含本发明核苷酸序列的载体被引入宿主细胞以使得载体以先前描述的染色体整合体或自我复制的染色体外载体存在。

宿主细胞可以是单细胞微生物例如原核生物或非单细胞微生物例如真核生物。

有用的单细胞是细菌细胞，例如革兰氏阳性细菌，其包括但不限于嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、Bacillus clausii、凝结芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌的芽孢杆菌(Bacillus)细胞；或链霉菌例如浅青紫链霉菌或鼠灰链霉菌的细胞；或革兰氏阴性细菌例如大肠杆菌或假单胞菌的细胞。在一个优选的实施方案中，细菌宿主细胞是迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌细胞。在另一个优选的实施方案中，芽孢杆菌细胞是嗜碱芽孢杆菌。

载体到细菌宿主细胞的导入可例如通过原生质体转化(参见例如Chang和Cohen，1979，Molecular General Genetics 168：111-115)、使用感受态细胞(参见例如Young和Spizizin，1961，细菌学杂志(Journal ofBacteriology)81：823-829，或Dubnau和Davidoff-Abelson，1971，分子生物学杂志(Journal of Molecular Biology)56：209-221)、电穿孔(参见例如Shigekawa和Dower，1988，生物技术(Biotechniques)6：742-751)、或接合(参见例如Koehler和Thorne，1987，细菌学杂志(Journal ofBacteriology)169：5771-5278)而完成。

宿主细胞可以是真核细胞，例如哺乳动物、昆虫、植物或真菌细胞。

在一个优选的实施方案中宿主细胞是真菌细胞。在此用到的“真菌类”包括子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)、壶菌门(Chytridiomycota)和接合菌门(Zygomycota)(如Ainsworth and Bisby’sDictionary of The Fungi，第八版，1995，CAB International，University Press，剑桥，英国一书中Haw Ksworth等人定义的)以及卵菌门(Oomycota)(如Hawksworth等人，1995，同上，第171页中引用)和所有有丝分裂真菌类(Hawksworth等人，1995，同上)。

在一个更优选的实施方案中，真菌宿主细胞是酵母细胞。在此用到的“酵母”包括产子囊酵母(内生真菌)、担孢子酵母和属于半知菌的酵母(芽生菌)。由于酵母的分类在将来可能有变化，为了本发明的目的，酵母定义为如酵母的生物学和活性(Biology and Activities of Yeast)(Skinner，F.A.，Passmore，S.M.和Davenport，P.R.编辑，Soc.App.Bacteriol.Symposium Series No.9，1980)中所描述的。

在一个更优选的实施方案中，酵母宿主细胞是假丝酵母属、汉逊酵母属、克鲁维酵母属、毕赤酵母属、酵母属、裂殖酵母属或Yarrowia细胞。

在最优选的实施方案中，酵母宿主细胞是卡尔酵母、酿酒酵母、糖化酵母、Saccharomyces douglasii、克鲁弗酵母、诺地酵母或卵形酵母细胞。在另一个最优选的实施方案中，酵母宿主细胞是乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)细胞。在另一个最优选的实施方案中，酵母宿主细胞是Yarrowia lipolytica细胞。

在另一个更优选的实施方案中，真菌宿主细胞是丝状真菌细胞。“丝状真菌类”包括所有真菌亚门和卵菌门(如Hawksworth等人，1995，同上定义)的丝状形式。丝状真菌的特点在于菌丝体壁由壳多糖、纤维素、葡聚糖、脱乙酰壳多糖、甘露聚糖和其它复合多糖组成。营养生长是通过菌丝的延长并且碳分解代谢是专性需氧的。相反，酵母例如酿酒酵母的营养生长是通过单细胞菌体的芽殖并且碳分解代谢是发酵。

在更优选的实施方案中，丝状真菌宿主细胞是支顶孢属、曲霉属、镰孢属、腐质霉属、毛霉属、毁丝霉属、链孢霉属、青霉属、草根霉属、Tolypocladium或木霉属的细胞，但不只限于此。

在最优选的实施方案中，丝状真菌宿主细胞是泡盛曲霉、臭曲霉、日本曲霉、构巢曲霉、黑曲霉或米曲霉细胞。在另一个最优选的实施方案中，丝状真菌宿主细胞是杆孢状镰孢、Fusarium cerealis、Fusariumcrookwellense、大刀镰孢、禾谷镰孢、禾赤镰孢、异孢镰孢、合欢木镰孢、尖孢镰孢、多枝镰孢、粉红镰孢、接骨木镰孢、肤色镰孢、拟分枝孢镰孢、硫色镰孢、Fusarium torulosum、Fusarium trichothecioides或Fusariumvenenatum细胞。在甚至最优选的实施方案中，丝状真菌亲本细胞是Fusarium venenatum(Nirenberg sp.nov.)细胞。在另一个最优选的实施方案中，丝状真菌宿主细胞是Humicola insolens、Humicola lanuginosa、米赫毛霉、嗜热毁丝霉、粗糙链孢霉、产紫青霉、Thielavia terrestris、哈茨木霉、康宁氏木霉、Trichoderma longibrachiatum、里氏木霉或绿色木霉细胞。

真菌细胞可通过包括原生质体的形成、原生质体的转化和细胞壁再生的方法以已经公知方式转化。适合曲霉属宿主细胞转化的方法在EP 238023和Yelton等人，1984，美国国家科学院学报81：1470-1474中有描述。适合镰孢属转化的方法在Malardier等人，1989，基因(Gene)78：147-156和WO 96/00787中有描述。酵母可利用Becker和Guarente在Abelson，J.N.和Simon，M.I.编辑的酵母遗传学和分子生物学指南(Guide to YeastGenetics and Molecular Biology)，酶学方法(Methods in Enzymology)，194卷第182-187页，Academic Press，Inc.，纽约；Ito等人，1983，细菌学杂志153：163；和Hinnen等人，1978，美国国家科学院学报75：1920中描述的方法转化。

产生方法

本发明也涉及产生本发明多肽的方法，其包括(a)培养其野生型能够产生该多肽的菌株；和(b)回收该多肽。优选地，该菌株属于假黑盘菌属，且更优选地为假黑盘菌。

本发明也涉及产生本发明多肽的方法，其包括(a)在有益于该多肽产生的条件下培养宿主细胞；和(b)回收该多肽。

在本发明的产生方法中，细胞利用本领域公知的方法在适于该多肽产生的营养培养基中培养。例如，细胞可通过摇动培养瓶培养，在实验室或工业发酵罐中于适合的培养基中并在允许多肽表达和/或分离的条件下进行的小规模或大规模的发酵(包括连续的、分批、补料分批或固体状态的发酵)培养。培养利用本领域公知的方法在包含碳源和氮源和无机盐的合适营养培养基中进行。合适的培养基可从供货商处购买或根据公开的组合物(例如，美国典型培养物保藏中心的目录)制备。如果多肽分泌到营养培养基中，可直接从培养基中回收该多肽。如果多肽不分泌，可从细胞裂解物回收。

多肽可利用本领域公知的特异于该多肽的方法检测。这些检测方法可包括特异抗体的使用、酶产物的形成或酶底物的消失。例如，如在此所述酶检测法可用于确定多肽的活性。

生成的多肽可通过本领域公知的方法回收。例如，多肽可通过常规方法包括，但不只限于此的，离心、过滤、提取、喷雾干燥、蒸发或沉淀从营养培养基中回收。

本发明的多肽可通过本领域公知的多种方法纯化，所述方法包括但不限于层析(例如离子交换层析、亲和层析、疏水的、层析聚焦和大小排阻)、电泳方法(例如制备型等电聚焦)、差异溶解度(例如硫酸铵沉淀)、SDS-PAGE或提取(参见例如蛋白质纯化(Protein Purification)，J.-C.Janson和Lars Ryden编辑，VCH Publishers，纽约，1989)。

植物

本发明也涉及用编码本发明的具有抗微生物活性多肽的核苷酸序列转化的以表达和产生可回收量的多肽的转基因植物、植物部分或植物细胞。多肽可从植物或植物部分中回收。备选地，含有重组多肽的植物或植物部分可用于改善食品或饲料的质量，例如改善营养价值、适口性和流变学特性或破坏抗营养因子。回收的多肽、植物或植物部分也可用于改善或改变动物或家畜体内的消化菌群。

转基因植物可以是双子叶的(双子叶植物)或单子叶的(单子叶植物)。单子叶植物的实例是草，例如草甸草(蓝草，早熟禾属(Poa))；饲料草如羊茅属(Festuca)、黑麦草属(Lolium)；温带草如剪股颖属(Agrostis)和谷物例如小麦、燕麦、黑麦、大麦、水稻、高粱和玉米。

双子叶植物的实例是烟草、马铃薯、甜菜、如羽扇豆、豌豆、菜豆和大豆的豆科植物和如花椰菜、油菜籽的十字花科植物(芸苔科(Brassicaceae))和紧密相关的模式生物拟南芥(Arabidopsis thaliana)。

植物部分的实例是茎、愈伤组织、叶、根、果实、种子和块茎。特定植物组织如叶绿体、质外体、线粒体、液泡、过氧化物酶体和胞质也被认为是植物部分。进一步地，任何植物细胞，无论其组织来源都被认为是植物部分。

在本发明的范围内也包括这些植物、植物部分和植物细胞的后代。

表达本发明多肽的转基因植物或植物细胞可根据本领域公知的方法构建。简而言之，植物或植物细胞通过将编码本发明多肽的一种或多种表达构建体整合到植物宿主基因组中并繁殖所得到的经修饰植物或植物细胞成为转基因植物或植物细胞。

一般，表达构建体是包含被可操作地连接到适合在选择的植物或植物细胞中表达该核苷酸序列所需要的调节序列上的编码本发明多肽的核苷酸序列的核酸构建体。进一步地，表达构建体可包含用于鉴定宿主细胞中表达构建体已被整合的选择性标记和将该构建体导入所讨论的植物所必需的DNA序列(后者取决于所使用的DNA导入方法)。

调节序列如启动子和终止子序列以及任选地信号或转运序列的选择，是根据例如多肽何时、何处以及怎样按需表达确定的。例如，编码本发明多肽的基因的表达可以是组成型的或可诱导的，或可以是发育、阶段或组织特异性的，或该基因产物可靶向特异组织或植物部分如种子或叶片。调节序列如Tague等人，在1988，植物生理学(Plant Physiology)86：506中描述。

对于组成型表达，可使用35S-CaMV启动子(Franck等人，1980，细胞(Cell)21：285-294)。器官特异型启动子可以是例如来自如种子、马铃薯块茎和果实的贮藏库组织(Edwards & Coruzzi，1990，Ann.Rev.Genet.24：275-303)，或来自如分生组织的代谢库组织(Ito等人，1994，植物分子生物学(Plant Mol.Biol.)24：863-878)的启动子，来自水稻的如谷蛋白、谷醇溶蛋白、球蛋白或白蛋白启动子的种子特异性启动子(Wu等人，1998，植物和细胞生理学(Plant and Cell Physiology)39：885-889)，来自豆球蛋白B4和蚕豆(Vicia faba)的未知种子蛋白质基因的蚕豆启动子(Conrad等人，1998，植物生理学杂志(Journal of Plant Physiology)152：708-711)，来自种子油体蛋白质的启动子(Chen等人，1998，植物和细胞生理学39：935-941)，来自Bressica napus的贮藏蛋白napA启动子，或如WO 91/14772中描述的本领域公知的其他任何种子特异性启动子。进一步地，启动子可以是叶片特异性启动子如来自水稻或番茄的rbcs启动子(Kyozuka等人，1993，植物生理学102：991-1000)，小球藻病毒腺嘌呤甲基转移酶基因启动子(Mitra和Higgins，1994，植物分子生物学26：85-93)，或来自水稻的aldP基因启动子(Kagaya等人，1995，分子和普通遗传学(Molecularand General Genetics)248：668-674)，或如番茄pin2启动子的愈伤可诱导启动子(Xu等人，1993，植物分子生物学22：573-588)。

启动子增强元件也可被使用以在植物中获得酶的较高表达。例如启动子增强元件可以是置于启动子和编码本发明多肽的核苷酸序列之间的内含子。例如Xu等人，1993，同上公开了利用水稻肌动蛋白1基因的第一内含子增强表达。

选择性标记基因和表达构建体的任何其他部分可从本领域适用的那些中选择。

核酸构建体根据本领域公知的常规技术整合到植物基因组中，包括农杆菌-介导的转化、病毒-介导的转化、显微注射、粒子轰击、生物弹射击转化和电穿孔(Gasser等人，1990，科学244：1293；Potrykus，1990，生物/技术(Bio/Technology)8：535；Shimamoto等人，1989，自然(Nature)338：274)。

目前，根瘤农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导的基因转移是选择用于产生转基因双子叶植物的方法(综述参见Hookyas和Schilperoort，1992，植物分子生物学19：15-38)。但是它也可用于转化单子叶植物，虽然对于这些单子叶植物而言其他转化方法是常规优选的。目前，生成转基因单子叶植物选择的方法是胚愈伤组织或发育胚的粒子轰击(用转化DNA包被的粒子金或钨颗粒)(Christou，1992，植物杂志(PlantJournal)2：275-281；Shimamoto，1994，Current Opinion Biotechnology5：158-162；Vasil等人，1992，生物/技术10：667-674)。转化单子叶植物的备选方法是如Omirulleh等人，1993，植物分子生物学21：415-428所描述的基于原生质体转化的方法。

转化后，其中已含有整合的表达构建体的转化体根据本领域公知的方法选择并再生为完整植株。

本发明也涉及产生本发明多肽的方法，其包括(a)在有益于该多肽产生的条件下培养包含编码本发明有抗微生物活性多肽的核苷酸序列的转基因植物或植物细胞，和(b)回收该多肽。

组合物

在更进一步的方面，本发明涉及包含本发明抗微生物多肽的组合物，如药物组合物。

该组合物可包含作为主要多肽成分的本发明多肽，例如单一成分组合物。备选地，该组合物可包含多重酶活性，如氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维素酶、壳多糖酶、角质霉、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、卤代过氧化物酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、氧化酶、果胶分解酶、肽谷氨酰胺酶、过氧化物酶、肌醇六磷酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶或木聚糖酶。

该组合物可进一步包含另一种药学活性剂，如另一种杀生物剂，诸如显示如上文定义的抗微生物活性的另一种抗微生物多肽。杀生物剂可以是本领域公知的抗生素。抗生素的分类包括例如青霉素G、青霉素V、甲氧苯青霉素、苯甲异噁唑青霉素、羧苄青霉素、乙氧萘青霉素、氨苄青霉素等的青霉素类；青霉素与β-内酰胺酶抑制剂的结合，头孢菌素例如氧头孢菌素、唑啉头孢菌素、头孢氨呋肟、拉氧头孢等；碳青霉烯类、单菌霉素类、氨基糖苷类、四环素类；大环内酯类；林可霉素类；多粘菌素类；磺胺类；喹诺酮类；氯霉素；甲硝唑；壮观霉素；甲氧苄啶；万古霉素等。杀生物剂也可以是抗真菌剂，包括例如两性霉素B、制霉菌素的多烯类；5-flucosyn；和例如咪康唑(miconazol)、酮康唑、依曲康唑和氟康唑的唑类。

在一个实施方案中，杀生物剂是非酶化学试剂。在另一个实施方案中，杀生物剂是非多肽化学试剂。

该杀生物剂能够在其25％(w/w)的水溶液中，优选在10％(w/w)的水溶液中，更优选在5％(w/w)的水溶液中，甚至更优选在1％(w/w)的水溶液中，最优选在0.5％(w/w)的水溶液中，以及特别地在含0.1％(w/w)杀生物剂的水溶液中，于20℃孵育30分钟后，减少大肠杆菌(DSM1576)活细胞的数量至1/100。

该杀生物剂也能够当其以1000ppm的浓度加入，优选当其以500ppm的浓度加入，更优选当其以250ppm的浓度加入，甚至更优选当其以100ppm的浓度加入；最优选当其以50ppm的浓度加入，以及特别的当其以25ppm的浓度加入微生物生长的培养基时，于25℃抑制大肠杆菌(DSM1576)的生长晕24小时。

该杀生物剂能够在其25％(w/w)的水溶液中，优选在10％(w/w)的水溶液中，更优选在5％(w/w)的水溶液中，甚至更优选在1％(w/w)的水溶液中，最优选在0.5％(w/w)的水溶液中，以及特别地在含0.1％(w/w)杀生物剂的水溶液中，于20℃孵育30分钟后，减少枯草芽孢杆菌(ATCC 6633)活细胞的数量至1/100。

该杀生物剂也能够当其以1000ppm的浓度加入，优选当其以500ppm的浓度加入，更优选当其以250ppm的浓度加入，甚至更优选当其以100ppm的浓度加入；最优选当其以50ppm的浓度加入，以及特别地当其以25ppm的浓度加入微生物生长的培养基时，于25℃抑制枯草芽孢杆菌(ATCC 6633)的生长晕24小时。

可对组合物中本发明的抗微生物多肽和杀生物剂进行选择以获得协同抗微生物效果。

可对组合物中本发明的抗微生物多肽和杀生物剂进行选择以使得大肠杆菌(DSM 1576)活细胞的数量在含有50％w/w(优选25％w/w，更优选10％w/w，最优选5％w/w)的杀生物剂和0.5ppm(优选0.1ppm)抗微生物多肽的水溶液中，于20℃孵育10分钟后，与通过将杀生物剂和抗微生物多肽分别单独孵育所得到的结果相加，即简单相加效应相比减少量多出至少5％(优选至少10％)。

也可对组合物中酶成分和杀生物剂进行选择以使得大肠杆菌(DSM1576)的生长晕在含有500ppm(优选250ppm，更优选100ppm，最优选50ppm)的杀生物剂和0.5ppm(优选0.1ppm)抗微生物多肽的微生物生长培养基中于25℃，与通过将杀生物剂和抗微生物多肽分别单独孵育所得到的结果相加，即简单相加效应相比抑制时间长出至少5％(优选至少10％)。

也可对组合物中本发明的抗微生物多肽和杀生物剂进行选择以使得枯草芽孢杆菌(ATCC 6633)活细胞的数量在含有50％w/w(优选25％w/w，更优选10％w/w，最优选5％w/w)的杀生物剂和0.5ppm(优选0.1ppm)抗微生物多肽的水溶液中，于20℃孵育10分钟后，与通过将杀生物剂和抗微生物多肽分别单独孵育所得到的结果相加，即简单相加效应相比减少量多出至少5％(优选至少10％)。

也可对组合物中酶成分和杀生物剂进行选择以使得枯草芽孢杆菌(ATCC 66337)的生长晕在含有500ppm(优选250ppm，更优选100ppm，最优选50ppm)的杀生物剂和0.5ppm(优选0.1ppm)抗微生物多肽的微生物生长培养基中于25℃，与通过将杀生物剂和抗微生物多肽分别单独孵育所得到的结果相加，即简单相加效应相比抑制时间长出至少5％(优选至少10％)。

组合物可包含适合的载体材料。组合物也可在当其用作药物时包含能够将本发明抗微生物多肽递送到所需位点的递送载体。

组合物可根据本领域公知的方法制备并且可以是液体或干燥组合物的形式。例如，多肽组合物可以是颗粒或微颗粒的形式。组合物中包含的多肽可根据本领域公知的方法稳定化。

下面给出本发明多肽组合物优选用途的实例。本发明多肽组合物的剂量和使用该组合物时的条件可根据本领域公知的方法确定。

方法和用途

本发明也包含抗微生物多肽的多种用途。该抗微生物多肽一般可用于受细菌、真菌、酵母或藻类污染的任何位点。一般，该位点是在如冷却水系统、衣物冲洗水的含水系统，如开采油、润滑剂、油田等的油系统中，其中微生物需被杀死或者其生长需受控制。但本发明也可用于已知其中抗微生物组合物有用的所有应用中，例如木材保护、橡胶、粘合剂、胶水、纸张、纸板、织物、皮革、塑料、压缝和食品。

其他用途包括食品、饮料、化妆品的保存，例如洗液、霜剂、凝胶、油膏、肥皂、香波、护发剂、止汗剂、除臭剂、漱口剂、隐形眼镜、酶制剂或食品成分。

因此本发明的抗微生物多肽可用作消毒剂，例如用在痤疮、眼部或口部感染、皮肤感染的治疗中；用在止汗剂或除臭剂中；用在足浴盐中；用于隐形眼镜、硬表面、牙齿(口腔护理)、伤口、擦伤等的清洁和消毒。

通常认为本发明的抗微生物多肽可用于任何硬表面上清洁、消毒或抑制微生物生长。可与本发明的抗微生物多肽有利接触的表面实例是例如奶制品厂、化学或药物加工厂、公共卫生水系统、油处理厂、纸浆处理厂、水处理厂和冷却塔使用的加工设备的表面。本发明的抗微生物多肽应以能在所讨论的表面上有效清洁、消毒或抑制微生物生长的量使用。

进一步地，认为本发明的抗微生物多肽可有利地用于清洁任何种类加工设备的定点清洁系统(cleaning in place，C.I.P.)。

本发明的抗微生物多肽另外可用于食品加工厂以及为如医院、保育院、餐馆、尤其是快餐店、熟食店等制备或供应食物的任何区域中清洁表面和烹饪器具。它也可用作食品中的抗微生物剂并特别用作奶酪、水果和蔬菜和沙拉条上食物的表面抗微生物剂。

它也可用作水性涂料的防腐剂或消毒剂。

本发明的抗微生物多肽也用于吃水线的微生物控制，并用于水的消毒，特别是用于工业水的消毒。

本发明也涉及本发明抗微生物多肽或组合物作为药物的用途。进一步地，本发明的抗微生物多肽或组合物可用于控制或抗击微生物如真菌或细菌，优选革兰氏阳性细菌的药物的生产。

本发明的组合物和抗微生物多肽可用作兽用或人用的治疗剂或预防剂。因此，本发明的组合物和抗微生物多肽可用于兽用或人用治疗剂或预防剂的制备，以用于治疗微生物感染，例如细菌或真菌感染、优选革兰氏阳性细菌感染。特别地，微生物感染可能伴发肺部疾病和性传播疾病，其中所述肺部疾病包括但不限于结核病和囊性纤维化；其中所述性传播疾病包括但不限于淋病和衣原体。

本发明的组合物包含有效量的本发明抗微生物多肽。

在此所用的术语“有效量”意指包含SEQ ID NO：2的1-40位氨基酸所示的氨基酸序列或其片段或变体的抗微生物多肽足以抑制所讨论的微生物生长的量。

本发明也涉及伤口治愈组合物或产品如绷带，医疗设备如导管，并进一步涉及抗头屑护发产品如香波。

体外合成

本发明的抗微生物多肽可利用本领域公知的常规方法通过体外合成制备。多种商业合成设备都是适用的，例如Applied Biosystem Inc.、Beckman等的自动化合成仪。通过使用合成仪，天然存在的氨基酸可用非天然氨基酸，特别地用D-异构体(或D-型)例如D-丙氨酸和D-异亮氨酸、非对映异构体、具有不同长度或官能度的侧链等替换。特定的序列和制备方式将由方便、经济、所需纯度等决定。

化学连接可提供给包含适宜官能团的多种肽和蛋白质键合，如氨基用于形成酰胺或形成取代的氨基，例如还原胺化，硫醇基用于硫醚或二硫化物形成，羧基用于酰胺形成等。

如果需要，在合成或表达过程中可将多种基团导入肽，其中所述多种基团允许肽与其它分子或表面的连接。因此半胱氨酸可用于制备硫醚，组氨酸用于连接金属离子复合体，羧基用于形成酰胺或酯，氨基用于形成酰胺等。

多肽也可根据常规的重组合成方法分离或纯化。可制备表达宿主的裂解物并用HPLC、排阻层析、凝胶电泳、亲和层析或其他纯化技术纯化裂解物。大多数情况下，所用的组合物相对于与产品制备和纯化方法中相关的污染物而言，将包含至少20％重量的所需产品，更通常地至少约75％重量，优选至少约95％重量，而对于治疗目的，通常至少约占99.5％重量。通常，该百分比是基于总蛋白的。

动物饲料

本发明也涉及有抗微生物活性的多肽在动物饲料中使用的方法，并涉及包含本发明多肽的饲料组合物和饲料添加剂。

术语动物包括所有动物，包括人类。动物的实例是非反刍动物和反刍动物，例如牛、绵羊和马。在特别的实施方案中，动物是非反刍动物。非反刍动物包括单胃动物例如猪(包括但不只限于此，小猪、成长猪和大母猪)；家禽例如火鸡和小鸡(包括但不只限于，适于烤焙的嫩鸡、产卵鸡)；小牛；和鱼(包括但不只限于鲑鱼)。

术语饲料或饲料组合物指适于或用于动物摄入的任何化合物、制剂、混合物或组合物。

在本发明的用途中，抗微生物多肽可在规定饮食前、后或同时喂饲。优选后者。

在一个特别的实施方案中，以一定形式加入饲料或包括在饲料添加剂中时，该抗微生物多肽是被充分定义的。充分定义指该抗微生物多肽制剂通过大小排阻层析(参见WO 01/58275的实施例12)确定为至少50％纯。在其他特别的实施方案中该抗微生物多肽制剂通过该方法确定为至少60、70、80、85、88、90、92、94或至少95％纯。

充分定义的抗微生物多肽制品是有利的。例如，它使基本上不受其他抗微生物多肽干扰或污染的该抗微生物多肽在饲料中的用量正确变得容易。术语用量正确特别指获得一致和恒定结果的客观性，并且根据所需要的效果能够得到优化剂量。

对于动物饲料中的用途，该抗微生物多肽不必太纯；它可例如包括其他酶，在此情况下它可被定义为抗微生物多肽制剂。

抗微生物多肽制剂可(a)直接加入饲料(或直接用于植物蛋白的处理加工)，或(b)它可用于产生一种或多种中间组合物如饲料添加剂或预混合物，其中所述饲料添加剂或预混合物随后加入饲料(或用于处理加工中)。上述纯化的程度指用于根据上述的(a)或(b)的原始抗微生物多肽制剂的纯度。

具有该等级纯度的抗微生物多肽制剂特别可利用重组方法生产获得，而当该抗微生物多肽是由传统发酵方法生产时它们不容易得到并且成批之间变异很大。

该抗微生物多肽制剂当然可与其他酶混合。

在此用到的术语植物蛋白指包括至少一种得自或来源自植物蛋白的任何化合物、组合物、制剂或混合物，其中所述蛋白包括经修饰蛋白或蛋白衍生物。在特别的实施方案中，植物蛋白的含量是至少10、20、30、40、50或60％(w/w)。

植物蛋白可来自如豆类和谷物的植物蛋白来源，例如来自豆科(Fabaceae)(Leguminosae)、十字花科(Cruciferaceae)、藜科(Chenopodiaceae)和禾本科(Poaceae)的植物材料，如大豆粉、羽扇豆粉和油菜籽粉。

在特别的实施方案中，植物蛋白源是来自豆科的一种或多种植物材料，例如大豆、羽扇豆、豌豆或菜豆。

在另一个特别的实施方案中，植物蛋白源是来自藜科的一种或多种植物材料，例如甜菜、菠菜或奎奴亚藜。

其他植物蛋白源的实例是油菜籽和卷心菜。

大豆是优选的植物蛋白源。

其他植物蛋白源的实例是谷物，例如大麦、小麦、黑麦、燕麦、玉米、水稻和高粱。

抗微生物多肽可以任何形式加入饲料，只要它是相当纯的抗微生物多肽，或以与其他用于添加至动物饲料的成分混合，即以动物饲料添加剂的形式，如称为动物饲料的预混合料加入。

本发明进一步的方面涉及用在动物饲料中的组合物，其中所述动物饲料如动物饲料和动物饲料添加剂例如预混合料。

除本发明的抗微生物多肽外，本发明的动物饲料添加剂含有至少一种脂溶性维生素和/或至少一种水溶性维生素和/或至少一种微量矿物质和/或至少一种大量矿物质。

进一步任选的，饲料添加成分是着色剂、芳香化合物、稳定剂和/或至少一种其它的酶，所述酶选自肌醇六磷酸酶EC3.1.3.8或3.1.3.26；木聚糖酶EC3.2.1.8；半乳聚糖酶EC3.2.1.89和/或β-葡聚糖酶EC3.2.1.4的酶。

在特别的实施方案中，这些其他酶被充分定义(如上对抗微生物多肽制剂的定义)。

其他抗微生物多肽(AMP’s)的实例是CAP18、LeucocinA、Tritrpticin、Protegrin-1、Thanatin、Defensin、Ovispirin如Novispirin(RobertLehrer，2000)和它们保留了抗微生物活性的变体或片段。

其他抗真菌多肽(AFP’s)的实例是巨大曲霉(Aspergillus giganteus)和黑曲霉的肽，以及在WO 94/01459和PCT/DK02/00289[一旦公开即用WO号替代]中公开的它们保留了抗真菌活性的变体或片段。

通常脂溶性和水溶性维生素以及微量矿物质形成用于加入饲料的称为预混合料的一部分，而大量矿物质通常被分开加入饲料。这些组合物类型当被本发明的抗微生物多肽强化时都是本发明的动物饲料添加剂。

在特别的实施方案中，本发明的动物饲料添加剂以0.01-10.0％，更优选0.05-5.0％或0.2-1.0％(％指g添加剂/100g饲料)的水平包括(或规定为必须包括)在动物饮食或饲料中。这特别是对预混合料同样如此。

下列是这些成分实例的非排他性列表：

脂溶性维生素的实例是维生素A、维生素D3、维生素E和维生素K、例如维生素K3。

水溶性维生素的实例是维生素B12、生物素和胆碱、维生素B1、维生素B2、维生素B6、烟酸、叶酸和泛酸盐，例如D-泛酸钙。

微量矿物质的实例是锰、锌、铁、铜、碘、硒和钴。

大量矿物质的实例是钙、磷和钠。

这些成分的营养需求(以家禽和小猪/猪为例证)如WO 01/58275表A中所列。营养需求指这些成分必须按照说明的浓度在食物中提供。

备选地，本发明的动物饲料添加剂包含至少一种WO 01/58275表A中指出的单独成分。至少一种指一种或多种、一种、或两种、或三种、或四种和这样直至所有十三种、或多至所有十五种单独成分。更具体地，该至少一种单独成分以在表A的第四栏或第五栏或第六栏说明的饲料内浓度范围提供的量包括在本发明的添加剂内。

本发明也涉及动物饲料组合物。动物饲料组合物或食料具有相对高含量的蛋白质。家禽和猪食料可如WO 01/58275表B中第2-3栏说明的表征。鱼食料可如该表B第4栏说明的表征。进一步的该鱼食料通常含有200-310g/kg含量的粗脂肪。

根据本发明的动物饲料组合物含有50-800g/kg含量的粗蛋白质，并且进一步包含至少一种此处要求专利保护的抗微生物多肽。

进一步地，或备选地(对于上述的粗蛋白质含量)，本发明的动物饲料组合物含有10-30MJ/kg含量的可代谢能量；和/或0.1-200g/kg含量的钙；和/或0.1-200g/kg含量的有效磷；和/或0.1-100g/kg含量的甲硫氨酸；和/或0.1-150g/kg含量的甲硫氨酸加半胱氨酸；和/或0.5-50g/kg含量的赖氨酸。

在特别的实施方案中，可代谢能量、粗蛋白质、钙、磷、甲硫氨酸、甲硫氨酸加半胱氨酸和/或赖氨酸的含量在WO 01/58275表B中2、3、4或5(R.2-5)的任一范围内。

粗蛋白质以氮(N)乘以系数6.25计算，即粗蛋白质(g/kg)＝N(g/kg)× 6.25。氮含量通过Kjeldahl方法(A.O.A.C.，1984，分析的正式方法(Official Methods of Analysis)14th ed.，Association of Official AnalyticalChemists，Washington DC)确定。

可代谢能量可根据NRC出版物猪的营养需求(Nutrient requirementsin swine)，第九次再版1988，国家研究委员会农业部动物营养协会猪营养分会，National Academy Press，华盛顿特区，第2-6页和家禽饲养材料能量值的欧洲表，Spelderholt centre for poultry research and extension，7361 DA Beekbergen，荷兰，Grafisch bedrijf Ponsen & looijen bv，Wageningen.ISBN 90-71463-12-5计算。

完整的动物食料中钙、有效磷和氨基酸的饮食含量根据如Veevoedertable 1997，gegevens over chemische samenstelling，verteerbaarheid en voederwaarde wan voedermiddelen，CentralVeevoederbureau，Runderweg 6，8219 pk Lelystad.ISBN 90-72839-13-7的饲料表计算。

在特别的实施方案中，本发明的动物饲料组合物含有至少一种上述的植物蛋白或蛋白源。

在进一步特别的实施方案中，本发明的动物饲料组合物含有0-80％的玉米；和/或0-80％的高粱；和/或0-70％小麦；和/或0-70％的大麦；和/或0-30％的燕麦；和/或0-40％的大豆粉；和/或0-10％的鱼粉；和/或0-20％的乳清。动物食料可生产为如磨碎饲料(非丸粒)或丸粒饲料。一般，研磨的饲料是混合的并根据所讨论种类的特异性加入充足量的必需维生素和矿物质。酶可以固体或液体酶制剂加入。例如固体酶制剂一般在混合步骤前或过程中加入，而液体酶制剂一般在粒化步骤后加入。酶也可被掺入饲料添加剂或预混合料中。

食料中酶的终浓度在0.01-200mg酶蛋白/kg食料的范围内，例如在5-30mg酶蛋白/kg动物食料的范围内。

抗微生物多肽可以下列一种或多种量(剂量范围)施用：0.01-200；或0.01-100、或0.05-100、或0.05-50、或0.10-10，所有这些范围是mg抗微生物多肽蛋白/kg饲料(ppm)。

为了确定mg抗微生物多肽蛋白/kg饲料，将抗微生物多肽从饲料组合物中纯化，并且纯化的抗微生物多肽的比活性利用相关检测(参见抗微生物活性、底物和检测部分)确定。饲料组合物的抗微生物活性也利用相同的检测确定，并且根据这两个测定计算mg抗微生物多肽蛋白/kg饲料的剂量。

应用相同的原理确定饲料添加剂中的mg抗微生物多肽蛋白。当然如果可获得用于制备饲料添加剂或饲料的抗微生物多肽样品，就从该样品确定比活性(不必从饲料组合物或添加剂中纯化抗微生物多肽)。

洗涤剂组合物

本发明的抗微生物多肽也可被加入并因此成为洗涤剂组合物的成分。

本发明的洗涤剂组合物可以是例如配制作为手洗或机洗衣物的洗涤剂组合物，包括适于预处理染色纤维的洗衣添加组合物和漂洗添加的织物柔顺组合物，或配制为用于常规家庭硬表面清洁操作的洗涤组合物或配制为用于手洗或机洗洗碟操作。

在特定的方面，本发明提供了包含本发明抗微生物多肽和表面活性剂的洗涤剂添加剂。该洗涤剂添加剂以及洗涤剂组合物可包括一种或多种其他酶，例如蛋白酶、脂肪酶、角质霉、淀粉酶、糖酶、纤维素酶、果胶酶、甘露聚糖酶、阿拉伯聚糖酶、半乳聚糖酶、木聚糖酶、氧化酶(如漆酶)和/或过氧化物酶(如卤代过氧化物酶)。

通常，所选择酶的特性应该适配于所选择的洗涤剂，(即最适pH，适配于其它酶的或非酶的成分等)，并且该酶应以有效量存在。

蛋白酶：适合的蛋白酶包括动物、植物或微生物来源的蛋白酶。微生物来源是优选的。化学修饰或蛋白质工程化的突变体也包括在内。蛋白酶可以是丝氨酸蛋白酶或金属蛋白酶，优选碱性微生物蛋白酶或胰蛋白酶样蛋白酶。碱性蛋白酶的实例是枯草杆菌蛋白酶，特别是来自芽孢杆菌的枯草杆菌蛋白酶，例如枯草杆菌蛋白酶Novo、枯草杆菌蛋白酶Carlsberg、枯草杆菌蛋白酶309、枯草杆菌蛋白酶147和枯草杆菌蛋白酶168(WO89/06279中描述)。胰蛋白酶样蛋白酶的实例是胰蛋白酶(例如猪或牛来源的)和WO 89/06270和WO 94/25583中描述的镰孢属蛋白酶。

有用的蛋白酶的实例是WO 92/19729、WO 98/20115、WO 98/20116和WO 98/34946中描述的变体，特别是在一个或多个下列位点：27、36、57、76、87、97、101、104、120、123、167、170、194、206、218、222、224、235和274替换的变体。

脂肪酶：适合的脂肪酶包括细菌或真菌来源的脂肪酶。化学修饰或蛋白质工程的突变体也包括在内。有用的脂肪酶的实例是来自腐质霉(同物异名词为Thermomyces)的脂肪酶，例如EP 258 068和EP 305 216中描述的来自H.lanuginosa(T.lanuginosa)或如WO 96/13580中描述的来自H.insolens，假单胞菌(Pseudomonas)脂肪酶，例如来自产碱假单胞菌(P.alcaligenes)或类产碱假单胞菌(P.pseudoalcaligenes)(EP 218 272)，洋葱假单胞菌(P.cepacia)(EP 331 376)，施氏假单胞菌(P.stutzeri)(GB1,372,034)，荧光假单胞菌(P.fluorescens)，假单胞菌(Pseudomonas sp.)菌株SD705(WO95/06720和WO 96/27002)，P.wisconsinensis(WO 96/12012)的脂肪酶，芽孢杆菌脂肪酶，例如来自枯草芽孢杆菌(Dartois等人(1993)，生物化学与生物物理学报(Biochemica et Biophysica Acta)，1131，253-360)，嗜热脂肪芽孢杆菌(JP 64/744992)或短小芽孢杆菌(B.pumilus)(WO91/16422)。

其他实例是如WO 92/05249、WO 94/01541、EP 407 225、EP 260 105、WO 95/35381、WO 96/00292、WO 95/30744、WO 94/25578、WO 95/14783、WO 95/22615、WO 97/04079和WO 97/07202中描述的脂肪酶变体。

淀粉酶：合适的淀粉酶(α和/或β)包括细菌或真菌来源的淀粉酶。化学修饰或蛋白质工程化的突变体也包括在内。淀粉酶包括例如从芽孢杆菌获得的α-淀粉酶，如GB 1,296,839中详细描述的地衣芽孢杆菌的一个特定菌株。

有用的淀粉酶的实例是WO 94/02597、WO 94/18314、WO 96/23873和WO 97/43424中描述的变体，特别是在一个或多个下列位点：15、23、105、106、124、128、133、154、156、181、188、190、197、202、208、209、243、264、304、305、391、408和444替换的变体。

纤维素酶：适合的纤维素酶包括细菌或真菌来源的纤维素酶。化学修饰或蛋白质工程化的突变体也包括在内。适合的纤维素酶包括来自芽孢杆菌属、假单胞菌属、腐质霉属、镰孢属、草根霉属、支顶孢属的纤维素酶，例如从在US 4,435,307、US 5,648,263、US 5,691,178、US 5,776,757和WO89/09259中公开的Humicola insolens、嗜热毁丝霉和尖孢镰孢中产生的真菌纤维素酶。

特别合适的纤维素酶是具有色彩护理优点的碱性或中性纤维素酶。这些纤维素酶的实例是在EP 0 495 257、EP 0531 372、WO 96/11262、WO96/29397、WO 98/08940中描述的纤维素酶。其它实例是在例如WO94/07998、EP 0 531 315、US 5,457,046、US 5,686,593、US 5,763,254、WO95/24471、WO 98/12307和PCT/DK98/00299中描述的纤维素酶变体。

过氧化物酶/氧化酶：适合的过氧化物酶/氧化酶包括植物、细菌或真菌来源的酶。化学修饰或蛋白质工程化的突变体也包括在内。有用的过氧化物酶的实例包括来自鬼伞属(Coprinus)例如灰盖鬼伞(C.cinereus)的过氧化物酶以及在WO 93/24618、WO 95/10602和WO 98/15257中描述的其变体。

这些洗涤剂酶可以通过添加含一种或多种酶的独立添加剂，或通过添加含所有这些酶的组合添加剂而被包含于洗涤剂组合物中。本发明的洗涤剂添加剂，也就是独立添加剂或组合添加剂可以制成例如颗粒状、液体、浆状等等。优选的洗涤剂添加剂制剂为颗粒(特别是无粉尘颗粒)、液体(特别是被稳定化的液体)或浆。

无粉尘颗粒可依照例如US 4,106,991和4,661,452所述进行生产并可任选地用本领域已知的方法加包衣。蜡质包衣材料的实例是平均分子量为1000到20000的聚(环氧乙烷)产物(聚乙二醇，PEG)；含有16到50个环氧乙烷单位的乙氧基化的壬基酚；乙氧基化脂肪醇，其中，醇含12到20个碳原子且其中存在15到80个环氧乙烷单位；脂肪醇；脂肪酸；和脂肪酸的单-、二-和三酸甘油酯。GB 1483591中给出了适合于通过流化床技术应用的成膜包衣材料的实例。液体酶制剂可以例如依照现成的方法通过添加多元醇如丙二醇、糖或糖醇、乳酸或硼酸得以稳定。受保护的酶可依照EP 238,216中所公开的方法进行制备。

本发明的洗涤剂组合物可以是任何方便的形式，例如棒状、片状、粉末、颗粒、糊或液体。液体洗涤剂可以是含水的，一般含高达70％的水和0-30％的有机溶剂，或是不含水的。

所述的洗涤剂组合物一般包含一种或多种表面活性剂，它们可以是非离子(包括半极性的)和/或阴离子和/或阳离子和/或两性离子表面活性剂。所述的表面活性剂一般占到0.1％到60％的重量。当包含在所述洗涤剂中时，洗涤剂通常包含约1％到约40％的阴离子表面活性剂，如直链烷基苯磺酸盐、α-烯属磺酸盐、烷基硫酸盐(脂肪醇硫酸盐)、醇乙氧化硫酸盐、仲链烷磺酸盐、α-磺基脂肪酸甲酯、烷基-或链烯基琥珀酸或皂。

当包含在所述洗涤剂中时，通常含有约0.2％到约40％的非离子表面活性剂，例如醇乙氧基化物、壬基酚乙氧基化物、烷基多苷、烷基二甲基胺氧化物、乙氧基化脂肪酸单乙醇酰胺、脂肪酸单乙醇酰胺、多羟基烷基脂肪酰胺或葡糖胺的N-酰基N-烷基衍生物(“葡糖酰胺”)。

所述的洗涤剂可以包含0-65％的洗涤剂助洗剂或络合剂例如沸石、二磷酸盐、三磷酸盐、膦酸酯、碳酸盐、柠檬酸盐、次氮基三乙酸、乙二胺四乙酸、二亚乙基三胺五乙酸、烷基-或链烯基琥珀酸、可溶性硅酸盐或层叠式硅酸盐(例如购自Hoechst的SKS-6)。

所述的洗涤剂可以包含一种或多种聚合物。实例为羧甲基纤维素、聚(乙烯吡咯烷酮)、聚(乙二醇)、聚(乙烯醇)、聚(乙烯基吡啶-N-氧化物)、聚(乙烯基咪唑)、聚羧酸酯如聚丙烯酸酯、马来酸/丙烯酸共聚物和甲基丙烯酸月桂醇酯/丙烯酸共聚物。

所述的洗涤剂可以含有漂白体系，所述漂白体系可以包含H₂O₂来源如过硼酸盐或过碳酸盐，其可以与形成过酸的漂白活化剂如四乙酰基乙二胺或壬酰氧基苯磺酸盐相结合。可选择地，所述的漂白体系可以包含例如酰胺、二酰亚胺或砜类的过氧酸。

本发明的洗涤剂组合物中的酶可以通过诸如以下的常规稳定剂稳定：多元醇如丙二醇或丙三醇、糖或糖醇、乳酸、硼酸或硼酸衍生物如芳香硼酸酯或苯基硼酸衍生物如4-甲酰基苯基硼酸，且所述的组合物可以按例如WO 92/19709和WO 92/19708中所述配制。

所述的洗涤剂还可以包含其它的常规洗涤剂成分，例如织物调理剂包括粘土、发泡剂、泡沫抑制剂、防腐蚀剂、污垢悬浮剂、抗污物再沉淀剂、染料、杀菌剂、光学增白剂、增溶剂、晦暗抑制剂或香料。

目前认为在所述洗涤剂组合物中任何酶，特别是本发明的酶可以以相当于每升洗涤液中具有0.01-100mg酶蛋白质，优选每升洗涤液0.05-5mg酶蛋白质，特别优选每升洗涤液中具有0.1-1mg酶蛋白质的量加入。

此外，本发明的酶可以额外地添加到如WO 97/07202所公开的洗涤剂制剂中，该文献引入本文作为参考。

通过下述的实施例对本发明进行更详细说明，这些实施例不作为对本发明请求保护范围的任何限制。

实施例

用作缓冲剂和底物的化学品至少是试剂级的商品。

实施例1

鉴定来自假黑盘菌的抗微生物多肽

材料和方法

从在Mex-1培养基上诱导5天的假黑盘菌(P.nigrella)的培养基中制备cDNA文库(国际专利申请WO98/38288的实施例中记载的方案)。根据标准的分子生物学方法纯化富含PolyA的RNA，合成cDNA和建立cDNA文库。常规方法的具体方案可在国际专利申请WO01/12794的实施例中找到。用于克隆的载体是pMhas5，其如SEQ ID NO：4中所示并具有下述特性：

                  表1载体pMhas5的特性

特性	定位	说明
			CDS	365-1156	卡那霉素抗性
CDS	2232-2387	β半乳糖苷酶α肽
			-10信号	2189-2192	SD序列
启动子	2101-2189	Lac启动子
			misc特性	626-650	BACE系统的KanP1引物

该质粒的显著特性是EcoRI-NotI限制性位点邻近Lac启动子的SD序列区域。这就允许具有EcoRI-NotI的cDNA能被克隆至该载体中并且所得到的构建体能在大肠杆菌(E.coli)宿主中有效地转录和翻译。

假黑盘菌文库的构建和所得cDNA质粒库的信号捕获法

cDNA质粒库是从最初的cDNA-pMhas5载体连接的20,000个总的转化子中制备的。质粒DNA是根据质粒DNA分离的Qiagen方案(QiagenInc.)直接从LB固体选择性培养基中回收的集落库中制备的。该质粒库按照转座酶厂商的教导(Finnizyme，芬兰)用转座子SigA2和MuA转座酶处理。关于转座子辅助信号捕获法的概述性信息可在国际专利申请WO01/77315中找到。所得到的混合物用乙醇沉淀以除去过量的盐并且根据随细胞(Gibco-BRL)提供的标准方案取1.5微升电穿孔导入20微升DH10B超感受态的细胞。电穿孔的细胞在被接种至选择性培养基前在SOC培养基中振摇(28摄氏度，2小时，250转/分)培养。使用三种琼脂培养基：

LB+50微克/毫升卡那霉素，

LB+卡那霉素+15微克/毫升氯霉素，或

LB+卡那霉素+氯霉素+12.5微克/毫升氨苄青霉素。

通过将电穿孔物稀释接种到LB+卡那霉素+氯霉素的培养基上，确定约119,000个克隆含有具SigA2转座的cNDA文库质粒。从三重选择实验中获得了总共363个克隆。所有的363个克隆重复接种入含50微克/毫升氨苄青霉素的三重选择培养基中选择以捕获真信号。总共336个克隆能在提高的氨苄青霉素浓度下生长并根据Qiagen Qiaturbo96的方法(QiagenInc.)小提质粒。质粒根据国际专利申请WO01/77315的实施例中公开的方法用转座子的正向和反向引物(引物A和B)测序。

引物A：agcgt ttgcg gccgc gatcc      (SEQ ID NO：16)

引物B：ttatt cggtc gaaaa ggatc c    (SEQ ID NO：17)

DNA序列通过AB3700毛细管测序仪上的反应获得。序列经过修整以除去载体，通过转座子序列以及A和B引物获得每一组合质粒的信息。这导致225个组合的序列通过序列同源性分组为145个毗连序列群。对所有的145个毗连序列群进行独立拆分并分析结果。一个质粒(Plectasin_6_B12)与已知的抗微生物多肽(防卫素样多肽)共有一些氨基酸同源性。

在下列的实施例中本发明的抗微生物多肽称为“Plectasin”。

实施例2

曲霉属Plectasin表达载体的构建

Plectasin编码序列以下述方式扩增自上述cDNA文库(见上述实施例1)：在PCR反应中使用1微升cDNA(约10纳克DNA)作为模板以及两个引物178和179。

引物178：tctgg atcca ccatg caatt tacca ccatc ctctc    (SEQ ID NO：7)

引物179：tctct cgagc tagta acact tgcaa acaaa gc       (SEQ ID NO：8)

在100微升的反应体积中使用每一引物10pmol。退火温度是55摄氏度，并在72摄氏度延伸1分钟。共进行35个循环。使用Expand High FidelityPCR系统(Roche)。

PCR反应物在4％琼脂糖凝胶上分离。见到两条明显的条带：最显著的条带在大小约300bp处而稍弱的条带在约350bp处。

这两个片段都用在PCR导物引入的突出端酶切的BamH1和Xho1消化。分离消化的片段并克隆入pMT2188，其中所述pMT2188是基于质粒pCaHj527(参见国际专利申请WO00/70064的实施例)的曲霉属表达载体，其构建如丹麦专利申请PA 2001 00088的实施例7中所述。发现较短的片段含有Plectasin编码序列，这是通过信号捕获法实验(见上述实施例1)而确定的。该较短PCR片段的序列如SEQ ID NO：5所示。

类似地，较长PCR片段的序列经确定含有Plectasin编码序列和额外的58bp的插入片段。注意到该58bp的插入片段含有真菌内含子的共有序列特征，并且进行该产物的扩增以作为mRNA库和从mRNA库获得的cDNA文库中内含子去除不完全的证据。较长PCR片段的序列如SEQ IDNO：6所示。较短PCR产物(SEQ ID NO：5)的曲霉属表达质粒命名为pMT2548。

实施例3

在曲霉属中Plectasin的表达

将pMT2548转化入米曲霉菌株BECh2(国际专利申请WO00/39322中公开)和黑曲霉MBin118中。每一菌株的30个转化子在具有蔗糖和乙酰胺的Cove最小平皿上于选择和非诱导的条件下再分离两次。为了检测Plectasin的表达，转化子在装有10ml YPM(2％蛋白胨，1％酵母提取物，2％麦芽糖)的试管中于30摄氏度生长6天。上清液如制造商所推荐的用MES电泳缓冲液在NuPage10％的Bis-Tris SDS凝胶(Invitrogen)上电泳以允许低分子量范围的分离。这两株曲霉属菌株即使在诱导Plectasin的表达时都生长良好。在多数转化子中见到Plectasin具有预期大小的明显条带，同时该条带在未转化的宿主菌株米曲霉BECh2和黑曲霉MBin118中并未见到。显示出Plectasin条带在BECh2转化子中强于在MBin118转化子中。非常粗略并仅仅基于染色强度估计在该生长条件下的产量为每升培养基10-50mg。

实施例4

将Plectasin克隆到自杀性表达系统中(SES)

Plectasin片段通过利用Plectasin全长cDNA作为模板(Plectasin_6_B12)，并用NcoI和XbaI接头引物DR34F和DR34R进行PCR扩增。

DR34F：ccggccatgg gatttggatg caatggtcct tggg                   (SEQ ID NO：9)

DR34R：gccgtctaga gccatctagt aacacttgca aacaaagccc cccttagc    (SEQ ID NO：10)

PCR扩增利用PWO DNA聚合酶根据制造商(Roche Bioscience，CA)提供的方法进行。PCR产物用NcoI和XbaI消化并定向插入pHHA和pHH质粒(国际专利申请WO 00/73433的实施例中公开)。所得的质粒命名为用于多肽胞质表达的pDR-18-plectasin和用于外周胞质表达的pDRS-18-plectasin。

这两种质粒都含有Plectasin片段的下列氨基酸序列：

mGFGCNGPWDEDDMQCHNHCKSIKGYKGGYCAKGGFVCKCY    (SEQ ID NO：11)

其中m(甲硫氨酸)不出现在天然的Plectasin中但是作为克隆策略导入。

Plectasin表达对大肠杆菌的生长抑制

为了评估大肠杆菌在液体培养基中是否由于内源性Plectasin表达的诱导而生长受抑制，进行如国际专利申请WO 00/73433的实施例中公开的下列实验。简而言之，将含有pDRS-18-plectasin、pDR-18-plectasin、pHH或pHHA中任一质粒的细胞的新鲜过夜培养物300倍稀释至有150微升LB或含有0.1％阿拉伯糖的LB的微量滴定板中，并于37摄氏度剧烈振摇孵育。生长曲线通过利用ELISA读数仪测量规则时间间隔的OD₄₅₀监测。结果显示当Plectasin导向外周胞质中时Plectasin抑制41％的细胞生长，但当在胞质中表达时它不影响细胞生长(见下表)。

        表2细胞生长的抑制

构建体	抑制百分率
		pHH	16％
pHH-plectasin(pDRS-18-plectasin)	41％
		pHHA	12％
pHHA-plectasin(pDR-18-plectasin)	13％

实施例5

假黑盘菌的Plectasin在大肠杆菌中的克隆、表达和活性评估 来自假黑盘菌的Plectasin在pET31b+中的克隆

为了产生Plectasin用于抗微生物活性检测，将编码Plectasin的cDNA插入表达载体pET31b+(Novagen Inc.，WI)。通过特殊设计的寡核苷酸(引物1和2)，Plectasin基因使用制造商(Roche Bioscience，CA)的PWODNA聚合酶进行聚合酶链反应扩增。

引物1：attattcagatgctggatcc gaaaaacctgcgtcgcatta tccgcaaaggcatccatatc   (SEQ ID NO：12)

引物2：aataatctcgagttattagc catattttttaatgatatgg atgcctttgcggataatgcg ac(SEQ ID NO：13)

两侧限制性内切酶位点(AlwNI/AvaI)的酶促消化使我们能够将该基因作为融合构建体克隆到pET31b+(标准步骤如制造商(New EnglandBiolabs Inc.，MA)所描述)中。所有的标准方法已在别处描述(Sambrook，Fritsch，和Maniatis，1989)。

假黑盘菌的Plectasin在大肠杆菌中的转化和表达

重组pET31b+被转化入制造商(Novagen)描述的大肠杆菌Novablue中。质粒通过QIAprep Mini Columns(QIAGEN Inc.，CA)制备并且利用质粒特异的引物(引物3和引物4)通过自动测序仪测序。

引物3：tgctagttat tgctcagcgg        (SEQ ID NO：14)

引物4：accgtagttg cgcccatcg         (SEQ ID NO：15)

质粒转化入购自制造商(Novagen)的大肠杆菌BLR-DE3中。细菌在LB培养基中培养至OD₆₀₀～0.8以及重组蛋白合成由1mM IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳吡喃糖苷)起始。经过3小时的诱导，收获细菌，在1/10体积的缓冲液A(50mM Tris-HCl，1mM EDTA，100mM NaCl，pH8)中重悬并通过压力破坏(1500 mBar)裂解。所得沉淀用缓冲液B(50mM Tris-HCl，10mM EDTA，0.5％TritonX-100，100mM NaCl，pH8)洗涤两次。所有的标准方法已在别处描述(Sambrook，Fritsch，和Maniatis，1989)。

从大肠杆菌包涵体中纯化淡黑假黑盘菌Plectasin

得自上述纯化的沉淀含有纯化的包涵体。为了从KSI融合部分释放多肽，对在Plectasin编码基因N-末端导入的经人工设计的Asp-Pro位点进行酸水解。

包涵体在100mM磷酸钠(pH 2.3)中重悬并在85摄氏度孵育过夜。所得上清液含有脯氨酸-Plectasin并且样品用100mM磷酸钠(pH 12.3)中和。脯氨酸-Plectasin的身份通过质谱证实。所有的标准方法已在别处描述(Sambrook，Fritsch，和Maniatis，1989)。

径向扩散检测抗微生物活性

先前公开方法的改进方法已被应用于抗微生物活性的检测(Lehrer等人，(1991)内源性抗微生物多肽的超灵敏检测，免疫方法杂志(JImmunol Methods)137：167-173)。将靶细菌(10⁶菌落形成单位(CFU))加入10ml用于铺制的琼脂糖(1％低电渗琼脂糖，0.03％胰化酪蛋白大豆培养液，10mM磷酸钠，pH7.4，37摄氏度)。该悬液在INTEGRID平皿(Becton Dickinson Labware，NJ)上凝固。使用3mm的凝胶穿孔器(GelPuncher)在铺制的琼脂糖(Amersham Pharmacia Biotech，Sweden)上打孔。在孔中加入样品并在37摄氏度孵育3小时。在顶部灌入覆盖层(LB培养基，7.5％琼脂)并将平皿孵育过夜。当孔周围出现细菌亮区时显示抗微生物活性。活细胞通过加入10ml，0.2mM的MTT(溴化3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四唑鎓，噻唑蓝)染色计数。所有的标准方法已在别处描述(Sambrook，Fritsch，和Maniatis，1989)。

Plectasin抗枯草芽孢杆菌的抗微生物活性

为了评估Plectasin的抗微生物活性，将重组米曲霉的发酵肉汤用于2倍连续稀释的径向扩散检测(上文描述)。当按照上述的方法测试样品抗枯草芽孢杆菌时见到大的亮区。得到的最大亮区是未稀释的发酵内汤(15mm)，同时取自非重组米曲霉的样品对枯草芽孢杆菌显示没有抗微生物活性。

在备选的大肠杆菌宿主中的包涵体表达Plectasin

为了提高有抗微生物活性的Plectasin的回收量，将Plectasin在大肠杆菌Origami-DE3(Novagen Inc.)中表达。该菌株携带编码硫氧还蛋白还原酶(trxB)和谷胱甘肽还原酶(gor)基因的突变。将编码Plectasin的pET31b+重组质粒转化入购自制造商(Novagen)的大肠杆菌Origami-DE3。含有Plectasin的包涵体的培养、表达和分离如上述(假黑盘菌Plectasin在大肠杆菌中的转化和表达)进行。Plectasin的回收如上述(假黑盘菌Plectasin自大肠杆菌包涵体的纯化)进行。随后，利用径向扩散检测了解抗微生物活性(见上述：通过径向扩散检测抗微生物活性)。

结果显示在大肠杆菌Origami-DE3中产生Plectasin肽导致肽抗微生物活性提高5-10倍。Plectasin生物活性的提高进一步得到表达另一种防卫素，人β-防卫素3获得相似结果的事实的支持。我们得出结论：允许胞质中二硫键形成的大肠杆菌在有生物活性的防卫素和其他有二硫键的抗微生物肽的生物合成中通常是适用的。

实施例6

Plectasin的酿酒酵母表达载体的构建

为了评估Plectasin在酿酒酵母中的表达，制备两种不同的质粒构建体pHH3875和pHH3876。pHH3875编码来自酿酒酵母的融合到成熟Plectasin上的α-前导序列。Plectasin可从α-前导序列释放并因此通过KEX2切割序列成熟。pHH3876编码已融合到Plectasin前区域的α-前导序列，其中所述Plectasin前区域之后是成熟的Plectasin。在该构建体中一个KEX2位点在α-前导序列和Plectasin前区域之间存在，同时另一个KEX2位点分隔Plectasin前区域和Plectasin自身。

pHH3875-α-前导序列/KEX2/Plectasin的构建

Plectasin基因利用下述的pHH3875正向和pHH3875反向引物通过标准的PCR反应扩增。利用来自实施例2的曲霉属质粒pMT2548作为PCR反应中的DNA模板。所得到的DNA片段利用Qiaquick PCR纯化试剂盒(Qiagen)纯化并用在由引物引入的突出段切割的XbaI和ClaI中进行限制性酶切。该片段进一步从2％的琼脂糖凝胶中纯化并连接入也用XbaI和ClaI限制性酶切的酿酒酵母表达载体。该2μ基于大肠杆菌/酵母的穿梭载体使用组成型tpi启动子来驱动α-前导序列/Plectasin融合体的表达，使用β-内酰胺酶用于大肠杆菌中的表型筛选，并携带POT基因用于Δtpi酵母中的质粒筛选(MT663；a/α，Δtpi/Δtpi，pep4-3/pep4-3)。

引物pHH3875正向：

gaagg ggtat cgatg gctaa gagag gattt ggatg caatg gtcct tggga tgagg    (SEQ ID NO：18)

引物pHH3875反向：

cttag tttct agact agtaa cactt gcaaa caaag ccccc c                    (SEQ ID NO：19)

pHH3876-α-前导序列/KEX2/前区域/KEX2 Plectasin的构建

pHH3876的构建方法与pHH3875的相同，除了使用的DNA引物不同。用到的pHH3876引物如下所示：

引物pHH3876正向：

gaagg ggtat cgatg gctaa gagag caccc cagcc tgttc ccgag gctta cgc      (SEQ ID NO：20)

引物pHH3876反向(与pHH3875反向相同)：

cttag tttct agact agtaa cactt gcaaa caaag ccccc c        (SEQ ID NO：21)

酿酒酵母中Plectasin的表达

质粒pHH3902(对照)、pHH3875和pHH3876利用乙酸锂法转化入酿酒酵母菌株MT633。选择pHH3902、pHH3875和pHH3876的几个转化子，划线接种到SC基质/琼脂(含有SC基质琼脂，2％D-葡萄糖，0.02％苏氨酸)平板上并在30摄氏度孵育至克隆形成。

为测试表达，单个克隆分别接种入10ml液体SC基质(含有SC基质，2％D-葡萄糖，0.02％苏氨酸)，剧烈振摇下于30摄氏度孵育3天。上清液在16％Tricine凝胶(Novex)电泳以得到低分子量区域的最佳分离。相应的，上清液利用3kDa分子量截流的微型旋转柱从500微升浓缩到20微升。所有来自pHH3875和pHH3876的样品显示预期大小的肽条带。浓缩的样品显示最显著的条带。

为了获得更多的详细信息，上清液利用MALDI-型质谱仪(来自Perseptive Biosystems的Voyager DE-Pro)分析。

对于pHH3875，主峰在质量4410-4411处被观察到。这与正确产生并加工的Plectasin预期的4402质量非常接近。

对于pHH3876，观察到几个峰。最显著的两个峰出现在质量4411-4413和7870-7871。4411峰与正确加工的Plectasin是一致的。7870峰极好地与前区域未从Plectasin切割的半加工Plectasin相对应。观察到推测为7870峰的几个分解产物。

来自pHH3875和pHH3876的Plectasin的活性

上述的上清液如实施例5中所描述的用径向扩散检测分析。

         表3抑制的近似区(mm)

质粒	正常的	浓缩的
			pHH3902	0	0
pHH3875	5	12
			pHH3876	8	14

令人惊讶地，pHH3876产生最大的抑制区，与pHH3875相比较显示更多的产物或更高活性的产物。

Plectasin变体的HTP筛选

为了进一步优化Plectasin的抗微生物活性，活性的高通量(HTP)检测是必需的。为建立该系统，含有对照质粒pHH3902或两种Plectasin表达质粒pHH3875和pHH3876的酵母细胞在96孔微量滴定板中生长。在合理的细胞密度时，将5或20微升的酵母培养物从微量滴定板中移出并用于如实施例5中所述的径向扩散检测。再次的，径向扩散测试平板上来自两种Plectasin生产菌株pHH3875和pHH3876上清液的亮区是明显的。如上观察到的，来自pHH3876的上清亮区较大。在对照质粒中没有观察到亮区。这说明该简单的HTP检测可以区别酵母细胞间具有不同抗微生物活性的表达水平，并且对于筛选具有所需活性的Plectasin变体是可行的。

实施例7

构建酵母的可诱导产生Plectasin和Plectasin的HTP筛选系统一构建 pYES2-3902、pHH3886(Plectasin)和pHH3887(前Plectasin)

为了评估可诱导表达系统和建立HTP筛选系统的潜力用于鉴定有生物活性提高的Plectasin变体，利用pYES2构建编码Plectasin和前Plectasin的可诱导表达载体。

pYES2(Invitrogen)是5.9kb的为在酿酒酵母中诱导表达重组蛋白和肽而设计的载体。该载体包含以下特性，例如通过半乳糖高水平诱导表达和葡萄糖抑制的酵母GAL1启动子。尿嘧啶原养型和氨苄青霉素抗性可分别用于酵母细胞和大肠杆菌细胞中转化子的筛选。

构建三种质粒：对照质粒pYES-3902，两种编码Plectasin的质粒：pHH3886和pHH3887。

pYES2是非融合载体，来自pHH3902、pHH3875和pHH3876的完整α-前导区在标准PCR反应中PCR扩增。片段在2％琼脂糖凝胶上电泳，利用Qiagen纯化试剂盒纯化，并且用HindIII和XbaI酶切，并连接到质粒pYES2的相应位点。这将α-前导区置于GAL1启动子之前。将连接混合物转化到感受态大肠杆菌中。转化子被再划线接种并且对一些单个克隆分别进行具有正确大小插入片段的质粒分析。利用引物AOP107和AOP446通过DNA测序作出最终确认。质粒命名为pYES-3902(对照)，pHH3886(Plectasin)和pHH3887(前Plectasin)。

引物AOP107：caata taaaa aagct agctt tccg    (SEQ ID NO：22)

引物AOP446：ccggc tgaag ctgct atcgg         (SEQ ID NO：23)

将三种质粒pYES-3902、pHH3886和pHH3887转化入酵母菌株JG169，并接种到含有葡萄糖(0.5％)/半乳糖(1.5％)的平板上。葡萄糖保证合适大小的克隆形成并在葡萄糖的耗竭后，半乳糖保证进一步生长，诱导转录和相应的Plectasin产生。在克隆形成后，指示菌株枯草芽孢杆菌的菌苔(约10⁶cfu)覆盖克隆并进一步将平板孵育过夜。如在上述其他酵母质粒中所见到的，含有对照质粒的酵母菌株不产生亮区，同时pHH3886和pHH3887都产生亮区。最大的亮区在编码前Plectasin的pHH3887中观察到。

实施例8

构建酵母的可诱导产生Plectasin和Plectasin的HTP筛选系统一构建 突变Plectasin文库

突变的Plectasin文库利用易错PCR构建。随机突变的DNA片段利用pYES-突变和pHH3885-反向引物以及模板pHH3875(前Plectasin)或pHH3876(Plectasin)在含有0.5mM MnCl₂的PCR反应中形成。

引物pYES-突变：

taaatactac tattgccagc attgctgcta aagaagaagg ggtatcgatg gccaagaga    (SEQ ID NO：24)

引物pHH3885-反向：

tgtaagcgtg acataactaa ttacatgatg cggccctcta ga                      (SEQ ID NO：25)

片段在2％琼脂糖凝胶上电泳，利用Qiagen纯化试剂盒纯化并插入质粒pYES2-3902。该质粒电穿孔导入感受态酵母细胞JG169。

两个不同的文库接种到大的含有0.5％葡萄糖和1.5％半乳糖的琼脂平板(23cm×23cm)上。在30摄氏度孵育两天后，该文库平板用含有约10⁷cfu的枯草芽孢杆菌的薄琼脂糖层覆盖。该平板进一步在30摄氏度孵育24小时。约10,000个克隆受到测试。分离显示显著亮区的酵母克隆用于进一步的鉴定。

生物材料的保藏

下列生物材料按照布达佩斯条约保藏于真菌菌种保藏中心(Centraalbureau Voor Schimmelcultures(CBS))，Uppsalalaan8，3584 CTUtrecht，荷兰(备选地P.O.Box 85167，3508 AD Utrecht，TheNetherlands)，并且给了如下保藏号：

保藏物              保藏号          保藏日期

假黑盘菌            CBS 444.97      1997年1月28

该保藏是由诺沃挪第克公司进行的，后授权给诺和酶股份有限公司。

假黑盘菌的分类：

真核生物；真菌；子囊菌纲；Pezizomycotina；Pezizomycetes；盘菌目；肉盘菌科；假黑盘菌属。

                    序列表

<110>诺和酶股份有限公司

<120>来自假黑盘菌的抗微生物多肽

<130>10212-WO

<160>25

<170>PatentIn版本3.1

<210>1

<211>288

<212>DNA

<213>假黑盘菌(Pseudoplectania nigrella)

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(285)

<223>

<220>

<221>信号肽

<222>(1)..(69)

<223>

<220>

<221>成熟肽

<222>(166)..()

<223>

<400>1

atg caa ttt acc acc atc ctc tcc atc ggt atc acc gtc ttc gga ctt    48

Met Gln Phe Thr Thr Ile Leu Ser Ile Gly Ile Thr Val Phe Gly Leu

-55                 -50                 -45                 -40

ctc aac acc gga gcc ttt gca gca ccc cag cct gtt ccc gag gct tac    96

Leu Asn Thr Gly Ala Phe Ala Ala Pro Gln Pro Val Pro Glu Ala Tyr

                -35                 -30                 -25

gct gtt tct gat ccc gag gct cat cct gac gat ttt gct ggt atg gat   144

Ala Val Ser Asp Pro Glu Ala His Pro Asp Asp Phe Ala Gly Met Asp

            -20                 -15                 -10

gcg aac caa ctt cag aaa cgt gga ttt gga tgc aat ggt cct tgg gat    192

Ala Asn Gln Leu Gln Lys Arg Gly Phe Gly Cys Asn Gly Pro Trp Asp

        -5              -1  1               5

gag gat gat atg cag tgc cac aat cac tgc aag tct att aag ggt tac    240

Glu Asp Asp Met Gln Cys His Asn His Cys Lys Ser Ile Lys Gly Tyr

10                  15                  20                   25

aag gga ggt tat tgt gct aag ggg ggc ttt gtt tgc aag tgt tac tag    288

Lys Gly Gly Tyr Cys Ala Lys Gly Gly Phe Val Cys Lys Cys Tyr

                30                  35                   40

<210>2

<211>95

<212>PRT

<213>假黑盘菌

<400>2

Met Gln Phe Thr Thr Ile Leu Ser Ile Gly Ile Thr Val Phe Gly Leu

-55                 -50                 -45                 -40

Leu Asn Thr Gly Ala Phe Ala Ala Pro Gln Pro Val Pro Glu Ala Tyr

                -35                 -30                 -25

Ala Val Ser Asp Pro Glu Ala His Pro Asp Asp Phe Ala Gly Met Asp

            -20                 -15                 -10

Ala Asn Gln Leu Gln Lys Arg Gly Phe Gly Cys Asn Gly Pro Trp Asp

        -5              -1  1               5

Glu Asp Asp Met Gln Cys His Asn His Cys Lys Ser Ile Lys Gly Tyr

10                  15                  20                  25

Lys Gly Gly Tyr Cys Ala Lys Gly Gly Phe Val Cys Lys Cys Tyr

                30                  35                   40

<210>3

<211>95

<212>PRT

<213>假黑盘菌

<220>

<221>信号肽

<222>(1)..(23)

<223>

<220>

<221>前肽

<222>(24)..(55)

<223>

<220>

<221>肽

<222>(56)..(95)

<223>

<400>3

Met Gln Phe Thr Thr Ile Leu Ser Ile Gly Ile Thr Val Phe Gly Leu

1               5                   10                  15

Leu Asn Thr Gly Ala Phe Ala Ala Pro Gln Pro Val Pro Glu Ala Tyr

            20                  25                  30

Ala Val Ser Asp Pro Glu Ala His Pro Asp Asp Phe Ala Gly Met Asp

        35                  40                  45

Ala Asn Gln Leu Gln Lys Arg Gly Phe Gly Cys Asn Gly Pro Trp Asp

    50                  55                  60

Glu Asp Asp Met Gln Cys His Asn His Cys Lys Ser Ile Lys Gly Tyr

65                  70                  75                   80

Lys Gly Gly Tyr Cys Ala Lys Gly Gly Phe Val Cys Lys Cys Tyr

                85                  90                  95

<210>4

<211>2403

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>载体pMHas5

<400>4

cgataagcta gcttcacgct gccgcaagca ctcagggcgc aagggctgct aaaggaagcg   60

gaacacgtag aaagccagtc cgcagaaacg gtgctgaccc cggatgaatg tcagctactg  120

ggctatctgg acaagggaaa acgcaagcgc aaagagaaag caggtagctt gcagtgggct  180

tacatggcga tagctagact gggcggtttt atggacagca agcgaaccgg aattgccagc  240

tggggcgccc tctggtaagg ttgggaagcc ctgcaaagta aactggatgg ctttcttgcc  300

gccaaggatc tgatggcgca ggggatcaag atctgatcaa gagacaggat gaggatcgtt  360

tcgcatgatt gaacaagatg gattgcacgc aggttctccg gccgcttggg tggagaggct  420

attcggctat gactgggcac aacagacaat cggctgctct gatgccgccg tgttccggct  480

gtcagcgcag gggcgcccgg ttctttttgt caagaccgac ctgtccggtg ccctgaatga  540

actccaagac gaggcagcgc ggctatcgtg gctggccacg acgggcgttc cttgcgcagc  600

tgtgctcgac gttgtcactg aagcgggaag ggactggctg ctattgggcg aagtgccggg  660

gcaggatctc ctgtcatctc accttgctcc tgccgagaaa gtatccatca tggctgatgc  720

aatgcggcgg ctgcatacgc ttgatccggc tacctgccca ttcgaccacc aagcgaaaca  780

tcgcatcgag cgagcacgta ctcggatgga agccggtctt gtcgatcagg atgatctgga  840

cgaagagcat caggggctcg cgccagccga actgttcgcc aggctcaagg cgcggatgcc  900

cgacggcgag gatctcgtcg tgacccatgg cgatgcctgc ttgccgaata tcatggtgga  960

aaatggccgc ttttctggat tcatcgactg tggccggctg ggtgtggcgg accgctatca    1020

ggacatagcg ttggctaccc gtgatattgc tgaagagctt ggcggcgaat gggctgaccg    1080

cttcctcgtg ctttacggta tcgccgctcc cgattcgcag cgcatcgcct tctatcgcct    1140

tcttgacgag ttcttctgag cgggactctg gggttcgcga tgataagctg tcaaacatga    1200

gaattacaac ttatatcgta tggggctgac ttcaggtgct acatttgaag agataaattg    1260

cactgaaatc tagaaatatt ttatctgatt aataagatga tcttcttgag atcgttttgg    1320

tctgcgcgta atctcttgct ctgaaaacga aaaaaccgcc ttgcagggcg gtttttcgaa    1380

ggttctctga gctaccaact ctttgaaccg aggtaactgg cttggaggag cgcagtcacc    1440

aaaacttgtc ctttcagttt agccttaacc ggcgcatgac ttcaagacta actcctctaa    1500

atcaattacc agtggctgct gccagtggtg cttttgcatg tctttccggg ttggactcaa    1560

gacgatagtt accggataag gcgcagcggt cggactgaac ggggggttcg tgcatacagt    1620

ccagcttgga gcgaactgcc tacccggaac tgagtgtcag gcgtggaatg agacaaacgc    1680

ggccataaca gcggaatgac accggtaaac cgaaaggcag gaacaggaga gcgcacgagg    1740

gagccgccag gggaaacgcc tggtatcttt atagtcctgt cgggtttcgc caccactgat    1800

ttgagcgtca gatttcgtga tgcttgtcag gggggcggag cctatggaaa aacggctttg    1860

ccttctttcc tgcgttatcc cctgattctg tggataaccg tattaccgcc tttgagtgag    1920

ctgataccgc tcgccgcagc cgaacgaccg agcgcagcga gtcagtgagc gaggaagcgg    1980

aagagcgccc aatacgcaaa ccgcctctcc ccgcgcgttg gccgattcat taatgcagct    2040

ggcacgacag gtttcccgac tggaaagcgg gcagtgagcg caacgcaatt aatgtgagtt    2100

agctcactca ttaggcaccc caggctttac actttatgct tccggctcgt atgttgtgtg    2160

gaattgtgag cggataacaa tttcacacag gaattcacag ctatgctaga gcggccgctc    2220

gacctgcagg catgcaagct tggcactggc cgtcgtttta caacgtcgtg actgggaaaa    2280

ccctggcgtt acccaactta atcgccttgc agcacatccc cctttcgcca gctggcgtaa    2340

tagcgaagag gcccgcaccg atcgcccttc ccaacagttg cgcagcctga atggcgaatg    2400

gcg                                                                  2403

<210>5

<211>303

<212>DNA

<213>假黑盘菌

<400>5

ggatccacca tgcaatttac caccatcctc tccatcggta tcaccgtctt cggacttctc     60

aacaccggag cctttgcagc accccagcct gttcccgagg cttacgctgt ttctgatccc    120

gaggctcatc ctgacgattt tgctggtatg gatgcgaacc aacttcagaa acgtggattt    180

ggatgcaatg gtccttggga tgaggatgat atgcagtgcc acaatcactg caagtctatt    240

aagggttaca agggaggtta ttgtgctaag gggggctttg tttgcaagtg ttactagctc    300

gag                                                                  303

<210>6

<211>361

<212>DNA

<213>假黑盘菌

<400>6

ggatccacca tgcaatttac caccatcctc tccatcggta tcaccgtctt cggacttctc     60

aacaccggag cctttgcagc accccagcct gttcccgagg cttacgctgt ttctgatccc    120

gaggctcatc ctgacgattt tgctggtatg gatgcgaacc aacttcagaa acgtggattt    180

ggatgcaatg gtccttggga tgaggatgat atgcagtgcc acaagtaaga atcacttata    240

actatagatt aagccaagag tattggaact gatgataaat agtcactgca agtctattaa    300

gggttacaag ggaggttatt gtgctaaggg gggctttgtt tgcaagtgtt actagctcga    360

g                                                                361

<210>7

<211>35

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物178

<400>7

tctggatcca ccatgcaatt taccaccatc ctctc                           35

<210>8

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物179

<400>8

tctctcgagc tagtaacact tgcaaacaaa gc                              32

<210>9

<211>34

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物DR34F

<400>9

ccggccatgg gatttggatg caatggtcct tggg                           34

<210>10

<211>48

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物DR34R

<400>10

gccgtctaga gccatctagt aacacttgca aacaaagccc cccttagc                48

<210>11

<211>41

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>met-Plectasin

<400>11

Met Gly Phe Gly Cys Asn Gly Pro Trp Asp Glu Asp Asp Met Gln Cys

1               5                   10                  15

His Asn His Cys Lys Ser Ile Lys Gly Tyr Lys Gly Gly Tyr Cys Ala

            20                  25                  30

Lys Gly Gly Phe Val Cys Lys Cys Tyr

        35                  40

<210>12

<211>60

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>Primer1

<400>12

attattcaga tgctggatcc gaaaaacctg cgtcgcatta tccgcaaagg catccatatc    60

<210>13

<211>62

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>Primer2

<400>13

aataatctcg agttattagc catatttttt aatgatatgg atgcctttgc ggataatgcg    60

ac                                                                   62

<210>14

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>Primer3

<400>14

tgctagttat tgctcagcgg                                                20

<210>15

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>Primer4

<400>15

accgtagttg cgcccatcg                                                 19

<210>16

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物A

<400>16

agcgtttgcg gccgcgatcc                                               20

<210>17

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物B

<400>17

ttattcggtc gaaaaggatcc                                              21

<210>18

<211>55

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物pHH3875-Forw

<400>18

gaaggggtat cgatggctaa gagaggattt ggatgcaatg gtccttggga tgagg        55

<210>19

<211>41

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物pHH3875-Rev

<400>19

cttagtttct agactagtaa cacttgcaaa caaagccccc c                       41

<210>20

<211>53

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物pHH3876-Forw

<400>20

gaaggggtat cgatggctaa gagagcaccc cagcctgttc ccgaggctta cgc       53

<210>21

<211>41

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物pHH3876-Rev

<400>21

cttagtttct agactagtaa cacttgcaaa caaagccccc c                    41

<210>22

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物AOP107

<400>22

caatataaaa aagctagctt tccg                                       24

<210>23

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物AOP446

<400>23

ccggctgaag ctgctatcgg                                            20

<210>24

<211>59

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物pYES-mut

<400>24

taaatactac tattgccagc attgctgcta aagaagaagg ggtatcgatg gccaagaga    59

<210>25

<211>42

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物pHH3885-Rev

<400>25

tgtaagcgtg acataactaa ttacatgatg cggccctcta ga                      42

Claims (35)

1.具有抗微生物活性的多肽，其选自：

(a)包含的氨基酸序列与SEQ ID NO：2的1-40位氨基酸具有至少65％同一性的多肽，其中组成该多肽的氨基酸独立地选自D型或L型；

(b)包含的氨基酸序列与假黑盘菌(Pseudoplectania nigrella)CBS444.97中抗微生物多肽编码部分的核苷酸序列所编码的多肽具有至少65％同一性的多肽；

(c)与选自以下的多核苷酸探针在低严谨条件下杂交的核苷酸序列所编码的多肽：

(i)SEQ ID NO：1的166-285位核苷酸的互补链，

(ii)SEQ ID NO：1的70-285位核苷酸的互补链，和

(iii)SEQ ID NO：1的1-285位核苷酸的互补链；以及

(d)具有抗微生物活性的(a)、(b)或(c)的片段。

2.根据权利要求1的多肽，其包含的氨基酸序列与SEQ ID NO：2的1-40位氨基酸具有至少70％的同一性，优选地与SEQ ID NO：2的1-40位氨基酸具有至少80％的同一性、至少85％的同一性、至少90％的同一性、至少95％的同一性，或至少99％的同一性。

3.根据权利要求2的多肽，其包含SEQ ID NO：2的1-40位氨基酸。

4.根据权利要求1至3中任意一项所述的多肽，其由SEQ ID NO：2的1-40位氨基酸组成。

5.根据权利要求1至3中任意一项所述的多肽，其中该多肽是人工变体，其包含的氨基酸序列与SEQ ID NO：2的1-40位氨基酸相比较具有至少一处氨基酸的替换、删除和/或插入。

6.根据权利要求1的多肽，其包含的氨基酸序列与假黑盘菌CBS444.97中抗微生物多肽编码部分的核苷酸序列所编码的多肽具有至少70％的同一性，优选地与假黑盘菌CBS 444.97中抗微生物多肽编码部分的核苷酸序列所编码的多肽具有至少80％的同一性、至少85％的同一性、至少90％的同一性、至少95％的同一性，或至少99％的同一性。

7.根据权利要求6的多肽，其包含的氨基酸序列由假黑盘菌CBS444.97中抗微生物多肽编码部分的核苷酸序列编码。

8.根据权利要求6或7的多肽，其由假黑盘菌CBS 444.97中抗微生物多肽编码部分的核苷酸序列所编码的氨基酸序列组成。

9.根据权利要求6或7的多肽，其中该多肽是人工变体，其包含的氨基酸序列与假黑盘菌CBS 444.97中抗微生物多肽编码部分的核苷酸序列所编码的氨基酸序列相比较具有至少一处氨基酸的替换、删除和/或插入。

10.根据权利要求1的多肽，其由与选自以下的多核苷酸探针在中严谨条件下，优选地在高严谨条件下杂交的核苷酸序列编码：

(i)SEQ ID NO：1的166-285位核苷酸的互补链，

(ii)SEQ ID NO：1的70-285位核苷酸的互补链，和

(iii)SEQ ID NO：1的1-285位核苷酸的互补链。

11.根据权利要求10的多肽，其由与这样的多核苷酸探针在中严谨条件下，优选地在高严谨条件下杂交的核苷酸序列编码，其中所述多核苷酸探针为SEQ ID NO：1的166-285位核苷酸的互补链。

12.多核苷酸，其具有的核苷酸序列编码权利要求1至11中任意一项所述的多肽。

13.核酸构建体，其包含可操作地与一个或多个调控序列连接的权利要求12中所述的核苷酸序列，其中所述调控序列指导所述多肽在合适的宿主中产生。

14.重组表达载体，其包含权利要求13中所述的核酸构建体。

15.重组宿主细胞，其包含权利要求13中所述的核酸构建体。

16.产生如权利要求1-11中任意一项所述的多肽的方法，该方法包括：

(a)培养菌株以产生该多肽，其中所述菌株在其野生型形式能够产生该多肽；以及

(b)回收该多肽。

17.产生如权利要求1-11中任意一项所述的多肽的方法，该方法包括：

(a)在有益于该多肽产生的条件下培养如权利要求16中所述的重组宿主细胞；以及

(b)回收该多肽。

18.多核苷酸，其具有的核苷酸序列与SEQ ID NO：1的166-285位核苷酸具有至少65％的同一性。

19.多核苷酸，其具有的核苷酸序列与假黑盘菌CBS 444.97中抗微生物多肽编码部分的核苷酸序列具有至少65％的同一性。

20.多核苷酸，其具有的核苷酸序列编码具有抗微生物活性的多肽，并且其具有的核苷酸序列与选自以下的多核苷酸探针在低严谨条件下杂交：

(i)SEQ ID NO：1的166-285位核苷酸的互补链，

(ii)SEQ ID NO：1的70-285位核苷酸的互补链，和

(iii)SEQ ID NO：1的1-285位核苷酸的互补链。

21.具有经修饰核苷酸序列的多核苷酸，其中所述经修饰的核苷酸序列包含在SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列中的至少一处修饰，且其中该经修饰的核苷酸序列编码由SEQ ID NO：2的1-40位氨基酸组成的多肽。

22.抗微生物组合物，其包含如权利要求1-11中任意一项所述的抗微生物多肽。

23.权利要求22的组合物，其还包含额外的杀生物剂。

24.杀死或抑制微生物细胞生长的方法，其包括将微生物细胞与权利要求1-11中任意一项所述的抗微生物多肽接触。

25.洗涤剂组合物，其包含表面活性剂和如权利要求1-11中任意一项所述的抗微生物多肽。

26.如权利要求1-11中任意一项所述的用作药物的抗微生物多肽。

27.如权利要求1-11中任意一项所述的用作兽或人的抗微生物治疗剂或预防剂的抗微生物多肽。

28.如权利要求1-11中任意一项所述的抗微生物多肽的用途，其用于制备治疗微生物感染的兽或人的治疗剂或用于预防用途。

29.如权利要求1-11中任意一项所述的抗微生物多肽的用途，其用于杀死或抑制微生物细胞的生长。

30.转基因植物、植物部分或植物细胞，其已经用这样的核苷酸序列转化，所述核苷酸序列编码如权利要求1-11中任意一项所述的具有抗微生物活性的多肽。

31.至少一种如权利要求1-11中任意一项所述的抗微生物多肽在动物饲料中的用途。

32.至少一种如权利要求1-11中任意一项所述的抗微生物多肽在制备用于动物饲料的组合物中的用途。

33.动物饲料添加剂，其包含

(a)至少一种如权利要求1-11中任意一项所述的抗微生物多肽；和

(b)至少一种脂溶性维生素，和/或

(c)至少一种水溶性维生素，和/或

(d)至少一种微量矿物质，和/或

(e)至少一种大量矿物质。

34.权利要求33的动物饲料添加剂，其还包含肌醇六磷酸酶、木聚糖酶、半乳聚糖酶和/或β-葡聚糖酶。

35.动物饲料组合物，其具有50-800g/kg的粗蛋白含量并包含至少一种如权利要求1-11中任意一项所述的抗微生物多肽。