MXPA02001447A

MXPA02001447A - Enzimas de fitasa, acidos nucleicos que codifican para enzimas de fitasa y vectores y celulas hospedadoras que incorporan las mismas.

Info

Publication number: MXPA02001447A
Application number: MXPA02001447A
Authority: MX
Inventors: Christian F Stafford
Original assignee: The Victoria University Of Manchester; Univ Manchester
Priority date: 1999-08-13
Filing date: 2000-08-11
Publication date: 2003-07-21
Also published as: CA2382084C; AU6537500A; NO20020513D0; EP1210413A1; NO329772B1; CN101671685B; NO20020513L; CA2382084A1; BR0013549A; US7022371B2; US20030124700A1; CN1451039A; WO2001012792A1; US20060041113A1; JP4965780B2; DK1210413T3; ATE450605T1; KR20020042640A; DE60043443D1; CN101671685A

Abstract

La presente invención se refiere a un nuevo ADN que codifica para una enzima que tiene actividad de fitasa aislada de Penicillium. También se proporciona un método para aislar ADN que codifica para una enzima que tiene actividad de fitasa a partir de organismos que poseen este ADN, transformación del ADN en un organismo hospedador adecuado, expresión del ADN transformado y el uso de la proteína de fitasa expresada en el alimento como un complemen

Description

ENZIMAS DE FITASA, ÁCIDOS NUCLEICOS QUE CODIFICAN PARA ENZIMAS DE FITASA Y VECTORES Y CÉLULAS HOSPEDADORAS QUE INCORPORAN LAS MISMAS Campo de la Invención La presente invención se refiere a fitasa, ácidos nucleicos que codifican para fitasa, así como la producción de fitasa y su uso .

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Antecedentes de la Invención El fósforo (P) es un elemento esencial para el crecimiento. Una cantidad esencial del fósforo encontrado en la alimentación convencional para el ganado, por ejemplo, granos de cereal, harina de semillas aceitosas y por productos que sé originan de estas semillas, está en la forma de fosfato que se une covalentemente en una molécula conocida como fitato (mio-inositol-hexaquisfosfato) . La biodisponibilidad del fósforo en esta forma en general es completamente baja para no rumiantes, tal como de (de corral y cerdos), debido a la carencia de enzimas digestivas para separar el fósforo de la molécula de fitato . Se pueden señalar varias consecuencias importantes de la incapacidad de los no rumiantes para optimizar el fitato. Por ejemplo, se incurre en un gasto cuando se adicionan productos de fósforo inorgánicos (por ejemplo, fosfato de dicalcio, fosfato desfluorado) o de animales (por ejemplo carne y harina de hueso, harina de pescado) para cumplir con los requisitos nutricionales de los animales para el fósforo. Adicionalmente , el fitato puede unirse o quelar varios minerales (por ejemplo, calcio, zinc, hierro, magnesio, cobre) en el tracto gastrointestinal, volviéndolos de esta manera no disponibles para la absorción. Aún además, la mayoría del fitato presente en la alimentación pasa a través del tracto gastrointestinal, elevando la cantidad de fósforo en el abono. Esto conduce a una carga incrementada de fósforo ecológico en el ambiente. Los rumiantes, tal como el ganado vacuno, en contraste, utilizan fácilmente el fitato gracias a una enzima producida por los microorganismos del rumen conocida como fitasa. La fitasa cataliza la hidrólisis del fitato a (1) mio-inositol y/o (2) mono-, di-, tri-, tetra- y/o penta-fosfatos del mismo y (3) fosfato inorgánico. Dos tipos diferentes de fitasa se conocen: (1) una llamada 3 -fitasa (mio-inositol-hexafosfato-3-fosfohidrolasa, EC 3.1.3.8) y (2) una llamada 6-fitasa (mio-inositol-hexafosfato-6- fosfohidrolasa, EC 3.1.3.26). La 3-fitasa hidroliza primero el enlace de éster en la posición 3, en tanto que la 6- fitasa hidroliza primero el enlace de éster en la posición 6. La fitasa microbiana, como un aditivo alimenticio, se ha encontrado que mejora la biodisponibilidad del fósforo a partir del fitato en las dietas típicas de los no rumiantes (ver, por ejemplo, Cromwell, et al., 1993). El resultado es una necesidad disminuida de adicionar fósforo inorgánico a las alimentaciones de los animales, así como niveles reducidos de fósforo en el abono excretado (ver, por ejemplo, Kornegay, et al., 1996). A pesar de estas ventajas, pocas de las fitasas conocidas han ganado aceptación amplia en la industria de los alimentos. La razón para esto varía de enzima a enzima. Los intereses típicos se refieren a los altos costos de fabricación, y/o pobre estabilidad/actividad de la enzima en el ambiente de la aplicación deseada (por ejemplo, el pH/temperatura encontrados en el proceso de la materia alimenticia, o en los tractos digestivos de los animales. De esta manera, es deseable descubrir y desarrollar nuevas enzimas que tengan buena estabilidad y actividad de fitasa para el uso en unión con la alimentación de animales, y aplicar los avances en la tecnología de fermentación a la producción de estas enzimas a fin de hacerlas comercialmente viables. También es deseable terminar las secuencias de nucleótidos que se pueden usar para producir organismos genéticamente manejados, más eficientes, capaces de expresar estas fitasas en cantidades adecuadas para la producción industrial. Es aún deseable además desarrollar un sistema de expresión de fitasa vía manejo genético que será capaz de la purificación y utilización de cantidades de trabajo de la enzima relativamente pura.

Breve Descripción de la Invención La presente invención proporciona una enzima purificada que tiene actividad de fitasa que se deriva de una fuente microbiana, y de manera preferente, de una fuente fungal, tal como una especie Penicillium, por ejemplo, P. hordei (anteriormente P. hirsutum; ATCC No. 22053), P. piceum (ATCC No. .10519), o P. brevi-compactum (ATCC No. 48944). La presente invención proporciona además una secuencia de polinucleótidos que codifica para la enzima que comprende un ADN como se muestra en cualquiera de las Figuras 1A-1C; un polinucleótido que codifica para la secuencia de aminoácidos mostrada en la Figura 2; un polinucleótido que codifica para una fitasa que comprende un segmento de aminoácidos que difiere de la secuencia en la Figura 2, con la condición que el polinucleótido codifique para un derivado de la fitasa específicamente descrita en la presente; y un polinucleótido que codifique para una fitasa que comprende un segmento de aminoácidos que difiere de la secuencia en la Figura 2, con la condición que el polinucleótido hibridice bajo condiciones de severidad media o alta con un ADN que comprende todo o parte del ADN en cualquiera de las Figuras 1A-1C. La presente invención también proporciona un polinucleótido que codifica para una enzima que tiene actividad de hidrolización de fitato e incluye una secuencia de nucleótidos como se muestra en la Figura 17; un polinucleótido que codifica para la secuencia de aminoácidos mostrada en la Figura 17; un polinucleótido que codifica para una fitasa que comprende un segmento de aminoácido que difiere de la secuencia en la Figura 17, con la condición que el polinucleótido codifique para un derivado de la fitasa específicamente descrita en la presente; y un polinucleótido que codifique para una fitasa que comprende un segmento de aminoácidos que difiere de la secuencia en la Figura 17, con la condición que el polinucleótido hibridice bajo condiciones de severidad media o alta con una secuencia de nucleótidos como se muestra en la Figura 17. Adicionalmente, la presente invención abarca vectores que incluyen las secuencias de polinucleotido descritas anteriormente, células hospedadoras que se han transformado con este polinucleotido o vectores, caldos de fermentación que comprenden las - células hospedadoras y proteínas de fitasa codificadas por el polinucleotido que se expresan por las células hospedadoras. De manera preferente, el polinucleotido de la invención está en la forma purificada o aislada y se usa para preparar una célula hospedadora transformada capaz de producir el producto de proteína codificado del mismo. Adicionalmente, los polipéptidos que son el producto de expresión de las secuencias de nucleótido descritas anteriormente están dentro del alcance de la presente invención. En una modalidad, la presente invención proporciona un polinucleotido aislado o purificado derivado de una fuente fungal del género Penicillium, polinucleotido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para una enzima que tiene actividad de fitasa. La fuente fungal se puede seleccionar, por ejemplo, del grupo que consiste de Penicillium piceum y Penicillium hordei . De acuerdo a una modalidad, el polinucleotido codifica para una enzima de hidrolización de fitato e incluye una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 55%, al menos 60%, al menos 65%, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, y/o aproximadamente 100% de identidad a una secuencia de aminoácidos como se describe en SEQ ID No.: 4. Una modalidad de la presente invención proporciona un polinucleotido aislado que comprende una secuencia de nucleótidos (i) que tiene al menos 55%, al menos 60%, al menos 65%, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, y/o aproximadamente 100% de identidad a una secuencia de un nucleótidos, como se describe en SEQ ID No.: 1, SEQ ID No.: 2 ó SEQ ID No . : 3 ó (ii) que es capaz de hibridizar a una sonda derivada de la secuencia de nucleótidos descrita en SEQ ID No.: 1, SEQ ID No.: 2 ó SEQ ID No . : , 3 bajo condiciones de severidad intermedia a alta, o (iii) que es complementario a la secuencia de nucleótidos descrita en SEQ ID No.: 1, SEQ ID No . : 2 ó SEQ ID No . : 3. Otro aspecto de la presente invención proporciona un polinucleotido aislado que codifica para una enzima que tiene actividad de fitasa, en donde la enzima se deriva a partir de una fuente de Penicillium. La fuente se puede seleccionar, por ejemplo, del grupo que consiste de Penicillium piceum y Penicillium hordei. En una modalidad, el polinucleotido codifica para una enzima de hidrolización de fitato que incluye una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 55%, al menos 60%, al menos 65%, al .menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, y/o aproximadamente 100% de identidad a una secuencia de aminoácidos como se describe en SEQ ID No.: 4. En otra modalidad, el polinucleótido tiene al menos 55%, al menos 60%, al menos 65%, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, y/o aproximadamente 100% de identidad a una secuencia de nucleótidos como se describe en SEQ ID No . : 1, SEQ ID No.: 2 ó SEQ ID No.: 3, o (ii) es capaz de hibridizar a una sonda deriva de la secuencia de nucleótidos descrito en SEQ ID No.: 1, SEQ ID No . : 2 ó SEQ ID No.: 3 bajo condiciones de severidad media a alta, o (iii) es complementaria a la secuencia de nucleótidos descrita en SEQ ID No.: 1, SEQ ID No . : 2 ó SEQ ID No . : 3. Aún un aspecto adicional de la presente invención proporciona un producto de expresión que incluye una secuencia de polinucleotidos (i) que tiene al menos 55%, al menos 60%, al menos 65%, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, y/o aproximadamente 100% de identidad a una secuencia de nucleótidos como se describe en SEQ ID No. : 1, SEQ ID No.: 2 ó SEQ ID No. : 3, o (ii) que es capaz de hibridizar una sonda derivad de la secuencia de nucleótidos descrita en SEQ ID No.: 1, SEQ ID No . : 2 ó SEQ ID No . : 3 bajo condiciones de severidad media a alta, o (iii) que es complementaria a la secuencia de nucleótidos descrita en SEQ ID No.: 1, SEQ ID No . : 2 ó SEQ ID No . : 3. También se proporciona un vector (por ejemplo, un plásmido) que incluye este vector de expresión, y una célula hospedadora (tal como un Aspergíllus, por ejemplo, Aspergíllus Níger o Aspergillus nidulans) transformada con este vector. En otro de sus aspectos, la presente invención proporciona una sonda para el uso en la detección de secuencias de ácido nucleico que codifican para una enzima que tiene actividad de fitasa derivada de una fuente microbiana, que comprende: una secuencia de nucleótidos (i) que tiene al menos 55%, al menos 60%, al menos 65%, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, y/o aproximadamente 100% de identidad a una secuencia de nucleótidos como se describe en SEQ ID No . : 1, SEQ ID No.: 2 ó SEQ ID No.: 3, o (ii) que es capaz de hibridizar a un polinucleótido que incluye una secuencia como se describe en SEQ ID No. : 1, SEQ ID No.: 2 ó SEQ ID No . : 3 bajo condiciones de severidad media a alta, o (iü) que es complementaria a una secuencia de nucleótidos descrita en SEQ ID No.: 1, SEQ ID No . : 2 ó SEQ ID No . : 3. En una modalidad, la fuente microbiana es una fuente fungal, por ejemplo, una especie de Penicillium tal como Penicillium hordei o Penicillium piceum. La presente invención proporciona adicionalmente un alimento o alimentación para animal que incluye una enzima que tiene actividad de fitasa, en donde la enzima comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 55%, al menos 60%, al menos 65%, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, y/o aproximadamente 100% de identidad a una secuencia de aminoácidos como se describe en SEQ ID No. : 4. La presente invención proporciona un alimento o alimentación para animal que incluye una enzima que tiene actividad de fitasa, en donde la enzima se deriva de una fuente fungal seleccionada del grupo que consiste de Penicillium hordei y Penicillium piceum. Un aspecto de la presente invención proporciona una enzima de fitasa aislada en donde la enzima se obtiene de un hongo seleccionado del grupo que consiste de P. piceum y P. hordei, y tiene las siguientes propiedades fisicoquímicas: (1) peso molecular: entre aproximadamente 45-60 kDa (no glicosilado) ; y (2) especificidad: fitato. En una modalidad, la presente invención proporciona una enzima derivada y una especie fungal (por ejemplo, un Penicillium, tal como P. piceum y P. hordei), o se codifica por una secuencia de nucleótidos capaz de hibridizar a SEQ ID No.: 1, SEQ ID No.: 2, SEQ ID No . : 3 ó la secuencia de nucleótidos de la Figura 17 bajo condiciones de severidad intermedia a alta, y que tiene una o más de las siguientes propiedades fisicoquímicas: (1) Peso molecular: entre aproximadamente 45-55 kDa (no glicosilada) [en base a una proteína de 489 aminoácidos] ; (2) Una actividad que es específica hacia fitato, ácido fítico o mio-inositol-hexa-fosfato, y/o derivados de fosfatos inferiores de los mismos; (3) un pH teórico de ente aproximadamente 7 y 7.6; por ejemplo 7.3; (4) un pH óptimo dentro de un intervalo de aproximadamente 4.5-5.5, por ejemplo, aproximadamente 5 ; y/o (5) una temperatura ambiente óptima de 40-45 grados C, por ejemplo, 42-44. grados C. Otro aspecto de la presente invención proporciona un método para producir una enzima que tiene actividad de fitasa, que comprende. (a) proporcionar una célula hospedadora transformada con un vector de expresión que comprende un polinucleótido como se describe en la presente; (b) cultivar la célula hospedadora transformada bajo condiciones adecuadas para que la célula hospedadora produzca la fitasa; y (c) recuperar la fitasa. De acuerdo a una modalidad, la célula hospedadora es una especie de Aspergillus, tal como A. niger o A. nidulans . En otro de sus aspectos, la presente invención proporciona un método para separar fósforo a partir de fitato, que comprende el paso de tratar el fitato con una enzima que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 55%, al menos 60%, al menos 65%, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, ylo aproximadamente 100% de identidad a una secuencia de aminoácidos como se describe en SEQ ID No . : 4. La presente invención proporciona adicionalmente un método para separar fósforo de fitato, que comprende el paso de tratar el fitato con una enzima como se define anteriormente . Otro aspecto de la presente invención proporciona una enzima de hidrolización de fitato que incluye una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 55%, al menos 60%, al menos 65%, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos' 85%, al menos 90%, al menos 95%, y/o aproximadamente 100% de identidad a una secuencia de aminoácidos como se describe en la Figura 17. Un aspecto adicional de la presente invención proporciona un polinucleotido aislado que incluye una secuencia de nucleotidos (i) que tiene al menos 55%, al menos 60%, al menos 65%, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, y/o aproximadamente 100% de identidad a la secuencia de nucleotidos como se describe en la Figura 17, o (ii) que es capaz de hidridizar a una sonda derivada de la secuencia de nucleotidos descrita en la Figura 17 bajo condiciones de severidad intermedia a alta, o (iii) que es complementario a la secuencia de nucleotidos descrito en la Figura 17. En una modalidad, el polinucleotido aislado codifica para una enzima de hidrolización de fitato derivada de Penicillium piceum o Penicillium hordei . La enzima incluye, de acuerdo a una modalidad, una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 55%, al menos 60%, al menos 65%, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, y/o aproximadamente 100% de identidad a una secuencia de aminoácidos como se describe en la Figura 17. En otra modalidad, el polinucleotido incluye una secuencia de nucleotidos (i) que tiene al menos 55%, al menos 60%, al menos 65%, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, y/o aproximadamente 100% de identidad a una secuencia de nucleotidos como se describe en la Figura 17, o (ii) capaz de hibridizar a una sonda derivada de la secuencia de nucleótidos descrita en la Figura 17 bajo condiciones de esterilidad media a alta, o (iii) complementaria a la secuencia de nucleótidos descrita en la Figura 17. Otro aspecto de la presente invención proporciona una construcción de expresión que comprende un polinucleótido que incluye una secuencia de nucleótidos (i) que tiene al menos 55%, al menos 63%, al menos 65%, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, y/o aproximadamente 100% de identidad a una secuencia de nucleótidos como se describe en la Figura 17, o (ii) que es capaz de hibridizar a una sonda derivada de la secuencia de nucleótidos descrita en la Figura 17 bajo condiciones de severidad media a alta, o (iii) que es complementaria a la secuencia de nucleótidos descrita en la Figura 17. La presente invención proporciona adicionalmente un vector (por ejemplo, plásmidos) que incluye esta construcción de expresión, así como una célula hospedadora (por ejemplo, Aspergillus Níger o Aspergillus nidulans) transformada con este vector. La presente invención proporciona adicionalmente una sonda para el uso en la detección de secuencias de ácido nucleico que codifican para una enzima que tiene actividad de fitasa derivadas de una fuente microbiana, que comprende: una secuencia de nucleótidos (i) que tiene al menos 55%, al menos 60%, al menos 65%, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, y/o aproximadamente 100% de identidad a una secuencia de nucleótidos como se describe en la Figura 17, o (ii) que es capaz de hibridizar a un polinucleótido que incluye una secuencia como se describe en la Figura 17 bajo condiciones de severidad media a alta, o (iii) que es complementaria a una secuencia de nucleótidos descrita en la Figura 17. En una modalidad, la fuente microbiana es una fuente fungal, por ejemplo, una especie Penicillium, tal como P. hordei o P. piceum. La presente invención proporciona adicionalmente un alimento o alimentación de animal que incluye una enzima que tiene actividad de fitasa, en donde la enzima incluye una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 55%, al menos 60%, al menos 65%, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, y/o aproximadamente 100% de identidad a una secuencia de aminoácidos como se describe en la Figura 17. Aún además, la presente invención proporciona un método para separar fósforo a partir de fitato, que comprende el paso de tratar el fitato con una enzima (i) que tiene una actividad de hidrolización de fitato y (ii) que incluye una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 55%, al menos 60%, al menos 65%, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, y/o aproximadamente 100% de identidad a una secuencia de aminoácidos como se describe en la Figura 17. Como se apreciará, una ventaja de la presente invención es que se ha aislado un polinucleotido que proporciona la capacidad de aislar polinucleótidos adicionales que codifican para proteínas que tienen actividad de fitasa. Otra ventaja de la presente invención es que, en virtud de proporcionar un polinucleotido que codifica para una proteína que tiene actividad de fitasa, es posible producir a través de un medio recombinante, una célula hospedadora que es capaz de producir la proteína que tiene actividad de fitasa en cantidades relativamente grandes. Aún otra ventaja de la presente invención es que la aplicación comercial de proteínas que tienen actividad de fitasa se hace práctica. Por ejemplo, la presente invención proporciona alimentación de animal que incorpora la fitasa descrita en la presente. Aún una ventaja adicional de la presente invención es que proporciona una enzima que tiene actividad de hidrolización de fitato, con la actividad que es óptima a temperatura de aproximadamente 40 a aproximadamente 45 grados C, que se hace muy adecuado para el uso en la alimentación de animales (es decir, la enzima tiene una alta actividad en el punto de acción, en el intestino de un animal). Otros objetos y ventajas de la presente invención llegarán a ser evidentes a partir de la siguiente especificación detallada.

Breve Descripción de los Dibujos La Figura 1A ilustra una secuencia de ácido nucleico (SEQ ID No.: 1) que corresponde aun gen que codifica para una enzima de hidrolización de fitato derivada de Penicillium hordei , con las siguientes características resaltadas.: codón de inicio ATG (negritas) para Met de fitasa; un intrón (letra minúscula); y un codón finalizador TAG (negritas). Notablemente, se muestran dos exones (120 pb y 1347 pb), separados por un intrón 5' de 120 pb de largo. Muestra la secuencia completa de ADN de fitasa a partir de p. hordei; secuencia completa (clon CS213) fitasa (inicio-fin e intrón). ATG significa codón de inicio para Met de fitasa, TAG significa codón finalizador; el intrón se identifica por letras minúsculas pequeñas. Dos exones (120 pb y 1347 pb) se separan por el intrón de 5 ' de 120 pb de largo. El gen fitasa de longitud completa es de 1467 pb de largo. La Figura IB muestra la región contigua de la secuencia de la Figura 1A entre los codones de inicio (ATG) y finalizador (TAG) (SEQ ID No.: 2). La Figura 1C muestra, como una secuencia contigua, la región de la secuencia de la Figura 1A entre los codones de inicio y finalizador, con el intrón de 120 pb removido (SEQ ID No . : 3). La Figura 2 ilustra la secuencia de aminoácidos (SEQ ID No.: 4) codificada por la secuencia de ácido nucleico de la Figura 1. Muestra la secuencia de proteína, fitasa de p. hordei . Las Figuras 3 y 4 son curvas de crecimiento para P. piceum y P. hordei, respectivamente, que muestran el efecto de P disponible en el medio en el crecimiento durante el tiempo. La Figura 5A muestra una alineación para cuatro secuencias de aminoácidos de fitasa fungal publicadas, que muestras reacciones conservadas (resaltadas en borde negro) usadas para diseñar cebadores degenerados para PCR. La Figura 5B muestra una alineación para las cuatro secuencias de aminoácidos de fitasa, fúngales, publicadas de la Figura 5A, junto con la secuencia de las secuencias de P. hordei y P. piceum de la presente invención (SEQ ID No.: y SEQ ID No.: , respectivamente). La Figura 6 muestra una alineación de las secuencias de aminoácido publicadas para las fitasas phyA y phyB a partir de A. niger, de la cual se diseñaron los cebadores degenerados CSl y CS2. Se muestran secuencias conservadas usadas para diseñar los cebadores CSl, CS2. La Figura 7 muestra las secuencias de aminoácido para cuatro fitasas fúngales publicadas alineadas con (i) la secuencia de aminoácidos traducida del producto de PCR obtenida usando los cebadores CSl y CS2 (línea 2, denotada como "P. hordei3D), y (ii) la secuencia de aminoácidos traducida de aproximadamente 80% del gen de fitasa de P. hordei (es decir, porciones N-terminal ausente) obtenido de la primera biblioteca genómica de P. Hordei (línea 1, denotada como "P hordei"). La Figura 8 ilustra un gel de transferencia Southern que muestra la hibridación entre una muestra que comprende el producto de PCR obtenido usando cebadores degenerados de CoSl y CS2 y varias digestiones de ADN genómico fungal, con: Senda 1- Marcador de Tamaño; Senda 2-Aspergillus niger - EcoRl ; Senda 3.- Penicillium piceu -Ecori; Senda 4.- Penicillium hordei.- EcoRI; Senda 5 Penicillium hordei- BamHI; senda 6.- Penicillium hordei . -Salí, Senda 7.- Penicillium hordei - Kpnl , y Senda 8.-Penicillium hordei-Sacl. La Figura 9 ilustra las secuencias de ácido nucleico de un clon, denotado como CS101, obtenido al generar y detectar una biblioteca genómica de P hordei (SEQ ID No.: ). CS101 contiene un fragmento de 4.8 kb de P hordei en el vector de clonación comercial pSK II+ BlueScript (Stratagene ; La Jolla, California). 1.7 kb de esta secuencia de inserto es una secuencia de la fitasa phyA de P hordei y representa 80% de la región de codificación del gen (incluyendo el extremo 3'), y las regiones reguladoras en la dirección 3 ' . La Figura 10 ilustra una secuencia de ácido nucleico 5 ' /N-terminal (SEQ ID No.: ) y 3 ' /C-terminal (SEQ ID No.: : ) de un clon, denotado como CS158. La secuencia de aminoácidos deducida que corresponde a cada secuencia de ácido nucleico también se muestra (SEQ ID No.: y SEQ ID No.: , respectivamente). Se generó el clon CS158 por PCR a partir de la combinación de los cebadores CS201-204. Se produjo una banda de tamaño apropiado (Figura 12), se clonó y secuenció. La secuencia deducida de aminoácidos se resume abajo. La secuencia deducida de aminoácidos preliminar para la fitasa se muestra en negritas. La secuenciación de CS158 fue incompleta ya que hubo una separación aproximada de 70 aminoácidos que representan el punto medio del gen. La reamplificación con cebadores rediseñados (Figura 13) generó la secuencia completa, analizada como que es fitasa. El extremo C-terminal de CS158 se mostró que es 100% homólogo a aquel del CS101. La secuencia de fitasa está resaltada en negritas, incluyendo el fin, en el extremo de la proteína. La Figura 11 proporciona una ilustración del vector en pGAPT-PG, que se puede usar para la expresión de la enzima de hidrolización de fitato de P hordei en Aspergillus . La Figura 12 muestra una amplificación por PCR del gen putativo de fitasa usando cebadores diseñados de la secuencia de los clones genómicos de fitasa aislados de P. hordei. La amplificación por PCR del gen putativo de fitasa que usa cebadores diseñados de la secuencia de los clones genómicos de fitasa aislados a partir de p. hordei. Senda marcadora.- Normas Amresco E261; Senda 1 Cebadores CS202/203, 54°C, Senda 2 Cebadores CS201/203, 54°C, Senda 3 Cebadores CS202/203, 52°C, Senda 4 Cebadores CS201/203, 52°C. Nota: la banda a tamaño esperado de 1.7 kb con cebador CS201/203. También se señala la presencia de múltiples bandas. La Figura 13 muestra una amplificación por PCR del gen putativo de fitasa usando cebadores diseñados a partir de la secuencia del gen de fitasa del clon CS158. La amplificación por PCR del gen putativo de fitasa que usa cebadores rediseñados a partir de la secuencia de gen de fitasa de clon CS158. Senda marcadora.- Normas Amresco E261; Senda 1 Cebadores CS22/CS203, 56°C, Senda 2 Cebadores CS22/CS204, 56°C, Senda 3 Cebadores CS23/CS203, 56°C, Senda 4 Cebadores CS23/CS23, 56°C. La Figura 14 muestra una análisis de transferencia Southern de Aspergillus nidulans transformado con el gen de fitasa de P. hordei . Análisis de transferencia Southern de Aspergillus nidulans transformado con gen de fitasa de p. hordei. Todos los ADN genómicos se digirieron con EcoRV y el Southern se sondeo con una sonda de fitasa de 650 pb a partir de p. hordei. Senda marcadora.- Normas Amresco E261; Senda 1.- ADN de sonda de control positivo; Senda 2.- Aspergillus nidulans no transformado; Senda 3.- Transformante CS213-2; Senda 4.-Transformante CS213-4. La Figura 15 muestra un perfil de pH de la enzima de fitasa a partir de P. hordei. La Figura 16 muestra un perfil de la temperatura-actividad de la enzima de fitasa a partir de P. hordei. La Figura 17 muestra la secuencia completa de un fragmento de 853 pb (SEQ ID No.: ) de la fitasa de P. piceum (5 '-3'), de un clon denotado como CS142, así como una secuencia deducida de aminoácidos (283 aminoácidos) (SEQ ID No.: ). Las porciones importantes para la estructura de fitasa y función y los residuos de Cys importantes para la estructura dentro de esa secuencia están en negritas.

Las porciones criticas para la estructura y función de fitasa y los residuos Cys importantes para la estructura dentro de esta secuencia están en negritas.

Descripción Detallada de la Invención I . Definiciones A menos que se define de otra manera en la presente, todos los términos técnicos y científicos usados en la presente tienen el mismo significado como se entiende comúnmente por un experto en la técnica al cual corresponde esta invención. Singleton, et al., DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY, 2D ED., John Wiley and Sons, New York (1994), and Hale & Marham, THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY, Harper Perennial, NY (1991) proporcionan a un experto en la técnica un diccionario general de muchos de los términos usados en esta invención. Aunque se pueden usar en la presente cualquier método y materiales similares o equivalentes a aquellos descritos en la presente, en la práctica o prueba de la presente invención, los métodos preferidos y materiales se describen. Los intervalos numéricos están abarcando los números que definen el intervalo. A menos que se indique de otro modo, los ácidos nucleicos se describen de izquierda a derecha en la orientación 5' ó 3'; las secuencias de aminoácidos se describen de izquierda a derecha en la orientación amino a carboxi , respectivamente. Los encabezados proporcionados en la presente no son limitaciones de los varios aspectos o modalidades de la invención que se pueden tener como referencia a la especificación como una totalidad. Por consiguiente como consiguiente, los términos definidos inmediatamente a continuación se definen más completamente por referencia a la especificación como una totalidad. Como se usa en la presente, el término "fitasa'O "actividad de fitasa" se refiere a una proteína o polipéptido que es capaz de catalizar la hidrólisis de fitato a (1) mio-inositol y/o (2) mono-, di-, tri-, tetra-y/o penta-fosfatos de los mismos y (3) fosfato inorgánico. Por ejemplo, las enzimas que tienen actividad catalítica como se define en el número S de la Comisión de Enzimas 3.1.3.8, o número EC 3.1.3.26. El término "idéntico" en el contexto de dos ácidos nucleicos o secuencias de polinucleótidos se refiere a los residuos en las dos secuencias que son los mismos cuando se alinean para la correspondencia máxima, como se mide usando uno de los siguientes algoritmos de análisis o comparación de secuencia. "Alineación óptima" como se define como una alineación dando la puntuación de identidad de por ciento más alta. Esta alineación se puede realizar usando una variedad de programas de análisis de secuencia comercialmente disponibles, tal como el programa de alineación local LALIGN usando un ktup de 1, parámetros por omisión y PAM por omisión. Una alineación preferida es la alineación en pares realizada usando el programa CLUSTAL-W en MACVECTOR, operado en el modo de alineación "lento" usando parámetros por omisión, incluyendo una penalidad de separación abierta de 10.0, una penalidad de separación extendida de 0.1, y una matriz de similitud BLOSUM30. Si una separación necesita ser insertada en una primera secuencia para alinearla óptimamente con una segunda secuencia, el por ciento de identidad se calcula usando solo los residuos que están en pares con un residuo de aminoácidos correspondiente (es decir, el cálculo no considera los residuos en las segundas secuencias que están en la "separación" de la primera secuencia). La alineación óptima de las secuencias para la comparación también se puede llevar a cabo, por ejemplo, por el algoritmo de homología local de Smith & Waterman, Adv. Ap l . Math. 2:482 (1981), por el algoritmo de alineación de homología de Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol . 48:443 (1970), por la búsqueda para el método de similitud de Pearson & Lipman, Proc . Nat ' 1. Acad. Sei. USA 85:2444 1988), por implementaciones computarizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA, and FASTA in the Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI) , o por inspección visual. El "por ciento de identidad de secuencias" con respecto a dos secuencias de aminoácidos o polinucleótidos, se refiere al porcentaje de residuos que son idénticos en las dos secuencias cuando las secuencias se alinean en forma óptima. De esta manera, una identidad de secuencia de aminoácidos de 80% significa que 80% de los aminoácidos en dos secuencias de polipéptidos óptimamente alineadas son idénticas. El por ciento de identidad se puede determinar, por ejemplo, por una comparación directa de la información de secuencia entre dos moléculas al alinear las secuencias, contando el número exacto de correspondencias entre las dos secuencias alineadas, dividiendo por la longitud de la secuencia más corta y multiplicando el resultado por 100. se pueden usar programas de computadora fácilmente disponibles para ayudar en el análisis, tal como ALIGN, Dayhoff, M.O. in Atlas of Protein Sequence and Structure M.O. Dayhoff ed.,* 5 Suppl . 3:353-358, National biomedical Research Foundation, Washington, DC, que adapta el algoritmo de homología local de Smith and Waterman (1981) Advances in Appl . Math. 2:482-489 para análisis de péptidos . Los programas para determinar la identidad de secuencia de nucleótidos están disponibles en el Wisconsin Sequence Analysis Package, Versión 8 (disponible de Genetics Computer Group, Madison, WI) por ejemplo, los programas BESTFIT, FASTA y GAP , que también dependen del algoritmo de Smith and Waterman. Estos programas se utilizan fácilmente con los parámetros por omisión recomendados por el fabricante y descritos en el Wisconsin Sequence Analysis Package referido anteriormente. Un ejemplo de un algoritmo que es adecuado para determinar la similitud de secuencia es el algoritmo BLAST, que se describe en Altschul, et al., J. Mol. Biol. 215:403- 410 (1990) . El programa de cómputo para realizar los análisis BLAST está públicamente disponible a través del Centro Nacional para la Información de Biotecnología (http://www.ncbi.nim.nih.gov/). Este algoritmo comprende identificar primero los pares de secuencia de alta puntuación (HSP) al identificar palabras cortas de longitud W en la secuencia de pregunta que ya sea corresponde o satisface alguna puntuación T de umbral de valor positivo cuando se alinea con una palabra de la misma longitud en una secuencia de base de datos. Estos aciertos iniciales de palabras de vecindad actúa como punto de inicio para encontrar HSP más largas que los contienen. Los aciertos de palabras se extienden a direcciones a lo largo de cada una de las dos secuencias que se comparan hasta un punto que se puede incrementar la puntuación de alineación acumulativa. La extensión de los aciertos de palabra se detiene cuando: la puntuación de alineación acumulativa declina por la cantidad X de un valor máximo logrado; la puntuación acumulativa va a cero o por abajo; o se alcanza el fin de cualquier secuencia. Los parámetros W, T y X el algoritmo BLAST determina la sensibilidad y velocidad de la alineación. El programa BLAST usa como omisiones una longitud de palabra (W) de 11, la matriz de puntuación BLOSUM62 (ver, Henikoff & Henikoff, Proc . Nati. Acad. Sci. USA 89:10915 (1989) alineaciones (B) de 50, expectación (E) de 10, M'5, N'-4, y una comparación de ambas hebras. El algoritmo BLAST entonces realiza un análisis estadístico de la similitud entre dos secuencias (ver, por ejemplo Karlin & Altschul, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 90:5873-5787 (1993). Una medida de similitud proporcionada por el algoritmo BLAS es la probabilidad de suma más pequeña (P(N)), que proporciona una indicación de la probabilidad por la cual una correspondencia entre dos secuencias de nucleótidos o aminoácidos ocurrirá por casualidad. Por ejemplo, una ácido nucleico se considera similar a un ácido nucleico de fitasa de esta invención si la probabilidad de suma más pequeña en una comparación del ácido nucleico de prueba a un ácido nucleico de fitasa es menos de aproximadamente 0.1, de manera preferente menos de aproximadamente 0.01 y de manera más preferente menos de aproximadamente 0.001. Donde el ácido nucleico de prueba codifica para un polipéptido de fitasa, se considera similar a un ácido nucleico de fitasa especificado, si la comparación da por resultado una probabilidad de suma más pequeña y menos de aproximadamente 05, y de manera más preferente de menos de aproximadamente 0.2. La frase "substancialmente idéntico" en el contexto de dos ácidos nucleicos o polipéptidos, significa de esta manera típicamente que un polinucleótido o polipéptido comprende una secuencia que tiene al menos 60% de identidad de secuencia, de manera preferente al menos 80%, de manera más preferente al menos 90% y de manera más preferente al menos 95%, en comparación a una secuencia de referencia usando los programas descritos anteriormente (por ejemplo, BLAST, ALIGN, CLUSTAL) usando parámetros normales. Una indicación que dos polipéptidos son substancialmente idénticos es que el primer polipéptido es inmunologicamente de reactividad cruzada con el segundo polipéptido. Típicamente, los polipéptidos que difieren por substituciones conservadoras de aminoácidos son inmunologicamente de reactividad cruzada. De esta manera, un polipéptido es substancialmente idéntico a un segundo polipéptido, por ejemplo, donde los dos polipéptidos difieren solo por una substitución conservadora. Otra indicación que dos secuencias de ácido nucleico son substancialmente idénticas es que las dos moléculas se hibridizan entre sí bajo condiciones severas (por ejemplo, dentro de un intervalo de severidad media a alta). "Hibridación" incluye cualquier proceso por el cual una hebra de ácido nucleico se une con una hebra complementaria de ácido nucleico a través de un apareamiento de base. De esta manera, hablando estrictamente, el término se refiere a la capacidad del complemento de la secuencia objetivo para unirse a una secuencia de prueba, o viceversa. "Condiciones de hibridación" se clasifican típicamente por el grado de "severidad" de las condiciones bajo las cuales se mide la hibridación. El grado de severidad se puede basar, por ejemplo, en la temperatura de fusión (Tm) del complejo o sonda de unión de ácido nucleico. Por ejemplo, "máxima severidad" se presenta típicamente aproximadamente Tm-5°C (5o por debajo de la Tm de la sonda); "alta severidad" a aproximadamente 5-10° por debajo de la Tm; "severidad intermedia" a aproximadamente 10-20° por debajo de la Tm de la sonda; y "baja severidad" a aproximadamente 20-25° por debajo de la Tm. Alternativamente o además, las condiciones de hibridación se pueden basar en. las condiciones de concentración iónica o sal de la hibridación y/o uno o más lavados de severidad. Por ejemplo, 6XSSC = muy baja severidad; 3xSSC = de baja a media severidad; lxSSC = severidad media; y 0.5xSSC = alta severidad. Funcionalmente , las condiciones de máxima severidad se pueden usar para identificar secuencias de ácido nucleico que tienen estricta identidad o casi estricta identidad con la sonda de hibridación; en tanto que se usan condiciones de alta severidad para identificar as secuencias de ácido nucleico que tienen aproximadamente 80% ó más de identidad de secuencia con la sonda. Para aplicaciones que requieran alta selectividad, será deseable típicamente emplear condiciones relativamente severas para formar los híbridos, por ejemplo, se seleccionará condiciones de alta temperatura y/o una concentración relativamente baja de sal. Las condiciones de hibridación, incluyendo severidad moderada y alta severidad, se proporcionan en Sambrook et al., incorporado en la presente como referencia. El término "aislado" o "purificado" significa que un material se remueve de su ambiente natural (por ejemplo, el ambiente natural si se presenta de forma natural). Por ejemplo, se dice que está "purificado" cuando está presente en una composición particular en una concentración más alta o más baja que la que existe en un algoritmo tipo silvestre que se presenta de forma natural o en combinación con los componentes no normalmente presentes en la expresión de un organismo que se presenta de forma natural o tipo silvestre. Por ejemplo, un polinucleótido o polipéptido que se presenta de forma natural, presente en un animal vivo no se aisla, pero el mismo polinucleótido o polipéptido, separado de algo o todo el material coexistente en el sistema natural, está aislado. Estos polinucleótidos pueden ser parte de un vector, y/o estos polinucleótidos o polipéptidos pueden ser parte de una composición, y aún ser aislados ya que este vector o composición no es parte de su ambiente natural. Se dice que un ácido nucleico o proteína está purificado, por ejemplo, si ocasiona esencialmente una banda en un gel electroforático . Como se usa en la presente, con referencia a las enzimas de hidrolización de fitato (fitasa), el término "derivado de" se propone no solo para indicar una fitasa producida o producible por una cepa del organismo en cuestión, sino también una fitasa codificada por una secuencia de ADN aislada de esta cepa y producida en un organismo hospedador que contiene esta secuencia de ADN. Adicionalmente , el término se propone para indicar una fitasa que se codifica por una secuencia de ADN de origen sintético y/o de ADNc y que tiene las características e identificación de la fitasa en cuestión. Para ejemplificar, "fitasas derivadas de Penicillium" se refieren a aquellas enzimas que tienen actividad de fitasa que se producen de forma natural por Penicillium, así como a ^fitasas como las producidas por fuentes de Penicillium pero que a través del uso de técnicas de manejo genético se producen por organismos no de Penicillium transformados con un ácido nucleico que codifica para estas fitasas. La presente invención abarca enzimas de hidrolizacion de fitato que son equivalentes a aquellas que se derivan de la cepa microbiana particular mencionada. Siendo "equivalente", en este contexto, significa que las enzimas de hidrolizacion de fitato se codifican por un polinucleótido capaz de hibridizar al polinucleótido que tiene la secuencia como se muestra en cualquiera de las Figuras 1A-1C bajo condiciones de severidad media o alta. Siendo equivalente, significa que la enzima de hidrolizacion de fitato comprende al menos 55%, al menos al menos 65%, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90% ó al menos 95% de identidad a la enzima de hidrolizacion y fitato que tiene la secuencia de aminoácidos descrita en la Figura 2 (SEQ ID No.: 4). La presente invención también abarca mutantes, variantes y derivados de las enzimas de hidrolizacion de fitato de la presente invención mientras que el mutante, variante o derivado de la enzima de hidrolizacion de fitato sea capaz de retener al menos una actividad característica de la enzima de hidrolizacion de fitato que se presenta de forma natural . Como se usa en la presente, los términos "imitantes y variantes", cuando se refieren a enzimas de hidrolizacion de fitato, se refieren a · enzimas de hidrolizacion de fitato obtenidas por alteración de la secuencia de aminoácidos que se presenta de forma natural y/o estructura de la misma, tal como por alteración de la secuencia de nucleotidos de ADN del gen estructural y/o por substitución y/o alteración directa de la secuencia de aminoácidos y/o estructura de la enzima de hidrolizacion de fitato . El término "derivado" o "derivado funcional" en cuanto se refiere a fitasa se usa en la presente para indicar un derivado de fitasa que tiene las características funcionales de fitasa de la presente invención. Los derivados funcionales de fitasa abarcan péptidos o fragmentos de péptidos que se presentan de forma natural, producidos de manera sintética o recombinante , mutantes o variantes que pueden tener una o más supresiones, substituciones o adiciones de aminoácidos que tienen las características generales de la fitasa de la presente invención . El -término "derivado funcional" en cuanto se refiere a ácidos nucleicos que codifican para fitasa se usa a todo lo largo de la especificación para indicar un derivado de un ácido nucleico que tiene las características funcionales de un ácido nucleico que codifica para fitasa. Los derivados funcionales de un ácido nucleico que codifica para fitasa de la presente invención abarcan ácidos nucleicos que se presentan de forma natural, producido de manera sintética o recombinante, o fragmentos, mutantes o variantes de los mismos, que pueden tener una o más supresiones, substituciones o adiciones de ácido nucleico y que codifican para la fitasa característica de la presente invención. Las variantes de ácido nucleico que codifican para la fitasa de acuerdo con la invención incluyen alelos y variantes en base a la degeneración conocida en la técnica. Los mutantes de ácido nucleico que codifican para la fitasa de acuerdo con la invención incluyen mutantes producidos vía técnicas de mutagénesis dirigidas al sitio (ver, por ejemplo Botstein, D. y Shortle, D., 1985, Science 229:1193-1201 and Myers, R.M. , Lerman, L.S., and Maniatis, T., 1985, Science 229: 242-247), PCR propensa a error (ver por ejemplo, Leung, D.W., Chen, E., y Goeddel, D.V. , 1989, Technique 1: 11-15; Eckert, K.A. y Kunkel, T.A., 1991, PCR Methods Applic. 1: 17-24; and Cadwell, R.C. and Joyce, G.F., 1992, PCR Methods Applic. 2: 28-33) y/o técnicas de mutagénesis inducidas por químicos conocidas en la técnica (ver, por ejemplo, Elander, R.P., Microbial screening, Selection and Strain Iimprovement , en Basic Biotechnology, J. Bullock y B. Kristiansen Eds . , Academic Press, New York, 1987, 217). "Vector de expresión" significa una construcción de ADN que comprende una secuencia de ADN que se enlaza operablemente a una secuencia de control, capaz de efectuar la expresión del ADN en un hospedador adecuado. Estas secuencias de control pueden incluir un promotor para efectuar la transcripción, una secuencia operadora opcional para controlar esta transcripción, una secuencia que codifica para los sitios de unión a ribosoma adecuados en el AKm, y secuencias que controlan la terminación de transcripción y traducción. Se usan de manera preferente diferentes tipos de células con diferentes vectores expresión. Un promotor preferido para vectores usados en Bacillus subtíllis es el promotor AprE; un promotor preferido usado en E. coli es el promotor Lac y un promotor preferido usado en Aspergillus niger es glaA. El vector puede ser un plásmido, una partícula de fago, o simplemente un inserto genómico potencial. Una vez transformada en un hospedador adecuado, el vector puede replicarse y funcionar independientemente del genoma del hospedador, o puede, bajo condiciones adecuadas, integrarse en el genoma mismo. En la presente especificación, el plásmido y vector algunas veces de usan de manera intercambiable. Sin embargo, la invención se propone para incluir otras formas de vectores de expresión que sirva para funciones equivalentes y que se conocen, o se llegan a conocer, en la técnica. De esta manera, se pueden emplear una amplia variedad de combinaciones de hospedador/vector de expresión al expresar las secuencias de ADN de esta invención. Los vectores de expresión útiles, por ejemplo, pueden consistir de segmentos de secuencia de ADN cromosónicas , no cromosómicas y de ADN sintéticas tal como varios derivados conocidos de SV40 y plásmidos bacterianos conocidos, por ejemplo, plásmidos de E. Coli que incluyen col El, pCRl, pBR322, pMb9, pUCb 19 y sus derivados, plásmidos de amplio intervalo de hospedadores , por ejemplo RP4 , ADN de fago, por ejemplo, los numerosos derivados de fago ?, por ejemplo NM989, y los otros fagos de ADN, por ejemplo M13 y los fagos de ADN de hebra individual filamentosos, plásmidos de levadura tal como el plásmido 2µ o derivados de los mismos, vectores útiles en células eucarióticas , tal como vectores útiles en células de animal y vectores derivados de combinaciones de plásmidos y ADN de fago, tal como plásmidos que se han modificado para emplear el ADN de fago u otras secuencias de control de expresión. Las técnicas de expresión que usan los vectores de expresión de la presente invención se conocen en la técnica y se describen en general, por ejemplo, en Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Press 1989). Frecuentemente, estos vectores de expresión que incluyen las secuencias de ADN de la invención se transforman en un hospedador unicelular por inserción directa en el genoma de una especie particular a través de un evento de integración (ver, por ejemplo Bennett & Lasure, More Gene Manipulations in Fungí, Academic Press, San Diego, pp . 70-76 (1991) y artículos citados en el mismo que describen la inserción genómica dirigida al objetivo, en hospedadores fúngales, incorporado en la presente como referencia. "Cepa hospedadora" o "célula hospedadora" significa un hospedador adecuado para un vector de expresión que comprende ADN de acuerdo con la presente invención. Las células hospedadoras útiles en la presente invención en general son hospedadores procarióticos y eucarióticos , incluyendo cualquier organismo transformable en el cual se pueda lograr la expresión. Por ejemplo, las células hospedadoras pueden ser Bacillus subtilis , Escherichia coli, Trichoderma longibrachiatum, Saccharomyces cerevisiae, Aspergillus niger, y Aspergillus nidulans . Las células hospedadoras se transforman o transfectan con vectores construidos usando técnicas de ADN recombinante. Estas células hospedadoras transformadas son capaces tanto de replicar vectores que codifican para fitasa y sus variantes (mutantes) o de expresar el producto peptídico deseado. Los ejemplos de hospedadores de expresión apropiados incluyen: células bacterianas, tal como E. Coli, Streptomyces , Salmonella typhimurium; células fúngales, tal como Aspergillus y Penicillium; células de insecto tal como Drosophila y Spodoptera Sf9; células de animal tal como CHO, COS, HEK 293 ó melanoma de Bowes; células planta, etc. La selección de un hospedador apropiado parece estar dentro del alcance de aquellos expertos en la técnica a partir de las enseñanzas en la presente. Se debe señalar que la invención no se limita por las células hospedadoras particulares empleadas.

II. Enzimas de fitasa y ácido nucleico que codifican para las enzimas de fitasa Un aspecto de la presente invención proporciona proteínas o polipéptidos que son capaces de catalizar la hidrólisis de fitato y de liberar fosfato inorgánico., por ejemplo, las enzimas que tienen actividad específica como se define en el Número EC de la Comisión de Enzima 3.1.3.8 o el número EEC 3.1.3.26. En una modalidad preferida, la invención proporciona una llamada 3-fitasa. La presente invención abarca adicionalmente polinucleótidos (por ejemplo ADN) que codifica para estas proteínas o polipéptidos que hidrolizan a fitato.

De manera preferente, la fitasa y/o polinucleótidos que codifican para la fitasa de acuerdo a la presente invención se deriva a partir de un hongo, de manera más preferente de un hongo anaeróbico, y de manera más preferente de Penicillium spp. , por ejemplo, Penicillium hordei o Penicillium piceum. De esta manera, se contempla que la fitasa o el ADN que codifica para la fitasa de acuerdo con la invención se puede derivar de Absidia spp.; Acremonium spp.; Actinomycetes spp.; Agaricus spp.; Anaeromyces spp.; Aspergillus spp., incluyendo A. auculeatus, A. awamori, A. flavus, A. foetidus, A. fumaricus, A. fumigatus, A. nidulans, A. niger, A. oryzae, A. terreus y A. versicolor; Aeurobasidium spp.; Cephalosporum spp.; Chaetomium spp.; Coprinus spp.; Dactyllum spp.; Fusarium spp., incluyendo F, conglomerans , F. decemcellulare, F. avanicum, F. lini, F. oxysporum y F. solani; Gliocladium spp.; Humicola spp., incluyendo H. insolens y H . lanuginosa; Mucor spp.; Neurospora spp., incluyendo N. crassa y N. sitophila; Neocallimastix spp.; Orpinomyces spp.; Penicillium spp; Phanerochaete spp.; Phlebia spp.; Piromyces spp.; Pseudomonas spp.; Rhizopus spp.; Schizophyllum spp.; Streptomyces spp; Trametes spp.; y Trichoderma spp., incluyendo T, reesei, T. longibrachiatum y T. viride; y Zygorhynchus spp. De manera similar, se contempla que una fitasa y/o ADN que codifica para una fitasa como se describe en la presente se puede derivar de bacterias tal como Streptomyces spp. , incluyendo S. Olivochromogenes, específicamente bacterias rumiantes que degradan fibra tal como Fibrobacter succinogenes; y en levadura incluyendo Candida torresii; C. parapsllosis ; C. sake; C. zeylanoides ; Pichia minuta; Rhodotorula glutinis; R. mucilaginosa; y Sporobolomyces holsaticus. En una modalidad preferida, la fitasa y/o polinucleótidos que codifican para la fitasa de acuerdo con la presente invención se deriva de (i) un hongo de desechos de grano, tal como Penicillium hordei, Penicillium piceum, o Penicillium brevi-compactum; . o (ii) un hongo eccomicorrizal asociado con raíces de árbol, por ejemplo, Lacearía laccata, Lacearía rufus, Paxillus involutus, Hebeloma crustuliniforme , Amanita rubescens, o Amanita muscaria . De acuerdo a una modalidad preferida, la fitasa y/o polinucleótido que codifica para la fitasa de la presente invención está en una forma purificada, es decir, presente en una composición particular en concentración mayor o menor que existe en un organismo que se presenta de forma natural o tipo silvestre o en combinación con componentes no normalmente presentes en la expresión de un organismo que se presenta de forma natural o tipo silvestre .

La invención abarca proteínas de hidrolización de fitato y péptidos que comprenden al menos 65%, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90% ó al menos 95% de identidad a la enzima de hidrolización de fitato que tiene la secuencia de aminoácidos descrita en la Figura 2 (SEQ ID NO . : 4). La invención abarca adicionalmente polinucleótidos , por ejemplo, ADN, que codifica para enzimas de hidrolización de fitato derivadas de fuentes fúngales, tal como Penicillium spp., polinucleótidos que incluyen una secuencia que tiene al menos 65% de identidad, al menos 70% de identidad, al menos 75% de identidad, al menos 80% de identidad, al menos 85% de identidad, al menos 90% de identidad y al menos 95% de identidad a la secuencia de polinucleótidos descrita en cualquiera de las Figuras 1A-1C, en tanto que la enzima codifica por el nucleótido es capaz de catalizar la hidrólisis de fitato y liberar fosfato inorgánico. En una modalidad preferida, el polinucleotido que codifica para la enzima de hidrolización de fitato tiene la secuencia de polinucleótidos como se muestra en cualquiera de las Figuras 1A-1C, o es capaz de hibridizar a la secuencia de polinucleótidos como se muestra en cualquiera de las Figuras 1A-1C, o es complementaria a esto. Como se entenderá por aquellos expertos en la técnica, debido a la degeneración del código genético, una variedad de polinucleótidos puede codificar la enzima de hidrolización de fitato descrita en la Figura 2 (SEQ ID NO.: 4). La presente invención abarca todos estos polinucleótidos .

III. Obtención de polinucleótidos que codifican para una enzima de hidrolización de fitato El ácido nucleico que codifica para una enzima de hidrolización de fitato se puede obtener por procedimientos normales conocidos en la técnica, por ejemplo, de ADN clonado (por ejemplo, una "biblioteca" de ADN), por síntesis química, por clonación de ADNc, por PCR, o por la clonación de ADN genómico, o fragmentos del mismo, purificado a partir de una célula deseada, tal como una especie fungal (ver, por ejemplo Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratoy Manual, 2d. Ed. , Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York; Glover, DM and Hames, BD (Eds . ) DNA Cloning: A Practical Approach, Vols 1 y 2, Segunada Edición). Las secuencias de ácido nucleico derivadas de ADN genómico pueden contener regiones reguladoras además de las regiones de codificación . En la clonación molecular del gen a partir del ADN genómico, los fragmentos de ADN se generan, algunos de los cuales comprenderán al menos una porción del gen deseado. El ADN se puede escindir en sitios específicos usando varias enzimas de restricción. De manera alternativa, se puede usar ADNasa en la presencia de manganeso para fragmentar el ADN, o el ADN se puede cizallar físicamente, por ejemplo, por tratamiento con sonido. Los fragmentos de ADN lineales entonces se pueden separar de acuerdo al tamaño por técnicas normales, incluyendo de manera enunciativa y sin limitación, a la electroforesis en gel de agarosa y poliacrilamida, PCR y cromatografía en columna. Una vez que se generen los fragmentos de ácido nucleico, la identificación del fragmento de ADN específico que codifica para una enzima de hidrolización de fitato se puede lograr de varias maneras. Por ejemplo, un gen que codifica para la enzima de hidrolización de fitato de la presente invención o su ARN específico o fragmento del mismo, tal como una sonda o cebador, se puede aislar y marcar y luego usar en los ensayos de hibridación para detectar un gen degenerado. (Benton, . y Davís, R. , 1977, Science 196: 180; Grunstein, M. y Hogness, D., 1975, Proc .

Nati. Acad. Sci. USA 72:3961). Estos fragmentos de ADN que comparten subtancial similitud de secuencia a la sonda hibridizarán bajo severidad media a alta. La presente invención abarca enzimas de hidrolización de fitato derivadas de especies fúngales (esp. , especies de Penicillium) que se identifica a través de técnicas de hibridación de ácido nucleico usando SEQ ID NO.: 1, SEQ ID NO . : 2 ó SEQ ID NO . : 3 ó una porción o fragmento adecuados del mismo (por ejemplo al menos aproximadamente 10-15 nucleótidos contiguos), como una sonda o cebador y detectar el ácido nucleico de cualquier origen de ADN genómico. El ácido nucleico que codifica para las enzimas que hidrolizan el fitato derivadas de las especies de Penicillium y que tienen al menos 65% de identidad a SEQ ID NO.: 1, SEQ ID NO.: 2 ó SEQ ID NO . : 3 ó una porción o fragmento del mismo se pueden detectar por hibridización de ADN-ADN o ADN-ARN o amplificación usando sondas, porciones o fragmentos de SEQ ID NO.: 1, SEQ ID NO.: 2 ó SEQ ID NO . : 3. Por consiguiente, la presente invención proporciona un método para la detección de ácido nucleico que codifica para una enzima de hidrolización de fitato abarcada por la presente invención que comprende hidrolizar parte o toda la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO.: 1, SEQ ID NO . : 2 ó SEQ ID NO . : 3 con ácido nucleico de Penicillium de cualquier origen de ADNc o genómico . También incluidas dentro del alcance de la presente invención están las secuencias de polinucleotidos que son capaces de hibridizar a la secuencia de nucleótidos descrita en SEQ ID NO.: 1, SEQ ID NO . : 2 ó SEQ ID NO . : 3 bajo condiciones de severidad media a alta. En una modalidad, las condiciones de hibridación se basan en la temperatura de fusión (Tm) del complejo de unión a ácido nucleico como se enseña en Berger y Kimmel (1987, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology, Vol . 152, Academic Press, San Diego, CA) incorporado en la presente como referencia, y confieren una severidad definida. En esta modalidad, "severidad máxima" se presenta típicamente a aproximadamente Tm-5°C (5°C por debajo de la Tm de la sonda); "severidad alta" a aproximadamente 5°C a 10°C por debajo de Tm; "severidad media o intermedia" a aproximadamente 10°C a 20°C por abajo de TM; y "baja severidad" a aproximadamente 20°C a 25°C por abajo de Tm. Se puede usar una hibridación de severidad máxima para identificar o detectar secuencias de polinucléótido idénticas o casi idénticas, en tanto que se puede usar una hibridación de severidad intermedia baja para identificar o detectar homólogos de secuencias de polinucleótidos . En otra modalidad, la severidad se determina por las condiciones de lavado empleadas después de la hibridación. Las condiciones de "baja severidad", para propósitos de esta modalidad, comprenden lavado con una solución de 0.2XSSC/0.1% de SDS a 20°C durante 15 minutos. Las condiciones de "severidad normal" comprenden un paso adicional de lavado que comprende el lavado con una solución de 0.2X SSC/0.1% de SDS a 37°C durante 30 minutos. El proceso de amplificación como se lleva a cabo en las tecnologías de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se describe en Dieffenbach CW y GS Dveksler (1995, PCR Primer, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Plainview Y). Una secuencia de ácido nucleico de al menos aproximadamente 10 nucleótidos y tantos como aproximadamente 60 nucleótidos de SEQ ID NO.: 1, SEQ ID NO.: 2 ó SEQ ID NO.: 3, de manera preferente aproximadamente 12 a 30 nucleótidos, y de manera más preferente aproximadamente 25 nucleótidos se pueden usar como una sonda o cebador de PCR. Un método preferido para aislar una construcción de ácido nucleico de la invención a partir de una biblioteca genómica o ADNc es por el uso de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) usando sondas de oligonucleótidos degenerados preparadas en base a la secuencia de aminoácidos de la proteína que tiene la secuencia de aminoácidos como se muestra en SEQ ID NO . : 4. Por ejemplo, la PCR se puede llevar a cabo usando las técnicas descritas en la Patente de los Estados Unidos No. 4, 683, 202. En vista de lo anterior, se apreciará que las secuencias de polinucleótidos proporcionadas en las Figuras ÍA'-IC son útiles para obtener fragmentos idénticos u homólogos de polinucleótidos a partir de otras especies, y particularmente a partir de hongos (por ejemplo, los hongos de desechos de granos, o el Ectomycorrhizae) que codifican para enzimas que tienen actividad de fitasa.

IV. Expresión y recuperación de enzimas de hidrolización de fitato Las secuencias de polinucleótidos de la presente invención se pueden expresar al enlazarlas operativamente a una secuencia de control de expresión en un vector de expresión apropiado y emplear en ese vector de expresión para transformar un hospedador apropiado de acuerdo a técnicas bien establecidas en la técnica. Los polipéptidos producidos en la expresión de las secuencias de ADN de esta invención se pueden aislar a partir de la fermentación de cultivos celulares y purificar en una variedad de maneras de acuerdo a técnicas bien establecidas. Un experto en la técnica es capaz de seleccionar las técnicas de aislamiento y purificación más apropiadas. De manera más particular, la presente invención proporciona células hospedadoras , métodos de expresión y sistemas para la producción de enzimas de hidrolización de fitato derivadas de microorganismos, tal como especies de Penicillium. Una vez que se obtiene el ácido nucleico que codifica para una enzima de hidrolización de fitato de la presente invención, las células hospedadoras recombinantes que contienen el ácido nucleico se pueden construir usando técnicas bien conocidas en la técnica. Las técnicas de biología molecular se describen en Sambrook et al . , Molecular Biology Cloning: A Laboratory Manual, segunda Edición (1989) Cold Spring Harbor Laboratoy Press, Cold Spring Harbor, MY (1989). En una modalidad, el ácido nucleico que codifica para las enzimas de hidrolización de fitato derivado de la especie Penicillium y que tiene al menos 65%, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90% y al menos 95% de identidad al ácido nucleico de cualquiera de las Figuras 1A-1C o un derivado funcional del mismo, o que es capaz de hibridizar bajo condiciones de severidad intermedia o alta al ácido nucleico de cualquiera de las Figuras 1A-1C, o que es complementario al ácido nucleico de cualquiera de las Figuras 1A-1C se obtiene y transforma en una célula hospedadora usando vectores apropiados. El ácido nucleico que codifica para las enzimas de hidrolización de fitato puede incluir una secuencia guía capaz de proporcionar la secreción de la fitasa codificada. Dependiendo de si la fitasa se va a expresar de manera intracelular o se segrega, se puede manejar una secuencia de ADN o vector de expresión de la invención tal que la forma madura de la fitasa se exprese con o sin una secuencia de señal de fitasa natural o una secuencia de señal que funciona en un hongo (por ejemplo Aspergillus niger), otras procariotas o eucariotas. También se puede lograr la expresión ya sea al remover o remover parcialmente la secuencia de señal. Una variedad de vectores y cartuchos de transformación y expresión adecuados para la clonación, transformación y expresión en células de hongo, levadura, bacterias, insectos y plantas se conocen por los expertos en la técnica. Típicamente, el vector o cartucho contienen secuencias que dirigen la trascripción y traducción del ácido nucleico, un marcador seleccionable , y secuencias que permiten la replicación autónoma o integración cromosómica. Los vectores adecuados comprenden una región 5' del gen que tiene controles de iniciación de trascripción y una región 3 ' del fragmento de ADN que controla la terminación transcripcional . Estas regiones de control se pueden derivar de genes homólogos o heterólogos al hospedador en tanto que la región de control seleccionada sea capaz de funcionar en la célula hospedadora. Las regiones o promotores de control de iniciación, que son útiles para impulsar la expresión de las enzimas de hidrolización de fitato en una célula hospedadora se conoce por aquellos expertos en la técnica. El ácido nucleico que codifica para la enzima de hidrolización de fitato se enlaza operablemente a través de los codones de iniciación a las regiones de control de expresión seleccionadas para la expresión efectiva de esta enzima. Una vez que se construyen cartuchos adecuados, se usan para transformar la célula hospedadora. En casos donde se usen vectores de expresión de planta, la expresión de una secuencia que codifica para fitasa se puede impulsar por cualquiera de varios promotores. Por ejemplo, los promotores virales tal como los promotores 35S y 19S de CaMV (Brisson et al (1984) Nature 310:511 514) se pueden usar solos o en combinación con la secuencia guía omega a partir de TMV (Takamatsu et al (1987) EMBO J 6:307-311). Alternativamente, los promotores de planta tal como la subunidad pequeña de RUBISCO (Coruzzi et al (1984) EMBO J 3:1671-1680; Broglie et al (1984) Science 224:838-843); o los promotores de choque térmico (Winter J y Sinibaldi RM (1991) Results Probl Cell Differ 17:85-105) se pueden usar. Estas construcciones se pueden introducir en células de planta por transformación de ADN directa o transfección mediada por patógenos. Para revisiones de estas técnicas, ver Hobbs S or Murry LE (1992) en McGraw Hill Yearbook of Science and Technology, McGraw Hill, New York, N.Y., pp 191-196; or Weissbach and Weissbach (1988) Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press, New York, N.Y. , pp 421-463.

Los procedimientos de transformación generales se enseñan en Current Protocols In Molecular Biology (vol . 1, editado por Ausubel et al., John Wiley & Sons, Inc. 1987, Capítulo 9) e incluyen métodos de fosfato de calcio, transformación usando PEG y electroporación . Para Aspergí llus y Trichoderma, se pueden usar PEG y transformación de protoplastos mediada por calcio (Finkelstein, DB 1992 Transíormation . In Biotechnology of Filamentous Fungi . Technology and Products (eds by Finkelstein & Bill) 113-156. La electroporación de protoplastos se describe en Finkelstein, DB 1992 Transíormation . In Biotechnology of Filamentous Fungi. Technology and Products (eds by Finkelstein & Bill) 113-156. El bombardeo de microinyección en conidios se describe en Fungaro et al. (1995) Transíormation of Aspergillus nidulans by microproj ection bombardment on intact conidia, FEMS Microbiology Letters 125 293-298. La transformación mediada por agrobacterias se describe en Groot et al. (1998) Agrobacterium tumefaciens-mediated transíormation of filamentous fungi, Nature Biotechnology 16 839-842. Para la transformación de Saccharomyces, la transformación mediada por acetato de litio y PEG y transformación de protoplasto mediada por calcio así como técnicas de electroporación, se conocen por aquellos expertos en la técnica.

Las células hospedadoras que contienen la secuencia de codificación para una enzima de hidrolización de fitato de la presente invención y expresan la proteína se puede identificar por una variedad de procedimientos conocidos por aquellos expertos en la técnica. Estos procedimientos incluyen de manera enunciativa y sin limitación hibridación ADN-ADN o ADN-ARN y bioensayo de proteína o técnicas de inmunoensayo que incluyen tecnologías basadas en membrana, basadas en solución o basadas en circuito para la detección y/o cuantificación del ácido nucleico o proteína. También se debe señalar que la invención contempla la expresión in vitro de las enzimas de fitasa descritas en la presente. En una modalidad de la presente invención, una secuencia de polinucleotido que codifica para una enzima de hidrolización de fitato derivada de Penicillium hordei (ATCC No. 22053) se aisla y expresa en Aspergillus niger, y en otra modalidad se expresa en Aspergillus nidulans. La fitasa expresada entonces se puede recuperar, por ejemplo, como se describe a continuación. La fitasa de la invención se puede recuperar a partir del medio de cultivo o de los lisados de las células hospedadoras. Si está unida a la membrana, se puede liberar de la membrana usando una solución detergente adecuada (por ejemplo Triton-X 100) o por escisión enzimática. Se pueden interrumpir células empleadas en la expresión de fitasa por varios medios físicos o químicos, tal como un ciclo de congelación-descongelación, tratamiento con sonido, disrupción mecánica o agentes de lisis celular. Se puede desear purificar la fitasa a partir de proteínas o polipéptidos de células recombinantes . Los siguientes procedimientos son ejemplo de los procedimientos de purificación adecuados: por fraccionamiento en una columna de intercambio iónico; precipitación con etanol HPLC de fase invertida; cromatografía en sílice o en una resina de intercambio catiónico tal como DEAE; cromatoenfoque ; SDS-PAGE; precipitación con sulfato de amonio; filtración en gel usando, por ejemplo, Sephadex G-75; columnas de proteína A-sefarosa para remover contaminantes; y columnas de quelación de metales para unir las formas marcadas en el epítope de la fitasa. Se pueden emplear varios métodos de purificación de proteína y estos métodos se conocen en la técnica y describen por ejemplo en Deutscher, Methods in Enzymoloqy, 182 (1990); Scopes, Protein Purification : Principies and Practice, Springer-Verlag, New York (1982). El (los) paso(s) de purificación seleccionados dependerán por ejemplo de la naturaleza del proceso de producción usado y la forma particular de la fitasa producida.

V. Aplicaciones de enzimas de hidrolización de fitato La fitasa y derivados de la misma como se enseña en la presente se puede usar en una variedad de aplicaciones donde es deseable separar el fósforo del fitato. Se exponen a continuación varias aplicaciones de ej emplo . Por ejemplo, la invención proporciona el uso de células bacterianas ? esporas capaces de producir fitasa de acuerdo a la invención como un producto microbiano de alimentación directa o probiótico. La modalidades preferidas para los usos son Aspergillus sp. productor de fitasa de la invención. Además, la invención contempla el uso de la fitasa como se describe en la presente en alimento o alimentación para animales. La presente invención proporciona alimento o alimentación para animales que incluye fitasa como se describe en la presente. De manera preferente, el alimento o alimentación para animales comprende fitasa como un aditivo que es activa en el tractodigestivo , 'de manera preferente en el buche y/o intestino delgado, del ganado, tal como aves de corral y cerdos, y animales de granjas acuáticas incluyendo peces y camarones. Este aditivo también es de manera preferente activo en el alimento o procesamiento de alimentos. La invención proporciona adicionalmente alimento o alimentación para animales que comprende células o esporas capaces de expresar fitasa como se describe en la presente . Aún además, la presente invención contempla un método para la producción de un alimento o alimentación para animales, caracterizado en que la fitasa de acuerdo con la invención se mezcla con alimento o alimentación para animales. La fitasa se adiciona como un producto seco antes del procesamiento o como un líquido antes o después del procesamiento. De acuerdo a una modalidad, en donde se usa un polvo seco, la enzima se diluye como un líquido sobre un portador seco tal como grano molido. La presente invención también proporciona un método para la producción de un alimento o alimentación para animales, caracterizado en que las células y/o esporas capaces de expresar fitasa de acuerdo con la invención se adicionan al alimento o alimentación para animales. Adicionalmente, la presente invención proporciona el uso de la fitasa descrita en la presente con o sin fosfatasas adicionales en la producción de inositol y fosfato inorgánico, y compuestos intermedios de fitato. También se proporciona un método para la reducción de niveles de fósforo en el abono del animal, caracterizado en que un animal se alimenta con una alimentación para animales de acuerdo con la invención en una cantidad efectiva al convertir el fitato contenido en la alimentación para animales. La fitasa y los compuestos intermedios derivados de fitato de la invención también se pueden usar en la molienda en número de granos, en productos de cuidado personal y limpieza, y en procesamiento textil. Los siguientes ejemplos se ofrecen para propósitos ilustrativos únicamente, y no se proponen para limitar el alcance de la invención de ningún modo. Todas las referencias de literatura y patentes citadas en la presente especificación se incorporan de este modo como referencia en su totalidad.

Ej emplos : Ejemplo 1 Evidencia de actividad de hidrolización de fitato en cultivo líquido Se cultivan P. piceum (ATCC No. 10519) y P. hordei (ATCC No. 22053) en medios definidos que contienen varias concentraciones de fosfato orgánico y características de crecimiento y producción de fitasa se valoran y comparan. Se usaron suspensiones de esporas (2x10 esporas /mi con punto final) par inocular un medio mínimo (Vogels) donde la concentración de fosfato se alteró para ver cómo esto afectará la producción de fitasa y crecimiento. Se cultivaron cultivos en 50 mi del medio en un cultivo de matraz agitado a 25°C (P. hordei) o 30°C (P. piceu ). Se recolectaron los cultivos a 24, 48, 72 y 96 horas. Los sobrenadantes de cultivo se valoraron para la actividad de fitasa usando el método de Fiske y SubbaRow. Se determinó el crecimiento por el peso seco (P. hordei) o lecturas de OD (P. piceum). 1A. Efecto de diferentes condiciones de medio en el crecimiento y morfología La serie de curvas de crecimiento de Penicillium que se produjeron, tal como la curva de crecimiento de P. piceum de la Figura 3 y la curva de crecimiento de P. hordei de la Figura 4, contemplaron el efecto de P. disponible en el medio en el crecimiento y producción de fitasa. Con interés particular a P. piceum, cuando el nivel de P se redujo a 0.57 mM (1/64 P de la curva de crecimiento [Figura 3]), se observaron cambios morfológicos en el crecimiento del hongo que se asocian con una condición acentuada (por ejemplo, fragmentación micelial, sedimentación, crecimiento heterogéneo y una apariencia total de un color amarillo pálido). Esta cepa fisiológica se reveló a la aparición de actividad de fitasa en un punto en la curva de crecimiento que se aproxima a la fase exponencial tardía (48 horas; ver Tabla 1, posteriormente). Se observó evidencia morfológica de la utilización de ácido fítico en cultivos idénticos de P bajo (0.57 mM) complementado después de 24 horas de crecimiento con fitato 1 mM como una fuente de fósforo. Los cambios morfológicos vistos sin fitato adicionado no fueron evidentes, en cambio las muestras complementadas asemejaron cultivos en medios de alta concentración de P que no fueron limitantes. Esto indica claramente que una actividad de hidrolización específica de ácido fítico se produjo de modo que P se puede suministrar al hongo en crecimiento. Sin embargo, cuando se complementó fitato mM, los cultivos no crecieron, sugiriendo que este nivel de fitato del medio quela los minerales esenciales dando por resultado un medio que no puede soportar el crecimiento y nutrición funga1. En un estudio de ejemplo de P. hordei, el hongo se cultivó en un medio que contiene • Alta cantidad de fosfato (1.14 mM) • Baja cantidad de fosfato (0.57 mM) • Baja cantidad de fosfato más fitato complementado 1 mM Se monitoreó el crecimiento durante 0, 24, 48, 72 y 96 horas por mediciones de peso seco, y las características morfológicas en respuesta a diferentes condiciones de medios también se observaron. Las observaciones principales y conclusiones son como sigue: 1. Buen crecimiento esperado en alta concentración de fosfato, morfología fungal consistente indicativa de cultivo saludable. 2. El crecimiento fue marcadamente más pobre en la condición de poco fosfato, la morfología fungal fue heterogénea con evidencia de aglomeración y fragmentación micelial. El cultivo tuvo una apariencia débilmente amarilla . 3. Cultivos similares en cuanto a (2) cuando se complementaron con fitato (el substrato) no se miraron por más tiempo bajo la misma tensión fisiológica. El crecimiento de la biomasa fue similar a la condición (1) y la morfología fungal fue la misma como para la condición de alta concentración de fosfato. 4. Las curvas de crecimiento y evidencia fotográfica de los cultivos respalda estas observaciones, y la principal conclusión total es que se estuvo viendo una actividad de hidrolización de fitato en la condición (3) que permite que el hongo tenga acceso a fosfato a partir de fitato, y de este modo circunvenga las tensiones de inanición de fosfato que el cultivo de otro modo está experimentando .

IB. Actividad de fitasa en sobrenadantes de cultivo La Tabla 1, a continuación, muestra la actividad de fitasa en los sobrenadantes de cultivo de P. piceu . También se muestra en la Tabla 1, los datos para los cultivos de A. niger, cultivados bajo las mismas condiciones en el medio Vogels 1/64 P (0.57 mM) como un control para la actividad de fitasa. Como se puede ver, los cultivos de A. niger mostraron niveles similares a los cultivos de P. piceum.

Tabla 1 Actividad de fitasa en sobrenadantes de cultivo de hongos que crecen en medios con niveles variables de P inorgánico Estas muestras comparan las actividades que se detectaron a 48 horas pos-inoculación. La actividad de fitasa se expresa como el número de xmoles de P liberados por minuto por mi de sobrenadante de cultivo. Las actividades de las muestras se calculan de los matraces de cultivo en triplicado, donde los sobrenadantes se valoraron para fitasa en duplicado. Se muestran las actividades como media ± SD, ?=ß, P. piceum* y P. piceum* * se refieren a datos de dos experimentos separados en el curso de tiempo.

De esta manera, una tensión fisiológica clara se asoció con cultivos donde se limitó el fosfato, que afecta adversamente el crecimiento y se enlaza a la aparición de la actividad de fitasa. 1C . Concentración de sobrenadantes de cultivo Evidencia adicional de la actividad de fitasa se puede esperar del sobrenadante concentrado (proteína concentrada). Por ejemplo, se pueden obtener muestras de proteína concentrada a partir de: 1. Cultivos de Penicillium de condiciones de tensión y baja concentración de fosfato (donde se espera que se exprese la fitasa), 2. Cultivos de Penicillium de alta concentración de fosfato y sin tensión, donde no se espera que se produzca fitasa, y 3. Cultivos complementados con baja concentración de fosfato y fitato complementario. Geles de SDS-PAGE teñidos con plata de estas muestras de prote na concentradas se espera que muestren un perfil de proteina que demuestre la aparición de una banda de proteína (banda de fitasa putativa) en proteína concentrada de la condición 1 (anterior) que no está presente en la condición 2. Una apariencia similar de esta banda también se espera en la condición 3 , si bien a un menor nivel . En base a la secuencia de aminoácidos de la fitasa de P. hordei, y al hecho que parece ser una enzima extracelular , el tamaño esperado de la proteína es de 50 kDa aproximadamente. Se debe señalar, sin embargo, que la modificación por glicolación en la enzima extracelular puede incrementar el peso molecular a 60-90 kDa.

Ejemplo 2 Amplificación por PCR de fragmentos de gen de fitasa 2A. Diseño de cebadores degenerados En base a alineaciones de las secuencias de aminoácidos de fitasa, publicadas, se diseñaron un intervalo de cebadores degenerados contra las regiones catalíticas y estructurales conservadas. Estas regiones incluyeron aquellas que estuvieron altamente conservadas entre las fitasas, así como aquellas conocidas como que son importantes para la estructura y función de la enzima.

En un estudio, la secuencia de aminoácidos para 4 fitasas publicadas se alinearon. Las secuencias fueron de las fitasas de: (i) A.niger (DEFINITION: A.niger phyA gene.; ACCESSION: Z16414; van Hartingsveldt , W. , et al, 1992); (ii) A. fumigatus (DEFINITION: Aspergillus fumigatus phytase gene, complete cds . ; ACCESSIO : U59804; Pasamontes, L . , et al, 1997); (iii) A.terreus (DEFINITION: Aspergillus terreus 9A1 phytase gene, complete cds.; ACCESSION: U59805; Mitchell, D.B., et al, 1997); y (iv) Myceliophtora thermophilus (DEFINITION: Myceliophthora thermophila phytase gene, complete cds.; ACCESSION: U59806; Mitchell, D.B., et al, 1997) . Se debe señalar que todas estas secuencias están públicamente disponibles del GENbank, y cada una se incorpora en la presente como referencia. Se eligieron cinco regiones particulares para cumplir los criterios anteriores, y un intervalo de cebadores directos e invertidos se diseñaron a partir de las secuencias de aminoácidos. Las secuencias específicas de aminoácidos usadas para diseñar los cebadores se resaltan en el borde negro en la alineación de la secuencia de proteína de la Figura 5. Usando el código genético para el uso de codor.es, se sintetizaron cebadores de PCR de nucleótidos degenerados por MWG-Biotech Ltd. En otro estudio, se diseñaron un par - de cebadores denotados como CSl y CS2 a partir de la secuencia publicada de aminoácidos para las fitasas phyA y phyB a partir de solo A. niger. Estos cebadores se diseñaron como sigue: • Cebador CCS1: Cebador directo (5 '-3') de la región RHGARYPT (ver Figura 1, a. a. 110-120 aproximadamente) que es el dominio de unión a fosfato de una fitasa phyA y esencial para la actividad catalítica. • Cebador CS2 : Cebador invertido de la región FT(H/Q)DEW(I/V) (ver Figura 5, a. a 335-345 aproximadamente) que fue una región de fitasa central que parece estar conservada relativamente bien. Las secuencias de cebadores son como sigue CS1: 5' CGI CAT/C GGI GCI CGI TAT/C CC 3' CS2 : 3' AAA/G TGI GTI CTA/G CTT/C ACC T/CAI 5' CS2: 5' AC/TC CAC/T TCG/A TCI TGI GTG/A AA 3' Puesto que todos los cebadores se sintetizaron en la dirección 5 '-3', el cebador invertido se hizo como se resume en negritas para CCS2. El código genético normal se usó para cambiar de aminoácido a codón' de triplete, y el código IUB normal para sitios de base mezclados se usó (por ejemplo para diseñar I para A/C/T/G). Ahora se describirán con referencia a la Figura 6 detalles adicionales con respecto al diseñó de los cebadores CCS1 y CS2. La Figura 6 muestra la secuencia de aminoácidos publicada para las fitasas phyA y phyB a partir de A. niger de los cuales se diseñaron los cebadores CS1 y CS2. De manera particular, las secuencias alineadas son de 1; Piddington et al, 1993 (Phy a and Phy b from A. niger var. awamori), 2; van Hartingsveldt et al., 1993 (Phy . a from A. niger), 3: Erlich et al., 1993 (Phy B. from A. niger). La alineación de la Figura 1 se realizó usando CLUSTAL V (Higgins D.G., et al., 1992) del paquete versión 3.5 PHYLIP. Las secuencias conservadas usadas para diseñar los cebadores degenerados CSl, CS2 se muestran. Como se puede ver de la alineación de la Figura 6 , el dominio de unión a fosfato de PhyA y PhyB está bien conservado con solo una diferencia individual de aminoácido entre PhyA (RHGARYP; van Hartingsveldt et al., 1993) y PhyB (RHGERYP; Piddington et al., 1993). El cebador degenerado CSl se diseñó complementario a esta región en la versión PhyA de la secuencia únicamente, es decir, usando RHGARYPT como la base para el diseño de cebador. Esto fue para desviar el cebador hacia un dominio de unión a fosfato tipo PhyA en este caso. La segunda región conservada, que sirve como la base para el cebador CS2 , se presenta en el punto intermedio de la secuencia de aminoácidos PhyA y PhyB. Este dominio específico de fitasa, central, conservado en PhyA (FTHDEWI) corresponde a los aminoácidos 285-291. En PhyB, la secuencia de aminoácidos (FTQDEWV) corresponde a los aminoácidos 280-286. Los cebadores degenerados CSl y CS2 amplificaron sucesivamente una región de 650 pb de P. hordei por PCR, como se describe a continuación. 2B. Amplificación por PCR de fragmentos de gen de fitasa Se usó el ADN genómico de especies de Penicillium como una plantilla para la amplificación por PCR de los fragmentos génicos de fitasa putativos usando combinaciones de los cebadores descritos anteriormente. Se llevó a cabo la PCR usando las cuentas de PCR Ready-to-go de Amersham Pharmacia. Se determinaron las condiciones por experimentos individuales, pero típicamente se corrieron treinta ciclos en un ciclador térmico Techne. Se verificó la amplificación exitosa por electroforesis de la reacción de PCR en un gel de agarosa al 1%. Un producto de PCR que se amplificó a partir de P. hordei por los cebadores CS1 y CS2 y fue del tamaño esperado correcto (650 pb) se purificó por extracción de gel usando el equipo Qiaquick Spin Gel Extraction de Qiagen. El producto de PCR purificado se ligó en el sistema comercial pGEM-T Easy vector System (Promega Corporation) para facilitar la clonación. Las reacciones de ligación se incubaron a 4°C durante la noche en un volumen total de 10 µ? que contiene 0.1 volúmenes de amortiguador 10 x ligasa y 1 µ? (1 ?.µG1) de T4-ADN-ligasa . Típicamente, se usó el ADN de inserto en la reacción en una relación molar 1-4:1 de inserto ADN de vector. Una alícuota de 100 µ? de células y XL-1 Blue de E. Coli competentes con CaCl2 se removieron de un almacenamiento a -80°C y se descongelaron en hielo para la transformación. Se adicionaron 3 µ? de mezcla de ligación a las células y la mezcla se incubó en hielo durante 20 minutos. Las células entonces se trataron térmicamente a 42 °C durante 1 minuto y se regresaron a hielo durante 5 minutos. La mezcla de transformación se adicionó a 0.9 mL del L-caldo y las células se incubaron con agitación y sin selección para permitir la expresión del producto génico de resistencia en penicilina antes de que se aplique la selección (37°C, lh) . Entonces se rociaron directamente en placas selectivas de agar alícuotas de 200, 300 y 400 µ? de este cultivo. Las placas se incubaron a 37 °C durante la noche. Se visualizaron colonias que contienen plásmidos recombinantes usando la selección de azul/blanco. Para la detección rápida de transformantes recombinantes, se preparó el ADN de plásmido de los cultivos de colonias positivas putativas (blanco). Se aisló el ADN por el método de Birnboim y Doly siguiendo el protocolo en Sambrook et al., (1989). La presencia del inserto correcto (650 pb) en el plásmido recombinante se confirmó por análisis de restricción. Se digirió el ADN con las enzimas de restricción Notl-pPstl durante la noche a 37°C y los productos digeridos se visualizaron por electroforesis en gel de agarosa. Un número de clones contuvieron el inserto de tamaño correcto y se seleccionaron para la secuenciacion manual para ver si el inserto fue un fragmento génico de fitasa. Se secuenciaron insertos usando el método de terminación de cadena de didesoxi de Sanger et al. (1977) con una forma modificada de T7-ADN-polimerasa (Sequenase versión 2.0). Las reacciones se llevaron a cabo usando los reactivos suministrados en el equipo Sequenase versión 2.0 (Amersham Life Science-United States Biochemical Corporation), siguiendo el protocolo del fabricante. La secuencia parcial de los extremos de dos clones (designados 3D y 3G) indicaron que un fragmento de gen de fitasa se ha clonado. El ADN de plásmido de ambos de estos clones se envió a MWG-Biotech Ltd. Para la secuenciacion completa de los insertos de doble hebra. 2C. Análisis de secuencia Las secuencias se analizaron por BLAST y herramientas de secuencia de traducción de proteína. La comparación BLAST a nivel de nucleótidos mostró varios niveles de homología a las secuencias de fitasa phyA publicadas. Inicialmente , las secuencias de nucleótidos se sometieron a BLAST (BLAST básico versión 2.0) al tener acceso a la base de datos de BLAST en la red mundial. El sitio de Internet usado estaba en http: /ncbi .nlm.nih.gov/cqi-bin/BLA5T. El programa elegido fue blastn, y la base de datos elegida fue nr. Se emplearon los valores de los parámetros normales/por omisión. Los datos de secuencia para los fragmentos de gen de P. hordei putativos se introdujeron como secuencia en formato FASTA y la búsqueda se sometió a BLAST para comparar las secuencias de la presente invención a aquellas que están ya en la base de datos. Los resultados regresaron para el fragmento de 650 pb y el fragmento génico EcoRI de la primera detección de biblioteca, analizada posteriormente, mostró un alto número de aciertos para los genes de fitasa de A. niger, E. nidulans, A. fumigatus y T. thermophilus . Las secuencias entonces se sometieron a una herramienta de traducción de ADN a proteína llamada máquina de proteína. Esta herramienta también está disponible en la Internet en htt : / /medkem. qu . se/edu/translat .html .. Otra herramienta de traducción adecuada se conoce como máquina de traducción, disponible en la red en htt : / /www2. ebi . ac . uk/traslate/ . Las secuencias de ADN de los fragmentos génicos de fitasa putativos de P. hordei se insertaron en el bloque de análisis, y se usó el código genético normal como la base para la traducción. Se llevaron a cabo traducciones en los tres cuadros y en las hebras directa e invertida. La secuencia traducida de aminoácidos se distribuyó en la pantalla por la herramienta de análisis como la secuencia de aminoácidos en el código de una letra. Cuando se tradujo a la secuencia de aminoácidos, los clones se mostraron que tienen 212 aminoácidos (636 pb fue el tamaño real del fragmento de gen) sin codones finalizadores . El análisis de la secuencia de aminoácidos mostró que el fragmento contuvo ambos extremos correctos (como se usa para diseñar los cebadores CS1 y CS2 , contuvo la porción de unión a P esencial (RHGARYP) y tres cisteínas que también están presentes en las secuencias publicadas de fitasa phyA. Se concluyó que el fragmento de 636 pb clonado fue un fragmento génico de fitasa phyA de P. hordei . Las alineaciones de secuencia y análisis de estas alineaciones se llevó a cabo al nivel de nucleótidos y aminoácidos usando el programa ALIGN (Alignment Editor Versión 4/97; Dominick Hepperle, Fontanestr, 9c, D016775, Neuglobsow, Alemania). Al realizar el análisis, las presentes secuencias se pegaron y se empleó el formato intercalado PHYLIP. El análisis de homología se llevó a cabo usando la sección "Analyse" del programa, y específicamente la opción titulada "análisis a distancia". Esto calcula el % de homologías y el número de diferentes sitios entre especies, usando un mínimo de dos secuencias de aminoácidos (es decir, dos "especies"). Se calcularon las homologías mínimas y máximas como el por ciento. La base para el análisis de homología se hizo como el por ciento de identidad, en el cálculo de "número de aminoácidos idénticos (o bases) dividido por el número total de aminoácidos (o bases) multiplicado por 100" para dar un valor de porcentaje. Las secuencias de aminoácidos de P. hordei se colocaron en el programa ALIGN junto con secuencias de fitasa publicadas y se llevó a cabo una alineación manual al nivel de aminoácido. Los resultados de ejemplo se muestran en la Figura 7. En la Figura 7, la secuencia denotada como "P. hordei3D" (SEQ ID NO. : ) representa la traducción deducida para el producto de PCR obtenido usando los cebadores degenerados CSl y CS2.

Ejemplo 3 Análisis Southern para producción de biblioteca El ADN genómico de P. hordei, P. piceum y A. niger se digirió con un intervalo de enzimas de restricción durante la noche a 37 °C. El ADN exitosamente digerido se corrió en un gel de agarosa al 1% en preparación para la transferencia a la membrana de nylon. Después del término de la electroforesis , el gel de agarosa se remojó durante 10 minutos en HCL 0.2M para despurinar el ADN y luego se enjuagó brevemente con ddH20. El ADN se ¦ transfirió a una membrana HybondMR-N+ (Amersham International PLC) por transferencia capilar alcalina. La transferencia se ajustó de modo que el filtro de nylon se intercaló entre el gel y una pila de toallas de papel absorbente. Una mecha de papel Whatman 3 M (Schleicher y Schuell, Dassel, Alemania) se preparó en una placa de vidrio sobre un depósito de amortiguador de transferencia (NaOH 0.4M) . El gel se invirtió en la mecha, tomando cuidado de evitar la formación de burbujas de aire, y se circundó por tiras de Nescofilm para prevenir la acción de transferencia de las toallas de papel de la derivación del gel en sus bordes. El gel se cubrió con una pieza de igual tamaño de la membrana HybondMR"N+ que se acortado en la esquina para corresponder al gel y se pre-humectó en 3XSSC. Luego, se colocaron 3-5 piezas de papel 3MM en la parte superior del filtro y la transferencia se terminó al adicionar una pila de 10 cm de papel de transferencia seguido por un peso de 0.5 kg. La transferencia se dejó durante 8-24 horas para transferir el ADN. La membrana entonces se lavó brevemente en 2xSSC a temperatura ambiente y se horneó en un horno al vacío a 80°C para fijar el ADN a la membrana. El fragmento de 633 pb de p. hordei se usó para sondear la transferencia Southern. Se marcó primeramente con el isótopo 3P por el uso del equipo de marcado de ADN de alta cebadura (Boehringer Mannheim). Se adicionó fragmento desnaturalizado en una reacción de marcado cebada, aleatoria que incorpora adenina radiomarcada . La transferencia Southern se pre-hibridizó durante 1 hora a 42 °C en 12 mL de amortiguador Easy-HHyb (Boehringer Mannheim) en un tubo de hibridización . La sonda radiomarcada se desnaturalizó y adicionó a 5 mi de amortiguador de hibridización Easy-HHyb y se dejó hibridizar durante la noche a 42 °C. Después de la hibridación, la transferencia se lavó por incubación en 40 mL 3xSSC, 0.1% de SDS durante 15 minutos a 42°C. Este lavado de baja severidad se repitió con solución de lavado fresca. Después del lavado de severidad, el lote se enjuagó en 3xSSC, se selló en un plástico claro y se expuso a una película de rayos x. Esto se dejó durante 2 horas y la película se removió. Como se muestra en la Figura 8, se observaron bandas de hibridización fuertes para las digestiones de P. hordei . En particular, la Figura 8 ilustra un gel de transferencia Southern que muestra la hibridización entre una sonda que comprende el producto de PCR obtenido usando los cebadores degenerados CSl y CS2 y varias digestiones de ADN genómico fungal; con Senda 1.- Marcador de tamaño; Senda 2.- Aspergillus niger-EcoRI; Senda 3-Penicillium piceum-EcoRI; Senda 4-Penicillium hordei-EcoRI; Senda 5-Penicillium hordei -BramHl; Senda 6-Penicillium hordei-Salt, Senda 7 -Penicillium hordei-Kpnl , y Senda 8-Penicillium hordei-Sacl . Estos resultados indican que el fragmento de 636 pb se puede usar como una sonda para la detección de biblioteca .

Ejemplo 4 Aislamiento de una secuencia de polinucleótido a partir del qenoma de P. hordei que codifica para una fitasa 4A. Generación de la biblioteca genomica de P. hordei y detección Después del análisis de hibridación Southern, se decidió hacer una biblioteca genomica parcial de P. hordei a fin de probar y clonar el gen de fitasa de longitud completa. Una biblioteca de plásmido restringido en tamaño que selecciona como objetivo el fragmento de EcoRI de 4.4Kb como se estima del análisis Southern se generó. Se corrió el ADN genómico de P. hordei digerido con EcoRI en un gel de agarosa al 1.25% Los fragmentos digeridos en aproximadamente 4.4 Kb se extrajeron del gel, y se purificaron por Glass- ax (Gibco-BRL, Escocia). Los fragmentos genómicos purificados se usaron en una reacción de ligación de disparo con el vector Psk II Bluescript linealizado con EcoRI (Stratagene) . El vector primeramente se desfosforiló antes de la ligación, y la reacción de ligación se llevó a cabo para 14°C durante la noche. La biblioteca se produjo por transformación de células ultracompetentes XL-10 Gold de E. Coli (Stratagene) . Se removieron alícuotas de 100 µ? de las células del almacenamiento a -80°C y se descongelaron en hielo para la transformación. Se adicionaron 4 µ? de ß-mercaptoetanol a las células en hielo. Se adicionó 3 µ? de la mezcla de ligación a la mezcla y la mezcla se incubó en hielo durante 20 minutos. Las células entonces se trataron térmicamente a 42 °C durante 30 segundos y se regresaron a hielo durante 2 minutos. La mezcla de transformación se adicionó a 0.9 mi de NZY-caldo, y las células se incubaron con agitación y sin selección para permitir la expresión del gen de resistencia a ampicilina. Las células transformadas se colocaron en placa en placas de LB-agar de selección azul/blanco, y se dejaron incubar durante la noche a 37 °C. Se vieron un total de 728 colonias en las placas, 450 de las cuales eran blancas. Las colonias se dejaron en filtros de nitrocelulosa por el método de Maniatis (10% de SDS-lisis, 3 min; desnaturalización con NaOH 1.5 , 5 min; TrisHCl 1.5M-neutralización, 5 min; 3xSSC-enjuague, 5 min). Los filtros entonces se hornearon durante 2 horas a 80°C bajo vacío para fijar el ADN. La biblioteca se detecto con la sonda de 636pb radiomarcada con 2P de la misma manera como para la hibridación Southern. Después de la hibridación, los filtros se lavaron dos veces en 3xSSC, 0.1% de SDS, 42°C 15 minutos. Los filtros entonces se enjuagaron en 3xSSC, se sellaron en plástico y se expusieron a película de rayos X durante la noche a -80°C. Se vieron en la película cinco puntos de hibridización positivos. Estos se alinearon a las placas de agar que contiene los transformantes. Los puntos de hibridización correspondieron hasta más de una colonia individual en las placas de agar. Todas las colonias en el radio del punto de hibridización se recolectaron usando asas estériles y sus asas estériles se usaron para inocular 2 mi del caldo Luria. Los cultivos se cultivaron a 37 °C durante 2 horas. Las diluciones de los cultivos se hicieron a partir de 10"1 y 10"5 y 100 µ? de cada muestra se colocaron en placas de agar LB-amp y se incubaron durante la noche a 37°C. Las placas que tienen entre 10 y 150 colonias entre ellas se eligieron para seguir a una detección secundaria. Se hicieron levantamientos de colonia como antes, y los filtros se procesaron usando los mismos procedimientos. Se preparó la zona marcada con 32P fresca y los filtros se detectaron de la misma manera como se resume previamente. Se llevaron a cabo lavados de severidad usando 2xSSC, 0.1% de SDS a 42°C durante 15 minutos. Entonces se enjuagaron los filtros en 2xSSC, se sellaron en plástico y se expusieron a una película de rayos x durante 2 horas. La película revelada mostró un número muy alto de puntos de hibridización fuertes, consistentes con amplificación de las colonias positivas de la detección primaria. La película entonces se alineó a las placas y los puntos entonces se co-coordinaron para ver si correspondieron a las colonias aisladas individuales. Los mejores 12 positivos que correspondieron a las colonias individuales se recolectaron y usaron para inocular el caldo Luria para las preparaciones de ADN de plásmido. El ADN de plásmido se purificó por el equipo Qiaspin Mini-Prep (Qiagen) y el análisis de restricción se llevó a cabo para estimar el tamaño de los insertos. Los doce clones dieron el mismo perfil de restricción que sugirió un tamaño de inserto entre 3-4Kb. Seis de los clones se enviaron a MWG-Biotech Ltd para la secuenciacion parcial para determinar si eran el fragmento gen/gen correcto. El análisis de secuencia mostró que tres de los clones contuvieron un fragmento de gen de una fitasa phyA, pero solo en un extremo. Estos tres clones entonces se enviaron para obtener la secuenciacion completa hecha en los insertos. El análisis de secuencia en la secuencia completa para estos clones indicó que los tres clones fueron la misma cosa y que codificaron para 355 aminoácidos que corresponde a aproximadamente 80% del gen de fitasa phyA (ver Figura 7, línea 1, denotado "P hordei"). Fue evidente que hubo un sitio interno de EcoRI >en el gen en una posición aproximadamente 300-400 pb corriente abajo del inicio del gel . 4B . Comparación de porcentaje de identidad entre fitasas fúngales El producto polipeptídico deducido del fragmento de gen de fitasa clonado se usó para el análisis de homología con las fitasas publicadas. El análisis mostró identidades de aproximadamente 42-56% (ver Tabla 2, posterior) y junto con el análisis de la secuencia traducida, proporcionó evidencia que el fragmento génico clonado fue una fitasa phyA.

Tabla 2 Comparación de porcentaje de identidad entre fitasas fúngales (editor ALIGN) Especies P. A. A. A. M. hordei niger fumigatus terreus thermophilus P. hordei 55.6 56.2 52.5 42.4 A. niger 67.4 62.1 44.9 A. fumigatus 61.7 47.6 A. terreus 43.7 M. thermophilus Nota : Comparación basada en aproximadamente 80% de la secuencia deducida de aminoácidos de fitasa de P. hordei (es decir, porción N-terminal [-140 a. a.] ausente). 4C. Generación y detección de biblioteca genómica restringida en tamaño, basada en Salí para aislar el resto del gen de fitasa. A fin de aislar el 20% restante estimado del gen de fitasa de P. hordei, se decidió usar una segunda enzima de restricción para generar una segunda biblioteca genómica parcial para aislar el extremo 5' del gen, e intentar entonces subclonar los dos fragmentos conjuntamente. Los sitios de reconocimiento de endonucleasa de restricción presentes dentro de la secuencia de fitasa clonada se identificaron usando Webcutter. De interés particular son los sitios para enzimas que se usaron en el análisis Southern ilustrado en la Figura 8. Se encuentra que estas enzimas (Kpnl, Sacl, BamHI y Salí) cortan todas dentro de la secuencia de fitasa a 48 pb, 75pb, 486 pb y 660 pb, respectivamente del extremo 5' del fragmento clonado. En análisis Southern de las digestiones del ADN genómico de P. hordei (Figura 8) mostró que el fragmento de BamHI es muy grande (aproximadamente 8 Kb) y sería difícil clonar en una biblioteca basada en plásmido. El grado de hibridación con la banda de Kpnl no es suficientemente fuerte para una detección de biblioteca, y la presencia de dos bandas en la senda Sacl probablemente va a complicar el proceso de detección. Se decidió generar una biblioteca restringida en tamaño en base a Salí de la misma manera como antes para aislar a banda Salí de 1.8 Kb. Con la presencia de un sitio Salí conocido en una posición de aproximadamente 120 pb en la dirección 3' del extremo de la secuencia de sonda, probablemente es que haya otro sitio Salí en una posición corriente arriba del inicio del gen de fitasa. La biblioteca se hizo como antes en pBluescript SKII, y se detectó usando la misma sonda de 636 pb. Una selección de colonias de hibridización positivas se eligieron y alinearon a colonias en las placas. Las 12 correspondieron a colonias aisladas individuales, y se recolectaron para las preparaciones de ADN de plásmido. El análisis de restricción mostró que solo tres clones tuvieron insertos, todos los cuales fueron de aproximadamente 1.8 Kb. Estos dos clones (CS112, CS114) entonces se enviaron a MWG-Biotech para la secuenciación completa. La secuencia deducida de aminoácidos mostró que los clones contuvieron secuencia que tiene porciones que corresponden a fitasa phyA, pero CS112 tuvo un número alto de errores de secuenciación. El análisis del clon CS114 mostró que hubo un traslape de 450 pb entre los fragmentos genómicos del gen de fitasa. Un codón de inicio propuesto se identificó, así como un intrón en 5 ' y también se identificaron en CS114 los elementos reguladores en la dirección 5'. 4D. Amplificación del gen de fitasa contiguo para expresión heteróloga Se produjo una secuencia de fitasa compuesta de los dos clones genómicos CS114 y CS101 (Figura 9) y se usó para diseñar un número de cebadores en la dirección 5 'y la dirección 3' que se podrían usar para amplificar una secuencia e gen de fitasa continua. La amplificación por PCR también se diseñó para facilitar la clonación y expresión del gen de fitasa completo en el vector de expresión heterólogo pGAP-PG, una construcción de 5.1 Kb proporcionada por Genecor International, Inc. (ver Figura 11). Hay dos sitios de enzima de restricción (EcoRV y Agel) dentro del sitio de clonación múltiple de pGAPT-PG que no está presentes dentro de la secuencia de gen de fitasa. Se diseñaron varios cebadores de flanqueo de 5' y 3' que usan la secuencia de gen de fitasa y se modificaron para incluir los sitios de reconocimiento de enzimas de restricción para estas enzimas (Tabla 3).

Tabla 3 Secuencias de cebadores específicos de fitasa como se diseña a partir de la secuencia de gen de phyA compuesto de los clones CS101 y CS114 F indica un cebador directo (5'? 3') en la hebra positiva; R indica un cebador invertido en la hebra negativa. Los sitios de reconocimiento de enzimas de restricción que se diseñan en las secuencias de cebador facilitan la clonación en el vector de expresión pGAPT-PG están subrayados y resaltados en negritas. Las regiones de flanqueo en la dirección 5' y en la dirección 3' usadas para diseñar los cebadores se eligen arbitrariamente en aproximadamente 100 pb en la dirección 5' del codón de ATG (inicio) y en la dirección 3' del codón de TAG (finalizador) , respectivamente. La secuencia génica usada también se eligió para contener un equilibrio igual de bases como sea posible . La amplificación del gen de fitasa por PCR se intentó usando ADN genómico del P. hordei y combinaciones de estos cebadores. La PCR debe amplificar una región de aproximadamente 1.7 kb, que corresponde al gen de fitasa de longitud completa. La Figura 12 muestra los resultados de la PCR revisada usando los cebadores CS201 ó CS202 y CS203. Una banda de tamaño correcto se puede ver para la combinación CS201-CS203, pero la presencia de múltiples bandas de bajo peso molecular también se puede ver. No se puede ver amplificación usando CS202-CS203 para estas condiciones aunque se pueden ver mandas muy débiles en aproximadamente 1.7 kb a la temperatura de fijación de 50°C (no mostrada). Se produjo una fuerte banda para CS201/CS202 y CS204 en aproximadamente 700 pb (no mostrado). El producto deseado visto en la Figura 12 producido por amplificación con los cebadores CS201-CS203, se clonó en el vector pTT y varios clones que contuvieron el tamaño correcto del inserto se seleccionaron para la secuenciación (CS158 y CS167).

La Figura 10 ilustra la secuencia de ácido nucleico 5 ' /N-terminal y la secuencia 3 ' /C-terminal del clon CS158. La secuencia de aminoácidos, deducida, preliminar para la fitasa se muestra en negritas. La secuencia del clon CS167 se analizó y no se reconoció como fitasa. El análisis del clon CS158 reveló algunas características interesantes. La secuencia deducida de aminoácidos para CS158 a partir del extremo 3' del clon demostró alta homología con la fitasa de CS101. Sin embargo, la secuencia generada del extremo 5' difirió substancialmente de CS114. Esto fue particularmente para la secuencia que corre en la dirección 5' de la porción de dominio de unión a fosfato (RHGARY) . Se señala que la secuencia de CS158 en el extremo 5' fue más similar a las secuencias publicadas de fitasa, y contuvieron varias porciones estructurales clave y aminoácidos conservados que no estuvieron presentes en la secuencia de aminoácidos SC114 N-terminal. Se concluyó que los clones CS101 y CS114 originados de 2 diferentes genes, y que CS158 fue la fitasa apropiada de longitud completa. Hay varios errores de secuenciación evidentes en la secuencia de CS158. Esto es probablemente debido al hecho que la Taq polimerasa se usó en la amplificación de la banda de 1.7 kb mostrada en la Figura 12. Se diseñaron dos nuevos cebadores de 5 ' a partir de la nueva secuencia para re-amplificar el gen de fitasa para la expresión. Se seleccionaron dos regiones en la dirección 5 ' de los codones de inicio putativos en la nueva secuencia de fitasa de CS158, y se modificaron para incluir los sitios de reconocimiento de EcoRV para facilitar la clonación en pGAPT-PG (Tabla 4).

Tabla 4 Secuencias de cebadores específicos de fitasa como se diseña a partir de la secuencia de gen de phyA amplificada por Taq-polimerasa de clon CS158 indica el cebador directo (5'· 3') en la hebra positiva, s sitios de reconocimiento de enzimas de restricción que se diseñan en las secuencias cebadoras para facilitar la clonación en el vector de expresión pGAPT-PG se subrayan y resaltan en negritas. Las regiones de flanqueo en la dirección 5' usadas para diseñar los cebadores se eligieron de forma arbitraria en aproximadamente 50-70 bp en la dirección 3' de un ATG propuesto (inicio). La secuencia génica usada también se eligió para contener un equilibrio igual de bases como sea posible. La amplificación por PCR del ADN genómico de P. hordei se llevó a cabo usando una combinación de estos cebadores de 51 y los cebadores de 3 ' diseñados de CS101 (Tabla 3), y usando una ADN-polimerasa de alta fidelidad, Pfu, para reducir al mínimo el error de la expresión del gen de fitasa (Figura 13). Esta polimerasa fue ADN-polimerasa Pfu (Stratagene) y viene como parte del equipo de ADN-polimerasa Pfu para PCR. Para estas reacciones, se mezclaron conjuntamente el amortiguador de reacción, dNTP, ADN objetivo y cebadores, y 2.5 unidades de polimerasa Pfu se adicionaron en un volumen final de reacción de 50 µ? . Después de la amplificación, se analizó una alícuota de 5 µ? de la mezcla de reacción por electroforesis en gel. Los cebadores diseñados de la nueva secuencia en combinación con el cebador CS204 produce un producto intenso individual en el tamaño esperado (1.7 Kb) . Este fragmento se clonó directamente en el vector pCR-Blunt II TOPO ( Invitrogen) , y un número seleccionado de clones se analizó para confirmar la presencia del inserto correcto. (Productos de PCR de extremos romos que se generaron por ADN-polimerasa PFU se clonaron en el equipo de clonación Zero BluntMR TOPO^PCR (Invitrogen) . Este vector contiene un sitio MCS y un gen de canamicina para la resistencia a antibióticos, pero también permite la selección en base a la disrupción del gen letal de E. coli, ccdb, como lo opuesto a la selección por azul-blanco. El producto de PCR purificado (50-200 ng) se adicionó a 1 µL del vector pCR-Bluntll-TOPO y el volumen de reacción se llevó a 5 fiL con agua estéril. Esto se mezcló suavemente para dejar incubar durante 5 minutos a temperatura ambiente. Se adicionaron 1 µ? de la Solución 6 x TOPO Cloning Stop, la reacción se dejó en hielo o se congeló a -20°C durante hasta 24 horas para la transformación) . La integridad de los sitios EcoRV y Agel manejados también se confirmó por este análisis. Varios clones, CS212 y CS213 se prepararon y secuenciaron . El análisis de secuencia, confirmó la presencia de un gen de fitasa phyA de longitud completa. Este gen se toma adelante para la expresión en un sistema heterólogo, y la caracterización bioquímica subsecuente de la enzima. 4E. Análisis de secuencia de fitasa de P. hordei CS213 representa la secuencia de fitasa de longitud completa de P. hordei. La secuencia genómica para este clon se puede ver en la Figura 1A. La secuencia deducida de aminoácidos para la fitasa P. hordei se puede ver en la Figura 2.

Se hizo una alineación de la secuencia de P. hordei y las fitasas publicadas y el análisis de homología se hicieron, en una base de identidad de %. Los resultados de esto se pueden ver en la Tabla 4 a continuación.

Tabla 4. Comparación del % de identidad entre las fitasas Los números en las regiones izquierda/ fondo indican el número de diferentes sitios entre dos especies. Homología mínima: 44.0 %, Homología Máxima: 68.3 % Ejemplo 5 Clonación, expresión de caracterización de fitasa a partir de P. hordei Se decidió intentar la sobre-expresión del gen de fitasa en un hospedador heterólogo para producir suficiente proteína para llevar a cabo la caracterización de la enzima . 5A. Clonación del gen de fitasa en el vector de expresión y transformación en A. nidulans El gen de fitasa de longitud completa que se amplificó con una ADN polimerasa de alta fidelidad, se produjo usando cebadores que se manejaron para contener dos sitios de enzima de restricción (EcoRV, Agel). Estos sitios se usaron para facilitar la clonación en el vector de expresión pGAPT-PG (Figura 11) . Los clones de fitasa CS212 y CS213 se digirieron con estas enzimas y produjeron en un fragmento de inserto individual de 1.7 Kb. También se digirió pGAPT-PG con estas enzimas y se linealizó. El fragmento de gen de fitasa se ligó al vector de expresión y varios transformantes se produjeron. Se analizó una selección de estos clones para confirmar la presencia del inserto. Los clones de fitasa entonces se usaron para transformar esporas abultadas de A. nidulans por electroporación . La transformación de la cepa FGSC A. niger y FGSC A1032 de A. nidulans por electroporación se adaptó del protocolo de O. Sánchez y J. Aguirre desarrollado para A. nidulans. Se inocularon 50 mi del medio YG (0.5 % de extracto de levadura, 2 % de glucosa, complementado con uridina 10 mM y uracilo 10 mM) a 107 esporas/mL con la suspensión apropiada de esporas. Los cultivos se cultivaron durante 4 horas a 25°C a 300 rpm en agitador giratorio. Las esporas abultadas se recolectaron por centrifugación a 4000 rpm durante 5 minutos a 4°C. Las esporas se redispersaron en 200 mL de agua estéril enfriado con hielo y se centrifugaron a 4000 rpm durante 5 minutos a 4°C. El sobrenadante se vertió y las esporas se redispersaron en 12.5 mi de medio YED, pH 8.0 (1 % de extracto de levadura, 1 % de glucosa, HEPES 20 mM) y se incubaron durante 60 minutos a 30°C a 100 rpm en agitador giratorio. Las esporas se recolectaron por centrifugación a 4000 rpm durante 5 minutos, luego se redispersaron en 1 mi de amortiguador EB enfriado con hielo (tris-HCl 10 mM, pH 7.5, sacarosa 270 mM, acetato de Litio 1 mM) a una concentración de 109 conidia.mL1 y se mantuvieron en hielo. Se mezclaron 50 µ? de la suspensión de esporas abultadas con 1 a 2 µg de ADN en un volumen total de 60 µ? en eppendorfs estériles y se mantuvieron en hielo durante 15 minutos. La suspensión se transfirió a un tubo de electroporacion. La electroporacion se llevó a cabo en un dispositivo de electroporacion BioRad (ajustes 1 kV, 400 W, 25 µ?) . Se adicionó 1 mi de YED enfriado con hielo a la suspensión después de la electroporacion y la mezcla combinada se transfirió a un tubo Falcon de 15 mL estéril pre-enfriado y se mantuvo en hielo durante 15 minutos. Esto entonces se incubó a 30°C durante 90 minutos a 100 rpm en agitador giratorio, con los tubos en una posición horizontal. Las esporas se colocaron en placa y se observaron los transformantes después de 36-48 horas. El ADN de plásmido circular se usó en cada caso, y se produjeron 15 transformantes para los clones que se originan de CS213, en tanto que se produjeron solo 2 de aquellos que se originan de CS212. Se obtuvieron la cepa FGSC A767 de A. niger y la cepa FGSC A1032 de A. nidulans a partir del Fungal Genetics Stock Center, University of Kansas Medical Center, 3901 Rainbow Boulevard, Kansas City, Kansas, USA. 5B. Caracterización preliminar de transformantes de A. nidulans En total, se seleccionaron 10 transformantes de A. nidulans para el análisis adicional (CS212-1, CS213-1 a 9) . Se usaron las esporas de cada uno de estos transformantes para inocular medios selectivos, y se hicieron suspensiones de esporas de cada clon. Estas se usaron para inocular cultivos líquidos de los transformantes que se detectaron para la actividad de fitasa. Se cultivaron cultivos durante 72 horas y los sobrenadantes se recolectaron. Las muestras se desalaron en columnas PD-10 y las muestras de proteína se eluyeron en acetato de sodio 0.25 M. Se llevaron a cabo análisis de fitasa a las condiciones normales (pH 5.5, 37 °C durante 30 minutos). Dos de los clones (CS213-2, CS213-4) demostraron actividad de fitasa en el sobrenadante de cultivo. CS213-2, tuvo una actividad de fitasa registrada en 0.12 mmol de Pi liberado por min por mL del sobrenadante de cultivo, en tanto que el transformante CS213-4 tuvo una actividad de 0.08 mmol de Pi liberado por min por mL . Estos se tomaron adelante para análisis adicional. 5C. Tiempo de expresión máxima de fitasa en cultivo líquido . A fin de valorar cuando el nivel de producción de fitasa estaba en su punto más alto para la caracterización bioquímica subsecuente, se generó una serie de cultivos líquidos CS213-2 y CS213-4 durante un periodo de 2 días a 7 días. Los cultivos se inocularon con suspensión de esporas de los transformantes apropiados, y se recolectaron cada día durante este periodo. Los sobrenadantes de cultivo se procesaron como es normal, y el sobrenadante de cultivo de salado se valoró bajo condiciones normales de fitasa. La Tabla 5 resume los resultados de' estos ensayos. La actividad de fitasa se ve durante el periodo completo, pero la expresión está en su punto más alto en el periodo de tres días.

Tabla 5 Actividad de fitasa en sobrenadantes de cultivo de transformantes durante el tiempo Se recolectaron cultivos líquidos en cada punto de tiempo, se desalaron y eluyeron en acetato de sodio 0.25 mM, pH 5.5. Se llevaron a cabo ensayos de fitasa bajo condiciones normales (pH 5.5, 37°C, 30 min) en duplicado. La actividad se expresa en unidades de fitasa por mL de sobrenadante de cultivo (µ???? de Pi liberado min-1 mL-1) .

También se ensayó A. nidulans no transformado a través de estos puntos" de tiempo como un control. No se detectó actividad de fitasa. Las muestras de proteína de las muestras de sobrenadante seleccionadas (día 4 y día 6) , tanto antes como después de salado se analizaron por SDS-PAGE . Los geles teñidos por Coomasie no mostraron bandas para algunas de las muestras usadas. Esto infiere que el nivel total de proteína segregada en el medio fue bajo. Los geles teñidos con plata también no mostraron evidencia de alguna banda de proteína. 5D. Análisis Southern de transformantes Aunque hubo evidencia que el gen de fitasa de P. hordei sea clonado exitosamente en el vector de expresión pGAPT-PG, y que la expresión de una enzima activa se ha logrado, esta hasta ahora carente de evidencia molecular. Se hicieron preparaciones de ADN genómico a partir de CS213-2 y CS213-4 de A. nidulans transformados, y el hospedador original no transformado. El ADN se digirió con EcoRV, puesto que no hay un sitio de EcoRV interno dentro del gen de fitasa de P. hordei, y el análisis de hibridación Southern de los transformantes se llevó a cabo. Las transferencias Southern se analizaron con la sonda de fitasa de 650pb a partir de P. hordei (Figura 14) . Se pueden ver bandas de hibridación fuertes individuales para ambos de los transformantes CS213-2 y CS213-4, bajo condiciones de severidad media alta (3xSSC). No hay evidencia de ninguna otra banda de hibridación, entonces se puede concluir que esto muestra una copia individual del gen de fitasa en A. nidulans transformado. No se pueden ver bandas de hibridación en la muestra no transformada, indicando que no hay homología entre la fitasa de P. hordei y cualquier fitasa presente en el genoma de A. nidulans . 5E. Caracterización bioquímica de fitasa de P. hordei Para probar que el gen clonado representa una actividad específica de fitasa, y para caracterizar esa actividad, se llevó a cabo un intervalo de ensayos bioquímicos en la enzima sobreexpresada . La caracterización preliminar ha indicado que el gen esta produciendo una actividad de hidrolización de ácido fítico. Este análisis se extendió para examinar la actividad a diferentes pH, temperaturas y contra diferentes sustratos. El transformante CS213-4 se tomó más adelante para estos análisis y los cultivos se recolectaron en 3 días. Con ácido fítico como el sustrato, la enzima mostró actividad entre pH 3.0 y 7.0 (Figura 15). La muestra purificada de la enzima se desaló del sobrenadante de cultivo, y se eluyó en acetato de sólido 0.025 mm, pH 5.0. Esto entonces se adicionó al sustrato que se hizo en soluciones de los siguientes amortiguadores: pH 3.0: glisina-HCl 0.4 M, pH 4.0: acetato de Sodio 0.4M, pH 5.0: acetato de Sodio 0.4M, pH 6.0: imidazol-HCl 0.4M, pH 7.0: Tris-HCl 0.4M, pH 8.0: Tris-HCl 0.4M, pH 9.0: Tris-HCl 0.4M. Hubo un óptimo claro a pH 5.0 (240 unidades por mL de sobrenadantes), con un amplio resalto de actividad de 5.0 hacia abajo a 6.0. Cuando se usó 4-nitrofenil-fosfato como el sustrato, hubo muy poca actividad vista, indicando un alto nivel de especificidad para el sustrato de ácido fitico. La actividad más alta contra este sustrato pareció ser a pH 3.0 pero aun esto es 25 % de la actividad contra ácido fitico a este pH. El perfil de temperatura de la enzima se caracterizó usando amortiguador de pH 5.0, sobre un intervalo de temperaturas, este tiempo solo usando ácido fitico como el sustrato (Figura 16). La fitasa de P. hordei mostró actividad de 30°C a 85°C, pero tubo un óptimo claro de temperatura a 44°C. La enzima tuvo una actividad mucho mayor a temperaturas más ambientes, y solo perdió 22 % de la actividad relativa entre 44°C y 37°C. Puesto que el nivel total de la proteína producida fue muy bajo, y los ensayos se realizaron en la proteína total del sobrenadante, es difícil de determinar la actividad específica de esta fitasa. La proteína total promedio para estas muestras fue de 8 µg ml-1 que dio una actividad específica' proyectada de 240000 unidades por mg de proteína. También se llevaron a cabo estudios de estabilidad preliminar en la fitasa. Las muestras de la proteína del día 3 se dejaron a -20°, 4°C y 37°C durante la noche, y luego se ensayó bajo condiciones normales. No se determinó actividad residual. También las muestras se expusieron a 85°C durante 20 minutos y 100°C durante 10 minutos para determinar la termoestabilidad de la actividad de fitasa. Cuando se ensayaban después de la exposición a estas temperaturas a 37°C, pH 5.0, no hubo una disminución sustancial en la actividad residual de la enzima (Tabla 6) .

Tabla 6 La actividad residual se basa en la comparación a las determinaciones de actividad de fitasa tomadas de las muestras antes de la exposición a cada condición (100 % de actividad correspondió a 112 unidades por mL del sobrenadante de cultivo) . Estas fueron condiciones normales de ensayo de fitasa a pH 5.0, 37°C durante 30 minutos, aunque las muestras se ensayaron solo en duplicado. Las muestras se ensayaron posteriormente en las mismas condiciones de ensayo.

Ejemplo 6 Clonación y análisis de fragmentos de gen de fitasa a partir de Penicillium piceum Se diseñaron dos cebadores para amplificar los fragmentos génicos de fitasa de este objetivo fungal (Tabla 7) . El CS11 se diseñó de la secuencia de ADN de los genes clonados de fitasa (A. niger, A. fumigatus, E. nidulans y T. thermophilus ) , la secuencia génica de la fitasa clonada de P. hordei y las secuencias de los cebadores diseñados CS1 y NI. Las primeras dos bases en cada codón para este cebador están bien conservadas. La tercera base se eligió en base a la desviación mostrada en las secuencias de ADN publicadas, y en particular, la base en la tercera posición en la secuencia de P. hordei CS12 se diseño de la porción de aminoácido conservada YADF/SHDN de las secuencias publicadas de fitasa, y de la secuencia deducida de aminoácidos del gen de fitasa de P. hordei.

Tabla 7 Secuencias de cebadores degenerados diseñados a partir secuencias conservadas entre fitasas fúngales.

F indica un cebador directo (5'?3') en la hebra positiva. R indica un cebador invertido en la hebra negativa.

La PCR se llevó a cabo en muestras génomicas del ADN P. piceum, y se amplificó un fragmento de aproximadamente 800 bp, que fue del tamaño esperado. Este fragmento se clonó en pTT-vector, y se realizó la transformación normal en una célula XLI-blue de E. coli . Se seleccionaron una selección de transformantes, y el ADN de plásmido se aisló. Una selección de clones con el inserto de tamaño correcto se envió para la secuenciación a MWG-Biotech. Un clon, CS142 contuvo la secuencia que tiene alta homología a las fitasas. La secuencia deducida de aminoácido mostró que el fragmento clonado (853 bp) fue de un gen de fitasa. Las secuencias genómicas y deducidas de aminoácidos del fragmento de P. piceum se ilustran en la Figura 17. Tienen el número esperado de residuos de Cys para esa región (3), y contuvieron todas las porciones cruciales para la estructura y función de las fitasas, notablemente : • RHGARYP · 3 x Cys • HD (dentro del YADFTHDN) Hay un número de otras regiones bien conservadas presentes ahí (ver alineación, Figura 59) y el análisis de % de identidad usando esta alineación mostró el P. piceum tuvo un 51 % aproximado de identidad a fitasa de P. hordei . Este fragmento de fitasa de P. piceum (283 aminoácidos) representa aproximadamente 65 % de la fitasa completa. El análisis Southern del fragmento de P. piceum contra digestiones de A. niger, P. hordei, P. piceum y P. brevi-compactum bajo condiciones de severidad media (3xSSC), mostraron hibridación contra únicamente la digestión de P. piceum. Por supuesto, se debe entender que un amplio intervalo de cambios y modificaciones se pueden hacer a la modalidad preferida descrita anteriormente.

Por lo tanto, se propone que la descripción detallada anteriormente se entienda en el contexto de las reivindicaciones siguientes, incluyendo todos los equivalentes, que se propone que definan el alcance de esta invenció . Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la presente invención, es el que resulta claro a partir de la presente descripción de la invención

Claims

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones : 1. Un polinucleótido aislado, derivado de una fuente fungal del género Penicillium, polinucleótido caracterizado porque comprende una secuencia de nucleotidos que codifica para la enzima que tiene actividad de fitasa.
2. El polinucleótido de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la fuente fungal se selecciona del grupo que consiste de Penicillium piceum y Penicillium hordei .
3. El polinucleótido de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la enzima comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 70 % de identidad, y opcionalmente al menos 80 % de identidad, a una secuencia de aminoácidos como se describe en SEQ ID NO: 4.
4. Un polinucleótido aislado, caracterizado porque comprende una secuencia de nucleotidos (i) que tiene al menos 55 % de identidad, y opcionalmente al menos 65 % de identidad, a una secuencia de nucleotidos como se describe en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO : 2, o SEQ ID NO: 3, o (ii) es capaz de hibridizar a una sonda derivada de la secuencia de nucleotidos descrita en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, o SEQ ID NO : 3 , bajo condiciones de severidad intermedia o alta, o (iii) es complementaria a la secuencia de nucleotidos descrita en SEQ ID N0:1, SEQ ID NO : 2, o SEQ ID NO : 3.
5. El polinucleótido de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque la secuencia de nucleotidos tiene al menos 75 % de identidad, y opcionalmente al menos 85 % de identidad, a la secuencia de nucleotidos descrita en SEQ ID N0:1, SEQ ID NO: 2, o SEQ ID NO: 3.
6. Un polinucleótido aislado, caracterizado porque codifica para una enzima que tiene actividad de fitasa en donde la enzima se deriva de una fuente de Penicillium.
7. El polinucleótido de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque la enzima comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 70 % de identidad, y opcionalmente al menos 80 % de identidad, a una secuencia de aminoácidos como se describe en SEQ ID NO: 4.
8. El polinucleótido de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque el polinucleótido tiene (i) al menos 55 % de identidad, y opcionalmente al menos 65 % de identidad, a una secuencia de nucleotidos como se describe en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, o SEQ ID NO: 3, o (ii) es capaz de hibridizar a una sonda derivada de la secuencia de nucleotidos descrita en SEQ ID N0:1, SEQ ID NO: 2, o SEQ ID NO : 3 bajo condiciones de severidad media a alta, o (iii) es complementaria a la secuencia de nucleótido descrita en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, o SEQ ID NO: 3.
9. Una construcción de expresión, caracterizada porque incluye una secuencia de polinucleótido (i) que tiene al menos 55 % de identidad, y opcionalmente al menos 65 % de identidad, a una secuencia de nucleotidos como se describe en SEQ ID NO : 1, SEQ ID NO: 2, o SEQ ID NO : 3, o (ii) que es capaz de hibridizar a una sonda derivada de la secuencia de nucleotidos descrita en SEQ ID NO : 1 , SEQ ID NO: 2, o SEQ ID NO : 3 bajo condiciones de severidad media a alta, o (iii) que es complementaria a la secuencia de nucleotidos descrita en SEQ ID NO:l, SEQ ID NO: 2, o SEQ ID NO: 3.
10. Un vector, caracterizado porque incluye la construcción de expresión de la reivindicación 9.
11. Una célula hospedadora, caracterizada porque esta transformada con el vector de la reivindicación 10.
12. Una sonda para el uso en la detección de secuencia de ácido nucleico que codifican para una enzima que tiene actividad de fitasa derivada de una fuente microbiana, caracterizada porque comprende: una secuencia de nucleótidos (i) que tiene al menos 55 % de identidad, y opcionalmente al menos 65 % de identidad, a una secuencia de nucleótidos como se describe en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, o SEQ ID NO: 3, o (ii) que es capaz de hibridizar a un polinucleótido que incluye una secuencia como se describe en SEQ ID NO : 1, SEQ ID NO: 2, o SEQ ID NO : 3. bajo condiciones de severidad media a alta, o (iii) es complementaria a la secuencia de nucleótidos descrita en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, o SEQ ID NO : 3.
13. La sonda de conformidad con la reivindicación 12, caracterizada porque la fuente microbiana es una fuente fungal.
14. la sonda de conformidad con la reivindicación 13, caracterizada porque la fuente fungal es una especie de Penicillium.
15. Producto alimenticio o producto para animales que incluye una enzima que tiene actividad de fitasa, caracterizado porque la enzima comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 70 % de identidad y opcionalmente al menos 80 % de identidad, a una secuencia de aminoácidos como se describe en SEQ ID NO: 4.
16. Producto alimenticio o alimento para animales que incluye una enzima que tiene actividad de fitasa, caracterizado porque la enzima se deriva de una fuente fungal seleccionada del grupo que consiste de Penicillium hordei y Penicillium piceum.
17. Una enzima de fitasa aislada, caracterizada porque la enzima se obtiene de un hongo seleccionado del grupo que consiste de P. piceum y P. hordei y tiene las siguientes propiedades fisicoquímicas: (1) Peso molecular: entre aproximadamente 45-55 kDa (no glicosilado) ; y (2) Especificidad: fitato.
18. Un método para producir una enzima que tiene actividad de fitasa, caracterizado porque comprende: (a) proporcionar una célula hospedadora transformada con un vector de expresión que comprende un polinucleotido como se define en la reivindicación 4; (b) cultivar la célula hospedadora transformada bajo condiciones adecuadas para que la célula hospedadora produzca la fitasa; y (c) recuperar la fitasa.
19. El método de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque la célula hospedadora es una especie de Aspergillus.
20. Un método para separar fósforo de fitato, caracterizado porque comprende: tratar el fitato con una enzima que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 70 % de identidad, y opcionalmente 80 % de identidad, a una secuencia de aminoácidos como se describe en SEQ ID NO: 4.
21. Un método para separar fósforo de fitato, caracterizado porque comprende: tratar el fitato con una enzima como se define en la reivindicación 17.
22. El polinucleotido de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la enzima incluye una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 70 % de identidad y opcionalmente al menos 80 % de identidad, a una secuencia de aminoácidos como se describe en la Figura 17.
23. Un polinucleotido aislado, caracterizado porque incluye una secuencia de nucleotidos (i) que tiene al menos 55 % de identidad, y opcionalmente al menos 65 % de identidad, a una secuencia de nucleotidos como se describe en la Figura 17, o (ii) es capaz de hibridizar a una sonda derivada de la secuencia de nucleotidos descrita en la Figura 17 bajo condiciones de severidad intermedia a alta, o (iii) que es complementaria a la secuencia nucleotidos descrita en la Figura 17.
24. El polinucleotido de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque la secuencia de nucleotidos tiene al menos 85 % de identidad a la secuencia de nucleotidos descrita en la Figura 17.
25. El polinucleotido aislado de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque la enzima se deriva de Penicillium piceum o Penicillium hordei .
26. El polinucleótido de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque la enzima incluye una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 70 % de identidad y opcionalmente al menos 80 % de identidad, a una secuencia de aminoácidos como se describe en la Figura 17.
27. El polinucleótido de conformidad con la rei indicación 25, caracterizado porque el polinucleótido incluye una secuencia de nucleótidos (i) que tiene al menos 55 % de identidad, y opcionalmente al menos 65 % de identidad, a una secuencia de nucleótidos como se describe en la Figura 17, o (ii) que es capaz de hibridizar a una sonda derivada de la secuencia de nucleótidos descrita en la Figura 17 bajo condiciones de severidad media a alta, o (iii) que es complementaria a la secuencia nucleótidos descrita en la Figura 17.
28. Una construcción de expresión, caracterizada porque comprende un nucleótido que incluye una secuencia de nucleótido (i) que tiene al menos 55 % de identidad, y opcionalmente al menos 65 % de identidad, a una secuencia de nucleótidos como se describe en la Figura 17, o (ii) que es capaz de hibridizar a una sonda derivada de la secuencia de nucleótidos descrita en la Figura 17 bajo condiciones de severidad media a alta, o (iii) que es complementaria a la secuencia nucleótidos descrita en la Figura 17.
29. Un vector ca ac erizado porque incluye la construcción de expresión de la reivindicación 28.
30. Una célula hospedadora, caracterizada porque esta transformada con el vector de la reivindicación 29.
31. Una sonda para el uso en la detección de secuencias de ácido nucleico que codifican para una enzima que tiene actividad de fitasa derivada de una fuente microbiana, caracterizada porque comprende: una secuencia de nucleótidos (i) que tiene al menos 55 % de identidad, y opcionalmente al menos 65 % de identidad, a una secuencia de nucleótidos como se describe en la Figura 17, o (ii) que es capaz de cómo se describe en la Figura 17 bajo condiciones de severidad media a alta, o (iii) que es complementaria a la secuencia nucleótidos descrita en la Figura 17.
32. La sonda de conformidad con la reivindicación 31, caracterizada porque la fuente microbiana es una fuente fungal.
33. La sonda de conformidad con la reivindicación 32, caracterizada porque la fuente fungal es una especie Penicillium.
34. Producto alimenticio o alimento para animales que incluye una enzima que tiene actividad de fitasa, caracterizado porque la enzima incluye una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 70 % de identidad, y opcionalmente al menos 80 % de identidad, a una secuencia de aminoácidos como se describe en la Figura 17.
35. Un método para producir una enzima que tiene actividad de fitasa, caracterizado porque comprende: (a) proporcionar una célula hospedadora transformada con un vector de expresión que comprende un polinucleótido como se define en la reivindicación 23; (b) cultivar la célula hospedadora transformada bajo condiciones adecuadas para que la célula hospedadora produzca la fitasa; y (c) recuperar la fitasa.
36. El método de conformidad con la reivindicación 35, caracterizado porque la célula hospedadora es una especie de Aspergillus.
37. Un método para separar fósforo de fitato, caracterizado porque comprende: tratar el fitato con una enzima (i) que tiene actividad de hidrolización de fitato y (ii) que incluye una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 65 % de identidad, y opcionalmente al menos 70 % de identidad, a una secuencia de aminoácidos como se describe en la Figura 17.
38. Una enzima derivada de una especie de Penicillium, opcionalmente P. piceum o P. hordei ; la enzima se codifica por una secuencia de nucleótidos capaz de hibridizar a una secuencia de polinucleótidos como se muestra en SEQ ID NO : 1, SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 3, o Figura 17 bajo condiciones de severidad intermedia o alta, la enzima está caracterizada porque tiene una o más de las siguientes propiedades fisicoquímicas: (1) Peso molecular: entre aproximadamente 45-60 kDa (no glicosilado) ; (2) Una actividad que es específica hacia fitato, ácido fítico o mio-inositol-hexafosfato , y/o derivados inferiores de fosfato de los mismos; (3) Un pl teórico entre aproximadamente 7 y 7.6; opcionalmente aproximadamente 7.3; (4) Un pH óptimo con un intervalo de aproximadamente 4.5 - 5.5, opcionalmente aproximadamente 5; y/o (5) Una temperatura ambiente óptima con un intervalo de aproximadamente 40 a aproximadamente 45 grados centígrados; opcionalmente 42-44 grados centígrados.