CN1602357A - 新的肌醇六磷酸酶和制造这些新肌醇六磷酸酶的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及新的肌醇六磷酸酶，尤其是真菌来源，同时涉及它们各自的产生方法。本发明更特定涉及获得自青霉属真菌的新肌醇六磷酸酶，尤其是青霉属CBS109899菌株，也涉及编码这些肌醇六磷酸酶的多核苷酸。发明同样涉及含这些多核苷酸的载体、在组织中表达所述肌醇六磷酸酶的转化的宿主生物。

Description

新的肌醇六磷酸酶和制造这些新肌醇六磷酸酶的方法

本发明涉及新的肌醇六磷酸酶，尤其是真菌来源，也涉及它们各自的制造方法。本发明更特定涉及获得自青霉属真菌的新肌醇六磷酸酶，尤其是青霉属CBS109899菌株，也涉及编码这些肌醇六磷酸酶的多核苷酸。发明还涉及含这些多核苷酸的载体、在组织中表达所述肌醇六磷酸酶的转化的宿主生物。

本发明的肌醇六磷酸酶特别适合用于动物营养物的饲养组合物。此适当性与它们的性质相关，尤其是它们在温度和pH条件下的活性，这些条件对应于制备所述组合物的条件以及动物消化系统中所遇到的条件。

磷是对于所有生物体生命必要的元素。它特别对于农场动物饲者非常重要，用于确定他们的动物消化足够量以最优化它们的生长和发育。大部分农场动物用以植物为基础的饲养组合物喂养。这些植物包含大量磷酸盐，它们将磷酸盐以贮藏化合物形式肌醇六磷酸保存在它们的组织中。肌醇六磷酸平均包含植物中存在的50％到70％的磷。肌醇六磷酸自然转移且其所含磷酸盐在大部分农场动物中释放，尤其是反刍动物。然而，肌醇六磷酸不被单胃动物代谢，如猪和家禽。因此在这些动物中，它们食物摄取中所含的肌醇六磷酸随着排泄物释放，饲者需要用无机磷酸盐补充所述摄入，从而使他的动物消化足够量磷。此策略造成饲者额外的花费且非吸收的肌醇六磷酸释放到环境中产生污染。此污染在饲养密集区域增加更快。

同样已知肌醇六磷酸是食物摄入中所含重要营养成分的螯合剂，例如镁、钙、锌或铁。此性质导致食物摄入的营养质量下降，给予肌醇六磷酸抗营养剂的性质。

为对应于多种与单胃动物缺乏肌醇六磷酸吸收相关的缺点，考虑将酶肌醇六磷酸酶导入这些家畜动物的食物摄入中。肌醇六磷酸酶水解肌醇六磷酸，释放肌醇和无机磷酸盐。肌醇六磷酸酶和编码这些肌醇六磷酸酶的基因从许多生物中体被分离。肌醇六磷酸酶主要从真菌中分离(Howsor和Davis，1983，Enzyme Microb.Technol.5，377-382；Wyss等，1999，Appli.Environ.Microbiol.，65(2)，359-366)。在这些产生肌醇六磷酸酶的真菌中，提到的真菌有曲霉属，尤其是A.ficcum(Ullah和Gibson，1987，Preparative Biochemistry 17(1)，63-91；Ullah和Dischinger，1993，Biochem.Biophys.Res.Commun.，192(2)，747-753)、土曲霉(A.terreus)(Mitchell等，1997，Microbiology，143(第1部分)，245-252)、黑曲霉(A.niger)(Dvorakova等，1997，Folia Microbiol(Praha)，42(4)，349-352)、烟曲霉(A.fumigatus)(Pasamontes等，1997，Appli.Environ.Microbiol.，63(5)，1696-1700)；青霉属，尤其是P.caseicolum；Myceliophthora，尤其是M.thermophila(Mitchell等，1997，Microbiology，143(第1部分)，245-252；Talaromyces，尤其是嗜热篮霉菌(T.thermophila)，脉孢菌属，尤其是粗糙脉孢菌(N.crass)和好食脉孢菌(N.sitophila)；高温霉菌属(Therrnomyce)，尤其是T.Lanuginosus(Berka等，1998，Appli.Environ.Microbiol.64(11)，4423-4427)；或红曲霉属，尤其是M.anka。肌醇六磷酸酶也在细菌中发现。作为例子，提到的细菌有芽孢杆菌属，尤其是枯草芽孢杆菌(B.subtilis)(Powar和Jagannathan，1982，J.Bacteriol.151(3)，102-1108；Shimizu，1992，Biosci.Biotech.Biochem.56(8)，1266-1269；Keruvo等，1998，Appli.Environ.Microbiol.64(6)，2079-2085)；假单胞菌属(Cosgrove，1970，Austral.J.Biol.Sci.23，1207-1220)；埃希氏菌属，尤其是大肠杆菌(E.coli)(Golovan等，2000，Can.J.Microbiol.46，59-71)；肠杆菌属(yoon等，1996，Enzyme and microbial.Technol.；18，449-454)或链霉菌属。酵母肌醇六磷酸酶也被分离(Dvorakova，1998，Folia Microbiol.43(4)，323-338)，如酵母Schwaniiomyces occidentalis和酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。最后，肌醇六磷酸酶在植物中发现，尤其是大豆(Ullah和Gibson，1988，Arch.Biochem.Biophys.，260(2)，514-20)、玉米(Maugenest等，1997，Biochem J.，322(第2部分)，511-7；Maugenest等，1999，Plant Mol.Biol.，39(3)，503-14)或拟南芥(Arabidopsis)(Mullaney和Ullah，1998，Biochem.Biophys.Res.Commun.，251(1)，252-5)。

能确定肌醇六磷酸酶特征的性质包括关于肌醇六磷酸的米氏常数(Km)、活性的最适pH和最适温度以及在特定pHs和温度的活性的稳定性。涉及肌醇六磷酸酶结构的数据也可使用，如分子量(MW)、等电点(pI)或肽序列。为能在动物营养物中使用，肌醇六磷酸酶的性质必须与用于此营养的饲料加工过程相容。特定的是，所用肌醇六磷酸酶的活性在制备这些饲料方法的温度和pH条件以及消化这些饲料的动物消化道中存在的条件下，必须维持且如果可能需为最佳。这些限制导致主要搜寻的肌醇六磷酸酶所具有的活性能抵挡高温条件如制备饲料组合物方法中所用条件，抵挡酸性pH条件如家畜动物消化道中存在的条件。

为符合这些标准，在生物体中寻找肌醇六磷酸酶，尤其是微生物，其生长的环境中温度和pH条件与这些标准对应。此策略能分离抵挡高温的肌醇六磷酸酶，例如专利申请WO 97/35016或EP 0 684 313所述，也分离具低Km的肌醇六磷酸酶，例如专利申请EP 0 960 934所述。另一种策略是通过定点突变来人工修饰已知肌醇六磷酸酶序列以赋予其优势性质。此策略特定描述于专利申请WO 99/48380、EP 0 897 985和EP 0897 010。

附图简述

图1：青霉属CBS 109899的肌醇六磷酸酶活性作为pH的函数。100％相对活性的值对应于特定pH的肌醇六磷酸酶最佳活性。

图2：青霉属CBS 109899的肌醇六磷酸酶活性作为温度的函数。100％相对活性的值对应于特定温度的肌醇六磷酸酶最佳活性。

概述

本发明涉及编码肌醇六磷酸酶的分离的多核苷酸，肌醇六磷酸酶由序列标识符SEQ ID NO：3描述。此肌醇六磷酸酶和编码它的多核苷酸也来源自青霉属的真菌菌株，尤其是青霉属CBS 109899菌株。

根据本发明，术语“多核苷酸”所指核酸分子包括天然或人造碱基序列，碱基可以是DNA或RNA类型，优选DNA类型，尤其是双链。当所述多核苷酸是天然的时，要清楚理解发明不涵盖天然环境中的此多核苷酸，但包括从其天然发现的活生物体基因组分离和纯化的相同多核苷酸。此多核苷酸可通过提取和纯化直接获得，或通过复制间接获得。然而，本发明包括所述多核苷酸，当它被人工整合到非其天然存在的活生物体基因组中或当它被人工重导入其来源的活生物体时，作为此生物体基因组中一个或多个拷贝。当此多核苷酸是探针时，它一般是单链。

因此发明包括编码肌醇六磷酸酶肽序列的多核苷酸，肌醇六磷酸酶由序列标识符SEQ ID NO：3描述。本领域技术人员熟知此定义包括所有多核苷酸，尽管所含核苷酸序列由于遗传密码简并性而不同，多核苷酸编码相同氨基酸并因而编码相同肌醇六磷酸酶，肌醇六磷酸酶由序列标识符SEQ ID NO：3表示。

本发明也包括与上述多核苷酸同源的多核苷酸、所述编码肌醇六磷酸酶的同源多核苷酸，肌醇六磷酸酶与序列标识符SEQ ID NO：3所示肌醇六磷酸酶同源。根据发明，术语“同源”指编码肌醇六磷酸酶的多核苷酸，其序列具有相对编码序列标识符SEQ ID NO：3所示肌醇六磷酸酶的多核苷酸的修饰。同源多核苷酸特征是与编码序列标识符SEQ ID NO：3所示肌醇六磷酸酶的多核苷酸有一定程度的同一性。两种相应多核苷酸间的同一性程度通过比较它们的序列来获得，一般由这些序列间相同的核苷酸百分比表示。测量特定序列长度的同一性程度，比较的较短序列确定测量同源序列同一性程度的序列长度。因此发明涵盖的多核苷酸具有一个或多个相对编码序列标识符SEQ ID NO：3所示肌醇六磷酸酶的多核苷酸的修饰，编码的肌醇六磷酸酶性质相当于序列标识符SEQ ID NO：3所示肌醇六磷酸酶的性质。

根据发明，表达“等价肌醇六磷酸酶”或“具相等性质的肌醇六磷酸酶”本质上指有肌醇六磷酸酶活性的蛋白质，这不取决于它们的内在性质如Km、活性的最适pH或活性的最适温度。肌醇六磷酸酶活性水平可通过任何方法测量以确定肌醇六磷酸酶活性的特征。术语“肌醇六磷酸酶”所指酶的催化活性包括水解肌醇六磷酸，用于释放肌醇和无机磷酸盐。然而由于大部分肌醇六磷酸酶不完全水解肌醇六磷酸(包括6个磷酸盐)，根据发明的肌醇六磷酸酶催化活性可导致无机磷酸盐和肌醇磷酸酯释放，所述酯取决于肌醇六磷酸酶水解能力，可能是肌醇一、二、三、四或五磷酸酯。作为例子，肌醇六磷酸酶活性可根据Shimizu(1992，Biosci.Biotech.Biochem.56(8)，1266-1269)的方法测量，特定如实施例2所述。然而，任何确定肌醇六磷酸酶活性特征的方法或通过测量底物量减少或通过测量来自酶反应的产物积聚，可用于测量肌醇六磷酸酶活性。特定的是，使用例如另外底物或其它反应物的类似方法也能测量所述肌醇六磷酸酶活性。

同源多核苷酸中存在的序列修饰可以是加入、缺失或取代天然或常规突变技术获得的核苷酸。已知这种同源多核苷酸编码具相等功能的蛋白质，多核苷酸天然存在于不同活种类的基因组中，甚至存在于不同种族、品种或菌株的基因组中。因此，本领域技术人员容易根据发明使用编码序列标识符SEQ ID NO：3所示肽序列的多核苷酸，用熟知的分子杂交技术分离这种同源多核苷酸(Sambrook等，1989，《分子克隆：实验室手册》(Molecular Cloning：A Laboratory Manual)，第2版，NolanC.编，New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press)。

分子杂交是在互补多核苷酸链间发生的配对反应，互补链的核苷酸序列间有一定程度同一性。因此使用编码序列标识符SEQ ID NO：3所示肌醇六磷酸酶的多核苷酸，杂交能在非它们获得自的活生物体基因组中鉴定与这些多核苷酸同源的多核苷酸，例如其它真菌，尤其是青霉菌的其它菌株如绳状青霉(P.funicolosum)IMI134756，编码的肌醇六磷酸酶具有与序列标识符SEQ ID NO：3所示肌醇六磷酸酶相等的性质。多核苷酸间序列同一性越高，所述多核苷酸间杂交的可能性越高且更容易，多核苷酸编码具相等性质蛋白质的可能性越高。用于使多核苷酸间杂交的方法广泛描述于文献中(Sambrook等，1989，《分子克隆：实验室手册》，第2版，Nolan C.编，New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press)且对于本领域技术人员是熟知的。例如，它们以筛选基因组或cDNA文库为基础，文库创建自活生物体或来自此生物体的组织。完成筛选所用的探针由已知多核苷酸或其片段组成，用于鉴定这些文库中与所述探针同源的多核苷酸，探针会和它杂交。根据发明，探针由多核苷酸或其片段组成，多核苷酸编码序列标识符SEQ ID NO：3所示肌醇六磷酸酶。为鉴定与探针杂交的多核苷酸，探针被标记，例如用放射性元素如³²P。本领域技术人员熟知的可商业购买的非放射性标记也能使用。

因此本发明也包括的多核苷酸能选择性地与一种编码序列标识符SEQ IDNO：3所示肌醇六磷酸酶的多核苷酸或其片段杂交。要理解的是如果这些多核苷酸编码的肌醇六磷酸酶相当于序列标识符SEQ ID NO：3所示，多核苷酸仅是本发明一部分。因此根据发明，表达“能选择性杂交的多核苷酸”指通过一种常规分子杂交方法(Sambrook等，1989，《分子克隆：实验室手册》，第2版，Nolan C.编，NewYork：Cold Spring Harbor Laboratory Press)与标记探针杂交的多核苷酸，探针由一种编码序列标识符SEQ ID NO：3所示肌醇六磷酸酶的多核苷酸或其片段组成，杂交水平高于所述探针与其它相对非同源多核苷酸的非特异杂交，如果多核苷酸探针获得自cDNA文库则特定为其它cDNAs。杂交水平通过标记探针产生的信号来测量。能选择性杂交的多核苷酸和探针间相互作用产生的信号水平一般是10倍，优选100倍，比探针与其它产生“背景嘈音”的多核苷酸间相互作用强。选择性杂交一般用正常杂交和冲洗条件获得(杂交所用缓冲液在约50-60℃含至少5×SSC和1％SDS，用0.1％SDS连续洗，SSC浓度从2×SSC逐步下降到0.4×SSC且温度从20℃上升到50℃)，优选严格或非常严格的杂交和冲洗条件。本领域技术人员能调节杂交条件，即本质上是用于杂交和冲洗步骤的温度和缓冲液盐浓度。这些条件应特定调节为所用探针长度和用此探针筛选的文库中所存在多核苷酸同一性程度的函数。需要调节杂交条件以最优化杂交的同源序列产生的信号，而同时最小化背景嘈音。

能与根据发明的多核苷酸选择性杂交的多核苷酸可分离自产生的基因组文库或cDNA文库，例如来自真菌菌株，尤其是青霉属菌株如绳状青霉IMI 134756菌株。分离这种多核苷酸可通过标准杂交技术完成(Sambrook等，1989，《分子克隆：实验室手册》，第2版，Nolan C.编，New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press)，使用的探针是编码序列标识符SEQ ID NO：3所示肌醇六磷酸酶的多核苷酸、这些多核苷酸片段或其互补多核苷酸。当多核苷酸通过这些技术分离时，需要确定其序列和鉴定此多核苷酸编码蛋白质的性质，特定用于证明此蛋白质相当于序列标识符SEQ ID NO：3所示的肌醇六磷酸酶。

因此上述杂交技术能分离的多核苷酸与编码序列标识符SEQ ID NO：3所示肌醇六磷酸酶的多核苷酸同源。这些多核苷酸和它们编码的肌醇六磷酸酶容易由生物技术领域技术人员鉴定，他们掌握标准分子生物技术。因此发明包括的多核苷酸与编码序列标识符SEQ ID NO：3所示肌醇六磷酸酶的多核苷酸同源。有利的是，同源多核苷酸相对编码序列标识符SEQ ID NO：3所示肌醇六磷酸酶的多核苷酸的同一性程度至少为45％，优选至少50％、至少70％、至少80％，更优选至少90％，优选至少95％。测量和鉴定序列间同一性程度的方法对于本领域技术人员是熟知的。可使用例如程序PILEUP、BLAST(尤其是Altschul等，1993，J.Mol.Evol.36：290-300；Altschul等，1990，J.Mol.Biol.215：403-10)或BestFit(Wisconsin序列分析包，Unix版本8，Genetics Computer Group，University Research Park，575 ScienceDrive，Madison，WI 5371l，用《应用数学》(Applied Mathematics)，1981，2号，482-489所述Smith和Waterman算法)。

这些同源多核苷酸也可通过常规突变技术人工获得。

编码序列标识符SEQ ID NO：3所示肌醇六磷酸酶的优选多核苷酸选自序列标识符SEQ ID NO：l和SEQ ID NO：2所示序列。

作为同源多核苷酸的例子，提到序列标识符SEQ ID NO：4所示多核苷酸。

根据发明的特定实施方案，上述编码肌醇六磷酸酶的多核苷酸来源自青霉属真菌。根据特定实施方案，它们源自青霉属CBS 109899菌株或来自绳状青霉IMI134756菌株。

根据发明的特定实施方案，依照发明的多核苷酸所编码的肌醇六磷酸酶具有下列性质：

(a)最适温度＝50℃

(b)最适pH＝4-5

(c)Km＝550μm

本发明也涉及上述多核苷酸片段。术语“片段”特定指至少20个核苷酸的片段，特定至少50个核苷酸，优选至少100个核苷酸。这些片段一般命名为寡核苷酸。它们可用作杂交探针以鉴定同源多核苷酸，或作为引物通过PCR(聚合酶链式反应)技术鉴定和扩增这些同源多核苷酸，PCR描述于Ausubel等，(1987)《分子生物的当前操作》(Current Protocols in Molecular Biology)，John Wiley&Sons编，6.3-6.4节。

术语“片段”也指根据发明的多核苷酸片段，它编码序列标识符SEQ ID NO：3所示肌醇六磷酸酶片段或与序列标识符SEQ ID NO：3所示肌醇六磷酸酶同源或相当的肌醇六磷酸酶片段。

本发明也涉及的多核苷酸包含至少一种上述多核苷酸。

所有上述多核苷酸编码序列标识符SEQ ID NO：3所示肌醇六磷酸酶或同源肌醇六磷酸酶或者这些肌醇六磷酸酶的活性片段。因此，发明延伸到所有这些多核苷酸编码的全部肌醇六磷酸酶。此定义因而包括序列标识符SEQ ID NO：3所示肌醇六磷酸酶、与此肌醇六磷酸酶同源的肌醇六磷酸酶和这些肌醇六磷酸酶的活性片段。

根据发明的优选实施方案，肌醇六磷酸酶是一种蛋白质，包括至少序列标识符SEQ ID NO：3所示肽序列。

因此发明也包括与序列标识符SEQ ID NO：3所示肌醇六磷酸酶同源的肌醇六磷酸酶。根据发明，术语“同源肌醇六磷酸酶”指肌醇六磷酸酶的序列相对序列标识符SEQ ID NO：3所示肌醇六磷酸酶有修饰。像同源多核苷酸，同源肌醇六磷酸酶的肽序列表现出一定程度同一性，同一性程度一般由相同氨基酸百分比表示。因此发明涵盖的肌醇六磷酸酶相对序列标识符SEQ ID NO：3所示肌醇六磷酸酶具有一个或多个序列修饰，其性质相当于序列标识符SEQ ID NO：3所示肌醇六磷酸酶的性质。这些修饰可以是加入、缺失或取代天然或常规突变技术获得的氨基酸。有利的是，同源肌醇六磷酸酶相对序列标识符SEQ ID NO：3所示肌醇六磷酸酶的同一性程度至少为35％，优选至少50％、至少70％、至少80％，更优选至少90％，优选至少95％。测量和鉴定序列间同一性程度的方法对于本领域技术人员是熟知的。可使用例如程序PILEUP、BLAST(尤其是Altschul等，1993，J.Mol.Evol.36：290-300；Altschul等，1990，J.Mol.Biol.215：403-10)或BestFit(Wisconsin序列分析包，Unix版本8，Genetics Computer Group，University Research Park，575 ScienceDrive，Madison，WI 53711，用《应用数学》，1981，2号，482-489所述Smith和Waterman算法)。

作为与序列标识符SEQ ID NO：3所示肌醇六磷酸酶同源的多核苷酸例子，提到序列标识符SEQ ID NO：4所示多核苷酸编码的肌醇六磷酸酶。

根据发明的特定实施方案，依照发明的肌醇六磷酸酶来源自青霉属真菌。

根据发明的特定实施方案，肌醇六磷酸酶具有下列性质：

(a)适温度＝50℃

(b)最适pH＝4-5

(c)Km＝550μm

发明也延伸到序列标识符SEQ ID NO：3所示肌醇六磷酸酶的片段和同源肌醇六磷酸酶的片段。术语“片段”本质上指生物活性片段，即片段具有的肌醇六磷酸酶活性相当于完全肌醇六磷酸酶，用实施例2所述测定或类似测定测量。

本发明也涉及的嵌合基因包括至少一个在宿主生物中有功能的启动子、根据发明编码肌醇六磷酸酶的多核苷酸、在相同宿主生物中有功能的终止元件，它们彼此功能相联。一般基因可包含的多种元件首选是调节转录、翻译和蛋白质成熟的元件，如启动子、编码信号肽或转运肽的序列、或构成聚腺苷酸信号的终止元件，其次是编码蛋白质的多核苷酸。表达“彼此功能相联”指所述嵌合基因的元件彼此相联从而这些元件中一个的功能受另一个影响。作为例子，当启动子能影响所述编码序列表达时，启动子与编码序列功能相联。根据发明的嵌合基因构建和其多种元件集合可用本领域技术人员熟知的技术完成，特定描述于Sambrook等(1989，《分子克隆：实验室手册》，第2版，Nolan C.编，New York：Cold Spring HarborLaboratory Press)。选择构成嵌合基因的调节元件本质上取决于它们在其中必须发挥功能的宿主生物，本领域技术人员能选择在特定宿主生物中有功能的调节元件。术语“有功能”指能在特定宿主生物中发挥功能。

嵌合基因根据发明可包含的启动子是组成型或可诱导的。作为例子，用于在细菌中表达的启动子可选择自下述启动子。为在大肠杆菌中表达，提到lac、trp、lpp、phoA、recA、araBAD、proU、cst-1、tetA、cadA、nar、tac、trc、lpp-lac、Psyn、cspA、PL、PL-9G-50、PR-PL、T7、λPL-PT7、T3-lac、T5-lac、T4基因32、nprM-lac、VHb和蛋白A启动子(Makrides，1996，《生物技术的当前观点》(Current Opinionsin Biotechnology 7：494-499)或其它P_trp启动子(WO 99/64607)。为在革兰氏阳性细菌如棒状杆菌或链霉菌中表达，提到P_tipA(Holmes等，1993，EMBO J.12：3183-3191)或PS1和PS2(FR91/09870)启动子或专利申请EP0629699A2所述启动子。为在酵母和真菌中表达，提到K.lactis P_LAC4启动子(Van den Berg等，1990，Bio/Technology8：135-139)或K.lactis P_pgk启动子(专利申请FR91/05294)、木霉菌(Trichoderma)tef1或cbh1启动子(WO 94/04673)、青霉菌his、csl或apf启动子(WO 00/68401)以及曲霉菌gla启动子(Gwynne等，1987，Bio/Technology 5：713-719)。

嵌合基因也包括编码信号肽或转运肽的亚细胞定位序列。这种序列位于编码肌醇六磷酸酶的多核苷酸上游或下游，能指导所述肌醇六磷酸酶特异进入宿主生物的细胞区室，或指导它分泌入胞外空间。例如，嵌合基因可包括编码信号肽或转运肽的序列，用于指导肌醇六磷酸酶趋向特定细胞质区室，如线粒体、体(plasts)、内质网或液泡。定位序列优选编码的信号肽使肌醇六磷酸酶定位到非原质体或胞外基质。

根据实施方案，转运肽可以是叶绿体、液泡或线粒体定位信号，信号随后在叶绿体、液泡或线粒体中裂解。这些肽广泛描述于文献中：Neuhaus和Rodgers，1998，Plant Molecular Biology 38：127-144；专利USP 5188642所述EPSPS转运肽；核酮糖-二羧化酶/氧化酶小亚基转运肽(EP 189707)。

根据另一个实施方案，转运肽可由信号肽组成，用于定位到细菌周质如pac(Schumacher等，1986，Nucl.Acids.Res.14：5713-5727)、ompA(Bowden和Georgiou，1990，J.Biol.Chem.265：16761-16766)和phoA(Chang等，1986，Gene 44：121-124)基因，或由细菌表面锚定肽组成，如PS1和PS2基因(FR91/09870)。

转运肽可以是单或双肽。双转运肽任选由中间序列分开。作为叶绿体转运肽的例子，提到的双转运肽在转录方向包括编码植物基因转运肽的序列，植物基因编码定位于质体的酶、来自植物基因成熟N-末端部分的序列部分，植物基因编码定位于质体的酶、以及编码植物基因第2个转运肽的序列，植物基因编码定位于质体的酶。例如，适当双叶绿体转运肽描述于专利申请EP 0 508 909。

根据实施方案，转运肽可包括多种元件，用于增加感兴趣蛋白质分泌到培养基的量。因此提到载体蛋白结合与感兴趣蛋白质融合的蛋白裂解位点(USP 6130063)。

根据发明，嵌合基因也包括其它调节序列，序列位于启动子和编码序列间，如转录活化子(增强子)。

本发明也涉及克隆、表达和/或转化载体，载体包括根据发明的嵌合基因。根据发明的载体用于转化的宿主生物和在此生物体中表达肌醇六磷酸酶。载体可以是质粒、粘粒、噬菌体或病毒。根据发明的转化载体优选是质粒。一般，此载体的主要性质应该是在宿主生物细胞中维持本身和自我复制的能力，特定通过存在复制起点以表达肌醇六磷酸酶。为稳定转化的宿主生物，载体也可整合到基因组。载体组成随后限制到在宿主中合成肌醇六磷酸酶所需的元件。选择这种载体以及根据发明将嵌合基因插入此载体的技术充分描述于Sambrook等(1989，《分子克隆：实验室手册》，第2版，Nolan C.编，New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press)且是本领域技术人员常识的一部分。有利的是，除了根据发明的嵌合基因，本发明所用载体也包含编码可选择标记的嵌合基因。此可选择标记能选择有效转化的宿主生物，即接纳载体的生物体。在能使用的可选择标记中，提到的标记含抗生素或杀真菌剂抗性的基因，例如潮霉素磷酸转移酶基因(Gritz等，1983，Gene25：179-188；Punt等，1987；Gene 56：117-24)、编码赋予腐草霉素抗性的多肽的链丝菌素乙酰转移酶、赋予苯菌灵抗性的突变β-微管蛋白(Gold等，1994，Gene142：225-30)或bialaphos乙酰转移酶(Avalos等，1989，Curr.Genet，16：369-72)。其它标记可以是与营养缺陷型互补的基因，如pyrA、pyrB、pyrG、pyr4(Buxton和Radford，1983，Mol.Gen.Genet.190：403-405)、arg4、arg B(Berse等，1983，Gene25：109-117)和trpC(Goosen等，1989，Mol.Gen.Genet.219：282-88)基因、molybdopterin合酶基因(Appleyard等，1998，J Biol Chem 273：14869-76；Unkles等，1999；J BiolChem 274：19286-93)或乙酰胺酶(Beri和Turner，1987，Curt Genet 11：639-41)。另一类可选择标记由耐受除草剂的基因组成，如bar基因(White等，NAR 18：1062，1990)用于bialaphos耐性、EPSPS基因(US 5,188,642)用于草甘膦耐性、HPPD基因(WO 96/38567)用于异唑耐性或草甘膦氧化还原酶基因(US5463175)。也提到的基因编码易鉴定酶如GUS酶，或者基因编码色素或调节转化细胞中色素生成的酶。这种可选择标记基因特定描述于专利申请WO 91/02071、WO 95/06128、WO96/38567和WO 97/04103。

本发明也涉及根据发明含至少一种嵌合基因的转化的宿主生物，嵌合基因整合到宿主基因组或在染色体外遗传元件上，如质粒。术语“宿主生物”指任何较低或较高的单细胞或多细胞生物体，其中导入根据发明的嵌合基因以制造依照发明的肌醇六磷酸酶。宿主生物优选微生物，尤其是真菌，例如青霉属、曲霉属、金孢霉菌属(Chrysosporium)或木霉菌属，细菌例如埃希氏菌属，尤其是大肠杆菌、棒状杆菌属、芽孢杆菌属或链霉菌属，酵母，尤其是酵母、克鲁维酵母(Kluyveromyces)或毕赤酵母属，杆状病毒或植物细胞。宿主生物也可以是植物或植物的一部分。

表达“转化的宿主生物”所指宿主生物将至少一个根据发明的嵌合基因掺入其基因组或在染色体外遗传元件中，例如质粒，从而在其组织或培养基中制造肌醇六磷酸酶。为获得根据发明的宿主生物，本领域技术人员可使用许多已知的转化方法。

这些方法之一是使待转化的宿主生物的细胞或组织接触聚乙二醇(PEG)和根据发明的载体(Chang和Cohen，1979，Mol.Gen.Genet.168(1)，111-115；Mercenier和Chassy，1988，Biochimie 70(4)，503-517)。电穿孔是另一种方法，使待转化的细胞或组织以及发明的载体接触电场(Andreason和Evans，1988，Aust.J.Biotechnol.3(1)，56-62)。另外一种方法是通过微注射将载体直接注入细胞或组织(Gordon和Ruddle，1985，Gene 33(2)，121-136)。有利的是，可使用“生物射弹(biolistic)”法。它用粒子轰击细胞或组织，粒子上吸收有发明的载体(Bruce等，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86(24)，9692-9696；Klein等，1992，Biotechnology10(3)，286-291；美国专利号4,945,050)。

一些转化细菌的方法描述于大肠杆菌和其它革兰氏阴性细菌的文献中(Ausubel等，1995，《分子生物的当前操作》，John Wiley和Sons，New York；Inoue等，1990，Gene 96：23-28；Chung等，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：2172-2175)。也可使用接合(Cameron等，1989，J.Bacteriol.，171：547-557)。对于革兰氏阳性细菌，可使用电穿孔以及原生质体转化，特定用于链霉菌属细菌(Bonamy等，1990，FEMSMicrobio.Lett 66：263-270；Hopwood等，1985，《链霉菌的遗传操作：实验室手册》(Genetic Manipulation of Streptomyces：A Laboratory Manual)，John Innes Foundation，Norwich)。

一些转化真菌的方法也描述于文献中(Talbot，2001，《丝状真菌的分子和细胞生物》(Molecular and cellular biology of filamentous fungi)，Oxford University Press，New York)。用PEG转化原生质体描述于EP 0260762，它用于曲霉菌，适于绳状青霉的此方法描述于WO 00/36120。同样已知的转化是通过调节整合的限制性酶或REMI(Sanchez等，1998，Mol.Gen.Genet.258：89-94)，也已知用农杆菌(Agrobacterium)属细菌的原生质体转化(de Groot等，1998，Nature Biotechnology16：839-842)。转化酵母的技术也描述于文献中，尤其是Ausubel等(1995，《分子生物的当前操作》，John Wiley和Sons，New York)和Van den Berg等(1990，Bio/Technolgy 8：135-139)。

在特定情况中，当待转化的宿主生物是植物来源时，植物细胞或组织优选用农杆菌属细菌转化，优选用根瘤农杆菌(A.tumefaciens)(Knopf，1979，Subcell.Biochem.6，143-173；Shaw等，1983，Gene 23(3)：315-330)或毛根农杆菌(A.rhizogenes)(Bevan和Chilton，1982，Annu.Rev.Genet.16：357-384；Tepfer和Casse-Delbart，1987，Microbiol.Sci.4(1)，24-28)感染所述植物的细胞或组织。优选的是，用农杆菌转化植物细胞或组织是根据Ishida等(1996，Nat.Biotechnol.14(6)，745-750)所述操作完成。本领域技术人员会选择适当方法，这取决于待转化的宿主生物性质。

本发明也涉及制造具肌醇六磷酸酶活性的提取物的方法。根据发明的一个实施方案，此方法包括步骤：

(a)在可表达所述肌醇六磷酸酶的条件下培养一种生物体，所述生物体基因组中天然具有根据发明的多核苷酸

(b)浓缩步骤(a)中培养的生物体

(c)破裂步骤(b)中分离的生物体细胞

(d)离心步骤(c)中获得的破裂细胞提取物

(e)回收从步骤(d)获得的具肌醇六磷酸酶活性的上清。

步骤(c)可用本领域技术人员已知技术完成，如机械碾磨(通过压力差异、超声波作用、研碎)、酶裂解或渗压震扰，所述技术能单独或组合使用。

本方法也可用于制造根据发明的肌醇六磷酸酶，这是通过加入另一个纯化的步骤(f)。用于制造根据发明的肌醇六磷酸酶的步骤(f)方法是从步骤(e)回收的上清中纯化肌醇六磷酸酶。纯化肌醇六磷酸酶可通过任何浓缩或分离蛋白质的技术完成，尤其是本领域技术人员熟知的微滤、超滤、电泳或层析技术。为获得纯化肌醇六磷酸酶，本领域技术人员能使用上述方法测量肌醇六磷酸酶活性以鉴定含所述肌醇六磷酸酶的纯化部分。根据此方法，制造的肌醇六磷酸酶可具有的纯度优选为50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或有利的100％。

根据依照发明的方法的另一个实施方案，尤其是当根据发明的肌醇六磷酸酶分泌到培养基时，所述方法包括以下步骤：

(a)在可表达所述肌醇六磷酸酶的条件下培养一种生物体，所述生物体具有根据发明的多核苷酸

(b)通过去除所述生物体来回收培养基。

表达“基因组中天然具有根据发明的多核苷酸的生物体”指任何生物体，其基因组在天然状态具有编码序列标识符SEQ ID NO：3所示肌醇六磷酸酶的多核苷酸或同源多核苷酸。

根据上述方法的另一个实施方案，所述生物体是微生物。根据一个特定实施方案，所述微生物是真菌，尤其是青霉属真菌，特别是青霉属CBS 109899菌株。

根据这些方法，生物体在适于产生肌醇六磷酸酶的培养基中培养，使用本领域技术人员熟知的技术。所述生物体尤其是微生物时，特别是真菌，可培养于Erlenmeyer摇瓶、实验室规模的发酵罐或工业规模的发酵罐(成批发酵、补料分批发酵或在固体培养基下发酵)。所用培养基应包含碳和氮源以及无机盐。在发明的特定实施方案中，使用青霉属CBS 109899菌株作为生物体，存在或缺乏肌醇六磷酸盐时获得肌醇六磷酸酶的表达(作为例子，肌醇六磷酸盐可以是Na⁺盐、Ca⁺⁺盐或Ca⁺⁺和Mg⁺⁺盐的组合)。pH可被控制(优选pH3或4)或不控制。

根据此方法，通过去除所述生物体来回收培养基的步骤可用任何分离液体部分中所含固体部分的方法完成。特定的是，过滤和离心是完成此步骤的适当方法。

本方法也可用于产生根据发明的肌醇六磷酸酶，这是通过加入另一个纯化的步骤(c)。用于产生根据发明的肌醇六磷酸酶的步骤(c)方法是从步骤(b)回收的上清中纯化肌醇六磷酸酶。纯化肌醇六磷酸酶可用任何浓缩或分离蛋白质的技术，尤其是本领域技术人员熟知的微滤、超滤、电泳或层析技术。为获得纯化肌醇六磷酸酶，本领域技术人员能使用上述方法测量肌醇六磷酸酶活性以鉴定含所述肌醇六磷酸酶的纯化部分。根据此方法，产生的肌醇六磷酸酶可具有的纯度优选为50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或有利的100％。

根据发明的另一个实施方案，制造具肌醇六磷酸酶活性的提取物的方法使用根据发明的宿主生物，包括步骤：

(a)培养根据发明的转化的宿主生物

(b)浓缩步骤(a)中培养的转化的宿主生物

(c)破裂步骤(b)中分离的生物体细胞

(d)离心步骤(c)中获得的破裂细胞提取物

(e)回收从步骤(d)获得的具肌醇六磷酸酶活性的上清。

步骤(c)可用本领域技术人员已知技术完成，如机械碾磨(通过压力差异、超声波作用、研碎)、酶裂解或渗压震扰，所述技术能单独或组合使用。

本方法也可用于产生根据发明的肌醇六磷酸酶，这是通过加入另一个纯化的步骤(f)。用于产生根据发明的肌醇六磷酸酶的步骤(f)方法是从步骤(e)回收的上清中纯化肌醇六磷酸酶。纯化肌醇六磷酸酶可通过任何浓缩或分离蛋白质的技术完成，尤其是本领域技术人员熟知的微滤、超滤、电泳或层析技术。为获得纯化肌醇六磷酸酶，本领域技术人员能使用上述方法测量肌醇六磷酸酶活性以鉴定含所述肌醇六磷酸酶的纯化部分。根据此方法，产生的肌醇六磷酸酶可具有的纯度优选为50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或有利的100％。

此方法所用转化的宿主生物优选是微生物。特定的是，所述微生物可以是真菌，例如青霉属、曲霉属、金孢霉菌属或木霉菌属，细菌例如埃希氏菌属，尤其是大肠杆菌、棒状杆菌属、芽孢杆菌属或链霉菌属，酵母，尤其是酵母、克鲁维酵母或毕赤酵母属，杆状病毒或植物细胞。

根据发明的另一个实施方案，尤其是当根据发明的肌醇六磷酸酶分泌到培养基时，此方法包括步骤：

(a)培养根据发明的转化的宿主生物。

(b)通过去除所述转化的宿主生物来回收培养基。

根据这些方法，生物体在适于产生肌醇六磷酸酶的培养基中培养，使用本领域技术人员熟知的技术。所述生物体尤其是微生物时，特别是真菌，可培养于Erlenmeyer摇瓶、实验室规模的发酵罐或工业规模的发酵罐(成批发酵、补料分批发酵或在固体培养基上发酵)。所用培养基应包含碳和氮源以及无机盐。

根据此方法，通过去除转化的宿主生物来回收培养基的步骤可用任何分离液体部分中所含固体部分的方法完成。特定的是，过滤和离心是完成此步骤的适当方法。

本方法也可用于产生根据发明的肌醇六磷酸酶，这是通过加入另一个纯化的步骤(c)。用于产生根据发明的肌醇六磷酸酶的步骤(c)方法是从步骤(b)回收的上清中纯化肌醇六磷酸酶。纯化肌醇六磷酸酶可用任何浓缩或分离蛋白质的技术，尤其是本领域技术人员熟知的微滤、超滤、电泳或层析技术。为获得纯化肌醇六磷酸酶，本领域技术人员能使用上述方法测量肌醇六磷酸酶活性以鉴定含所述肌醇六磷酸酶的纯化部分。根据此方法，产生的肌醇六磷酸酶可具有的纯度优选为50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或有利的100％。

本发明也涉及酶组合物，包括至少一种根据发明的肌醇六磷酸酶。

术语“酶组合物”所指组合物包含至少一种根据发明的肌醇六磷酸酶，肌醇六磷酸酶可以不同的比例，这取决于它是否结合促进其稳定性和保守性的不同佐剂。作为根据发明的酶组合物中所用佐剂例子，提到山梨糖醇、甘露醇、安息香酸盐、无机盐或植物油。根据发明的酶组合物可以是液体形式，所述组合物和它所含肌醇六磷酸酶随后在水溶液中或以固体形式，所述组合物和它所含肌醇六磷酸酶之后以粉末形式被冻干。

根据发明的一个特定实施方案，除了根据发明的肌醇六磷酸酶，酶组合物包含至少一种另外的酶。此另外的酶可具有肌醇六磷酸酶活性或除了肌醇六磷酸酶活性的活性。当此另外的酶具有肌醇六磷酸酶活性时，所述肌醇六磷酸酶活性优选与根据发明的肌醇六磷酸酶活性不同且互补。当此另外的酶具有除了肌醇六磷酸酶活性的活性时，它可例如具有木聚糖酶、纤维素酶、β-葡聚糖酶、昆布多糖酶、阿魏酸酯酶、支链淀粉酶、蛋白酶、酰胺酶、磷酸酶或甘露聚糖酶活性。

优选的是，所述酶组合物要掺入家畜动物的饲料中，尤其是单胃动物，优选猪或家禽。

本发明也涉及的饲料组合物包含至少一种根据发明的肌醇六磷酸酶。

术语“饲料组合物”本质上指用于家畜动物的饲料，尤其是单胃动物，优选猪或家禽。根据发明的饲料组合物是用于家畜动物的理想饲料，添加有根据发明的酶组合物。因此根据发明的饲料组合物是家畜动物的饲料，加入至少一种根据发明的酶组合物，混合所述饲料和所述酶组合物以获得所述饲料组合物。

根据发明的一个特定实施方案，所述饲料组合物包含至少一种根据发明的转化的宿主生物。根据发明的另一个特定实施方案，所述饲料组合物包含至少一种具有根据发明的多核苷酸的生物体，尤其是至少一种青霉属的一种真菌，特别是青霉属CBS 109899菌株的真菌。

有利的是，根据发明的饲料组合物用于单胃动物营养物。根据发明的一个特定实施方案，所述饲料组合物用于猪营养物。根据发明的另一个特定实施方案，所述饲料组合物用于家禽营养物。

本发明的一个主题也是产生上述饲料组合物的方法。

根据发明的一个特定实施方案，所述方法包括培养根据发明的宿主生物或具有根据发明的多核苷酸的生物体，尤其是真菌，更确切是青霉属真菌，特别是青霉属CBS 109899菌株，用任何本领域技术人员已知浓缩方法来浓缩所述生物体，尤其是过滤或离心，随后将所述浓缩的生物体掺入饲料组合物。

根据发明的另一个特定实施方案，所述方法包括制造具肌醇六磷酸酶活性的提取物或根据发明的肌醇六磷酸酶，通过上述产生所述提取物或所述肌醇六磷酸酶的方法之一，随后将生成的所述提取物或所述肌醇六磷酸酶掺入饲料组合物。

本发明也涉及的方法用于增加单胃动物吸收以植物为基础饲料的肌醇六磷酸中所含无机磷酸盐，其中肌醇六磷酸酶或根据发明的酶组合物掺入所述动物营养物中。在所述方法中，所述单胃动物优选用根据发明的饲料组合物喂养。

本发明也涉及的方法用于减少单胃动物营养物中磷的加入，其中所述动物用根据发明的饲料组合物喂养。

本发明也涉及的方法用于减少来自单胃动物营养物的磷释放，其中所述动物用根据发明的饲料组合物喂养。

本发明也涉及青霉属的丝状真菌，保藏号CBS 109899。

下面的例子能阐述本发明，然而不限制其范围。

实施例1：青霉属CBS 109899菌株的特征和培养

1.1特征

在PDA琼脂培养基上(24g/l马铃薯右旋糖肉汤，16g/l琼脂-琼脂)，CBS 109899菌株的菌丝体在30℃生长，老化时颜色变黄。在柱外围观察到气生菌丝体，没有青霉菌的结构特征。真菌在28℃培养于MN-Uri液体培养基后(P.J.Punt和C.A.M.J.J.van den Hondel，(1992)《酶学中的方法》(Methods in Enzymology)216，447-457)，振荡2天，菌丝体通过过滤和在液氮中碾磨来回收。基因组DNA提取通过本领域技术员人员熟知的酚-氯仿方法完成，1g碾磨物质在5ml裂解缓冲液中(1％SDS、2％Triton X-100、100mM NaCl、lmM EDTA、10mM Tris，pH8.0)。纯化后，基因组DNA通过加入2体积乙醇来沉淀。用高保真聚合酶和引物PN3(SEQ ID NO：5)及PN4(SEQ ID NO：6)进行PCR扩增，能获得1175bp片段，此片段被测序(SEQ IDNO：7)。

PN3：5’-CCGTTGGTAACCAGCGGAGGGATC-3’

PN4：5’-CCTTGGTCCGTGTTTCAAGACGGG-3’

将此内部转录间隔序列与数据库中可用的ITS序列排列显示与鉴定为青霉菌aculeatum的ITS序列有96％的同一性且与绳状青霉IMI 134756的ITS序列有96％的同一性。因此CBS 109899菌株被命名为青霉属。

1.2培养条件

确定培养CBS 109899菌株的合成培养基。它包括软化水中的10g/l葡萄糖、0.1M NH₄NO₃、1.5g/l KH₂PO₄、0.5g/l KCl、0.5g/l MgSO₄、10mg/l MnCl₂、10mg/lZnSO₄和10mg/l FeSO₄。为表达肌醇六磷酸酶，取自PDA培养基上生长集落的1cm²菌丝体样品在30ml MSP3培养基(10g/l葡萄糖、NaNO₃、20g/l肌醇六磷酸钙、0.5g/l KCl、0.5g/l MgSO₄、2.2mg/l ZnSO₄、1.1mg/l H₃BO₃、0.5mg/l MnCl₂、0.5mg/lFeSO₄、0.17mg/l CaCl₂、0.16mg/l CuSO₄、0.15mg/l Na₂MoO₄和5mg/l Na₂EDTA)中30℃振荡培养7天。培养物以5000rpm离心10分钟且上清如实施例2所述分析。

实施例2：测量肌醇六磷酸酶活性

测量肌醇六磷酸酶活性以Shimizu方法为基础(1992，Biosci.Biotech.Biochem.56(8)，1266-1269)。此方法的原理包括在肌醇六磷酸酶与其底物的酶反应中测量释放的无机磷酸盐量(肌醇六磷酸钠溶液在250nM醋酸缓冲液中以10g/l制备，缓冲液含1mM CaCl₂，pH5.5)。释放的无机磷酸盐量通过此磷酸盐与显色试剂反应来测量(1体积10.8％的硫酸铁与4体积在0.012M H₂SO₄的钼酸铵当场混合)。此反应在高酸性介质中导致有色磷钼酸盐复合体的形成(在Fe²⁺存在时)，通过在分光光度计上测量产生的有色溶液在700nm的吸光率来定量所形成复合体的量。

三种反应平行进行以在37℃产生10、20和30分钟的酶动力学。酶反应通过加入2.5ml 20％三氯乙酸来终止。确定样品干扰通过加入20％三氯乙酸和随后的肌醇六磷酸到粗提取物，粗提取物可以稀释或不稀释。酶反应的空白用250mM醋酸缓冲液制备，缓冲液含1mM CaCl₂，pH5.5。反应终止后，释放的磷酸盐量通过加入相同体积有色试剂来显示[1体积FeSO₄·7H₂O+4体积钼酸铵溶液]。蓝色强度通过分光光度计在700nm测量。它涉及磷酸盐浓度，使用的KH₂PO₄范围在0和1mM间。酶活性用酶动力学进程中磷酸盐的出现速度来确定。

实施例3：分离含肌醇六磷酸酶活性的真菌提取物

CBS 109899菌株以锥形烧瓶规模培养，在3-200升的发酵罐中30℃ 6-8天。生成培养基包括10g/l葡萄糖、40g/l淀粉、25g/l米糠、20g/l Ca²⁺肌醇六磷酸、15g/l氯化铵、0.5g/l硫酸铵和0.9g/l防沫剂。pH调节到5.5，但它在发酵中不受控制。4％的接种体用于起始发酵。此接种体对应于30℃ 3-4天的培养物，包括10g/l葡萄糖、10g/l蛋白胨、5g/l Na-CMC、0.5g/l硫酸镁、0.5g/l氯化钙、0.01g/lFeSO₄·7H₂O和0.01g/l MnSO₄·4H₂O。接种体直接用上面培养真菌的孢子或琼脂块(PDA培养基，30℃ 10天)接种。它也可自身用相同条件下制备的3-到4-天培养物接种。

发酵结束后，过滤全部的培养物且过滤物通过超滤经有机或无机膜浓缩，膜的截止为10kDa。活性在超滤滞留物样品上确定且涉及起始发酵体积。

表1：发酵结束后获得的活性作为发酵体积的函数

发酵罐体积	搅拌rpm	通风vvm	活性U/mL
				锥形烧瓶	220	-	45-63
3L	450	1	45
				30L	400	1	55-66

实施例4：根据发明的分离肌醇六磷酸酶的特征

确定所提供粗真菌提取物的最适pH和最适温度、对pH和温度的稳定性以及米氏常数，使用实施例2所述方法。

4.1米氏常数

Michaelis-Menten常数(Km_app)和最大反应速度(Vm_app)通过修改底物浓度和孵育时间来获得。确定真菌提取物中所含肌醇六磷酸酶的特征是通过550μM Km_app和1.425μmol Vm_app的每分钟和每mg样品所释放磷酸盐。

4.2肌醇六磷酸酶活性作为pH的函数

最适pH通过修改反应缓冲液的pH和/或性质(在pH 2：KCl-HCl缓冲液；在pH3：甘氨酸-HCl缓冲液；在pH 4、5、5.5和6：乙酸钠缓冲液；在pH 7：Tris-HCl缓冲液)。图1给出的结果显示关于所得最大酶活性计算的相对活性。在37℃测量时，真菌提取物中所含肌醇六磷酸酶的最适pH在pH4和pH5间。

4.3肌醇六磷酸酶活性作为温度的函数

最适温度通过修改酶反应的孵育时间来获得。图2给出的所得数据显示关于确定最大酶活性计算的相对活性。在pH5.5时，真菌提取物中所含肌醇六磷酸酶的最适温度在50℃区域。

4.4肌醇六磷酸酶的稳定性作为pH的函数

评估肌醇六磷酸酶活性对酸性pHs的抗性。提取物在41℃暴露于pH2和pH6.5间的pHs 0到180分钟后，溶液的pH通过稀释稳定在pH5.5。活性随后用实施例2所述方法确定。结果显示提取物的肌醇六磷酸酶活性在下降到pH3.5时相对稳定。然而，它在更酸的pHs中迅速变性，尤其是pH2。

4.5肌醇六磷酸酶的稳定性作为温度的函数

评估温度大于或等于60℃时肌醇六磷酸酶活性的稳定性。提取物的稀释溶液(终浓度1IU/ml)接受特定时间段(不超过30分钟)的测试温度。回到周围温度后，各热处理的溶液根据实施例1A中所述方法分析。60℃ 5分钟间，肌醇六磷酸酶活性降低约80％，直到它在80℃ 1分钟后成为零，所在条件用于完成实验。

实施例5：纯化根据发明的肌醇六磷酸酶

实施例3所得真菌酶提取物通过超滤用10kDa截止的膜来浓缩。提取物的离子强度和pH通过20mM甘氨酸缓冲液，pH3洗几次来调节。

阳离子交换层析通过将所得浓缩物应用至固定pH为3的SP10柱(PerSeptiveBiosystems)来完成。附着蛋白质用甘氨酸缓冲液中0到1M NaCl梯度以3ml/分钟的流速洗脱。肌醇六磷酸酶活性峰值在约30％的1M NaCl时获得。肌醇六磷酸酶与活性峰值的其它成分分离是通过HR200柱(Pharmacia)上的胶渗透，以0.7ml/分钟的流速在50mM乙酸钠缓冲液中，pH5.5。收集部分的纯度通过银染色非变性聚丙烯酰胺胶电泳来估计。胶上存在单条蛋白质带，估计分子量为130kDa。然而，纯化肌醇六磷酸酶进行SDS-PAGE电泳后，观察到2条多肽带，一条是相对迁移距离为70kDa的主带，另一条是相对迁移距离为90kDa的小带。

实施例6：纯化肌醇六磷酸酶的微量测序

6.1 N-末端序列的确定

与SDS-PAGE电泳所得70和90kDa多肽带相应的多肽在4℃转15小时到PVDF膜上(ProBlott，Applied Biosystems)。检测多肽通过酰胺黑10B(Sigma)染色并接受测序(Institut Pasteur，Laboratoire de Microsequencage de Proteines[Protein Micro-sequencing Laboratory]，Paris)。两条多肽带获得相同的N-末端序列(SEQ ID NO：8)。

此结果得出结论SDS-PAGE上鉴定的两条多肽带可能对应于相同多肽，迁移速度的差异可能产生自纯化步骤中多肽组分的部分降解。

6.2肌醇六磷酸酶内部片段氨基酸序列的确定

2个70和90kDa的多肽用SDS-PAGE电泳分离且通过酰胺黑染色检测。70kDa的多肽带从胶上切下且多肽用内溶素-C(Endolysine-C)在37℃原位消化18小时。肽片段用HPLC在C18 DEAE柱上分离。4个内部片段的序列通过微量测序获得(SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12)。

SEQ ID NO：8：IPTDPQVPQ/VYF

SEQ ID NO：9：TSGGDAVNEWTALYLQK

SEQ ID NO：10：AGGAPFLAQXNPIYXQPXYV

SEQ ID NO：11：LYDPASK

SEQ ID NO：12：APGLVR

实施例7：生成涉及青霉属CBS 109899菌株肌醇六磷酸酶的分子探针

微量测序后，寡核苷酸从肽中推断以通过PCR扩增DNA片段，此片段涉及编码青霉属CBS 109899菌株肌醇六磷酸酶的基因。

7.1 PCR引物设计

引物推断自内部序列SEQ ID NO：9的N-末端氨基酸序列。N-末端序列推出4组有义简并引物，内部序列SEQ ID NO：9推出1组反义简并引物。各组有义引物分别与反义引物组使用。

7.2扩增涉及肌醇六磷酸酶的基因组DNA

首先，青霉属CBS 109899培养于液体MN-Uri培养基中(28℃，180rpm，2天)。菌丝体通过过滤和液氮中碾磨来回收。基因组DNA提取在5ml裂解缓冲液中完成(1％SDS、2％Triton X-100、100mM NaCl、1mM EDTA、10mM Tris，pH8.0)且1g碾磨物质上有5ml酚。通过酚/氯仿和氯仿抽提纯化水相后，加入2体积乙醇来沉淀基因组DNA。

进行PCR反应，100ng基因组DNA用1单位Taq聚合酶(Q-BIOgene)且使用MJ Research热循环仪模型PTC-200。来自各PCR的反应产物在0.8％琼脂糖胶上分析。获得的核苷酸片段在850bp区域中且对应于引物对OT ACS 17 P4.4(SEQ IDNO：13)和OT ACS 25 P6.1(SEQ ID NO：14)，片段直接亚克隆到载体pCR4-TOPO(Invitrogen)并测序(SEQ ID NO：15)。

分析序列显示用于扩增的两个引物存在于扩增片段的任一侧，随后从它们推出的氨基酸序列与微量测序肌醇六磷酸酶所得的相一致。此外，内部肽片段SEQ IDNO：10和SEQ ID NO：11的氨基酸序列出现在从DNA片段推出的氨基酸序列中。这些发现得出结论，扩增的DNA片段对应于微量测序的肌醇六磷酸酶，它被命名为OT ACS 29.1。此DNA片段随后用作同源分子探针以克隆编码纯化肌醇六磷酸酶的基因。

OT ACS 17 P4.4(SEQ ID NO：13)  5’-ACNGAYCCNCARGTCCC

OT ACS 25 P6.1(SEQ ID NO：14)  5’-GCNGTCCAYTCRTTNAC

实施例8：克隆编码青霉属CBS 109899肌醇六磷酸酶的基因和确定特征

8.1确定涉及肌醇六磷酸酶的cDNA序列

根据5’和3’RACE-PCR技术通过扩增、亚克隆和测序其5’和3’末端来获得cDNA的完整序列。

首先，青霉属CBS 109899在诱导肌醇六磷酸酶表达的条件下培养，培养基包括40g/l淀粉面粉、25g/l米糠、20g/l肌醇六磷酸钙、10g/l葡萄糖、15g/l NH₄Cl和0.5g/l MgSO₄·7H₂O，pH5.5，添加0.06g/l葡糖淀粉酶AMG 300 L(Novozymes)和0.18g/lα淀粉酶Termamyl 120 L(Novozymes)。培养继续直到获得10U/ml培养基的肌醇六磷酸酶活性。回收菌丝体是通过经滤纸(Whatman)过滤培养物，随后在液氮中碾磨。总RNA提取自碾磨物质，通过50mM乙酸钠缓冲液，pH5.3中的酚抽提，缓冲液含10mM EDTA。随后mRNAs用GeneRacer试剂盒(Invitrogen)反转录。合成的cDNAs在它们的5’和3’末端有特定核苷酸序列，用于之后的PCR扩增。为特异扩增感兴趣cDNA末端，2个引物推断自涉及肽序列SEQ ID NO：10的区域中的分子探针，一个引物趋向5’末端，名为OT ACS 37 P1(SEQ ID NO：20)，另一个趋向3’末端，名为OT ACS 37 P3(SEQ ID NO：21)。

进行PCR反应，1μl cDNA合成产物用1单位Taq聚合酶(Q-BIOgene)，使用MJ Research热循环仪模型PTC-200。PCR扩增产物在0.8％琼脂糖胶上分析。涉及5’末端的0.3kb区域中的片段和另一个涉及3’末端的1.7kb区域中的片段直接亚克隆到载体pCR4-TOPO(Invitrogen)，随后测序。然后重构完整cDNA序列(SEQ IDNO：2)。

OT ACS 37 P1(SEQ ID NO：20)  5’-GGCGCTCCGTTCCTTGCGCAAAC-3’

OT ACS 37 P3(SEQ ID NO：21)  5’-GTAGGTCGGCTGGGAATAGATCG-3’

8.2亚克隆含基因的EcoRV基因组DNA片段

基因组DNA片段用基因组步移技术克隆。首先，连接物连到EcoRV限制性片段末端。为此，青霉属CBS 109899基因组DNA的EcoRV消化产物用50mMTris-HCl缓冲液，pH7.5中的T4 DNA连接酶连入GenomeWalker连接物(CLONTECH Laboratory，Inc)，缓冲液含10mM MgCl₂、10mM二硫苏糖醇、1mMATP和0.25μg/ml牛血清白蛋白，16℃作用15小时。反应通过70℃的热处理终止且反应混合物吸收在200μl的超纯水中。

为通过PCR扩增EcoRV限制性片段的5’和3’末端，两个有义引物从分子探针推出，一个引物趋向5’末端，名为OT ACS 32 P5(SEQ ID NO：16)，另一个趋向3’末端，名为OT ACS 32 P3(SEQ ID NO：17)。名为连接引物(CLONTECH Laboratory，Inc)的反义引物用于PCR反应，对应于连接物的5’末端序列。

进行PCR反应，1μl连接产物用1单位优势基因组聚合酶混合物(CLONTECHLaboratory，Inc)，使用MJ Research热循环仪模型PTC-200。来自各PCR的反应产物在0.8％琼脂糖胶上分析。

两个片段，一个在涉及5’末端的1.8kb区域中且另一个在涉及3’末端的1.3kb区域中，片段被亚克隆并通过测序分析。一旦有EcoRV片段的5’和3’核苷酸序列，设计特异于末端的引物并命名为OT ACS 38 P1(SEQ ID NO：18)和OT ACS 38P2(SEQ ID NO：19)。用高保真聚合酶扩增全部片段。进行PCR反应，100ng青霉属CBS 109899基因组DNA用1单位PLATINUM pfx DNA聚合酶(Life Technology，Inc.)，使用MJ Research热循环仪模型PTC-200。扩增产物在0.8％琼脂糖胶上分析。3.8kb片段直接亚克隆到载体pCR4-TOPO(Invitrogen)、测序(SEQ ID NO：1)并命名为OT ACS 38.1。

8.3分析cDNA和基因的序列

氨基酸序列推自cDNA并分析(SEQ ID NO：3)。微量测序所得肌醇六磷酸酶的所有内部肽序列在此氨基酸序列中发现，证明测序的cDNA对应于感兴趣的肌醇六磷酸酶。此外，推出的氨基酸序列包含结合(RHGXRXP)和亲核攻击(HD)磷酸盐的特异位点，这是属于组氨酸磷酸酶的肌醇六磷酸酶特征。cDNA序列与OT ACS38.1基因组DNA片段的排列能确定感兴趣基因的确切界限并定位它包含的内含子。

实施例9：同源序列搜索

9.1构建绳状青霉IMI 134756菌株的粘粒文库

绳状青霉IMI 134756培养于液体MN-Uri培养基中(28℃，180rpm，2天)。菌丝体通过过滤和液氮中碾磨来回收。基因组DNA提取在5ml裂解缓冲液中完成(1％SDS、2％Triton X-100、100mM NaCl、1mM EDTA、10mM Tris，pH8.0)且1g碾磨物质上有5ml酚。通过酚/氯仿和氯仿抽提纯化水相后，加入2体积乙醇来沉淀基因组DNA。

用SalI限制性酶部分消化的20μg基因组DNA产物上样到琼脂糖(低熔点)胶上以在0.5×TBE中进行脉冲电场电泳(18小时，5V/cm)。用溴化乙锭染色后，30到40kb长度的DNA片段通过β-琼脂糖酶(GIBCO-BRL)消化和乙醇沉淀从胶中释放。此基因组DNA的等分样品连入载体pMOCosX[Orbach(1994)，GENE 150，159-162页]，载体用XhoI消化并预先用小牛肠磷酸酶去磷酸化。连接产物与λ噬菌体元件接触(包装操作-STRATAGENE；Gigapack Gold-11)，能转染大肠杆菌菌株Q358(Maniatis等，1982)。在添加50μg/ml氨卡青霉素的Luria和Bertani(LB)琼脂培养基上平板培养后，集落吸入50个96孔微量滴定板中且在添加50μg/ml氨卡青霉素的150μl LB中过夜培养。在添加终浓度50％的甘油和-80℃保存前，培养物影印到Hybond N+膜(AMERSHAM)。

9.2筛选探针OT ACS 29.1的粘粒文库

对绳状青霉IMI 134756菌株基因组DNA的DNA印迹分析用探针OT ACS29.1进行。基因组DNA用一些限制性内切酶消化并预先通过电泳分离，基因组DNA转移的膜在杂交缓冲液(7％SDS；0.5M磷酸钠，pH7.0)中65℃预杂交10分钟。探针用α-³²P dCTP标记，使用DNA标记试剂盒(Amersham)。使用前，标记探针加入杂交缓冲液且混合物在100℃加热5分钟。杂交在65℃进行6小时。杂交后，膜在漂洗缓冲液(1％SDS；0.5M磷酸钠，pH7.0)中65℃洗3次15分钟，随后曝光。此分析仅显示一个信号。因此绳状青霉IMI基因组仅包含一个感兴趣基因的拷贝。然后粘粒文库在相同严格条件下用探针OT ACS 29.1筛选，在15、19和48号膜上显示一些信号。因此，涉及15号膜的粘粒15F10被鉴定为含与探针OT ACS 29.1杂交的DNA序列。在此粘粒的DNA上进行限制性分析以确定相应基因的位置。基因被命名为phyF。克隆和测序粘粒15F10的1.3kb NcoI片段显示与序列OT ACS 29.1的强同源性。完整phyF基因位于2.7kb EcoRV-EcoRI片段，此片段被克隆和测序(SEQ ID NO：4)。

序列分析指示790bp的启动子区域和在ATG 791编码phyF的序列起始。phyF基因有1536bp(位置791-2527)，包括两个35bp和61bp长度的推定内含子。

实施例10：OT ACS 38.1(SEQ ID NO：I)所含基因的重组表达

10.1将基因的多个拷贝导入绳状青霉IMI 134756

为确认克隆基因(OT ACS 38.1)，将多个拷贝导入产生少量肌醇六磷酸酶的绳状青霉IMI 134756菌株基因组中，以观察转化克隆是否表现出产率上升。

为此，根据专利WO 00/68401所述技术用含片段OT ACS 38.1的质粒和可用潮霉素选择的质粒pAN7-1(Punt等，1987；Gene，56：117-24)共转化绳状青霉IMI134756。转化后，整合感兴趣基因的多个拷贝通过Southern分析用分子探针OTACS 29.1验证。Southern分析根据实施例9所述条件进行，候选基因组DNA用EcoRI限制性内切酶消化。

阳性候选在诱导肌醇六磷酸酶表达的条件下培养于50ml培养基，培养基包括40g/[空斑]肌醇六磷酸钙、10g/l葡萄糖、8g/l NH₄NO₃、5g/l KCl和5g/lMgSO₄·7H₂O，添加1ml/l痕量元素溶液(2.2％ZnSO₄·7H₂O、1.1％H₃BO₃、0.5％MnCl₂·4H₂O、0.5％FeSO₄·7H₂O、0.17％CoCl₂·6H₂O、0.16％CuSO₄·5H₂O、0.15％Na₂MoO₄·2H₂O和5.0％Na₂EDTA，pH6.5)。随着时间测量培养基中肌醇六磷酸酶活性。

所得结果用于分析2个候选，非转化的绳状青霉IMI 134756用作对照，结果示于表2。

表2：监控2个候选培养物中的肌醇六磷酸酶活性(U/ml)，候选由用片段OT ACS38.1转化的绳状青霉IMI 134756和野生型绳状青霉IMI 134756组成

天数	D1	D2	D3	D4	D5	D6	D7	D8	D11	D12	D14
												IMI 134756	0	0	0	1.1	0.8	0.9	1.3	1.2	0.9	1.5	1.4
候选1	0	0	0	2	1.3	1.2	2.2	1.7	2.5	3.6	4.1
												候选2	0	0	0	2.2	1.8	1.4	1.4	1.3	2	2.6	3

监控培养基中肌醇六磷酸酶活性显示对于多拷贝OT ACS 38.1整合到其基因组的2个测试候选，肌醇六磷酸酶活性增加2-2.5倍。此结果趋向确认片段OT ACS38.1所含感兴趣基因编码肌醇六磷酸酶且青霉菌菌株的肌醇六磷酸酶活性可通过增加其基因组中该基因拷贝数来提高。

10.2：基因在异源启动子控制下的表达

专利WO 00/68401所述表达盒包含cs131启动子和终止子，用于表达编码感兴趣肌醇六磷酸酶的基因组DNA片段OT ACS 38.1区域。为此，在SwaI位点引入启动子末端后，表达盒用SwaI/SpeI限制性内切酶消化。基因组DNA片段OT ACS38.1中所含编码肌醇六磷酸酶的区域用下列引物扩增：

phyGoamp4  5’TAGATATCACGATGCTCAAGCTATATGTAGCTGC 3’(SEQ IDNO：22)

phyGoamp5  5’ATACTAGTTTAGGACGTAGCATTCTTCGGAATAG 3’(SEQID NO：23)

PCR反应用MJ Research热循环仪模型PTC-200进行，100pmol的各引物和1单位PLATINUM pfx DNA聚合酶(Life Technology，Inc.)在50μl涉及此聚合酶的缓冲液中(Life Technology，Inc.)。PCR产物用EcoRV和SpeI限制性内切酶消化并连入载体pBCMT。因此所得质粒命名为pCP。

根据专利WO 00/68401所述技术用含片段OT ACS 38.1的质粒和能用潮霉素选择的质粒pAN7-1(Punt等，1987；Gene，56：117-24)共转化绳状青霉IMI 134756。pCP盒整合到候选基因组通过Southern分析用分子探针OT ACS 29.1验证，8个候选的基因组DNA用EcoRI限制性内切酶消化。分析后，选择4个共转化子并在诱导cs131启动子的条件下培养。分析基因表达并测量肌醇六磷酸酶活性。

选择的4个候选在125ml锥形烧瓶中培养于添加1％玉米浆的50ml基本培养基。菌丝体在28℃，180rpm培养48小时和72小时后收集，用探针OT ACS 29.1对20μg总RNA进行各样品Northern分析(Sambrook等，1989，《分子克隆：实验室手册》)。冲洗膜后，信号用STORM磷成像仪(phosphoimager)(Molecular Dynamics)显现。

结果显示信号全在用pCP转化的候选中，非转化对照没有信号，证明该基因在csl31启动子控制下表达。

肌醇六磷酸酶活性在各培养物上清中平行测量。结果示于表3。

表3：在诱导cs131启动子条件下48和72小时测量4个pCP转化的候选培养物上清中肌醇六磷酸酶活性(U/ml)，绳状青霉IMI 134756用作对照。

	48小时	72小时
			对照	0	0
候选1	1	1.2
			候选2	0.8	1.7
候选3	0.7	1.2
			候选4	1.7	2.9

分析结果显示肌醇六磷酸酶活性仅在对应于pCP转化候选的上清中存在。此结果与基因表达一致且证明基因组DNA片段包含编码肌醇六磷酸酶的基因。

实施例11-最优化青霉属CBS 109899菌株的培养条件

11.1搅拌对肌醇六磷酸酶生成的影响

发酵在实施例3的条件下进行，搅拌速度范围从400到450rpm(表4)。

表4：发酵结束所得活性作为搅拌的函数

发酵罐体积	搅拌rpm	活性U/ml
			30L	400	66
30L	425	48
			30L	450	36

这些结果显示搅拌增加对天然青霉属CBS 109899菌株产生肌醇六磷酸酶有负作用。

11.2氮源对肌醇六磷酸酶生成的影响

发酵在实施例3的条件下进行。唯一改变的参数是氮源(米糠)，它由另一种氮源豆糠取代(表5)。

表5：发酵结束所得活性作为氮源的函数

氮源	活性(％)
		米糠	100％
豆糠	128％

这些结果显示氮源对天然青霉属CBS 109899菌株产生肌醇六磷酸酶有作用；特定的是，豆糠作为氮源促进肌醇六磷酸酶生成。

11.3肌醇六磷酸来源对肌醇六磷酸酶生成的影响

发酵在实施例3的条件下进行。唯一改变的参数是Ca⁺⁺肌醇六磷酸，它由Ca⁺⁺和Mg⁺⁺重盐取代(表6)。

表6：发酵结束所得活性作为肌醇六磷酸来源的函数

肌醇六磷酸盐	活性(％)
		Ca++盐	100％
Ca++和Mg++盐	120％

这些结果显示肌醇六磷酸来源对天然青霉属CBS 109899菌株产生肌醇六磷酸酶有作用；特定的是，钙和镁重盐作为肌醇六磷酸来源相较钙盐能改进肌醇六磷酸酶生成。

11.4肌醇六磷酸量对肌醇六磷酸酶生成的影响

发酵在实施例3的条件下进行。唯一改变的参数是发酵介质中存在的肌醇六磷酸量(表7)。

表7：发酵结束所得活性作为肌醇六磷酸量的函数

Ca++肌醇六磷酸g/L	活性(％)
		20	100％
15	700％
		10	60％
0	10％

这些结果显示发酵介质中存在肌醇六磷酸量时，天然青霉属CBS 109899菌株产生的肌醇六磷酸酶显著增加。

实施例12：青霉属CBS 109899菌株产生的肌醇六磷酸酶的畜牧学功效

12.1添加肌醇六磷酸酶的饮食对雄禽磷消化的作用

实验用20只雄禽进行。动物分成2组10只，一组处理动物和一组对照动物，随后在笼中单独饲养。然后它们用以玉米和大豆为基础的饲料喂养，饲料缺乏可消化的磷(P)，对于处理动物组，添加702IU(国际单位＝在37℃ pH5.5的10g/l肌醇六磷酸钠溶液每分钟能释放1μmol磷酸盐的肌醇六磷酸酶量)肌醇六磷酸酶每kg饲料。

动物排泄物在实验开始后2和3天收集以分析磷排泄。磷消化对应于动物吸收的磷相较摄入量的百分比。此百分比推断自排泄物中发现的排泄量(表8)。

表8：磷摄入、排泄和消化

磷
	摄入              排泄              消化(g/kg)            (g/kg)            (％)
基本饲料              0.804±0.003      0.319±0.019      60.3±2.5
	添加702IU/kg的饲料    0.801±0.011      0.255±0.028      68.1±4.4

表6结果显示缺乏可消化磷的基本饲料添加根据发明的肌醇六磷酸酶会显著减少(P＜0.05)磷排泄。此作用反映用添加饲料喂养的动物的磷消化增加。这显示根据发明的肌醇六磷酸酶对于释放食物摄入中不易消化的磷有效。

12.2添加肌醇六磷酸酶的饮食对小鸡生长的作用

实验用210只Ross 308种小鸡进行。动物分成6组35只，4组不同剂量肌醇六磷酸酶处理的动物、1组未处理的阴性对照动物和1组无机磷处理的阳性对照。动物以每笼5只动物的比例饲养，喂养13天(从9天大到22天大)。基本饲料由玉米和大豆组成，缺乏可消化的磷(P)，对于4组处理动物，添加4种不同浓度的肌醇六磷酸酶：243、433、738和1234IU肌醇六磷酸酶每kg饲料，对于阳性对照，用0.1％单钙或二钙磷酸盐形式的无机磷。

通过测量实验开始和结束时的动物体重估计生长。这些测量能确定体重增加和消耗指数(CI)。消耗指数对应于消耗饲料量相对体重增加。对于特定饲料量，指数减少表示动物重量增加，即动物更好的吸收饲料。结果示于表9。

表9：肌醇六磷酸酶对小鸡生长的作用

处理	阴性对照	243IU/kg	433IU/kg	738IU/kg	1234IU/kg	阳性对照
							重量增加(g)	216±76	369±88	435±82	452±97	497±81	461±72
CI	2.28±0.91	1.74±0.52	1.57±0.34	1.64±0.44	1.51±0.26	1.51±0.23

结果显示缺乏可消化磷的基本饲料添加243、433、738和1234IU/kg根据发明的肌醇六磷酸酶导致重量增加，分别提高1.7、2.0、2.1和2.3倍。甚至最高剂量能获得的重量增加大于用无机磷添加饲料。此添加也能使消耗指数平均增加33％。

12.3添加肌醇六磷酸酶的饮食对小鸡骨矿化的作用

实验用210只Ross 308种小鸡进行。动物分成6组35只，4组不同剂量肌醇六磷酸酶处理的动物、1组未处理的阴性对照动物和1组无机磷处理的阳性对照。动物以每笼5只动物的比例饲养，喂养13天(从9天大到22天大)。基本饲料由玉米和大豆组成，缺乏可消化的磷(P)，对于4组处理动物，添加4种不同浓度的肌醇六磷酸酶：243、433、738和1234IU肌醇六磷酸酶每kg饲料，对于阳性对照，用0.1％单钙或二钙磷酸盐形式的无机磷。

在14天，从各动物中取出胫骨。各胫骨被称重并焚化，分析它的灰烬、钙和磷含量。结果示于表10。

表10：肌醇六磷酸酶对小鸡骨矿化的作用

处理	阴性对照	243IU/kg	433IU/kg	738IU/kg	1234IU/kg	阳性对照
							胫骨磷(mg)	89.1	138.2	157.8	180.1	215.9	184.1
SD	±22.5	±21.4	±28.1	±41.2	±37.6	±14.8
							胫骨钙(mg)	43	66.7	76.8	87.8	103.6	89.7
SD	±9.6	±9.3	±13.6	±18.6	±19.3	±8.0
							胫骨灰烬(mg)	309	473	527	594	683	602
SD	±71	±54	±71	±102	±106	±42

这些结果清楚显示对于所有试验浓度，饲料添加根据发明的肌醇六磷酸酶对小鸡骨矿化有正作用。特定的是，根据发明的肌醇六磷酸酶促进骨的钙和磷矿化以及它们的灰烬质量。此外，对于各测量参数，观察到剂量作用。

12.4添加肌醇六磷酸酶的饮食对猪的磷和钙消化的作用

实验用7只平均质量约为70kg的猪进行。通过手术对动物进行回肠直肠(ileorectal)接合以能定量收集它们的回肠含量。它们被单独饲养用于实验需要。

动物用以玉米和大豆为基础的三种饲料喂养。添加300和600IU每kg饲料。各动物连续6天适应饲料。在第7天收集回肠含量，随后改变动物饲料。分析回肠含量中钙和磷的量，然后测量这两种元素的消化。结果示于表11。

表11：肌醇六磷酸酶对猪的钙和磷消化的作用

对照             300IU/kg        600IU/kg
	Ca消化(％)   42.73±7.40      45.26±2.49     47.09±8.14P消化(％)    39.46±11.86     43.06±9.11     47.52±15.23

饲料添加根据发明的肌醇六磷酸酶会显著增加钙和磷消化。对于每kg饲料添加300和600IU的饲料，钙消化分别增加5.6和9.3％，对于每kg饲料添加300和600IU的饲料，磷消化分别增加8.4和17％。

12.5添加肌醇六磷酸酶的饮食对猪磷消化的作用

实验用12只平均质量约为11kg的小猪进行。动物分成2组6只，1组处理动物和一组对照动物，随后在笼中单独饲养。然后它们用以玉米和大豆为基础的饲料喂养26天，饲料缺乏可消化的磷(P)，添加418IU肌醇六磷酸酶每kg饲料。

动物的排泄物从实验第21天收集5天，以分析它们的磷和钙含量。磷消化对应于动物吸收的磷和钙相较摄入量的百分比。此百分比推断自排泄物中发现的排泄量(表12)。

表12：肌醇六磷酸酶对猪磷消化的作用

               摄入(g)              排泄(g)             消化(％)

                                    磷

对照           1.007±0.127         0.800±0.078        20.11±5.79

418IU/kg       1.145±0.124         0.573±0.111        50.28±6.52

对照           1.873±0.237         1.228±0.180        34.2±7.73

418IU/kg       2.131±0.234         1.102±0.102        48.62±8.44

这些结果显示饲料添加根据发明的肌醇六磷酸酶使磷消化增加250％且钙消化增加42％。

12.6添加肌醇六磷酸酶的饮食对小猪生长的作用

实验用12只平均质量约为11kg的小猪进行。动物分成2组6只，1组处理动物和一组对照动物，随后在笼中单独饲养。然后它们用以玉米和大豆为基础的饲料喂养26天，饲料缺乏可消化的磷(P)，添加418IU肌醇六磷酸酶每kg饲料。

通过测量实验开始和结束时的动物体重估计生长。这些测量能确定体重增加和消耗指数(CI)。结果示于表13。

表13：肌醇六磷酸酶对小猪生长的作用

处理                   对照                  418IU/kg

起始体重(kg)           6.81±0.69            6.75±0.88

最终体重(kg)           13.34±1.58           14.86±1.41

体重增加(kg)           6.53±1.72            8.11±1.66

CI                     2.31±1.85            1.63±0.88

结果显示缺乏可消化磷的基本饲料添加418IU/kg根据发明的肌醇六磷酸酶导致重量增加24％。此添加也显著减少消耗指数。

12.7添加肌醇六磷酸酶的饮食对小猪骨矿化的作用

实验用12只平均质量约为11kg的小猪进行。动物分成2组6只，1组处理动物和一组对照动物，随后在笼中单独饲养。然后它们用以玉米和大豆为基础的饲料喂养26天，饲料缺乏可消化的磷(P)，添加418IU肌醇六磷酸酶每kg饲料。

在实验的第27天，从各动物中取出胫骨。各胫骨被称重并焚化，分析它的灰烬、钙和磷含量。结果示于表14。

表14：肌醇六磷酸酶对小猪骨矿化的作用

处理                  对照               418IU/kg

胫骨磷(％)            1.66±0.10         2.18±0.09

胫骨钙(％)            3.56±0.30         4.69±0.42

矿物(％)              10.45±0.69        13.12±0.55

结果显示缺乏可消化磷的基本饲料添加418IU/kg根据发明的肌醇六磷酸酶导致小猪骨矿化显著增加。特定的是，根据发明的肌醇六磷酸酶促进骨的钙和磷矿化以及它们的矿物质量。

                               序列表

<110>埃迪塞欧法国联合股份有限公司(Adisseo)

<120>新的肌醇六磷酸酶和制造这些新肌醇六磷酸酶的方法

<130>PM01046

<140>

<141>

<160>23

<170>PatentIn Ver.2.1

<210>1

<211>3753

<212>DNA

<213>青霉属CBS 109899

<220>

<221>内含子

<222>(1491)..(1550)

<220>

<221>内含子

<222>(1703)..(1764)

<400>1

ggctttgctg gtgcggggtg agtccgctgg ttggctcgct tctgctgttg cgatttcagc 60

gtcggcttgg gctatgatag ccgccagggt ggctgcgact cggtcatgga gctgtgcgag 120

agtctcacca cgtcgcggtg ggatcacaaa tggtttgtag agactttcag ggttttcggc 180

aaggcaagtt gagaaatgag ggtacagaac atttgccgaa acgggagcgg gaggttcaaa 240

tgtgatgcct ccgaaccatt cgctatgtta aagctgtcaa tcttcttttt cttaatcata 300

ccaatggatg actgccctac cctaatccat tttcgactct gacgttgaga tctgtcccag 360

cgtcaagatt tatctcggct gactgggatt tcttcgctaa ctgctccacg gttggctgga 420

ttgtctgcat gcatcgatag aacggactag aataaatccg aaatggtttt gggatgaagt 480

tagggctact aatatgcgat gcgagctcat gggattgttt gacaccgctt ggattcaagg 540

ttgggtctgc gccattgccg gttggtgtag gaaattctgg aatgtattct tgtttgtcga 600

aatcgatttc ccagttgtta cgattctagc caagaagatt aatacatcca gttctcaaat 660

aaagctcaag ggacatgctt actccatggc gaacgagata gattgtgtct agaggcatcg 720

cgtcgaaagg ccgtcttggg actcttggct gtattgatag atttgattga acagttgtaa 780

gttctcaatt tctctagcct ttatacttct agaggcaaac tctccatcaa agagtttgct 840

tcaataccta cacctggaat ccactttccg atagactgca atgcccacta taactagtgc 900

ccaactgtgg tccctaagtt ccatctaact tcttgagatc tctcttggac aaacttaaac 960

caaagcgagc cgacataatt gcctcatctg gctgatcaga taaagaataa aatcaacaga 1020

ggacaacgaa ttaaagcgcc ttgtttcaat caattttcag tacccgacca tgcaccttct 1080

tggaccagtt attgtcggca aatgtaaatg cttgggatag gcccaatgaa ctcactatga 1140

ggccccaaat catttctagc taccccagat tttcaaaagc cggggtagaa atatggtgct 1200

tgctatgttg tctattcggg caggaggtcg tgtgacagag agagttataa ataaccttgg 1260

aaccttggaa atcttcgtaa tgtatacttt gtaccggact ttcaaggttt catttaacat 1320

tcattgtcct ttggttcata ttctatacag aagaatcaga actgtatttc gattaccacg 1380

atgctcaagc tatatgtagc tgcctgtctg gtggtggccg gtgtttctat cccgacagac 1440

cctaccgtaa cccaagtccc ggattacttc caaacgagct atgggccata tgcaggtatg 1500

gaaatatgcg taccttgtca aaggctatta gggcrcaaca ggctacaggt gctaccaaag 1560

ccggaggcgc tccgttcctt gcgcaaacca atccgatcta ttcccagccg acctacgtcg 1620

caaacacgcc attggtgaca actcttccca tatctggtga accccatgac ggaaacatat 1680

tcggctggat ggggactttg aggtatgtat tatctttcgc tgaagtaccg ttagtacgga 1740

tgaaactgat cttagacaaa acagtcctta ccaacccagc cctgatggat ttggcgtgga 1800

tgaatatcct ctccctcccg gtgcaaacat tacgcaaatc catatggtgc atcgccatgg 1860

ctcgcgctat ccgacgtcaa attccgcaat cagcgattgg gctaagaaaa taatgcagta 1920

tcgatccaac ggcacagtgt tctcaggcga acttgagttt ctgaacgctt ggaactatca 1980

gctcggacag gcagagctaa cagcacgagg tcggcaagag ttattcgaca gcgggattct 2040

acattggttc aattatggaa agctctacga tcctgcatca aaaatcatag ctcgcacaac 2100

aacgatggtg aggatgttgc aatcagcgga gaacttcctc aatggatttt ttggtccaaa  2160

ctggactaat aatgcgacgc ttgaagtcat tattgaaagt accgggttca acaactccct  2220

cgcagggaat gatatgtgtc gcaacgcaaa aaatacatcg gggggcgacg cagtaaatga  2280

atggaccgcg ctatacttgc agaaagcgac aaatcgcttc agaagtgaaa tatctggaag  2340

tctgaactgg actgttgacg acacgtacaa tgcacagtcg atgtgcccat acgagactgt  2400

tgcacttggt tatagtccgt tttgtacatt gttttcttgg gaggaatggc aagggttcca  2460

gtatgttaac gacttgaacc tctatgggaa ctatggcatg ggttctccag ttggccgcgc  2520

cattggactt ggatttgtcg aagaattgat tgcacggctg caggggcaaa tcccaaaccc  2580

ccctgaagac tcaattgggt tcaatcaatc gctagatgat agtgccgcga ctttccctct  2640

caaccaaaca atctacttcg actttagcca cgacaacgag atgttctcga tgttgactgc  2700

cctgggcttg acacagtttg gggactacct ctctcccacg aagccctctg cggatcgttc  2760

gttgattgga agccatatcg tcccgttctc ggctaccttt gtatttgaga tcatcaaagc  2820

acctggtctt gtacgagaga atcgatcaaa gtattgcggt gaaagtgtgt atgaaaatac  2880

gagcgaagaa acaacctaca tacatctcgt cattaaccag aggactgttc ctcttggtca  2940

aagcatttca gcatgcgggc aacgagatga tggttggtgt gaaatttccg ccttcattca  3000

ggcgcagaaa gaaaacatcg tgaaggcaaa ttacgaggaa agctgtttcg gaaattggag  3060

catcccggcg tacggcgaga tcagggatgg cgctattccg aagaatgcta cgtcctaact  3120

gctatattag acgccctcga aagtttagat tggagatact cggacaaact cgcttcattc  3180

aatagctaga agggcaacta tgttcgtttc acttacttcg ataccagata cacgtagtat  3240

gatgcaagta ttccgagttc tcacatgaat attcgggcta agtctgctga aagacatcct  3300

gattaaatct agttgtcagt tgccggtgcc accgataact gacagctaca gcgagtatat  3360

tggtgttatg tatataatta actaactact gttaaggcgt gtgagtaatc gatacataaa  3420

tctctcatag gtcaaccgtg gcaagagtta tcaactacct agatctatca cttctgtctc  3480

acgaagagga ggaggaggag accatgcttt tccgcagcac tataaaatac attttcggtt  3540

atatataagt tgctgaccga cgtcggtgtc gtttccctcg aaatctgcat tttctaaatt  3600

ttccatggcc aactaggagg ctgggatttc atcaaagcac gggaaaggct tttgtcaact  3660

atatcctgtt attagtatat ccgtaagagt tagggttagt gaggccacga tgtttctggg  3720

gtcaagttac aaacaaagtt acgaacccgc agg                               3753

<210>2

<211>1761

<212>DNA

<213>青霉属CBS 109899

<220>

<221>CDS

<222>(89)..(1711)

<400>2

accggacttt caaggtttca tttaacattc attgtccttt ggttcatatt ctatacagaa  60

gaatcagaac tgtatttcga ttaccacg atg ctc aag cta tat gta gct gcc     112

                               Met Leu Lys Let Tyr Val Ala Ala

                                 1               5

tgt ctg gtg gtg gcc ggt gtt tct atc ccg aca gac cct acc gta acc    160

cys Leu Val Val Ala Gly Val Ser Ile Pro Thr Asp Pro Thr Val Thr

     10                  15                  20

caa gtc ccg gat tac ttc caa acg agc tat ggg cca tat gca ggt gct    208

Gln Val Pro Asp Tyr Phe Gln Thr Ser Tyr Gly Pro Tyr Ala Gly Ala

 25                  30                  35                  40

acc aaa gcc gga ggc gct ccg ttc ctt gcg caa acc aat ccg atc tat    256

Thr Lys Ala Gly Gly Ala Pro Phe Leu Ala Gln Thr Asn Pro Ile Tyr

                 45                  50                  55

tcc cag ccg acc tac gtc gca aac acg cca ttg gtg aca act ctt ccc    304

Ser Gln Pro Thr Tyr Val Ala Asn Thr Pro Leu Val Thr Thr Leu Pro

             60                  65                  70

ata tct ggt gaa ccc cat gac gga aac ata ttc ggc tgg atg ggg act    352

Ile Ser Gly Glu Pro His Asp Gly Asn Ile Phe Gly Trp Met Gly Thr

         75                  80                  85

ttg agt cct tac caa ccc agc cct gat gga ttt ggc gtg gat gaa tat    400

Leu Ser Pro Tyr Gln Pro Ser Pro Asp Gly Phe Gly Va1 Asp Glu Tyr

     90                  95                 100

cct ctc cct ccc ggt gca aac att acg caa atc cat atg gtg cat cgc    448

Pro Leu Pro Pro Gly Ala Asn Ile Thr Gln Ile His Met Val His Arg

105                 110                 115                 120

cat ggc tcg cgc tat ccg acg tca aat tcc gca atc agc gat tgg gct    496

His Gly Ser Arg Tyr Pro Thr Ser Asn Ser Ala Ile Ser Asp Trp Ala

                125                 130                 135

aag aaa ata atg cag tat cga tcc aac ggc aca gtg ttc tca ggc gaa    544

Lys Lys Ile Met Gln Tyr Arg Ser Asn Gly Thr Val Phe Ser Gly Glu

            140                 145                 150

ctt gag ttt ctg aac gct tgg aac tat cag ctc gga cag gca gag cta    592

Leu Glu Phe Leu Asn Ala Trp Asn Tyr Gln Leu Gly Gln Ala Glu Leu

        155                 160                 165

aca gca cga ggt cgg caa gag tta ttc gac agc ggg att cta cat tgg    640

Thr Ala Arg Gly Arg Gln Glu Leu Phe Asp Ser Gly Ile Leu His Trp

    170                 175                 180

ttc aat tat gga aag ctc tac gat cct gca tca aaa atc ata gct cgc    688

Phe Asn Tyr Gly Lys Leu Tyr Asp Pro Ala Ser Lys Ile tle Ala Arg

185                 190                 195                 200

aca aca acg atg gtg agg atg ttg caa tca gcg gag aac ttc ctc aat    736

Thr Thr Thr Met Val Arg Met Leu Gln Ser Ala Glu Asn Phe Leu Asn

                205                 210                 215

gga ttt ttt ggt cca aac tgg act aat aat gcg acg ctt gaa gtc att    784

Gly Phe Phe Gly Pro Asn Trp Thr Asn Asn Ala Thr Leu Glu Val Ile

            220                 225                 230

att gaa agt acc ggg ttc aac aac tcc ctc gca ggg aat gat atg tgt    832

Ile Glu Ser Thr Gly Phe Asn Asn Ser Leu Ala Gly Asn Asp Met Cys

        235                 240                 245

cgc aat gca aaa aat aca tcg ggg ggc gac gca gta aat gaa tgg acc    880

Arg Asn Ala Lys Asn Thr Ser Gly Gly Asp Ala Val Asn Glu Trp Thr

    250                 255                 260

gcg cta tac ttg cag aaa gcg aca aat cgc ttc aga agt gaa ata tct    928

Ala Leu Tyr Leu Gln Lys Ala Thr Asn Arg Phe Arg Ser Glu Ile Ser

265                 270                 275                 280

gga agt ctg aac tgg act gtt gac gac acg tac aat gca cag tcg atg    976

Gly Ser Leu Asn Trp Thr Val Asp Asp Thr Tyr Asn Ala Gln Ser Met

                285                 290                 295

tgc cca tac gag act gtt gca ctt ggt tat agt ccg ttt tgt aca ttg    1024

Cys Pro Tyr Glu Thr Val Ala Leu Gly Tyr Ser Pro Phe Cys Thr Leu

            300                 305                 310

ttt cct tgg gag gaa tgg caa ggg ttc cag tat gtt aac gac ttg aac    1072

Phe Ser Trp Glu Glu Trp Gln Gly Phe Gln Tyr Val Asn Asp Lou Asn

        315                 320                 325

ctc tat ggg aac tat ggc atg ggt tct cca gtt ggc cgc gcc att gga    1120

Leu Tyr Gly Asn Tyr Gly Met Gly Ser Pro Va1 Gly Arg Ala Ile Gly

    330                 335                 340

ctt gga ttt gtc gaa gaa ttg att gca cgg ctg cag ggg caa atc cca    1168

Leu Gly Phe Val Glu Glu Leu Ile Ala Arg Leu Gln Gly Gln Ile Pro

345                 350                 355                 360

aac ccc cct gaa gac tca att ggg ttc aat caa tcg cta gat gat agt    1216

Asn Pro Pro Glu Asp Ser Ile Gly Phe Asn Gln Ser Leu Asp Asp Ser

                365                 370                 375

gcc gcg act ttc cct ctc aac caa aca atc tac ttc gac ttt agc cac    1264

Ala Ala Thr Phe Pro Leu Asn Gln Thr Ile Tyr Phe Asp Phe Ser His

            380                 385                 390

gac aac gag atg ttc tcg atg ttg att gcc ctg ggc ttg aca cag ttt    1312

Asp Asn Glu Met Phe Ser Met Leu Thr Ala Leu Gly Leu Thr Gln Phe

        395                 400                 405

ggg gac tac ctc tct ccc acg aag ccc tct gcg gat cgt tcg ttg att    1360

Gly Asp Tyr Leu Ser Pro Thr Lys Pro Ser Ala Asp Arg Ser Leu Ile

    410                 415                 420

gga agc cat atc gtc ccg ttc tcg gct acc ttt gta ttt gag atc atc    1408

Gly Ser His Ile Val Pro Phe Ser Ala Thr Phe Val Phe Glu Ile Ile

425                 430                 435                 440

aaa gca cct ggt ctt gta cga gag aat cga tca aag tat tgc ggt gaa    1456

Lys Ala Pro Gly Leu Val Arg Glu Asn Arg Ser Lys Tyr Cys Gly Glu

                445                 450                 455

agt gtg tat gaa aat acg agc gaa gaa aca acc tac ata cat ctc gtc    1504

Ser Val Tyr Glu Asn Thr Ser Glu Glu Thr Thr Tyr Ile His Leu Val

            460                 465                 470

att aac cag agg act gtt cct ctt ggt caa agc att tca gca tgc ggg    1552

Ile Asn Gln Arg Thr Val Pro Leu Gly Gln Ser Ile Ser Ala Cys Gly

        475                 480                 485

caa cga gat gat ggt tgg tgt gaa att tcc gcc ttc att cag gcg cag    1600

Gln Arg Asp Asp Gly Trp Cys Glu Ile Ser Ala Phe Ile Gln Ala Gln

    490                 495                 500

aaa gaa aac atc gtg aag gca aat tac gag gaa agc tgt ttc gga aat    1648

Lys Glu Asn Ile Val Lys Ala Asn Tyr Glu Glu Ser Cys Phe Gly Asn

505                 510                 515                 520

tgg agc atc ccg gcg tac ggc gag atc agg gat ggc gct att ccg aag    1696

Trp Ser Ile Pro Ala Tyr Gly Glu Ile Arg Asp Gly Ala Ile Pro Lys

                525                 530                 535

aat gct acg tcc taa ctgctatatt agacgccctc gaaagcttag attggagata    1751

Asn Ala Thr Ser

            540

ctcggacaaa                                                         1761

<210>3

<211>540

<212>PRT

<213>青霉属CBS 109899

<400>3

Met Leu Lys Leu Tyr Val Ala Ala Cys Leu Val Val Ala Gly Val Ser

  1               5                  10                  15

Ile Pro Thr Asp Pro Thr Val Thr Gln Val Pro Asp Tyr Phe Gln Thr

             20                  25                  30

Ser Tyr Gly Pro Tyr Ala Gly Ala Thr Lys Ala Gly Gly Ala Pro Phe

         35                  40                  45

Leu Ala Gln Thr Asn Pro Ile Tyr Ser Gln Pro Thr Tyr Val Ala Asn

     50                  55                  60

Thr Pro Leu Val Thr Thr Leu Pro Ile Ser Gly Glu Pro His Asp Gly

 65                  70                  75                  80

Asn Ile Phe Gly Trp Met Gly Thr Leu Ser Pro Tyr Gln Pro Ser Pro

                 85                  90                  95

Asp Gly Phe Gly Val Asp Glu Tyr Pro Leu Pro Pro Gly Ala Asn Ile

            100                 105                 110

Thr Gln Ile His Met Va1 His Arg His Gly Ser Arg Tyr Pro Thr Ser

        115                 120                 125

Asn Ser Ala Ile Ser Asp Trp Ala Lys Lys Ile Met Gln Tyr Arg Ser

    130                 135                 140

Asn Gly Thr Val Phe Ser Gly Glu Leu Glu Phe Leu Asn Ala Trp Asn

145                 150                 155                 160

Tyr Gln Leu Gly Gln Ala Glu Leu Thr Ala Arg Gly Arg Gln Glu Leu

                165                 170                 175

Phe Asp Ser Gly Ile Leu His Trp Phe Asn Tyr Gly Lys Leu Tyr Asp

            180                 185                 190

Pro Ala Ser Lys Ile Ile Ala Arg Thr Thr Thr Met Val Arg Met Leu

        195                 200                 205

Gln Ser Ala Glu Asn Phe Leu Asn Gly Phe Phe Gly Pro Asn Trp Thr

    210                 215                 220

Asn Asn Ala Thr Leu Glu Val Ile Ile Glu Ser Thr Gly Phe Asn Asn

225                 230                 235                 240

Ser Leu Ala Gly Asn Asp Met Cys Arg Asn Ala Lys Asn Thr Ser Gly

                245                 250                 255

Gly Asp Ala Val Asn Glu Trp Thr Ala Leu Tyr Leu Gln Lys Ala Thr

            260                 265                 270

Asn Arg Phe Arg Ser Glu Ile Ser Gly Ser Leu Asn Trp Thr Val Asp

        275                 280                 285

Asp Thr Tyr Asn Ala Gln Ser Met Cys Pro Tyr Glu Thr Val Ala Leu

    290                 295                 300

Gly Tyr Ser Pro Phe Cys Thr Leu Phe Ser Trp Glu Glu Trp Gln Gly

305                 310                 315                 320

Phe Gln Tyr Val Asn Asp Leu Asn Leu Tyr Gly Asn Tyr Gly Met Gly

                325                 330                 335

Ser Pro Val Gly Arg Ala Ile Gly Leu Gly Phe Val Glu Glu Leu Ile

            340                 345                 350

Ala Arg Leu Gln Gly Gln Ile Pro Asn Pro Pro Glu Asp Ser Iie Gly

        355                 360                 365

Phe Asn Gln Ser Leu Asp Asp Ser Ala Ala Thr Phe Pro Leu Asn Gln

    370                 375                 380

Thr Ile Tyr Phe Asp Phe Ser His Asp Asn Glu Met Phe Ser Met Leu

385                 390                 395                 400

Thr Ala Leu Gly Leu Thr Gln Phe Gly Asp Tyr Leu Ser Pro Thr Lys

                405                 410                 415

Pro Ser Ala Asp Arg Ser Leu Ile Gly Ser His Ile Val Pro Phe Ser

            420                 425                 430

Ala Thr Phe Val Phe Glu Ile Ile Lys Ala Pro Gly Leu Val Arg Glu

        435                 440                 445

Asn Arg Ser Lys Tyr Cys Gly Glu Ser Val Tyr Glu Asn Thr Ser Glu

    450                 455                 460

Glu Thr Thr Tyr Ile His Leu Val Ile Asn Gln Arg Thr Val Pro Leu

465                 470                 475                 480

Gly Gln Ser Ile Ser Ala Cys Gly Gln Arg Asp Asp Gly Trp Cys Glu

                485                 490                 495

Ile Ser Ala Phe Ile Gln Ala Gln Lys Glu Asn Ile Val Lys Ala Asn

            500                 505                 5l0

Tyr Glu Glu Ser Cys Phe Gly Asn Trp Ser Ile Pro Ala Tyr Gly Glu

        515                 520                 525

Ile Arg Asp Gly Ala Ile Pro Lys Asn Ala Thr Ser

    530                 535                 540

<210>4

<211>2757

<212>DNA

<213>绳状青霉(Penicillium funiculosum)

<400>4

tgtattgttg tttgtcgaag tcgatttccc egttgttacg attctagcaa gaagattaat 60

acatgcagtt ctcaaacaaa gctcaaggga catgcttact ccatggcgaa caagatagat 120

ggtgtctaga ggcatcgcat cgaaaggccg tcttggctgt attgatagat ttgattgaac 180

agttgraagt tctcaatttt tctagccttt atacttctaa aggcaaactc tccatcaaaa 240

agtttgcttc gatacctaca cctggaatcc actttccgat agactgcaat gcccactatg 300

accagtgccc acttgcagtc gccaagtttc atttaacttc ctgagacctt ttttggataa 360

acctaaagca aagcgagccg acataattgc ctcatctgat aaagaatgaa atcaagttta 420

gccaacagcg gataaagcaa tatcgcgcct tggttcttaa taggcgttca gtacctgaca 480

atgcagcttc ttggaccagt tattatcggc aaatgtaaat gcttaggata ggcccaacga 540

actcactaat gaggtcccaa atcggaagtc tccagctacc ccagattgtc aaaagccggg 600

gtaggaatat ggcgctcgct atgttgtcta ttcgggcaga aagtcgtgtg acagagagag 660

ttataaataa ccttggaaag cttcgtaatg gacactttgt accggacttc caagattctg 720

ttaacattca ttgttcttct gttcatttga ttttatacaa aagaatcaac agtgtattct 780

cattagcatg atgctcaagc tatgtgtagc tgcctgtttg gtggtggccg gtgtttctat 840

cccgacagac cctacagtaa ctcaagtccc ggattacttc caaacaagct atgggccata 900

tgcaggtatg gtaatacgtg taacttgtca aagagtccca gggctcacag gctataggtg 960

ctactaaagc cggagacgct ccgttccttg cgcaaaccaa cccagtctat tcccagccga 1020

cctatgtcgc aaacacgcca ttggtgacta ctcttcccat atctggtgaa ccccatgacg 1080

ggaacatatt cggctggatg gggactttga ggtatgtatt ctcttgcgct gaagtgccgt 1140

tactacggat ggaactaatt tgatacaaaa cagtccttac cagcccagcc ctgatggatt 1200

tggcgtggat gaatatcctc tccctcccgg tgcaaacatt acgcaaatcc atatggtgca 1260

tcgccatggc tcgcgctatc cgacagcaaa ctccgccatt agcagttggg caaagaagat 1320

aatgcagtat cgatccaacg gcaccgtgtt ctcaggcgaa cttgattttc tgaacacttg 1380

gaactaccag cttggacagg cagagctaac agcacgaggt cggcaagagt tattcgatag 1440

cggtgttctg cattggttca attatggaaa gctctacgat cctgcgtcga aaatcattgc 1500

tcgtacgaca acgatggtgc ggatgttgca atcggctgag aacttcctca acgggttttt 1560

tggtccaaac tggaacaata atgcgacact tgaagttatt attgaaagta ccgggttcaa 1620

caactccctc gcagggaatg atatgtgtcc caatgcaaaa aatacatcag gaggcgatgc 1680

agtagatgaa tggacctcgc tatacttgca gaaagcgaca aatcgcttta gaagtgaaat 1740

atcaggaagc ctgaactgga ctgttgacga cacctacaat gcacaatcta tgtgcccata 1800

tgagacggtt gcccttggtt atagcccgtt ttgcacsttg ttttcttggg aggaatggca 1860

agggttccag tatgctaacg atttgaacct ccatgggaat tatggcatgg gatccccagt 1920

aggccgcgcc attgggcttg gattcgtcga agaattaatt gcaaggttgc aaggacaatt 1980

tccaacaccc cctgaagact caattgtttt caatcaatcg ctagatcaga gtgcggcaac 2040

cttccctctc aaccaaacta tctacttcga tttcagccac gacaacgaga tgttctccat 2100

gttaactgcc ctgggctcaa cacaatttgg ggactacctc tctcccacaa agccctctgc 2160

cgatcgttcg ttgattggaa gccatatcgt cccgttctcg gctacctttg tgtttgagat 2220

catcaaagca cctggccctg tacgagagga tcgatcaaag tattgcggtg aaagtgtgta 2280

tgaaaacact agcgaggaga caacctacat acatctcgtc attaaccaga ggactgttcc 2340

tcttggtcaa agcatttcag catgcggaca acgagatgat ggttggtgtg agattcccgc 2400

cttcattcag gcgcagaaag acaacattga gaaggcaaat tacgagcaaa gctgctttgg 2460

aaactggagt atcccggcgt acggccagat tagagatggc gctattccga agaatgccac 2520

ttcctaactg ctatattaga tgcccccgaa agtttagaca ggagatagta ctcgtcagga 2580

ggcccatatc tcagccagcc acagcactgc ggagcgatga agggttgaat atagcacacc 2640

gcggggtgct tgatcccaag tttgggaagc cggatttaga cattttaatt ctctgttagg 2700

tatatttatg ctacgtagct gatttttgtc caatcgacca atttcatctc cgatatc    2757

<210>5

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述

     寡核苷酸PN3

<400>5

ccgttggtaa ccagcggagg gatc                                        24

<210>6

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述

     寡核苷酸PN4

<400>6

ccttggtccg tgtttcaaga cggg                                        24

<210>7

<211>1175

<212>DNA

<213>青霉属CBS 109899

<400>7

ccgttggcaa ccagcggagg gatcattacc gagtgcgggc cctcgcggcc caacctccca 60

cccttgtctc tatacacctg ttgctttggc gggcccaccg gggccacctg gtcgccgggg 120

gacgcacgtc cccgggcccg cgcccgccga agcgcgctgt gaaccctgat gaagatgggc 180

tgtctgagta ctatgaaaat tgtcaaaact ttcaacaatg gatctcttgg ttccggcatc 240

gatgaagaac gcagcgaaat gcgataagta atgtgaattg cagaattccg tgaatcatcg 300

aatcttcgaa cgcacattgc gccccctggc attccggggg gcatgcctgt ccgagcgtca 360

tttctgccct caagcacggc tggtgtgttg ggtgtggtcc ccccggggac ctgcccgaaa 420

ggcagcggcg acgtccgtct ggtcctcgag cgtatggggc tctgtcactc gctcgggaag 480

gacctgcggg ggttggtcac caccacattt taccacggtt gacctcggat caggtaggag 540

ttacccgctg aacttaagca tatcaataag cggaggaaaa gaaaccaacc gggattgcct 600

cagtaacggc gagtgaagcg gcaagagctc aaatttgaaa tctggcccct ttggggtccg 660

agttgtaatt tgcagaggat gcttcgggtg cggtccccgt ctaagtgccc tggaacgggc 720

cgtcatagag ggtgagaatc ccgtctggga tgggcggccg cgcccgtgtg aagctccttc 780

gacgagtcga gctgtttggg aatgcagctc taagcgggtg gtaaatttca tctaaagcta 840

aatactggcc ggagaccgat agcgcacaag tagagtgatc gaaagatgaa aagcactttg 900

aaaagagagt caaacagcac gtgaaattgt tgaaagggaa gcgttgtcca ccagactcgc 960

ccgggggggt tcagccggca cgtgtgccgg tgtactcctc tccgggcggg ccagcatcgg 1020

tttgggcggc tggtgaaagg ccccgggaat gtaacaccct tcggggtgcc ttatagcccg 1080

gggtgccata cagccagcct ggaccgaggc ccgcgcttcg gcgaggatgc tggcgcaatg 1140

gtggtcaacg gcccgtcttg aaacacggac caagg                            1175

<210>8

<211>11

<212>PRT

<213>青霉属CBS 109899

<220>

<221>待定

<222>(9)

<223>Xaa＝Gln或Val

<400>8

Ile Pro Thr Asp Pro Gln Val Pro Xaa Tyr Phe

  1               5                  10

<210>9

<211>17

<212>PRT

<213>青霉属CBS 109899

<400>9

Thr Ser Gly Gly Asp Ala Val Asn Glu Trp Thr Ala Leu Tyr Leu Gln

  1               5                  10                  15

Lys

<210>10

<211>20

<212>PRT

<213>青霉属CBS 109899

<400>10

Ala Gly Gly Ala Pro Phe Let Ala Gln Xaa Asn Pro Ile Tyr Xaa Gln

  1               5                 10                  15

Pro Xaa Tyr Val

             20

<210>11

<211>7

<212>PRT

<213>青霉属CBS 109899

<400>11

Leu Tyr Asp Pro Ala Ser Lys

  1               5

<210>12

<211>6

<212>PRT

<213>青霉属CBS 109899

<400>12

Ala Pro Gly Leu Val Arg

  1               5

<210>13

<211>17

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述

     寡核苷酸OT ACS 17 P4.4

<400>13

acngayccnc argtccc                                                17

<210>14

<211>17

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述

     寡核苷酸OT ACS 25 P6.1

<400>14

gcngtccayt crttnac                                                17

<210>15

<211>846

<212>DNA

<213>青霉属CBS 109899

<400>15

acagatcccc aggtcccgga ttacttccaa acgagctatg ggccatatgc aggtatggaa 60

atatgcgtac cctgacaaag gctattaggg ctcaacaggc tacaggtgct accaaagccg 120

gaggcgctcc gttccttgcg caaaccaatc cgatctattc ccagccgacc tacgtcgcaa 180

acacgccatt ggtgacaact cttcccatat ctggtgaacc ccatgacgga aacatattcg 240

gctggatggg gactttgagg tatgtattat ctttcgctga agtaccgtta gtacggatga 300

aactgatctt agacaaaaca gtccttacca acccagccct gatggatttg gcgtggatga 360

atatcctctc cctcccggtg caaacattac gcaaatccat atggtgcatc gccatggctc 420

gcgctatccg acgtcaaatt ccgcaatcag cgattgggct aagaaaataa tgcagtatcg 480

atccaacggc acagtgttct caggcgaact tgagtttctg aacgcttgga actatcagct 540

cggacaggca gagccaacag cacgaggtcg gcaagagtta ttcgacagcg ggattctaca 600

ttggttcaat tatggaaagc tctacgatcc tgcatcaaaa atcatagctc gcacaacaac 660

gatggtgagg atgttgcaat cagcggagaa cttcctcaat ggattttttg gcccaaactg 720

gactaataat gcgacgcttg aagtcattat tgaaagtacc gggtttaaca actccctcgc 780

agggaatgat aagtgtcgca atgcaaaaaa tacatcgggg ggcgacgcag taaatgaatg 840

gaccgc                                                            846

<210>16

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述

     寡核苷酸OT ACS 32 P5

<400>16

ccatcagggc tgggttggta aggactg                                     27

<210>17

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述

     寡核苷酸OT ACS 32 P5

<400>17

ctggactaat aatgcgacgc ttgaagtc                                    28

<210>18

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述

     寡核苷酸OT ACS 38 P1

<400>18

ggctttgctg gtgcggggtg agtc                                        24

<210>19

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述

     寡核苷酸OT ACS 38 P2

<400>19

cctgcgggt cgtaactttg tttgtaactt gac                               33

<210>20

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述

     寡核苷酸OT ACS 37 P1

<400>20

ggcgctccgt tccttgcgca aac                                         23

<210>21

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述

     寡核苷酸OT ACS 37 P3

<400>21

gtaggtcggc tgggaataga tcg                                         23

<210>22

<211>34

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述

     寡核苷酸phyGoamp4

<400>22

tagatatcac gatgctcaag ctatatgtag ctgc                             34

<210>23

<211>34

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述

     寡核苷酸phyGoamp5

<400>23

atactagttt aggacgtagc attcttcgga atag                             34

Claims (53)

1.一种编码肌醇六磷酸酶的分离的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸选自：

(a)编码序列标识符SEQ ID NO：3所示肌醇六磷酸酶的分离的多核苷酸

(b)与(a)所述的多核苷酸杂交的分离的多核苷酸

(c)与(a)所述的多核苷酸同源的分离的多核苷酸

(d)(a)、(b)或(c)所述多核苷酸的片段。

2.如权利要求1所述的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸选自序列标识符SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示序列。

3.如权利要求1所述的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸是序列标识符SEQID NO：4所示序列。

4.如权利要求1-3中任一项所述的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸源自青霉属真菌。

5.一种分离的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸包含权利要求1-4中任一项所述多核苷酸。

6.一种肌醇六磷酸酶，其特征在于，所述肌醇六磷酸酶由权利要求1-5中任一项所述多核苷酸编码。

7.如权利要求6所述的肌醇六磷酸酶，其特征在于，所述肌醇六磷酸酶选自：

(a)序列标识符SEQ ID NO：3所示的肌醇六磷酸酶

(b)与(a)所述肌醇六磷酸酶同源的肌醇六磷酸酶

(c)(a)或(b)所述肌醇六磷酸酶的片段

8.如权利要求6或7所述的肌醇六磷酸酶，其特征在于，所述肌醇六磷酸酶源自青霉属真菌。

9.如权利要求8所述的肌醇六磷酸酶，其特征在于，所述肌醇六磷酸酶源自青霉属CBS 109899菌株。

10.一种嵌合基因，其特征在于，所述嵌合基因至少包括彼此功能相联的：

(a)一个在宿主生物中有功能的启动子

(b)如权利要求1-5中任一项所述多核苷酸

(c)一个在宿主生物中有功能的终止元件。

11.如权利要求10所述的嵌合基因，其特征在于，所述嵌合基因还包括在所述宿主生物中有功能的信号肽或转运肽。

12.一种表达或转化载体，其特征在于，所述载体包括权利要求10或11所述的嵌合基因。

13.如权利要求12所述的载体，其特征在于，所述载体是质粒、噬菌体或病毒。

14.一种转化的宿主生物，其特征在于，所述宿主生物包含权利要求10或11所述的嵌合基因。

15.如权利要求14所述的宿主生物，其特征在于，所述宿主生物是微生物。

16.如权利要求15所述的宿主生物，其特征在于，所述微生物选自细菌、真菌、酵母或病毒。

17.如权利要求16所述的宿主生物，其特征在于，所述微生物是选自棒状杆菌属、芽孢杆菌属、链霉菌属和埃希氏菌属的细菌，尤其是大肠杆菌。

18.如权利要求16所述的宿主生物，其特征在于，所述微生物是选自青霉属、曲霉属、金孢霉菌属或木霉菌属的真菌。

19.如权利要求16所述的宿主生物，其特征在于，所述微生物是选自酵母、克鲁维酵母和毕赤酵母属的酵母。

20.如权利要求14所述的宿主生物，其特征在于，所述宿主生物是植物细胞、植物或植物的一部分。

21.一种制造具肌醇六磷酸酶活性的提取物的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

(a)在可表达所述肌醇六磷酸酶的条件下培养具有权利要求1-5中任一项所述多核苷酸的生物体

(b)浓缩步骤(a)中培养的生物体

(c)破裂步骤(b)中分离的生物体细胞

(d)离心步骤(c)中获得的破裂细胞提取物

(e)回收从步骤(d)获得的具肌醇六磷酸酶活性的上清。

22.一种制造具肌醇六磷酸酶活性的提取物的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

(a)在可表达所述肌醇六磷酸酶的条件下培养具有权利要求1-5中任一项所述多核苷酸的生物体

(b)通过去除所述生物体来回收培养基。

23.一种制造如权利要求6-9中任一项所述肌醇六磷酸酶的方法，其特征在于，所述方法包括权利要求21或22所述方法的所有步骤，其中加入了以下额外步骤：

(f)在权利要求21所述方法中加入从步骤(e)回收的上清中纯化肌醇六磷酸酶的步骤

(c)在权利要求22所述方法中加入从步骤(b)回收的培养基中纯化肌醇六磷酸酶的步骤。

24.如权利要求21、22或23中任一项所述的产生方法，其特征在于，所述生物体是微生物。

25.如权利要求24所述的产生方法，其特征在于，所述微生物是真菌。

26.如权利要求25所述的产生方法，其特征在于，所述真菌是青霉属真菌。

27.如权利要求26所述的产生方法，其特征在于，所述青霉属真菌是青霉属CBS109899菌株。

28.一种制造具肌醇六磷酸酶活性的提取物的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

(a)培养权利要求14-20中任一项所述的转化的宿主生物

(b)浓缩步骤(a)中培养的转化的宿主生物

(c)破裂步骤(b)中分离的生物体细胞

(d)离心步骤(c)中获得的破裂细胞提取物

(f)回收从步骤(d)获得的具肌醇六磷酸酶活性的上清。

29.一种制造具肌醇六磷酸酶活性的提取物的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

(a)培养权利要求14-20中任一项所述的转化的宿主生物

(b)通过去除所述转化的生物体来回收培养基。

30.一种制造如权利要求6-9中任一项所述的肌醇六磷酸酶的方法，其特征在于，所述方法包括权利要求28和29所述方法的所有步骤，其中加入了以下额外步骤：

(f)在权利要求28所述方法中加入从步骤(e)回收的上清中纯化肌醇六磷酸酶的步骤

(c)在权利要求29所述方法中加入从步骤(b)回收的培养基中纯化肌醇六磷酸酶的步骤。

31.一种酶组合物，其特征在于，所述组合物包含至少一种权利要求6-9中任一项所述的肌醇六磷酸酶。

32.一种饲料组合物，其特征在于，所述组合物包含至少一种权利要求14-20中任一项所述的转化的宿主生物。

33.一种饲料组合物，其特征在于，所述组合物包含至少一种生物体，该生物体具有权利要求1-5中任一项所述的多核苷酸。

34.如权利要求33所述的饲料组合物，其特征在于，所述生物体是真菌。

35.如权利要求34所述的饲料组合物，其特征在于，所述真菌是青霉属真菌。

36.如权利要求35所述的饲料组合物，其特征在于，所述真菌是青霉属CBS109899菌株。

37.一种饲料组合物，其特征在于，所述组合物包含至少一种权利要求6-9中任一项所述肌醇六磷酸酶。

38.如权利要求32-37中任一项所述的饲料组合物在单胃动物营养物中的应用。

39.如权利要求38所述的饲料组合物的应用，其特征在于，用于猪营养物。

40.如权利要求38所述的饲料组合物的应用，其特征在于，用于家禽营养物。

41.一种制造如权利要求32所述的饲料组合物的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

(a)培养权利要求14-20中任一项所述的宿主生物

(b)浓缩步骤(a)中培养的宿主生物

(c)将步骤(b)中分离的宿主生物掺入所述饲料组合物。

42.一种制造如权利要求33-36所述的饲料组合物的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

(a)在可表达所述肌醇六磷酸酶的条件下培养具有权利要求1-5中任一项所述多核苷酸的生物体

(b)浓缩步骤(a)中培养的生物体

(c)将步骤(b)中分离的生物体掺入所述饲料组合物。

43.一种制造如权利要求37所述的饲料组合物的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

(a)在可表达所述肌醇六磷酸酶的条件下培养具有权利要求1-5中任一项所述多核苷酸的生物体

(b)浓缩步骤(a)中培养的生物体

(c)破裂步骤(b)中分离的生物体细胞

(d)离心步骤(c)中获得的破裂细胞提取物

(e)回收从步骤(d)获得的具肌醇六磷酸酶活性的上清

(f)将步骤(e)中回收的上清掺入所述饲料组合物。

44.一种制造如权利要求37所述的饲料组合物的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

(a)在可表达所述肌醇六磷酸酶的条件下培养具有权利要求1-5中任一项所述多核苷酸的生物体

(b)通过去除所述生物体来回收培养基

(c)将步骤(b)中回收的培养基掺入所述饲料组合物。

45.一种制造如权利要求37所述的饲料组合物的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

(a)培养如权利要求14-20中任一项所述的转化的宿主生物

(b)浓缩步骤(a)中培养的转化的宿主生物

(c)破裂步骤(b)中分离的生物体细胞

(d)离心步骤(c)中获得的破裂细胞提取物

(e)回收从步骤(d)获得的具肌醇六磷酸酶活性的上清

(f)将步骤(e)中回收的上清掺入所述饲料组合物。

46.一种制造如权利要求37所述的饲料组合物的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

(a)培养如权利要求14-20中任一项所述的转化的宿主生物

(b)通过去除所述转化的宿主生物来回收培养基

(c)将步骤(b)中回收的培养基掺入所述饲料组合物。

47.如权利要求43或45所述的方法，其特征在于，步骤(f)被以下步骤取代：

(f)从步骤(e)回收的上清中纯化肌醇六磷酸酶

(g)将步骤(f)中纯化的肌醇六磷酸酶掺入所述饲料组合物。

48.如权利要求44或46所述的方法，其特征在于，步骤(c)被以下步骤取代：

(c)从步骤(b)回收的上清中纯化肌醇六磷酸酶

(d)将步骤(c)中纯化的肌醇六磷酸酶掺入所述饲料组合物。

49.一种增加单胃动物吸收无机磷的方法，所述无机磷含在以植物为基础的饲料的肌醇六磷酸中，其特征在于，权利要求6-9中任一项所述的肌醇六磷酸酶或权利要求31所述的酶组合物被掺入所述动物营养物。

50.如权利要求48所述的方法，其特征在于，所述单胃动物用权利要求32-37中任一项所述的饲料组合物喂养。

51.一种减少单胃动物营养物中磷加入的方法，其特征在于，所述单胃动物用权利要求32-37中任一项所述的饲料组合物喂养。

52.一种减少来自单胃动物营养物的磷释放的方法，其特征在于，所述单胃动物用权利要求32-37中任一项所述的饲料组合物喂养。

53.一种青霉属的丝状真菌，其特征在于，所述真菌的保藏号为CBS 109899。

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